CN115058504A - 膀胱癌th17 cd4+t细胞亚群及其特征基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了膀胱癌TH17CD4+T细胞亚群及其特征基因与应用,涉及生物医药技术领域。本发明的一种用于识别、检测或鉴定TH17CD4+T细胞的生物标志物组,所述生物标志物组包括基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种,或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。本发明筛选得到的特征基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1在膀胱癌组织的TH17CD4+T细胞中低表达,可用于肿瘤辅助诊断、预后判断、免疫治疗的药物制备;本发明的特征基因在正常膀胱组织的TH17CD4+T细胞中的表达高于膀胱癌组织,表明本发明的特征基因能够促进TH17CD4+T的免疫作用,可用于膀胱癌治疗药物的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,具体涉及膀胱癌TH17 CD4+T细胞亚群及其特征基因与应用。
背景技术
肿瘤发生发展是一个复杂且多步骤的过程,其中肿瘤微环境(tumormicroenvironment,TME)发挥着举足轻重的作用。TME是指肿瘤癌巢内和间质中存在的众多免疫细胞、间质细胞、细胞外基质及活性介质。TME大体上可分为免疫细胞为主的免疫微环境和成纤维细胞为主的非免疫微环境两大类。其中,免疫微环境是TME的重要组成部分,主要由肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)以及其他免疫细胞组成。TILs是指存在于肿瘤实质和肿瘤间质内的以T细胞为主的一类异质性淋巴细胞群体,其在肿瘤微环境内参与肿瘤免疫正向和负向调节作用,主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞和髄源性抑制细胞等。癌症的早期诊断与筛查、疗效与预后的判断,以及潜在的治疗靶点,都对加强癌症治疗效果、提高患者的生存率有着重要的意义。近年TILs在肿瘤微生态中的作用越来越受到重视,大量研究表明TILs的浸润密度、类型和所处的肿瘤位置在多种肿瘤如结直肠癌、乳腺癌、黑色素瘤等的预后判断中占主导地位。尽管免疫系统与癌组织的之间的作用机制在免疫疗法的开发与改善中,以及肿瘤发生发展的检测中有着重要的作用,但是TIL的种类以及抑制途径还没有被理解透彻。人体T细胞的种类多而复杂,对每一种T细胞亚群的识别与鉴定,可以为癌症免疫治疗提供新的免疫靶点,以及预后的分子标志物。因此,需要我们更深地了解并探索膀胱癌浸润T细胞亚群的异质性和功能,特别是膀胱癌浸润CD4+T细胞亚群的异质性和功能,向膀胱癌的精确治疗迈进。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足,提供膀胱癌TH17 CD4+T细胞亚群及其特征基因与应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:一种用于识别、检测或鉴定TH17 CD4+T细胞的生物标志物组,所述生物标志物组包括基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种,或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。
本发明利用10X单细胞转录组测序分析技术,对膀胱癌患者正常膀胱组织和膀胱癌组织来源的T细胞进行了单细胞转录组测序,发现TH17 CD4+T细胞亚群特异性分布在肿瘤组织中,可作为膀胱癌治疗的靶点。并进一步分析TH17CD4+T细胞亚群与其他T细胞亚群的基因表达差异情况,筛选出特异性表达在TH17 CD4+T细胞中的基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1。
本发明还提供所述的生物标志物组在制备用于肿瘤的辅助诊断、预后判断或免疫治疗的药物中的应用。
作为本发明所述的应用的优选实施方式,所述肿瘤为膀胱癌。
本发明还提供检测生物标志物组表达量的试剂在制备用于膀胱癌的辅助诊断或预后判断的产品中的应用,所述生物标志物组包括基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种,或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。
作为本发明所述的应用的优选实施方式,所述试剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体。
本发明还提供一种用于膀胱癌的辅助诊断或预后判断的试剂盒,所述试剂盒包括能够与生物标志物组结合的结合剂;所述生物标志物组包括基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种,或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。
作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式,所述结合剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体。
作为本发明所述的试剂盒的优选实施方式,包括如下(a)-(d)中的至少一种:
(a)所述结合剂是能与基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种特异性结合的核酸探针或配体;
(b)所述结合剂是能与特异性扩增基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种的引物;
(c)所述结合剂是能与基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种编码的蛋白或蛋白片段特异性结合的抗体;
(d)所述结合剂能与指示分子结合;所述指示分子包括荧光物质、放射性物质、或酶中的至少一种。
本发明还提供IL17A、FURIN、CTSH或KLRB1在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
作为本发明所述的应用的优选实施方式,所述肿瘤包括膀胱癌。
本发明的有益效果:本发明利用单细胞转录组测序分析技术,通过对膀胱癌患者正常膀胱组织和膀胱癌组织来源的T细胞进行单细胞转录组测序,筛选出4种特异性表达在TH17 CD4+T细胞中的特征基因。本发明筛选得到的特征基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1在膀胱癌组织的TH17 CD4+T细胞中低表达,可用于肿瘤辅助诊断、预后判断、免疫治疗的药物制备;本发明的特征基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1在正常膀胱组织的TH17 CD4+T细胞中的表达高于膀胱癌组织,表明IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1能够促进TH17CD4+T的免疫作用,可用于膀胱癌治疗药物的制备。
附图说明
图1为实施例1中通过10X单细胞测序对膀胱癌细胞进行亚群鉴定的t-sne图以及Umap图;
图2为实施例1中T细胞亚群细分图;
图3为实施例1中膀胱癌样本中的基因IL23R、RORC、IL17A、FURIN、CTSH、CXCR3、CCR6、KLRB1、IL22在IL17 CD4+T细胞以及其他T细胞亚群中的基因表达量的柱形图;
图4为实施例1中T细胞亚群差异表达基因的KEGG通路富集气泡图;
图5为实施例2TH17 CD4+T细胞差异表达基因的通路富集分类气泡图;
图6为实施例3TH17 CD4+细胞的细胞流式分选结果;
图7为实施例3中荧光定量PCR检测膀胱癌肿瘤浸润TH17 CD4+T细胞在肿瘤组织和正常膀胱组织中IL23R、RORC、IL17A、FURIN、CTSH、CXCR3、CCR6、KLRB1、IL2的表达量柱状图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1单细胞转录组测序
1、临床样本收集
本研究选取了7例膀胱尿路上皮癌患者的膀胱癌组织和癌旁正常组织,由广州医科大学附属第一医院负责采集和提供。所有患者均已提供书面的知情同意书。收集患者手术切除的膀胱癌组织、癌旁正常组织。要求患者均无自身免疫疾病或其他癌症病史,术前未接受过新辅助化疗或其他抗肿瘤治疗的膀胱癌,且肿瘤直径大于1cm。样本采集应在手术结束后立即将新鲜样本4℃平稳运输回实验室,在2h内进行细胞分离实验,保证细胞最大活性。
2、膀胱癌组织和癌旁正常组织中T细胞的分离
(1)单细胞悬液的制备
从膀胱癌患者身上取出膀胱肿瘤及邻近正常组织后立即进行处理。将每个样品切成小块(<1mm直径),然后与2ml胰蛋白酶(Gibco,Cat:R001100)、1ml胶原酶IV(Biofrox,Cat:2275MG100)和100μl DNA酶(Service bio,Cat:1121MG010)在37℃摇床上孵育1h;加入4ml DMEM稀释悬浮液,然后使用40μm细胞网过滤悬浮液;在250g离心5min后,丢弃上清液,然后用PBS洗涤细胞两次;将细胞颗粒再悬浮在1mL冰冷红细胞裂解缓冲液中,并在4℃下培养10min;将10mL冰冷PBS添加到试管中,然后以250g离心10min;倾析上清液后,将颗粒再悬浮在5ml无钙无镁PBS中,其中含有0.04%重量/体积的BSA;用血液细胞仪在倒置显微镜下计数10μl悬浮液;台盼蓝用于定量活细胞。
(2)基于液滴的单细胞测序
使用铬单细胞3’试剂盒v3制备条形码scRNA-seq文库,将单细胞悬浮液装载到铬单细胞控制器仪器(10×基因组学)上以产生单细胞凝胶珠状液(GEMs);为了捕获每个库中的7000个细胞,每个通道中添加了大约10000个细胞;在产生GEMs后,进行逆转录反应以产生条形码全长cDNA,随后使用回收剂破坏乳液,然后使用Dyna Beads My one SilaneBeads(赛默飞世尔科学公司)进行cDNA净化;其次,用PCR扩增cDNA,根据回收细胞的数量选择合适的循环次数;将扩增的cDNA片段化、末端修复、A-尾连接到索引适配器上,然后扩增文库,每个文库在Hi Seq X-Ten平台(Illumina)上测序,产生150bp配对末端阅读。
(3)原始数据处理和质量控制
Cell Ranger 2.2.0用于处理原始数据、解复用细胞条形码、对转录组的映射读取和向下样本读取(根据需要生成跨样本的标准化聚合数据)。这些过程产生了一个原始的唯一分子标识符(UMI)计数矩阵,该矩阵由R包Seurat29 3.0.0转换为一个Seurat对象。UMI值<1000或线粒体来源的UMI计数超过10%的细胞被认为是低质量细胞,并被去除。为了消除潜在的双重基因,检测到6000多个基因的单个细胞也被筛选出来。最后,在质量控制和消除批次之间的批次效应后,共捕获到131,993个细胞,Seurat和doublet finder过滤后共得到105,123个高质量细胞,并应用于下游分析。质量控制后,对UMI计数矩阵进行对数归一化。由于对7名患者的样本进行了分批处理和测序,因此使用患者编号来消除潜在的分批效应。在这个过程中,前3000个可变基因被用来创建具有Seurat的Find Integration Anchors功能的潜在锚。随后,利用积分数据函数对数据进行积分,生成一个新的具有3000个特征的矩阵,回归出潜在的批量效应。为了降低scRNA-Seq数据集的维数,在综合数据矩阵上进行了主成分分析(PCA)。利用Seurat的Elbowplot功能,用前30个PCs进行下游分析。用Seurat提供的Find Clusters功能识别主要细胞簇,分辨率设置为默认值(res=0.8)。然后用二维tSNE或UMAP图显示。以前的研究中描述的常规标记被用来将每个细胞分类为一个已知的生物细胞类型。首先,将105,123个细胞分为8种主要细胞类型。根据聚类结果,采用t-SNE降维算法,在二维空间上展示细胞的分布情况,结果参见图1。
随后,依据已发表的文献或细胞标志物数据库,利用亚群上调表达的基因进行细胞亚群定义,将T细胞定义为不同细胞亚群。经癌旁正常组织与肿瘤组织中细胞亚群聚类的对比,我们发现TH17 CD4+T细胞亚群特异性分布在肿瘤组织中,或可作为膀胱癌治疗的靶点。我们进一步分析TH17 CD4+T细胞亚群与其他T细胞亚群的基因表达差异情况(表1),以及这些差异表达基因在样本的所有细胞亚群中的表达量(表2),筛选出特异性表达在TH17CD4+T细胞中的基因。具体方法为,通过将该亚群与样品中其他所有细胞亚群进行比较,得到该亚群与其他亚群之间的差异基因列表,利用差异分析算法(默认采用Wilcoxon ranksun test),寻找该亚群的差异高表达基因,为进一步筛选特征基因提供依据。进一步地,特征基因仅在该亚群中高表达(ave_logFC值>0.25),在其他亚群中表达量较低(P值<0.05),且其对TH17 CD4+T细胞的免疫功能有一定程度的促进作用。
表1膀胱癌组织浸润的TH17 CD4+T细胞亚群差异表达基因。
表2膀胱癌浸润T细胞各亚群中的基因表达量
经筛选,IL17 CD4+T细胞特征基因为IL23R、RORC、IL17A、FURIN、CTSH、CCR6、KLRB1、IL2。
对临床取得的膀胱癌样本中的基因IL23R、RORC、IL17A、FURIN、CTSH、CCR6、KLRB1、IL22在IL17 CD4+T细胞以及其他T细胞亚群中的表达进行基因表达量分析,绘制柱形图,结果参见图3。
实施例2TH17 CD4+T细胞差异表达基因的通路富集分析
基因通路富集分析是分析基因在细胞中的代谢途径以及其功能的过程,本发明中,利用Matescape对差异表达基因进行通路富集分析。Metascape是提供基因注释和分析资源的门户网站,网址为http://metascape.org,集成了四十多个生物信息数据库,例如GO/KEGG terms,canonical pathways,hall mark gene sets,UniProt和DrugBank等常用数据库都包括在内。我们可以方便地运用此网站进行生物通路功能富集分析,蛋白质互作用网络结构分析。我们通过在网站首页提交需要分析的cluster的差异基因列表,选择物种信息为H.sapiens,再点击分析选项即可得到可视化功能富集分析和蛋白质互作分析结果,所有的数据可通过一个Zip文件包下载保存。以临床取得的膀胱癌样本为例,对TH17 CD4+T细胞亚群差异表达基因的通路富集情况进行分析,结果参见图4~5。分析结果表明,TH17CD4+T细胞差异表达基因多富集在淋巴细胞激活与分化、获得性免疫系统、细胞因子依赖的信号通路以及免疫系统负调控等通路。
实施例3TH17 CD4+细胞的富集及特征基因测定
1、分选TH17 CD4+细胞
收集5例新鲜膀胱癌组织,按照上述实施例1的方法,对组织进行剪碎和消化,制备单细胞悬液。PBS洗涤2次,2ml无血清DMEM/F12重悬,计数备用。
①分出100μL细胞悬液作不染色对照,加培养基至200μL。
②分出100μL细胞悬液作CD3单阳对照,加入CD8抗体5μL,加培养基至200μL。
③分出100μL细胞悬液作CD4单阳对照,加入CD4抗体5μL,加培养基至200μL。
④分出100μL细胞悬液作CD45RA单阳对照,加入CD45RA抗体5μL,加培养基至200μL。
⑤分出100μL细胞悬液作CD27单阳对照,加入CD27抗体5μL,加培养基至200μL。
⑥剩下1500μL作实验组(至少6×106个细胞),加入CD3抗体20μL,CD4抗体5μL,CD45R抗体5μL,CD27抗体5μL,混匀,4-8℃置于摇床避光染色30min。
⑦染色完成后,3000rpm离心5min,弃上清。用0.5-0.6mL PBS重悬,3000rpm,离心5min,弃去上清。用500μL分选缓冲液重悬(至少5×10^6个细胞),流式收集CD4+CD45RA-CD27-TH17 CD4+T细胞。代表性的流式分选结果如图6所示。
2、qPCR测定特征基因表达量
采用qPCR进行对步骤1中分选出的细胞的基因表达量进行分析,具体包括以下步骤:
2.1总RNA提取Trizol法提取细胞中的RNA
(1)中皿培养细胞到汇合度达90%以上,吸去培养基,预冷PBS洗两遍;
(2)弃去PBS,加入1mL Trizol吹打细胞,直至细胞完全脱落,移入RNase-free的1.5mL EP管中,震荡混匀,静止5分钟;
(3)加入200μL氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15秒,静止5分钟;然后将离心管置于4℃离心机,12000转离心15分钟;
(4)小心取出离心管,取上层清亮液体转移到新的1.5mL离心管中,加入等体积的异丙醇,上下颠倒混匀,室温静止10分钟;然后将离心管置于4℃离心机,12000转离心10分钟;
(5)弃去上清,保留底部沉淀,加入1mL 75%乙醇,上下颠倒,充分清洗沉淀;然后将离心管置于4℃离心机,12000转离心10分钟;
(6)弃去上清,用枪头吸去管壁多余的液体,通风橱晾干5分钟,加入无酶水30μL吹打溶解RNA沉淀,使用Nanodrop2000进行质控并测浓度,置于-80℃冰箱。
2.2RNA逆转录合成cDNA
(1)使用Takara试剂盒PrimeScriptTM RT regent Kit with gDNA Eraser逆转录RNA,由两部分组成,第一部分为去除gDNA反应体系,包括表3的组分,混匀反应体系后,室温5分钟或者42℃,2分钟,置于冰上用于下一步反应。
表3
成分 | 体积 |
5×gDNA Eraser Buffer | 2μL |
gDNA Eraser | 1μL |
Total RNA | 1μg |
RNase Free dH<sub>2</sub>O | variable |
Total | 23μL |
(2)cDNA的合成:采用表4的反应体系,混匀反应体系,PCR仪中37℃15分钟,85℃5秒,4℃条件下保存,用于下一步实验,长期可放至-80℃保存。
表4
成分 | 体积 |
步骤(1)的反应液 | 10μL |
5×PrimeScript Buffer | 4μL |
PrimeScript RT Enzyme | 1μg |
RT Primer Mix | 4μL |
RNase Free dH<sub>2</sub>O | 4μL |
Total | 37μL |
(3)荧光定量PCR检测特征基因表达量:以步骤(2)中得到的cDNA为模板进行荧光定量PCR检测特征基因表达量。反应体系如表5所示。所述引物序列入表6所示。
表5
成分 | 体积 |
10×PCR buffer for KOD-Plus-Neo | 5μL |
2nM dNTPs | 5μL |
Primer F(10nM) | 1.5μg |
Primer R(10nM) | 1.5μL |
cDNA | 200ng |
KOD-Plus-Neo(1U/μL) | 37μL |
Total | 20 |
表6
将反应体系按上述混匀后,使用PCR仪扩增,PCR程序如表7所示。
表7
结果如图7所示,IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1在正常膀胱组织的TH17CD4+T亚群的表达量明显比膀胱癌组织的高,进一步说明IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1能够促进TH17 CD4+T的免疫作用。因此,IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1是全新的TH17 CD4+T细胞的生物标志物,在鉴定肿瘤浸润TH17CD4+T细胞方面有良好的应用前景,并有望成为膀胱癌免疫治疗的新靶点。
最后应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种用于识别、检测或鉴定TH17 CD4+T细胞的生物标志物组,其特征在于,所述生物标志物组包括基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种,或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。
2.根据权利要求1所述的生物标志物组在制备用于肿瘤的辅助诊断、预后判断或免疫治疗的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述肿瘤为膀胱癌。
4.检测生物标志物组表达量的试剂在制备用于膀胱癌的辅助诊断或预后判断的产品中的应用,其特征在于,所述生物标志物组包括基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种,或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述试剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体。
6.一种用于膀胱癌的辅助诊断或预后判断的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括能够与生物标志物组结合的结合剂;所述生物标志物组包括基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种,或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述结合剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,包括如下(a)-(d)中的至少一种:
(a)所述结合剂是能与基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种特异性结合的核酸探针或配体;
(b)所述结合剂是能与特异性扩增基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种的引物;
(c)所述结合剂是能与基因IL17A、FURIN、CTSH、KLRB1中的至少一种编码的蛋白或蛋白片段特异性结合的抗体;
(d)所述结合剂能与指示分子结合;所述指示分子包括荧光物质、放射性物质、或酶中的至少一种。
9.IL17A、FURIN、CTSH或KLRB1在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,所述肿瘤包括膀胱癌。
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