CN102149401A - 用于多发性骨髓瘤的诊断、预后和治疗的基于微rna的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

用于评估受试者的病理状态的方法包括测量一种或多种标志物的表达特征谱，其中差异表示多发性骨髓瘤(MM)或对MM的易感性。本发明提供了用于MM的诊断、预后和治疗的新型方法和组合物。本发明还提供了鉴定抗MM癌试剂的方法。

Description

用于多发性骨髓瘤的诊断、预后和治疗的基于微RNA的组合物和方法

发明者：Carlo M.Croce

交叉参考相关申请

本申请要求2008年8月12日提交的美国临时申请案61/088,036(其全部公开内容通过引用明确地合并入本文)的权益。

关于联邦政府支助的研究的声明

本发明在National Cancer Institute Grant No.--------下得到政府支持。政府在本发明中具有某些权利。

发明的技术领域和工业实用性

本发明总的来说涉及分子生物学领域。更特别地，其涉及牵涉多发性骨髓瘤的生物标志物的方法和组合物。本发明的某些方面包括在多发性骨髓瘤相关疾病的诊断、治疗和预后中的应用。

发明背景

不承认本节中公开的背景技术在法律上构成现有技术。

多发性骨髓瘤(MM)是特征在于克隆性恶性浆细胞在骨髓中积累的B细胞肿瘤(1)。该癌症可从头发生或以每年约1％的速率从称为意义未明的单克隆γ球蛋白病(MGUS)的良性病症发展而来(2-3)。MM细胞被赋予多种抗细胞凋亡信号转导机制，这解释了对现有化学疗法方案的抗性(4)。在MM中有效的治疗方式调节促细胞凋亡和抗细胞凋亡Bcl-2蛋白家族和主要由p53(其在MM中以低的频率突变)调控的细胞凋亡的抑制剂的水平(4)。众所周知，骨髓(BM)微环境在MM的生物学中起着显著作用；MM细胞至BM基质的附着触发细胞因子产生，通过激活核因子系(nuclear factor line)增强细胞增殖和对化学疗法的抗性(7)，更重要地这似乎是MM与MGUS之间的主要遗传差异(3-7)。

尽管在癌基因组学和MM细胞-基质相互作用上取得了新进展，但仍然急切需要鉴定在MM发病机制中可被药物介入靶向的至关重要的参与者以改善该仍然不可治愈的疾病的结果。新技术例如微阵列基因表达(包括非编码RNA)的出现可通过建立基因表达变化与MM分子和临床特征之间的关联性来提高对MM生物学的理解，如我们对于慢性淋巴细胞性白血病和急性髓性白血病所显示的(8-9)。

微RNA(miRNA)是长度为19-25个核苷酸的非编码RNA，其通过诱导它们的靶mRNA的翻译抑制和降解(通过与部分或完全互补的位点碱基配对)来调节基因表达(10)。MiRNA参与至关重要的生物过程，包括发育、细胞分化、应激响应、细胞凋亡和增殖(10)。最近，已将特定的miRNA表达模式与造血作用和癌症相关联(11-13)。

然而关于miRNA在MM中的表达知之甚少。最近的研究已显示，在IL-6依赖性MM细胞系中，IL-6通过STAT-3机制控制miR-21转录。此外，异位miR-21表达足以维持IL-6依赖性细胞系在IL-6不存在的情况下生长(14)。

有鉴于此，需要就对多发性骨髓瘤(MM)的易感性可靠且准确地诊断和/或筛查个体的方法。

治疗与多发性骨髓瘤(MM)相关的多发性骨髓瘤(MM)相关癌症的方法也受到高度期待。

尽管对治疗多发性骨髓瘤(MM)的疗法进行了相当多的研究，但MM仍然难以有效诊断和治疗，并且在患者中观察到的死亡率表明所述疾病的诊断、治疗和预防需要改进。

发明概述

在第一广泛方面，本文中提供了用于评估受试者的病理状况的方法，其包括测量一种或多种标志物的表达特征谱，其中差异表示多发性骨髓瘤(MM)或对MM的易感性。

在另一个广泛的方面中，本文中提供了用于MM的诊断、预后和治疗的新型方法和组合物。本发明还提供了鉴定抗MM癌症试剂的方法。

当根据附图阅读时，根据优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和优势对本领域技术人员来说将变得显然。

附图简述

本专利或申请文件包含一个或多个以彩色制成的图和/或一幅或多幅照片。具有彩色附图和/或照片的本专利或专利申请公开案的拷贝将应请求且支付必要的费用后由Patent Office提供。

图1A-1D：MM和MGUS与正常CD138+PC相比较表达不同的miRNA谱：

图1A：显示PC转化的多步骤分子过程的示意图。

图1B：经分析相对于正常PC在MGUS中显著失调的miRNA的代表性清单。星号表示特定关联的簇。

图1C：经分析在MM患者与正常PC以及PC MM与正常PC的比较中共同失调的miRNA的代表性清单。星号表示特定关联的簇。

图1D：miR-17微RNA簇。可鉴定到微RNA前体的3个旁系同源家族：miR-17/18/18X120/93/106a/106b/93(黄色)、miR-19a/19b-1/19b-2(蓝色)和miR-92-1/92-2/25(绿色)。

图2A-2D：miR-181、106b-25簇、32靶向PCAF：

图2A：根据“计算机(in silico)”靶Target Scan预测软件，经预测与PCAF基因在处于其3′-UTR中的几个共有结合位置上相互作用的miRNA。

图2B、2C、2D：显示用pGL3-PCAF-3*共转染的细胞中减少的萤光素酶活性(活性±SD)的萤光素酶测定。每一个报告基因质粒转染至少2次(在不同的日期)并且以一式三份测定每一个样品。

图2D：显示在用乱序的(scrambled)寡核苷酸或miR-19a、miR-19b或两种ASO转染后48小时来自U266和JJN3细胞的完整细胞裂解物中的SOCS-1蛋白的Western印迹。GADPH用作上样对照。基于GADPH水平的光密度测定显示在miR-19a或miR-19b或两种反义寡核苷酸(ASO)存在的情况下SOCS-1水平在U266和JJN3细胞中增加。

图2E：显示miR-19体外调节激活的STAT-3在U266细胞中的表达的Western印迹。用反义miR-19或阴性对照(Scr)miRNA抑制剂体外转染细胞，并且在72小时后获得细胞裂解物。基于STAT-3水平的光密度测量显示在miR-19存在的情况下P-STAT-3的水平降低。

图2F：验证在转染U266细胞后72小时内源miR-19a和miR-19b的表达的茎环qRT-PCR(图2G-3H)。

图2I：在转染后48小时和在4小时的UV处理后，用miR-181a/b或用miR-181a/b和miR-106b/25一起(混合物)或用乱序的寡核苷酸转染的MM.1s细胞中p53和PCAF表达的实时RT-PCR分析。将两种基因的PCR产物针对GADPH和肌动蛋白的表达进行标准化。条形图表示在4个分开的研究中观察到的平均值±SE。

图2L：显示在48小时的miR-181a、miR-181b、miR-92和乱序的ASO转染后，在与10μM nutlin-3a一起温育9小时和过夜后MM1细胞中p53蛋白表达的免疫印迹分析；GADPH是内部上样对照。基于GADPH水平的光密度测定显示在miR-181a和miR-181b ASO存在的情况下MM.1s细胞中p53的水平升高。

图3A-3F：miR-19在MM细胞系中靶向SOCS-1：

图3A：在15个MM细胞系和两个来自健康供体的CD138+PC(对照)中使用抗SOCS-1和GADPH的抗血清的免疫印迹分析。

图3B：人、小鼠、大鼠和狗中预测的miR-19在SOCS-1的3′UTR上的高度保守的共有结合位点。

图3C：用含有SOCS-1的3′UTR的萤光素酶报告基因载体和miR-19或乱序的寡核苷酸瞬时共转染的MEG01细胞中的相对萤光素酶活性。假定的miR-19给合位点中与miRNA种子区域互补的6个碱基的缺失消除了该效应(MUT)。条棒表示针对海肾萤光素酶活性标准化的萤火虫萤光素酶活性±SD。每一个报告基因质粒转染至少2次(在不同的日期)并且以一式三份测定每一个样品。

图3D：显示在用乱序的寡核苷酸或miR-19a、miR-19b或两种ASO转染后48小时来自U266和JJN3细胞的完整细胞裂解物中的SOCS-1蛋白的Western印迹。GADPH用作上样对照。基于GADPH水平的光密度测定显示在miR-19a或miR-19b或两种ASO存在的情况下U266和JJN3细胞中SOCS-1的水平升高。

图3E：显示miR-19体外调节激活的STAT-3在U266细胞中的表达的Western印迹。用反义miR-19或阴性对照(Scr)miRNA抑制剂体外转染细胞，并且在72小时后获得细胞裂解物。基于STAT-3水平的光密度测定显示在miR-19存在的情况下P-STAT-3的水平减少。

图3F：用于验证在用拮抗性寡核苷酸转染U266细胞后72小时，在用RNU6B标准化后，内源miR-19a和miR-19b的表达的茎环qRT-PCR。

图4A-4B：拮抗性miR-19和miR-181在MM细胞系中的表达导致裸小鼠中显著的肿瘤抑制。皮下注射用miR-181ASO或乱序的寡核苷酸转染的U266和JJN3细胞(30x10⁶个细胞)。在第35天处死小鼠，计算肿瘤体积。

图4A：U266细胞系的肿瘤生长的时程。

图4B：JJN3细胞系的肿瘤生长的时程；对于两个细胞系，用miR-19和miR-181ASO处理的肿瘤比乱序组的肿瘤显著更小(比例尺(scale bar)；10mm)。

图5A-5C：共同的miRNA的表达。显示在MM PC与健康PC(图5A)以及来自MM患者的PC与健康PC(图5B)的两类比较中共同的miRNA(图5C)的维恩图。

图6A-6F：通过qRT-PCR进行的MM患者、MGUS和MM细胞系相对于CD138+PC健康者的微阵列数据的验证。通过qRT-PCR测量的来自健康供体(n＝3)、MGUS(n＝3)、MM患者(n＝6)的CD138+PC和MM细胞系(n＝15)中的平均miR-93、miR-25和miR-106b(图6A)、miR-181a和miR-181b(图6B)、miR-32(图6C)、miR-17-5和miR-20a(图6D)、miR-92和miR-106a(图6E)以及miR-19a和miR-19b(图6F)的表达。条棒表示MM PC、MGUS和健康PC之间的相对倍数变化±SE。在用RNU6B标准化后比较不同组之间的miRNA表达。

图7A-7B：MM细胞系中的PCAF表达：

图7A：15个MM细胞系和1个健康CD138+PC样品中的PCAF表达的实时RT-PCR分析。将PCR产物针对GADPH和肌动蛋白的表达进行标准化，以一式四份重复每一个点；差异是显著的(p＜0.001)。

图7B：显示针对肌动蛋白的表达标准化的PCAF的表达的15个MM细胞系的免疫印迹分析。

图8A-8B：ASO转染的验证：

图8A：显示在用miR-181a/b、miR-106b-25簇、miR-32(混合物)或miR-181a/b或乱序的ASO转染MM1细胞后48小时MM.1s细胞中的PCAF蛋白质表达的免疫印迹分析；GADPH是内部上样对照。

图8B：验证在用拮抗性寡核苷酸转染MM.1s细胞后48小时，在用U6标准化后内源miR-181a/b、miR-106b-25簇、miR-32的表达的茎环q-RT-PCR。

图9：miR-17-92簇靶向Bim。显示在用miR-19a或miR-19b或者两种ASO转染后48小时，BIM-EL、BIM-L和GADPH在U266细胞中的表达的免疫印迹分析。基于GADPH水平的光密度测定显示在miR-19b以及miR-19a和b(两种ASO)存在的情况下U266细胞中BIM-EL和BIM-L的水平升高。

图10：表1-患者样品的临床数据。

图11：表2-在MGUS与健康PC之间差异表达的miRNA。

图12：表3-用于微阵列分析和茎环的MM细胞系。

图13：表4-在MM患者和细胞系(MM PC)与健康PC之间差异表达的miRNA。

图14：表5-在来自MM患者的PC与健康PC之间差异表达的miRNA。

图15：表6-在MM PC与MM患者之间表达的共同的miRNA。

优选实施方案的详述

在整个本公开内容中，通过标识引用来引用各种公开物、专利和公开的专利说明书。这些公开物、专利和公开的专利说明书的公开内容通过引用并入本公开内容以更充分地描述本发明所属领域的现有技术水平。

在一个广泛的方面中，本文提供了诊断受试者是否患有多发性骨髓瘤(MM)和/或意义未明的单克隆γ球蛋白病(MGUS)或处于发生所述疾病的风险中的方法，其包括：测量来自受试者的测试样品中至少一种miR基因产物的水平，其中与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中miR基因产物的水平的变化表示受试者患有MM和/或MGUS或处于发生所述疾病的风险中。

在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21，miR-19a，miR-19b，miR-181a，miR-181b和miR-32。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-19a和miR-19b中的一种或多种。

在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物表示受试者患有MM(与MGUS相区别)。

在另一个广泛的方面，本文中提供了在有此需要的受试者中抑制肿瘤生长的方法，其包括施用至少一种基因产物，所述基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-19a，miR-19b，miR-181a和miR-181b。所述miR基因产物是miR-191a和miR-191b中的一种或多种。

在某些实施方案中，至少一种miR基因产物与p53蛋白调控相关。

在另一个广泛的方面，本文中提供了诊断受试者是否患多发性骨髓瘤(MM)或处于发生所述疾病的风险中的方法，其包括：1)逆转录获自受试者的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；2)将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和3)将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有MM疾病或处于发生所述疾病的风险中。

在另一个广泛的方面，本文中提供了诊断受试者是否患与受试者中的一个或多个不利预后标志物关联的多发性骨髓瘤(MM)相关疾病或处于发生所述疾病的风险中的方法，其包括：1)逆转录获自受试者的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；2)将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和3)将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，其中信号的改变表示受试者患有MM相关疾病或处于发生所述疾病的风险中。

在另一个广泛的方面，本文提供了治疗患多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的受试者中的多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的方法，其中与对照细胞相比，受试者的MM细胞中至少一种miR基因产物下调或上调，所述方法包括：1)当MM细胞中所述至少一种miR基因产物下调时，对受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，以便抑制受试者中MM细胞的增殖；或2)当MM细胞中所述至少一种miR基因产物上调时，对受试者施用有效量的用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的至少一种化合物，以便抑制受试者中MM细胞的增殖。

在另一个广泛的方面，本文提供了治疗受试者的多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的方法，其包括：1)测定与对照细胞相比，MM细胞中至少一种miR基因产物的量；和2)如下改变MM细胞中表达的miR基因产物的量：i)如果MM细胞中表达的miR基因产物的量低于对照细胞中表达的miR基因产物的量，那么对受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物；或ii)如果MM细胞中表达的miR基因产物的量高于对照细胞中表达的miR基因产物的量，那么对受试者施用有效量的用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的至少一种化合物，以便抑制受试者中MM细胞的增殖。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物表示受试者患有MM(与MGUS相区别)。

在另一个广泛的方面，本文提供了治疗多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的药物组合物，其包含至少一种分离的miR基因产物和药学上可接受的载体。在某些实施方案中，所述miR基因产物包含miR表达抑制剂和反义寡核苷酸(anti-sense oligo，ASO)中的至少一种或多种。在某些实施方案中，所述至少一种miR表达抑制剂化合物特异于在MM细胞中相对于适当的对照细胞上调的miR基因产物。

在另一个广泛方面，本文中提供了鉴定抗多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的试剂的方法，其包括：对细胞提供受试试剂和测量与MM细胞中改变的表达水平关联的至少一种miR基因产物的水平，其中与合适的对照细胞相比，细胞中miR基因产物的水平的改变表示受试试剂为抗癌试剂。

在另一个广泛的方面，本文中提供了用于评估一个或多个代谢途径的标志物，所述代谢途径促成了多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的起始、进展、严重性、病状、攻击性、分级、活性、失能(disability)、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在的致病或病理特征中的至少一种，其中所述标志物包括编码至少一种分离的miR基因产物的一个或多个基因产物，所述分离的miR基因产物是miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-181b和miR-32。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-19a和miR-19b中的一种或多种。

在另一个广泛的方面中，本文提供了一种制品，其包含：至少一种捕获试剂，所述捕获试剂与选自本文所述的至少一种标志物的多发性骨髓瘤相关疾病的标志物结合。

在另一个广泛的方面，本文中提供了测试多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的试剂，其中所述试剂包含识别由本文中所述的至少一种标志物编码的蛋白质的抗体。

在另一个广泛的方面中，本文提供了评估预防、诊断和/或治疗多发性骨髓瘤(MM)的疗法的有效性的方法，其包括：1)使受试者经历其有效性待评估的疗法，和2)通过评估本文中所述的至少一种标志物，测定待测试的疗法在治疗或预防多发性骨髓瘤(MM)中的有效性水平。在某些实施方案中，候选治疗剂包括如下的一种或多种：药物组合物，营养食品组合物(nutraceutical composition)和顺势疗法组合物(homeopathic composition)。在某些实施方案中，待评估的疗法用于人类受试者。

在另一个广泛的方面中，本文提供了用于筛选用于治疗多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包含：至少一种本文所述的标志物的一种或多种试剂和表达至少一种标志物的细胞。在某些实施方案中，使用包含特异性结合至少一种标志物的抗体或抗体片段的试剂检测所述标志物的存在。

在另一个广泛的方面中，本文提供了用于多发性骨髓瘤(MM)的筛选测试，其包括：将一种或多种本文中所述的标志物与所述标志物的底物和与受试试剂接触；和，确定所述受试试剂是否调节所述标志物的活性。在某些实施方案中，所有的方法步骤在体外进行。

在另一个广泛的方面中，本文提供了在有此需要的个体中治疗、预防、逆转或限制多发性骨髓瘤(MM)并发症的严重性的方法，其包括：将干扰至少多发性骨髓瘤(MM)应答信号转导途径的试剂以足以干扰这样的信号转导的量给个体施用，其中所述试剂包含至少一种干扰SOCS-1表达的miR基因产物。

在另一个广泛的方面中，本文提供了干扰多发性骨髓瘤(MM)应答信号转导途径的试剂用于制备药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体中多发性骨髓瘤(MM)并发症的严重性，其中所述试剂包含至少一种基因产物，所述基因产物选自miR-21、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32的至少一个miR基因产物和其组合。

在另一个广泛的方面中，本文提供了用于治疗多发性骨髓瘤(MM)癌症的药物组合物，其包含至少一种p300-CBP相关因子表达抑制化合物和药学上可接受的载体。

在另一个广泛的方面中，本文中提供了在有此需要的细胞中控制p53活性的方法，其包括将所述细胞与足以控制这样的活性的量的至少一种miR基因产物接触，其中所述miR基因产物是如下的一种或多种：miR-106b-25簇、miR-32、miR-181a和miR-181b。在某些实施方案中，所述miR基因产物靶向p300-CBP相关因子(PCAF)基因。在某些实施方案中，所述细胞是多发性骨髓瘤(MM)细胞。

在另一个广泛的方面中，本文中提供了与从正常经由MGUS至临床明显的MM的MM多步骤转化过程关联的miRNA特征(signature)，其包括：如下的至少一种或多种：miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-181b和miR-32。在某些实施方案中，所述至少一种miR基因产物是miR-19a和miR-19b中的一种或多种。

在另一个广泛的方面中，本文中提供了在有此需要的受试者中阻止细胞凋亡和/或促进细胞存活的方法，其包括施用有效量的一种或多种miR基因产物，其中所述基因产物是如下的一种或多种：miR-17～92、miR-19a、miR-19b和miR-21。

在另一个广泛的方面中，本文中提供了在有此需要的受试者中靶向PCAF，p53正调节剂的方法，其包括施用有效量的一种或多种miR基因产物，其中所述miR基因产物是如下的一种或多种：miR106b～25，miR-181a和miR-32。

在另一个广泛的方面中，本文中提供了在细胞中在MM病理晚期下调SOCS-1和/或激活IL-6的方法，其包括上调细胞中的miR-19。

在另一个广泛的方面中，本文中提供了miRNA微阵列和定量RT-PCR用于评估MM来源的细胞系和来自MM患者、MGUS和正常供体的CD138+骨髓浆细胞(PC)中miRNA表达的用途。

本文中还提供了与和PC的恶性转化关联的蛋白质的表达和调控相关的miRNA特征。

在下列实施例中进一步定义本发明，其中，除非另有说明，所有部分和百分比以重量计并且温度是摄氏度。应理解，表示本发明的优选实施方案的这些实施例仅通过举例说明的方式给出。根据上述讨论和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的本质特征，并且无需背离其精神和范围，可以对本发明进行多种变化和改进以使其适应不同的用法和条件。本说明书中涉及的所有公开物，包括专利和非专利文献明确地通过引用并入本文。

实施例

特征性miRNA特征区分MGUS与健康PC

目前的模型假定MM通过多步骤转化过程发展而来(图1A)(15)。为了鉴定与MM的早期发病事件关联的特定改变，本发明者通过使用本文描述的miRNA微阵列平台分析了5个来自MGUS受试者的CD138+PC和4个健康PC[关于患者特征，参见图10-表1]。

我们首先通过使用BRB工具中的单变量t检验(分类比较)将MGUS与健康对应者PC相比较(图11-表2，图1B)。本发明者发现48种miRNA显著失调(p值≤0.05)；相对于正常CD138+PC，41种miRNA在MGUS中上调并且7种下调(图11-表2，代表性清单示于图1B中)。

在MGUS中上调最多的miRNA是miR-21(其在MM中也被描述为上调(14))、miR-181a(已知其在B和T细胞分化中具有作用(16))和致癌簇miR-106b～25，特别是miR-93、miR106b和miR-25(图11-表2，图1B)。

MM患者和细胞系的MiRNA特征

为了确定miRNA在MM中是否失调，本发明者使用本发明者的miRNA微阵列(17)分析了41个MM来源的细胞系(图12-表3)、来自10个MM的CD138+未处理骨髓PC和4个正常CD138+PC的全局性miRNA表达。在用AutoMACs自动化分离系统(Miltenyi-Biotec，Auburn，CA)分离后CD138+PC的纯度程度以及MM病例和正常PC的临床特征列于图10-表1中。

首先，本发明者使用BRB中的单变量t检验将原发性肿瘤和细胞系中的miRNA表达与CD138+健康对照相比较(图13-表4)。本发明者的分析显示，与CD138+健康对照相比较，在MM患者和细胞系中60个miRNA上调以及36个miRNA下调(图13-表4，图1C)。

所有miRNA具有超过2倍的变化并且p-值≤0.01。由于细胞系中miRNA的表达也可因延长的体外培养而失调，因此本发明者分析了仅在MM患者与健康PC中的miRNA的表达(图14-表5)。

本发明者发现，相对于正常PC，在MM患者中37个miRNA上调和37个miRNA下调，变化倍数＞2并且p值≤0.01(图14-表5)。约90％的上调的miRNA(37个中的34个)和30％的下调的miRNA(37个中的10个)与组合的MM患者和细胞系的组是共同的，从而验证了将细胞系和MM患者样品组合的本发明者的方法(至少对于上调的miRNA的分析)(图1C)(图15-表6)。

图5中的维恩图显示这两组比较之间的共同miRNA。与在MGUS中观察到的特征相似，发现miR-21和miR-106a～92簇在MM患者和细胞系中上调(图1C，图12-表3)。然而，本发明者发现，miR-32和簇miR-17～92，特别是miR-19a和miR-19b，只在MM样品但不在MGUS或健康PC中显著上调(图1C)，这表明其在从MGUS至MM的恶性转化中的可能作用。

通过q-RT-PCR验证miRNA特征

为了验证微阵列结果，本发明者使用独立的一组随机选择的健康受试者的CD138+PC(n＝3)、MM患者样品(n＝6)和MGUS(n＝3)(图10-表1)(全都来自不同供体)加上一组MM细胞系(n＝15)(图10-表1)对miR-32、miR-17-5、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92、miR-106a(miR-17～92簇)、miR-106b、miR-93和miR-25(miR-106b～25簇)、miR-328和miR-181a和miR-181b进行q-RT-PCR。

本发明者确认，miR-106b～25簇在MGUS和MM样品(相对于CD138+健康PC)中过表达(图6A)。虽然miR-106b～25簇与miR-17～92簇共有高度的同源性(图1D)，并且对于两者都报导了致癌作用(18-20)，但本发明者对茎环q-RT-PCR分析高度相似的miRNA的特异性充满信心；来自本发明者的实验室的之前报道显示miR-106b、miR-93和miR-25引物的精确特异性(20)。成熟miR-181a在2/3的MGUS、6/6的MM和9/15的细胞系中过表达，差异表达的平均值示于图6B中。

此外，miR-181b也在MM和MGUS中过表达，虽然程度低于miR-181a(图6B)。本发明者还验证了miR-32和miR-17～92簇(图6C-F)在MM患者和细胞系中的过表达。与阵列数据相一致，两个miR-17～92簇成员miR-19a和miR-19b以及miR-32在6/6的MM PC样品和15/15的细胞系中高度过表达(图6C，6F)。本发明者主要地发现miR-19a和miR-19b具有大于100倍的倍数变化(图6F)，而它们在1/3的MGUS中显示极低的表达以及在2/3的MGUS和3/3的健康PC样品中几乎不表达，从而验证了本发明者的初步阵列结果并且表明此类miRNA是MM特异性的。

在MM中上调的几种miRNA靶向PCAF(p53的正调节剂)

在MGUS和MM患者及细胞系中上调最多的miRNA之一是miR-181a和miR-181b以及miR-106b～25，然而miR-32偏向于在MM中上调。通过使用“计算机”靶预测软件[Target Scan(21)，Pictar(22)]，本发明者发现，此类miRNA经预测靶向p 300-CBP相关因子(PCAF)的3′-UTR(图2A)。PCAF是参与多种转录调节剂包括肿瘤抑制蛋白p53的可逆乙酰化的组蛋白乙酰转移酶(HAT)(23)。最近Linares等人已显示PCAF具有对于控制Hdm2表达水平(从而控制p53的表达水平)是至关重要的内在泛素化活性(24)，所述p53在MM中在诊断时极少突变(5-10％的病例)或缺失(25-26)。

为了检查这些miRNA是否可调控PCAF，本发明者首先通过q-RT-PCR(图7A)和Western印迹(图7B)在15个MM细胞系中分析PCAF的表达。作为对照，本发明者使用从健康供体分离的两个CD138+PC。本发明者发现PCAF的表达在10/15的细胞系中几乎不存在(对照的1/10以下)，而剩下的5个细胞系展示极低的表达。为了研究该基因是否在基因组水平上缺失，本发明者使用Affymetrix SNP 6.0阵列进行全部15个MM细胞系的完整基因组CGH分析。然而，本发明者未观察到PCAF基因的缺失(数据未显示)。

其次，本发明者将PCAF 3′UTR 5克隆入萤光素酶报告基因载体并且与候选miRNA模拟物或乱序的寡核苷酸一起共转染，然后如方法中所述进行萤光素酶测定。本发明者发现miR-181a/b(图2B)、miR-106b～25簇和miR-32(图2D，2B)在体外与PCAF 3′UTR相互作用。然而，对于miR-92该相互作用较不显著(图2C)并且对于miR-19a和miR-19b未观察到相互作用(数据未显示)。报告基因载体中预测的miRNA结合位点的突变消除该效应，从而表明此类miRNA与PCAF 3′UTR直接相互作用。

为了确认MM细胞中此类miRNA在PCAF调控中的生物学作用，本发明者通过在U266和JJN3 MM细胞系中使用反义寡核苷酸(ASO)拮抗内源miR-181a、miR-181b、miR-25、miR-93、miR-106b和MiR-92验证了体外研究。在两种细胞系中，在转染后72小时antagomiR诱导PCAF蛋白表达的积累(图2E，2F)。相反地，通过寡核苷酸转染产生的相同miRNA的过表达在K562细胞系中减少PCAF表达(图2G，2H)。MiR-19a和miR-19b不影响PCAF表达(图2H)并且miR-92对其表达几乎不具有影响(图2F)，从而确认了萤光素酶表达数据(图2C)。

为了确定PCAF的miRNA调节剂是否能够间接影响p53表达，本发明者用反义miR-181a/b或同时使用全部antagomiR(反义miR-181、反义miR-93、反义miR-106b、反义miR-25、反义miR-32)转染MM1细胞，将细胞暴露于紫外线(UV)照射(图2I)，然后通过qRT-PCR测量p53和PCAF的表达(图2I)。

图8A显示在48小时的antagomiR处理后，PCAF蛋白的重新表达。转染的寡核苷酸的拮抗活性示于图8B中。在UV处理后，p53mRNA的表达在用反义miR-181a/b转染的细胞中几乎加倍，然而在同时用全部antagomiR转染的细胞中在nucleoporation后，其增加6倍(图2I)。此外，在用反义miR-181a/b寡核苷酸转染MM.1后，本发明者用小分子MDM2拮抗剂nutlin-3a(10μM)处理细胞，然后通过Western印迹测量p53。本发明者发现用miR-181反义寡核苷酸(ASO)转染的细胞在第9和第12小时展示更高水平的p53蛋白质(与乱序的和miR-29AOS相比较)(图2L)。这些数据综合起来显示，miR-106b-25簇、miR-32、miR-181a和miR-181b靶向PCAF并且通过该基因，间接控制骨髓瘤中的p53活性。

miR-19a和miR-19b靶向SOCS-1(IL-6R/STAT3途径的负调节剂)

我们的发现表明miR-19a和miR-19b在患者样品中上调＞100倍，在细胞系中上调＞2000倍(图6F)并且在正常PC和MGUS中两者几乎都不存在。两种miRNA都促成了MM的发展。因此，本发明者使用可获得的靶预测软件[Target Scan(21)，Pictar(22)]搜索参与骨髓瘤发病机制的miR-19a和b的mRNA靶标。在多于100种的预测的靶当中，SOCS-1牵涉几个细胞因子途径(包括IL-6，特别是Jak/STAT途径)的负调控(27)并且在MM中通常被甲基化沉默(28)。本发明者现相信MM样品中高水平的miR-19水平可通过下调负调节剂SOCS-1而在Jak/STAT-3信号转导的组成型激活中发挥重要作用。本发明者首先在15个MM细胞系和两个健康CD138+PC中评估其表达并且发现与对照相比较在13/15的细胞系中几乎无蛋白质表达(图3A)。

为了检查SOCS-1的降低的表达水平是否是MM细胞中上调的miR-19a/b的结果，本发明者在用候选antagomiRNA或乱序的寡核苷酸转染U266(其具有活性IL-6自分泌环)(29)和JJN3 MM细胞系(其展示减少的SOCS-1表达)后使用SOCS-1抗体进行Western印迹分析(图3D)。

此外，miR-19a和miR-19b模拟物抑制包含SOCS-1 3′UTR的报告基因载体的表达，然而预测的miRNA结合位点的突变消除了该效应(图3B，3C)，在用反义miR-19而非乱序的寡核苷酸转染后(图3E)。

通过q-RT-PCR检测第72小时时ASO的活性(图3F)。这些研究显示在MM的发病机制和恶性生长中miR-19在IL-6抗细胞凋亡信号中的作用。

miR-17～92簇靶向MM细胞中的Bim

由于已显示miR-17～92簇靶向促细胞凋亡基因Bim(19-20)，因此本发明者检查Bim在MM细胞中的表达是否受miR-17-92调控。用miR-19ASO转染U266细胞，使用免疫印迹评估Bim表达。本发明者发现与乱序的寡核苷酸相比较在用反义miR-19处理后48小时Bim蛋白水平显著增加(图9)。综合起来，这些结果已支持之前公布的数据(19-20)，所述数据显示Bim为miR-17～92的直接靶并且提出miR-17～92的过表达促成MM中的抗细胞凋亡信号的可能机制。

miR-19和miR-181a/b在MM细胞系中的异位表达导致裸小鼠中肿瘤 生长的显著抑制

为了探索本发明者的观察结果的体内相关性，本发明者检查了在沉默内源miR-19和miR-181a/b后U266和JJN3细胞在无胸腺nu/nu小鼠中的致肿瘤性。进行两个独立的实验，每一个实验对于每一种细胞系使用16只小鼠。用ASO或乱序的寡核苷酸体外转染U266或JJN3细胞。本发明者使用BLOCK-IT Fluorescent Oligo(Invitrogen)确认转染效率(80％，对于U266和JJN3)。24小时后，对于每一个组，重悬浮于100μl BD基质胶基质中的3x10⁷个有活力的细胞发展了可测量的肿瘤。相反地，用表达antagomiR的细胞移植的小鼠与对照相比较显示显著的对肿瘤生长的抑制(P＜0.01)(图4A，4B)。

用反义miR-19处理的两种细胞系都显示肿瘤体积大于10倍的减小并且用antagomiR-181处理的肿瘤减小至1/3(在JJN3细胞中)以及减小至1/10(在U266细胞中)，分别地P＝0.02和P＝0.01。

重要地，在注射了用反义miR-19处理的U266细胞的2只小鼠中观察到完全的肿瘤抑制。对于U266细胞，4周后的平均肿瘤体积为308.5mm³，对于JJN3细胞，为225mm³。在第4周只有50％的注射了用antagomiR-19和miR-181转染的MM细胞的小鼠发生可测量的肿瘤。对于U266/反义miR-19，平均肿瘤体积为19.5mm³，以及对于U266/反义miR-181，为14mm³。对于JJN3 MM细胞观察到相似的结果，其中对于反义miR-19和反义miR-181，平均肿瘤体积分别为25mm³和80mm³(图4A，4B)。总之这些结果显示这些微RNA在MM中的致癌作用，并且本发明者在本文中现相信，反义miR-19的更强的作用与U266的IL-6依赖性相关。

讨论

在过去数年中，几个研究已举例说明了miRNA对于正常造血细胞的分化的生物相关性以及失调的miRNA表达在恶性对应物中的贡献(11、30、31)。

本发明者在本文中显示了MM、MGUS的首个综合性全局性微RNA表达特征谱并且将此类表达模式与正常PC的表达模式相比较。在MM细胞系和原发性新诊断的MM中观察到的相似miRNA表达模式支持了如本文中描述的研究设计。此外，之前的MM微阵列研究已将MM细胞系与原发性患者样品组合，从而验证了本发明者的策略(32)。

此外，本发明者现鉴定了可与从正常PC经由MGUS至临床上明显的骨髓瘤的MM多步骤转化过程关联的miRNA特征，然而本发明者仍然意识到因MGUS和原发性肿瘤样品的较少数量而引起的限制。

在MGUS患者中，本发明者鉴定了具有致癌功能的上调的miRNA，例如miR-21和miR-106b～25簇。MiR-21在许多实体瘤和血液肿瘤中上调(11，25)。miR-21在胶质母细胞瘤细胞中的异位表达阻止细胞凋亡(33)，而在几种癌细胞中沉默其表达则抑制了细胞生长并且通过解除对其靶(肿瘤抑制基因如磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)以及蛋白质程序化细胞死亡4(PDCD4))的表达的阻止而导致增加的凋亡细胞死亡(34)。Petrocca等人(20)已显示miR-106b～25簇通过靶向促细胞凋亡Bim和p21而在胃癌肿瘤发生中起着重要作用。因此，这两个miRNA可通过阻断细胞凋亡，促进PC存活和诱发将最终导致完全发展的恶性肿瘤的次级遗传异常来促成浆细胞转化中的早期步骤。

在MM(包括MM细胞系和原发性肿瘤，相对于正常PC)中，本发明者鉴定了包含多个上调的miRNA(特别地，包括：miR-32、miR-21、miR-17～92、miR-106～25以及miR-181a和miR-181b)的特征。

虽然miR-106～25、miR-181a和b以及miR-21相对于正常PC也在MGUS患者中上调，但miR-32和miR-17～92簇只在MM患者中高度表达，这表明这些miRNA是MM特异性的。

除了RAS突变外，未发现其他遗传异常区分MGUS与MM(3)。因而，miR-32和miR-17～92簇可代表MM特异性遗传改变。

与miR-106～25簇相似，miR-17～92簇在B细胞淋巴瘤中的致癌作用是公知的并且几个已知的促细胞凋亡基因包括PTEN、E2F1和Bcl2111/Bim被确认为miR-17～92的靶(35-36)。最近Ventura等(19)已显示miR-17～92簇也是B细胞发育所必需的并且miR-17～92的不存在导致增加的促细胞凋亡蛋白Bim的水平并且在祖B细胞至前B细胞的转化中抑制B细胞发育。然而，鉴于几乎相同的序列，miR-106b～25和miR-17～92簇极可能在发挥相似(如果不是相同的话)的功能中(如在靶向Bim中)协同作用(19-20)。

本文中现显示关于在MM中失调的miRNA的重要功能见解。本发明者已确认促细胞凋亡Bim在MM细胞中是miR-17～92簇的靶。因而，miR-17～92和miR-21一起阻止细胞凋亡并且促进细胞存活。在另一方面，miR106b～25、miR-181a和miR-32[但非miR17～92簇(特别是miR-19和miR-92)]靶向PCAF(p53正调节剂)。

然而不希望受理论束缚，本发明者在本文中现相信，与MM中低频率的p53突变一致，miR-106b～25簇、miR-181和miR-32对PCAF的下调使p53保持在低水平或通过控制其稳定性(通过Hdm2)(24)和用作组蛋白乙酰转移酶(HAT)(23)使其部分地失活。

本文中还首次描述了miR-19对STAT3/IL6R负调节剂SOCS-1的特异性作用。事实上，MM中的IL-6途径是最详尽表征的存活途径之一，该途径通过STAT3参与PC转化和致癌作用，影响细胞凋亡调节剂例如Bcl-2家族成员(1，16)。这些发现表明MM中miR-19的上调可在MM发病机制的晚期促成SOCS-1下调和IL-6激活。

miR-19和miR-181在MM细胞中作为oncomiRNA的作用得到体内研究证实。数据显示在用miR-19和181 antagomir处理后移植的肿瘤的显著肿瘤消退。这些数据现表明miRNA在拮抗转化的PC的生长中可具有治疗潜能。

综上所述，本文中描述了MM和MGUS中独特的miRNA特征，其特征在于具有已知的致癌活性的miRNA的过表达。数据通过建立与miRNA对MM中至关重要的途径包括细胞凋亡、存活和增殖的调控的联系提供了miRNA在MM中的功能的见解。这些结果表明，这类调节分子在与PC的恶性转化关联的多步骤过程中产生另外水平的控制。

材料和方法

RNA提取和miRNA微阵列实验 如其他地方(37)详细描述的，进行RNA提取和miRNA微芯片实验。miRNA微阵列基于单通道系统(35)。将5微克总RNA用于在OSU定制miRNA微阵列芯片(OSU_CCC version 3.0)上杂交，所述芯片包含x1，100个miRNA探针，包括以一式二份点印的345个人和249个小鼠miRNA基因。

RT-PCR 如之前所述(10)，使用ABI Prism 7900HT序列检测系统(Applied Biosystems)，将单管TaqMan miRNA测定用于检测和定量成熟miRNA。使用RNU6B进行标准化。以一式三份进行比较实时PCR，包括无模板对照。使用比较Ct法计算相对表达。

ASO和模拟物转染实验  通过使用nucleoporation(Amaxa)试剂盒V(用于JJN3和MM1细胞系)和试剂盒C(用于U266细胞系)，利用100nM miRNA前体(Ambion)或100nM LNA miRNA反义寡核苷酸(Ambion)转染细胞。在指定的时间上收集蛋白质裂解物和总RNA。通过northern印迹和茎环qRT-PCR验证miRNA的加工和表达。对于所有细胞系，本发明者使用BLOCK-IT Fluorescent Oligo(Invitrogen)确认转染效率(对于U266和JJN3，约80％，对于MM1，50％)。将用阴性对照寡核苷酸转染的未处理的细胞用作校准物(calibrator)。

细胞收集和总RNA纯化  样品包括来自16个新诊断的MM病例、6个具有意义未明的单克隆γ球蛋白病(MGUS)的患者和6个健康供体(正常PC)的PC。按照机构政策获得书面知情同意。使用AutoMACs自动化分离系统(Miltenyi-Biotec，Auburn，CA)，通过使用单克隆小鼠抗人CD138抗体的免疫磁珠选择从单核细胞级分分离PC。PC纯度示于图11-表2中，针对细胞质轻链免疫球蛋白(Ig)进行免疫组织化学，以及通过Wright-Giemsa染色进行形态学研究。6个健康PC中的3个获自ALLCELLS，LLC，通过FACScan Analysis评估PC的纯度，并且其纯度超过80％。如所推荐的(美国典型培养物保藏中心，Chantilly，VA)培养MM细胞系(图12-表3)[Dr M.Kuehl(National Cancer Institute，MD)，Dr.Joshua Epstein(Little Rock，AR)，Dr S.Rosen(Chicago，IL)，Dr.M.Gramatzki(Kiel，Germany)的好意]和Epstein-Barr病毒(EBV)转化的B-淋巴母细胞细胞系(ARH-77，ARK，UCLA-1)。使用Trizol提取试剂(Invitrogen)分离总RNA。

萤光素酶报告基因载体  通过PCR从基因组DNA(293T/17细胞)扩增包含预测的微RNA结合位点的PCAF和SOCS1 3′UTR并且通过使用紧在萤火虫萤光素酶的终止密码子下游的Xba1位点将其插入pGL3对照载体(Promega)。按照制造商的方案，使用快速变化定点诱变试剂盒(Stratagene)将每一个互补种子区互补位点的前6个核苷酸的缺失插入突变体构建体。引物序列可在请求后获得。

萤光素酶测定  利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)在6孔板中，用1μg pGL3萤火虫萤光素酶报告基因载体(参见萤光素酶报告基因载体方法)、0.1μg phRL-SV40对照载体(Promega)和100nM miRNA前体(Ambion)共转染QBI293和Meg01细胞。在转染后24小时通过使用Dual Luciferase Assay(Promega)常规地测量萤火虫和海肾萤光素酶活性。每一个报告基因质粒转染至少2次(在不同的日期)并且以一式三份测定每一个样品。

异种移植物模型  在Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)批准的方案下进行研究。按照IACUC方法和指南维持8周龄雄性无胸腺nu/nu小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)。将30x10⁶个U266细胞或JJN3经转染的细胞悬浮于0.10ml细胞外基质凝胶(BD Biosciences)中，将混合物皮下注射入右和左肋腹。进行异种移植物生长的系列测量，使用公式4/3π(L^*W^*H/8)计算肿瘤体积。

Western印迹  如所描述的(10)，使用：兔多克隆抗SOCS-1(Abeam)；抗Gadph、Bim、Stat-3、P-Stat-3(Tyr705)的兔多克隆抗血清(Cell Signaling)；兔多克隆PCAF和单克隆p53(Santa Cruz)进行免疫印迹分析。针对β肌动蛋白或/和Gapdh水平(使用适当的抗血清(Santa Cruz Biotechnology)进行检测)标准化蛋白质水平。

UV和Nutlin3a处理  如本文中所描述的，用miR-181、miR-106b-25、miR-32和miR-19 ASO转染MM.1和U266 MM细胞系并且在转染后24小时，用10μM Nutlin3a(Cayman Chemical Company)处理U266细胞，用6J/m² UV(Ultra LUM.Inc.Paramount，CA)处理MM.1S，然后在本文中描述的时间上收获细胞。

数据分析  通过使用GenePix Pro 6.0分析微阵列图像。将每一个miRNA的重复点的平均值扣除背景，并进行进一步分析。当在至少50％的样品中存在时并且当至少50％的miRNA与基因中值相比较具有大于1.5的倍数变化时，保留miRNA。在标准化和统计分析之前将Absent call的阈值设置为4.5(log2标度)。该水平是miRNA芯片实验中检测到的高于背景的平均最小强度水平。使用Bioconductor包/功能进行分位数标准化。使用BRB工具版本3.5.0中的单变量t检验鉴定差异表达的微RNA。显著单变量α水平设置为等于0.01。该工具经设计用于使用参数检验t/F检验和随机方差t/F检验分析数据。将基因包括在基因清单中的标准是小于指定的阈值的p值或对假发现的数量或假发现的比例的指定的限制。通过使用多变量排列检定控制后者。

用途的实例

在一个方面，本发明提供用于预测患有癌症的受试者的存活的方法。预测方法基于多个生物标志物在癌细胞中的差异表达。已发现一些生物标志物倾向于在短期癌症存活者中过表达，而其他生物标志物倾向于在长期癌症存活者中过表达。来自患有癌症的受试者的细胞样品中，这些生物标志物的独特的表达模式可以用于预测该受试者的相对存活时间和最终的预后。

用于预测患有癌症的受试者的存活的方法

本发明的一个方面提供用于预测癌症存活的方法。该方法包括测定来自患有癌症的受试者的细胞样品中多个生物标志物(即，miR)的差异表达。癌症的生物标志物表达特征可以用于推算风险评分，所述风险评分预测该癌症的存活。所述评分可以指示低风险，这样受试者可能长期存活(即5年以上)，或所述评分可以指示高风险，这样受试者可能不能长期存活(即小于两年)。

存活相关生物标志物

一些生物标志物在长期存活者中过表达而一些生物标志物在短期存活者中过表达。通过影响细胞粘附、细胞运动、或炎症和免疫应答生物标志物可能在癌症转移中起作用。生物标志物还可能参与细胞凋亡。生物标志物可能在转运机制中起作用。生物标志物还可能与其他种类的癌症的存活有关。

测量多个生物标志物的表达

一种方法包括测量来自患有癌症的受试者的细胞样品中多个存活相关生物标志物的差异表达。然后，各种癌症中不同的表达模式，或基因表达特征，可以用于产生预测癌症存活的风险评分。与其他患有癌症的受试者相比，受试者中生物标志物的表达水平可以增加或减少。生物标志物在长期存活者中的表达可以比在短期存活者中的更高。可选地，生物标志物在短期存活者中的表达可以比在长期存活者中的更高。

可以通过本领域公知的各种技术测量多个生物标志物的差异表达。生物标志物的信使RNA(mRNA)的水平的定量可以用于测量所述生物标志物的表达。可选地，生物标志物的蛋白产物的水平的定量可以用于测量所述生物标志物的表达。关于下述方法的另外的信息可见于Ausubel等(2003)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY或Sambrook等(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY中。本领域技术人员将知道可以操作哪些参数来优化目的mRNA或蛋白的检测。

核酸微阵列可以用于定量多个生物标志物的差异表达。可以按照制造商的方案使用商购可获得的设备，例如通过使用Affymetrix技术(Santa Clara，CA)或来自Incyte的Microarray System(Fremont，CA)进行微阵列分析。一般地，将单链核酸(例如cDNA或寡核苷酸)铺板或排列在微芯片基质上。然后将排列的序列与来自目的细胞的特定核酸探针杂交。可以通过逆转录从目的细胞提取的RNA经由掺入荧光标记的的脱氧核苷酸产生荧光标记的cDNA探针。可选地，RNA可以通过体外转录进行扩增并且用标志物(例如生物素)标记。然后在高严格条件下将标记的探针与微芯片上固定的核酸杂交。在严格清洗以除去非特异性结合的探针后，通过共聚焦激光显微镜或通过另一种检测方法(例如CCD照相机)扫描芯片。一般地，杂交文件中的原始荧光强度数据用鲁棒多芯片均值(RMA)算法进行预处理以产生表达值。

定量实时PCR(qRT-PCR)也可以用于测量多个生物标志物的差异表达。在qRT-PCR中，通常将RNA模板逆转录为cDNA，然后cDNA经由PCR反应扩增。实时地逐个循环地追踪PCR产物的量，这允许确定mRNA的起始浓度。为了测量PCR产物的量，反应可以在结合双链DNA的荧光染料(例如SYBR Green)的存在下进行。反应还可以用特异于待扩增的DNA的荧光报告探针进行。荧光报告探针的非限制性实例是探针(Applied Biosystems，Foster City，CA)。当淬灭剂在PCR延伸循环期间除去时，荧光报告探针发出荧光。可以通过使用多个基因特异性报告探针进行多重qRT-PCR，其中每一个探针包含不同的荧光团。在各个循环期间记录荧光值并且荧光值代表扩增反应中扩增至该点的产物的量。为了使误差最小化并且降低任何样品间变异，通常使用参照标准进行QRT-PCR。理想的参照标准在不同的组织间以恒定水平表达，并且不受实验处理的影响。适当的参照标准包括但不限于持家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和β-肌动蛋白的mRNA。可以使用本领域公知的计算来测定起始样品中的mRNA水平或各个生物标志物的表达的倍数变化。

免疫组织化学染色也可以用于测量多个生物标志物的差异表达。该方法通过蛋白与特异性抗体的相互作用，允许确定蛋白在组织切片的细胞中的位置。对于该方法，组织可以在甲醛或另一种适当的固定剂中进行固定，在石蜡或塑料中进行包埋，并且用切片机切成薄片(厚度约0.1mm至几mm)。可选地，组织可以使用冰冻切片机(cryostat)进行冷冻并切成薄片。组织切片可以排列并且附着在固体表面上(即组织微阵列)。将组织切片与抗目的抗原的一抗一起温育，然后清洗以除去未结合的抗体。一抗可以偶联至检测系统，或一抗可以用与检测系统偶联的二抗检测。检测系统可以是荧光团或其可以是酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)，其可以将底物转化为比色、荧光或化学发光产物。通常在显微镜下扫描染色的组织切片。因为来自患有癌症的受试者的组织样品可能是异质的，即，一些细胞可能是正常细胞而其他细胞可能是癌细胞，所以可以测定组织中阳性染色的细胞的百分比。该测量，与染色强度的定量一起，可以用于产生生物标志物的表达值。

酶联免疫吸附测定或ELISA可以用于测量多个生物标志物的差异表达。存在许多ELISA测定的变种。所有的ELISA测定基于抗原或抗体在固体表面(一般是微量滴定板)上的固定。最初的ELISA方法包括制备包含目的生物标志物蛋白的样品，用所述样品包被微量滴定板的孔，将各个孔与识别特定抗原的一抗一起温育，洗掉未结合的抗体，然后检测抗体-抗原复合物。可以直接检测抗体-抗体复合物。为此，将一抗缀合至检测系统，例如产生可检测的产物的酶。可以间接地检测抗体-抗体复合物。为此，如上所述，通过与检测系统缀合的二抗来检测一抗。然后扫描微量滴定板并且原始强度数据可以用本领域已知的方法转化为表达值。

抗体微阵列也可以用于测量多个生物标志物的差异表达。为此，将多个抗体排列并且共价连接到微阵列或生物芯片的表面。通常用荧光染料标记包含目的生物标志物蛋白的蛋白质提取物。将标记的生物标志物蛋白质与抗体微阵列一起温育。在清洗以除去未结合的蛋白后，扫描微阵列。可以用本领域已知的方法将原始荧光强度数据转化为表达值。

Luminex multiplexing微球也可以用于测量多个生物标志物的差异表达。这些微小的聚苯乙烯珠用荧光染料进行内部颜色编码，从而每个珠具有独特的光谱特征(多达100种)。具有相同特征的珠用特定寡核苷酸或特定抗体进行标记，所述寡核苷酸或抗体将与目的靶(即分别地，生物标志物mRNA或蛋白)结合。所述靶依次还用荧光报告分子进行标记。因此，存在两种颜色来源，一种来自珠而另一种来自靶上的报告分子。然后将珠与包含靶的样品一起温育，在一个孔中可以检测到多达100种靶。珠的小的尺寸/表面面积和珠对靶的三维暴露在结合反应期间允许几乎液相的动力学。通过基于流式细胞术的高技术射流技术检测捕获的靶，其中激光激发识别各个珠的内部染料以及测定期间捕获的任何报告染料。可以用本领域已知的方法将来自采集文件的数据转化为表达值。

原位杂交也可以用于测量多个生物标志物的差异表达。该方法允许定位组织切片的细胞中的目的mRNA。为此，组织可以进行冷冻或固定，并且包埋，然后切成薄片(其进行排列并且附着到固体表面)。组织切片与标记的反义探针(其与目的mRNA杂交)一起温育。通常在高严格条件下进行杂交和清洗步骤。探针可以用荧光团或小的标签(例如生物素或地高辛)进行标记，所述标签可以通过另一种蛋白或抗体检测，从而标记的杂交物可以在显微镜下进行检测和可视化。可以同时检测多种mRNA，只要各个反义探针具有可区分的标记。一般地，在显微镜下扫描杂交的组织阵列。因为来自患有癌症的受试者的组织样品可能是异质的，即，一些细胞可能是正常细胞而其他细胞可能是癌细胞，所以可以测定组织中阳性染色的细胞的百分比。该测量结果，与染色强度的定量一起，可以用于产生各个生物标志物的表达值。

在来自患有癌症的受试者的细胞样品中测量其表达的生物标志物的数量可以变化。因为预测的存活评分基于生物标志物的差异表达，当测量更多的生物标志物的表达时，将获得更高的准确度。

从患有癌症的受试者获得细胞样品

在来自患有癌症的受试者的细胞样品中测量多个生物标志物的表达。癌症的类型和分类可以并且将不同。癌症可以是早期癌症，即I期或II期，或其可以是晚期癌症，即III期或IV期。

一般地，可以通过活组织检查或手术切除从患有癌症的受试者获得细胞样品或组织样品。活组织检查的类型可以并且将不同，这取决于癌症的位置和性质。可以通过针吸活检取出细胞、组织或体液样品。为此，连接到注射器的细针刺穿皮肤并且插入目的器官或组织。一般地，用超声或计算机断层(CT)成像指导针到达目的区域。当针插入组织中时，用注射器产生真空，从而细胞或体液可以通过针吸取并且收集到注射器中。还可以通过切取或核心活检取出细胞或组织样品。为此，从目的区域取出锥形、圆柱形或微小的组织。通常用CT成像、超声或内窥镜指导这类活组织检查。最后，可以通过切除活检或手术切除取出整个癌损伤。

一旦从患有癌症的受试者中取出了细胞样品或组织样品，就可以用本领域公知的和标准分子生物学参考书(例如Ausubel等，(2003)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY)中公开的技术处理所述样品以分离RNA或蛋白。还可以保存或迅速冷冻组织样品并且在-80℃贮存备用。还可以用固定剂，例如甲醛、多聚甲醛或乙酸/乙醇固定活组织检查的组织样品。可以将固定的组织样品包埋到蜡(石蜡)或塑料树脂中。可以将包埋的组织样品(或冷冻组织样品)切成薄片。也可以从固定的或石蜡包埋的组织样品中提取RNA或蛋白。

患有癌症的受试者通常是哺乳动物受试者。哺乳动物可以包括灵长类动物、家畜动物和伴侣动物。非限制性实例包括：灵长类动物可以包括人、猿、猴子和长臂猿；家畜动物可以包括马、牛、山羊、绵羊、鹿和猪；伴侣动物可以包括狗、猫、兔和啮齿类动物(包括小鼠、大鼠和豚鼠)。在示例性实施方案中，受试者是人。

产生风险评分

本发明的生物标志物与癌症存活有关。多个此类生物标志物的不同的表达模式可以用于预测患有癌症的受试者的存活结果。某些生物标志物倾向于在长期存活者中过表达而其他生物标志物倾向于在短期存活者中过表达。受试者中多个生物标志物的独特的表达模式(即表达特征)可以用于产生存活的风险评分。具有高风险评分的受试者在手术切除后可能具有短的存活时间(＜2年)。具有低风险评分的受试者在手术切除后可能具有较长的存活时间(＞5年)。

无论用于测量多个生物标志物的差异表达的技术，通常将各个生物标志物的表达转换为表达值。然后，利用本领域公知的统计方法，将这些表达值用于计算患有癌症的受试者的存活的风险评分。可使用主成分分析法计算风险评分。还可以利用单变量Cox回归分析计算风险评分。在一个优选的实施方案中，可以利用部分Cox回归分析计算风险评分。

通过部分Cox回归分析产生的评分分为两组：1)具有正值的评分；和2)具有负值的评分。具有正值的风险评分与短的存活时间相关，而具有负值的风险评分与长的存活时间相关。

在该方法的一个实施方案中，可以通过手术切除从患有早期癌症的受试者中取出组织样品。组织样品可以保存在RNAlater中或进行快速冷冻，从而可以在之后进行RNA分离。RNA可以用作qRT-PCR的模板，在所述QRT-PCR中分析多个生物标志物的表达，并且利用部分Cox回归分类法，将表达数据用于推导风险评分。风险评分可以用于预测受试者是短期的还是长期的癌症存活者。

在该方法的特别优选的实施方案中，可以从患有早期癌症的受试者采集组织样品。可以从所述组织分离RNA并且将其用于产生标记的探针以用于核酸微阵列分析。利用部分Cox回归分类法，从微阵列分析产生的表达值可以用于推导风险评分。风险评分可以用于预测受试者是短期的还是长期的癌症存活者。

用于确定患有癌症的受试者的预后的方法

本发明的另一个方面提供用于确定患有癌症的受试者的预后的方法。所述方法包括测量来自受试者的细胞样品中一个或多个生物标志物的差异表达。将各个生物标志物的差异表达转换为表达值，并且如上所述，利用统计方法，将表达值用于推导受试者的评分。具有正值的评分表示不良预后或不良结果，而具有负值的评分表示良好预后或良好结果。

在该方法的一个实施方案中，通过核酸微阵列分析产生患有早期癌症的受试者的表达特征，并且将表达值用于计算评分。计算的评分可以用于预测受试者将具有癌症结果的良好预后还是不良预后。

用于选择用于患有癌症的受试者的治疗的方法

本发明的另一个方面提供用于选择用于患有癌症的受试者的有效治疗的方法。在计算出受试者的风险评分后，该信息可以用于决定对于受试者适当的疗程。具有正风险评分(即短的存活时间或不良预后)的受试者可能受益于侵入性治疗方案。侵入性治疗方案可以包括一种或多种适当的化学治疗剂。侵入性治疗方案还可以包括放射治疗。治疗方案可以并且将不同，这取决于癌症的类型和分期。具有负风险评分(即长的存活时间或良好预后)的受试者可能不需要额外的治疗，因为受试者不太可能发生复发的癌症。

在其中一种或多种试剂抑制微RNA的表达或活性，抑制微RNA的一种或多种靶基因的表达，或抑制其组合的条件下维持细胞，从而抑制细胞的增殖。

还提供鉴定可用于抑制癌细胞的增殖的试剂的方法。所述方法包括将一种或多种微RNA与待评估的试剂接触；将一种或多种微RNA的一种或多种靶基因与待评估的试剂接触；或接触其组合。如果微RNA的表达在所述试剂存在的情况下被抑制；或如果靶基因的表达在所述试剂存在的情况下增加，或在所述试剂存在的情况下发生其组合，那么所述试剂可用于抑制滤泡性甲状腺癌细胞的增殖。

鉴定治疗剂的方法

本文还提供鉴定可用于治疗CRC的试剂的方法。所述方法包括将一种或多种微RNA与待评估的试剂接触；接触一种或多种微RNA的一种或多种靶基因；或接触其组合。如果微RNA的表达在所述试剂存在的情况下被抑制；或如果靶基因的表达在所述试剂存在的情况下增加，或在所述试剂存在的情况下发生其组合，那么所述试剂可用于抑制滤泡性甲状腺癌细胞的增殖。

可以在本文提供的方法中进行评估的试剂包括miRNA抑制剂。所述试剂的其他实例包括药剂、药物、化学化合物、离子化合物、有机化合物、有机配体(包括辅因子)、糖类、重组和合成肽、蛋白质、类肽、核酸序列(包括基因)、核酸产物、以及抗体和其抗原结合片段。可以单独筛选所述试剂，或可以根据本文的方法同时检测一种或多种化合物。可以检测通过组合化学合成或其他方法产生的化合物(例如有机化合物、重组或合成肽、类肽、核酸)的大的组合文库。当从组合文库选择的化合物携带独特的标签时，通过层析方法鉴定单独的化合物是可能的。还可以根据本文的方法检测(筛选)化学文库、微生物肉汤和噬菌体展示文库。

用于预测患癌症的受试者的存活或预后的试剂盒

本发明的另一个方面提供用于预测患有癌症的受试者的存活或预后的试剂盒。试剂盒包括用于测量一个或多个生物标志物的差异表达的多种试剂，用于将表达数据转换为表达值的方法和用于分析表达值以产生预测存活或预后的评分的方法。试剂盒中用于测量生物标志物表达的试剂可包括一系列与生物标志物的mRNA互补的多核苷酸。在另一个实施方案中，试剂盒中用于测量生物标志物表达的试剂可包括用于qRT-PCR的多个PCR探针和/或引物。

本发明还涉及用于检测个体中的CRC的试剂盒，其包括一种或多种试剂，所述试剂用于检测1)一种或多种微RNA；2)一种或多种微RNA的一种或多种靶基因；3)由靶基因表达的一种或多种多肽，或4)其组合。例如，试剂盒可以包括杂交探针、限制性酶(例如用于RFLP分析)，等位基因特异性寡核苷酸，和与靶基因表达的多肽结合的抗体。

在特定的实施方案中，试剂盒至少包括连续的核苷酸序列，所述核苷酸序列基本上或完全与一种或多种微RNA的区域互补。在一个实施方案中，标记试剂盒中的一种或多种试剂，并且因此，试剂盒可以进一步包括能够检测所述标记的试剂。试剂盒可以进一步包括使用所述试剂盒的组分检测CRC的说明书。

核酸阵列

本发明的另一个方面提供核酸阵列，所述核酸阵列包含与本发明的生物标志物的mRNA杂交的多核苷酸。一般而言，核酸阵列由具有至少一个地址的基质组成。核酸阵列是本领域公知的，而且包含核酸阵列的基质也是本领域公知的。基质材料的非限制性实例包括玻璃和塑料。基质可以塑造成载玻片或芯片(即四边形)，或者可选地，基质可以塑造成孔。

本发明的阵列由至少一个地址组成，其中地址之上已布置了可以与本发明的生物标志物的mRNA杂交的核酸。在一个实施方案中，阵列由多个地址组成，其中各个地址之上已布置了可以与生物标志物的mRNA杂交的核酸，所述生物标志物用于预测患有肺癌的受试者的存活。阵列还可以包含一个或多个这样的地址，其中所述地址之上已经布置了对照核酸。对照可以是内部对照(即阵列本身的对照)和/或外部对照(即应用于阵列的样品的对照)。一般地，阵列包含约1至约10,000个地址。在一个实施方案中，阵列包含约10至约8,000个地址。在另一个实施方案中，阵列包含不多于500个地址。在一个可选的实施方案中，阵列包含不少于500个地址。使用核酸阵列的方法是本领域公知的。

使用方法

在一个方面，本文提供诊断受试者是否患有MM和/或MGUS或处于发生所述疾病的风险中的方法，其包括测量来自受试者的测试样品中至少一个基因产物的水平和将测试样品中所述基因产物的水平与对照样品中相应的基因产物的水平相比较。如本文所用的，″受试者″可以是任何哺乳动物，所述哺乳动物患有或怀疑患有MM和/或MGUS。在特定的实施方案中，受试者是患有或怀疑患有MM和/或MGUS的人。

可在从受试者获得的生物样品的细胞中，测量至少一种基因产物的水平。例如，可通过常规取样技术，从怀疑患有相关的MM和/或MGUS的受试者中取出组织样品。在另一个实例中，可从受试者中取出血液样品，并且可通过标准技术分离白细胞以用于DNA提取。优选在开始放射疗法、化学疗法或其它疗法之前从受试者获得血液或组织样品。可从受试者的未受影响的组织、从正常人个体或正常个体的群体或从相应于受试者的样品的大部分细胞的培养细胞获得相应的对照组织或血液样品。然后将对照组织或血液样品与来自受试者的样品一起进行处理，以便可将从来自受试者的样品的细胞中给定的基因产生的基因产物的水平与来自对照样品的细胞的相应的基因产物的水平进行比较。

与对照样品中相应的基因产物的水平相比，获自受试者的样品中基因产物的水平的变化(即增加或减少)表示受试者中存在MM和/或MGUS。在一个实施方案中，测试样品中至少一种基因产物水平高于对照样品中相应的基因产物的水平(即，基因产物的表达“上调”)。如本文中所使用的，当来自受试者的细胞或组织样品中基因产物的量大于对照细胞或组织样品中相同基因产物的量时，基因产物的表达“上调”。在另一个实施方案中，测试样品中至少一种基因产物的水平低于对照样品中相应基因产物的水平(即，基因产物的表达“下调”)。如本文中所使用的，当从来自受试者的细胞或组织样品中的该基因产生的基因产物的量低于从对照细胞或组织样品中的相同基因产生的量时，基因的表达“下调”。可根据一个或多个RNA表达标准确定对照和正常样品中的相对基因表达。所述标准可包括例如0基因表达水平、标准细胞系中的基因表达水平、或之前从正常人对照群体获得的基因表达的平均水平。

可使用适合用于检测生物样品中RNA表达水平的任何技术测量样品中基因产物的水平。适用于测定来自生物样品的细胞中的RNA表达水平的技术(例如，Northern印迹分析、RT-PCR、原位杂交)对于本领域技术人员来说是熟知的。在特定的实施方案中，使用Northern印迹分析检测至少一种基因产物的水平。例如，可通过在核酸提取缓冲液存在的情况下进行匀浆，接着进行离心来从细胞纯化总的细胞RNA。沉淀核酸，然后通过用DNA酶处理和沉淀来除去DNA。然后按照标准技术在琼脂糖凝胶上通过凝胶电泳分离RNA分子，并将其转移至硝酸纤维素滤器。然后通过加热将RNA固定在滤器上。使用适当标记的与所述RNA互补的DNA或RNA探针进行特定RNA的检测和定量。参见，例如，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等人，eds.，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapter 7，其全部公开内容通过引用合并入本文。

可以根据给定的基因产物的核酸序列产生适用于给定的基因产物的Northern印迹杂交的探针。标记的DNA和RNA探针的制备方法以及用于其与靶核苷酸序列杂交的条件描述于Molecular Cloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等人，eds.，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，Chapters 10和11，其公开内容通过引用合并入本文。

例如，可用例如放射性核素例如³H、³²P、³³P、¹⁴C或³⁵S；重金属；或能够用作已标记的配体的特异性结合对成员的配体(例如，生物素、抗生物素蛋白或抗体)、荧光分子、化学发光分子、酶等来标记核酸探针。

可通过Rigby等人(1977)，J.Mol.Biol.113：237-251的切口平移法或Fienberg等人(1983)，Anal.Biochem.132：6-13的随机引物法(其全部公开内容通过引用合并入本文)将探针标记至高比放射性(specificactivity)。后者是选择用于从单链DNA或从RNA模板合成高比放射性的³²P-标记的探针的方法。例如，按照切口平移法通过用高放射性的核苷酸置换预先存在的核苷酸，可能制备具有大大超过10⁸cpm/微克的比放射性的³²P-标记的核酸探针。然后可通过将杂交滤器暴露于照相胶片来进行杂交的放射自显影检测。暴露于杂交滤器的照相胶片的光密度扫描提供了基因转录物水平的精确测量。使用另一个方法，可通过计算机化的成像系统例如可从Amersham Biosciences，Piscataway，NJ获得的Molecular Dynamics 400-B 2D Phosphorimager定量基因转录物水平。

当不能进行DNA或RNA探针的放射性核素标记时，可使用随机引物法将类似物例如dTTP类似物5-(N-(N-生物素基-ε-氨基己酰基)-3-氨基烯丙基)脱氧尿苷三磷酸掺入探针分子。可通过与结合生物素的蛋白质例如偶联至荧光染料或产生颜色反应的酶的抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和抗体(例如抗生物素抗体)反应来检测生物素化的探针寡核苷酸。

除了Northern和其它RNA杂交技术外，可使用原位杂交技术来测定RNA转录物的水平。该技术需要比Northern印迹技术更少的细胞，其包括将整个细胞置于显微镜盖玻片上和用含有放射性标记的或另外标记的核酸(例如，cDNA或RNA)探针的溶液探测细胞的核酸含量。该技术特别适合用于分析来自受试者的组织活组织检查样品。原位杂交技术的实施在美国专利5,427,916(其全部公开内容通过引用合并入本文)中进行了更详细的描述。用于给定的基因产物的原位杂交的合适的探针可根据核酸序列产生。

细胞中基因转录物的相对数目还可通过对基因转录物进行逆转录，然后通过聚合酶链式反应扩增经逆转录的转录物(RT-PCR)来进行测定。可通过与内部标准例如存在于相同样品中的来自“持家”基因的mRNA的水平相比较来定量基因转录物的水平。用作内部标准的合适的“持家”基因包括例如，肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于定量RT-PCR和其变型的方法在本领域技术人员的能力之内。

在一些情况下，可能期望同时测定样品中多个不同基因产物的表达水平。在其它情况下，可能期望测定与癌症关联的所有已知基因的转录物的表达水平。评估数百种基因的癌症特异性表达水平非常费时，并且需要大量的总RNA(对于每一个Northern印迹需要至少20μg)和需要放射性同位素的放射自显影技术。

为了克服这些限制，可构建以微芯片形式(即，微阵列)存在的寡核苷酸文库，该文库包含一组特异于一组基因或基因产物的探针寡脱氧核苷酸。使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，将它们与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交以产生杂交特征谱或表达特征谱，来测定生物样品中多个微RNA的表达水平。然后将测试样品的杂交特征谱与对照样品的杂交特征谱比较，从而确定具有改变的表达水平的微RNA。如本文中所使用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”是指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”是指待检测(例如，通过杂交)的分子。“特异性探针寡核苷酸”或“特异于基因产物的探针寡核苷酸”是指具有选择用于与特定基因产物或特定基因产物的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。

特定样品的“表达特征谱”或“杂交特征谱”本质上是样品的状态指纹；虽然两种状态可能具有相似表达的任何特定基因，但同时评价大量基因允许产生对于细胞的状态是独特的基因表达特征谱。即，正常细胞可与MM和/或MGUS细胞相区别，并且在MM和/或MGUS细胞内，可确定不同的预后状态(例如，良好的或不良的长期存活希望)。通过比较不同状态中MM和/或MGUS细胞的表达特征谱，获得关于在这些状态的每一个状态中为重要的基因的信息(包括基因的上调或下调)。在MM和/或MGUS细胞或正常细胞中差异表达的序列的鉴定以及导致不同预后结果的差异表达允许以许多方法使用该信息。例如，可评估特定的治疗方案(例如，确定化疗药物是否改善特定患者的长期预后)。类似地，可通过将患者样品与已知的表达特征谱比较来进行或确认诊断。此外，这些基因表达特征谱(或个体基因)允许筛选抑制MM和/或MGUS表达特征谱或将不良预后特征谱转变成更好的预后特征谱的药物候选物。

因此，本发明提供诊断受试者是否患有MM和/或MGUS或处于发生所述疾病的风险中的方法，其包括逆转录来自从受试者获得的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，使所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱，和将测试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱比较，其中至少一个miRNA的信号的改变表示受试者患有MM和/或MGUS或处于发生所述疾病的风险中。

本发明还提供诊断与一种或多种预后标志物有关的MM和/或MGUS的方法，其包括测量来自受试者的MM和/或MGUS测试样品中至少一个基因产物的水平和将MM和/或MGUS测试样品中所述至少一个基因产物的水平与对照样品中相应的基因产物的水平比较。与对照样品相比，测试样品中至少一个基因产物的信号的改变(例如增加，减少)表示受试者患有与一种或多种预后标志物有关的MM和/或MGUS，或者处于发生所述疾病的风险中。

MM和/或MGUS可以与一种或多种预后标志物或特征(包括与不良(即消极)预后有关的标志物，或与良好(即积极)预后有关的标志物)有关。在某些实施方案中，使用本文描述的方法诊断的MM和/或MGUS与一种或多种不良预后特征有关。

本文描述了其表达在与这些预后标志物的每一种有关的MM和/或MGUS细胞中改变的特定的微RNA。在一个实施方案中，通过下述测量至少一种基因产物的水平：逆转录来自从受试者获得的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸，将靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱，和将测试样品杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较。

不希望受任何理论束缚，据信，细胞中一种或多种基因产物水平的改变可导致这些基因产物的一种或多种预期的靶失调，这可导致MM和/或MGUS形成。因此，改变基因产物水平(例如，通过减少在MM和/或MGUS细胞中上调的基因产物的水平，通过增加在癌细胞中下调的基因产物的水平)可成功地治疗MM和/或MGUS。本文描述了在MM和/或MGUS细胞中失调的基因产物的推定基因靶的实例。

因此，本发明包括治疗受试者的MM和/或MGUS的方法，其中至少一种基因产物在受试者的癌细胞中失调(例如，下调、上调)。当至少一种分离的基因产物在MM和/或MGUS细胞中下调时，该方法包括施用有效量的所述至少一种分离的基因产物，从而抑制受试者中癌细胞的增殖。当至少一种分离的基因产物在癌细胞中上调时，该方法包括给受试者施用有效量的抑制所述至少一种基因的表达的至少一种化合物(在本文称为基因表达抑制化合物)，从而抑制MM和/或MGUS细胞的增殖。

如本文中所使用的，术语“治疗”、“医治”和“疗法”是指改善与疾病或病况例如MM和/或MGUS相关的症状，包括预防或延迟疾病症状的发作，和/或减少疾病或病况的症状的严重性或频率。术语“受试者”和“个体”在本文中定义为包括动物例如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛科、羊科、马科、犬科、猫科、啮齿目或鼠科物种。在优选实施方案中，动物是人。

如本文中所使用的，分离的基因产物的“有效量”是足以在患有MM和/或MGUS L的受试者中抑制癌细胞增殖的量。通过考虑因素例如受试者的大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的基因产物的有效量。

例如，分离的基因产物的有效量可基于待治疗的受试者的大致或估计的体重。优选，如本文中所描述的，胃肠外或肠内施用这样的有效量。例如，对受试者施用的分离的基因产物的有效量可在大约5-3000微克/kg体重、大约700-1000微克/kg体重的范围内或大于大约1000微克/kg体重。

本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用分离的基因产物的合适的给药方案。例如，可对受试者施用一次(例如，作为单次注射或沉积(deposition))基因产物。或者，可以每天1次或2次对受试者施用基因产物，进行大约3至大约28天，特别地大约7至大约10天的时期。在特定的给药方案中，每天1次施用基因产物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，应理解，对受试者施用的基因产物的有效量可包括在整个给药方案中施用的基因产物的总量。

如本文中使用的，“分离的”基因产物是合成的或通过人工介入从天然状态改变或取出的基因产物。例如，合成的基因产物，或部分或完全从其天然状态的共存材料分离的基因产物被认为是“分离的”。分离的基因产物可以以大体上纯化的形式存在，或可以存在于已将所述基因产物递送入其中的细胞中。因此，有意地被递送至细胞或在细胞中表达的基因产物被认为是“分离的”基因产物。在细胞内从前体分子产生的基因产物也被认为是“分离的”分子。

分离的基因产物可使用许多标准技术获得。例如，可使用本领域已知的方法化学合成或重组产生基因产物。在一个实施方案中，使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪化学合成基因产物。合成的RNA分子或合成试剂的提供商包括例如Proligo (Hamburg，Germany)、Dharmacon Research(Lafayette，CO，U.S.A.)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，IL，U.S.A.)、Glen Research(Sterling，VA，U.S.A.)、ChemGenes(Ashland，MA，U.S.A.)和Cruachem(Glasgow，UK)。

可选地，可使用任何合适的启动子从重组环形或线性DNA质粒表达基因产物。用于从质粒表达RNA的合适的启动子包括例如U6或H1RNA pol III启动子序列或巨细胞病毒启动子。其它合适启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组质粒还可包括用于在癌细胞中表达基因产物的诱导型或可调控的启动子。

可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组质粒表达的基因产物。还可将从重组质粒表达的基因产物递送至癌细胞并且在其中直接表达。下面更详细地论述重组质粒将基因产物递送至癌细胞的用途。

基因产物可从分开的重组质粒表达，或它们可从相同的重组质粒表达。在一个实施方案中，基因产物从单个质粒表达为RNA前体分子，然后通过合适的加工系统(包括但不限于癌细胞中现有的加工系统)将该前体分子加工成功能性基因产物。其它合适的加工系统包括例如体外果蝇细胞裂解物系统(例如，如属于Tuschl等人的美国公开专利申请2002/0086356中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文)和大肠杆菌RNA酶III系统(例如，如属于Yang等人的美国公开专利申请2004/0014113中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文)。

适合用于表达基因产物的质粒的选择、用于将核酸序列插入质粒以表达基因产物的方法以及将重组质粒递送至目的细胞的方法在本领域技术人员的能力之内。参见，例如，Zeng等人(2002)，Molecular Cell 9：1327-1333；Tuschl(2002)，Nat.Biotechnol，20：446-448；Brummelkamp等人(2002)，Science 296：550-553；Miyagishi等人(2002)，Nat.Biotechnol.20：497-500；Paddison等人(2002)，Genes Dev.16：948-958；Lee等人(2002)，Nat.Biotechnol.20：500-505；和Paul等人(2002)，Nat.Biotechnol.20：505-508，其全部公开内容通过引用合并入本文。

在一个实施方案中，表达基因产物的质粒包含在CMV立即早期启动子(intermediate-early promoter)控制下编码前体RNA的序列。如本文中所使用的，“在启动子的控制下”是指编码基因产物的核酸序列位于启动子的3′端，以便启动子可起始基因产物编码序列的转录。

基因产物还可从重组病毒载体表达。预期基因产物可从两个分开的重组病毒载体或从相同的病毒载体表达。可通过标准技术从培养的细胞表达系统分离从重组病毒载体表达的RNA或所述RNA可在癌细胞中直接表达。下面更详细地论述重组病毒载体将基因产物递送至癌细胞的用途。

本发明的重组病毒载体包含编码基因产物的序列和用于表达RNA序列的任何合适的启动子。合适的启动子包括例如U6或H1 RNA polIII启动子序列，或巨细胞病毒启动子。其它合适的启动子的选择在本领域技术人员的能力之内。本发明的重组病毒载体还可包含用于在癌细胞中表达基因产物的诱导型或可调控的启动子。

可使用能够接受基因产物的编码序列的任何病毒载体；例如，来源于腺病毒(AV)、腺伴随病毒(AAV)、逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒(Rhabdoviruses)、鼠白血病病毒)、疱疹病毒等的载体。可通过用来自其它病毒的包膜蛋白或其它表面抗原假型化载体或通过置换不同的病毒衣壳蛋白(如果合适)来改变病毒载体的趋向性。

例如，可用来自水泡性口膜炎病毒(VSV)、狂犬病病毒(rabies)、埃博拉病毒(Ebola)、莫科拉病毒(Mokola)等的表面蛋白假型化本发明的慢病毒载体。可通过对载体进行工程改造以表达不同的衣壳蛋白血清型来制备本发明的AAV载体，使之靶向不同的细胞。例如，表达血清型2型基因组上的血清型2型衣壳的AAV载体称为AAV 2/2。AAV 2/2载体中的该血清型2型衣壳基因可用血清型5型衣壳基因替换，从而产生AAV 2/5载体。用于构建表达不同衣壳蛋白血清型的AAV载体的技术在本领域技术人员的能力之内；参见，例如，Rabinowitz，J.E.，等人(2002)，J.Virol.76：791-801，其全部公开内容通过引用合并入本文。

适合用于本发明的重组病毒载体的选择、用于将用于表达RNA的核酸序列插入载体的方法、将病毒载体递送至目的细胞的方法和表达的RNA产物的回收在本领域技术人员的能力之内。参见，例如，Dornburg(1995)，Gene Therap.2：301-310；Eglitis(1988)，Biotechniques 6：608-614；Miller(1990)，Hum.Gene Therap.1：5-14；和Anderson(1998)，Nature 392：25-30，其全部公开内容通过引用合并入本文。

在某些实施方案中，合适的病毒载体是来源于AV和AAV的载体。用于表达基因产物的合适的AV载体、用于构建重组AV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Xia等人(2002)，Nat.Biotech.20：1006-1010，其全部公开内容通过引用合并入本文。用于表达基因产物的合适的AAV载体、用于构建重组AAV载体的方法以及用于将载体递送至靶细胞的方法描述于Samulski等人(1987)，J.Virol.61：3096-3101；Fisher等人(1996)，J.Virol，70：520-532；Samulski等人(1989)，J.Virol.63：3822-3826；美国专利5,252,479；美国专利5,139,941；国际专利申请WO 94/13788；和国际专利申请WO93/24641，其全部公开内容通过引用合并入本文。

在某些实施方案中，本发明的重组AAV病毒载体包含在人U6 RNA启动子控制下的与polyT终止序列有效连接的编码前体RNA的核酸序列。如本文中所使用的，“与polyT终止序列有效连接”是指编码有义或反义链的核酸序列以5′方向与polyT终止信号紧密邻接。在从载体转录序列的过程中，polyT终止信号用于终止转录。

在本发明的治疗方法的其它实施方案中，还可对受试者施用有效量的至少一种抑制表达的化合物。如本文中所使用的，“抑制基因表达”是指治疗后基因产物的活性成熟形式的产量低于治疗前产生的量。通过使用例如上述用于诊断方法的测定转录物水平的技术，本领域技术人员可容易地确定表达在癌细胞中是否已被抑制。抑制可在基因表达的水平上(即，通过抑制编码基因产物的基因的转录)或在加工的水平上(例如，通过抑制前体至成熟的活性基因产物的加工)发生。

如本文中所使用的，抑制表达的化合物的“有效量”是足以在患有与癌症相关染色体特征相关的癌症的受试者中抑制癌细胞的增殖的量。通过考虑因素，例如受试者的大小和体重、疾病侵入的程度、受试者的年龄、健康和性别、施用的途径以及施用是局部的还是全身性的，本领域技术人员可容易地确定对给定的受试者施用的抑制表达的化合物的有效量。

例如，抑制表达的化合物的有效量可基于待治疗的受试者的大致或估计的体重。特别地，如本文中所描述的，胃肠外或肠内施用这样的有效量。例如，对受试者施用的抑制表达的化合物的有效量可在大约5-3000微克/kg体重、大约700-1000微克/kg体重的范围内或其可以大于大约1000微克/kg体重。

本领域技术人员还可容易地确定用于对给定的受试者施用抑制表达的化合物的适当的给药方案。例如，可对受试者施用一次(例如，作为单次注射或沉积)抑制表达的化合物。可选地，可以每天1次或2次对受试者施用抑制表达的化合物，进行大约3至大约28天，更优选地大约7至大约10天的时期。在特定的给药方案中，每天1次施用抑制表达的化合物，进行7天。当给药方案包括多次施用时，应理解，对受试者施用的抑制表达的化合物的有效量可包括在整个给药方案中施用的化合物的总量。

用于抑制表达的合适的化合物包括双链RNA(例如短或小干扰RNA或“siRNA””)、反义核酸和酶促RNA分子例如核酶。这些化合物中的每一种可被靶向给定的基因产物，并且破坏靶基因产物或诱导靶基因产物的破坏。

例如，给定的基因的表达可通过用分离的双链RNA(“dsRNA”)分子诱导基因的RNA干扰来抑制，所述双链RNA分子与基因产物的至少一部分具有至少90％、例如至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同源性。在具体的实施方案中，dsRNA分子是“短或小干扰RNA”或“siRNA”。

用于本方法的siRNA包括长度大约17个核苷酸至大约29个核苷酸、优选长度大约19至大约25个核苷酸的短双链RNA。siRNA包含通过标准Watson-Crick碱基配对相互作用(在下文中“碱基配对”)退火在一起的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包含与靶基因产物内包含的核酸序列大体上同一的核酸序列。

如本文中所使用的，siRNA中与靶mRNA内包含的靶序列“大体上同一”的核酸序列是与靶序列同一的核酸序列或与靶序列相异于1或2个核苷酸的核酸序列。siRNA的有义和反义链可包括两个互补的单链RNA分子或可包括其中两个互补部分碱基配对并且通过单链“发夹结构”区域共价连接的单个分子。

siRNA还可以是与天然存在的RNA相异于一个或多个核苷酸的添加、缺失、置换和/或改变的经改变的RNA。这样的改变可包括非核苷酸材料的添加，例如至siRNA的末端或至siRNA的一个或多个内部核苷酸的添加，或使siRNA抵抗核酸酶降解的修饰或用脱氧核糖核苷酸对siRNA中的一个或多个核苷酸的置换。

siRNA的一条或两条链还可包含3′突出端。如本文中所用的，“3′突出端”是指从双链RNA链的3′-末端延伸的至少一个未配对的核苷酸。因此，在某些实施方案中，siRNA包含至少一个长度为1至大约6个核苷酸(其包括核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)、长度为1至大约5个核苷酸、长度为1至大约4个核苷酸或长度为大约2至大约4个核苷酸的3′突出端。在特定的实施方案中，3′突出端存在于siRNA的两条链上，且其长度为2个核苷酸。例如，siRNA的各条链可包含二胸苷酸(“TT”)或二尿苷酸(“uu”)的3′突出端。

siRNA可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分离的基因产物所描述的。

用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于属于Gewirtz的美国公开专利申请2002/0173478和属于Reich等人的美国公开专利申请2004/0018176，其全部公开内容通过引用合并入本文。

给定的基因的表达还可通过反义核酸抑制。如本文中所使用的，“反义核酸”是指通过RNA-RNA或RNA-DNA或RNA-肽核酸相互作用与靶RNA结合的核酸分子，其改变靶RNA的活性。适合用于本方法的反义核酸是通常包含与基因产物中的连续核酸序列互补的核酸序列的单链核酸(例如，RNA、DNA、RNA-DNA嵌合物、PNA)。反义核酸可包含与基因产物中的连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补或95-100％互补的核酸序列。本文提供了基因产物的核酸序列。不希望受任何理论束缚，据信，反义核酸激活RNA酶H或降解基因产物/反义核酸双链体的另一种细胞核酸酶。

反义核酸还可包含对核酸主链或对糖和碱基部分(或它们的等价物)的修饰，从而增加靶特异性、核酸酶抗性、递送或与分子的功效相关的其它性质。此类修饰包括胆固醇部分、双链体插入剂例如吖啶或一种或多种抗核酸酶基团。

反义核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分离的基因产物所描述的。用于产生和检测的示例性方法在本领域技术人员的能力之内；参见，例如，Stein和Cheng(1993)，Science 261：1004以及属于Woolf等人的美国专利5,849,902，其全部公开内容通过引用合并入本文。

给定的基因的表达还可通过酶促核酸(enzymatic nucleic acid)抑制。如本文中所使用的“酶促核酸”是指包含与基因产物的连续核酸序列具有互补性的底物结合区并且能够特异性切割基因产物的核酸。酶促核酸底物结合区可以例如与基因产物中的连续核酸序列50-100％互补、75-100％互补或95-100％互补。酶促核酸还可包括在碱基、糖和/或磷酸基团上的修饰。用于本方法的示例性酶促核酸是核酶。

酶促核酸可通过化学或生物方法产生，或可从重组质粒或病毒载体表达，如上文对分离的基因产物所描述的。用于产生和检测dsRNA或siRNA分子的示例性方法描述于Werner和Uhlenbeck(1995)，Nucl.Acids Res.23：2092-96；Hammann等人(1999)，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev.9：25-31；以及属于Cech等人的美国专利4,987,071，其全部公开内容通过引用合并入本文。

至少一种基因产物或至少一种用于抑制表达的化合物的施用将在患有与癌症相关染色体特征有关的癌症的受试者中抑制癌细胞的增殖。如本文中所使用的，“抑制癌细胞的增殖”是指杀死细胞或永久性或暂时地阻止或减缓细胞的生长。如果受试者中癌细胞的数目在施用基因产物或基因表达抑制化合物后保持恒定或减少，那么可推断癌细胞增殖被抑制。如果癌细胞的绝对数目增加但肿瘤生长的速度下降，则也可推断癌细胞增殖被抑制。

受试者体内的癌细胞数目可通过直接测量或通过对原发性或转移性肿瘤块的大小的估计来确定。例如，受试者中癌细胞的数目可通过免疫组织学方法、流式细胞术或经设计用于检测癌细胞的特征表面标志物的其它技术来测量。

可通过适合用于将此类化合物递送至受试者的癌细胞的任何方法来对受试者施用基因产物或基因表达抑制化合物。例如，可通过适合于用此类化合物或用包含编码此类化合物的序列的核酸转染受试者的细胞的方法来施用基因产物或抑制表达的化合物。在一个实施方案中，用包含编码至少一种基因产物或基因表达抑制化合物的序列的质粒或病毒载体转染细胞。

用于真核细胞的转染方法在本领域内是公知的，其包括例如核酸至细胞的细胞核或前核的直接注射；电穿孔；脂质体转移或通过亲脂材料介导的转移；受体介导的核酸递送、微粒轰击(bioballistic)或颗粒加速；磷酸钙沉淀以及由病毒载体介导的转染。

例如，可用脂质体转移化合物例如DOTAP(N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵，Boehringer-Mannheim)或等价物例如LIPOFECTIN转染细胞。使用的核酸的量对于本发明的实施不是至关重要的；可接受的结果可使用0.1-100微克核酸/10⁵个细胞来获得。例如，可使用在3微克DOTAP中的约0.5微克质粒载体/10⁵个细胞的比率。

还可通过任何合适的肠内或胃肠外施用途径对受试者施用基因产物或基因表达抑制化合物。用于本方法的合适的肠内施用途径包括例如口服、直肠或鼻内给药。合适的胃肠外施用途径包括例如血管内给药(例如，静脉内团注(bolus injection)、静脉内输注、动脉内团注、动脉内输注和至脉管系统内的导管滴注)；组织外周(peri-tissue)和组织内注射(例如，肿瘤外周和肿瘤内注射，视网膜内注射或视网膜下注射)；皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如通过渗透泵)；对目的组织的直接施用，例如通过导管或其它安置装置(例如，视网膜丸剂(retinal pellet)或栓剂或包含多孔的、无孔的或凝胶状材料的植入物)；以及吸入。特别合适的施用途径是注射、输注和静脉内施用给患者。

在本方法中，基因产物或抑制基因产物表达的化合物可以作为裸RNA、与递送试剂一起或作为包含表达基因产物或抑制表达的化合物的序列的核酸(例如，重组质粒或病毒载体)对受试者进行施用。合适的递送试剂包括例如Mirus Transit TKO亲脂试剂、lipofectin、lipofectamine、cellfectin、聚阳离子(例如，聚赖氨酸)和脂质体。

本文中讨论了包含表达基因产物或基因表达抑制化合物的序列的重组质粒和病毒载体、以及用于将此类质粒和载体递送至癌细胞的技术。

在特定的实施方案中，脂质体用于将基因产物或基因表达抑制化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至受试者。脂质体还可增加基因产物或核酸的血液半衰期。可从标准的形成小囊泡的脂质形成用于本发明的合适的脂质体，所述脂质通常包括中性的或带负电荷的磷脂和固醇例如胆固醇。脂质的选择通常通过考虑因素例如期望的脂质体大小和脂质体在血流中的半衰期来进行指导。已知许多用于制备脂质体的方法，例如如Szoka等人(1980)，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467；和美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369(其全部公开内容通过引用合并入本文)中所描述的方法。

用于本方法的脂质体可包含将脂质体靶向癌细胞的配体分子。结合癌细胞中普遍的受体的配体例如结合肿瘤细胞抗原的单克隆抗体是优选的。

用于本方法的脂质体还可进行修饰以避免被单核巨噬细胞系统(“MMS”)和网状内皮系统(“RES”)清除。此类经修饰的脂质体在表面具有调理作用-抑制部分或所述部分被整合入脂质体结构。在特别优选的实施方案中，本发明的脂质体可包含调理作用-抑制部分和配体。

用于制备本发明的脂质体的调理作用-抑制部分通常是与脂质体膜结合的巨大的亲水聚合物。如本文中所使用的，调理作用-抑制部分，当其通过化学或物理方式(例如通过将脂溶性锚嵌入膜本身或通过与膜脂质的活性基团直接结合)附着至膜时，与脂质体膜“结合”。此类抑制调理作用的亲水聚合物形成了显著减少脂质体被MMS和RES吸收的保护性表面层；例如，如美国专利4,920,016中所描述的，其全部公开内容通过引用合并入本文。

适合于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选是具有大约500至大约40,000道尔顿，更优选大约2,000至大约20,000道尔顿的数量平均分子量的水溶性聚合物。此类聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如甲氧基PEG或PPG以及PEG或PPG硬脂酸酯；合成的聚合物，例如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；线性的、分支的或树枝状聚酰胺胺(polyamidoamines)；聚丙烯酸；多元醇，例如与羧基或氨基化学连接的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，例如神经节苷脂GM1。PEG、甲氧基PEG或甲氧基PPG或其衍生物的共聚物也是合适的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG和多聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚乙烯胺或多核苷酸的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物还可以是包含氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、褐藻酸、角叉菜胶(carrageenan)；胺化的多糖或低聚糖(线性或分支的)；或羧基化的多糖或低聚糖，例如与碳酸的衍生物反应从而与羧基连接的多糖或低聚糖。优选，调理作用-抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG-衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化的脂质体”。

可通过许多熟知的技术中的任一种将调理作用抑制部分结合至脂质体膜。例如，可将PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯与磷脂酰乙醇胺脂质可溶性锚结合，然后再与膜结合。类似地，可使用Na(CN)BH₃和溶剂混合物(例如以30∶12比例的四氢呋喃和水)在60℃下通过还原胺化作用，用硬脂酰胺脂质可溶性锚衍生葡聚糖(dextran)聚合物。

用调理作用-抑制部分修饰的脂质体在循环中比未修饰的脂质体保持更长时间。因此，此类脂质体有时称为“隐形(stealth)”脂质体。已知隐形脂质体在通过多孔或“渗漏”微脉管系统饲喂的组织中积累。因此，由此类微脉管系统缺陷表征的组织例如实体瘤，将有效地积累这些脂质体；参见Gabizon，等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，18：6949-53。此外，减少的被RES的吸收通过阻止脂质体在肝和脾中的大量积累来降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用-抑制部分修饰的脂质体特别适合用于将基因产物或基因表达抑制化合物(或包含编码它们的序列的核酸)递送至肿瘤细胞。

可在对受试者施用前，按照本领域已知的技术将基因产物或基因表达抑制化合物配制为药物组合物，有时称为“药剂”。因此，本发明包括用于治疗MM和/或MGUS的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种分离的基因产物和药学上可接受的载体。在特定的实施方案中，所述至少一种基因产物相应于与适合的对照细胞相比在MM和/或MGUS细胞中具有减少的表达水平的基因产物。

在其它实施方案中，本发明的药物组合物包括至少一种抑制表达的化合物。在特定的实施方案中，至少一种基因表达抑制化合物特异于其在MM和/或MGUS细胞中的表达高于对照细胞的基因。

本发明的药物组合物表征为是至少无菌的和无热原的。如本文中所使用的，“药物制剂”包括用于人和兽医用途的制剂。用于制备本发明的药物组合物的方法在本领域技术人员的能力之内，例如如Remington′s Pharmaceutical Science，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA.(1985)中所描述的，其全部分公开内容通过引用合并入本文。

本药物制剂包含与药学上可接受的载体混合的至少一种基因产物或基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)(例如，按重量计算0.1至90％)或其生理上可接受的盐。本发明的药物制剂还可包含由脂质体封装的至少一种基因产物或基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和药学上可接受的载体。

特别适合的药学上可接受的载体是水、缓冲水溶液、常用盐溶液、0.4％的盐溶液、0.3％的甘氨酸、透明质酸等。

在特定的实施方案中，本发明的药物组合物包含抗核酸酶降解的至少一种基因产物或基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。本领域技术人员可以例如通过将一个或多个在2′-位置被修饰的核糖核苷酸掺入基因产物来容易地合成具有核酸酶抗性的核酸。合适的2′-修饰的核糖核苷酸包括在2′-位置用氟、氨基、烷基、烷氧基和O-烯丙基修饰的核糖核苷酸。

本发明的药物组合物还可包含常规药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、渗透压调节剂(osmolality adjusting agent)、缓冲剂和pH调节剂。合适的添加剂包括例如生理上生物相容性缓冲剂(例如，氨丁三醇盐酸盐)、螯合剂(例如，DTPA或DTPA-双酰胺)或钙螯合络合物(例如，钙DTPA、CaNaDTPA-双酰胺)的添加或任选地，钙或钠盐(例如，氯化钙、抗坏血酸钙、葡萄糖酸钙或乳酸钙)的添加。本发明的药物组合物可以以液体形式包装使用或可以进行冻干。

对于本发明的固体药物组合物，可使用常规无毒性的固体的药学上可接受的载体；例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。

例如，用于口服施用的固体药物组合物可包含上文所列的任何载体和赋形剂以及10-95％，优选25％-75％的至少一种基因产物或基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)。用于气雾剂(吸入)施用的药物组合物可包含按重量计算0.01-20％，优选1％-10％的封装在上文所述的脂质体中的至少一种基因产物或基因表达抑制化合物(或至少一种包含编码它们的序列的核酸)和喷射剂。还可如所期望的包含载体例如卵磷脂以用于鼻内递送。

本发明还包括鉴定抗ALL试剂的方法，该方法包括给细胞提供受试试剂和测量细胞中至少一种基因产物的水平。在一个实施方案中，该方法包括给细胞提供受试试剂和测量与MM和/或MGUS细胞中减少的表达水平关联的至少一种基因产物的水平。与合适的对照细胞相比，细胞中基因产物水平的增加指示受试试剂为抗ALL试剂。在特定的实施方案中，与MM和/或MGUS细胞中减少的表达水平关联的至少一种基因产物选自本文中描述的组和其组合。

在其它实施方案中，该方法包括给细胞提供受试试剂和测量与MM和/或MGUS细胞中增加的表达水平关联的至少一种基因产物的水平。与合适的对照细胞相比，细胞中基因产物水平的降低指示受试试剂为抗MM和/或MGUS试剂。在特定的实施方案中，与MM和/或MGUS细胞中增加的表达水平关联的至少一种基因产物选自本文中描述的组和其组合。

合适的试剂包括但不限于药物(例如，小分子、肽)和生物大分子(例如，蛋白质、核酸)。试剂可通过重组、合成产生，或其可从天然来源分离(即，纯化)。用于给细胞提供此类试剂的各种方法(例如，转染)在本领域内是熟知的，并且在上文中描述了几种此类方法。用于检测至少一种基因产物的表达的方法(例如，Northern印迹、原位杂交、RT-PCR、表达特征谱分析)在本领域内也是熟知的。

定义

术语“阵列”在本文中可与术语“微阵列”互换使用。

术语“癌症”，如本文中所使用的，是指哺乳动物中通常由不受调控的细胞增殖以及此类细胞侵袭其他组织的能力表征的生理状况。

术语“表达”，如本文中所使用的，是指DNA序列信息转变为信使RNA(mRNA)或蛋白质。表达可通过测量全长mRNA、mRNA片段、全长蛋白质或蛋白质片段的水平来监测。

如本文中所使用的，短语“基因表达特征(gene expression signature)”是指细胞中，特别地癌细胞中基因表达的独特模式。

术语“杂交”，如本文中所使用的，是指两条单链核酸之间的结合、退火或碱基配对的过程。“杂交的严格性”由温度和离子强度的条件确定。核酸杂交体的稳定性表示为解链温度或Tm，其是杂交体在确定的条件下发生50％变性时的温度。已得到公式来估计给定的杂交体的Tm；该公式考虑了核酸的G+C含量，杂交探针的长度等(例如，Sambrook等，1989)。为了使探针与其靶的退火率达到最大，通常在比Tm低大约2025℃的温度下在高离子强度的溶液(6x SSC或6x SSPE)中进行杂交。如果待杂交的序列不同一，则对于每1％的错配，杂交温度降低1-1.5℃。通常，清洗条件应当尽可能严格(即，在比计算的Tm低大约12-20℃的温度下在低离子强度中)。例如，高严格条件通常包括在68℃下在6x SSC/5x Denhardt′s溶液/1.0％SDS中进行杂交和在65℃下在0.2x SSC/0.1％SDS中进行清洗。在溶液中进行的杂交与使用固定的核酸进行的杂交之间的最适杂交条件通常不同。本领域技术人员将了解操纵哪些参数以最优化杂交。

术语“核酸”，如本文中所使用的，是指连接的核苷酸的序列。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，它们可以是标准或非标准核苷酸；它们可以是经修饰的或衍生的核苷酸；它们可以是合成的类似物。核苷酸可通过磷酸二酯键或不可水解的(non-hydrolyzable)键连接。核酸可包含少许核苷酸(即，寡核苷酸)，或其可包含许多核苷酸(即，多核苷酸)。核酸可以是单链或双链的。

术语“预后”，如本文中所使用的，是指癌症的可能的过程和结果，和特别地，恢复的可能性。

虽然已通过参考各种和优选实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，可进行各种变化并且可用等价物替代其元素而不背离本发明的基本范围。此外，可进行许多改进以使特定的情况或材料适合于本发明的教导而不背离本发明的基本范围。

因此，本发明无意限定于本文中公开的用于进行本发明的特定实施方案，而是将包括落在权利要求书的范围内的所有实施方案。

参考文献

本文中用于举例说明本发明或提供关于本发明的实施的另外的详细内容的公开物和其他材料通过引用合并入本文，并且为方便起见按下列文献目录提供。

本文中引用的任何文献的引用不意欲作为任何前述内容是相关现有技术的承认。关于日期的所有声明或关于这些文献的内容的所有陈述基于申请人可获得的信息，并且不构成关于这些文献的日期或内容的正确性的任何承认。

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Claims (51)

1.诊断受试者是否患有多发性骨髓瘤(MM)和/或意义未明的单克隆γ球蛋白病(MGUS)或处于发生所述疾病的风险中的方法，其包括：

测量来自受试者的测试样品中的至少一种miR基因产物的水平，

其中与对照样品中相应的miR基因产物的水平相比，测试样品中miR基因产物的水平的变化表示受试者患有MM和/或MGUS或处于发生所述疾病的风险中。

2.权利要求1的方法，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。

3.权利要求1的方法，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-181b和miR-32。

4.权利要求1的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-19a和miR-19b中的一种或多种。

5.权利要求3或4的方法，其中所述至少一种miR基因产物表示受试者患有MM，如与MGUS相区别的。

6.在有此需要的受试者中抑制肿瘤生长的方法，其包括施用至少一种基因产物，所述基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。

7.权利要求6的方法，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-19a、miR-19b、miR-181a和miR-181b。

8.权利要求6的方法，其中所述miR基因产物是miR-191a和miR-191b中的一种或多种。

9.权利要求1或6的方法，其中至少一种miR基因产物与p53蛋白调控相关。

10.诊断受试者是否患多发性骨髓瘤(MM)或处于发生所述疾病的风险中的方法，其包括：

(1)逆转录获自受试者的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；

(2)将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和

(3)将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，

其中至少一种miRNA的信号的改变表示受试者患有MM疾病或处于发生所述疾病的风险中。

11.诊断受试者是否患与受试者中的一个或多个不利预后标志物关联的多发性骨髓瘤(MM)相关疾病或处于发生所述疾病的风险中的方法，其包括：

(1)逆转录获自受试者的测试样品的RNA以提供一组靶寡脱氧核苷酸；

(2)将所述靶寡脱氧核苷酸与包含miRNA-特异性探针寡核苷酸的微阵列杂交以提供测试样品的杂交特征谱；和

(3)将测试样品的杂交特征谱与从对照样品产生的杂交特征谱相比较，

其中信号的改变表示受试者患有MM相关疾病或处于发生所述疾病的风险中。

12.治疗患多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的受试者中的多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的方法，其中与对照细胞相比，受试者的MM细胞中至少一种miR基因产物下调或上调，所述方法包括：

(1)当MM细胞中所述至少一种miR基因产物下调时，对受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物，以便抑制受试者中MM细胞的增殖；或

(2)当MM细胞中所述至少一种miR基因产物上调时，对受试者施用有效量的用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的至少一种化合物，以便抑制受试者中MM细胞的增殖。

13.治疗受试者的多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的方法，其包括：

(1)测定与对照细胞相比，MM细胞中至少一种miR基因产物的量，和

(2)通过下列方法改变MM细胞中表达的miR基因产物的量：

(i)如果MM细胞中表达的所述miR基因产物的量低于对照细胞中表达的所述miR基因产物的量，那么对受试者施用有效量的至少一种分离的miR基因产物；或

(ii)如果MM细胞中表达的所述miR基因产物的量高于对照细胞中表达的所述miR基因产物的量，那么对受试者施用有效量的用于抑制所述至少一种miR基因产物的表达的至少一种化合物，

以便抑制受试者中MM细胞的增殖。

14.权利要求10、11、12或13的方法，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。

15.权利要求10、11、12或13的方法，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-181b和miR-32。

16.权利要求10、11、12或13的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-19a和miR-19b中的一种或多种。

17.权利要求10、11、12或13的方法，其中所述至少一种miR基因产物表示受试者患有MM，如与MGUS相区别的。

18.治疗多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的药物组合物，其包含至少一种分离的miR基因产物和药学上可接受的载体。

19.权利要求18的药物组合物，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。

20.权利要求18的药物组合物，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-181b和miR-32。

21.权利要求18的药物组合物，其中所述至少一种miR基因产物是miR-19a和miR-19b中的一种或多种。

22.权利要求18的药物组合物，其中所述miR基因产物包含如下的至少一种或多种：miR表达抑制剂和反义寡核苷酸(ASO)。

23.权利要求18的药物组合物，其中所述至少一种miR表达抑制剂化合物特异于与适当的对照细胞相比在MM细胞中上调的miR基因产物。

24.鉴定抗多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的试剂的方法，其包括：

对细胞提供受试试剂，和

测量与MM细胞中改变的表达水平关联的至少一种miR基因产物的水平，

其中与合适的对照细胞相比，细胞中所述miR基因产物的水平的改变表示受试试剂为抗癌试剂。

25.权利要求24的方法，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。

26.权利要求24的方法，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-181b和miR-32。

27.权利要求24的方法，其中所述至少一种miR基因产物是miR-19a和miR-19b中的一种或多种。

28.用于评估一个或多个代谢途径的标志物，所述代谢途径促成了多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的起始、进展、严重性、病状、攻击性、分级、活性、失能、死亡率、发病率、疾病亚分类或其他潜在的致病或病理特征中的至少一种，

其中所述标志物包括编码至少一种分离的miR基因产物的一个或多个基因产物，所述分离的miR基因产物是miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。

29.权利要求28的标志物，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-181b和miR-32。

30.权利要求28的标志物，其中所述至少一种miR基因产物是miR-19a和miR-19b中的一种或多种。

31.一种制品，其包含：至少一种捕获试剂，所述捕获试剂与多发性骨髓瘤相关疾病的标志物结合，所述标志物选自权利要求28、29或30的标志物的至少一种。

32.测试多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的试剂，其中所述试剂包含识别由权利要求28的至少一种标志物编码的蛋白质的抗体。

33.评估疗法预防、诊断和/或治疗多发性骨髓瘤(MM)的有效性的方法，其包括：

(1)使受试者经历其有效性待评估的疗法，和

(2)通过评估权利要求28的至少一种标志物，测定测试的疗法在治疗或预防多发性骨髓瘤(MM)中的有效性水平。

34.权利要求33的方法，其中候选治疗剂包含如下的一种或多种：药物组合物，营养食品组合物和顺势疗法组合物。

35.权利要求33的方法，其中所述待评估的疗法用于人类受试者。

36.筛选用于治疗多发性骨髓瘤(MM)相关疾病的治疗剂的候选化合物的试剂盒，其中所述试剂盒包含：权利要求28、29或30的至少一种标志物的一种或多种试剂和表达至少一种标志物的细胞。

37.权利要求36的试剂盒，其中使用包含特异性结合至少一种标志物的抗体或抗体片段的试剂检测所述标志物的存在。

38.用于多发性骨髓瘤(MM)的筛选测试，其包括：将一种或多种权利要求28、29或30的标志物与所述标志物的底物和与受试试剂接触；并且确定所述受试试剂是否调节所述标志物的活性。

39.权利要求38的筛选测试，其中体外进行全部方法步骤。

40.在有此需要的个体中治疗、预防、逆转或限制多发性骨髓瘤(MM)并发症的严重性的方法，其包括：

将干扰多发性骨髓瘤(MM)应答信号转导途径的试剂以足以干扰这样的信号转导的量给个体施用，

其中所述试剂包含至少一种干扰SOCS-1表达的miR基因产物。

41.干扰多发性骨髓瘤(MM)应答信号转导途径的试剂用于制备药剂的用途，所述药剂用于治疗、预防、逆转或限制个体中多发性骨髓瘤(MM)并发症的严重性、

其中所述试剂包含至少一种基因产物，所述基因产物选自miR-21、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32中的至少一个miR基因产物和其组合。

42.治疗多发性骨髓瘤(MM)癌症的药物组合物，其包含至少一种p300-CBP相关因子表达抑制化合物和药学上可接受的载体。

43.在有此需要的细胞中控制p53活性的方法，其包括将所述细胞与足以控制这样的活性的量的至少一种miR基因产物接触，其中所述miR基因产物是如下的一种或多种：miR-106b-25簇、miR-32、miR-181a和miR-181b。

44.权利要求43的方法，其中所述miR基因产物靶向p300-CBP相关因子(PCAF)基因。

45.权利要求43的方法，其中所述细胞是多发性骨髓瘤(MM)细胞。

46.与从正常经由MGUS至临床明显的MM的MM多步骤转化过程关联的miRNA特征、其包括：如下的至少一种或多种：miR-21、miR-25、miR-106b～25簇、miR-181a、miR-181b、miR-106a、miR-17～92簇、miR-19a、miR-19b和miR-32。

47.权利要求46的miRNA特征，其中所述至少一种miR基因产物是如下的一种或多种：miR-21、miR-19a、miR-19b、miR-181a、miR-181b和miR-32。

48.权利要求46的miRNA特征，其中所述至少一种miR基因产物是miR-19a和miR-19b中的一种或多种。

49.在有此需要的受试者中阻止细胞凋亡和/或促进细胞存活的方法，其包括施用有效量的一种或多种miR基因产物，其中所述基因产物是如下的一种或多种：miR-17～92、miR-19a、miR-19b和miR-21。

50.在有此需要的受试者中靶向PCAF，p53正调节剂的方法，其包括施用有效量的一种或多种miR基因产物，其中所述miR基因产物是如下的一种或多种：miR106b～25、miR-181a和miR-32。

51.在细胞中在MM发病机制晚期下调SOCS-1和/或激活IL-6的方法，其包括上调细胞中的miR-19。

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