CN111575375A - 一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒,所述的试剂盒包含分别与各检测基因对应的多个叠瓦式寡核苷酸探针,用于获取所述检测基因的热点突变区域的变异信息;所述检测基因包括48个检测基因。本发明还公开了采用免疫磁珠分选细胞结合高通量测序技术检测能提高多发性骨髓瘤基因突变的检出率,可有效避免在多发性骨髓瘤中低频比例的基因突变漏检情况,在多发性骨髓瘤的诊断、治疗以及微小残留病灶(MRD)监测应用中具有广泛的临床价值。
Description
技术领域
本发明属于基因突变检测技术领域,具体涉及一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒和检测方法。
背景技术
目前已知的血液肿瘤就包括了40多种白血病、50多种淋巴瘤和多种骨髓瘤。多发性骨髓瘤是浆细胞异常增生的恶性肿瘤,是一种目前还无法治愈的血液恶性肿瘤。多发性骨髓瘤(MM)是一种恶性浆细胞克隆增殖性疾病,正常的浆细胞负责生成对抗感染的抗体(免疫球蛋白),骨髓中发生癌变的浆细胞称为骨髓瘤细胞,它在骨髓中大量增殖聚集,替代了骨髓中正常的细胞,破坏正常的免疫系统,并抑制正常的造血功能,进一步损伤骨骼及软组织(神经和肌肉等)等的功能。多发性骨髓瘤在全球发病率各不相同,在美国,多发性骨髓瘤是继非霍奇金淋巴瘤的血液系统第二大恶性肿瘤,约占所有恶性肿瘤的1%,占血液系统恶性肿瘤的13%。在中国,多发性骨髓瘤发病率约为1/10万~2/10万,已经超过急性白血病,位居血液系统恶性肿瘤发病率的第二位。
随着对多发性骨髓瘤发病机制研究的不断深入、诊断标准和预后评估方式的更新、新药的不断问世,以及异基因造血干细胞移植供者来源问题的解决,MM患者的治疗效果已经明显得到改善。近几年来,国内多发性骨髓瘤诊疗水平也取得了长足进步,逐渐与国际水平接轨。NCCN、ESMO、中国多发性骨髓瘤诊治指南中明确指出关于多发性骨髓瘤的诊断分型、鉴别诊断、治疗及复发治疗。数据库中权威文献报道与多发性骨髓瘤相关基因突变的预后影响,其中包括预后良好的基因(IRF4、EGR1等)突变,预后不良的基因(TP53、ATM、ATR、ZFHX4等)突变,这些基因的变异情况均可作为MM患者预后分子标记物。
高通量测序技术(NGS)出现以来,血液肿瘤受相关基因突变影响尤为明显。最常见的基因涉及MAPK通路、NF-kB通路、DNA损伤应答/TP53通路。迄今为止的实验证据表明,多发性骨髓瘤的进展,无论是无症状期的自发进展还是治疗后的复发,都与其异质性克隆及亚克隆成分有关。新发的多发性骨髓瘤(MM)突变谱具有高度异质性,只有少数基因突变在多发性骨髓瘤患者中反复出现,而<10%的患者中同时存在多个的基因突变,在同一患者中,基因突变通常只存在于一小部分细胞中,因此,我们需要将这一小部分细胞先富集纯化做预处理,再从预处理后的细胞中提取核酸进行高通量测序。这样,预处理和复发多发性骨髓瘤患者样本中,亚克隆结构的基因突变检测频率更高。
目前,我们仍然主要依靠形态学特征和有限的免疫表型来识别克隆浆细胞,浆细胞疾病的范围从无症状的浆细胞单克隆群到浆细胞白血病和多发性骨髓瘤,其中骨髓中的正常细胞可以被骨髓瘤浆细胞积累所取代。免疫磁珠分选细胞已成为一种宝贵的工具,根据多发性骨髓瘤患者CD138+的强表达,浆细胞可以从其他白细胞中分离出来。本发明中涉及了采用免疫磁珠分选法从新鲜或冷冻的人骨髓单核细胞中分离高纯度CD138+细胞,通过识别CD138表面标记物的抗体靶向CD138+细胞进行阳性选择,相比流式细胞仪分选的复杂操作,此方法具有温和、快速简单、高纯度的优势。
基于富集CD138+细胞的基础上,对富集后CD138+细胞进行核酸提取,设计一系列的叠瓦式寡核苷酸探针,探针覆盖区域为与多发性骨髓瘤相关的48种基因编码区,通过探针与基因组DNA片段进行杂交实现对特定基因组区域的富集,随后通过NGS技术对该区域进行深度测序,发现目标区域的特定变异信息。鉴于市场上与多发性骨髓瘤相关基因检测大多是对全血细胞中提取的核酸DNA进行高通量深度测序,由于多发性骨髓瘤基因突变通常只存在于一小部分细胞中,我们需要将这一小部分细胞先富集,可以避免在多发性骨髓瘤中漏检基因变异的情况。
本发明涉及数据库文献中报道与多发性骨髓瘤相关的48种基因的检测,按基因功能分类主要分为:信号传导通路基因,如ATM、BIRC、BRAF、CARD11、EGFR、KIT、CXCR4、PTPN11及KRAS等;免疫途径基因,如B2M;细胞周期调节基因:CCND1、CDKN1B;抑癌基因,如WT1、TP53、CDKN2A;转录因子基因,如CUX1、IKZF1、PHF6、RB1等;甲基化基因,如IDH1、IDH2、TET2等;原癌基因,如MYC;染色质修饰基因,如KDM6A。
发明内容
本发明的目的在于,克服现有技术中的不足,提供一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒和检测方法,以此解决现有的基因突变检测技术中,漏检基因变异的情况。本试剂盒通过温和、高效、快速、简单的方法对多发性骨髓瘤患者浆细胞中CD138+细胞进行富集,对富集后的CD138+细胞进行文库构建结合高通量测序技术检测基因突变。
本发明提供了一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒,所述的试剂盒包含分别与各检测基因对应的多个叠瓦式寡核苷酸探针,用于获取所述检测基因的热点突变区域的变异信息;所述检测基因包括48个检测基因:ATM、B2M、BIRC3、BRAF、CARD11、CCND1、CDKN1B、CDKN2A、CSF3R、CUX1、CXCR4、DIS3、DNM2、EGFR、FAM46C、FAT1、FGFR3、FLT3、IDH1、IDH2、IKZF1、IL7R、IRF4、JAK1、JAK2、KDM6A、KIT、KRAS、MYC、MYD88、NF1、NRAS、PDGFRB、PHF6、PIK3CA、PRDM1、PRPF40B、PTPN11、RB1、RELN、SF3B1、STAT3、SUZ12、TET2、TP53、TRAF3、WHSC1、WT1。
在本发明的一些实施方案中,所述叠瓦式寡核苷酸探针对应的其中8个检测基因的热点突变位点如下所示:
本发明还提供了一种多发性骨髓瘤基因突变检测方法,利用本发明提供的试剂盒可以温和、高效、快速检测多发性骨髓瘤基因突变,并且所述的检测方法包括以下步骤:
S1.裂解红细胞以获取白细胞:采集骨髓血液,使用红细胞裂解液裂解红细胞,经离心分离,获取纯的白细胞;
S2.筛选CD138+细胞:采用免疫磁珠分选出CD138+细胞;
S3.提取待测样本基因组DNA:利用天根DNA提取试剂盒对分选后的CD138+细胞进行抽提DNA,通过质检确保DNA浓度达10ng/ul以上;
S4.文库构建:使用超声破碎仪将基因组DNA随机打断成150bp~250bp的片段经末端修复、3’端加特异性的A尾、引入测序接头、纯化、PCR扩增构建文库;
S5.文库捕获及上机测序:使用试剂盒中叠瓦式寡核苷酸探针捕获48种基因特定外显子区域,通过高通量测序illumina平台的Novaseq 6000进行测序以获取48种基因特定区域的变异信息。
在本发明的一些实施方案中,步骤S1中,所述红细胞裂解液分两次加入,所述离心次数为两次,第一次离心条件为:冰浴10min后2100rpm离心10min;第二次离心条件为颠倒混匀震荡30s后2000rpm离心5min。
在本发明的一些实施方案中,步骤S3中,利用Nano及Qubit定量检测DNA的OD值及浓度。
在本发明的一些实施方案中,步骤S3中,通过凝胶电泳检测DNA的完整性,其中电泳条带应无明显拖尾。
本发明的目的之一是提供一种多发性骨髓瘤(MM)中权威数据库报道的48种具有明确临床意义的基因突变的检测方法,该48个基因分别为:ATM、B2M、BIRC3、BRAF、CARD11、CCND1、CDKN1B、CDKN2A、CSF3R、CUX1、CXCR4、DIS3、DNM2、EGFR、FAM46C、FAT1、FGFR3、FLT3、IDH1、IDH2、IKZF1、IL7R、IRF4、JAK1、JAK2、KDM6A、KIT、KRAS、MYC、MYD88、NF1、NRAS、PDGFRB、PHF6、PIK3CA、PRDM1、PRPF40B、PTPN11、RB1、RELN、SF3B1、STAT3、SUZ12、TET2、TP53、TRAF3、WHSC1、WT1。
所检测的部分基因经过COSMIC数据库、ClinVar数据库及权威文献中的报道,具体相关报道及临床意义如下:
CCND1基因位于11号染色体,有5个外显子,其编码的蛋白属于高保守的细胞周期蛋白家族,与肿瘤抑制蛋白Rb相关,表达受Rb蛋白调控;CCND1基因的突变、扩增和过表达常出现在多种肿瘤细胞中。CCND1基因与未突变的t(11,14)骨髓瘤患者相比发生CCND1基因V42L突变的患者总生存期OS降低,在骨髓瘤患者中存在CCND1基因P18S突变。
CXCR4位于2号染色体长臂,共有2个外显子,其编码蛋白是一种趋化因子受体。在生理状态下,CXCR4在胚胎发生时期对淋巴细胞生成和骨髓成髓作用有重要作用;个体出生以后,可通过CXCR4/SDF-1的相互作用调控CD34+细胞归巢到骨髓,同时在淋巴细胞转运过程中发挥作用。
CUX1基因位于7号染色体,由34个外显子组成,CUX1基因编码的蛋白属于DNA结合同源结构域家族,或许可以调控基因表达、形态发生与分化,可能还在细胞周期中发挥作用。
BRAF基因位于7号染色体,有21个外显子,是RAF激酶家族中的主要成员,BRAF基因突变使BRAF激酶持续活化,激活下游MAPK和MEK-ERK等信号通路,进而促进细胞增殖和肿瘤侵袭转移,导致肿瘤细胞无限生长。
KRAS基因位于12号染色体,有6个外显子,属于原癌基因RAS家族,其编码的蛋白通过结合多种细胞膜受体调节信号转导,在细胞增殖、分化、凋亡等多种生理过程中发挥重要作用。
RB1基因位于13号染色体,由28个外显子组成,具有明显的细胞转化抑制作用,在许多肿瘤中出现RB1基因的突变或缺失。
TRAF3基因位于14号染色体,有15个外显子,是肿瘤坏死因子受体作用因子(TNFreceptor associatedfactors,TRAFs)家族成员之一,主要参与TNF受体家族信号通路;多篇研究发现TRAF3的缺失能够导致非经典NF-kB信号通路激活,影响血液病的发生发展。
本发明的另一个目的在于提供一种温和、高效、快速、简单的CD138+细胞富集方法及试剂盒。在本发明的另外一个方面,本发明采用免疫磁珠分选细胞结合高通量测序技术检测能提高多发性骨髓瘤基因突变的检出率,免疫磁珠细胞分选是高效简捷的CD138+细胞分离纯化方法,富集处理后的细胞在多发性骨髓瘤患者样本中亚克隆结构的基因突变检测频率更高,可有效避免在多发性骨髓瘤中低频比例的基因突变漏检情况,在多发性骨髓瘤的诊断、治疗以及微小残留病灶(MRD)监测应用中具有广泛的临床价值。
本发明的另一个目的在于对MM患者CD138+细胞富集后的核酸提取,进行下游的文库构建,采用高通量测序技术进行测序,来分析MM患者的基因变异情况。
本发明的另一个目的在于对分选后的CD138+细胞进行核酸(DNA)提取,提取试剂盒购买于天根生化,提取所得的核酸(DNA)质检标准:Nano所测OD260/280值应在1.8~2.0之间,浓度的Q/N值大于0.6,Qubit定量浓度大于10ng/ul;核酸(DNA)的质量会对下游的建库有很大影响,DNA浓度及纯度不达要求可能会引起建库失败或扩增效率受到抑制,致使最终的检测结果不准确。因此,MM患者浆细胞中CD138+细胞的富集是前提,DNA的提取质量是保证结果的条件之一。
本发明的另一个目的在于对提取后核酸DNA质检合格,用于下游高通量测序文库的构建。根据所检测48种基因特定基因组区域的设计探针,通过探针与基因组DNA片段进行杂交实现对特定基因组区域的富集,随后通过NGS技术对该区域进行深度测序,发现目标区域的特定变异信息。建库过程中普通扩增选用的PCR仪为BIO-RAD T100,测序所选用的是高通量测序illumina平台的Novaseq 6000进行测序,采用的测序策略为PE150,故文库片段大小集中在250~400bp。
附图说明
图1示出了本发明中的免疫磁珠分选细胞技术原理图;
图2示出了本发明中二代测序检测技术的文库检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施方式仅仅用以解释本发明,并不限制本发明。
本发明的一个实施方式提供了一种发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒,所述的试剂盒包含分别与各检测基因对应的多个叠瓦式寡核苷酸探针,用于获取所述检测基因的热点突变区域的变异信息;所述检测基因包括48个检测基因:ATM、B2M、BIRC3、BRAF、CARD11、CCND1、CDKN1B、CDKN2A、CSF3R、CUX1、CXCR4、DIS3、DNM2、EGFR、FAM46C、FAT1、FGFR3、FLT3、IDH1、IDH2、IKZF1、IL7R、IRF4、JAK1、JAK2、KDM6A、KIT、KRAS、MYC、MYD88、NF1、NRAS、PDGFRB、PHF6、PIK3CA、PRDM1、PRPF40B、PTPN11、RB1、RELN、SF3B1、STAT3、SUZ12、TET2、TP53、TRAF3、WHSC1、WT1。
在一些具体的实施方案中,通过叠瓦式寡核苷酸探针对48种基因目标区域进行捕获测序,部分突变热点位点如下所示:
本发明的另一目的在于提供一种检测多发性骨髓瘤基因突变的方法,所述的方法包括以下步骤:
S1.裂解红细胞以获取白细胞:采集骨髓血液,使用红细胞裂解液裂解红细胞,经离心分离,获取纯的白细胞;
S2.筛选CD138+细胞:采用免疫磁珠分选出CD138+细胞;
S3.提取待测样本基因组DNA:利用天根DNA提取试剂盒对分选后的CD138+细胞进行抽提DNA,通过质检确保DNA浓度达10ng/ul以上;
S4.文库构建:使用超声破碎仪将基因组DNA随机打断成150bp~250bp的片段经末端修复、3’端加特异性的A尾、引入测序接头、纯化、PCR扩增构建文库;
S5.文库捕获及上机测序:使用试剂盒中叠瓦式寡核苷酸探针捕获48种基因特定外显子区域,通过高通量测序illumina平台的Novaseq 6000进行测序以获取48种基因特定区域的变异信息。
在一些具体的实施方案中,步骤S1中,所述红细胞裂解液分两次加入,所述离心次数为两次,第一次离心条件为:冰浴10min后2100rpm离心10min;第二次离心条件为颠倒混匀震荡30s后2000rpm离心5min。
在一些具体的实施方案中,步骤S3中,利用Nano及Qubit定量检测DNA的OD值及浓度。
在一些具体的实施方案中,步骤S3中,通过凝胶电泳检测DNA的完整性,其中电泳条带应无明显拖尾。
本发明采用骨髓血富集CD138+细胞结合高通量测序技术具有更高的检出率,同时也验证了在同一患者中,基因突变通常只存在于一小部分细胞中,将这一小部分细胞先富集纯化做预处理,再从预处理后的细胞中提取核酸进行高通量测序,可以避免在多发性骨髓瘤中漏检基因变异的情况。由于多发性骨髓瘤癌变发生于浆细胞,免疫磁珠分选细胞的方法已经成为多发性骨髓瘤提高基因突变检出率简单高效的方法之一。
以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。
实施例1
实施例中所涉及到的检测试剂耗材包括:免疫磁珠细胞分选的EasySepTM试剂盒(主要包含CD138抗体、微型磁珠)、Phosphate Buffered Saline(1x)PBS缓冲液、牛血清、购买于天根DNA提取试剂盒、STEMCELL无柱细胞分选磁极、Falcon 5ml圆底分离柱。
多发性骨髓瘤患者基因突变通常只存在于一小部分细胞中,通过运用免疫磁珠细胞分选(MACS)原理将MM患者骨髓血中CD138+细胞富集,从人体新鲜骨髓血中分离出CD138+细胞。免疫磁珠CD138+细胞分选实验方案具体操作流程如下:
S1.裂解红细胞以获取白细胞:从EDTA管抗凝管中吸取3ml骨髓血到15ml离心管中,加入10ml红细胞裂解液,上下颠倒混匀,置冰浴10min后2100rpm离心10min,倒掉上清,再加入5ml红细胞裂解液,颠倒混匀震荡30s后2000rpm离心5min,白细胞沉于离心管底部,倒掉上清液,保留约200ul液体,用移液器吹打均匀,然后转移到5ml圆底试管。此步骤为分选前处理,目的通过裂解红细胞提纯的白细胞。
S2.筛选CD138+细胞:采用免疫磁珠分选出CD138+细胞:
免疫磁珠法分为正选法和负选法,也称之为阳性分选和阴性分选。阳性分选是磁珠结合的细胞即所要分离获得的细胞,阴性分选是指磁珠结合后不需要的细胞,游离于上清液的细胞为所需细胞。从MM患者骨髓血中用免疫磁珠分选CD138+细胞属于阳性分选,即磁珠特异性地与有相应抗原的细胞亚群结合的细胞,通过分离得到的连有磁珠的细胞可直接用于提取DNA。具体步骤为:
向上述所得的细胞溶液中加入10ul抗体,吹打均匀后室温放置3分钟,使细胞溶液与抗体充分结合,再加入10ul充分混匀的磁珠(加之前务必充分混匀),吹打混匀液体后室温放置3分钟,微型磁珠充分吸附包被的抗体,加入2.5ml PBS含2%FBS缓冲液,轻轻混匀后放到磁力架上,静置3分钟,倾斜磁力架,试管中的液体在重力作用下自然流尽,再次加入2.5ml PBS含2%FBS缓冲液洗涤,3分钟后倾斜磁力架弃掉试管中的液体,此时目标CD138+细胞被吸附在试管中,约用1ml不含2%FBS的PBS缓冲液(注意),把试管壁上面磁珠吸附的细胞吹打下来,把含CD138+细胞溶液转移到1.5ml离心管中,室温离心4500rpm5min,CD138+细胞沉于试管底部,可用于后续核酸DNA的提取。
S3.提取待测样本基因组DNA:通过免疫磁珠细胞分选获得高质量的CD138+细胞,再利用商业化的天根DNA提取试剂盒对分选后的CD138+细胞进行抽提DNA,利用Nano及Qubit定量检测DNA的OD值及浓度,电泳条带无明显拖尾以确保DNA的完整性,通过质检确保DNA浓度达10ng/ul以上方可执行文库构建。
S4.文库构建:上述抽提DNA样品检测合格后,使用Covaris超声波破碎仪随机打断,由于Illumina平台测序仪测序策略是PE150,故不可能将整个基因组长片段进行测序,需将基因组DNA随机打断成150bp~250bp,再经末端修复、3’端加特异性的A尾、引入测序接头、纯化出杂、PCR扩增等步骤完成整个文库制备工作。
S5.文库捕获及上机测序:运用叠瓦式寡核苷酸探针捕获48种基因特定外显子区域,通过高通量测序illumina平台的Novaseq 6000进行测序以获取48种基因特定区域的变异信息。
以上实施例通过免疫磁珠分选技术并运用高通量测序技术来提高MM 48种基因突变检出率的方法流程,详细介绍了该检测方法基本原理,提供了与多发性骨髓瘤(MM)相关的48种基因,并列举了重点关注近年来权威文献报道过的热点变异信息。
实施例2
通过以上操作方法及本发明的试剂盒检测18例临床样本特异性检测MM中48种基因突变情况。
对18例(编号M1~M18)疑似、初诊、难治及复发的多发性骨髓瘤患者骨髓血样本进行了筛查检测,严格执行上述免疫磁珠分选细胞方法的操作流程,对富集CD138+细胞进行核酸提取及下游文库构建并进行高通量测序,所提取的DNA采用自建的生信流程进行分析以及专业遗传咨询解读人员进行解读,采用本发明的方法核酸检测的结果如表1和2所示,最终统计的基因突变阳性率如表3所示。
表1编号M1~M9的患者骨髓血分选CD138+细胞后提取DNA方法检测结果汇总表
表2.编号M10~M18的患者骨髓血中分选CD138+细胞后提取DNA方法检测结果汇总表
表3.采用本发明的分选CD138+细胞后提取DNA结合高通量测序技术检测48个基因阳性率
对比实施例1
通过直接提取样本DNA检测18例临床样本来特异性检测MM中48种基因突变情况。
对18例(编号M1~M18)疑似、初诊、难治及复发的多发性骨髓瘤患者骨髓血样本进行了筛查检测,对这18例患者骨髓血样本直接进行DNA提取(不预先进行分选),并执行文库构建操作流程,所提取的DNA采用自建的生信流程进行分析以及专业遗传咨询解读人员进行解读,采用本发明的方法核酸检测的结果如表4和5所示,最终统计的基因突变阳性率如表6所示。
表4编号M1~M9的患者骨髓血中直接提取DNA方法检测结果汇总表
表5编号M10~M18的患者骨髓血中直接提取DNA方法检测结果汇总表
表6对骨髓血样本直接提取核酸进行高通量测序检测48个基因阳性率
由表1~6的结果可以看出,通过18例MM患者骨髓血样本富集CD138+细胞提取DNA及直接从骨髓血中提取DNA结合高通量测序的两种检测方法结果汇总比较,采用骨髓血富集CD138+细胞结合高通量测序技术具有更高的检出率,同时也验证了在同一患者中,基因突变通常只存在于一小部分细胞中,将这一小部分细胞先富集纯化做预处理,再从预处理后的细胞中提取核酸进行高通量测序,可以避免在多发性骨髓瘤中漏检基因变异的情况。由于多发性骨髓瘤癌变发生于浆细胞,免疫磁珠分选细胞的方法已经成为多发性骨髓瘤提高基因突变检出率简单高效的方法之一。
本发明实施案例展示了中两种对样本处理方式的检测结果,利用分选CD138+细胞结合高通量测序技术提高了部分基因的检出率,如CCND1、CXCR4等基因与骨髓瘤调控及预后息息相关。
因此,采用免疫磁珠分选细胞结合高通量测序技术检测能提高多发性骨髓瘤基因突变的检出率,免疫磁珠细胞分选是高效简捷的CD138+细胞分离纯化方法,富集处理后的细胞在多发性骨髓瘤患者样本中亚克隆结构的基因突变检测频率更高,可有效避免在多发性骨髓瘤中低频比例的基因突变漏检情况,在多发性骨髓瘤的诊断、治疗以及微小残留病灶(MRD)监测应用中具有广泛的临床价值。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭露如上,然而并非用以限定本发明,任何熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种多发性骨髓瘤基因突变检测试剂盒,所述的试剂盒包含分别与各检测基因对应的多个叠瓦式寡核苷酸探针,用于获取所述检测基因的热点突变区域的变异信息;所述检测基因包括48个检测基因:ATM、B2M、BIRC3、BRAF、CARD11、CCND1、CDKN1B、CDKN2A、CSF3R、CUX1、CXCR4、DIS3、DNM2、EGFR、FAM46C、FAT1、FGFR3、FLT3、IDH1、IDH2、IKZF1、IL7R、IRF4、JAK1、JAK2、KDM6A、KIT、KRAS、MYC、MYD88、NF1、NRAS、PDGFRB、PHF6、PIK3CA、PRDM1、PRPF40B、PTPN11、RB1、RELN、SF3B1、STAT3、SUZ12、TET2、TP53、TRAF3、WHSC1、WT1。
3.一种检测多发性骨髓瘤基因突变的方法,所述的方法包括以下步骤:
S1.裂解红细胞以获取白细胞:采集骨髓血液,使用红细胞裂解液裂解红细胞,经离心分离,获取纯的白细胞;
S2.筛选CD138+细胞:采用免疫磁珠分选出CD138+细胞;
S3.提取待测样本基因组DNA:利用天根DNA提取试剂盒对分选后的CD138+细胞进行抽提DNA,通过质检确保DNA浓度达10ng/ul以上;
S4.文库构建:使用超声破碎仪将基因组DNA随机打断成150bp~250bp的片段经末端修复、3’端加特异性的A尾、引入测序接头、纯化、PCR扩增构建文库;
S5.文库捕获及上机测序:使用试剂盒中叠瓦式寡核苷酸探针捕获48种基因特定外显子区域,通过高通量测序illumina平台的Novaseq 6000进行测序以获取48种基因特定区域的变异信息。
4.根据权利要求3所述的检测方法,其中,步骤S1中,所述红细胞裂解液分两次加入,所述离心次数为两次,第一次离心条件为:冰浴10min后2100rpm离心10min;第二次离心条件为颠倒混匀震荡30s后2000rpm离心5min。
5.根据权利要求3所述的检测方法,其中,步骤S3中,利用Nano及Qubit定量检测DNA的OD值及浓度。
6.根据权利要求3所述的检测方法,其中,步骤S3中,通过凝胶电泳检测DNA的完整性,其中电泳条带应无明显拖尾。
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