CN113005197B - 检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒及其应用 - Google Patents
检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒及其应用，所述试剂盒为基于高通量DNA测序技术检测试剂盒，用于检测直肠癌放化疗敏感性相关的18个基因的DNA突变位点，该试剂盒包括检测基因突变位点的特异性引物，所述的特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35所示，所述的特异性引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36所示。本发明的肿瘤组织标本检测基因DNA突变位点稳定性好，临床可操性强，检测过程简便。本发明可用于区分对新辅助放化疗敏感的局部晚期直肠癌患者，使其在新辅助放化疗中显著获益。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学诊断技术领域，具体涉及一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒及其应用。
背景技术
恶性肿瘤中，结直肠癌发病率在全球排名第3、我国排名第5；其发病率呈现快速上升且年轻化的趋势，是影响我国社会发展的常见恶性肿瘤，严重危害人类健康。新辅助放化疗是直肠癌整体治疗策略的主要组成部分，而新辅助放化疗敏感性在个体间存在显著差异。新辅助放化疗后肿瘤退缩的程度与患者的长期生存率和生存质量显著相关，新辅助放化疗后手术时约30％患者可达到完全病理缓解，如果能提前预测肿瘤的退缩，在新辅助放化疗后采用前瞻性严密的等待和观察策略，可以使这部分患者避免手术保留肛门；另有部分患者即使接受了强烈的新辅助放化疗，肿瘤退缩仍不尽人意，如果能提前预测肿瘤退缩有限，则可以从治疗初始调整治疗策略和增加治疗强度，以提高这部分患者的生存率，延长生存时间。直肠是非常特殊的器官，根据最大程度的根治肿瘤和最大程度的保证脏器功能两大原则，能够在保证肿瘤疗效的同时最大程度保存患者生存质量，尽可能提高不良预后患者的疗效，是直肠癌治疗领域急需开展的工作。
DNA是遗传物质，是所有生物性状最决定性的因素。人类95％的疾病与基因相关，每个人的基因信息都不一样，基因信息不仅是生命科学研究的重要内容，更是人类攻克疑难病症的重要依据。高通量二代基因测序技术，又称“新一代测序技术”，基于平行测定几十万到几百万条DNA分子序列以及后续的数据处理和比对，高通量二代基因测序技术允许同时检测多种类型的基因遗传变异，包括单核苷酸变异(SNV)，小的插入/缺失(indel)以及拷贝数变异(CNVs) 或复杂的基因组重排。当前，国内外对直肠癌术前放化疗后病理完全缓解的预测尚缺乏DNA层面基因测序的研究；
既往研究中，临床因素(初始临床分期、癌胚抗原水平等)对新辅助放化疗后疗效预测效果不佳。文献中探讨过至少40种不同的可能与直肠癌新辅助放化疗敏感性相关的分子指标，例如TP53、KRAS、TYMS、MTHFR等基因，结果一致性非常不理想，相互矛盾的结果常有存在。除TP53基因突变以外，其余基因突变与直肠癌新辅助放化疗敏感性的关系没有得到多个研究的证实。当前临床和分子指标用于预测新辅助放化疗后疗效的效能十分有限，局限于理论和经验挑选研究对象，注定难以高效挖掘出大量影响研究结局的分标记。因此，结合临床病理特征联合基因检测建立直肠癌新辅助放化疗后疗效精准预测模型是决定直肠癌精准个体化医疗能否成功的关键因素。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术中的不足之处，本发明的所解决的技术问题在于提供一种一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒，能够稳定、有效地基于基因DNA突变位点预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性，筛选对放化疗敏感的患者，使其在新辅助放化疗中显著获益。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案的如下：
一种检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为基于高通量DNA测序技术检测试剂盒，用于检测直肠癌放化疗敏感性相关的18个基因的DNA突变位点，该试剂盒包括检测基因突变位点的特异性引物，所述的特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、3、5、 7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35所示，所述的特异性引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36所示。
所述特异性引物如下表1所示：
进一步地，所述的基因DNA突变位点如下：chr6_33052958_C_T、chr9_125316157_C_T、chr9_123850770_G_A、chr3_122259606_T_C、 chr6_160211646_GTT_、chr1_160920966_C_T、chr8_23294761_T_C、 chr7_122635024_C_T、chr6_56420538_C_T、chr1_232574921_T_C、 chr8_21862551_A_G、chr11_66254085_G_T、chr5_55406952_T_C、 chr19_45001346_G_A、chr16_58318604_T_C、chr1_150679033_G_A、 chr21_47974582_A_G、chr11_44636833_G_A。
进一步地，所述试剂盒还包括用于检测基因DNA突变位点肿瘤组织中水平的试剂。
更进一步地，所述用于检测基因DNA突变位点肿瘤组织中水平的试剂为二代测序试剂。
另一方面，本发明还提供了该试剂盒在作为预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的检测试剂中的应用。
具体而言，所述的局部晚期直肠癌为NCCN指南推荐应用新辅助芳华路的 II期、III期局部晚期直肠癌。所述的基因DNA突变位点，在对放化疗敏感的患者肿瘤组织中，其基因突变频率高于对放化疗不敏感的患者。
为了实现该试剂盒在作为预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的检测试剂中的应用，须按照如下步骤建立18个基因DNA突变位点组成的预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的预测模型：
(1)基于二代测序方法，通过全外显子测序筛选局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感患者与新辅助放化疗不敏感患者差异的候选基因DNA突变位点；
(2)靶向测序验证候选基因DNA突变位点；
(3)在由局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感患者与新辅助放化疗不敏感患者组成的训练组中确立可区分对新辅助放化疗敏感的局部晚期直肠癌患者的基因DNA突变位点组合；
(4)在两个独立验证组验证步骤(3)确立的基因DNA突变位点组合预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性组合的效果；
(5)采用逻辑回归模型，分析步骤(3)确立的基因DNA突变位点组合预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性组合的效果。
更进一步地，所述逻辑回归模型中所用的逻辑回归公式为： logit[p＝Logit(P＝PCR)＝-2.66E+01+
5.31E+01*chr6_33052958_C_T-5.63E-12*chr9_125316157_C_T
+9.19E-12*chr9_123850770_G_A+2.73E-12*chr3_122259606_T_C-3.81E-12*chr6_160211646_GTT_.+8.70E-12*chr1_160920966_C_T-8.87E-13*chr8_2329476 1_T_C-3.64E-12*chr7_122635024_C_T+1.72E-13*chr6_56420538_C_T+4.01E-12 *chr1_232574921_T_C-7.88E-12*chr8_21862551_A_G+1.36E-12*chr11_66254085 _G_T+1.05E-11*chr17_25970633_G_A-8.29E-12*chr19_45001346_G_A-7.66E-12 *chr16_58318604_T_C+2.126E-12*chr5_55406952_T_C+0.0.413×chr21_47974582 _A_G-4.711E-6*chr11_44636833_G_A，其中括号内为相应位点突变频率离散化后的数值，并以0.23445803为诊断阈值，高于0.23445803则诊断为放化疗敏感的患者，低于0.23445803则诊断为放化疗不敏感的患者。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明的肿瘤组织标本检测基因DNA突变位点稳定有效，临床可操性强，检测便利，实验方法非常成熟，检测过程简便、易于重复。本发明可用于区分对新辅助放化疗敏感的局部晚期直肠癌患者，使其在新辅助放化疗中显著获益。具体优点如下：
(1)本发明采用高通量筛选、多中心验证以及在前瞻性收集的局部晚期直肠癌标本中进行研究，对基因DNA突变位点组合的效果以及诊断试剂盒进行了全面评估，以上方法和策略的应用保证了本发明在评估局部晚期直肠癌患者对新辅助放化疗是否敏感中的潜在应用价值，并为其他疾病生物放化疗敏感预测标志物的研制提供可借鉴的方法策略。
(2)基因DNA突变位点组合诊断试剂盒能够及时在局部晚期直肠癌患者新辅助化疗前预测其对放化疗是否敏感，使其在新辅助放化疗中显著获益。避免既往繁杂检测，节约时间人力成本，便于临床医生及时采取个性化的防治方案。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
实施例1
本发明的基于基因DNA突变位点预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的诊断试剂盒，所述的基于基因DNA突变位点预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的诊断试剂盒包括检测基因突变位点的特异性引物，所述的特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35所示，所述的特异性引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、 28、30、32、34、36所示。
所述的基因DNA突变位点如下：chr6_33052958_C_T、 chr9_125316157_C_T、chr9_123850770_G_A、chr3_122259606_T_C、 chr6_160211646_GTT_、chr1_160920966_C_T、chr8_23294761_T_C、 chr7_122635024_C_T、chr6_56420538_C_T、chr1_232574921_T_C、chr8_21862551_A_G、chr11_66254085_G_T、chr5_55406952_T_C、 chr19_45001346_G_A、chr16_58318604_T_C、chr1_150679033_G_A、 chr21_47974582_A_G、chr11_44636833_G_A。
所述的基因突变位点为18个基因DNA突变位点，所述的18个基因DNA 突变位点组成的预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的预测模型：
(1)基于二代测序方法，通过全外显子测序筛选局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感患者与新辅助放化疗不敏感患者差异的候选基因DNA突变位点；
(2)靶向测序验证候选基因DNA突变位点；
(3)在由局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感患者与新辅助放化疗不敏感患者组成的训练组中确立可区分对新辅助放化疗敏感的局部晚期直肠癌患者的基因DNA突变位点组合；
(4)在两个独立验证组验证步骤(3)确立的基因DNA突变位点组合预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性组合的效果；
(5)分析步骤(3)确立的基因DNA突变位点组合预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性组合的效果。
更进一步地，所述的基因DNA突变位点，在对放化疗敏感的患者肿瘤组织中，其基因突变频率高于对放化疗不敏感的患者。
所述的基于基因DNA突变位点预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的诊断试剂盒包括用于检测基因DNA突变位点肿瘤组织中水平的试剂。
所述用于检测基因DNA突变位点肿瘤组织中水平的试剂为二代测序试剂。
所述的逻辑回归公式为：logit[p＝Logit(P＝PCR)＝
-2.66E+01+5.31E+01*chr6_33052958_C_T-5.63E-12*chr9_125316157_C_T+9.19E -12*chr9_123850770_G_A+2.73E-12*chr3_122259606_T_C-3.81E-12*chr6_160211646_GTT_.+8.70E-12*chr1_160920966_C_T-8.87E-13*chr8_23294761_T_C-3.64 E-12*chr7_122635024_C_T+1.72E-13*chr6_56420538_C_T+4.01E-12*chr1_23257 4921_T_C-7.88E-12*chr8_21862551_A_G+1.36E-12*chr11_66254085_G_T+1.05E -11*chr17_25970633_G_A-8.29E-12*chr19_45001346_G_A-7.66E-12*chr16_5831 8604_T_C+2.126E-12*chr5_55406952_T_C+0.0.413×chr21_47974582_A_G -4.711E-6*chr11_44636833_G_A，其中()为相应位点突变频率离散化后的数值，并以0.23445803为诊断阈值，高于0.23445803则诊断为放化疗敏感的患者，低于0.23445803则诊断为放化疗不敏感的患者。
本发明的一种基于基因DNA突变位点预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的诊断试剂盒在预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的药物中的应用。
所述的局部晚期直肠癌为NCCN指南推荐应用新辅助芳华路的II期、III期局部晚期直肠癌。
实施例2
肿瘤组织标本的采集及制备
发明人于2005年09月至2017年06月，采集了局部晚期直肠癌的肿瘤组织标本，这些人群满足入组标准。纳入标准主要包括四点：1、首次诊断且未接受过任何治疗的局部晚期直肠患者；2、接受新辅助放化疗、根治性手术及术后辅助化疗标准治疗的患者；3、经过病理组织学检查确诊，TGR分级评分，PCR 组为TRG 1级，即：新辅助放化疗后病理完全缓解(pathological complete response，PCR)，none-PCR组为TRG 2～5级，即：新辅助放化疗后肿瘤仍有残留组(None-PCR组)；4、愿意参与并配合研究随诊者。并根据性别、年龄匹配的原则，设定放化疗敏感组及放化疗不敏感组标本。
筛选组：放化疗敏感组患者(8例)及放化疗不敏感组患者(7例)肿瘤组织样本。
训练组：放化疗敏感组患者(41例)及放化疗不敏感组患者(161例)肿瘤组织样本。
内部验证组：放化疗敏感组患者(18例)及放化疗不敏感组患者(59例)肿瘤组织样本。
外部验证组：放化疗敏感组患者(17例)及放化疗不敏感组患者(56例)肿瘤组织样本。同时检测CEA、CA199等生化指标以及MR等影像学检查。
患者初诊时，肠镜活检留取的患者新鲜肿瘤组织及癌旁组织进行冻存，组织大小均为0.2*0.2*0.2cm，生理盐水冲洗后，放入专用组织冻存管，液氮运输， -80度冰箱保存。
实施例3
全外显子测序及其数据分析
发明人选取8个新辅助放化疗敏感患者以及7个新辅助放化疗不敏感患者肿瘤组织标本用于全外显子测序筛选。
本发明采用Themor Fisher公司的全外显子测序方法筛选新辅助放化疗敏感患者以及新辅助放化疗不敏感间的差异基因突变位点，外显子测序能够检测所有蛋白编码基因外显子区域的DNA突变位点的突变频率。具体步骤参见Themor Fisher网站。得到的原始数据经校准后，发明人采用Ion Torrent信息平台Ion Reporter分析方法和挑选差异基因DNA突变位点，最终筛选得到1385个用于后续验证的候选基因DNA突变位点。
实施例4
靶向测序检测训练组标本基因DNA突变位点水平
步骤1肿瘤组织DNA提取，进行文库构建
1.提取肿瘤组织基因组DNA，
2.利用发明人设计的多重PCR引物，进行目的基因片段捕获，
3.20μL反应体系：5×Phusion HF buffer 4μL，10mM dNTPs 0.4μL，Phusion DNA
Polymerase 2U，NIPT-Library F与NIPT-Library R(10μM)各1μL，DNA 模板40ng。
4.反应程序为：98℃2min，98℃15s，62℃15s，70℃1min，共10个循环， 70℃延长5min。
5.利用磁珠纯化方法去除反应过程中加入的酶及引物等，对目的DNA进行纯化。
6.Agilent 2100Bioanalyzer分析文库的片段分布，主峰为140bp。
7.用Qubit 2.0分析DNA文库的浓度。
8.qPCR定量标准品的Qubit浓度
步骤2上机测序
1.采用步骤1构建完成的文库，进行模板制备、模板富集与上机测序，操作按照Themor Fisher网站说明书进行，使用仪器主要是DA8600及配套仪器。将得到的文库DNA按照qPCR定量方法与Qubit定量方法分别稀释至100pM 进行均匀混合后上机测序，得到的Reads数。
2.测序结果，loading率(即芯片微孔中DNA阳性磁珠的覆盖率)为92％，DNA Reads数为87.12M，而总的reads数达到80M即可说明利用该浓度上机测序是合适的，而该标准品测序后总reads越高，以此标准品检测其他样本，每个样本的reads数也越高，越能满足要求。
步骤3数据分析
1.利用Themor Fisher提供的测序数据突变分析软件variantCaller，分析样本中基因的突变频率。
2.训练组标本按照位点突变频率从大到小排列，并依次取值(如有重复值则只取一次)，根据取值将标本判定为阳性或阴性类群，结合标本的既定类别分析获得每次取值的敏感性和特异性，进一步绘制ROC曲线(Receiver Operating Characteristic Curve)。寻找使(敏感性+特异性)/2值达到最大的点，该点对应的表达数值即为位点离散化的阈值。进一步将高或低于阈值的标本分别赋值为1或0，实现离散化，用于进一步的模型构建。本发明采用的 DNA离散化阈值将用于训练组、验证组中相应DNA数据的离散化，从而将连续变量转变为二分类变量。利用ROC将位点突变频率离散化为0或1。具体方法为选择每个为点中，使其分类效果AUC达到最优的点作为离散化的阈值点对每个位点进行离散化。
3.指标的筛选，利用卡方检验，保留卡方检验中在放化疗敏感与非敏感病人中能够显著区分的位点(P≤0.05)。
4.采用stepwise方法，代入逻辑回归进一步筛选位点，利用逻辑回归构建分类器模型。
实施例5
训练组中确定最优DNA突变位点组合
建模结果显示，逻辑回归模型构建的18个DNA突变位点组合为最优组合，其评估局部晚期直肠癌病人放化疗敏感性的公式为：logit[p＝Logit(P＝PCR)＝ -2.66E+01+5.31E+01*chr6_33052958_C_T-5.63E-12*chr9_125316157_C_T+9.19E -12*chr9_123850770_G_A+2.73E-12*chr3_122259606_T_C-3.81E-12*chr6_16021 1646_GTT_.+8.70E-12*chr1_160920966_C_T-8.87E-13*chr8_23294761_T_C-3.64 E-12*chr7_122635024_C_T+1.72E-13*chr6_56420538_C_T+4.01E-12*chr1_23257 4921_T_C-7.88E-12*chr8_21862551_A_G+1.36E-12*chr11_66254085_G_T+1.05E -11*chr17_25970633_G_A-8.29E-12*chr19_45001346_G_A-7.66E-12*chr16_5831 8604_T_C+2.126E-12*chr5_55406952_T_C+0.0.413×chr21_47974582_A_G -4.711E-6*chr11_44636833_G_A，其中公式中位点信息为相应病人活检组织检测DNA突变频率离散化后的数值。
该组合在训练组中可以区分局部晚期结直肠癌放化疗敏感性人群，具有很好的肝癌诊断效果，表现在DNA突变位点组合的AUC均大于CA199或CEA 的AUC(P≤0.05)(表2)。
验证组中验证DNA突变位点组合预测放化疗敏感性病人。在训练组中确立的DNA突变位点组合预测放化疗敏感性病人。所述组合在验证内部验证和外部验证组中仍可放化疗敏感性病人，具有很好的预测效果，表现在DNA突变位点组合的AUC均大于CA199或CEA(表2)。分类器与临床指标的分类效果如表 2所示：
表2
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
<120> 检测直肠癌放化疗敏感性相关18基因突变位点的试剂盒及其应用
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cactccagca tcactcactt tg 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gggagctgaa ggactactac ct 22
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctacaccagt tttatcatct tttgctcatc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caaaaatctg tttctaccac ttaccttgag 30
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcagaaaac caagaagctc tacattga 28
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaccatttc ttcataagac tcattgcttt 30
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgttggaga cactcagcac a 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gcctggttcc gagtccaatc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagggaacac ttctacctgg g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggctgtccta gcagttgtgg 20
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcaggaagga ctgtcctcac t 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gagcacatgg aagccttacc t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
catgatctgc gcgttgatgt 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggctgtgctt tctcgtcttc a 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tctgcatcag ctggactgtt g 21
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acctagtgaa cagtcagttc ctatatcc 28
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gattgttcta catggcatat tcacatcc 28
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccagtcagct ttagcccaga atg 23
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgagtctacc tggtcgtgta gt 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gcggctatga gaggttttcc tc 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tcaccaccac attctgcatg tac 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgctgtgaca gaaagtgagt gag 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggccaagttt ctcagctgtt ga 22
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaacccatca ggaaagttcc agtt 24
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggaaccattc tggtggtcat ga 22
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
agagagacaa caaggaggtg tga 23
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgagcaagtt ttaatgacgt tgttacattc 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gctctcattc ctaactgaac atcagaaaat 30
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
aagaagccga agaatcccag tac 23
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ccaggatgat cctgtctaac acca 24
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ctccctgcca aggaggacaa g 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaggcagtag gtgtgcatgt ag 22
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctgttaaaga agctctcacc tgtgt 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
agggacacca gttgcctact attaa 25
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gtggattcgg accagtctga 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccaggacatg gcgaggagta 20
Claims (5)
1.一种检测直肠癌放化疗敏感性相关的 18个 基因突变位点的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为基于高通量DNA测序技术检测试剂盒，用于检测直肠癌放化疗敏感性相关的18个基因的DNA突变位点，该试剂盒包括检测基因突变位点的特异性引物，所述的特异性引物的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35所示，所述的特异性引物的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测基因DNA突变位点在肿瘤组织中水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述用于检测基因DNA突变位点在肿瘤组织中水平的试剂为二代测序试剂。
4.如权利要求1所述的试剂盒在制备预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的检测试剂中的应用；
所述的局部晚期直肠癌为NCCN指南推荐应用新辅助放化疗的II期、III期局部晚期直肠癌；
所述的基因DNA突变位点，在对放化疗敏感的患者肿瘤组织中，其基因突变频率高于对放化疗不敏感的患者。
5.根据权利要求4的所述的应用，其特征在于：在该应用的实际预测过程中，须按照如下步骤建立18个基因DNA突变位点组成的预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性的预测模型：
(1)基于二代测序方法，通过全外显子测序筛选局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感患者与新辅助放化疗不敏感患者差异的候选基因DNA突变位点；
(2)靶向测序验证候选基因DNA突变位点；
(3)在由局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感患者与新辅助放化疗不敏感患者组成的训练组中确立可区分对新辅助放化疗敏感的局部晚期直肠癌患者的基因DNA突变位点组合；
(4)在两个独立验证组验证步骤(3)确立的基因DNA突变位点组合预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性组合的效果；
(5)采用逻辑回归模型，分析步骤(3)确立的基因DNA突变位点组合预测局部晚期直肠癌新辅助放化疗敏感性组合的效果。
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