CN113174440B - 用于多发性骨髓瘤第二代测序的组合基因及其应用和基于其的测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于多发性骨髓瘤第二代测序的组合基因及其应用和基于其的测序方法，包括92种基因组合、基因检测区域、测序流程及测序结果分析。本发明提供的新型基因测序组合，囊括了MM相关致病基因、耐药基因、骨病基因及其他高频基因，具有通用、敏感、准确的特点，补充了常规遗传学检测的不足，从分子水平探索了疾病的发生与发展，对耐药患者提供潜在治疗靶点，为临床治疗决策提供重要参考依据，使MM最终达到个体化及精准化治疗。

Description

用于多发性骨髓瘤第二代测序的组合基因及其应用和基于其 的测序方法

技术领域

本发明属于第二代基因测序技术临床应用领域，具体涉及用于多发性骨髓瘤第二代测序的组合基因及其应用和基于其的测序方法。

背景技术

多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）是浆细胞来源的恶性肿瘤，发病率居血液系统恶性肿瘤第2位，其发病机制尚未完全阐明。尽管蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米等）和新型免疫调节剂（如来那度胺等）的应用极大的改善了患者的生存，但至今仍是一种不可治愈的疾病。既往研究发现MM的发生、发展与多个癌基因及原癌基因的异常表达有关，包括Bcl-2，C-myc，RAS，P53，RB1等，但目前为止，没有发现任何一个基因在所有MM患者都存在异常，这提示多种基因异常及多个信号通路参与导致了疾病的发生与发展。同时，大量的研究不断探讨并发现许多新的致病基因及异常激活/抑制的信号通路，并且在治疗过程中发现耐药MM患者可能存在一种以上的基因突变可能与疾病耐药有关，揭示MM的遗传学背景更为复杂，单一基因无法阐明MM的生物学特性，需要从大量的致病基因中筛选出关键基因组合，来阐明MM的发生发展机制及导致肿瘤耐药的机制，对于判断危险分层、明确治疗靶点、指导药物选择具有重要临床意义。

新型高分辨分子学检测手段第二代测序（Next Generation Sequencing，NGS）是基因组学研究的重大进展，通过高通量测序可纳入数以百计的基因进行分析，对肿瘤的基因组全面而综合的分析可深入理解肿瘤的遗传背景及可能的致病机制，但由于其数据量大且分析复杂、花费较高，临床应用较少。对比一代测序技术，NGS技术可显著提高检测灵敏性，随着技术的成熟，多重建库法对DNA起始量要求低，建库时间短可低至6小时，并极大地降低了检测成本。目前仅有几个大规模研究依托临床试验回顾性对MM患者进行了全外显子组的NGS检测，结果仅阐释了西方国家MM患者的基因突变情况，仅提出一些单基因如PRDM1缺失可能与疾病预后有关。而靶向测序是从样品文库中的总DNA中富集指定个数目标DNA片段（即基因panel，基因突变组合），再进行NGS检测，检测数据量少且更易于分析，更加适用于临床。依托于全基因组测序及全外显子组测序的已知结果，筛选出高频基因及体外实验等验证参与多发性骨髓瘤发生发展或耐药的基因。

已有报道的研究机构设立了不同的基因组合如GEP70、SKY92、UAMS70、UAMS80、IFM15及HM19等，但不同的研究NGS检测方式、纳入基因、检测人群差异均较大，导致研究结果偏倚大，同时因大多数检测未进行浆细胞分选，突变检出率较低，使临床应用推广受限。对比目前已申请MM相关靶基因检测专利（CN 111575375 A），MM高频突变基因KRAS/NRAS/BRAF检出率仅27.78%，且多种基因检出率为0，与文献报道不一致。。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明解决的问题在于提供一种用于多发性骨髓瘤第二代测序的组合基因及其应用和基于其的测序方法，该方法适于初诊及复发后的多发性骨髓瘤患者，可为临床治疗选择及判断预后提供分子学依据。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种用于多发性骨髓瘤第二代测序的组合基因检测试剂盒，该检测试剂盒中包含92种靶向基因，分别为：11个耐药基因、1个骨病相关基因、3个POEMS综合征高频突变基因、1个骨肉瘤高频基因、36个多发性骨髓瘤驱动基因（癌基因/原癌基因）以及40个多发性骨髓瘤潜在致病基因（包含可能的治疗靶点基因）在内的92种靶向基因，具体如下：

11个耐药基因分别为：CRBN，STAT3，IKZF3、IKZF1、CUL4B、CUL4A、DDB1、ERN1、NR3C1、PSMB5、PSMB9；

1个骨病相关基因为：GFI1；

3个POEMS综合征高频突变基因为：PCDH10、EML4、KMT2D；

1个骨肉瘤高频基因为：PTEN；

36个多发性骨髓瘤癌基因/原癌基因：ACTG1、ATM、BRAF、CCND1、CDKN1B、CDKN2C、CYLD、DIS3、DNMT3A、EGR1、EP300、FAM46C 、FGFR3、HIST1H1E、IRF4、KDM6A、KLHL6、KRAS、LTB、MAF、MAFB、MAX、NFKB2、NRAS、PRDM1、PIK3CA、PRKD2、PTPN11、RASA2、RB1、SP140、TET2、TP53、XBP1、TRAF3、TRAF2；

40个多发性骨髓瘤高频基因：AKT1、ALK、BIRC3、BIRC2、BRCA2、CARD11、CCND3、CDK4、CDKN2A、CSF3R、CUX1、CXCR4、EGFR、FAT4、FAT3、FAT1、FBXW7、FOXO1、GNAQ、JAK2、JAK1、KIT、LRP1B、MDM2、MKI67、MUM1、MYC、MYD88、PSMG2、RIPK1、ROBO1、ROBO2、RUNX3、RUNX1、SOCS3、SUZ12、TNFRSF21、VCAN、WHSC1、ZFHX4。

本发明所采用的检测方法为第二代测序，其特征在于提高了基因突变检出率，采用本发明检测的初诊MM患者突变率为94.3%（33/35），复发患者中突变率为100%，接近全基因组测序突变检出率（99%）。

本发明还公开了采用上述的组合基因检测试剂盒进行多发性骨髓瘤致病基因、治疗预测靶基因或预后相关基因突变的检测方法，，包括以下步骤：

1）骨髓血标本处理，提取CD138阳性分选细胞；

2）从分选细胞中提取DNA，检测纯度；

3）建立包括所述92种靶向基因编码区全部基因的DNA集合即得到DNA文库；

4）应用二代测序方法对样本进行靶基因序列检测；

5）通过生物信息学方法进行数据分析对比，判断基因是否存在突变，完成测序。

优选地，步骤1）中，采用骨髓CD138分选样本，提取分选细胞。

进一步地，具体操作如下：

将10mL骨髓标本离心去上清，加入等体积的分选缓冲液混匀，加入50μl/mL的CD138微磁珠混匀，4℃孵育15min后加入2ml/ml分选缓冲液冲洗，离心去上清，重悬细胞至总体积10mL，加入全血细胞分离柱洗脱后加压收集目的细胞，获得分选细胞并计数。

优选地，采用流式抗体CD38-APC-A700和CD138-APC进行纯度检测。

进一步地，具体操作如下：

取1×10⁴个分选细胞加入流式管，加入流式抗体CD38-APC-A700、CD138-APC各2μl混匀，避光孵育15分钟；1500rpm离心5min，去上清；加入2ml缓冲液混匀，1500rpm离心5min去上清；加入200μlPBS缓冲液混匀，流式机器检测。

优选地，步骤2）中从分选细胞中提取DNA，具体步骤如下：

（1）取1×10⁶个分选细胞，应用200μlPBS 缓冲液重悬细胞，加入200μlBufferAL+20μl的蛋白酶，涡旋震荡混匀15秒，瞬时离心；

（2）56°C水浴锅水浴10分钟，离心，甩干盖子上的液体；

（3）加入200μl无水乙醇，混匀，瞬时离心；

（4）将全部液体移至旋转柱中，12000rmp离心3min，去掉收集管，放入新的收集管中；

（5）加入 500μlAW1缓冲液，12000rmp离心1min，去掉收集管，放入新的收集管中；

（6）加入 500μlAW2缓冲液，12000rmp离心1min，去掉收集管，放入新的 EP 管中；

（7）12000rmp离心3min，室温干燥 1min，放入新的EP管中，取 100μlAE缓冲液中，在中间白色薄膜里，室温孵育 5min及以上，12000 rpm离心1min。

取1μlDNA 测浓度，A260/A208 比值在1.7- 1.9合格。

优选地，步骤3）建立的DNA文库浓度要求≥0.3ng/μL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提出的采用92种突变基因形成的检测组合，是依据MM患者全基因组测序结果进行设计，纳入了致病基因、耐药基因及高频突变基因，是对现有遗传学检测的精细补充，对疾病发展过程及治疗结果进行分子层面的阐释，有利于筛选治疗靶点，是MM进入个体化治疗及精准化治疗的重要依据。检测CD138分选细胞92个靶基因突变情况，对比已申请专利（CN 111575375 A）纳入48个基因组合，新纳入了55个MM相关基因，祛除了13个基因，在提高基因突变检出率的同时，纳入低频但具有明确预后价值的基因，如ZFHX4，可更好的指导临床。因此，本发明提供的新型基因测序组合，囊括了MM相关致病基因、耐药基因、骨病基因及其他高频基因，具有通用、敏感、准确的特点，补充了常规遗传学检测的不足，从分子水平探索了疾病的发生与发展，对耐药患者提供潜在治疗靶点，为临床治疗决策提供重要参考依据，使MM最终达到个体化及精准化治疗。

本发明提出应用CD138分选骨髓细胞进行检测的方法，提高了肿瘤丰度，检测的样本中肿瘤浓度可达95%，检测到的突变基因比例较文献报道更多，提高了检测的准确性及特异性，对临床的指导价值更大。本发明应用二代测序技术，对比一代测序技术提高了检测灵敏度，减少了建库所需DNA起始剂量，缩短了建立DNA文库时间至6小时，降低了检测成本，使该技术更加利于推广应用。

附图说明

图1为MM患者骨髓标本CD138分选后流式检测结果FSC-A，分选纯度在95%左右；图中横坐标FSC提示细胞内颗粒度，纵坐标SSC提示细胞大小，所圈细胞为所有分选细胞；

图2为MM患者骨髓标本CD138分选后流式检测结果CD138APC-A；图中横坐标为CD138单抗标记，纵坐标为CD38单抗标记，所圈P3群细胞为CD38阳性CD138阳性骨髓瘤细胞；

图3为MM患者骨髓标本CD138分选后显著提高了肿瘤丰度结果图；

图4为NGS检测48例样本突变瀑布图；

图5为NGS检测48例样本初诊MM基因突变情况柱状图；

图6为NGS检测48例样本复发MM基因突变情况柱状图；

图7为NGS检测高频突变基因KRAS突变图谱；图中，KRAS检测到的五个突变位点G12S、G12R、G12A、Q61L及Q61H；

图8为NGS检测高频突变基因NRAS突变图谱；图中NRAS检测到的七个突变位点G12S、G12D、G13R、Q61K、Q61R、Q61L及Y64D。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

1、基因组合设计及引物设计：纳入既往文献报道骨髓瘤患者全基因组测序的：11个耐药基因、1个骨病相关基因、3个POEMS综合征高频突变基因、1个骨肉瘤高频基因、36个多发性骨髓瘤驱动基因以及40个多发性骨髓瘤潜在致病基因，具体如下：

11个耐药基因分别为：CRBN、STAT3、IKZF3、IKZF1、CUL4B、CUL4A、DDB1、ERN1、NR3C1、PSMB5、PSMB9；

1个骨病相关基因为：GFI1；

3个POEMS综合征高频突变基因为：PCDH10、EML4、KMT2D；

1个骨肉瘤高频基因为：PTEN；

36个多发性骨髓瘤驱动基因：ACTG1、ATM、BRAF、CCND1、CDKN1B、CDKN2C、CYLD、DIS3、DNMT3A、EGR1、EP300、FAM46C、FGFR3、HIST1H1E、IRF4、KDM6A、KLHL6、KRAS、LTB、MAF、MAFB、MAX、NFKB2、NRAS、PRDM1、PIK3CA、PRKD2、PTPN11、RASA2、RB1、SP140、TET2、TP53、XBP1、TRAF3、TRAF2；

40个多发性骨髓瘤潜在致病基因：AKT1、ALK、BIRC3、BIRC2、BRCA2、CARD11、CCND3、CDK4、CDKN2A、CSF3R、CUX1、CXCR4、EGFR、FAT4、FAT3、FAT1、FBXW7、FOXO1、GNAQ、JAK2、JAK1、KIT、LRP1B、MDM2、MKI67、MUM1、MYC、MYD88、PSMG2、RIPK1、ROBO1、ROBO2、RUNX3、RUNX1、SOCS3、SUZ12、TNFRSF21、VCAN、WHSC1、ZFHX4。

具体如下表1所示，应用illumina官网提供的design studio，输入检测基因及检测区域自动化设计（https://designstudio.illumina.com/），进行引物合成。

表1

2、患者骨髓标本CD138分选，具体操作步骤如下：

取患者10毫升骨髓血过100μm筛网，445g离心10分钟去上清，加等体积的分选缓冲液（auto MACS Running Buffer）充分混匀，在缓冲液中获得悬浮的细胞。

在每毫升上述缓冲液中悬浮的细胞中加入50μL CD138微磁珠（美天旎）混匀，4℃冰箱孵育15分钟，获得样本。

每毫升样本用2毫升分选缓冲液冲洗，445g室温离心10分钟后去上清，应用分选缓冲液重悬细胞至总体积10毫升，得到处理好的样本。

3毫升分选缓冲液润洗全血细胞分离柱，后将处理好的样本放入全血细胞分离柱，加入2毫升分选缓冲液润洗2遍，最后加入4毫升全血细胞柱洗脱缓冲液，迅速用加压棒加压后收集目的细胞。

应用细胞计数板计数分选细胞数量。

流式检测CD138分选分细胞纯度，具体操作步骤如下：

取1×10⁴个分选细胞加入流式管，加入流式抗体CD38-APC-A700、CD138-APC各2μl混匀，避光孵育15分钟。

1500rpm离心5min，去上清。加入2ml缓冲液混匀，1500rpm离心5min去上清。

加入200μlPBS缓冲液混匀，流式机器检测。

分选结果具体如图1所示，图1中横坐标FSC提示细胞内颗粒度，纵坐标SSC提示细胞大小，所圈细胞为所有分选细胞；图2中横坐标为CD138单抗标记，纵坐标为CD38单抗标记，所圈P3群细胞为CD38阳性CD138阳性骨髓瘤细胞，分选纯度为94.7%。

3、DNA提取，具体操作步骤如下：

取1×10⁶个分选细胞，应用200μlPBS缓冲液重悬细胞，加入200μlBufferAL+20μl的蛋白酶，涡旋震荡混匀15秒，瞬时离心。

56°C水浴锅水浴10分钟，稍离心，甩干盖子上的液体。

加入200μl无水乙醇，轻轻颠倒混匀，以防破坏 DNA 链，瞬时离心。

将全部液体移至旋转柱中，12000rmp离心3min，去掉收集管，放入新的收集管中。

加入 500μlAW1缓冲液，12000rmp离心1min，去掉收集管，放入新的收集管中。

加入 500μlAW2缓冲液，12000rmp离心1min，去掉收集管，放入新的 EP 管中。

12000rmp离心3min，室温干燥 1min，放入新的EP管中，取 100μlAE缓冲液中，在中间白色薄膜里，室温孵育 5min及以上，12000 rpm离心1min。

取1μlDNA 测浓度，A260/A208 比值在1.7- 1.9合格。

4、Illumina DNA 建库，使用 Ampliseq for Illumina DNA 建库试剂盒，具体操作步骤如下：

DNA均一化：将定量好的 DNA 样本用 PCR-grade water 统一稀释到 5ng/μL。

靶向扩增：样本反应预混液包含2μl的PCR-grade water及4μl的5X AmpliseqHiFi Mix，分为2管，每管0.2mlPCR管中加入3μl预混液，每管分别加入2μl均一化的DNA。2管中分别加入5μL 2X AmpliSeq Custom DNA Panel Pool1、2，涡旋混匀10秒后离心，放入PCR仪。设置PCR程序8分钟×18循环，运行程序为：

9℃×2min→99℃×15s+60℃×8min，共18循环→10℃hold。

靶向引物消化：-20℃冰箱取出FUPA reagent，冰盒上解冻。靶向扩增后的2管合并后加入2μl FUPA reagent，稍离心，振荡混匀10秒再离心，放入PCR仪，运行程序为：

50℃×10min→55℃×10min→62℃×20min→10℃hold。

接头连接：-20℃冰箱取出Switch solution及和 Ampliseq CD 接头 DNALigase，冰盒上解冻后混匀离心待用。每个样本中加入4μl的Switch solution及2μl DNALigase，加入2μlAmpliseq CD，涡旋混匀10s后离心。运行PCR程序为：

22℃×30min→68℃×5min→72℃×5min→10℃hold。

接头连接产物纯化：AMPure XP 磁珠室温孵化30分钟，振荡1min混匀，3个1.5mlEP管分别加入30μL,25μL 和 60μL 磁珠，标记n1、n2、n3。接头连接产物加入n1中振荡混匀离心，室温5分钟，置于磁力架上2分钟，溶液澄清后吸去上清，加入200μL70%酒精，孵育30s，溶液清澈后吸去上清，重复1次后磁力架上晾干3分钟。

Post-PCR扩增纯化：配置扩增反应预混液1X Library Amp Mix 45μL+ 10XLibrary Amp Primers 5μL，加入样本中，转移至0.2mlPCR管，运行PCR程序98℃×2min→98℃×5s+64℃×min共7个循环→10℃hold。产物转移至n2中，震荡离心后孵育5分钟，磁力架上放置5分钟，溶液澄清后转移上清至n3中，震荡离心后孵育5分钟，磁力架上放置5分钟，溶液澄清后去上清，加入200μL70%酒精，孵育30s，溶液清澈后吸去上清，重复1次后室温孵育5分钟。加入50μL Low TE，振荡混匀离心，室温孵育5分钟，磁力架放置5分钟，溶液澄清后转入1.5mlEP管中贮存。

文库质量检测：应用ABI Qubit4进行检测，文库浓度要求≥0.3ng/μL。

5、应用Illumina 测序仪(MiSeq 型号)进行测序检测，具体操作步骤如下：试剂夹盒常温解冻60分钟，加入600μL DNA文库，依据说明书进行仪器设置，装载试剂夹盒，启动运行，检测结束后导出检测数据。

6、测序检测结果的生物信息学分析，具体操作步骤如下：

数据预处理：使用分析系统中的bcl2fastq软件将miseq测序生成的bcl文件文件转换成样本对应的fastq文件。

数据比对：使用分析系统的序列比对模块(基于bwa 0.7.17)将fastq文件中的碱基序列比对至hg19（GRCh37）人类参考基因组上生成bam文件，并根据基因组坐标对bam 文件进行排序。

引物软切除：使用分析系统中的引物切除模块（translatebam）对序列两端属于引物部分做软切除。

数据质控：使用分析系统中的数据质控模块计算每个样本的Q30碱基占比，序列比对至参考基因组比例，目标区域的平均深度，均一性等参数。

序列重比对和突变分析：使用分析系统的pisces软件(pisces 5.2.11.163)对bam文件进行局部重比对，碱基质量矫正和突变分析。

突变注释：使用注释模块（基于ANNOVAR v20180416）对鉴定出的点突变和插入缺失进行HGVS格式和COSMIC数据框(v86)注释。

具体地，采用本发明的方法检测48例样本获得的突变瀑布图如图4所示，于初次诊断MM及MM复发时行常规骨穿检查，骨髓液应用CD138+磁珠分选后获得骨髓瘤细胞悬液，提取DNA后建立MM-92个基因的靶基因DNA文库，应用Illumina仪器进行测序，应用生物信息学分析系统判断基因突变情况，带入R软件中生成图4。图4中深红色方框为Truncating，橘色方框代表Multiple Mutation，蓝色方框代表Missense，左侧纵坐标为检测到的40种基因突变，右侧纵坐标为初诊MM患者该基因的检测频率、复发患者的检测频率，上标题De novo为初诊MM患者（n=35），Relapse为复发MM患者（n=13），其中初诊患者中仅2例未检测出任何基因突变，初诊MM患者突变率为94.3%，所有复发MM患者均检测到基因突变。

本发明选择48例于北京积水潭医院诊断的多发性骨髓瘤患者骨髓CD138⁺阳性浆细胞，检测48例样本获得的突变柱状图如图5和图6所示，图5为初诊MM基因突变情况，可以看出，突变比例前五位的基因分别为KRAS、NRAS、TP53、DIS3及BRAF，图6位为复发MM基因突变情况，可以看出，突变比例前五位的基因分别为KRAS、NRAS、BRAF、TP53及CYLD。因此，进一步检测高频突变基因KRAS及NRAS突变图谱如图7和图8所示，图7为KRAS检测到的五个突变位点G12S、G12R、G12A、Q61L及Q61H，图8为NRAS检测到的七个突变位点G12S、G12D、G13R、Q61K、Q61R、Q61L及Y64D。

对比专利“多发性骨髓瘤预后相关基因突变检测试剂盒及检测方法”（CN106148551 A），该发明应用PCR方法检测未分选多发性骨髓瘤标本中22个基因的热点突变位点。本发明采用二代测序方法检测CD138分选后多发性骨髓瘤标本中92个基因的蛋白质编码区（sequence coding for amino acids in protein, CDS），通过一下三点提高了突变检出率（1）CD138分选提高了肿瘤丰度，本发明前期研究显示未分选标本18例，6例检出1种及以上基因突变，检出率为33.3%，而分选后标本检出率提高到95.8%；（2）检测CDS区域，能够检出基因的非热点突变；（3）增加了72种基因，去掉了ANK2及NEB（近2年文献报道较少且预后意义不明确），增加了少见基因突变的检出。具体增加的72种基因中，包含11种耐药相关基因可指导临床用药、3种POEMS基因及1种骨肉瘤基因用于鉴别诊断、1种骨病相关基因及其他56种预后相关基因。本发明应用价值的实际临床示例：初诊多发性骨髓瘤IgG-κ型III期A组（DS分期）I期（ISS分期）I期（FISS分期）患者，女性，54岁，FISH检测阴性，分期及分型，在新药时代预计中位无进展生存期66个月，预计中位总生存期尚未达到，该患者NGS检测到KRAS错义突变（G13D）44.8%，TET2错义突变（S1898P），该患者应用MM标准化治疗12个月疾病进展，并出现髓外肿物，髓外肿物NGS检测出现ZFHX4错义突变（P996H）6.5%，提示该突变为肿瘤进展后出现的亚克隆，应用新药治疗效果差，总生存15个月，显著低于传统预后分层所提示的中位生存期，依据本发明检测基因结果，TET2基因突变为表观遗传学相关基因，在多发性骨髓瘤中检出率约为5.8%，有表观遗传学基因突变的多发性骨髓瘤患者预后较差（PMID：32299093），此类病人造血干细胞中亦存在该基因突变，导致自体移植治疗效果差（PMID：32533060），在复发时出现的ZFHX4基因突变亚克隆也预示着较短的无病生存期（PMID：26282654）。该例患者从基因突变层面更好的预示了现有治疗手段下的不良预后结局，对临床具有更大的指导意义。

对比已申请专利“一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒和检测方法”（CN111575375 A）应用二代测序方法检测CD138磁珠分选后多发性骨髓瘤标本的48种基因的热点突变区域，该专利报道的基因检出率为100%（18/18），突变比例前4位的基因分别为CCND1、CXCR4、KDM6A、IL7R，而大型全基因组测序结果回报多发性骨髓瘤基因突变比例前5位多为KRAS、NRAS、DIS3、BRAF、TP53（PMID：29884747及31444325）。本发明检测样本较多，对48例多发性骨髓瘤患者CD138分选标本进行了92个基因CDS区域检测，初诊病人检出率为94.3%，复发病人检出率为100%，总体检出率为95.8%，文献报道246靶基因测序检出率为98.6%（412/418）（PMID：29789651），且本发明所报道检出基因突变比例顺序与文献报道一致，检测流程及生物信息学分析严谨，使结果真实可信。本发明较之新增加55种基因，去除13种检出比例低、预后不明确基因，具体增加的基因有11种耐药相关基因可指导临床用药、3种POEMS基因及1种骨肉瘤基因用于鉴别诊断、1种骨病相关基因及其他39种预后相关基因。本发明应用价值的实际临床示例：初诊多发性骨髓瘤IgG-λ型II期A组（DS分期）II期（ISS分期）II期（RISS分期），FISH检测阴性，在新药时代预计中位无进展生存期42个月，预计中位总生存期大于88个月，多发性骨髓瘤一线治疗获得非常好的部分缓解后行自体造血干细胞移植，移植后巩固治疗后来那度胺联合地塞米松维持治疗2年复发，无进展生存期38.3个月，复发后CD38单抗新药治疗无效，复发后检测到BRAF错义突变（V600E）3.8%，CRBN无义突变（Q198*）5.1%，提示该患者蛋白酶体抑制剂耐药、免疫调节剂耐药，揭示了为何疾病复发，可以选择BRAF-V600E抑制剂维莫非尼治疗，对临床选择治疗药物具有重大意义。

综上所述，本发明基于相关基因数据库，能够制定适用于MM患者的靶向基因检测组合，依托于大规模临床研究及生物信息学分析，完善的多基因分层体系，能够指导医生对MM患者进行预后分层及治疗选择，也是MM患者进入精准治疗及分层的重要一步。

本发明提供的针对MM基因突变检测组合对初诊及难治复发患者的致病基因及耐药基因进行检测，探讨突变基因对预后分层评价、靶向药物选择的指导价值，从而改善骨髓瘤患者预后，进一步优化目前的治疗体系。因此，本发明公开的可用于多发性骨髓瘤初诊及复发患者的第二代测序基因突变检测组合方案，包含致病基因、耐药基因及高频突变基因在内的92种基因，并通过48例初诊及复发骨髓瘤患者骨髓分选浆细胞进行验证，与临床治疗疗效及预后相关，表明该基因突变检测组合是可行的、准确的，具有临床应用价值。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种用于多发性骨髓瘤第二代测序的组合基因在制备多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述用于多发性骨髓瘤第二代测序的组合基因为92种靶向基因，分别为：11个耐药基因、1个骨病相关基因、3个POEMS综合征高频突变基因、1个骨肉瘤高频基因、36个多发性骨髓瘤驱动基因以及40个多发性骨髓瘤潜在致病基因，具体如下：

11个耐药基因分别为：CRBN、STAT3、IKZF3、IKZF1、CUL4B、CUL4A、DDB1、ERN1、NR3C1、PSMB5、PSMB9；

1个骨病相关基因为：GFI1；

3个POEMS综合征高频突变基因为：PCDH10、EML4、KMT2D；

1个骨肉瘤高频基因为：PTEN；

36个多发性骨髓瘤驱动基因：ACTG1、ATM、BRAF、CCND1、CDKN1B、CDKN2C、CYLD、DIS3、DNMT3A、EGR1、EP300、FAM46C、FGFR3、HIST1H1E、IRF4、KDM6A、KLHL6、KRAS、LTB、MAF、MAFB、MAX、NFKB2、NRAS、PRDM1、PIK3CA、PRKD2、PTPN11、RASA2、RB1、SP140、TET2、TP53、XBP1、TRAF3、TRAF2；

40个多发性骨髓瘤潜在致病基因：AKT1、ALK、BIRC3、BIRC2、BRCA2、CARD11、CCND3、CDK4、CDKN2A、CSF3R、CUX1、CXCR4、EGFR、FAT4、FAT3、FAT1、FBXW7、FOXO1、GNAQ、JAK2、JAK1、KIT、LRP1B、MDM2、MKI67、MUM1、MYC、MYD88、PSMG2、RIPK1、ROBO1、ROBO2、RUNX3、RUNX1、SOCS3、SUZ12、TNFRSF21、VCAN、WHSC1、ZFHX4。

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