CN105603087A - 检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物及试剂盒 - Google Patents

检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物及试剂盒，该基因探针组合物，包括TP53基因探针,Rb1基因探针,CKS1B基因探针,CYLD基因探针和BIRC2基因探针。本发明试剂盒可用于对多发性骨髓瘤克隆结构及克隆异质性的分析。

Description

检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种基因探针组合物及试剂盒，尤其涉及一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物及试剂盒。
背景技术
多发性骨髓瘤(Multiplemyeloma，MM)是一种异常浆细胞克隆性增生并大多数以产生单克隆免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)为特征的恶性血液系统疾病。MM病程分期明确，从意义未明的单克隆免疫球蛋白血症(Monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance,MGUS)经历冒烟型骨髓瘤(smolderingmultiplemyeloma,SMM)，到有症状骨髓瘤，再到浆细胞白血病(plasmacellleukemia,PCL)或者髓外浆细胞瘤。不同的病程具有其不同的细胞遗传学异常。因此MM成为研究肿瘤细胞克隆异质性和克隆进化的良好模型。
虽然肿瘤细胞的克隆进化早已被人们注意到，但是对于他的研究却并无固定的成熟模式。目前主要可以通过比较基因组杂交(comparativegenomichybridization，CGH)、全基因组/外显子测序(wholegenome/exomesequencing，WG/ES)、单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)等分析。但是上述方法主要分析单个核苷酸水平的变化，这些异常与MM预后之间的联系目前研究较少，尚不清楚。另外上述方法只能分析大量细胞群混杂的信息，而肿瘤细胞的异质性使得上述分析方法可能遗漏占比例较少部分细胞群的信息。近些年，荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridisation，FISH)技术检测细胞遗传学异常成为MM预后分层并指导治疗的重要参考因素，并且这些常见细胞遗传学异常与MM病程及预后密切相关。我们综合了FISH技术和多参数分析的优势，采用可以直观分析单细胞水平细胞遗传信息变化的多色荧光原位杂交(multicolorfluorescenceinsituhybridization,mFISH)技术，它在单细胞水平通过常见而重要的细胞遗传学信息可以研究MM克隆进化。
MM常见的分子遗传学异常包括原发性细胞遗传学异常和继发性细胞遗传学异常，本发明旨在发现MM病程中的细胞遗传学变化，所以本发明利用mFISH技术研究MM患者不同时间点的常见继发性细胞分子遗传学异常(包括TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2所在的染色体片段即del(17p)、del(13q)、1q21gains、del(16q)、del(11q)，了解初诊、复发、缓解、再复发等不同疾病状态下细胞分子遗传学的演变，藉此分析MM进展过程中的克隆进化及与临床治疗反应及生存的联系。
TP53基因定位于17号染色体短臂,包含11个外显子和10个内含子,其mRNA长25kb,编码一个含有393个氨基酸的蛋白质,分子量为53kD。在初诊MM,其所在片段17p的缺失约为8-10％，随着疾病进展，在多次复发患者中，其缺失可达40％。该基因的缺失与MM发生、发展关系密切，并与临床不良预后密切相关。
Rb1基因全长大约200kb,定位于13号染色体长臂,它所编码的105kD磷酸蛋白参与细胞周期的调控,调控细胞增殖。在初诊MM，该基因缺失的检出率达到40％，但是该基因单独缺失与MM预后并无明确关联，它对MM预后的影响取决于是否同时合并其它高危遗传学异常。
CKS1B基因位于1号染色体长臂，是CDC28蛋白激酶调节亚基1B。在MM，其表达水平与1q21区连锁扩增拷贝数呈正相关，其高表达与MM不良预后关系密切。在初诊MM，该基因所在染色体1q21的扩增约达40％。
CYLD基因定位于16号染色体长臂，是具有去泛素化酶活性的抑癌基因，在多种肿瘤中存在该基因的突变或低表达。该基因的异常表达，可以对细胞周期产生明显影响。研究表明，其高表达，可以使细胞增殖速率明显降低，使G1-S期的转换延迟。在初诊MM，其所在片段16q的缺失达到35％。
BIRC2基因定位于11号染色体长臂，编码凋亡抑制蛋白cIAP1。它通过肿瘤坏死因子家族发挥抑制凋亡的作用。在MM，该基因所在染色体片段的缺失约占7％。
综上所述，TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2这5种基因和多发性骨髓瘤的发生、发展有着密切的关系，目前临床对于MM主要通过少数单个基因的检测，其结果远不能反应该病复杂的病理发生过程。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物及试剂盒，可以用于确定多发性骨髓瘤的克隆进化路径，判断患者病程当中的克隆进化情况，指导个体化治疗。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供了一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物，包括TP53基因探针,Rb1基因探针,CKS1B基因探针,CYLD基因探针和BIRC2基因探针。
优选地，所述的基因探针组合物包括：
TP53基因探针：对应的克隆编号RP11-89D11(UCSCgenomebrowser)；
Rb1基因探针：对应的克隆编号RP11-305D15(UCSCgenomebrowser)；
CKS1B基因探针：对应的克隆编号RP11-307C12(UCSCgenomebrowser)；
CYLD基因探针：对应的克隆编号RP11-327F22(UCSCgenomebrowser)；
BIRC2基因探针:对应的克隆编号RP11-864G5(UCSCgenomebrowser)。
根据本发明一个优选的实施方案，TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2单个基因探针制备步骤如下：
1)、克隆筛选：检索UCSCgenomebrowser，NCBICloneRegistry，EnsemblGenomeBrowser数据库分别含TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2基因的所有克隆，并对这些克隆进行筛选，选择最佳的克隆；
2)、克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买BAC克隆(美国Invitrogen公司),取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时；然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养8-16小时；TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2的BAC克隆用相对应的基因引物进行多聚酶链式反应扩增，用1-2％的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，从而完成待选克隆的分子鉴定；
3)、基因探针的制备和验证：对多聚酶链式反应鉴定阳性的菌液，进行质粒制备；用ND-1000超微量分光光度计对质粒进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定；采用缺口平移的方法对质粒DNA进行荧光标记，(选择最佳的荧光染料和镜检的荧光显微镜的滤光片匹配组合，使检测到的荧光信号强度最大)；对标记产物进行沉淀和浓缩；将荧光标记的探针溶于含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液中，-20℃避光，储存，采用正常人外周血单个核细胞甩片进行探针鉴定。
根据本发明一个优选的实施方案，TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2基因探针组合物的制备步骤如下：
1)、克隆筛选：检索UCSCgenomebrowser，NCBICloneRegistry，EnsemblGenomeBrowser数据库分别含有TP53、Rb1、CKS1B、CYLD和BIRC2基因的所有细菌人工染色体(BAC)克隆，并对这些克隆进行多聚酶链式反应(PCR)鉴定，选出最佳的克隆。
2)、克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买BAC克隆(美国Invitrogen公司),取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时；然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养8-16小时；对TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2的BAC克隆用相对应的基因引物进行多聚酶链式反应扩增，用1-2％的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，从而完成待选克隆的分子鉴定。
3)、基因探针的制备和鉴定：获得目的基因的克隆后，提取大量DNA，酶切DNA后采用缺口平移的方法对酶切后的DNA进行荧光素标记，再对TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2基因探针组合后进行沉淀和浓缩，将制作好的探针组合物溶解到含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液中，即得荧光标记探针组杂交混合液，采用正常人外周血单个核细胞甩片进行探针鉴定。
优选地，克隆筛选步骤中含TP53基因最优的克隆，编号为RP11-89D11(UCSCgenomebrowser)；含Rb1基因最优的克隆，编号为RP11-305D15(UCSCgenomebrowser)；含有CKS1B基因最优的克隆，编号为RP11-307C12(UCSCgenomebrowser)；含有CYLD基因最优的克隆，编号为RP11-327F22(UCSCgenomebrowser)；克隆筛选步骤中含有BIRC2基因最优的克隆，编号为RP11-864G5(UCSCgenomebrowser)。
根据本发明一个优越的实施方案，克隆培养和鉴定步骤中使用的引物序列为：
TP53基因探针：上游引物5’-TGACACGCTTCCCTGGATTG-3’和
下游引物5’-GCTCGACGCTAGGATCTGAC-3’；
Rb1基因探针：上游引物5’-CCTCTCGTCAGGCTTGAGTT-3’和
下游引物5’-ACAGATTCCCCACAGTTCCT-3’；
CKS1B基因探针：上游引物5’-GTGCTGTTGGGAGTTGCTTG-3’和
下游引物5’-TTGGCTATGTCCTTGGGCAG-3’；
CYLD基因探针：上游引物5’-CCCCCTTTCTAGGGTGAGGA-3’和
下游引物5’-TTCAGCAACGTGGTGTCCAT-3’；
BIRC2基因探针：上游引物5’-CAAAGGCATTTGTGCTGGGA-3’和
下游引物5’-CTGCAGTCATTTCAGCGTCG-3’。
多聚酶链式反应扩增条件为：94℃5分钟；“94℃30秒，58-62℃30秒，72℃45秒”循环35次：72℃10分钟。
根据本发明的一个优选方法：基因探针制备过程中用EcoRⅠ酶对目的DNA进行酶切，EcoR1酶的浓度为0.1单位/微升；50微升切口平移体系中脱氧核糖核酸聚合酶I的使用量为10个单位，脱氧核糖核酸酶I使用量为50纳克。
根据本发明一个优选方案，在将标记好荧光素的DNA进行沉淀时，加入三种人类未标记的竞争性CotDNA,ssDNA和tRNA重复序列脱氧核糖核酸，以降低杂交反应时产生的荧光背景，其中CotDNA,ssDNA和tRNA沉淀时的使用浓度均为1毫克/毫升,沉淀的体系为300微升。
根据本发明一个优选方案，基因探针浓缩方法为乙醇(-20℃)沉淀浓缩，最后使用杂交缓冲液溶解沉淀。
根据本发明一个优选实施方案，杂交缓冲液的组分包括50％的去离子甲酰胺，2×SSC和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。
本发明的另一目的是提供了一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的试剂盒，包括上述基因探针组合物。
优选地，所述的试剂盒还包括杂交缓冲液。更优选地，所述基因探针组合物溶解在杂交缓冲液中，即荧光标记探针组杂交混合液，更优选地，所述TP53基因探针的浓度为：4ng/μL，Rb1基因探针的浓度为:4ng/μL,CKS1B基因探针的浓度为：4ng/μL，CYLD基因探针的浓度为：4ng/μL，BIRC2基因探针的浓度为：4ng/μL。
更优选地，所述杂交缓冲液的组分包括50％的去离子甲酰胺，2×SSC和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。
优选地，所述试剂盒还包括DAPI复染液。
优选地，所述试剂盒还包括20XSSPE洗涤液。
优选地，所述试剂盒还包括包装试剂管的塑料包装盒。
本发明还提供了上述试剂盒在多发性骨髓瘤细胞遗传学异常荧光原位杂交检测中的应用，包括如下步骤：
1)、标本处理和制片：收集病人骨髓细胞，Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞，然后CD138磁珠阳性分选分离得到的单个核细胞，用PBS调整细胞浓度为1×105/ml，进行细胞甩片，晾干，用钻石笔标记细胞位置，用2×SSC(37℃)洗涤5分钟，0.2g/L胃酶中消化12分钟，用2×SSC(37℃)洗涤3分钟。梯度乙醇(70％，85％，100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，晾干后FISH检测备用。
2)、杂交：将要检测的标本处理好后，加入上述制备的荧光标记探针组杂交混合液，3微升/片，加上规格为12×12mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟，将玻片放入杂交仪中，85℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
3)、洗片：标本杂交过夜后，去除盖玻片，放入4×核酸杂交的缓冲液(SalineSodiumPhosphateEDTA，SSPE)中洗涤两次，梯度乙醇中脱水，晾干，用DAPI复染，在荧光显微镜下观察检测结果。
4)、图像采集与分析：在荧光显微镜下使用相应的滤光片观察不同的荧光信号，对信号进行拍照和计数。
本发明所具有的有益效果：
1、目前市场上的荧光原位杂交法通常可同时检测1-2个基因；而本试剂盒可对多发性骨髓瘤样本的单个细胞进行5种基因的同时检测，显著提高了检测能力和效率。
2、本试剂盒着眼于单细胞水平的基因异常，因此可用于对多发性骨髓瘤的克隆进化路径进行分析。
3、本试剂盒可用于对多发性骨髓瘤克隆结构及克隆异质性的分析。
3、本发明试剂盒可直接用于中期或间期骨髓瘤细胞的荧光原位杂交法检测，而无需细胞培养和制备高质量的中期细胞片，操作大大简化。
4、本发明试剂盒也可用于其他血液系统恶性疾病如慢性淋巴细胞白血病、浆细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤等恶性血液疾病的细胞遗传学异常及克隆结构、克隆异质性和克隆进化的研究。
附图说明
图1为用蓝色荧光素PromoFluor-415-aadUTP(PF415)标记含有CKS1B基因的BAC克隆、绿色荧光素GreendUTP标记含有TP53基因的BAC克隆、橙色荧光素PromoFluor-590-aadUTP标记含有RB1基因的BAC克隆、红色荧光素PromoFluor-555-aadUTP标记含有CYLD基因的BAC克隆、紫色荧光素HyPer5dCTP标记含有BIRC2基因的BAC克隆，将制作好的探针分别和正常人外周血单个核细胞进行杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示细胞核中均呈现两个清晰的荧光素信号点，可见经过本发明大量实验对比选择的最佳的BAC克隆能够获得清晰的图像，信噪比高。(BAC克隆的克隆编号如表1所示)
图2是本发明将成功制作的Green-TP53(绿色荧光素标记的TP53探针)，PF590-Rb1(橙色荧光素标记的RB1探针)，PF555-CYLD(红色荧光素标记的CYLD探针)，HyPer5-BIRC2(紫色荧光素标记的BIRC2探针)，PF415-CKS1B(蓝色荧光素标记的CKS1B探针)5种探针(表1)混合后对正常人外周血单个核细胞进行杂交，再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示在同一细胞核中，每种探针得到两个清晰的荧光信号，5种探针一共获得10个相应的荧光信号点,获得的图像清晰，信噪比高。
图3为多发性骨髓瘤患者五种基因荧光原位杂交检测。
图4为克隆稳定型患者病程中克隆演变示意图：该例患者诊断为多发性骨髓瘤IgGκ型(DSⅢB期，ISSⅢ期)，在第一次复发、一次复发治疗后、第二次复发、疾病稳定4个时间点，分别进行了FISH和mFISH的检测。病程中通过4次mFISH检测该时间点检测del(17p)、del(13q)、1q21扩增、del(16q)、del(11q)，优势克隆均为2G2O2B2R2IN。
图5为线性进展型患者病程中克隆演变示意图：该例患者诊断为多发性骨髓瘤IgGκ型(DSⅢA期，ISSⅢ期)。在患者初诊、难治、复发进展3个时间点，分别进行了单色和mFISH的检测。初诊时mFISH检测结果为2G2O2R2IN2B；4月时认为患者为难治骨髓瘤，mFISH检测获得del(13q)和1q21扩增两种异常，结果为2G1O2R2IN3B；17月时复发时mFISH检测又获得del(17p)、del(16q)两种遗传学异常，结果为1G1O1R2IN4B。
图6为分枝模式进展型患者病程中克隆演变示意图：该例患者诊断为多发性骨髓瘤轻链λ型(DSⅢA期，ISSⅢ期)。在初诊、第一次复发、第二次复发3个时间点，进行了mFISH的检测，初诊时患者上述片段均未发现异常，表现为2G2O2B2R2IN，29.5个月疾病进展，行mFISH检测，提示获得del(17p)、del(13q)和1q21扩增，且1G1O2R2IN4B成为优势克隆。38月时疾病复发，行mFISH检测发现进一步获得del(16q)，并且1G1O2R2IN3B克隆成为优势克隆。
图7为分枝模式进展型患者病程中克隆演变示意图：该例患者诊断为多发性骨髓瘤λ轻链型(DSⅢB期，ISSⅢ期)。在初诊、复发、复发治疗后3个时间点，分别进行了mFISH的检测。初诊时mFISH检测结果提示3种克隆并存，2G1O2R2IN4B为优势克隆，1G1O2R2IN4B和1G1O2R2IN3B为两个共存的小克隆。40个月后复查提示疾病复发，mFISH检测结果提示原1G1O2R2IN14B成为优势克隆，2G1O2R2IN4B成为小克隆，提示在选择压力下，2G1O2R2IN4B对治疗相对敏感，大部分被治疗杀灭，而1G1O2R2IN14B可能耐药，随着敏感克隆的清除，耐药克隆得以存活并不断扩张。治疗1个月后复查mFISH与前次无明显变化，1G1O2R2IN14B仍为优势克隆，提示1G1O2R2IN14B对治疗不敏感，在治疗作用下，其比例无明显变化。
具体实施方式
下列通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
实施例1：TP53基因探针的制备方法，包括如下步骤：
1.引物设计克隆筛选：TP53基因位于人17号染色体短臂17P13.1，检索UCSCgenomebrowser，NCBICloneRegistry，EnsemblGenomeBrowser数据库所有含有TP53基因的克隆，用多聚酶链式反应筛选出包含有该基因的最优克隆，编号为RP11-89D11(如表1所示)。
2.克隆培养和鉴定：购买克隆RP11-89D11(美国Invitrogen公司),取8微升克隆菌液加到5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养12小时；然后将菌液全部加入至450毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养12小时后收集菌液，菌液使用上游引物5’-TGACACGCTTCCCTGGATTG-3’和下游引物5’-GCTCGACGCTAGGATCTGAC-3’；进行PCR扩增，扩增条件为：94℃5分钟；(“94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒”)循环35次：72℃10分钟，对扩增产物进行电泳验证。
3.基因探针制备：
(1)对鉴定阳性的菌液，使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒，按照说明书要求进行BAC克隆质粒的提取和纯化。用ND-1000超微量分光光度计对质粒DNA进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。用EcoRⅠ酶对目的DNA进行酶切，方法如下：
37℃孵育1小时，加入1微升的0.5M的乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraaceticAcid，EDTA)(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。
(2)沉淀DNA：加入步骤(1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
(3)再加入步骤(2)总液体量2倍体积100％乙醇(-20℃)，混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时。离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100微升70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10微升的10mM的Tris-HCl(PH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速800rpm，将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
(4)连接反应:
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记，对TP53基因采用Green-dUTP荧光素标记，Green-TP53(绿色)探针标记方法如下：
取避光的EP管，先加入水，最后加入DNaseⅠ(10纳克/微升)和DNApolymeraseⅠ(10单位/微升，酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液：
混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)。次日加入5微升的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的DNA放在-20℃避光保存。
(5)沉淀DNA:
按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀：
再加入15微升的3M的乙酸钠，630微升的100％乙醇(-20℃)混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100微升的70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。加入10微升的含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针，转速800rpm，将溶解好的探针放入56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中，4℃中保存，若长期不用探针应保存于-20℃。
4.Green-dUTP-TP53基因探针验证：
(1)细胞准备：
采用密度梯度离心的方法用Ficoll液提取正常人外周血单个核细胞，磷酸缓冲液(PBS)洗涤后进行细胞甩片，转速1000rpm，3分钟；晾干，放入甲醇中室温固定过夜；次日放入1-2％的甲醛溶液中室温固定5分钟，PBS中洗涤后放入70％的乙醇中-20℃保存；将保存在70％的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针，2微升/片，加上12×12mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
(2)杂交：
将玻片放入杂交仪中，78℃变性5分钟，37℃杂交过夜。
(3)洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟；梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度；放入己烷：异丙醇(60:40)混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100％的乙醇中5分钟；空气中干燥片子约10分钟后加入8微升的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
(4)图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜AxioImagerZ2型，滤光片采用Chroma公司DAPI(SP-100)和Zeiss公司SpectrumGreenTM(MF101)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVisionRel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-CoupledDevice，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission：450-490nm)和SpectrumGreenTM(MF101)两个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的图像(如图1所示)。
(5)结果判断：
荧光原位杂交结果显示，在同一个正常人外周血单个核细胞中，Green-dUTP-TP53基因探针得到两个清晰的荧光信号点。从获得的Green-dUTP-TP53(绿色)图像(图1)中可以看出，该基因的荧光信号较强，图像清晰，信噪比高，方法可靠稳定。
同样地，采用上述方法分别制备Rb1、CKS1B、CYLD、BIRC2基因探针(表1)，荧光原位杂交结果显示如图1，同样得到两个清晰的荧光信号点，可见选择的基因的荧光信号较强，图像清晰，信噪比高，方法可靠稳定。
实施例2：TP53、Rb1、CKS1B、CYLD、BIRC2基因探针组合物的制备方法，包括如下步骤
1.引物设计克隆筛选：
通过检索UCSCgenomebrowser，NCBICloneRegistry，EnsemblGenomeBrowser等数据库分别含有TP53、Rb1、CKS1B、CYLD、BIRC2基因的所有克隆，用多聚酶链式反应筛选出包含有该基因的克隆，编号依次为：RP11-89D11、RP11-305D15、RP11-307C12、RP11-327F22、RP11-864G5(如表1所示)。
2.克隆培养和鉴定：按照克隆编号购买克隆(美国Invitrogen公司),取8微升克隆菌液加到5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养12小时；然后将菌液全部加入至450毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养12小时后收集菌液，分别用以下引物扩增5个目的基因：
TP53基因探针：上游引物5’-TGACACGCTTCCCTGGATTG-3’和
下游引物5’-GCTCGACGCTAGGATCTGAC-3’；
Rb1基因探针：上游引物5’-CCTCTCGTCAGGCTTGAGTT-3’和
下游引物5’-ACAGATTCCCCACAGTTCCT-3’；
CKS1B基因探针：上游引物5’-GTGCTGTTGGGAGTTGCTTG-3’和
下游引物5’-TTGGCTATGTCCTTGGGCAG-3’；
CYLD基因探针：上游引物5’-CCCCCTTTCTAGGGTGAGGA-3’和
下游引物5’-TTCAGCAACGTGGTGTCCAT-3’；
BIRC2基因探针：上游引物5’-CAAAGGCATTTGTGCTGGGA-3’和
下游引物5’-CTGCAGTCATTTCAGCGTCG-3’。
扩增条件为：94℃5分钟；“94℃30秒，58-62℃30秒，72℃45秒”循环35次：72℃10分钟。对扩增产物进行电泳验证。
在用于检测TP53、Rb1、CKS1B、CYLD、BIRC2基因的BAC克隆中能分别扩增出相应基因的DNA片段，并且这些DNA片段大小和设计相符合。
3.基因探针制备：
(1)使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒，按照说明书要求进行BAC克隆质粒的提取和纯化。用ND-1000超微量分光光度计对质粒DNA进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。用EcoR1酶对目的DNA进行酶切，方法如下：
37℃孵育1小时，加入1微升的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心。
(2)沉淀DNA：加入步骤(1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
(3)再加入步骤(2)总液体量2倍体积100％乙醇(-20℃)，混匀，瞬时离心，-70℃，沉淀约2小时，离心14000rpm，4℃，20分钟，用枪尖小心吸弃上清，加入100微升70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，干燥沉淀10分钟，用10微升的10mM的Tris-HCl(pH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时，转速800rpm，将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
(4)连接反应:
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记，对TP53、Rb1、CKS1B、CYLD、BIRC2基因分别采用GreendUTP，PromoFluor-590-aadUTP,PromoFluor-415-aadUTP，PromoFluor-555-aadUTP,HyPer5dCTP，五种荧光素(表2)标记，对Green-TP53(绿色)，PF590-Rb1(橙色)，PF415-CKS1B(蓝色),PF555-CYLD(红色)，HyPer5-BIRC2(紫色)，探针分别标记如表1，方法如下：
取避光的EP管，先加入水，最后加入DNaseⅠ(10纳克/微升)和DNApolymeraseⅠ(10单位/微升，酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液：
混匀，瞬时离心，14℃孵育过夜(9-12小时)，次日加入5微升的0.5M的EDTA(PH7.5)终止反应，混匀，瞬时离心，连接好的DNA放在-20℃避光保存。
(5)沉淀DNA:
按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀：
再加入15微升的3M的乙酸钠，630微升的100％乙醇(-20℃)混匀，瞬时离心，-20℃，沉淀过夜。次日离心14000rpm，4℃，20分钟。用枪尖小心吸弃上清，加入100微升的70％乙醇(4℃)，混匀，离心14000rpm，4℃，15分钟。用枪尖小心吸弃上清，室温避光干燥沉淀10分钟。加入10微升的含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀，在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针组合物，转速800rpm，将溶解好的探针组合物放入56℃中孵育1小时，室温离心14000rpm，20分钟，将离心好的探针组合物转移至一个新的避光EP管中，4℃中保存，若长期不用探针组合物应保存于-20℃。
4.Green-TP53，PF590-Rb1，PF555-CYLD，PF415-CKS1B,HyPer5-BIRC2，基因探针组合物验证：
(1)细胞准备：
用Ficoll液进行密度梯度离心提取正常人外周血单个核细胞，PBS洗涤后进行细胞甩片，细胞甩片，转速1000rpm，3分钟；晾干，放入甲醇中室温固定过夜；次日放入1-2％的甲醛溶液中室温固定5分钟，PBS中洗涤后放入70％的乙醇中-20℃保存；将保存在70％的乙醇中的标本拿出，放入梯度乙醇(70％，85％，2×100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，脱水后晾干，加入制作好的探针组合物，2微升/片，加上12×12mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。
(2)杂交：
将玻片放入杂交仪中，85℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
(3)洗涤：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟；梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度；空气中干燥片子约10分钟后加入8微升的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
(4)图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜AxioImagerZ2型，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100),SpectrumGreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),TexasRed(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVisionRel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-CoupledDevice，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission：450-490nm),SpectrumGreenTM(Emission：512-542nm),Cy3TMv1(Emission：559.5-574.5nm),TexasRed(Emission：619.5-642.5nm),Cy5(Emission：665-715nm),PF-415(Emission：460-500nm)六个滤光片通路中采集荧光信息，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得获得清晰、稳定，理想的多色图像。拍摄3个区域共计200个细胞，记录TP53、Rb1、CKS1B、CYLD、BIRC2基因的荧光信号数目。
(5)结果判断：TP53、Rb1、CKS1B、CYLD、BIRC2
荧光原位杂交结果显示，同一细胞核中，每种探针得到两个清晰的荧光信号，5种探针一共获得10个相应的荧光信号点。从获得的Green-TP53(绿色)，PF590-Rb1(红色)，PF555-CYLD(橙色)，HyPer5-BIRC2(紫色)，PF415-CKS1B(蓝色)多色图像(图2)中可以看出，同时检测的5个不同基因的荧光信号均较强，图像清晰，信噪比高。方法可靠稳定。
实施例3：一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的试剂盒(50人份)，组成如下：
其中荧光标记探针组杂交混合液中包括TP53基因探针、Rb1基因探针、CKS1B基因探针、CYLD基因探针、BIRC2基因探针，其中TP53基因探针浓度为：4ng/μL，Rb1基因探针浓度为:4ng/μL,CKS1B基因探针浓度为：4ng/μL，CYLD基因探针浓度为：4ng/μL，BIRC2基因探针浓度为：4ng/μL。所述杂交混合液的组分包括50％的去离子甲酰胺，2×SSC和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。
实施例4：一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的试剂盒的使用方法
收集临床多发性骨髓瘤CD138阳性分选细胞标本25例(包括序贯标本62份，每一患者至少包括初诊和复发或者复发或复发2个时间点的标本)，使用实施例3中所述检测多发性骨髓瘤克隆进化的试剂盒进行检测，方法如下：
1.标本处理和制片：
收集病人骨髓细胞，Ficoll分离骨髓单个核细胞，然后CD138磁珠阳性分选浆细胞，用磷酸盐缓冲液调整细胞浓度为1×105/ml，进行细胞甩片，晾干，用钻石笔标记细胞位置，用2×SSC(37℃)洗涤5分钟，梯度乙醇(70％、85％、100％乙醇)中脱水，3分钟/梯度，晾干后FISH检测备用。
2.杂交反应：
将要检测的标本处理好后，加入实施例3试剂盒中的荧光标记探针组杂交混合液，2微升/片，加上规格为12×12mm普通盖玻片，避免产生气泡，用封片胶封片，37℃干燥20分钟。将玻片放入杂交仪中，85℃变性5分钟，47℃杂交过夜。
3.洗片：
将杂交过夜的片子移去盖玻片，放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟，55℃的4×SSPE中洗涤10分钟；梯度乙醇中脱水(70％，85％，2×100％乙醇)，3分钟/梯度；放入己烷：异丙醇(60:40)混合液中10分钟，再放入异丙醇中5分钟，最后放入100％的乙醇中5分钟；空气中干燥片子约10分钟后加入10微升的DAPI，加上盖玻片，避免产生气泡，指甲油封片。
4.图像采集与分析：
采用Zeiss公司多色荧光显微镜AxioImagerZ2型，滤光片采用Chroma公司分别为：DAPI(SP-100),SpectrumGreenTM(MF101),Cy3TMv1(SP-102),TexasRed(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50)，PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野，定位，用AxioVisionRel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置，然后用高分辨率CCD(Charge-CoupledDevice，电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission：450-490nm),SpectrumGreenTM(Emission：512-542nm),Cy3TMv1(Emission：559.5-574.5nm),TexasRed(Emission：619.5-642.5nm),Cy5(Emission：665-715nm),PF-415(Emission：460-500nm)六个滤光片通路中采集荧光信息，调整焦距，在核的不同层次找到信号点，记录观察每个细胞中的各探针的数目，用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5层，采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上，从而获得清晰、稳定，理想的多色图像。每片拍摄10个区域共计200个细胞，记录TP53、Rb1、CKS1B、CYLD和BIRC2基因的荧光信号数目。
5.结果判断：
多发性骨髓瘤患者五种基因荧光原位杂交检测，结果如图3所示。
通过记录TP53、Rb1、CKS1B、CYLD、BIRC2基因的荧光信号数目。发现MM患者骨髓细胞中不同的克隆结构，如图4所示，图4为克隆稳定型患者病程中克隆演变示意图：该例患者诊断为多发性骨髓瘤IgGκ型(DSⅢB期，ISSⅢ期)，在第一次复发、一次复发治疗后、第二次复发、疾病稳定4个时间点，分别进行了FISH和mFISH的检测。病程中通过4次mFISH检测该时间点检测del(17p)、del(13q)、1q21扩增、del(16q)、del(11q)，优势克隆均为2G2O2B2R2IN。
通过对同一个患者病程中初诊、治疗后、复发、再治疗后的骨髓CD138+细胞检测，可以发现MM患者骨髓细胞中的亚克隆种类发生的变化，如图5所示，图5为线性进展型患者病程中克隆演变示意图：该例患者诊断为多发性骨髓瘤IgGκ型(DSⅢA期，ISSⅢ期)。在患者初诊、难治、复发进展3个时间点，分别进行了单色和mFISH的检测。初诊时mFISH检测结果为2G2O2R2IN2B；4月时认为患者为难治骨髓瘤，mFISH检测获得del(13q)和1q21扩增两种异常，结果为2G1O2R2IN3B；17月时复发时mFISH检测又获得del(17p)、del(16q)两种遗传学异常，结果为1G1O1R2IN4B。
图6为分枝模式进展型患者病程中克隆演变示意图：该例患者诊断为多发性骨髓瘤轻链λ型(DSⅢA期，ISSⅢ期)。在初诊、第一次复发、第二次复发3个时间点，进行了mFISH的检测，初诊时患者上述片段均未发现异常，表现为2G2O2B2R2IN，29.5个月疾病进展，行mFISH检测，提示获得del(17p)、del(13q)和1q21扩增，且1G1O2R2IN4B成为优势克隆。38月时疾病复发，行mFISH检测发现进一步获得del(16q)，并且1G1O2R2IN3B克隆成为优势克隆。
图7为分枝模式进展型患者病程中克隆演变示意图：该例患者诊断为多发性骨髓瘤λ轻链型(DSⅢB期，ISSⅢ期)。在初诊、复发、复发治疗后3个时间点，分别进行了mFISH的检测。初诊时mFISH检测结果提示3种克隆并存，2G1O2R2IN4B为优势克隆，1G1O2R2IN4B和1G1O2R2IN3B为两个共存的小克隆。40个月后复查提示疾病复发，mFISH检测结果提示原1G1O2R2IN14B成为优势克隆，2G1O2R2IN4B成为小克隆，提示在选择压力下，2G1O2R2IN4B对治疗相对敏感，大部分被治疗杀灭，而1G1O2R2IN14B可能耐药，随着敏感克隆的清除，耐药克隆得以存活并不断扩张。治疗1个月后复查mFISH与前次无明显变化，1G1O2R2IN14B仍为优势克隆，提示1G1O2R2IN14B对治疗不敏感，在治疗作用下，其比例无明显变化。
从图4,5,6,7获得的Green-TP53(绿色)，PF555-Rb1(红色)，PF590-CYLD(橙色)，HyPer5-BIRC2(紫色)，PF415-CKS1B多色图像中可以看出，同时检测的5个不同基因的荧光信号均较强，图像清晰，信噪比高，方法可靠稳定。
通过本发明试剂盒对单细胞水平细胞克隆进行多基因综合检测，可以更好的进行分子病理分型，研究和跟踪MM克隆在疾病发生和发展过程中的演变，更好的判断预后，指导个体化治疗。
表1TP53、Rb1、CKS1B、CYLD、BIRC2基因检测试剂盒基因片段标记
表2荧光素标记的dUTP

Claims (6)

1.一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物，其特征在于：包括TP53基因探针,Rb1基因探针,CKS1B基因探针,CYLD基因探针和BIRC2基因探针。
2.根据权利要求1所述一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物，其特征在于：所述的基因探针组合物包括：
TP53基因探针：对应的克隆编号RP11-89D11(UCSCgenomebrowser)；
Rb1基因探针：对应的克隆编号RP11-305D15(UCSCgenomebrowser)；
CKS1B基因探针：对应的克隆编号RP11-307C12(UCSCgenomebrowser)；
CYLD基因探针：对应的克隆编号RP11-327F22(UCSCgenomebrowser)；
BIRC2基因探针:对应的克隆编号RP11-864G5(UCSCgenomebrowser)。
3.根据权利要求1或2所述一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的基因探针组合物的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
1)、克隆选择：选择含有TP53基因的克隆，编号为RP11-89D11(UCSCgenomebrowser)；含有Rb1基因的克隆，编号为RP11-305D15(UCSCgenomebrowser)；含有CKS1B基因的克隆，编号为RP11-307C12(UCSCgenomebrowser)；含有CYLD基因的克隆，编号为RP11-327F22(UCSCgenomebrowser)；含有BIRC2基因的克隆，编号为RP11-864G5(UCSCgenomebrowser)；
2)、克隆培养和鉴定：按照筛选确定的克隆编号购买BAC克隆，取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振摇活化培养8-16小时；然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中，37℃震摇培养8-16小时；对TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2的BAC克隆用相对应的基因引物进行多聚酶链式反应扩增，用1-2％的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析，从而完成待选克隆的分子鉴定；
3)、基因探针的制备和鉴定：获得目的基因的克隆后，提取大量DNA，酶切DNA后采用缺口平移的方法对酶切后的DNA进行荧光素标记，再对TP53,Rb1,CKS1B,CYLD和BIRC2基因探针组合后进行沉淀和浓缩，将制作好的探针组合物溶解到含有50％去离子甲酰胺的杂交缓冲液中，即得荧光标记探针组杂交混合液，采用正常人外周血单个核细胞甩片进行探针鉴定。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：克隆培养和鉴定步骤中使用的引物序列为：
TP53基因探针：上游引物5’-TGACACGCTTCCCTGGATTG-3’和
下游引物5’-GCTCGACGCTAGGATCTGAC-3’；
Rb1基因探针：上游引物5’-CCTCTCGTCAGGCTTGAGTT-3’和
下游引物5’-ACAGATTCCCCACAGTTCCT-3’；
CKS1B基因探针：上游引物5’-GTGCTGTTGGGAGTTGCTTG-3’和
下游引物5’-TTGGCTATGTCCTTGGGCAG-3’；
CYLD基因探针：上游引物5’-CCCCCTTTCTAGGGTGAGGA-3’和
下游引物5’-TTCAGCAACGTGGTGTCCAT-3’；
BIRC2基因探针：上游引物5’-CAAAGGCATTTGTGCTGGGA-3’和
下游引物5’-CTGCAGTCATTTCAGCGTCG-3’。
多聚酶链式反应扩增条件为：94℃5分钟；“94℃30秒，58-62℃30秒，72℃45秒”循环35次：72℃10分钟。
5.一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述基因探针组合物。
6.根据权利要求5所述一种检测多发性骨髓瘤克隆进化的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括杂交缓冲液；所述基因探针组合物溶解在杂交缓冲液中，即荧光标记探针组杂交混合液，所述TP53基因探针的浓度为：4ng/μL，Rb1基因探针的浓度为:4ng/μL,CKS1B基因探针的浓度为：4ng/μL，CYLD基因探针的浓度为：4ng/μL，BIRC2基因探针的浓度为：4ng/μL。
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