CN102978279B - 检测急性淋巴细胞性白血病的基因探针组合物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测急性淋巴细胞性白血病的基因探针组合物及试剂盒,该基因探针组合物包括TEL基因探针,AML1基因探针,PAX5基因探针,P16基因探针和IKZF1基因探针。本发明的另一目的是提供了一种急性淋巴细胞性白血病荧光原位杂交检测试剂盒,该试剂盒包括上述基因探针组合物。本发明试剂盒可对同一样本甚至白血病单个细胞进行5种基因的同时检测,显著提高了检测能力和效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因探针组合物及试剂盒,尤其涉及一种检测急性淋巴细胞性白血病的基因探针组合物及试剂盒。
背景技术
急性淋巴细胞性白血病是一种恶性程度很高的血液疾病,其特征为外周血中存在大量的类似于淋巴母细胞的未成熟白细胞,这些异常细胞也可在骨髓,淋巴结,脾脏和其它器官中发现。急性淋巴细胞白血病在儿童急性白血病中约占80%,发病率高峰在3岁至7岁之间,该病也可发生于成年人,约占所有成年白血病的20%。在急性白血病中,恶性细胞失去成熟和定向分化的功能,恶变细胞迅速分裂并取代正常细胞。当恶性细胞取代正常的骨髓成分时即发生骨髓衰竭,由于正常细胞的数目急剧减少,患者变得容易出血和感染。
目前,急性淋巴细胞性白血病的发病原因仍不清楚。辐射、某些毒素,如苯和一些化学试剂,可能和该病的诱发有关。近年来分子生物学的研究表明,染色体和某些基因的异变在急性淋巴细胞性白血病的发生过程中发挥了关键的作用。例如:TEL/AM1基因融合是由t(12;21)染色体易位引起的。这种基因重排最常见于B细胞急性淋巴细胞性白血病,荧光原位杂交法的检出率为21%,而常规细胞遗传学的检出率仅为0.05%。这种基因易位有较好的预后,但可能有复发。TEL基因在儿童急性淋巴细胞白血病中常有缺失,虽然在细胞遗传学上不可见,但可引起12p12-13的杂合子缺失(LOH)。这个缺失和TEL/AM1易位有关。TEL和AML1基因均编码转录因子,但TEL在骨髓造血中是必需的。TEL/AML1易位引起几乎完整的AML1蛋白和TEL的一部分相融合,是引发急性淋巴细胞性白血病的原因之一。
PAX5也是一种转录因子。PAX5编码B淋巴细胞特异的激活蛋白,在淋巴细胞分化的早期表达,该蛋白在淋巴细胞分化早期具有重要调节作用。PAX5基因位于染色体9p13区域。T(9;14)(p13;q32)易位引起的PAX5基因转录异常,会引起淋巴瘤。
P16基因位于染色体9p21。而9p21的缺失存在大量肿瘤之中包括10%的儿童急性淋巴细胞性白血病病人,并且其发病率在T细胞急性淋巴细胞性白血病中更高。这一区域有很多研究,发现荧光原位杂交法检出9p21缺失的儿童急性淋巴细胞白血病中的90%含有抑癌基因P16(CDKN2A)的缺失。该基因抑制CDK4和CDK6两个激酶,控制细胞周期从G1到S期的转换。这一细胞周期控制功能的破坏引起突变细胞的增值。
IKZF1(Ikaros family zinc finger protein 1)是一种具有锌指结构的重要的人体蛋白质。IKZF1在造血系统中具有极其重要的功能,它的缺失可引发淋巴细胞性白血病。近年来的研究表明IKZF1是一种抑癌基因,该基因的缺失和急性B淋巴细胞性白血病的发病密切相关。最近的研究发现,在费城染色体阳性的急性淋巴细胞性白血病的发生和慢性髓性白血病的急淋变过程中,包括IKZF1基因缺失在内的其他遗传学改变与BCR-ABL1易位起了协同作用。
综上所述,TEL,AML1,PAX5,P16和IKZF1这5种基因和急性淋巴细胞白血病的发生有着密切的关系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:提供一种检测急性淋巴细胞性白血病的基因探针组合物及试剂盒,可以用于确定急性淋巴细胞性白血病的分子病理类型,判断病情预后,指导个体化治疗,评估临床治疗效果,监测病灶复发和转移。
为了解决上述问题,本发明采用的技术方案为:
本发明提供了一种检测急性淋巴细胞性白血病的基因探针组合物,包括TEL基因探针,AML1基因探针,PAX5基因探针,P16基因探针和IKZF1基因探针。
优选地,所述的基因探针组合物包括:
TEL基因探针:RP11-654E9(UCSC genome browser);
AML1基因探针:RP11-77G18(UCSC genome browser);
PAX5基因探针:RP11-243F8(UCSC genome browser);
P16基因探针:RP11-97A22(UCSC genome browser);
IKZF1基因探针:RP11-663L2(UCSC genome browser)。
上述基因探针组合物中所涉及的基因探针均为经过荧光素标记的探针。
根据本发明一个优选的实施方案,TEL、AML1、PAX5、P16、IKZF1单个基因探针制备步骤如下:
1)、克隆筛选:检索UCSC genome browser,NCBI Clone Registry,Ensembl GenomeBrowser等数据库分别含TEL,AML1,PAX5,P16,IKZF1基因的所有克隆,并对这些克隆进行筛选,选择最佳的克隆;
2)、克隆培养和鉴定:按照筛选确定的克隆编号购买BAC克隆(美国Invitrogen公司),取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃振摇活化培养8-16小时;然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃震摇培养8-16小时;对TEL、AML1、PAX5、P16、IKZF1的BAC克隆用相对应的基因引物进行多聚酶链式反应扩增,用1-2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析,从而完成待选克隆的分子鉴定;
3)、基因探针的制备和验证:对多聚酶链式反应鉴定阳性的菌液,进行质粒制备;用ND-1000超微量分光光度计对质粒进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定;采用缺口平移的方法对质粒DNA进行荧光标记,(选择最佳的荧光染料和镜检的荧光显微镜的滤光片匹配组合,使检测到的荧光信号强度最大);对标记产物进行沉淀和浓缩;将荧光标记的探针溶于含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液中,-20°C避光,储存,采用正常人外周血单个核细胞甩片进行探针鉴定。
根据本发明一个优选的实施方案,TEL、AML1、PAX5、P16、IKZF1基因探针组合物的制备步骤如下:
1)、克隆筛选:检索UCSC genome browser,NCBI Clone Registry,Ensembl GenomeBrowser等数据库分别含有TEL,AML1,PAX5,P16、IKZF1基因的所有细菌人工染色体(BAC)克隆,并对这些克隆进行多聚酶链式反应(PCR)鉴定,选出最佳的克隆。
2)、克隆培养和鉴定:按照筛选确定的克隆编号购买BAC克隆(美国Invitrogen公司),取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃振摇活化培养8-16小时;然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃震摇培养8-16小时;对TEL、AML1、PAX5、P16、IKZF1的BAC克隆用相对应的基因引物进行多聚酶链式反应扩增,用1-2%的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析,从而完成待选克隆的分子鉴定。
3)、基因探针的制备和鉴定:获得目的基因的克隆后,提取大量DNA,酶切DNA后采用缺口平移的方法对酶切后的DNA进行荧光素标记,再对TEL,AML1,PAX5,P16和IKZF1基因探针组合后进行沉淀和浓缩,将制作好的探针组合物溶解到含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液中,即得荧光标记探针组杂交混合液,采用正常人外周血单个核细胞甩片进行探针鉴定。
根据本发明一个优越的实施方案,克隆筛选步骤中含TEL基因最优的克隆,编号为RP11-654E9(UCSC genome browser);
根据本发明一个优越的实施方案,克隆筛选步骤中含AML1基因最优的克隆,编号为RP11-77G18(UCSC genome browser);
根据本发明一个优越的实施方案,克隆筛选步骤中含有PAX5基因最优的克隆,编号为RP11-243F8(UCSC genome browser);
根据本发明一个优越的实施方案,克隆筛选步骤中含有P16基因最优的克隆,编号为RP11-97A22(UCSC genome browser);
据本发明一个优越的实施方案,克隆筛选步骤中含有IKZF1基因最优的克隆,编号为RP11-663L2(UCSC genome browser)。
根据本发明一个优越的实施方案,克隆培养和鉴定步骤中使用的TEL基因引物序列为:
TEL基因探针:上游引物5’-TTTGGATGAAGAGCCTCGTTGTG-3’(SEQ ID NO:1)和
下游引物5’-GCGTGATATTGCCGAGATTTGC-3’(SEQ ID NO:2);
根据本发明一个优越的实施方案,克隆培养和鉴定步骤中使用的AML1基因引物序列为:
AML1基因探针:上游引物5’-CCAAGAGGATTCATAGTCACGGG-3’(SEQ ID NO:3)和
下游引物5’-TCCTTGCCCTTACTGACCTTCC-3’(SEQ ID NO:4);
根据本发明一个优越的实施方案,克隆培养和鉴定步骤中使用的PAX5基因引物序列为:
PAX5基因探针:上游引物5’-GATCCTTCCAGCTTGGTCTCC-3’(SEQ ID NO:5)和
下游引物5’-GGCTGAACGTGTATGTCTTCCC-3’(SEQ ID NO:6);
根据本发明一个优越的实施方案,克隆培养和鉴定步骤中使用的P16基因引物序列为:
P16基因探针:上游引物5’-CTTCCTGGACACGCTGGT-3’(SEQ ID NO:7)和
下游引物5’-AGTCTTCATTGCTCCGCAGT-3’(SEQ ID NO:8);
根据本发明一个优越的实施方案,克隆培养和鉴定步骤中使用的IKZF1基因引物序列为:
IKZF1基因探针:上游引物5’-CGGAAATCTGAAAGGGAACTG-3’(SEQ ID NO:9)和
下游引物5’-GATGAAGAGAATGGGCGTGC-3’(SEQ ID NO:10);
多聚酶链式反应扩增条件为:94°C 5分钟;“94°C 30秒,58-62°C 30秒,72°C 45秒”循环35次:72°C 10分钟。
根据本发明的一个优选方法:基因探针制备过程中用EcoR1酶对目的DNA进行酶切,EcoR1酶的浓度为0.1单位/微升;50微升切口平移体系中脱氧核糖核酸聚合酶I的使用量为10个单位,脱氧核糖核酸酶I使用量为50纳克。
根据本发明一个优选方案,在将标记好荧光素的DNA进行沉淀时,加入三种人类未标记的竞争性CotDNA,ssDNA和tRNA重复序列脱氧核糖核酸,以降低杂交反应时产生的荧光背景,其中CotDNA,ssDNA和tRNA沉淀时的使用浓度均为1毫克/毫升,沉淀的体系为300微升。
根据本发明一个优选方案,基因探针浓缩方法为乙醇(-20℃)沉淀浓缩,最后使用杂交缓冲液溶解沉淀。
根据本发明一个优选实施方案,杂交缓冲液的组分包括50%的去离子甲酰胺,2×SSC和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。
本发明的另一目的是提供了一种急性淋巴细胞性白血病荧光原位杂交检测试剂盒,包括上述基因探针组合物。
优选地,所述的试剂盒还包括杂交缓冲液。更优选地,所述基因探针组合物溶解在杂交缓冲液中,即荧光标记探针组杂交混合液,更优选地,所述TEL基因探针的浓度为:4ng/μl,AML1基因探针的浓度为:4ng/μl,PAX5基因探针的浓度为:4ng/μl,P16基因探针的浓度为:4ng/μl,IKZF1基因探针的浓度为:4ng/μl。
更优选地,所述杂交缓冲液的组分包括50%的去离子甲酰胺,2×SSC和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。
优选地,所述试剂盒还包括DAPI复染液。
优选地,所述试剂盒还包括20X SSPE洗涤液。
优选地,所述试剂盒还包括包装试剂管的塑料包装盒。
本发明还提供了上述试剂盒在急性淋巴细胞白血病荧光原位杂交检测中的应用,包括如下步骤:
1)、标本处理和制片:收集病人骨髓细胞,用0.075摩尔/升的KCl低渗液去除骨髓中的红细胞,用固定液(甲醇:冰乙酸=3∶1)室温固定细胞三次,第一次固定30分钟,第二、三次固定各15分钟,用固定液调整细胞浓度为1×105/ml,进行细胞甩片,晾干,用钻石笔标记细胞位置,用2×SSC(37℃)洗涤5分钟,梯度乙醇(70%,85%,2×100%乙醇)中脱水,3分钟/梯度,晾干后FISH检测备用。
2)、杂交:将要检测的标本处理好后,加入上述制备的荧光标记探针组杂交混合液,2微升/片,加上规格为12×12mm普通盖玻片,避免产生气泡,用封片胶封片,37℃干燥20分钟,将玻片放入杂交仪中,78℃变性5分钟,37℃杂交过夜。
3)、洗片:标本杂交过夜后,去除盖玻片,放入4×核酸杂交的缓冲液(Saline SodiumPhosphate EDTA,SSPE)中洗涤两次,梯度乙醇中脱水,放入己烷:异丙醇(60∶40)混合液中10分钟,再放入异丙醇中5分钟,最后放入100%的乙醇中5分钟,晾干,用DAPI复染,在荧光显微镜下观察检测结果。
4)、图像采集与分析:在荧光显微镜下使用相应的滤光片观察不同的荧光信号,对信号进行拍照和计数。
本发明所具有的有益效果:
1、目前市场上的荧光原位杂交法通常可同时检测1-2个基因;而本试剂盒可对同一样本甚至白血病单个细胞进行5种基因的同时检测,显著提高了检测能力和效率。
2、本试剂盒可用于对急性淋巴细胞白血病进行分子病理分型。
3、本发明试剂盒可直接用于中期或间期白血病细胞的荧光杂交法检测,而无需细胞培养和制备高质量的中期染色体片,操作大大简化。
4、本发明试剂盒也可用于其他种类白血病如慢性淋巴细胞白血病,急性髓系白血病,慢性髓系白血病等恶性血液疾病的研究和分子病理分型。
附图说明
图1为使用多聚酶链式反应(PCR)对相应的BAC探针进行鉴定的1%琼脂糖凝胶电泳图。其中hGD(human genomic DNA):人类基因组DNA用作阳性对照;PD(plasmid DNA):BAC探针DNA;URC(unrelated control):无关BAC克隆对照。凝胶电泳结果显示,在用于检测AML1,PAX5,p16,TEL和IKZF1基因的BAC克隆中能分别扩增出相应基因的DNA片段,并且这些DNA片段大小和设计相符合,而无关BAC克隆对照则呈现PCR阴性。
图2为用蓝色荧光素PromoFluor-415-aadUTP(PF415)标记含有IKZF1基因的BAC克隆(表2),将制作好的探针和正常人外周血单个核细胞进行杂交,再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示细胞核中呈现两个荧光素信号点,表明含IKZF1基因的BAC克隆可用于制作检测IKZF1基因的FISH探针。
图3是本发明将成功制作的Green-TEL(绿色荧光素标记的TEL探针),PF555AML1(红色荧光素标记的AML1探针),PF590-PAX5(橙色荧光素标记的PAX5探针),HyPer5-P16(紫色荧光素标记的P16探针),PF415-IKZF1(蓝色荧光素标记的IKZF1探针)5种探针(表1)混合后对正常人外周血单个核细胞进行杂交,再进行荧光显微镜镜检得到的图像。结果显示在同一细胞核中,每种探针得到两个清晰的荧光信号,5种探针一共获得10个相应的荧光信号点,获得的图像清晰,信噪比高。
图4是本发明成功制备的Green-TEL,PF555AML1,PF590-PAX5,HyPer5-P16,PF415-IKZF1基因检测试剂盒对急性淋巴细胞性白血病TELAML1融合基因阳性患儿骨髓标本进行检测获得的图像。从获得的图像中可以看出急性淋巴细胞性白血病患儿的骨髓细胞中有许多(该病例有6种)的亚克隆种类(如表4所示)。
图5是本发明成功制备的Green-TEL,PF555-AML1,PF590-PAX5,HyPer5-P16,PF415-IKZF1基因检测试剂盒对同一个急性淋巴细胞性白血病TEL-AML1融合基因阳性患儿初诊和缓解后的骨髓细胞检测获得的图像。从获得的图像中可以看出该患儿骨髓细胞中的亚克隆种类发生的变化(如表5所示)。
具体实施方式
下列通过具体实施例对本发明作进一步说明,但不限定本发明的保护范围。实施例1:IKZF1基因探针的制备方法,包括如下步骤:
1.引物设计克隆筛选:IKZF1基因位于人7号染色体短臂12.3-12.2区段(7p12.3-p12.2),检索UCSC genome browser,NCBI Clone Registry,Ensembl GenomeBrowser数据库所有含有IKZF1基因的克隆,用多聚酶链式反应筛选出包含有该基因的最优克隆,编号为RP11-663L2(如表2所示)。
2.克隆培养和鉴定:购买克隆RP11-663L2(美国Invitrogen公司),取8微升克隆菌液加到5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃振摇活化培养12小时;然后将菌液全部加入至450毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃震摇培养12小时后收集菌液,菌液使用上游引物5’-CGGAAATCTGAAAGGGAACTG-3’和下游引物5’-GATGAAGAGAATGGGCGTGC-3’进行PCR扩增,扩增条件为:94°C 5分钟;(“94°C 30秒,58-62°C 30秒,72°C 45秒”)循环35次:72°C 10分钟,对扩增产物进行电泳验证。
3.基因探针制备:
(1)对鉴定阳性的菌液,使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒,按照说明书要求进行BAC克隆质粒的提取和纯化。用ND-1000超微量分光光度计对质粒DNA进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。用EcoR1酶对目的DNA进行酶切,方法如下:
37℃孵育1小时,加入1微升的0.5M的乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid,EDTA)(PH 7.5)终止反应,混匀,瞬时离心。
(2)沉淀DNA:加入步骤(1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
(3)再加入步骤(2)总液体量2倍体积100%乙醇(-20℃),混匀,瞬时离心,-70℃,沉淀约2小时。离心14000rpm,4℃,20分钟,用枪尖小心吸弃上清,加入100微升70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。用枪尖小心吸弃上清,干燥沉淀10分钟,用10微升的10mM的Tris-HCl(PH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时,转速800rpm,将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
(4)连接反应:
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记,对IKZF1基因采用PromoFluor-415-aadUTP荧光素标记,PF415-IKZF1(蓝色)探针标记方法如下:
取避光的EP管,先加入水,最后加入DNase I(10纳克/微升)和DNA polymerase I(10单位/微升,酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液:
混匀,瞬时离心,14℃孵育过夜(9-12小时)。次日加入5微升的0.5M的EDTA(PH 7.5)终止反应,混匀,瞬时离心,连接好的DNA放在-20℃避光保存。
(5)沉淀DNA:
按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀:
再加入15微升的3M的乙酸钠,630微升的100%乙醇(-20℃)混匀,瞬时离心,-20℃,沉淀过夜。次日离心14000rpm,4℃,20分钟。用枪尖小心吸弃上清,加入100微升的70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。用枪尖小心吸弃上清,室温避光干燥沉淀10分钟。加入10微升的含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀,在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针,转速800rpm,将溶解好的探针放入56℃中孵育1小时,室温离心14000rpm,20分钟,将离心好的探针转移至一个新的避光EP管中,4℃中保存,若长期不用探针应保存于-20℃。
4.PF415-IKZF1基因探针验证:
(1)细胞准备:
采用密度梯度离心的方法用Ficoll液提取正常人外周血单个核细胞,磷酸缓冲液(PBS)洗涤后进行细胞甩片,转速1000rpm,3分钟;晾干,放入甲醇中室温固定过夜;次日放入1-2%的甲醛溶液中室温固定5分钟,PBS中洗涤后放入70%的乙醇中-20℃保存;将保存在70%的乙醇中的标本拿出,放入梯度乙醇(70%,85%,2×100%乙醇)中脱水,3分钟/梯度,脱水后晾干,加入制作好的探针,2微升/片,加上12×12mm普通盖玻片,避免产生气泡,用封片胶封片,37℃干燥20分钟。
(2)杂交:
将玻片放入杂交仪中,78℃变性5分钟,37℃杂交过夜。
(3)洗涤:
将杂交过夜的片子移去盖玻片,放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟,55℃的4×SSPE中洗涤10分钟;梯度乙醇中脱水(70%,85%,2×100%乙醇),3分钟/梯度;放入己烷:异丙醇(60∶40)混合液中10分钟,再放入异丙醇中5分钟,最后放入100%的乙醇中5分钟;空气中干燥片子约10分钟后加入8微升的DAPI,加上盖玻片,避免产生气泡,指甲油封片。
(4)图像采集与分析:
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型,滤光片采用Chroma公司DAPI(SP-100)和Zeiss公司PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野,定位,用AxioVisionRel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置,然后用高分辨率CCD(Charge-CoupledDevice,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission:450-490nm)和PF-415(Emission:460-500nm)两个滤光片通路中采集荧光信息,用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层,采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上,从而获得清晰、稳定,理想的图像(如图1所示)。
(5)结果判断:
荧光原位杂交结果显示,在同一个正常人外周血单个核细胞中,PF415-IKZF1基因探针得到两个清晰的荧光信号点。从获得的PF415-IKZF1(蓝色)图像(图2)中可以看出,该基因的荧光信号较强,图像清晰,信噪比高,方法可靠稳定。
实施例2:TEL、AML1、PAX5、P16、IKZF1基因探针组合物的制备方法,包括如下步骤
1.引物设计克隆筛选:
通过检索UCSC genome browser,NCBI Clone Registry,Ensembl Genome Browser等数据库分别含有TEL,AML1,PAX5,P16、IKZF1基因的所有克隆,用多聚酶链式反应筛选出包含有该基因的克隆,编号依次为:RP11-654E9,RP11-77G18,RP11-243F8,RP11-97A22,RP11-663L2。(如表1所示)。
2.克隆培养和鉴定:按照克隆编号购买克隆(美国Invitrogen公司),取8微升克隆菌液加到5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃振摇活化培养12小时;然后将菌液全部加入至450毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃震摇培养12小时后收集菌液,
对TEL基因探针对应的菌液使用上游引物5’-TTTGGATGAAGAGCCTCGTTGTG-3’(SEQ IDNO:1)和下游引物5’-GCGTGATATTGCCGAGATTTGC-3’(SEQ ID NO:2)进行PCR扩增;对AML1基因探针对应的菌液使用上游引物5’-CCAAGAGGATTCATAGTCACGGG-3’(SEQ ID NO:3)和下游引物5’-TCCTTGCCCTTACTGACCTTCC-3’(SEQ ID NO:4)进行PCR扩增;对PAX5基因探针对应的菌液使用上游引物5’-GATCCTTCCAGCTTGGTCTCC-3’(SEQ ID NO:5)和下游引物5’-GGCTGAACGTGTATGTCTTCCC-3’(SEQ ID NO:6)进行PCR扩增,对P16基因探针对应的菌液使用上游引物5’-CTTCCTGGACACGCTGGT-3’(SEQ ID NO:7)和下游引物5’-AGTCTTCATTGCTCCGCAGT-3’(SEQ ID NO:8)进行扩增;对IKZF1基因探针对应的菌液使用上游引物5’-CGGAAATCTGAAAGGGAACTG-3’和下游引物5’-GATGAAGAGAATGGGCGTGC-3’进行PCR扩增。
扩增条件为:94°C 5分钟;(“94°C 30秒,58-62°C 30秒,72°C 45秒”)循环35次:72°C 10分钟,对扩增产物进行电泳验证。
凝胶电泳结果显示(如图1所示),在用于检测AML1,PAX5,p16,TEL和IKZF1基因的BAC克隆中能分别扩增出相应基因的DNA片段,并且这些DNA片段大小和设计相符合。
3.基因探针制备:
(1)使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒,按照说明书要求进行BAC克隆质粒的提取和纯化。用ND-1000超微量分光光度计对质粒DNA进行浓度和纯度(260nm/280nm)测定。用EcoR1酶对目的DNA进行酶切,方法如下:
37℃孵育1小时,加入1微升的0.5M的EDTA(PH 7.5)终止反应,混匀,瞬时离心。
(2)沉淀DNA:加入步骤(1)总液体量1/10体积的3M乙酸钠。
(3)再加入步骤(2)总液体量2倍体积100%乙醇(-20℃),混匀,瞬时离心,-70℃,沉淀约2小时,离心14000rpm,4℃,20分钟,用枪尖小心吸弃上清,加入100微升70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。用枪尖小心吸弃上清,干燥沉淀10分钟,用10微升的10mM的Tris-HCl(pH8.5)重悬后在振荡器上连续震荡至少5小时,转速800rpm,将溶解好的DNA放在4℃保存直至连接反应。
(4)连接反应:
采用切口平移法对酶切好的DNA进行荧光素标记,对TEL、AML1、PAX5、P16、IKZF1基因分别采用Green dUTP,PromoFluor-555-aadUTP,PromoFluor-590-aadUTP,HyPer5dCTP,PromoFluor-415-aadUTP五种荧光素(表3)标记,对Green-TEL(绿色),PF555-AML1(红色),PF590-PAX5(橙色),HyPer5-P16(紫色),PF415-IKZF1(蓝色)探针分别标记如表1,方法如下:
取避光的EP管,先加入水,最后加入DNase I(10纳克/微升)和DNA polymerase I(10单位/微升,酶始终放在冰盒或冰上)按如下反应体系加液:
混匀,瞬时离心,14℃孵育过夜(9-12小时),次日加入5微升的0.5M的EDTA(PH 7.5)终止反应,混匀,瞬时离心,连接好的DNA放在-20℃避光保存。
(5)沉淀DNA:
按照以下反应体系对目的标记好的DNA进行沉淀:
再加入15微升的3M的乙酸钠,630微升的100%乙醇(-20℃)混匀,瞬时离心,-20℃,沉淀过夜。次日离心14000rpm,4℃,20分钟。用枪尖小心吸弃上清,加入100微升的70%乙醇(4℃),混匀,离心14000rpm,4℃,15分钟。用枪尖小心吸弃上清,室温避光干燥沉淀10分钟。加入10微升的含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液溶解沉淀,在振荡器上连续震荡至少6小时以充分溶解探针组合物,转速800rpm,将溶解好的探针组合物放入56℃中孵育1小时,室温离心14000rpm,20分钟,将离心好的探针组合物转移至一个新的避光EP管中,4℃中保存,若长期不用探针组合物应保存于-20℃。
4.Green-TEL,PF555-AML1,PF590-PAX5,HyPer5-P16,PF415-IKZF1基因探针组合物验证:
(1)细胞准备:
用Ficoll液进行密度梯度离心提取正常人外周血单个核细胞,PBS洗涤后进行细胞甩片,细胞甩片,转速1000rpm,3分钟;晾干,放入甲醇中室温固定过夜;次日放入1-2%的甲醛溶液中室温固定5分钟,PBS中洗涤后放入70%的乙醇中-20℃保存;将保存在70%的乙醇中的标本拿出,放入梯度乙醇(70%,85%,2×100%乙醇)中脱水,3分钟/梯度,脱水后晾干,加入制作好的探针组合物,2微升/片,加上12×12mm普通盖玻片,避免产生气泡,用封片胶封片,37℃干燥20分钟。
(2)杂交:
将玻片放入杂交仪中,78℃变性5分钟,37℃杂交过夜。
(3)洗涤:
将杂交过夜的片子移去盖玻片,放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟,55℃的4×SSPE中洗涤10分钟;梯度乙醇中脱水(70%,85%,2×100%乙醇),3分钟/梯度;放入己烷:异丙醇(60∶40)混合液中10分钟,再放入异丙醇中5分钟,最后放入100%的乙醇中5分钟;空气中干燥片子约10分钟后加入8微升的DAPI,加上盖玻片,避免产生气泡,指甲油封片。
(4)图像采集与分析:
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型,滤光片采用Chroma公司分别为:DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TM v1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50),PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野,定位,用AxioVision Rel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置,然后用高分辨率CCD (Charge-CoupledDevice,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission:450490nm),SpectrumGreenTM(Emission:512-542nm),Cy3TM v1(Emission:559.5-574.5nm),Texas Red(Emission:619.5-642.5nm),Cy5(Emission:665-715nm),PF-415(Emission:460-500nm)六个滤光片通路中采集荧光信息,用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描25-30层,采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上,从而获得获得清晰、稳定,理想的多色图像。拍摄3个区域共计200个细胞,记录TEL基因,AML1基因,PAX5基因,P16基因和IKZF1基因的荧光信号数目。
(5)结果判断:
荧光原位杂交结果显示,同一细胞核中,每种探针得到两个清晰的荧光信号,5种探针一共获得10个相应的荧光信号点。从获得的Green-TEL(绿色),PF555-AML1(红色),PF590-PAX5(橙色),HyPer5-P16(紫色),PF415-IKZF1(蓝色)多色图像(图3)中可以看出,同时检测的5个不同基因的荧光信号均较强,图像清晰,信噪比高。方法可靠稳定。实施例3:一种急性淋巴细胞性白血病荧光原位杂交检测试剂盒(50人份),组成如下:
1)荧光标记探针组杂交混合液100微升; 1管
2)DAPI复染液500微升; 1管
3)20X SSPE洗涤液20毫升; 1瓶
4)说明书 1份。
其中荧光标记探针组杂交混合液中TEL基因探针浓度为:4ng/μl,AML1基因探针浓度为:4ng/μl,PAX5基因探针浓度为:4ng/μl,P16基因探针浓度为:4ng/μl,IKZF1基因探针浓度为:4ng/μl。所述杂交混合液的组分包括50%的去离子甲酰胺,2×SSC和0.1克/毫升的硫酸葡聚糖。
实施例4:急性淋巴细胞性白血病荧光原位杂交检测试剂盒的使用方法
收集临床急性淋巴细胞性白血病TEL-AML1融合基因阳性患儿骨髓标本45例,使用实施例3中所述急性淋巴细胞性白血病荧光原位杂交检测试剂盒进行检测,方法如下:
1.标本处理和制片:
收集病人骨髓细胞,用0.075摩尔/升的KCl低渗液去除骨髓中的红细胞,用固定液(甲醇:冰乙酸=3∶1)室温固定细胞三次,第一次固定30分钟,第二、三次固定各15分钟,用固定液调整细胞浓度为1×105/ml,进行细胞甩片,晾干,用钻石笔标记细胞位置,用2×SSC(37℃)洗涤5分钟,梯度乙醇(70%,85%,2×100%乙醇)中脱水,3分钟/梯度,晾干后FISH检测备用。
2.杂交反应:
将要检测的标本处理好后,加入实施例3试剂盒中的荧光标记探针组杂交混合液,2微升/片,加上规格为12×12mm普通盖玻片,避免产生气泡,用封片胶封片,37℃干燥20分钟。将玻片放入杂交仪中,78℃变性5分钟,37℃杂交过夜。
3.洗片:
将杂交过夜的片子移去盖玻片,放在47℃的4×SSPE中洗涤5分钟,55℃的4×SSPE中洗涤10分钟;梯度乙醇中脱水(70%,85%,2×100%乙醇),3分钟/梯度;放入己烷:异丙醇(60∶40)混合液中10分钟,再放入异丙醇中5分钟,最后放入100%的乙醇中5分钟;空气中干燥片子约10分钟后加入10微升的DAPI,加上盖玻片,避免产生气泡,指甲油封片。
4.图像采集与分析:
采用Zeiss公司多色荧光显微镜Axio Imager Z2型,滤光片采用Chroma公司分别为:DAPI(SP-100),Spectrum GreenTM(MF101),Cy3TM v1(SP-102),Texas Red(SP-107)和Zeiss公司Cy5(50),PF-415(45)组合。首先在DAPI滤光片下选择视野,定位,用AxioVisionRel.4.8.2软件中的重定位模块记录图像采集位置,然后用高分辨率CCD(Charge-CoupledDevice,电荷耦合原件)相机在63倍油镜下分别在DAPI(Emission:450-490nm),SpectrumGreenTM(Emission:512-542nm),Cy3TM v1(Emission:559.5-574.5nm),Texas Red(Emission:619.5-642.5nm),Cy5(Emission:665-715nm),PF-415(Emission:460-500nm)六个滤光片通路中采集荧光信息,调整焦距,在核的不同层次找到信号点,记录观察每个细胞中的各探针的数目,用图象处理软件Z-Stack采集模块在每个拍摄的细胞核上进行立体扫描5层,采用焦深延长模块将多层扫描的荧光杂交信号压缩在一张图像上,从而获得清晰、稳定,理想的多色图像。每片拍摄10个区域共计200个TEL-AML1融合基因阳性的细胞,记录TEL基因,AML1基因,PAX5基因,P16基因和IKZF1基因的荧光信号数目。
5.结果判断:
通过记录TEL基因,AML1基因,PAX5基因,P16基因和IKZF1基因的荧光信号数目。发现急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓细胞中有许多的亚克隆种类组成(图4);通过对同一个患儿初诊和缓解后的骨髓细胞检测,可以发现急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓细胞中的亚克隆种类发生的变化(图5)。从获得的Green-TEL(绿色),PF555AML1(红色),PF590PAX5(橙色),HyPer5-P16(紫色),PF415-IKZF1(蓝色)多色图像(图4,5)中可以看出,同时检测的5个不同基因的荧光信号均较强,图像清晰,信噪比高,方法可靠稳定。
目前临床对于急性淋巴细胞性白血病主要通过少数单个基因的检测,其结果远不能反应该病复杂的病理发生过程。因此,通过本发明试剂盒对同一标本甚至同一白血病细胞克隆进行多基因综合检测,可以更好得进行分子病理分型,研究和跟踪白血病干细胞克隆在疾病发生和发展过程中的衍化,更好的判断预后,指导个性化治疗,判断疗效和监测病程。
表1TEL,AML1,PAX5,P16和IKZF1基因检测试剂盒基因片段标记
表2IKZF1基因片段标记
表3荧光素标记的dUTP
表4急性淋巴细胞性白血病患儿骨髓细胞亚克隆种类(6种)
表5急性淋巴细胞性白血病患儿初诊和缓解时骨髓细胞亚克隆种类
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,但本发明的内容并不局限在上述的实施例中,相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例,但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
序列表
<110> 中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)
<120> 检测急性淋巴细胞性白血病的基因探针组及试剂盒
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEL基因探针上游引物
<400> 1
tttggatgaa gagcctcgtt gtg 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TEL基因探针下游引物
<400> 2
gcgtgatatt gccgagattt gc 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AML1基因探针上游引物
<400> 3
ccaagaggat tcatagtcac ggg 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AML1基因探针下游引物
<400> 4
tccttgccct tactgacctt cc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAX5基因探针上游引物
<400> 5
gatccttcca gcttggtctc c 21
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PAX5基因探针下游引物
<400> 6
ggctgaacgt gtatgtcttc cc 22
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P16基因探针上游引物
<400> 7
cttcctggac acgctggt 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> P16基因探针下游引物
<400> 8
agtcttcatt gctccgcagt 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IKZF1基因探针上游引物
<400> 9
cggaaatctg aaagggaact g 21
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IKZF1基因探针下游引物
<400> 10
gatgaagaga atgggcgtgc 20
Claims (4)
1.一种急性淋巴细胞性白血病荧光原位杂交检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒包括基因探针组合物,所述基因探针组合物为:TEL基因探针、AML1基因探针、PAX5基因探针、P16基因探针和IKZF1基因探针;上述基因探针均为经过荧光素标记的探针;
所述基因探针组合物的制备方法,包括如下步骤:
1)、选择含TEL基因的克隆, 编号为 RP11-654E9;含AML1基因的克隆, 编号为 RP11-77G18;含有PAX5基因的克隆, 编号为 RP11-243F8;含有P16基因的克隆, 编号为 RP11-97A22;含有IKZF1基因的克隆, 编号为 RP11-663L2;
2)、克隆培养和鉴定:按照选择的克隆编号购买BAC克隆,取5-10微升克隆菌液加到3-5毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃振摇活化培养8-16 小时;然后将菌液全部加入至400-500毫升含氯霉素抗性的LB液体培养基中,37℃震摇培养8-16小时;对TEL、AML1、 PAX5、P16、IKZF1的BAC克隆用相对应的基因引物进行多聚酶链式反应扩增,用1-2% 的琼脂糖凝胶电泳对产物进行分析,从而完成待选克隆的分子鉴定;
3)、基因探针的制备和鉴定:获得目的基因的克隆后,提取大量DNA,酶切DNA后采用缺口平移的方法对酶切后的DNA进行荧光素标记,再对TEL,AML1,PAX5,P16和IKZF1基因探针组合后进行沉淀和浓缩,将制作好的探针组合物溶解到含有50%去离子甲酰胺的杂交缓冲液中,即得荧光标记探针组杂交混合液,采用正常人外周血单个核细胞甩片进行探针鉴定;
克隆培养和鉴定步骤中使用的引物序列为:
TEL 基因探针: 上游引物 5’-TTTGGATGAAGAGCCTCGTTGTG-3’和
下游引物5’-GCGTGATATTGCCGAGATTTGC-3’;
AML1基因探针: 上游引物5’-CCAAGAGGATTCATAGTCACGGG-3’ 和
下游引物5’-TCCTTGCCCTTACTGACCTTCC-3’;
PAX5基因探针: 上游引物 5’-GATCCTTCCAGCTTGGTCTCC-3’ 和
下游引物5’-GGCTGAACGTGTATGTCTTCCC-3’;
P16基因探针: 上游引物5’-CTTCCTGGACACGCTGGT-3’ 和
下游引物5’-AGTCTTCATTGCTCCGCAGT-3’;
IKZF1基因探针: 上游引物 5’-CGGAAATCTGAAAGGGAACTG-3’和
下游引物5’-GATGAAGAGAATGGGCGTGC-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒还包括杂交缓冲液,所述的基因探针组合物溶解在杂交缓冲液中,即荧光标记探针组杂交混合液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:TEL基因探针的浓度为:4ng/ml,AML1基因探针的浓度为:4ng/ml, PAX5基因探针的浓度为:4ng/ml,P16基因探针的浓度为:4ng/ml,IKZF1基因探针的浓度为:4ng/ml。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于:所述杂交缓冲液的组分包括50%的去离子甲酰胺,2×SSC和0.1 克/毫升的硫酸葡聚糖。
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