CN105274111B - 一种长链非编码RNA lncRNA‑CRNN及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种长链非编码RNA lncRNA‑CRNN及其应用。根据lncRNA‑CRNN在宫颈癌组织中呈现低水平表达，构建过表达lncRNA‑CRNN的SiHa细胞系，研究lncRNA‑CRNN在宫颈癌细胞肿瘤形成中的作用，结果表明过表达lncRNA‑CRNN能够明显抑制SiHa细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力。本发明揭示了lncRNA‑CRNN在宫颈癌发病机制中的重要作用，也为宫颈癌的临床诊断、治疗和预后监测提供了新的分子标记和药物靶点。

Description

一种长链非编码RNA lncRNA-CRNN及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，涉及一种长链非编码RNA及其应用，具体涉及一种长链非编码RNA lncRNA-CRNN及其应用。

背景技术

宫颈癌是出现在子宫颈移行带或阴道部的子宫颈管内膜上皮细胞与鳞状上皮细胞交会处的恶性肿瘤。宫颈癌在女性中的发病率仅次于乳腺癌位居第二，死亡率则居于妇科恶性肿瘤之首，是威胁女性健康和生命的最常见的恶性肿瘤之一。我国是宫颈癌的高发国家，其发病率以2%-3%的速度逐年上升，并且呈现年轻化的趋势。因此，针对宫颈癌及癌前病变的早期诊断与干预显得尤为重要。

宫颈癌的发生、发展与转归是一个复杂的多阶段的过程。1974年，德国病毒学家Zur Hausen首先提出人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）可能与宫颈癌的发生有关^[1]（[1] Durst M，Gissmann L，lkenberg，et a1．A papillomavirus DNA from acervical carcinoma and its prevalence in cancer biopsy samples from differentgeographic regions[J]．Prec Natl Acad Sci USA，1983，80 (12)：3812～3815．）。随着对HPV与宫颈癌的关系的深入研究，目前认为HPV是导致宫颈癌发生的重要因素。然而，仅高危型HPV感染尚不足以导致宫颈癌的发生，多种异常调控的基因和遗传学因素的改变亦是肿瘤发展过程中至关重要的环节。

近年来，非编码RNA在肿瘤细胞增殖、分化、转移和凋亡等生物学过程中发挥的调节作用是研究者们关心的焦点问题。其中长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录本长度大于200 nt（nucleotide），并且不翻译成蛋白质的功能性RNA分子^[2]（[2]Carninci P，Kasukawa T，Katayama T，et al．The transcriptional landscape of themammalian genome[J]. Science，2005，309(5740)：1559-1563．）。近年来研究表明，lncRNA与许多癌症的发生和发展密切相关，如膀胱癌、乳腺癌、肝癌和前列腺癌等^[3-4]（[3] Zhu YY，Yu M，Li Z H，et al．lncRNA，a newly identified long noncoding RNA，enhanceshuman bladder tumor growth，invasion，and survival[J]．Urology，2010，77(2)：510.e1-510.e5．[4] Gupta R A，Shan N，Wang K C，et al．Long non-coding RNA HOTAIRreprograms chromatin state to promote cancer metastasis[J]．Nature，2010，464(7291)：1071-1076.）。但是关于lncRNA在宫颈癌发生过程中的作用尚鲜有报道。因此，本发明通过lncRNA芯片技术寻找在宫颈癌组织中异常表达的lncRNA，以期为宫颈癌的诊断、预后判断发掘新的生物标志物，以及为宫颈癌的治疗提供突破点。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是提供一种在宫颈癌组织中表达显著降低的长链非编码RNA lncRNA-CRNN及其应用。本发明的长链非编码RNA lncRNA-CRNN核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，是与人类宫颈癌发生密切相关的长链非编码RNA。

技术方案：

一种长链非编码RNA lncRNA-CRNN，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

含有权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒pCDH-lncRNA-CRNN。

含有权利要求1所述核苷酸序列的重组病毒lncCRNN。

含有权利要求1所述核苷酸序列的重组病毒载体。

所述长链非编码RNA lncRNA-CRNN在制备诊断宫颈癌的产品中的应用。

长链非编码RNA lncRNA-CRNN在制备治疗宫颈癌的产品中的应用。

本发明利用lncRNA表达谱芯片技术检测宫颈癌组织中lncRNA的表达情况，通过差异分析筛选到lncRNA-CRNN的表达显著降低；荧光定量PCR实验进一步证实lncRNA-CRNN在宫颈癌组织中的表达量明显低于癌旁组织。提取宫颈癌组织及癌旁组织的总RNA，反转录合成cDNA，设计lncRNA-CRNN PCR引物进行PCR扩增，首次克隆获得lncRNA-CRNN基因。构建表达lncRNA-CRNN的重组慢病毒，以获得过表达lncRNA-CRNN的SiHa宫颈癌细胞系，研究lncRNA-CRNN对SiHa细胞增殖、迁移、侵袭以及恶性程度的影响，从而探讨lncRNA-CRNN在宫颈癌发病过程中的作用，及其作为新的肿瘤标记物在宫颈癌临床诊断、治疗和药物开发中的应用。

有益效果：

本发明提供的lncRNA-CRNN在宫颈癌组织中呈现低水平表达，在宫颈癌细胞恶性转化及肿瘤形成过程中发挥重要作用。人为过表达宫颈癌细胞中的lncRNA-CRNN，能够明显抑制SiHa细胞的增殖、迁移、侵袭能力和恶性程度，表明lncRNA-CRNN在宫颈癌发病过程中发挥重要作用，可以作为诊疗宫颈癌的新的分子标记和药物靶点。

附图说明

图1为lncRNA芯片结果火山示意图，显示3对宫颈癌及癌旁组织中差异表达达2倍以上的lncRNA的分布；

图2为Real-time PCR检测lncRNA-CRNN在13对宫颈癌及癌旁组织中的表达示意图；

图3为过表达lncRNA-CRNN的SiHa细胞系中lncRNA-CRNN的表达示意图，（A）荧光显微镜观察慢病毒pCDH或lncCRNN感染SiHa细胞48 h后的GFP表达（100×）；Phase：白光视野；GFP：荧光视野；（B）Real-time PCR检测慢病毒pCDH或lncCRNN感染SiHa细胞72 h后lncRNA-CRNN的表达情况；

图4为过表达lncRNA-CRNN的SiHa细胞系的CCK-8增殖实验结果示意图；

图5为过表达lncRNA-CRNN的SiHa细胞系的软琼脂克隆形成实验结果示意图，（A）荧光显微镜观察慢病毒pCDH或lncCRNN感染SiHa细胞14 d后的克隆形成情况（100×）；Phase：白光视野；GFP：荧光视野；（B）图5A的结果统计；

图6为过表达lncRNA-CRNN的SiHa细胞系的细胞迁移实验结果示意图，（A）Transwell迁移实验中于接种6 h和12 h后迁移至小室底部的细胞图片；（B）图6A的结果统计；

图7为过表达lncRNA-CRNN的SiHa细胞系的细胞侵袭实验结果示意图，（A）Transwell侵袭实验中于接种12 h和24 h后穿膜至小室底部的细胞图片；（B）图7A的结果统计。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域的常规方法，或按照制造厂商所建议的条件与实验步骤。

实施例1：lncRNA-CRNN在宫颈癌组织中的表达

1. 材料

1.1 组织

本发明的临床组织标本均来自2013年11月至2015年6月于南京医科大学附属南京妇幼保健院妇产科治疗的Ib1期宫颈癌患者，每对标本包含手术切除的宫颈癌组织和配对的癌旁组织。所有标本的使用均由患者或其委托人签署知情同意书，得到了南京医科大学医学伦理委员会批准。

1.2 试剂

TRIzol^® Reagent购自美国Invitrogen公司。反转录试剂盒（DDR037A）购自宝生物工程（大连）有限公司。荧光实时（Real-time）定量PCR（polymerase chain reaction）所用的SYBR Premix Ex Taq^TM（Tli RNaseH Plus）试剂盒为日本Takara公司生产。Real-timePCR特异性引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。ArrayStar公司的lncRNA芯片产品（Human LncRNA Microarray V3.0Service）由上海康成生物工程有限公司代理。

2. 方法

2.1 宫颈癌组织及癌旁组织的lncRNA芯片技术

以3例不同年龄（39岁、54岁、65岁）的宫颈癌患者的手术切除样本为对象，委托上海康成生物工程有限公司进行“ArrayStar Human LncRNA Microarray V3.0Service”服务：按照RNA提取试剂TRIzol^® Reagent说明书推荐的步骤提取宫颈癌组织及癌旁组织总RNA。对样品RNA进行Cyanine-3-CTP荧光标记（Quick Amp Labeling Kit, One-Color，Agilent p/n 5190-0442)。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen p/n 74104）分离已被标记的RNA后，于65℃条件下加于lncRNA芯片（Agilent Gene Expression Hybridization Kit，Agilent p/n 5188-5242），与探针进行杂交孵育17小时。洗涤芯片后即可用于芯片扫描，转化为数字信号分析图像，将原始数据输入到6eneSpring GX软件中，进行差异基因筛选，将这种表达显著降低的lncRNA命名为lncRNA-CRNN，全长397 nt，其转录区域位于1号染色体，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.2 lncRNA-CRNN的Real-time PCR检测

2.2.1 提取总RNA

以13例宫颈癌患者的宫颈癌组织样本及癌旁组织样本（约50-100 mg）为对象，加入1 mL TRIzol^® Reagent后置于室温（15~30℃）使核蛋白复合物完全分离。5 min后加入0.2 mL氯仿，盖好管盖，手持剧烈振荡15 s，室温放置2~3 min。于2~8℃条件下以12 000 g离心15 min，将上层无色水相转移至另一个1.5 mL Eppendorf管。加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min。于2~8℃条件下以12 000 g离心10 min，弃去上清。用1 mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀，旋涡混合器混合。于2~8℃条件下以7 500 g离心5 min，弃去上清。空气干燥5~10 min后用无RNA酶的ddH₂O溶解RNA，微量加样器反复吹吸并置于55~60℃温育10 min，促进RNA溶解。于260nm测定RNA浓度，提取的RNA可置于-70℃保存。

2.2.2 引物设计

根据lncRNA-CRNN的转录本序列，通过NCBI的引物设计工具（Primer BLAST）设计引物，即上游引物：5’- CACTTCTCTGCTTGTGAAGTCTATG -3’（SEQ ID No：2）；下游引物：5’-GGTTGTGCTATGGTAATCTGATGA -3’（SEQ ID No：3）。

2.2.3反转录反应

以提取的总RNA（1 μg）为模板，加入以下反应体系，具体为：5×PrimeScript^®Buffer 4 μL，PrimeScript^® RT Enzyme Mix 1 μL，Oligo dT Primer（50 μM）1 μL，Random6 mers（100 μM）1 μL，以无RNA酶的ddH₂O将反应体积补足为20 μL。将上述混合液置于37℃15 min，85℃ 5s，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA Real-time PCR检测。

2.2.4 Real-time PCR

按日本Takara公司的SYBR^® Premix Ex Taq^TM（Tli RNaseH Plus）试剂盒推荐的引物最适浓度（10 μM），将lncRNA-CRNN的Real-time PCR特异性引物以去离子水溶解，并建立以下反应体系：SYBR Premix Ex Taq^TM（2×）25 μL，ROX Reference Dye（50×）1 μL，PCRForward Primer（10 μM）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）1 μL，cDNA 4 μL，灭菌ddH₂O18 μL。以95℃ 20 s预变性，按95℃ 10 s变性、60℃ 20 s退火、70℃ 10 s延伸过程循环40次，获得Ct值。获得的Ct值按Applied Biosystem公司ABI PRISM 7300 SequenceDetection System User Bulletin #2推荐方法进行计算。

3. 结果

3.1 lncRNA芯片结果

通过Arraystar human lncRNA expression microarray V3.0技术，获得3例不同年龄的宫颈癌患者的肿瘤组织和癌旁组织中差异表达的lncRNA（图1），同时获得相应lncRNA的邻近表达的差异基因。其中lncRNA-CRNN在宫颈癌组织中的表达明显降低。

3.2 利用lncRNA-CRNN的差异表达对宫颈癌组织进行筛查

为了验证lncRNA芯片结果，本发明对临床样本进行lncRNA-CRNN的Real-time PCR检测，证实lncRNA-CRNN在13例宫颈癌组织中的表达明显低于癌旁组织（图2），提示lncRNA-CRNN可能参与调控宫颈癌的发生过程，具有应用于宫颈癌治疗的潜能。

实施例2：构建过表达lncRNA-CRNN的SiHa细胞系

1. 材料

1.1 质粒与细胞

本发明所用的慢病毒包装系统为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体质粒、pMD2.G包膜质粒、psPAX2包装质粒。宫颈鳞癌细胞系SiHa细胞和人胚肾上皮细胞（293T）购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，均培养于含有10%灭活胎牛血清（美国Thermo公司）、庆大霉素（100 U/mL）、链霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 U/mL）的DMEM培养基中，培养条件为37℃、5% CO₂。

1.2 试剂

限制性内切酶EcoR I和BamH I、T4 DNA连接酶、感受态DH5α均购自美国FermentasMBI公司；质粒小提试剂盒（Plasmid Mini Kit I）购自美国OMEGA公司；质粒转染Lipofectamine^TM 2000购自美国Invitrogen公司；Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司；聚凝胺（polybrene，PB）、青霉素、链霉素及琼脂糖为美国Sigma公司产品。其他试剂同实施例1。

2. 方法

2.1 重组质粒pCDH-lncRNA-CRNN的构建

通过实例1中的2.2所述方法获得lncRNA-CRNN cDNA，设计lncRNA- CRNN PCR扩增用引物，即上游引物：5’- GAA TTC AGC TGC AGT TCC TGA TAC TG -3’（SEQ ID No：4，下划线部分为EcoR I识别序列）；下游引物：5’- GGA TCC TTA AGG GTC CAA TTG ATT TA -3’（SEQ ID No：5，下划线部分为BamH I识别序列）。上述引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。以lncRNA-CRNN cDNA作为模板，使用上述引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×PCRbuffer 5 μl，dNTP 4 μl，上下游引物各1 μl，ddH₂O 37 μl，DNA 1 μl，Taq DNA聚合酶（5U/μl）1 μl，总体积50 μl。反应条件如下：95℃预变性5 min，然后95℃ 1 min，62℃ 1 min，72℃ 1 min条件下扩增30个循环，最后72℃延伸7 min，最终获得如序列表中SEQ ID NO：1所示的lncRNA-CRNN基因。用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别双酶切纯化的PCR产物和pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体后，用T4 DNA连接酶进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定后送至南京金斯瑞生物科技公司进行测序鉴定，将测序结果正确的携带lncRNA-CRNN的重组质粒命名为pCDH-lncRNA-CRNN。

2.2 重组病毒的包装

取对数生长期的293T细胞，按1.5×10⁶个/板细胞数接种在直径10 cm细胞培养板内，加入10 ml不含抗生素的DMEM培养基，于37℃、5% CO₂培养箱内培养。次日当细胞汇合度达70%～80%时，利用脂质体Lipofectamine^TM 2000将携带lncRNA-CRNN的质粒pCDH-lncRNA-CRNN、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G按照4：3：1的比例共转染293T细胞，同时以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP、psPAX2、pMD2.G质粒共转染293T细胞作为空载体对照。于转染后10 h更换新鲜的含抗生素的完全培养基。转染48 h后利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（greenfluorescent protein，GFP）的表达情况。转染48 h和72 h后分别收集细胞培养上清，将两次收集的上清混合后加入PB至终浓度为8 μg/ml，然后经0.45 μm滤器过滤后分装，于-70℃保存备用。将所获得的慢病毒分别命名为pCDH（慢病毒空载体）和lncCRNN（表达lncRNA-CRNN的重组慢病毒）

2.3 lncRNA-CRNN在SiHa细胞中的表达

将SiHa细胞以0.5×10⁶/孔接种于6孔板中，用无血清DMEM培养基培养。当细胞汇合度达到70%~80%时去除培养基，用pCDH或lncCRNN感染SiHa细胞，8 h后吸弃上清加入新鲜的完全培养基。于48 h后经荧光显微镜观察GFP的表达情况；感染72 h后，以汇合度达到75%的SiHa细胞（约10⁶-10⁷）为对象，通过实例1中的2.2所述方法以Real-time PCR检测lncRNA-CRNN在SiHa细胞中的表达情况。

3. 结果

以慢病毒pCDH或lncCRNN感染SiHa细胞，48 h后可在荧光显微镜下观察到GFP的表达（图3A）。提取SiHa细胞的总RNA，通过Real-time PCR分析lncRNA-CRNN的表达情况。如图3B所示，与感染慢病毒空载体的SiHa细胞相比，在感染表达lncRNA-CRNN的重组慢病毒的SiHa细胞中，lncRNA-CRNN的表达量明显上调，说明已成功构建稳定表达lncRNA-CRNN的SiHa细胞系，从而为研究lncRNA-CRNN在宫颈癌发生过程中的作用，以及研究lncRNA-CRNN在抗宫颈癌变中的应用提供了一个理想的细胞模型。

实施例3：lncRNA-CRNN在抗宫颈癌变中的应用

1. 材料

1.1 细胞和动物

实验所用到的SiHa细胞培养方法同实施例2。

1.2 试剂

慢病毒pCDH和lncCRNN包装同实施例2。基质胶BD Matrigel ™ BasementMembrane Matrix为加拿大BD Biosciences公司产品。低熔点琼脂糖（Agarose L.M.P）为美国BIOSHARP 公司产品。细胞增殖检测试剂盒CCK-8（Cell Counting Kit）为日本DOJINDO株式会社（同仁化学研究所）产品。Transwell小室为Millipore公司产品。血红蛋白检测试剂Drabkin’s Reagent为美国Sigma公司产品。

2. 方法

2.1 CCK-8实验

以1×10⁵个/孔细胞数将SiHa细胞接种于12孔板中，37℃ 5% CO₂培养，次日当细胞长至70%汇合度时，去除原培养基，加入慢病毒pCDH或lncCRNN分别感染细胞，24 h后胰酶消化，以3 000个/孔细胞数接种于96孔板中，每组设5个复孔。分别在培养1-7 d后向每孔加入10 μl CCK-8，继续培养1 h，以空白孔调零，波长为450 nm，用全自动酶标读数仪上检测OD值。

2.2 软琼脂克隆形成实验

配制2×DMEM培养液（含有2×抗生素和20%的胎牛血清）和1.2%、0.6%两种浓度的低熔点琼脂糖溶液，维持低熔点琼脂糖溶液的温度在40℃，使其不凝固。将1.2%的琼脂糖溶液和2×DMEM培养液按照1：1比例进行混合，取2 ml混合液平铺于6孔板中，室温冷却待其凝固即制备成为底层琼脂。将慢病毒pCDH或lncCRNN分别感染SiHa细胞24 h后，消化制成细胞悬液、计数并调整细胞浓度为1 000个/ml。取100 μl细胞悬液（100个细胞）、1 ml 0.6%琼脂糖溶液和1 ml 2×DMEM，于无菌离心管中充分混匀后注入已铺有0.6%底层琼脂的6孔板中，每组设3个复孔，置37℃、5% CO₂培养箱中孵育。14 d后取出培养板，荧光显微镜下观察计数形成的细胞克隆数量和大小。

2.3 Transwell迁移实验

在24孔板中加入500 μl DMEM培养基，将Transwell小室置于孔上，放入细胞培养箱中平衡30 min。分别将感染慢病毒pCDH或lncCRNN 24 h后的SiHa细胞用纯DMEM培养基配制成5×10⁴个/ml的细胞悬液。向每个小室加入100 μl细胞悬液，即每孔细胞约为5×10³个。每组设置3个复孔，将24孔板放入细胞培养箱，于培养6 h后取出小室染色固定，显微镜下拍照计数，通过观察进入下室的细胞数量证明细胞迁移情况。

2.4 Transwell侵袭实验

将基质胶和DMEM培养基按1：8配成基质胶-DMEM混合液，置于冰上备用。将Transwell小室置于24孔板中，下室为500 μl DMEM培养基，每个小室加入60 μl基质胶-DMEM混合液，于37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养5 h。

分别将感染慢病毒pCDH或lncCRNN 24 h后的SiHa细胞用DMEM培养基配制成5×10⁵个/ml的细胞悬液，每个小室加入100 μl细胞悬液，即每孔5×10⁴个细胞，每组设置3复孔。将24孔板放入细胞培养箱，于12 h后取出小室染色固定，显微镜下拍照计数，通过观察进入下室的细胞数量证明细胞侵袭情况。

3. 结果

3.1 lncRNA-CRNN对SiHa细胞增殖能力的影响

为了验证lncRNA-CRNN是否能够影响SiHa细胞的增殖能力，本发明实验通过CCK-8实验检测了慢病毒pCDH或lncCRNN感染SiHa细胞后不同时间点的细胞增殖情况，发现过表达lncRNA-CRNN第2 d起，SiHa细胞的增殖速度明显慢于对照组细胞（图4），提示lncRNA-CRNN具有抑制SiHa细胞增殖的作用。

通过软琼脂克隆形成实验观察lncRNA-CRNN对SiHa细胞恶性程度的影响。当慢病毒pCDH或lncCRNN感染SiHa细胞培养14 d后，可观察到对照组形成的克隆数目显著多于lncRNA-CRNN组，并且单个克隆的体积也较大（图5），表明lncRNA-CRNN明显抑制了SiHa细胞的恶性生长。

3.2 lncRNA-CRNN对SiHa细胞迁移和侵袭能力的影响

Transwell小室迁移实验结果显示，接种后6 h后lncRNA-CRNN组细胞迁移到小室底部的数目明显少于对照细胞，提示lncRNA-CRNN具有抑制SiHa细胞迁移的能力（图6）。

在Transwell迁移实验的基础上，于小室中包被基质胶，用于模拟体内天然基底膜，进行Transwell细胞侵袭实验。结果显示，接种12 h后lncRNA-CRNN组穿膜进入下室的细胞数量都明显降低。提示lncRNA-CRNN具有抑制SiHa细胞侵袭的能力（图7）。

上述结果表明，lncRNA-CRNN的过表达能够明显抑制宫颈癌细胞SiHa的增殖、迁移、侵袭能力及恶性程度，说明宫颈癌中低水平表达的lncRNA-CRNN参与调控肿瘤发生的多个过程，而且具有抗宫颈癌变的潜能，为宫颈癌的诊断和治疗提供了新的分子标记和药物靶标。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110> 南京医科大学

<120> 一种长链非编码RNA lncRNA-CRNN及其应用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 397

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agctgcagtt cctgatactg gtttttctac atgcttcagc caaagacata tactctttga 60

tccctgagaa cactatttcc tcagtgtctt tgcacatgga gttcacttct ctgcttgtga 120

agtctatgaa tattgcatgg ctgatttgtc acaattttaa gtcttcaaca tctggagtgt 180

tctggcaaga atttgtagga aaaatttttg aatcatcaga ttaccatagc acaaccttgg 240

agaataaaac tcttttgctc tgaagctcat ctaataacct gatatctctc aaatgaatct 300

atccaatgac agggaatacc ccatgttaaa cagctgattc ttgttctgaa tacgtttatt 360

atcttgtagt tagtaaataa atcaattgga cccttaa 397

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cacttctctg cttgtgaagt ctatg 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttgtgcta tggtaatctg atga 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaattcagct gcagttcctg atactg 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggatccttaa gggtccaatt gattta 26

Claims (6)

1.一种长链非编码RNA lncRNA-CRNN，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组质粒pCDH-lncRNA-CRNN。

3.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组病毒lncCRNN。

4.含有权利要求1所述核苷酸序列的重组病毒载体。

5.权利要求1所述长链非编码RNA lncRNA-CRNN在制备诊断宫颈癌的产品中的应用。

6.权利要求1所述长链非编码RNA lncRNA-CRNN在制备治疗宫颈癌的产品中的应用。