CN108611410B - N6-甲基腺嘌呤在自身免疫性疾病的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了定量染色体DNA的N6‑甲基腺嘌呤的丰度的试剂在制备自身免疫性疾病的检测、预后试剂中的应用。本发明发现染色体DNA上的N6‑甲基腺嘌呤在自身免疫性疾病患者与健康人之间有比较明显的表达差异，而目前用于自身免疫性疾病的临床辅助诊断技术还有所欠缺，因此，染色体DNA上的N6‑甲基腺嘌呤具有作为自身免疫性疾病相关的检测、预后的潜能。

Description

N6-甲基腺嘌呤在自身免疫性疾病的用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种N6-甲基腺嘌呤的用途。

背景技术

表观遗传学指的是在DNA序列不发生变化的情况下，基因表达发生了可遗传的改变。甲基化是表观遗传学修饰形式中研究的最充分的一种。它是指DNA或RNA序列中的碱基在甲基化转移酶的催化下与甲基发生共价结合，可在细胞分裂过程中传递给子细胞的表观遗传现象。DNA甲基化可发生在非酶学介导的DNA损伤或有信号功能引起的由特异性甲基转移酶完成的直接修饰。每个DNA碱基在不同的生物体中均有不同程度的修饰。DNA损伤甲基化包括N1-甲基腺嘌呤(1mA)，N3-甲基腺嘌呤(3mA)，N7-甲基腺嘌呤(7mA)，N3-甲基胞嘧啶(3mC)，N2-甲基鸟嘌呤(2mG)，O6-甲基鸟嘌呤(6mG)，N7-甲基鸟嘌呤(7mG)，N3-甲基胸腺嘧啶(3mT)和O4-甲基胸腺嘧啶(4mT)，而定向甲基化DNA有N6-甲基腺嘌呤(6mA)，N4-甲基胞嘧啶(4mC)和C5-甲基胞嘧啶(5mC)。其中5mC和6mA是目前DNA甲基化修饰中较为重要的修饰形式。而在mRNA水平上，N6-甲基腺嘌呤(m6A)同样是甲基化修饰中较为重要的修饰形式。

6mA是DNA腺嘌呤碱基第6位N原子上存在甲基化修饰，它最早在原核生物中发现，且广泛存在。在原核生物中，6mA控制着许多重要的生物学过程。细菌中的6mA修饰在DNA复制、碱基修复、基因表达调控、转座子调控及宿主与病原体之间的相互拮抗等方面具有重要的调节功能。后来，甲基化研究技术的不断发展使得研究者们相继在各种真核生物中发现了6mA的存在。真核生物基因组内6mA丰度比原核生物基因组的6mA丰度低，且6mA被认为是一种非典型的DNA甲基化，因此真核生物中6mA修饰的产生、去除、分布及功能一直被忽视。

近年来随着测序等相关技术突飞猛进，真核生物的6mA修饰在其发育过程中的功能作用已经展开了一定的研究。研究发现甲基腺嘌呤修饰可能参与到人体细胞的分化发育过程。但关于6mA与自身免疫疾病的相关性还未见公开。

发明内容

本发明的目的是提供一种定量染色体DNA的N6-甲基腺嘌呤的丰度的试剂在制备自身免疫性疾病的检测、预后试剂中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

定量染色体DNA的N6-甲基腺嘌呤的丰度的试剂在制备自身免疫性疾病的检测、预后试剂中的应用。

优选的，试剂定量染色体DNA的重复序列的N6-甲基腺嘌呤的丰度。

进一步优选的，重复序列为短散在重复序列、长散在重复序列、长末端重复序列中的至少一种。

更进一步优选的，重复序列为LINE/L1、LINE/L2、SINE/Alu、SINE/MIR、LTR/ERVL、LTR/ERVL-MaLR、LTR/ERV1中的至少一种。

优选的，试剂定量染色体DNA的基因功能元件的N6-甲基腺嘌呤的丰度。

进一步优选的，基因功能元件为上游2K、5-UTR、外显子、内含子、3-UTR、下游2K、基因间区中的至少一种。

优选的，自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、皮肌炎。

定量染色体DNA上N6-甲基腺嘌呤的丰度的试剂盒在自身免疫性疾病的检测、预后中的应用。

优选的，自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、皮肌炎。

本发明的有益效果是：

本发明发现染色体DNA上的N6-甲基腺嘌呤在自身免疫性疾病患者与健康人之间有比较明显的表达差异，而目前用于自身免疫性疾病的临床辅助诊断技术还有所欠缺，因此，染色体DNA上的N6-甲基腺嘌呤具有作为自身免疫性疾病相关的检测、预后的潜能。

附图说明

图1是测序碱基质量分布图。

图2是读长在重复序列上的分布图。横轴上每个重复序列中从左到右分别为SLEIP组、SLEInput组、NCIP组和NCInput组。

图3是读长在各基因功能区域上的分布图。横轴上每个元件部分从左到右分别为SLEIP组、SLEInput组、NCIP组和NCInput组。

图4是Peaks显著程度分布图。

图5是SLE和NC两样本间差异基因的韦恩图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种慢性的系统性自身免疫病。患者自身免疫系统产生抗体攻击自身细胞和组织，导致炎症的发生和组织损害。SLE的发病机制尚不明确，目前认为其致病是多因素多层面的影响，包括免疫，遗传，环境，性激素等，诸多细胞因子参与其中。本发明将以系统性红斑狼疮这一常见的、典型的自身免疫性疾病作为代表和实施例进行说明。

实施例1

病例样本为2016年7月至2016年9月于深圳市人民医院住院的系统性红斑狼疮患者20例，诊断依据为1997年修订的美国风湿病学会SLE诊断标准，根据1992年制定的SLE疾病活动指数(SLEDAI)，所有SLE患者均在疾病活动期。患者均未进行免疫抑制剂、激素及细胞毒药物，且排除其他免疫性疾病。健康对照组为深圳市人民医院体检科的健康体检者。所有受试对象均知情同意，自愿参加并签署书面知情同意书，实验符合人体实验伦理学标准，并经过获得暨南大学第二临床学院伦理委员会的批准。系统性红斑狼疮患者(SLE组)和正常人(NC组)基本信息如下表所示。

表1.基本分组情况

(1)单个核细胞分离

用EDTA抗凝管收集狼疮患者及正常人外周静脉血(空腹时)5ml，4小时内处理样品，根据Ficoll密度梯度离心法，使用淋巴细胞分离液将收集的静脉血分离出血PBMC。具体步骤如下：

a)将收集的静脉血加入15ml离心管中，用等量PBS 1:1稀释混匀。

b)将与稀释血液等体积的淋巴细胞分离液预先置于另外的15ml离心管中，加入淋巴细胞分离液时尽量不碰壁，若有，测将离心管离心1分钟，使淋巴细胞分离液不沾管壁。

c)从离心管边缘轻轻将稀释后的静脉血加于淋巴细胞分离液的上面，尽量不破坏细胞分离液的液面。

d)2000r/min，30min，室温下水平离心，离心后分为四层，从上至下依次为：稀释的血浆、淋巴细胞、淋巴细胞分离液、红细胞。

e)弃掉上层血浆，吸取中间层淋巴细胞置于新的离心管中，加入PBS至12ml，2500rpm，30min，室温下水平离心。

f)离心后弃去上清液，重复步骤e)，将洗得的细胞转入2ml冻存管中。

g)取1ml Trizol加入所获得的细胞中，混匀，待混合液清亮后放入-80℃冰箱备用。

(2)DNA的提取和质量检测

使用DNA提取试剂盒提取单个核细胞中DNA(invitrogen，Thermo fisher，USA)，步骤简要描述如下：加入1mlDNAzol试剂于上述步骤提取到的PBMC中，混匀后10000g离心10分钟，去上清加入0.5ml 100％乙醇沉淀DNA，75％乙醇洗涤两次后，加入8mM乙醇氢氧化钠和8mM氢氧化钠溶液于负20℃保存。

DNA需要达到质量要求如下：

需求量：DNA量≧20ng

浓度：≧1ng/μl

纯度：OD260/280＝1.8～2.0

其他要求：DNA分布在100～500bp范围，且主带明显。

(3)文库的建立和质控

将一部分DNA作为比对(Input)，一部分DNA用来免疫共沉淀(IP)，通过染色质免疫共沉淀技术特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，10ng免疫共沉淀后的DNA起始，依次末端修复、加“A”、加PE Adapter反应和文库构建至接头产物，采用m6A抗体(目前尚未有6mA特异性抗体，本方案中采用Diagenode公司的m6A抗体，该抗体可用于6mA)进行免疫共沉淀反应，对共沉淀获得的目标序列进行PCR扩增，最后进行片段筛选获得目标长度的6mA-IP-seq文库，得到SLEInput，SLEIP，NCInput和NCIP共4个文库。本操作流程主要包括以下几个内容：

a)DNA片段化。若DNA检测结果在100-500bp范围内，不进行此步骤；若片段不在100-500bp范围内，通过超声打断至100-500bp。

b)末端修复。

c)末端加“A”。

d)PE接头连接。

e)PCR扩增Chip文库。

f)2％琼脂糖片段筛选，切胶回收获得Chip最终文库。

在文库构建完成后，需要对文库进行质控，先使用Qubit^TM2.0荧光定量仪进行初步定量，然后使用Aglient 2100Bioanalyzer生物芯片分析系统对文库的片段大小insertsize进行检测，insert size符合预期后，使用StepOnePlus^TM实时荧光定量PCR系统进行Q-PCR检测，准确地定量文库的有效浓度，以确保文库的质量。

(4)测序

对检测合格的文库，在Hiseq平台上进行SE50测序。

(1)碱基质量分布

在免疫共沉淀步骤中，一部分未经免疫共沉淀的DNA用来作为参考内参，所以在读长(reads)结果中，一共有SLEIP(共沉淀)、SLEInput(未共沉淀)、NCIP(共沉淀)和NCInput(未共沉淀)四组数据。测序错误率与碱基质量有关，为了反映测序过程中测序质量的稳定性，以过滤后序列的碱基位置作为横坐标，每个位置的平均质量值作为纵坐标，绘制测序碱基质量分布图1。当值为40时，测序碱基正确识别率达99.99％。结果显示，SLE组和NC组的值分布均接近40，测序碱基正确识别率高，说明测序结果可靠。

(2)相关性检验

通过样本比对结果的相关性分析结果比较IP与Input的样品间的区别是检验试验可靠性的重要指标。样品比对结果的相关系数越高，则表明样品之间的模式相似度越高。由图2可知，SELIP样本和SELInput样本的相关系数为0.22、NCIP样本和NCInput样本的相关系数为0.28，相关系数低，两样本存在明显区别，实验可靠。

(3)读长在重复区域的分布

对于很多物种来说，表观修饰在基因结构稳定性上起到重要作用。生物细胞中的DNA序列中包含许多重复序列(Repeated Sequence)，可分为两大类，即：串连重复序列和散落重复序列，大类中细分为多种型态。例如：串连重复(Tandem Repeat)又包括卫星DNA(Satellite DNA)、小卫星(Minisatellite)、微卫星(Microsatellite)；散在重复(Interspersed Repeat)包括短散在序列(Short Interspersed Nuclear Element，SINE)、长散在重复(Long Interspersed Nuclear Element，LINE)。对比对到Repeats区域的Reads进行分析，有助于更好的了解染色体结构的表观调控机制。Reads在repeats区域分布如图2所示。我们发现约40％的reads出现在重复序列中，表明6ma和重复序列有一定的关系，其中在LINE/L1中的Reads有5254294，在SINE/Alu中的是2887416，所占的比例明显增多，而LINE/L2、SINE/MIR、LTR/ERVL、LTR/ERVL-MaLR、LTR/ERV1等重复序列上，SLE患者也有一定的增多。同时，系统性红斑狼疮单个核细胞唯一定位读长在参考基因组中定位比例在基因重复序列中的分布高于正常对照组中单个核细胞的分布(11545843>8366568)。

(4)读长在各基因功能元件上的分布

系统性红斑狼疮单个核细胞唯一定位读长在参考基因组中定位比例在基因体中的分布同样高于正常对照中的单个核细胞(56.4317％>43.5328％)。图3表示比对的读长在基因组上各个区域的分布。无论是在下游2K、外显子、内含子、上游2K、3-UTR、5-UTR或基因间区上，两者之间都有一定的差异。

(5)Peaks分析

对于一个特异性结合位点而言，Reads在其结合位点处会有显著的富集。简而言之，peaks出现的位置就是高N6-甲基腺嘌呤的热点位置。Peaks扫描就是为了寻找这些热点。采用MACS2软件(V2.1.1)预测IP比对样本的Fragment size。MACS2以某个window size扫描基因组，统计每个window中Reads的富集程度，然后抽取1000个的window作为样本以构建富集模型，来进行Frag_size的预测。在定义分析模型后进行全基因组的Peaks扫描，即可预测peaks的位置、序列等。对预测出来的peaks，采用Poisson分布模型，利用唯一比对Reads计算各个潜在区域的p-value。当p-value<1e-5时，认为该区域是一个Peak。扫描结果如下表所示。结果显示，SLE患者的峰个数明显高于对照组。

表2.Peaks扫描结果

Peaks的显著程度是Peaks可信程度的指标，我们也对每个Peaks计算其qvalue，以表示其显著性，横轴表示-log10qvalue分布，纵轴表示Peaks数(左侧坐标轴)及其百分比(右侧坐标轴)，qvalue越小显著性越大，其结果越可信。如图4所示，SLEIP组总计有208875个peak的-log10qvalue大于20。NCIP组总计有101034个peak的-log10qvalue大于20。因此，结果可信。

(6)Peaks差异分析

将不同样品的Peaks进行分组比较，得到不同样品间的共有Peaks和特异Peaks的数量。分析方法：每组比较的两个样品中，合并Peaks区域，若两个样品中两个及以上的Peaks有交集就认为是一个共有的Peaks。一个样品的Peaks可能与另一个样品的两个或以上Peaks有交集。

表3.SLE和NC两样本间共有和特异Peaks的比较

对差异性分析后得到的Peaks相关基因进行分析，统计在不同样品中的差异基因数量，结果如图5。

对得到的每个样品的特异性基因进行分析，统计特异性基因在不同基因区域的分布，详细统计如表4所示。

表4.SLE和NC两样本差异基因的峰统计表

本发明应用精确的测序方法，首次对比了6mA在系统性红斑狼疮患者与健康人之间的分布差异。结合结果可知，与正常人相比，6mA reads在SLE组分布较高。在Peaks分析结果中，SLE组中的特异峰值较高，有129149个特异峰，其中21222个峰分布在基因功能区。同时，在SLE单个核细胞DNA基因功能区域上共有5462个6mA位点基因差异表达，这些结果均提示6mA与SLE有关，可能参与了SLE的发病机制，因此，6mA可能可以成为精确诊断SLE的标记物，而去甲基化也是SLE的治疗潜在靶点之一。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (3)

1.定量染色体DNA的N6-甲基腺嘌呤的丰度的试剂在制备系统性红斑狼疮的检测、预后试剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂定量所述染色体DNA的重复序列的N6-甲基腺嘌呤的丰度；

其中，所述重复序列为LINE/L1、LINE/L2、SINE/Alu、SINE/MIR、LTR/ERVL、LTR/ERVL-MaLR、LTR/ERV1中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂定量所述染色体DNA的基因功能元件的N6-甲基腺嘌呤的丰度；

其中，所述基因功能元件为基因间区、内含子中的至少一种。

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