DE69912443T2 - Oligomerreinigung durch selektion mittels zweier enden - Google Patents

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Biopolymere und bezieht sich insbesondere auf die Reinigung von Oligomeren, zum Beispiel Oligonucleotiden, Oligopeptiden, Oligosacchariden und dergleichen.
  • STAND DER TECHNIK
  • Es besteht ein wachsender Bedarf für Oligonucleotide zur Verwendung in Nucleinsäure-Hybridisierungs-Assays, als Polymerasekettenreaktions ("PCR")-Primer oder als Sequenzierungsprimer bei Sanger oder Didesoxysequenzierung. Die Synthese und Reinigung von Mengen an Oligonucleotiden für Forschungszurecke liefert routinemäßig ein Produkt mit einer Reinheit von höher als 95%, allerdings erfordert diese hohe Reinheit ein langes, zeitaufwendiges und arbeitsintensives Reinigungsprotokoll. Typischerweise verlangt ein Präparat im 0,2-Mikromohnaßstab ein siebenstufiges Reinigungsverfahren: 1) Herstellung eines Reinigungsgels; 2) Beladen des Gels mit dem zu reinigenden Reaktionsgemisch; 3) Laufen lassen des Gels über Nacht; 4) Sichtbarmachen und Schneiden der geeigneten Banden aus dem Gel; 5) Einweichen der Banden für zurei Tage in Elutionspuffer, um das gewünschte Produkt aus der Gelmatrix zu extrahieren; 6) manuelles Entsalzen des extrahierten Produkts an einer reverse phase ("RP")-Säule und Verdampfen des Lösungsmittels, und 7) manuelles Präzipitieren des Produkts aus dem Lösungsmittel. Die erhaltene Menge des Produkts wird unter Verwendung der UV-Spektroskopie quantitativ bestimmt.
  • Jede Vereinfachung dieser langen, zeitaufwendigen und arbeitsintensiven Reinigungsprotokolle wäre sehr wertvoll. Darüber hinaus wäre auch ein Reinigungsschema wünschenswert, das automatisiert werden könnte und auf andere Oligomere als Oligonucleotide angewendet werden könnte.
  • Frühere Ansätze zur Vereinfachung der Reinigung von DNA-Oligomeren:
  • Während des Verfahrens der Oligonucleotidsynthese können depurinisierte Stellen an statistischen Stellen eingeführt werden, was durch längere Einwirkung von Säure verursacht wird; der abschließende Schutzentfernungsschritt mit Ammoniumhydroxid spaltet die Oligonucleo tidkette an den depurinisierten Stellen. McHugh et al., (1995) Nucleinc Acids Research, 23: 1664–1670. Verfahren, die entwickelt wurden, um eine DNA-Reinigung zu vereinfachen, zum Beispiel Efcavitch et al., (1985), Nucleosides & Nucleotides, 4: 267 und McBride et al., (1988), BioTechniques, 6: 362–367, waren nur fähig, kürzere DNA-Oligomere zu reinigen, da sie der komplizierten Natur der Ammoniumhydroxidspaltungsprodukte nicht vollständig Rechnung trugen.
  • Es wurde ein enzymatisches Reinigungsschema beschrieben, in dem ein Oligomer zunächst an einem festen Träger synthetisiert wird. Urdea et al., (1986), Tetrahedron Lett., 27: 2933–2936. Nach der Herstellung des an einen festen Träger gebundenen Oligonucleotids gewünschter Länge wurden exocyclische Amine und Phosphatgruppen im Oligomer von Schutzgruppen befreit, ohne dass die Bindung an den Träger gespalten wurde. Die Reinigung verwendete Milzphosphodiesterase, um Fehlsequenzen zu verdauen, die keine terminale 5'-Benzoylgruppe des Volllängen-Oligomerprodukts enthielten. Das Verfahren resultierte in Oligomeren mit verbesserter Reinheit, allerdings blieben abasische Stellen im Produkt-Oligomer zurück.
  • Es wurde auch ein schnelles Kartuschenreinigungsverfahren beschrieben, siehe Horn et al., (1988) in Nucleic Acids Res. 16: 11559–11571. Der Schlüsselschritt in diesem Verfahren ist die Spaltung aller apurinischen Stellen im Oligomer mit einer wässrigen Lysinlösung vor Entfernung des Rohprodukts vom festen Träger. Als Resultat werden im Wesentlichen alle verkürzten 5'-O-Dimethoxytrityl ("DMT") enthaltenden Oligomere aus dem Gemisch gespaltener Oligomere eliminiert. Die Autoren berichten, dass DNA-Oligomere mit einer Länge von bis zu 118 Basen unter Verwendung dieses Verfahrens nahezu bis zur Homogenität gereinigt wurden.
  • Ein Verfahren, das mit dem von Horn et al. (1988) beschriebenen verwandt ist, verwendet einen festen Träger mit einer Disilyloxybindung. Die Spaltung von abasischen Stellen im Oligomer unter milden Bedingungen, während das Oligomer noch immer an dem Träger gebunden ist, gewährleistet, dass alle 5'-O-DMT enthaltenden Moleküle, wenn sie vom Träger abgespalten wurden, korrekte 3'- und 5'-Enden hatten. Kwiatkowski et al., (1996), Nucleic Acids Res., 24: 4632–4638.
  • Natt et al., (1997), Tetrahedron, 53: 9629–9636, beschreibt ein Verfahren zur Oligomerreinigung, das ein lipophiles Capping-Reagens verwendet, um Fehlsequenzen während der Synthe se zu verkappen. Die lipophile Natur der Fehlsequenzen macht es möglich, verkappte Fehlsequenzen chromatographisch von detritylierten Volllängen-Oligomeren zu trennen. Allerdings war das Verfahren bezüglich depurinisierter/gespaltener Sequenzen ineffizient, da diese zurei Species-Familien, d. h. das detritylierte 5'-Segment und das detritylierte 3'-Segment die lipophile Capping-Gruppe nicht enthalten. Die Verwendung von Tritylgruppen mit verstärkten lipophilen Eigenschaften als 5'-O-Schutzgruppen wurde befürwortet, um eine Reinigung durch RP-Hochdruckflüssigkeitschromatographie ("HPLC") zu erleichtern. Ramage, (1993), Tetrahedron Lett., 34: 7133–7136. Wie bei den oben diskutierten Ansätzen ist das Verfahren bezüglich gespaltener abasischer Stellen limitiert.
  • Es wurden Reinigungsverfahren vorgeschlagen, die einen "Einfang"-Schritt beinhalten. In jedem Fall trägt das 5'-Ende des zu reinigenden Oligomers eine Gruppierung, durch die ein Einfangen bewirkt werden kann. Beispielsweise beschreibt Bannwarth et al., (1990), in Helv. Chim. Acta, 73: 1139–114, ein kombiniertes Reinigungs-/Phosphorylierungsverfahren für Oligodesoxynucleotide, das einen Einfang-Schritt beinhaltet. Ein spezielles Ribonucleotid, N'-(MMT-S-(CH2)10)-2',3'-Bz2-rU-5'-β-cyanoethyl, (worin "MMT" Monomethoxytrityl darstellt und "Bz" Benzyl darstellt), umfassend ein geschütztes Thiol- und ein Diolsystem, wurde während des abschließenden DNA-Synthe-sezyklus in das Oligonucleotid eingebaut. Nach vollständiger Schutzgruppenentfernung und Entfernung der MMTr-Schutzgruppe konnte das Oligomer mit einer 5'-SH-Gruppe an einem kontrollierten Porenglas ("CPG")-Träger mit oberflächengebundenen -S-S-Pyridingruppen eingefangen werden; kontaminierende Oligomere wurden durch Waschen entfernt. Das gereinigte Oligomer wurde nach oxidativer Spaltung des Ribo-Diol-Systems und beta-Eliminierung unter basischen Bedingungen vom Einfangträger freigesetzt.
  • Beschrieben wurde auch ein Reinigungsverfahren unter Verwendung eines photolabilen 5'-Biotinreagens, um Oligomere an einem Avidin-Einfangträger einzufangen. Olejnik et al., (1996), Nucleic Acids Research, 24: 361–366. Die Verknüpfungsgruppen konnten durch Photolyse unter Freisetzung des Produktoligomers in der 5'-Phosphatform abgespalten werden.
  • Es wurde eine Synthese und Reinigung von 5'-Mercapto-alkylierten Oligonucleotiden beschrieben, wobei thiolierte Oligomere durch ein einstufiges kovalentes Chromatographieverfahren unter Verwendung eines aktivierten Sulfhydrylträgers gereinigt wurden. Kumar et al., (1996), Bioorg. Med. Chem. Lett., 6: 683–688.
  • Außerdem wurde vor Jahren eine Reinigung von Proteinen unter Ausnutzung der Selektivität von einzigartigen festen Nickel-Nitrilotriessigsäure ("Ni-NTA")-Trägern mit einer Affinitätsmarkierung, bestehend aus sechs aufeinanderfolgenden Histidinresten, bekannt. Dieser Typ der immobilisierten Metallaffinitätschromatographie ("IMAC") wurde zur sequenzspezifischen Isolierung von Nukleinsäuren durch Peptidnukleinsäure ("PNA")-kontrollierte Hybridselektion unter Verwendung von Oligohistidin-PNA-Chimären (die Chemie von PNA und Peptidanordnung sind im Wesentlichen identisch) verwendet. Orum et al., (1995), BioTechniques, 19: 472–480. Das System wurde auf synthetische DNA-Oligomere, die sechs aufeinanderfolgende 6-Histaminylpurin ("His")-Nucleotide enthalten, ausgedehnt, unter Verwendung eines konvertierbaren Nucleotidphosphoramidits eingeführt und unter Bildung der His-Nucleotide derivatisiert. Min et al., (1996), Nucleic Acids Research, 24: 3806–3810. Der His6-markierte Strang wurde durch eine Ni-NTA-Agarosechromatographiematrix selektiv zurückgehalten und die eingefangene DNA wurde danach aus dem Harz eluiert.
  • Überblick über den Stand der Technik:
  • Hintergrundliteratur, die sich allgemein auf Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden bezieht, umfasst solche, die sich auf 5'-zu-3'-Synthesen, basierend auf der Verwendung von β-Cyanoethylphosphat-Schutzgruppen bezieht, z. B. de Napoli et al., (1984), Gazz. Chim. Ital., 114: 65, Rosenthal et al., (1983), Tetrahedron Lett., 24: 1691, Belagaje et al., (1977), Nucl. Acids Res., 10: 6295, und solche, die 5'-zu-3'-Synthesen in Lösungsphase beschreibt, wie zum Beispiel Hayatsu et al., (1957), J. Am. Chem. Soc., 89: 3880, Gait et al., (1977), Nucl. Acids Res., 4: 1135, Cramer et al., (1968), Angew. Chem. Int. Ausg. Engl., 7.473 und Blackburn et al., (1967), J. Chem. Soc., Teil C, 2438.
  • Zusätzlich zum oben genannten Stand der Technik beschreiben Matteucci et al., (1981), J. Am. Chem. Soc., 103: 3185–3191, die Verwendung von Phosphochloriditen bei der Herstellung von Oligonucleotiden. Beaucage et al., (1981), Tetrahedron Lett., 22: 1859–1862 und US-Patent Nr. 4 415 732 beschreiben die Verwendung von Phosphoramiditen bei der Herstellung von Oligonucleotiden. Smith (1983) ABL 15–24, die darin angegebenen Literaturstellen und Warner et al., (1984), DNA, 3: 401–411 beschreiben eine automatisierte Festphasen-Oligodesoxyribonucleotidsynthese.
  • Die US-Patente Nr. 4 483 964 und 4 517 338 von Urdea et al. beschreiben ein Verfahren zur Synthese von Polynucleotiden durch selektives Einführen von Reagenzien an ein Festphasensubstrat in einer röhrenförmigen Reaktionszone. Das US-Patent Nr. 4 910 300 von Horn et al. beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden durch Anfügen von Nucleotidmonomeren an eine wachsende Kette, beinhaltet aber den Einbau von markierten, N4-modifizierten Cytosinresten in vorher festgelegten, voneinander beabstandeten Positionen. Das US-Patent Nr. 5 256 549 von Horn et al. beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden, das eine Kombinationstechnik beinhaltet, d. h. bei dem das gewünschte Oligonucleotid im Wesentlichen gleichzeitig synthetisiert und "gereinigt" wird, so dass das Endprodukt in im Wesentlichen reiner Form produziert wird.
  • Horn et al., (1986), DNA 5(5): 421–425 beschreibt die Phosphorylierung von an einen Feststoff gebundenen DNA-Fragmenten unter Verwendung von Bis(cyanoethoxy}-N,N-diisopropylaminophosphin. Siehe auch Horn et al., (1986), Tetrahedron Lett., 27: 4705–4708.
  • Horne et al., (1990), J. Am. Chem. Soc., 112: 2435–2437 und Froehler et al., (1992), Biochemistry, 31: 1603–1609 beziehen sich auf eine Oligonucleotid-spezifische Tripelhelix-Bildung.
  • Die US-Patente Nr. 5 594 117 und 5 430 136 von Urdea et al. offenbaren Verfahren und Reagenzien, z. B. modifizierte monomere Reagenzien, zur Synthese von Oligonucleotiden, die abasische, selektiv spaltbare Stellen enthalten. Hergestellte Oligonucleotide, die solche Stellen haben, sind durch Photolyse oder durch chemische oder enzymatische Reagenzien, z. B. Reduktionsmittel, selektiv spaltbar.
  • Verfahren zur Herstellung von Oligosacchariden sind gut bekannt. Beispielsweise beschreiben Kanie et al., (1992), Curr. Opin. Struct. Biol., 2: 674–681 und Ding et al., (1995), Adv. Exp. Med. Biol., 376: 261–269 die chemische Synthese von Oligosacchariden. Um Saccharidoligomere definierter Struktur zu synthetisieren, werden orthogonale Schutzgruppen an den Hydroxylgruppierungen der Monosaccharide bereitgestellt, die sequenziell an die wachsende Oligosaccharidkette angefügt werden. Acetyl- und Benzylschutzgruppen werden üblicherweise verwendet. Eine Saccharidgruppierung kann ein Akzeptor werden und somit fähig sein, sich mit einem anderen Saccharid zu kombinieren, indem ein Hydroxylwasserstoff, zum Beispiel durch p-s-φ-CH3(p-Methylphenylthio), -(CH2)nCOOCH3 oder -(CH2)n-O-φ-OCH3 er setzt wird. Das US-Patent Nr. 4 701 494 von Graafland ist als Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen Vinylsaccharidpolymeren interessant.
  • Demnach ist klar, dass viele Verfahren zur Herstellung von Oligomeren von Nucleotiden, Aminosäuren, Sacchariden und anderen Monomeren entwickelt wurden. Diese Verfahren beruhen zum größten Teil auf der Befestigung eines ersten Monomers, jede nachfolgende Monomereinheit wird dann sequenziell angefügt, wobei jede Addition eine Reihe chemischer Reaktionen beinhaltet.
  • In jeder Stufe während der Synthese des Oligomers gibt es eine kleine, aber begrenzte Wahrscheinlichkeit, dass eine Reihe von Ketten nicht verlängert werden konnte. Daher können während des gesamten Oligomerisierungsverfahrens eine Reihe von Fehlern eingeführt werden. Diese fehlerhaften Sequenzen (oder "Fehlsequenzen") können sich auf verschiedenen Wegen zeigen. Ohne einen adäquaten Reinigungsprozess zur Entfernung von Fehlsequenzen kann der Fehler zu unerwünschten Produkten, einer suboptimalen Leistungsfähigkeit und dergleichen führten.
  • Die Fähigkeit, Oligomere mit der Sicherheit herzustellen, dass es im Wesentlichen keine Kontamination mit Oligomeren gibt, die Sequenzen haben, die der gewünschten Sequenz nahe kommen, sich aber von ihr unterscheiden, gewann daher wachsende Bedeutung. Durch Entfernung von Fehlsequenzen zu Beginn kann man die Notwendigkeit für nachfolgende Reinigungsschritte, wie zum Beispiel Elektrophorese, die zu einem Verlust an Materialien führen können, vermeiden; der Materialverlust kann natürlich ein ernstes Problem sein, wenn mit sehr geringen Mengen an Materialien gearbeitet wird.
  • OFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Dem entsprechend besteht eine erste Aufgabe der Erfindung unter Hinwendung auf den vorstehend beschriebenen Bedarf auf dem Fachgebiet in der Bereitstellung eines vereinfachten, effizienten und vielseitigen Verfahrens zur Reinigung von Oligomeren.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines derartigen Verfahrens, wobei das Oligomer ein Oligonucleotid, ein Oligopeptid, ein Oligosaccharid oder dergleichen ist.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens, bei dem ein Träger-gebundenes Oligomer gereinigt wird, indem abwechselnde Spaltungs- und Einfang-Schritte angewendet werden.
  • Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung eines synthetischen Oligonucleotids, bei dem sowohl ein 5'-Selektionsschritt als auch ein 3'-Selektionsschritt durchgeführt werden.
  • Nach einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Oligomersegments von Interesse bereitgestellt, umfassend: (a) Bereitstellen eines Träger-gebundenen Oligomers, das eine erste selektierbar spaltbare Bindung, eine zureite selektierbar spaltbare Bindung und eine dritte selektierbar spaltbare Bindung hat, wobei das Oligomersegment von Interesse von der zureiten und dritten selektierbar spaltbaren Bindung flankiert wird und wobei außerdem eine erste Einfang-Gruppierung am freien Ende des Oligomers vorliegt und eine zureite Einfang-Gruppierung zurischen der ersten und dritten selektierbar spaltbaren Bindung vorliegt; (b) Spalten der ersten selektierbar spaltbaren Bindung und Freisetzung des Oligomers vom Träger; (c) Inkubieren des freigesetzten Oligomers mit einem ersten Einfang-Medium, das das freigesetzte Oligomer durch Bindung an die erste Einfang-Gruppierung selektiv zurückhält, wodurch ein erster Einfang-Medium-Oligomerkomplex gebildet wird; (d) Spalten der zureiten selektierbar spaltbaren Bindung; (e) Inkubieren des oligomeren Produkts von Stufe (d) mit einem zweiten Einfang-Medium, das selektiv an die zweite Einfang-Gruppierung bindet, unter Bildung eines zweiten Einfang-Medium-Oligomerkomplexes; und (f) Spalten der dritten selektierbar spaltbaren Bindung unter Bereitstellung des Oligomersegments von Interesse in gereinigter Form.
  • Zunächst beinhaltet das Verfahren eine sequenzielle Kupplung von Monomeren an das Ende (bzw. den Terminus) einer wachsenden Träger-gebundenen Oligomerkette, bis das gewünschte Träger-gebundene Oligomer erhalten ist. Die selektierbar spaltbaren Bindungen und die Einfang-Gruppierungen werden während der Synthese unter Verwendung von Techniken, die hierin beschrieben sind, und/oder solchen, die dem Fachmann auf dem Fachgebiet bekannt sind, eingeführt.
  • Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf das Träger-gebundene Oligomerprodukt, das, wie gerade beschrieben, synthetisiert wird und als Ausgangsmaterial zur Bereitstellung des gereinigten Oligomersegments von Interesse einsetzbar ist. Somit stellt die Erfindung auch ein Träger-gebundenes Oligomer mit der Strukturformel (I) bereit: (I) S-[X1]n1-SC1-CP2-[X2]n2-SC3-T1-X-T2-SC2-CP1 worin T1 und T2 einen ersten bzw. zweiten Oligomer-Terminus darstellen; S einen festen Träger darstellt; X ein Oligomersegment von Interesse darstellt; X1 und X2 Monomere oder oligomere Segmente sind; n1 und n2 unabhängig voneinander Null oder 1 sind; SC1 eine erste selektierbar spaltbare Bindung darstellt; SC2 eine zweite selektierbar spaltbare Bindung darstellt; SC3 eine dritte selektierbar spaltbare Bindung darstellt; CPl eine erste Einfang-Gruppierung darstellt; und CP2 eine zweite Einfang-Gruppierung darstellt.
  • Das Träger-gebundene oligomere Produkt der Formel (I) kann in dem oben beschriebenen Verfahren zur Bereitstellung des oligomeren Segments X von Interesse, das in T1 und T2 endet, in gereinigter Form verwendet werden.
  • Weitere Aufgaben, Vorteile und neue Merkmale der Erfindung werden im folgenden Teil der Beschreibung ausgeführt und ein Teil wird dem Fachmann bei Untersuchung des folgenden klar werden oder kann bei der Durchführung der Erfindung gelernt werden.
  • Zu Zwecken der Klarheit und ohne die Erfindung auf eine besondere Ausführungsform zu beschränken, betrifft die folgende Diskussion die Reinigung eines Oligomers, das ein Oligonucleotid ist. Wenn das Oligomer ein Oligonucleotid ist, stellen T2 und T1 den 5'- bzw. den 3'-Terminus dar, stellt SC2 eine 5'-spaltbare Bindung dar, und stellt SC3 eine 3'-spaltbare Bindung dar. Der Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, dass die hier offenbarten und beanspruchten Verfahren mit geringerer Modifikation auf die Reinigung anderer Oligomere, z. B. Oligopeptide, Oligosaccharide und dergleichen, angewendet werden kann.
  • Es wird ein Oligonucleotid bereitgestellt, das die Struktur der Formel (I) hat, worin X ein Oligonucleotidsegment von Interesse ist und X1 und X2 einzelne Nucleotide oder Oligonucleotidsegmente sind. Eine Reinigung des Oligonucleotidsegments von Interesse wird durch Spaltung an SC1, Inkubation des freigesetzten Produkts CP2-[X2]n2-SC3-T1-X-T2-SC2-CP1 mit einem ersten Einfang-Medium CM1, das aus einem reverse phase-Chromatographie- oder hydrophobem Wechselwirkungschromtogra-phiemedium besteht, Spaltung an SC2, Inkubation des resultierenden Produkts CP2-[X2]n2-SC3-T1-X-T2 mit einem zweiten Einfang-Medium CM2, das aus einem reverse phase-Chromatographie- oder hydrophobem Wechselwirkungschromatographiemedium besteht, und Spaltung an SC3 unter Erhalt des gereinigten Oligonucleotidsegments von Interesse T1-X-T2 durchgeführt.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A und 1B stellen eine Reinigung eines Oligomersegments von Interesse unter Verwendung des eifindungsgemäßen Verfahrens dar.
  • MODI ZUR DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
  • Definitionen und Nomenklatur:
  • Bevor die vorliegende Erfindung offenbart und im Detail beschrieben wird, ist zu betonen, dass die vorliegende Erfindung nicht auf spezifische Reaktionsbedingungen, Materialien oder Reagenzien beschränkt wird, da diese natürlich variieren können. Es ist auch selbstverständlich, dass die hierin verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung besonderer Ausführungsformen und nicht zur Beschränkung verwendet wird.
  • Ferner umfassen die Singularformen "ein", "eine" auch die Pluralformen, wenn der Kontext nichts anderes eindeutig vorgibt.
  • In dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen wird auf eine Reihe von Ausdrücken Bezug genommen, die mit den folgenden Bedeutungen definiert werden sollen: Der Ausdruck "Monomer", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine chemische Einheit, die kovalent an eine oder mehrere andere solcher Einheiten unter Bildung eines Oligomers kovalent gebunden werden kann. Beispiele für "Monomere" umfassen Aminosäuren, Nucleotide, Saccharide, Peptoide und dergleichen. Im Allgemeinen haben die Monomere, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, erste und zweite Stellen (z. B. 5'- und 3'-Termini bzw. Enden, C-Termini und N-Termini, usw.), die zur Bindung an andere ähnliche Monomere mittels chemischer Standardreaktionen (z. B. nucleophile Verdrän gung einer Austrittsgruppe, Kondensation oder dergleichen) geeignet sind, und ein unterschiedliches Element, das ein besonderes Monomer von einem anderen Monomer desselben Typs (z. B. eine Nucleotidbase, eine Aminosäureseitenkette, usw.) unterscheidet. Ein anfängliches Träger-gebundenes "Monomer" wird im Allgemeinen als Baublock in einem mehrstufigen Syntheseverfahren verwendet, um ein vollständiges Oligomer zu bilden, wie zum Beispiel in der Synthese von Oligonucleotiden, Oligopeptiden, Oligosacchariden und dergleichen.
  • Der Ausdruck "Oligomer" wird hier verwendet, um eine chemische Einheit zu bezeichnen, die eine Vielzahl von Monomeren enthält. Die Ausdrücke "Oligomer" und "Polymer", wie sie hier verwendet werden, werden austauschbar verwendet, wie es allgemein üblich ist, obgleich nicht notwendig, und bezeichnen kleinere "Polymere", die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden. Beispiele für Oligomere und Polymere umfassen Polydesoxyribonucleotide, Polyribonucleotide, andere Polynucleotide, die N- oder C-Glycodide einer Purin- oder Pyrimidinbase sind, Polypeptide, Polysaccharide und andere chemische Einheiten, die Repetiereinheiten ähnlicher Struktur enthalten. In der Praxis der vorliegenden Erfindung umfassen Oligomere im Allgemeinen etwa 2–50 Monomere, vorzugsweise etwa 2– 20 Monomere, und am bevorzugtesten etwa 3–10 Monomere.
  • Die Ausdrücke "Polynucleotid" und "Oligonucleotid", wie sie hier verwendet werden, sollen allgemein die Gruppen der Polydesoxyribonucleotide (enthaltend 2'-Desoxy-D-ribose), Polyribonucleotide (enthaltend D-Ribose), jeden anderen Polynucleotidtyp, der ein N- oder C-Glycosid einer Purin- oder Pyrimidinbase ist, und andere Polymerer, die nicht-nucleotidische Bindungen enthalten, zum Beispiel Polyamid (z. B. Peptidnucleinsäuren ("PNAs"), Polymorpholino (im Handel erhältlich von AVI Biopharm. Corvallis, Oregon, als NeugeneTM-Polymere) und andere synthetische Sequenz-spezifische Nucleinsäurepolymere, bezeichnen, vorausgesetzt, dass die Polymere Nucleobasen in einer Konfiguration enthalten, die eine Basenpaarung und Basenstapelung, wie sie in DNA und RNA gefunden wird, ermöglicht. Es gibt keine beabsichtigte Unterscheidung in der Länge zwischen dem Ausdruck "Polynucleotid" und "Oligonucleotid", und diese Ausdrücke werden untereinander austauschbar verwendet. Diese Ausdrücke beziehen sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit umfassen diese Ausdrücke doppel- und einzelsträngige DNA, wie auch doppel- und einzelsträngige RNA, DNA : RNA-Hybride und Hybride zwischen PNAs und DNA oder RNA, und umfassen auch bekannte Modifikationstypen, zum Beispiel Markierungen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, Methylierung, "Caps", Substitution eines oder mehrerer der natürlich auftretenden Nuc leotide durch ein Analogon, Internucleotidmodifikationen, zum Beispiel die mit ungeladenen Bindungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoramidate, Carbamate, usw.), die mit positiv geladenen Verknüpfungen (z. B. kationisch substituierte Phosphoramidatbindungen, wie sie von Letsinger et al., (1988), J. Am. Chem. Soc., 110: 4470–4471, offenbart sind, oder kationisch-substituierte Phosphonatderivate, wie sie von Fathi et al., (1994), Nucleic Acid Res., 22: 5416–5424 und Fathi et al., (1994), Bioconjugate Chem, 5: 47–52) offenbart sind, und die mit negativ geladenen Bindungen (z. B. Phosphorothioate, Phosphorodithioate, usw.), die, die 2'-O-Internucleotidbindungen von 3'-Oxy- oder 3'-Desoxyribosegruppierungen enthalten, die, die anhängende Gruppierungen enthalten, zum Beispiel Proteine (einschließlich Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin, usw.), die, die mit Intercalatoren (z. B. Acridin, Psoralen, usw.), die, die Chelatbildner enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxidative Metalle, usw.), die, die Alkylierungsmittel enthalten, die mit modifizierten Bindungen (alpha-anomere Nucleinsäuren, usw.), wie auch unmodifizierte Formen des Polynucleotids oder Oligonucleotids.
  • Es wird einzusehen sein, dass die Ausdrücke "Nucleosid" und "Nucleotid", wie sie hier verwendet werden, solche Gruppierungen umfassen, die nicht nur die bekannten Purin- und Pyrimidinbasen, sondern auch modifizierte Purin- und Pyrimidinbasen und andere heterocyclische Basen, die modifiziert wurden, enthalten. Solche Modifikationen umfassen methylierte Purine oder Pyrimidine, acylierte Purine oder Pyrimidine, oder andere Heterocyclen. Außerdem umfassen die Ausdrücke "Nucleosid" und "Nucleotid" solche Gruppierungen, die nicht nur herkömmliche Ribose- und Desoxyribosezucker, sondern auch andere Zucker enthalten. Modifizierte Nucleoside oder Nucleotide werden auch Modifikationen an der Zuckergruppierung enthalten, wobei eine oder mehrere der Hydroxylgruppen durch Halogen, aliphatische Gruppen ersetzt sind, einschließlich 2'-O-Alkyl, z. B. 2'-O-Methyl, oder als Ether, Amine oder dergleichen funktionalisiert sind. Gängige Nucleotidanaloga umfassen, sind aber nicht beschränkt, auf 1-Methyladenin, 2-Methylade-nin, N6-Methyladenin, N6-Isopentyladenin, 2-Methylthio-N6-iso-pentyladenin, N,N-Dimethyladenin, 8-Bromadenin, 2-Thiocyto-sin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, 5-Ethylcytosin, 4-Ace-tylcytosin, 1-Methylguanin, 2-Methylguanin, 7-Methylguanin, 2,2-Dimethylguanin, 8-Bromguanin, 8-Chlorguanin, 8-Aminoguanin, 8-Methylguanin, 8-Thioguanin, 5-Fluoruracil, 5-Bromura-cil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, 5-Ethyluracil, 5-Propyluracil, 5-Methoxyuracil, 5-Hydroxymethyluracil, 5-(Carboxyhydroxymethyl)-Uracil, 5-(Methylaminomethyl)-uracil, 5-(Carboxy-methylaminomethyl)-uracil, 2-Thiouracil, 5-Methyl-2-thiouracil, 5-(2-Bromvinyl)-uracil, Uracil-5-oxyessigsäure, Uracil-5- oxyessigsäuremethylester, Pseudouracil, 1-Methylpseudoura-cil, Queosin, Inosin, 1-Methylinosin, Hypoxanthin, Xanthin, 2-Aminopurin, 6-Hydroxyaminopurin, 6-Thiopurin und 2,6-Diaminopurin. Andere geeignete Analoga werden dem Fachmann bekannt sein und sind in den einschlägigen Texten und in der einschlägigen Literatur beschrieben.
  • Darüber hinaus umfassen Modifikationen an nucleotidischen Einheiten Umlagerungen, Anhänge, Ersatz funktioneller Gruppen oder in anderer Weise Verändern von funktionellen Gruppen an der Purin- oder Pyrimidinbase, die Wasserstoffbrücken zu dem entsprechenden komplementären Pyrimidin oder Purin bildet. Die resultierende modifizierte Nucleotideinheit kann ein Basenpaar mit anderen solchen modifizierten nucleotidischen Einheiten, aber nicht mit A, T, C, G oder U, bilden. A-T- und G-C-Standard-Basenpaare bilden unter Bedingungen, die die Bildung von Wasserstoffbindungen zwischen dem N3-H und C4-Oxy von Thymidin bzw. dem N1 und C6-NH2 von Adenosin und zwischen dem C2-Oxy, N3 und C4-NH2 von Cytidin und dem C2-NH2, N1-H und C6-Oxy von Guanosin ermöglichen. So kann zum Beispiel Guanosin (2-Amino-6-oxy-9-β-D-ribofuranosylpurin) unter Bildung von Isoguanosin (2-Oxy-6-amino-9-β-D-ribofuranosylpurin) modifiziert sein. Solch eine Modifikation führt zu einer Nucleosidbase, die nicht länger wirksam ein Standard-Basenpaar mit Cytosin bilden wird. Dagegen führt die Modifikation von Cytosin (1-β-D-Ribofuranosyl-2-oxy-4-aminopyrimidin) unter Bildung von Isocytosin (1-β-D-Ribofuranosyl-2-amino-4-oxypy-rimidin) zu einem modifizierten Nucleotid, das mit dem Guanosin nicht wirksam ein Basenpaar bilden wird, aber mit Isoguanosin ein Basenpaar bilden wird. Isocytosin ist von Sigma Chemical Co., (St. Louis, MO) erhältlich; Isocytidin kann durch das Verfahren hergestellt werden, das von Switzer et al., (1993), Biochemistry, 32: 10489–10496, und den darin zitierten Referenzen beschrieben ist; 2'-Desoxy-5-methylisocytidin kann durch das Verfahren von Tor et al., (1993), J. Am. Chem. Soc. 115: 4461–4467 und darin zitierten Referenzen hergestellt werden; und Isoguaninnucleotide können unter Verwendung des Verfahrens, das von Switzer et al., (1993), supra, und Mantsch et al., (1993), Biochem., 14: 5593–5601, beschrieben wurde, hergestellt werden. Die nicht-natürlichen Basenpaare, die als κ und η bezeichnet werden, können durch das Verfahren, das von Piccirilli et al., (1990), Nature, 343: 33–37, für die Synthese von 2,6-Diaminopyrimidin und sein Komplement (1-Methylpyrazolo-[4,3]-pyrimidin-5,7-(4H,6H)-dion beschrieben wurde, synthetisiert werden. Andere derartige modifizierten Nucleotideinheiten, die einzigartige Basenpaare bilden, wurden bei Leach et al., (1992), J. Am. Chem. Soc., 114: 3675–3683 und Switzer et al., (1993), supra, beschrieben oder werden dem Fachmann auf diesem Gebiet einfallen.
  • Die Bezeichnung "3'", wie sie in der Strukturdarstellung einer Internucleosidbindung hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Bindung an den 3'-Kohlenstoff der Ribosegruppierung des Nucleosids, das sich 5' zu der Bindung befindet. Entsprechend bezieht sich die Bezeichnung "5'", wie sie in der Strukturdarstellung einer Internucleosidbindung verwendet wird, auf eine Bindung an den 5'-Kohlenstoff der Ribosegruppierung des Nucleosids, das sich 3' zu der Bindung befindet. Wie oben angegeben wurde, ist die Erfindung allerdings nicht auf Oligonucleotide beschränkt, die nur Ribosegruppierungen enthalten. Dem Fachmann auf diesem Gebiet wird klar sein, dass die Oligonucleotide in diesem Zusammenhang nicht auf traditionelle 3'- und 5'-Internucleosidbindungen beschränkt werden müssen. Beispielsweise wurde ein 2'-Strukturisomer von DNA, das 3'-Desoxynucleoside durch 2',5'-Phosphodiesterbindungen verbunden enthält, beschrieben (Prakash et al., (1996), Chem. Commun., 1996: 1793–1794) und derartige Isomere sind in der Definition "Oligonucleotid" hier mitumfasst.
  • Eine "selektierbar spaltbare" Bindung, z. B. eine "abasische Stelle", ist eine Stelle in einem Oligonucleotid-Grundgerüst, die enzymatisch, chemisch oder photolytisch spaltbar sein kann, wie es in den US-Patenten Nr. 4 775 619, 5 118 605, 5 258 506, 5 367 066, 5 380 833, 5 580 731 und 5 591 584 beschrieben ist. Abasische Stellen sind nicht-nucleotidische Stellen, wie sie zum Beispiel im US-Patent Nr. 5 430 136 beschrieben sind. Mit "abasischer Stelle" ist eine monomere Einheit gemeint, die in einer Oligonucleotidkette enthalten ist, die aber keine Purin- oder Pyrimidinbase enthält. Die monomeren Einheiten, die in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bereitstellung abasischer Stellen verwendet werden, enthalten den Ribose- oder Desoxyribosering, enthalten in der 1'-Position aber keine Purin- oder Pyrimidinbase. Wie in den vorstehend genannten Patenten erläutert wurde, kann eine Reihe von Reagenzien und Verfahren eingesetzt werden, um abasische Stellen und/oder Stellen, die unter Verwendung chemischer Reagenzien, Restriktionsenzyme oder Photolyse spaltbar sind, verwendet werden. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5 258 506 von Urdea et al., mit dem Titel "Photolabile Reagents for Incorporation into Oligonucleotide Chalns"; US-Patent Nr. 5 367 066 von Urdea et al., mit dem Titel "Oligonucleotides with Selectably Cleavable and/or Abasic Sites"; US-Patent Nr. 5 380 833 von Urdea, mit dem Titel "Polynucleotide Reagents Containing Selectable Cleavage Sites"; US-Patent Nr. 5 430 136 von Urdea et al., mit dem Titel "Oligonucleotides Having Selectable Cleavable and/oder Abasic Sites"; US-Patent Nr. 5 552 538 von Urdea et al., mit dem Titel "Oligonucleotides With Cleavable Sites"; und US- Patent Nr. 5 578 717 von Urdea et al., mit dem Titel "Nucleotides for Introducing Selectable Celavable and/or Abasic Sites into Oligonucleotides".
  • Der Ausdruck "Aminosäure", wie er hier verwendet wird, soll nicht nur die L-, D- und nichtchiralen Formen natürlich vorkommender Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Asparaginsäure, Cystein, Glutamin, Glutaminsäure, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin), sondern auch modifizierte Aminosäuren, Aminosäureanaloga und andere chemische Verbindungen, die bei der herkömmlichen Oligopeptidsynthese eingebaut werden können, zum Beispiel D-Aminosäuren und andere unnatürliche oder unkonventionelle Aminosäuren, wie zum Beispiel 4-Nitrophenylalanin, Isoglutaminsäure, Isoglutamin, ε-Nicotinoyllysin, Isonipecotinsäure, Tetrahydroisochinolinsäure, α-Aminoisobuttersäure, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, 4-Aminobuttersäure und dergleichen, umfassen.
  • Die Ausdrücke "herkömmlich" oder "natürlich vorkommend", wie sie hier auf Oligopeptide angewendet werden, beziehen sich auf Oligopeptide, die aus den natürlich vorkommenden Aminosäuren, d. h. Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp und Tyr, aufgebaut sind. Der Ausdruck "Oligopeptide" bezieht sich auf Oligomere, in denen die Monomere alpha-Aminosäuren sind, die durch Amidbindungen verknüpft sind.
  • Der Ausdruck "Saccharid" soll nicht nur natürlich vorkommende Mono- und Disaccharide, sondern auch modifizierte Saccharide umfassen. Beispiele für Monosaccharide umfassen Triosen, wie zum Beispiel Glyceraldehyd und Dihydroxyaceton, Tetrosen, wie zum Beispiel Erythrose, Erythrulose und Threose, Pentosen, wie zum Beispiel Ribose, Ribulose, Arabinose, Xylose, Xylulose und Lyxose, Hexosen, wie zum Beispiel Allose, Altrose, Glukose, Mannose, Gulose, Idose, Galactose, Talase, Psicose, Fructose, Sorbose und Tagatose, Heptosen, wie zum Beispiel Seduheptulose, und dergleichen. Disaccharide umfassen Dimere von beliebigen der obigen Monosaccharide, die durch α-1,2-, α-1,3-, α-1,4-, α-1,6-, β-1,2-, β-1,3-, β-1,4-, β-1,6-Bin-dungen oder dergleichen verknüpft sind. Beispiele für solche Disaccharide umfassen Maltose, Lactose, Saccharose und dergleichen. Modifizierte Saccharide umfassen solche, in denen eine oder mehrere der Hydroxylgruppen durch Halogen, aliphatische Gruppen ersetzt sind oder als Ether, Amine, Phosphate oder dergleichen funktionalisiert sind. Ein "Oligosac charid" ist ein Oligomer aus Monosacchariden. Verknüpfungen zwischen Zuckern können α-1,2-, α-1,3-, α-1,4-, α-1,6-, β-1,2-, β-1,3-, β-1,4-, β-1,6-Verknüpfungen oder dergleichen sein.
  • "Molekulare Mimetics" umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, kleine organische Verbindungen; Nucleinsäuren und Nucleinsäurederivate; Saccharide und Oligosaccharide; Peptidmimetics einschließlich Peptide, Proteine und Derivate davon, wie zum Beispiel Peptide, die organische Nicht-Peptidgruppierungen enthalten, synthetische Peptide, die Aminosäuren oder Peptidbindungen enthalten können, aber die strukturellen und funktionellen Merkmale eines Peptidliganden beibehalten; und Peptoide und Oligopeptoide, wie zum Beispiel die, die von Simon et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9367, beschrieben werden; und Antikörper einschließlich Anti-Idiotyp-Antikörper.
  • Ein "Peptoid" ist ein Oligomer, das mindestens teilweise aus Monomereinheiten von Aminosäure-"Ersatzstoffen" hergestellt ist, welche aus einem beliebigen anderen Molekül als einer Aminosäure bestehen, die aber dazu dienen, eine Aminosäure in einem Peptoidpolymer nachzuahmen. Besonders bevorzugte Monomereinheiten sind N-alkylierte Derivate von Glycin. Peptoide werden produziert, indem der Aminosäure-"Ersatzstoff" in eine lineare Ketten- oder cyclische Struktur mit Aminosäuren und/oder anderen Aminosäure-Ersatzstoffen gebunden wird. Die Verknüpfungen können, ohne Beschränkung, Peptidbindungen, Ester, Ether, Amine, Phosphate, Sulfate, Sulfate, Thioether, Thioester, aliphatische Bindungen und Carbamate umfassen. Beispiele für Aminosäure-Ersatzstoffe umfassen, ohne Beschränkung, N-substituiertes Glycin, N-alkylierte Glycine, N-substituiertes Alanin, N-substituiertes D-Alanin, Urethane und substituierte Hydroxysäuren, wie zum Beispiel Hydroxyessigsäure, 2-Hydroxypropansäure, 3-Hydroxypropansäure, 3-Phe-nyl-2-hydroxypropansäure und dergleichen. Ein Peptoid kann Aminosäure-Ersatzstoffe umfassen, die mehr als einen Verknüpfungstyp verwenden, vorausgesetzt, dass die Chemie für die Reaktionsschemata kompatibel ist und allgemein durch die hierin beschriebenen Reaktionen umfasst wird. Weitere Beispiele für Aminosäure-Ersatzstoffe und Peptide werden zum Beispiel bei Bartlett et al., PCT WO91/19735 und Zuckermann et al., PCT WO94/06451, beschrieben.
  • Mit dem Ausdruck "Schutzgruppe" (protecting group) oder "PG" ist hier eine Spezies gemeint, die verhindert, dass ein Segment eines Moleküls oder die Stelle, an der diese Schutzgruppe gebunden ist, eine spezifische chemische Reaktion eingeht, die aber nach Beendigung dieser Reaktion aus dem Molekül entfernbar ist. Dies steht im Gegensatz zu einer "Capping- Gruppe" (capping group), die auch eine kovalente Bindung mit einem Segment eines Moleküls bildet, aber eine weitere chemische Transformation dieses Segments verhindert.
  • Die Ausdrücke "Schutz" und "Entfernung von Schutzgruppen", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf die Einfügung bzw. Entfernung von chemischen Schutzgruppen unter Verwendung herkömmlicher Materialien und Techniken, die im Rahmen des Fachwissens eines Fachmanns liegen und/oder in der einschlägigen Literatur beschrieben sind; siehe zum Beispiel Greene et al., Protective Groups in Organic Sythesis, 2. Ausgabe (New York : John Wiley & Sons, 1991). Geeignete Verfahren zur Entfernung von Hydroxylschutzgruppen umfassen insbesondere, sind aber nicht beschränkt auf, Behandlung mit einer Säure ausreichender Stärke, um die Schutzgruppen zu entfernen, die aber ansonsten die Eigenschaften des festen Trägers oder irgendwelcher darin gebundenen Komponenten nicht verändert.
  • Der Ausdruck "Alkyl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich, wenn nichts andere spezifiziert ist, auf eine gesättigte, geradkettige, verzweigte oder zyklische Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 24, typischerweise 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, Cyclopentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Isohexyl, Cyclohexyl, 3-Methylpentyl, 2,2-Dimethylbutyl und 2,3-Dimethylbutyl. Der Ausdruck "Niedrigalkyl" bezieht sich auf eine Alkylgruppe aus 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und umfasst zum Beispiel Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, Cyclopentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Isohexyl, Cyclohexyl, 3-Methylpentyl, 2,2-Dimethylbutyl und 2,3-Dimethylbutyl. Der Ausdruck "Cycloalkyl" bezieht sich auf zyklische Alkylgruppen, zum Beispiel Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cyclohepyl und Cyclooctyl.
  • Der Ausdruck "Alkenyl", wie er hier verwendet wird, bezeichnet, wenn nichts anderes spezifiziert ist, eine verzweigte, unverzweigte oder zyklische (im Fall von C5- und C6-) Kohlenwasserstoffgruppe mit 2 bis 24, typischerweise 2 bis 12 Kohlenstoffatomen, die mindestens eine Doppelbindung enthält, wie zum Beispiel Ethenyl, Vinyl, Allyl, Octenyl, Decenyl und dergleichen. Der Ausdruck "Niedrigalkenyl" bezieht sich auf eine Alkenylgruppe mit 2 bis 6 Kohlenstoffatomen und umfasst zum Beispiel Vinyl und Allyl. Der Ausdruck "Cycloalkenyl" bezieht sich auf zyklische Alkenylgruppen.
  • Der Ausdruck "Aryl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine aromatische Spezies, die 1 bis 5 aromatische Ringe, entweder kondensiert oder aneinander gebunden, und entweder unsubstituiert oder mit einem oder mehreren Substituent(en), typischerweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Amino, Halogen und Niedrigalkyl, enthält. Bevorzugte Arylsubstituenten enthalten 1 bis 3 kondensierte aromatische Ringe und besonders bevorzugte Arylsubstituenten enthalten einen aromatischen Ring oder zwei kondensierte aromatische Ringe. Aromatische Gruppen hierin können heterozyklisch sein oder nicht.
  • Der Ausdruck "Arylen" bezieht sich auf eine bifunktionelle Gruppe, worin Aryl wie oben definiert ist.
  • Die Ausdrücke "Aralkyl" und "Alkaryl" beziehen sich auf Gruppierungen, die sowohl Alkyl- als auch Arylspezies enthalten, die typischerweise weniger als etwa 24 Kohlenstoffatome und noch typischer weniger als etwa 12 Kohlenstoffatome im Alkylsegment der Gruppierung enthalten, und die typischerweise 1 bis 5 aromatische Ringe enthalten. Der Ausdruck "Aralkyl" bezieht sich auf eine Aryl-substituierte Allcylgruppe, während der Ausdruck "Alkaryl" sich auf eine Alkyl-substituierte Arylgruppe bezieht. Die Ausdrücke "Aralkylen" und "Alkarylen" werden in ähnlicher Weise verwendet, um Gruppierungen zu bezeichnen, die sowohl Alkylenwie auch Arylspezies enthalten, wobei sie typischerweise weniger als etwa 24 Kohlenstoffatome im Alkylenteil und 1 bis 5 aromatische Ringe im Arylteil enthalten; "Aralkylen" betrifft eine Aryl-substituierte Alkylenbindung, während "Alkarylen" sich auf eine Alkyl-substituierte Arylenbindung bezieht.
  • Der Ausdruck "heterozyklisch" bezieht sich auf eine 5- oder 6-gliedrige monozyklische Struktur oder auf eine 8- bis 11-gliedrige bizyklische Struktur, die entweder gesättigt oder ungesättigt ist. Die heterozyklischen Gruppen hierin können aliphatisch oder aromatisch sein. Jeder Heterozyklus besteht aus Kohlenstoffatomen und aus 1 bis 4 Heteroatomen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel. Die Ausdrücke "Stickstoffheteroatome" und "Schwefelheteroatome", wie sie hier verwendet werden, umfassen jede oxidierte Form von Stickstoff und Schwefel und die quaternisierte Form eines basischen Stickstoffs. Beispiele für Heterozyklen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Pyrrol, Pyrrolidin, Pyridin, Piperidin, Morpholin, Chinolin, Indol, Pyrimidin, Piperazin, Pipecolin, Imidazol, Benzimidazol, Purin und dergleichen. Diese Gruppen können auch substituiert sein, wie es oben ausgeführt wurde.
  • "Gereinigt" oder "homogen" bedeutet, wenn es sich auf eine Oligomersequenz bezieht, dass das Oligomer beim wesentlichen Fehler anderer biologischer Makromoleküle desselben Typs oder der stereoisomeren Konfiguration vorliegt. Der Ausdruck "gereinigt" wie in "gereinigtes Oligomersegment von Interesse" bezieht sich auf eine Zusammensetzung, in der das Oligomersegment von Interesse wenigstens etwa 90 Gew.-%, vorzugsweise wenigstens etwa 95 Gew.-% und am vorteilhaftesten wenigstens etwa 95 Gew.-% der Zusammensetzung darstellt.
  • Der Ausdruck "Halogen" wird in seinem herkömmlichen Sinn verwendet, um einen Chlor-, Brom-, Fluor- oder Iodsubstituenten zu benennen. Die Ausdrücke "Halogenalkyl", "Halogenalkenyl" oder "Halogenalkinyl" (oder "halogeniertes Alkyl", "halogeniertes Alkenyl" oder "halogeniertes Alkinyl") beziehen sich auf eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, in der mindestens eines der Wasserstoffatome in der Gruppe durch ein Halogenatom ersetzt wurde.
  • Der Ausdruck "Substituent", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine funktionelle Gruppe oder einen Nicht-Wasserstoff-Substituenten, der an ein Atom einer Molekülgruppierung gebunden ist. Der Fachmann auf dem Fachgebiet wird leicht erkennen, dass die hierin definierten und aufgezeigten Verbindungen und Molekülsegmente unsubstituiert, substituiert, wie spezifisch angegeben, oder mit anderen Substituenten substituiert sein können. Beispiele von Substituenten, die in den erfindungsgemäßen Verbindungen vorliegen können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Halogen, insbesondere Chlor; Hydroxy; Alkoxy, insbesondere Niedrigalkoxy, wie Methoxy, n-Propoxy und t-Butoxy; primäres Amino (NH2); sekundäres Amino, typischerweise Niedrigalkyl-substituiertes Amino; tertiäres Amino, typischerweise Niedrigalkyl-disubstituiertes Amino; Nitro; Acyloxy, das als R'COO- dargestellt werden kann; Acylamido, das als R'CONH- dargestellt werden kann, und Thioanaloga davon (R'CSO- bzw. R'CSNH-), worin R' Alkyl, typischerweise Niedrigalkyl ist; Carboxy (C(O)OH); Alkoxycarbonyl (-C(O)OR'); Carbamyl (-C(O)NH2); Alkylcarbamyl (C(O)NHR'); Alkylsulfonyl (R'SO2-) und Alkylphosphonyl (R'P(OR')O-). Die Ausdrücke "Alkyl", "Alkenyl", "Hydrocarbyl", usw., wie sie hier verwendet werden, sollen nicht nur unsubstituierte Gruppen sondern auch substituierte Gruppen, die einen oder mehrere "Substituent(en)" enthalten, wie sie gerade definiert wurden, umfassen.
  • "Fakultativ" oder "gegebenenfalls" bedeutet, dass das anschließend beschriebene Event oder die Umstände vorliegen können oder nicht und dass die Beschreibung Fälle beinhaltet, bei denen das Event oder diese Umstände auftreten und auch Fälle beinhaltet, bei denen dies nicht der Fall ist. Beispielsweise meint der Ausdruck "gegebenenfalls vorhandene" selektierbare Spaltungsstelle, dass eine selektierbare Spaltungsstelle vorliegen kann oder nicht, und dass die Beschreibung Fälle beinhaltet, in denen die selektierbare Spaltung vorliegt, und auch Fälle beinhaltet, bei denen die selektierbare Spaltungsstelle fehlt.
  • Hierin wird eine neue Strategie zur Herstellung von Oligomersegmenten von Interesse in gereinigter Form offenbart und beansprucht. Zunächst beinhaltet das Verfahren die Herstellung eines Träger-gebundenen Oligomers, das das Oligomersegment von Interesse, das in gereinigter Form bereitgestellt werden soll, enthält. Das Träger-gebundene Oligomer wird durch sequentielle Kupplung von Monomeren an das Ende einer wachsenden Träger-gebundenen Oligomerkette, bis das gewünschte Träger-gebundene Oligomer erhalten ist, synthetisiert. Das Träger-gebundene Oligomer enthält eine erste selektierbar spaltbare Bindung, eine zweite selektierbar spaltbare Bindung, und eine dritte selektierbar spaltbare Bindung, wobei das Oligomersegment von Interesse von der zweiten und dritten selektierbar spaltbaren Bindung flankiert wird, und wobei eine erste Einfang-Gruppierung am freien Ende des Trägergebundenen Oligomers vorliegt und eine zweite Einfang-Gruppierung zwischen der ersten und dritten selektierbar spaltbaren Bindung vorliegt.
  • Die selektierbar spaltbaren Bindungen und die Einfang-Gruppierungen werden während der Synthese unter Verwendung von Techniken, die hierin beschrieben sind und/oder die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, eingeführt. Die selektierbar spaltbaren Bindungen und die Einfang-Gruppierungen werden während der Synthese unter Verwendung von Techniken, die hierin beschrieben sind und/oder dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, eingeführt. Das Träger-gebundene oligomere Molekül, das im Reinigungsverfahren als Ausgangsmaterial eingesetzt wird, ist schematisch im oberen Teil von 1A dargestellt und kann allgemein durch die Formel (I) dargestellt werden: (I) S-[X1]n1-SCl-CP2-[X2]n2-SC3-T1-X-T2-SC2-CP1 worin S den festen Träger darstellt, X1 und X2 Monomer oder oligomere Segmente sind, n1 und n2 unabhängig voneinander Null oder 1 sind, SC1, SC2 und SC3 die erste, zweite und dritte selektiv spaltbare Stelle darstellen, CP1 und CP2 die erste und zweite Einfang-Gruppierung darstellen, T1 den ersten Terminus des Oligomersegments von Interesse "X" darstellt, und T2 den zweiten Terminus des Oligomersegments X darstellt.
  • Wenn die Synthese von (I) beendet ist, wird ein schrittweises Verfahren durchgeführt, um das Oligomersegment von Interesse, T1-X-T3, in gereinigter Form bereitzustellen. Die Stufen des Verfahrens sind in den 1A und 1B schematisch dargestellt. Zuerst wird die erste selektierbar spaltbare Bindung SC1 so gespalten, dass das oligomere Produkt vom festen Träger freigesetzt wird (1A, Schritt 1). Das freigesetzte oligomere Produkt wird dann mit einem ersten Einfang-Medium CM1 inkubiert, das an die erste Einfang-Gruppierung CP1 bindet, und das "eingefangene" oligomere Produkt wird dann isoliert und gegebenenfalls gereinigt (1A, Schritt 2). Als nächstes wird die zweite selektierbar spaltbare Bindung SC2 gespalten, um das Oligomersegment von Interesse zu produzieren, das in einer zweiten Einfang-Gruppierung CP2 endet (1A, Stufe 3). Das so bereitgestellte Oligomersegment wird mit einem zweiten Einfang-Medium CM2 inkubiert, welches an die zweite Einfang-Gruppierung CP2 bindet, und das eingefangene Oligomersegment wird dann isoliert und dann gegebenenfalls gereinigt (1B, Schritt 4). Schließlich wird die dritte selektierbare spaltbare Bindung (SC3) gespalten, um das Oligomersegment von Interesse in gereinigter Form zu erhalten.
  • Zur Vereinfachung bezieht sich die nun folgende Beschreibung auf Oligomere, die aus Oligonucleotiden bestehen. Allerdings wird dem Fachmann auf diesem Gebiet klar sein, dass die Methodik in einfacher Weise angepasst werden kann, um andere Typen gereinigter Oligomere unter Verwendung herkömmlicher Techniken und Reagenzien herzustellen.
  • In einer Ausführungsform wird dann ein Verfahren zur Herstellung eines Oligonucleotidsegments von Interesse in gereinigter Form unter Verwendung eines Träger-gebundenen Oligonucleotids der Struktur der Formel (I) als Ausgangsmaterial bereitgestellt. In dieser Ausführungsform stellt T1-X–T2 das gewünschte Oligomersegment von Interesse dar, wobei T1 und T2 die 5'- und 3'-Termini des Oligonucleotids "X" darstellen. Somit verwendet eine Reinigung bei Oligonucleotiden unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowohl 3'- wie auch 5'-Selektionstechniken. Die 5'-Selektion basiert auf der bewährten DMT/RP-Chromatographietechnik. Horn et al., (1988), Nucleic Acids Res., 16: 11559–71. Allerdings ist die 5'-Selektion allein zur Isolierung des Produkt-Oligomers nicht adäquat. Der Schlüsselschritt in der neuen Strategie ist ein 3'-Einfangen, das Oligonucleotide mit intakten 3'-Termini selektiv bindet, so dass das Einfangen nur erfolgen wird, wenn die gewünschte terminale Gruppierung vorhanden ist. So werden statistisch gekürzte Oligonucleotide, die während der Entfernung der Schutzgruppen gebildet werden, nicht eingefangen, da ihnen die 3'-Einfang-Gruppierung fehlt. Ein Einfangen resultiert in der Bildung einer kovalenten Bindung zwischen Oligomer und Einfang-Träger, d. h. zwischen CP1 und CM1 und zwischen CP2 und CM2. Nach Waschen zur Entfernung von Oligomeren, die nicht kovalent gebunden sind, wird das eingefangene Oligomer spezifisch freigesetzt.
  • Das Schema kann bei der Reinigung von synthetischen DNA-Oligomeren eingesetzt werden, kann aber potentiell auch auf andere Oligomertypen (RNA, PNA, Peptoide, Peptide, Oligosaccharide und andere) ausgedehnt werden. Es ist ferner möglich, in den vorliegenden Reinigungsschemata zwei beliebige Einfang-Techniken zu verwenden, zum Beispiel 5'-Thiol- und 3'-Aldehyd-Einfangen, 3'-Aldehyd- und 5'-Thiol-Einfangen, usw. Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, dass ein Oligonucleotid entweder 5'→3' oder 3'→5' synthetisiert werden kann und dass die hierin beschriebenen Verfahren, obgleich beispielhaft unter Verwendung der 3'→5'-Oligonucleotidsynthese beschrieben, unter Verwendung jedes Syntheseschemas in die Praxis umgesetzt werden können.
  • Die Erfindung ermöglicht eine Reinigung von Oligomeren, so dass Fehler enthaltende und unvollständige Oligomere entfernt werden. Dies wird erreicht, indem das 5'-Ende blockierende Gruppen und Einfang-Gruppierungen verwendet werden, welche Mittel zur vollständigen Trennung von eine Blockierungsgruppe enthaltenden und eine Einfang-Gruppierung enthaltenden Oligomeren und Polymeren bereitstellen. Eine Trennung kann durchgeführt werden, indem das die Blockierungsgruppe enthaltende und die Einfang-Gruppierung enthaltende Oligomer, wie es oben hergestellt wurde, verwendet wird oder gegebenenfalls können die 5'-Blockierungsgruppe, die 3'-Einfang-Gruppierung oder beide modifiziert werden, um alternative Mittel zur Reinigung des Oligomers bereitzustellen.
  • 5'-Einfangen und die 5'-Einfang-Gruppierung
  • Vorzugsweise, obgleich nicht notwendigerweise, ist der anfängliche "Einfang"-Schritt im Reinigungsschema ein 5'-Selektionsschritt. Typischerweise ist die 5'-Einfang-Gruppierung Dimethoxytrityl ("DMT"), Monomethoxytrityl ("MMT"), Trityl, Pixyl oder dergleichen, wobei DMT bevorzugt ist. Andere Hydroxyl-Schutzgruppen umfassen Carbonatester, wie zum Beispiel 2-Methylen-9,10-anthrachinoncarbonatester und p-Nitrobenzylcarbonatester, wie sie von Urdea et al., US-Patent Nr. 5 703 218, offenbart sind. Die 9-Fluorenyl-methylcarbonat ("Fmoc")-Gruppe wird auch zum 5'-Schutz in der Festphasen-Oligonucleotidsynthese verwendet (Fukuda et al., (1988), Nucleic Acids Res. Symposium Ser. 19, 13 und C. Lehmann et al., (1989), Nucleic Acids Res. 17: 2389). Ähnlich beschreiben R. L. Letsinger et al. (1967), J. Am. Chem. Soc., 32: 296, die Verwendung der p-Nitrophenyloxycarbonylgruppe zum 5'-Hydroxylschutz. Hydrazin-labile 5'-Schutzgruppen umfassen Benzoyl-Propionylgruppen (Letsinger et al., (1967), J. Am. Chem. Soc., 89: 7147), und Levulinylestergruppen (deRooij et al., (1979), Real. Track. Chain. Pays-Bas., 98: 537, Iwai et al., (1988), Tetrahedron Lett., 29: 5383; und Iwai et al., (1988), Nucleic Acids Res., 16: 9443). Der 5'-Selektionsschritt wird durch Inkubation mit einem Einfang-Medium, wie zum Beispiel einem reverse phase-Chromatographiemedium, einem hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographiemedium oder dergleichen, durchgeführt. Mit anderen Worten, es kann eine Reinigungsstufe mit einer reverse phase-Kartusche oder einer Massenphase eingesetzt werden, um auf Oligomere, die die DMT-Gruppierung enthalten, zu selektieren. Horn et al., (1988), supra.
  • 5'-Einfang-Gruppierungen, die zur Durchführung eines 5'-Einfangens unter Verwendung zum Beispiel einer reverse phase-Trennung, einer hydrophoben Wechselwirkungstrennung oder dergleichen verwendet werden können, umfassen 2-(Tritylthio)-alkyl-Linker mit der Formel 2-(Tritylthio)-R1-O-p-5'-O-Nu1, worin R1 Niedrigalkyl ist, p für P(O)2 steht, und Nu1 ein 5'-Nucleotid ist. In diesem Fall ist die 5'-terminale Einfang-Gruppierung eine Tritylgruppe und ist der 5'-spaltbare Linker S-R1-O-p. Solche Derivate, z. B. 2-(Tritylthio)-CH2CH2-O-p-r'-O, werden bei Conolly et al., (1985), Nucleic Acids Res., 13: 4485–4502, beschrieben. Eine Schutzgruppenentfernung der Tritylthiogruppe mit AgNO3 führt zur Bildung des HS-Alkyl-O-p-O-Oligomers, das spontan Ethylensulfid eliminiert, wodurch ein 5'-phosphoryliertes Oligonucleotid erhalten wird. Folglich wäre ein solcher Linker mit einem Disilyloxy-Linker kompatibel (d. h. bezüglich diesem orthogonal entfernbar), wobei dieser Linker selektiv mit einem Fluoridreagens abgespalten werden kann.
  • Eine zusätzliche 5'-Einfang-Gruppierung, die verwendet werden kann, um ein 5'-Einfangen durch RP-Trennung, hydrophobe Wechselwirkungstrennung oder dergleichen durchzuführen, und die auch als spaltbarer Linker dient, ist (φ)3Si-R2-O-p-5'-O-Nu1, wobei φ Phenyl ist, R2 Niedrigallcyl ist, und Nu1 wie oben definiert ist. Eine Behandlung mit Fluoridreagenzien, wie zum Beispiel Tetrabutylammoniumfluorid ("TBAF") und Triethylamintrihydrofluorid ("TEA(HF)3") führt zur Fragmentierung des (φ)3Si-R2-O-p-5'-O-Oligomers in (φ)3Si-F, Ethylenoxid und 5'-p-O-Oligomer. Eine derartiger Linker-Gruppierung ist mit einem Disilyloxy-Linker inkompatibel, welcher auch unter Verwendung von Fluoridreagenzien gespalten wird. Beispiele für Linker, wie zum Beispiel (φ)3Si-CH2CH2-O-p-5'-O-Nu werden in Celebuski et al., (1992), J. Org. Chem., 57: 5535–5538 und im US-Patent Nr. 5 380 835 von Celebuski et al., erteilt am 10. Januar 1995, beschrieben.
  • Eine 5'-Selektion solcher Oligomere wird unter Verwendung von Einfang-Schemata, die für die 5'-Einfang-Gruppierung spezifisch sind, durchgeführt; dadurch wird eine kovalente Bindung mit dem ersten Einfang-Medium oder Einfang-Träger gebildet. In diesem Fall ist es notwendig, dass ein 5'-spaltbarer Linker zwischen der 5'-Einfang-Gruppierung und dem 5'-Terminus des Oligomers eingebaut wird. Außerdem ist es bevorzugt, dass der 5'-spaltbare Linker mit dem 3'-terminalen Linker kompatibel ist.
  • So kann zum Beispiel ein 5'-Thiol-Einfangen durchgeführt werden, um ein Oligomer zu erhalten, das ein 5'-terminales Phosphat trägt, wenn die 5'-Einfang-Gruppierung DMT-O-R3-S-S-R4-O-p ist, worin R3 und R4 unabhängig voneinander Niedrigalkylen, Arylen, Aralkylen oder Alkarylen sind, und der 5'-Linker "reverser L1" (d. h. orthogonal bezüglich L1-Linkern) ist, welches eingebaut werden kann, indem als letztes Kondensationsmonomer N4-(DMT-O-R3)-2',3'-O-Benzoyl-ribocytidin-5'-(β-cyanoethyl)-phosphoramidit, worin R5 Niedrigalkylen, Arylen, Aralkylen oder Alkarylen ist, verwendet wird. Alternativ können N4-(DMT-O-R5)-2',3'-O-Benzoyl-cytidin-5'-(β-cyanoethyl)-phosphoramidit oder N4-(DMT-O-R5)-5-Methyl-2',3'-O-benzoyl-cytidin-5'-(β-cyanoethyl)-phosphoramidit als das letzte Kondensationsmonomer eingebaut werden. Der Fachmann wird erkennen, dass ähnlich derivatisierte Guanosin-, Adenosin- oder Uridinderivate, z. B. N4-(DMT-O-R5)-2',3'-O-Benzoyl-guanosin, N4-(DMT-O-R5)-2',3'-O-Benzoyl-adenosin und N4-(DMT-O-R5)-2',3'-O-Benzoyl-uridin oder auch abasische Stellen, wie zum Beispiel 1-O-(DMT-O-R5)-2,3-O-Dibenzoyl-ribose-5'-(β-cyano-ethyl)-phosphoramidit oder 5-O-DMT-2,3-Dibenzoyl-ribose-1-O-(β-cyanoethyl-O-R5) als letztes Kondensationsmonomer eingebaut werden können.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der 5'-Linker "reverser L1" und R3, R4 und R5 sind -C6H12-Bindungen. Eine Reduktion der -S-S-Bindung unter Verwendung eines Reduktionsmittels wie zum Beispiel Dithiothreitol ("DTT") führt zu einer aktiven Thiolgruppe, mit der ein Einfangen, wie unten beschrieben, durchgeführt werden kann. Ein 5'-Thiol-Einfangen kann unter Erhalt einer 5'-Hydroxylgruppierung durchgeführt werden, wobei der 5'-Linker -O-R6-O-Si(R7)(R8)-O-Si(R9)(R10)-5'-O, worin R6, R7, R8, R9, R10 unabhängig voneinander Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl sind. Vorzugsweise ist der 5'-Linker -O-(CH2)3-O-Si(CH(CH3)2)2-O-Si(CH(CH3)2)2-5'-O. In ähnlicher Weise kann ein 5'-Dialdehyd-Einfangen durchgeführt werden, bei dem die 5'-Einfang-Gruppierung 2',3'-O-(Benzoyl)2-riboNu-5'-p ist, worin riboNu ein Ribonucleotid ist und vorzugsweise riboU ist, und wobei der 5'-Linker -O-R6-O-Si(R7)(R8)-O-Si(R9)(R10)-5'-O ist, vorzugsweise -O-(CH2)3-O-Si(CH(CH3)2)2-O-Si(CH(CH3)2)2-5'-O, ist.
  • Alternativ kann die 5'-Bindung eine selektierbar spaltbare abasische Stelle sein, wie es im US-rt ist. Beispielsweise kann eine Patent Nr. 5 430 136 offenbaOligonucleotidkette die folgende Struktur enthalten:
    Figure 00240001
    rt, ist, "worin CP2 eine 5'-Einfang-Gruppierung, wie oben definiert, ist, Oligomer" ein Segment des Oligonucleotids ist, und R aus der Gruppe bestehend aus 2-Nitrobenzyl, 4-Penten-1-yl, -CH2CH2Sφ, -CH2CH2Si(CH3)3, -P(O)-O-– 2, -CH2CH2-C6H4-NO2 und der 2-Methylen-9,10-anthrachinon ("MAQ")-Gruppierung ausgewählt ist.
    Figure 00240002
    worin R' Wasserstoff, Aryl oder Aralkyl ist, und wenn es Aryl oder Aralkyl, so ist es vorzugsweise C1-C8-Aryl oder Aralkyl; Ri gleich oder verschieden sein können und aus der Gruppe bestehend aus Amino, Nitro, Halogen, Hydroxyl, Niedrigalkyl und Niedrigalkoxy ausgewählt sind, Rj, gleich oder verschieden sein können und aus der Gruppe bestehend aus Amino, Nitro, Halogen, Hydroxyl, Niedrigalkyl und Niedrigalkoxy ausgewählt sind, i Null, 1, ll, 1, 2, 3 oder 4 ist. Die Spaltung eines 2 oder 3 ist, und j NuOligonucleotids, das eine solche abasische Stelle enthält, kann wie im '136-Patent beschrieben durchgeführt werden. Das heißt, wenn R 2-Nitrobenzyl ist, kann eine Spaltung durch Photolyse unter Verwendung von UV- Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 350 nm, gefolgt von einer basischen Hydrolyse, z. B. Ammoniumhydroxid oder dergleichen, durchgeführt werden. Wenn R -CH2CH2Sφ (worin φ Phenyl darstellt) ist, wird eine Spaltung durch Oxidation des Schwefelatoms in -SO- oder -SO2- mit zum Beispiel Natriumperiodat, gefolgt von einer Basenbehandlung, durchgeführt. Wenn R-CH2CH2Si(CH3)3 ist, kann das Oligonucleotid durch Behandlung mit zum Beispiel Fluoridionen, wiederum gefolgt von einer Basenbehandlung, gespalten werden. Wenn R MAQ ist, kann eine Spaltung durch Oxidation mit Na2S2O4, gefolgt von einer Basenbehandlung, durchgeführt werden. Wenn R-CH2CH2-C6H4-NO2 ist, kann eine Spaltung unter Verwendung von 1,8-Diazabicy-clo[5.4.0-undec-7-en] durchgeführt werden. Wenn R Phosphat ist, kann eine Entfernung mit alkalischer Phosphatase, gefolgt durch Behandlung mit Base, durchgeführt werden, während, wenn R 4-Penten-1-yl ist, eine Spaltung typischerweise unter Verwendung von N-Bromsuccinimid, gefolgt von einer Basenbehandlung, durchgeführt werden kann.
  • Andere selektierbar spaltbare Bindungen, die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, umfassen zum Beispiel durch Enzym spaltbare Stellen, zum Beispiel Bindungen, die mit Restriktionendonucleasen spaltbar sind, wie es zum Beispiel im US-Patent Nr. 4 775 619 von Urdea et al. beschrieben wird, und Pyrophosphatdiesterbindungen, die durch Pyrophosphatasen spaltbar sind. Zusätzliche selektierbar spaltbare Bindungen sind chemisch spaltbare Stellen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Disulfidbindungen, die durch Reduktion beispielsweise mit Ellman's Reagens oder dergleichen spaltbar sind; 1,2-Diole, die mit Periodat spaltbar sind; und andere mit Periodat spaltbare Bindungen wie zum Beispiel – (CO)-CH(OH)-, -CH(NHR)-CH(OH)-, -(CO)-(CO)- und -CH(NHR)-CH(NHR)- worin R für H oder Niedrigalkyl steht.
  • Vorzugsweise ist die 5'-Einfang-Gruppierung von der 3'-Einfang-Gruppierung verschieden, z. B. wird eine 5'-Thiol-Einfang-Gruppierung oder eine 5'-Dialdehyd-Einfang-Gruppierung mit einem Oligomer, das eine 3'-Dialdehyd-Einfang-Gruppierung oder eine 3'-Thiol-Einfang-Gruppierung trägt, verwendet. Wie oben angegeben, ist es außerdem bevorzugt, dass, wenn vorhanden, der spaltbare 5'-Linker mit dem spaltbaren 3'-Linker kompatibel ist, d. h. nicht durch dieselbe Behandlung wie dieser abgespalten wird, oder dass, wenn beide am Oligomer vorliegen, die Synthese die Gruppierung freisetzt.
  • Fester Träger:
  • Für die Festphasensynthese eines Oligonucleotids kann eine weite Vielzahl von Trägern eingesetzt werden. Beispiele für geeignete Trägermaterialien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Polysaccharide, wie zum Beispiel Agarose (z. B. die, die im Handel als Sepharose(R) von Pharmacia verfügbar ist) und Dextran (z. B. die, die im Handel unter den Handelsbezeichnungen Sephadex(R), Sephadex LH-20 und Sephacyl(R), ebenfalls von Pharmacia erhältlich sind), Polyacrylamide, Poly(dimethylacrylamid), Poly(acrylmorpholid), Polystyrole, Polystyrol auf Poly(tetrafluorethylen) aufgepfropft, Polyvinylalkohole, Copolymere von Hydroxyethylmethacrylat und Methylmethacrylat, Siliziumdioxide, Teflone, Gläser, Porasil C, Glas mit kontrollierten Poren ("CPG"), Kieselguhr, Cellulose, Fractosil 500 und dergleichen, wie sie im US-Patent Nr. 5 256 540 von Urdea et al. und darin angegebenen Referenzen beschrieben sind.
  • Spaltbare Linker, die das Oligomer mit der 3'-Einfang-Gruppierung verbinden
  • Spaltbare Linker, die verwendet werden, um das Oligomer während einer Synthese und Reinigung an die 3'-Einfang-Gruppierung zu binden, müssen unter den Bedingungen der Synthese, der selektiven Abspaltung vom festen Träger, der Schutzgruppenentfernung, reverse phase/ Entsalzungs/-hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographie und des kovalenten Einfangens stabil sein. Eine Abspaltung dieses spaltbaren Linkers führt zu dem endgültigen, gereinigten Oligomer entweder mit einer 3'-Phosphat- oder einer freien 3'-Hydroxylgruppe, was vom verwendeten Linker abhängt.
  • Selektierbar spaltbare Linker, die verwendet werden, um das Oligomer an die Einfang-Gruppierung zu binden und ein Oligomer mit einem 3'-Phosphat zu produzieren, umfassen N4-(Phosphoryl-5-oxyhexyl)-cytidin ("L1") und 2',3'-Isopropylidin-N4-(phosphoryl-6-oxyhexyl)-cytidin ("L2"): L1 kann zum Beispiel unter Verwendung einer (3-Eliminierung nach Periodatoxidation des 2',3'-Diolsystems abgespalten werden, wie es in Keith et al., (1974), Biochemistry, 13: 3601–3606, beschrieben ist. L2 kann unter Verwendung von Säure unter Abspaltung der Isopropylidingruppe, Periodatoxidation des 2',3'-Diolsystems und (3-Eliminierung unter basischen Bedingungen nach Periodatoxidation des 2',3'-Diolsystems abgespalten werden. Keith et al., supra. Andere spaltbare Linker, die verwendet werden können, um das Oligomer mit der 3'-Einfang-Gruppierung zu verknüpfen, oder Mittel, um das Oligomer von der 3'-Einfang-Gruppierung unter Erhalt eines 3'-Phosphats zu spalten, umfassen P-O-Alkylen1-S-alkylen2-P-p-, worin mindestens eines von Alkylen1 und Alkylen2 Ethylen ist, und worin eine Eliminierung nach Oxidation von -S- in -SO- (mit Periodat oder N-Chlorsuccinimid ("NCS"), gefolgt von einer Basenbehandlung (Kamaike et al., (1993), Nucleosides & Nucleotides, 12: 1015–1032), Säurespaltung der Phosphoramidatbindung, durchgeführt wird, R11-O-p-NH-R12 (Gryaznov et al., (1993), Tetrahedron Lett., 34: 1261–1264), worin R11 ein Nucleosid ist und R12 ein Alkyl-, Aryl-, Aralkyl- oder Alkaryl-, Allylphosphat-Linker ist, die durch Palladiumkatalyse (Zhang et al., (1997), Nucleic Acids Research, 25: 3980–3983) gespalten werden können, sowie andere Linker und Spaltungsmittel, die auf dem Fachgebiet bekannt sind.
  • Selektierbar spaltbare Linker, die verwendet werden, um das Oligomer mit der Einfang-Gruppierung zu verknüpfen und ein Oligomer, das eine 3'-Hydroxylgruppe hat, zu produzieren, umfassen Linker, die die Struktwformel Nu2-3'-O-Si(R13)(R14)-O-Si(R15)(R16)-O-R17 haben, worin Nu2 das terminale 3'-Nucleotid des Oligomers ist, R13, R14, R15 und R16 unabhängig voneinander Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl sind und R17 eine Einfang-Gruppierung ist, wie sie hier offenbart ist, z. B. 1,1,3,3-Tetraalkyl-disilyloxy, wie sie von Kwiatkowski et al., (1996), Nucleic Acids Research, 24: 4632–4638, beschrieben wird. Der Disilyloxy-Linker kann unter Verwendung von Fluoridreagenzien, wie zum Beispiel TBAF und TEA(HF)3, wie es von Westman et al., (1994), Nucleic Acids Research, 22: 2430–2431, beschrieben ist, gespalten werden. Andere spaltbare Linker, die verwendet werden können, um das Oligomer mit der 3'-Einfang-Gruppierung zu verbinden und die nach Spaltung ein 3'-Phosphat liefern, umfassen -Nu2-O-Si(R18)(R19)-2-O-R20 (Walsh et al., (1997), Tetrahedron Letters, 38: 651–1654), worin Nu2 wie oben definiert ist, R18 und R19 unabhängig voneinander Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl sind und R20 eine Einfanggruppierung, wie sie hierin offenbart ist, ist, und Nu2-O-Si(R21)(R22)-R23-Si(R24)(R25)-O-R26, worin Nu2 wie oben definiert ist, R21, R22, R23, R24 und R25 unabhängig voneinander Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl sind und R26 eine Einfanggruppierung ist, wie sie hierin offenbart ist, z. B. Nu2-O-Si(CH3)2-(CH2)2-Si(CH3)2-O-R26, von denen jede mit Fluoridreagenzien abspaltbar ist; und 2'-O-PG-Ribonucleotid, worin die Schutzgruppe und die Behandlung zur Entfernung aus der Gruppe bestehend aus t-Butyldimethylsilyl (Behandlung mit Fluorid und danach mit Base), Phosphat (alkalische Phosphatase, Base), 1-Methoxycyclohexylether (0,01 M HCl, Base; Reese et al., (1967), J. Am. Chem. Soc., 89: 3366), Methylthiomethylether (AgNO3, Base; Corey et al., (1975), Tetrahedron Letters, 1975: 3269–3270) und Siloxymethylether (Fluorid, Base; Gundersen et al., (1989), Acta Chem. Scand., 43: 706) ausgewählt sind. Nach Entfernung der 2'-O-PG-Gruppe wird das Oligomer durch Behandlung mit starker Base (unter Zurücklassung eines zyklischen Phosphats) (Crea et al., (1980), Nucleic Acids Res., 8: 2331–48; Schwanz et al., (1995), Tetrahedron Letters, 36: 27–30) abgespalten. Weitere verwendbare Linker sind Linker mit der Formel, z. B. Nu2-O-R27S-R28, worin N wie oben definiert ist, R27 Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl ist, und R28 eine Einfang-Gruppierung ist, z. B. Thio-formacetalderivate wie zum Beispiel Nu2-O-CH2S-R28, wobei diese Derivate mit Silbernitrat spaltbar sind, wie es von Keck et al., (1978), J. Org. Chem., 31: 1031 beschrieben wurde; Linker der Formel Nu2-O-R29-O-R30(NO2), worin Nu wie oben definiert ist und R29 Niedrigalkyl ist und R30 Aryl, Aralkyl oder Alkaryl ist, zum Beispiel 4-Nitrobenzyloxymethylderivate, wie zum Beispiel Nu2-O-CH2-O-C6H3(NO2), wobei diese Derivate mit Fluorid spaltbar sind, wie es von Gough et al., (1996), Tetrahedron Letters, 37: 981–982, beschrieben ist, und 2-Nitrobenzyloxymethylderivate, wie zum Beispiel Nu2-O-CH2-O-C6H3(NO2), wobei diese Derivate durch Photolyse spaltbar sind, wie es von Pillai, (1980), Synthesis, 1980: 1–26 beschrieben ist; Linker, die von Alkyldiolaminen abgeleitet sind, z. B. 2,3-Propandiolamin (HO-CH2-CHOH-CH2-NH2), wobei das Derivat die Formel Nu2-O-p-O-R31-NH(allyloxycarbonyl)-O- hat, worin Nu wie oben definiert ist und R31 Niedrigalkyl ist, zum Beispiel Nu2-O-p-O-CH2-CH-CH2-NH(Allyloxycarbonyl)-O-, wie sie bei Lyttle et al., (1996), Nucleic Acids Research, 24: 2793– 2798, beschrieben werden.
  • Alternativ können 3'-spaltbare Linker selektierbar spaltbare abasische Stellen der folgenden Formel sein
    Figure 00280001
    worin PG DMT oder dergleichen sein kann, und R wie vorstehend definiert ist. Noch andere Verknüpfungen, die als 3'-Linker geeignet sind, sind die, die oben als an der 5'-Stelle nützlich beschrieben wurden; allerdings sollten die 3'- und 5'-Linker, wie hier betont wird, bezüglich zueinander orthogonal spaltbar sein.
  • 3'-Einfang-Schemata:
  • Es werden eine Vielzahl von 3'-Einfang-Schemata verwendet, um ein Oligomer in Kombination mit einem 5'-Einfangschema zu reinigen. Beispiele für solche 3'-Einfang-Schemata umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die folgenden: Thiol-Einfang-Schemata unter Verwendung eines Einfang-Mediums, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus fester Träger-S-S-Pyridin, Bromacetyl-fester Träger, fester Träger-NH-CO-NH-phenyl-NCS und fester Träger-Epoxy, wobei das Oligomer vom festen Träger freigesetzt wird und eine Thiolgruppe trägt; ein "reverses"-Thiol-Einfangschema, bei dem das freigesetzte Oligomer eine 3'-Bromacetyl- oder Malimidogruppierung enthält und das Oligomer an einem Träger eingefangen wird, der eine Thiolgruppierung trägt; Einfangen eines Oligomers, das bei Freisetzung vom festen Träger eine Aldehydgruppierung trägt, und wobei ein Einfangen unter Verwendung eines fester Träger-CO-NHNH2 durchgeführt wird (Timofeev et al., (1996), Nucleic Acids Research, 24: 3142–3148; Hansske et al., (1974), Bioorganic Chemistry, 3: 367–376); ein "reverses"-Aldehyd-Einfangschema, bei dem das Oligomer vom festen Träger freigesetzt wird und eine Hydrazidgruppe trägt und bei dem das Einfangen an einem Aldehydträger erfolgt; (6-Histaminylpurin)6 (His6)-Einfangen unter Verwendung von Nickel-Nitrilotriessigsäure ("Ni-NTA") durch Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Metall, d. h. CPG-Ni-NTA, wie von Orum et al., (1995), Bio Techniques, 19: 472–480; Minet et al., (1996}, Nucleic Acids Research, 24: 3806–3810, beschrieben; Amin-Einfangen an CPG-DITC (CPG-phenyl-NCS), Urdea et al., (1988), Nucleic Acids Res., 16: 4937–56) oder CPG-Epoxy; Diol-Einfangen an Borsäureträger (Mazzeo, (1989), Bio Techniques, 4: 124–130; Pace et al., (1980), Analytical Biochemistry, 107: 128–135), Biotin-Einfangen an Avidinträger oder Avidin-Einfangen an Biotinträger; Dinitrophenyl-Einfangen an anti-DNP-Träger (Grzybowski et al., (1993), Nucleic Acids Research, 21: 1705–1712); und Diels-Alder-Einfangen, wie es von Wang et al., (1997), Chem. Commun., 1997: 1495–1496, beschrieben ist. Von den oben aufgelisteten 3'-Einfang-Schemata sind das Thiol-Einfangen und Aldehyd-Einfangen bevorzugt.
  • Thiol-Einfangen – Bei diesem Einfangen wird das Oligomer an einem Träger synthetisiert, der eine Disulfidbindung enthält, 5'-DMT-Oligo-3'-p-O-alkylen-S-S-alkylen-O-succinyl-CPG, z. B. 5'-DMT-Oligo-3'-p-O-(CH2)3-S-S-(CH2)3-O-succinyl-CPG. Nach einer Standard-Ammoniumhydroxid-Schutzgruppenentfernung liegt das Oligomer als 5'-DMT-Oligo-3'-p-O-(CH2)3-S-S-(CH2)3-OH vor. Eine nachfolgende Behandlung mit einem Reduktionsmittel, zum Beispiel tris-(2-Carboxyethyl)-phosphinhydrochlorid ("TCEP") oder Dithiothreitol ("DTT"), spaltet die Disulfidbrücke unter Erhalt von 5'-DMT-Oligo-3'-p-O-(CH2)3-SH. Die Herstellung von 5'-thiolierten Oligodesoxynucleotiden wurde bereits beschrieben (Kumar et al., (1996), Bioorg. Med. Chem. Lett., 6: 683–688; Bischoff et al., (1987); Analytical Biochemistry, 164: 336– 344; Kuijpers et al., (1993), Tetrahedron, 49: 10931–44). Die Festphasensynthese von 3'-Thiololigomeren unter Verwendung von 3'-Sulihydrylträgern kann durch Techniken erreicht werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind; siehe z. B. Gupta et al., (1991), Nucleic Acids Research, 19: 3019–3025.
  • Die Reinigung eines Oligomers nach diesem Schema umfasst ein Dreistufenverfahren. Das von dem festen Träger freigesetzte Oligomer wird einer Reinigung unter Verwendung eines 5'-Einfangens und einer Baker-Phenylsäule (BP) oder anderer Mittel zur Entfernung überschüssigen Reduktionsmittels und einiger Nicht-DMT-Spezies unterworfen. Es können alle DMT enthaltenden Spezies beispielsweise mit einer 75%igen Methanollösung, die 50 mmol TEAA enthält, eluiert werden.
  • Alternativ können die DMT enthaltenden Spezies von einem Überschuss an Reduktionsmittel abgetrennt werden, indem eine Entsalzungssäule, eine hydrophobe Wechselwirkungssäule oder ein anderes Trennmittel verwendet wird, welches auf der Basis der Größe (z. B. zur Entsalzung) oder Hydrophobität selektiert, z. B. um DMT enthaltende Spezies von Spezies ohne DMT zu trennen.
  • Das Eluat, das die DMT enthaltenden Spezies enthält, wird dann einem Einfangen an einem aktivierten Thiol-Einfang-träger, z. B. CPG-S-S-Pyridin, unterworfen. Dies kann dadurch erreicht werden, dass das Elutionsmittel auf eine kurze Säule aus aktiviertem Thiol-Einfangträger, CPG-S-S-Pyridin, aufgebracht wird. Alternativ kann die Trennung unter Anwendung eines Chargentrennungsprotokolls erfolgen. Nicht-gebundenes Material wird mit einem Puffer mit hohem Salzgehalt, z. B. 0,5 M NaCl in 10 mmol Tris, pH 8, weggewaschen.
  • Das eingefangene Oligomer wird dann entweder durch (1) Freisetzung des Oligomers von der Einfangträgersequenz unter Verwendung eines Reduktionsmittels, z. B. DTT, in Lösung und danach Spalten des 3'-spaltbaren Linkers in Lösung, z. B. für den Disilyloxy-Linker, oder (2) Oxidation des Linkermoleküls in den eingefangenen Oligomeren mit Natriumperiodat, z. B. für den L1-Linker, gefolgt von einer Behandlung mit einer milden Base in einem Puffer mit hohem Salzgehalt, isoliert.
  • Eine weitere Reinigung des Oligomers kann durch Auftragen des Produkts des vorangehenden 3'-Einfangschritts auf eine reverse phase- oder eine hydrophobe Wechselwirkungssäule unter Ausnutzung des Vorliegens des 5'-O-DMT, wie es von Horn et al., (1988), supra, beschrieben wird, erfolgen.
  • Ein Beispiel für eine Oligonucleotidreinigung durch kombinierte Thiol-Einfang/DMT-Selektion unter Verwendung eines 3'-spaltbaren Linkers L1 ist in Schema 1 dargestellt. Schema 1A stellt ein Oligonucleotidprodukt (T3dAT3) dar, das von dem festen Träger freigesetzt wurde und eine 5'-O-DMT-Gruppe und eine 3'-DM1-p-(CH2)3-S-S-(CH2)3-OH-Gruppierung umfasst. Zusätzlich zu der gewünschten Oligonucleotidspezies (1) ist das Produkt mit einem Oligonucleotid kontaminiert, das eine abasische Stelle (2) enthält. Die abasische Stelle kann aus der Schutzgruppenentfernung an exozyklischen Aminen und Phosphatgruppen im Oligomer vor der Freisetzung von festem Träger resultieren. Eine Ammoniumhydroxid-Schutzgruppenentfernung des Volllängen-Oligomers resultiert in mindestens drei Spezies, die im Schema 1B dargestellt sind: (a) das vollständig von Schutzgruppen befreite, intakte Volllängen-Oligomer, das eine 5'-O-DMT-Gruppierung und eine 3'-CM1-p(CH2)3-S-S-(CH2)3-OH-Gruppierung (1) trägt; (2) eine Spezies, die eine 5'-O-DMT-Gruppierung und einen 3'-Terminus mit einer apurinischen Gruppierung (3) hat; und (3) eine Spezies mit einer 5'-Phosphatgruppierung und eine 3'-CM1-p-(CH2)3-S-S-(CH2)3-OH-Gruppierung (4) hat. Eine Behandlung der von Schutzgruppen befreiten Spezies, die eine Reduktionsmittel, z. B. DTT, führt zu einer Umwandlung von 3'-CM1-p-(CH2)3-S-S-(CH2)3-OH in Spezies (1) und (4) in 3'-CM1-p-(CH2)3-SH (Schema 1C).
  • Das Leiten einer Lösung, die die Spezies (1), (3) und (4) umfasst, über eine BP-reverse phase-Säule führt zur Retention von Spezies (1) und (3), die eine 5'-O-DMT-Gruppierung haben. Spezies (4) wird nicht zurückgehalten (Schema 1D). Wie in den Schemata 1D-1E dargestellt ist, führt die Behandlung der Spezies (1) und (3) mit einem aktivierten Thiol-Einfangträger, z. B. CPG-S-S-Pyridin, zu einem kovalenten Einfangen nur der Spezies (1) unter Bildung der Spezies (5); dadurch wird die Reinigung eines Volllängen-Oligomers durch 5'- und 3'-Selektion durchgeführt. Schema 1E erläutert die Freisetzung des gereinigten Oligomers vom Einfangträger durch oxidative Periodatspaltung des ribo-Diol-Systems unter Bildung von Spezies (6) und beta-Eliminierung unter basischen Bedingungen unter Erhalt eines gereinigten Voll-längen-T3dAT3-3'-p (7). In Schema 1E sind nur der 3'-Teil von Spezies (6) und (7) gezeigt.
  • Ein zusätzlicher reverse phase-Säulenreinigungsschritt kann vor Detritylierung des Oligomers durchgeführt werden.
  • Schema 2 liefert ein Beispiel eines 3'-Thiol-Einfangverfahrens ähnlich dem in Schema 1 dargestellten, worin die 3'-Gruppierung Nu-3'-O-Si(alkyl)2-O-Si(alkyl)2-p-(alkyl)-S-S-(alkyl)-OH, z. B. Nu-3'-O-Si(CH(CH3)CH2)2-O-Si(CH(CH3)(CH2))2-p-(CH2)3-S-S-Pr-OH, ist. Die Reinigung ist entsprechend der bezüglich Schema 1 beschriebenen. Allerdings wird das eingefangene Oligonucleotid mit DTT vom Träger freigesetzt, worauf eine Spaltung des Disilyloxy-Linkers unter Verwendung eines Fluoridreagens, z. B. TBAF und TEA(HF)3, folgt.
  • Figure 00320001
    SCHEMA 1A
  • Figure 00330001
    SCHEMA 1B
  • Figure 00340001
    SCHEMA 1C
  • Figure 00350001
    SCHEMA 1D
  • Figure 00360001
    SCHEMA 1E
  • Figure 00370001
    SCHEMA 1F
  • Figure 00380001
    SCHEMA 2A
  • Figure 00390001
    SCHEMA 2B
  • Figure 00400001
    SCHEMA 2C
  • Figure 00410001
    SCHEMA 2D
  • Figure 00420001
    SCHEMA 2E
  • Aldehyd-Einfangen – Das Oligomer wird an einem festen Standard-Ribonucleosidträger synthetisiert und freigesetzt. Eine Behandlung des terminalen Ribonucleosids am 3'-Ende des Oligomers mit Natriumperiodat wird ein reaktives Nucleosid-Zwischenprodukt mit zwei benachbarten Aldehydgruppen bilden; diese können gemeinsam mit Hydrazidogruppen am Träger unter Bildung stabiler Morpholino-Zwischenprodukte reagieren. Eine Reinigung unter Verwendung eines Aldehyd-Einfangens wird unter Verwendung der folgenden Schritte durchgeführt.
  • Das 5'-DMT-Oligomer-3'-p-ribonucleotid wird mit Natriumperiodat unter Erhalt eines 5'-DMT-Oligomer-3'-p-ribonucleotid(ox) mit zwei Aldehydgruppen oxidiert. Siehe z. B. Hansske et al., (1974), oben. Das oxidierte Konstrukt wird an einem festen Träger, der anhängende Hydrazidogruppen hat, z. B. fester Träger-CO-NHNH2, eingefangen, wodurch stabile Morpholino-Zwischenprodukte gebildet werden. Ungebundenes Material wird mit einem Puffer mit hohem Salzgehalt weggewaschen, wie es bei Hansske et al., (1974), oben, beschrieben ist. Die 3'-eingefangene Sequenz wird durch Spaltung der Linker-Gruppierung freigesetzt, während das Oligomer an dem Träger für orthogonale Linker, z. B. die Disilyoxy- und L2-Linker, gebunden wird. Der L1-Linker würde in dieser Situation nicht als orthogonaler Linker angesehen, da eine Oxidation der Ribonucleotid-Einfang-Gruppierung auch zu einer Oxidation des darin enthaltenen L1-ribo-Diol-Systems führen würde. Gegebenenfalls wird die Lösung mit freigesetztem Material direkt auf eine Baker-Phenyl-Kartusche aufgetragen, wie es von Horn et al., (1988), oben, beschrieben wurde.
  • Ein Beispiel für eine Oligonucleotid-Reinigung durch kombinierte Aldehyd-Einfang/DMT-Selektion unter Verwendung eines an einer abasischen Stelle 3'-spaltbaren Linkers ist in Schema 3 dargestellt. Schema 3A stellt die Herstellung eines Oligonucleotid-Produkts dar, das von dem festen Träger freigesetzt wurde und das eine 5'-O-DMT-Gruppe und eine 3'-abasische Stelle-p-ribocytidin-Gruppierung umfasst. Darüber hinaus enthält das Oligonucleotid eine zweite abasische Stelle, die, wie oben beschrieben wurde, für ein Resultat aus der Schutzgruppenentfernung von exozyklischen Aminen und Phosphatgruppen im Oligomer vor der Freisetzung vom festen Träger erläutert ist. Eine Ammoniumhydroxid-Schutzgruppenentfernungsbehandlung des Volllängen-Oligomers resultiert in mindestens den drei Spezies, die in Schema 3B gezeigt sind: (1) das vollständig von Schutzgruppen befreite intakte Volllängen-Oligomer, das eine 5'-O-DMT-Gruppierung und eine 3'-abasische Stelle-p-ribocytidin-Gruppierung (1) trägt; (2) eine Spezies, die eine 5'-O-DMT-Gruppierung und eine 3'-OH (3) hat; und (3) eine Spezies, die eine 5'-Phosphat-Gruppierung und eine 3'-abasische Stelle-pribocytidin-Gruppierung (4) hat.
  • Das Leiten einer Lösung, die die Spezies (1), (3) und (4) umfasst, über eine BP-Säule würde zur Retention der Spezies (1) und (3), die eine 5'-O-DMT-Gruppierung haben, an der Säule führen. Die dritte Spezies würde nicht zurückgehalten. Eine Periodatoxidation des ribo-Diol-Systems der Ribocytidin-Gruppierung der Spezies (1) und (3) führt zur Bildung einer Dialdehyd-Gruppierung in Spezies (1'). Wie in Schema 3C dargestellt ist, führt eine Behandlung der Spezies (1') und (3) mit einem Träger-gebundenen Hydrazid, z. B. CPG-Hydrazid, zum Einfangen nur von Spezies (1'), wodurch eine Reinigung eines Volllängen-Oligomers durch 5'- und 3'-Selektion erfolgt. Schema 3D stellt die Freisetzung des gereinigten Oligomers vom Einfangträger durch Abspaltung der abasischen Stelle dar. Ein zusätzlicher reverse phase-Säulenreinigungsschritt kann vor der Detritylierung des Oligomers durchgeführt werden.
  • Figure 00450001
    SCHEMA 3A
  • Figure 00460001
    SCHEMA 3B
  • Figure 00470001
    SCHEMA 3C
  • Figure 00480001
    SCHEMA 3D
  • Figure 00490001
    SCHEMA 4
  • Zusätzliche Schemata zur Reinigung von Oligonucleotiden – Zusätzliche 3'-Einfang-Schemata umfassen His6-Einfangen unter Verwendung von Ni-NTA durch Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Metall, d. h. CPG-Ni-NTA (siehe Schema 4), Amin-Einfangen unter Verwendung immobilisierter Gruppierungen, die mit primären Aminen reagieren, z. B. DITC oder Phenyl-NCS, Ribonucleotid-Einfangen unter Verwendung von immobilisierter Borsäure, Einfangen an einer Borsäuresäule, 3'-biotinyliertes Oligomer-Einfangen an einem Avidinderivatisierten, festen Träger, 3'-dinitrophenyliertes Oligomer-Einfangen an einem festen Träger, der einen Antikörper gegen Dinitrophenol trägt, und dergleichen.
  • Reinigung von Peptiden, Peptoiden und PNAs:
  • N-Terminus – Ein spezieller Linker für den N-Terminus von Peptiden, Peptoiden und PNAs, der in Verbindung mit einer geeigneten Reinigungsgruppierung verwendet werden kann, wie es z. B. bei Canne et al., (1997), Tetrahedron Letters, 38: 3361–3364, beschrieben ist. Der spezielle derivatisierte Aminoethylsulfonylethyloxycarbonyl-Griff wird mit einer Base gespalten. Er ist gegenüber starker Säure, einschließlich HF, stabil.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird Aminoethylthioethyloxycarbonyl ("AETEOC"; NH-(CH2)2-S-(CH2)2-O-CO-) mit einem Biopolymer an einer geeigneten Einfang-Gruppierung, wie sie oben beschrieben wurde, gebunden. AETEOC ist bei basischen Bedingungen stabiler als sein Sulfonyl-Gegenstück. Bei Behandlung mit Periodat wird AETEOC zu Aminoethylsulfoethyloxycarbonyl (-NH-(CH2)2-SO-(CH2)2-O-CO-) oxidiert, das gegenüber starker Säure, einschließlich HF, stabil ist und mit einer Base abgespalten werden kann.
  • C-Terminus – Peptide, Peptoide und PNAs können nach fachbekannten Verfahren so hergestellt werden, dass der C-Terminus eine Einfang-Gruppierung, z. B. eine Carboxyhydrazid-Gruppierung, eine -S-S-Verknüpfung, einen Cysteinrest oder dergleichen, beherbergt. Derartige C-Terminus-Einfang-Gruppierungen können verwendet werden, um das Biopolymer nach Verfahren zu reinigen, wie sie hierin offenbart werden und nachfolgend beispielhaft beschrieben werden.
  • Die vorliegende Erfindung führt ein einfaches Zwei-Kartuschen-Reinigungsverfahren durch, das die Bearbeitungszeit, die bei einer Routinereinigung von Oligomeren, insbesondere Oligonucleotiden, benötigt wird, drastisch reduziert und ein Oligomer mit einer Reinheit von über 95% für ein synthetisches 30-mer Oligonucleotid im 1 Mikromol-Maßstab ohne die Verwendung von Gelen und HPLC liefert. Das vereinfachte Verfahren eignet sich zur Automatisierung.
  • Es ist einzusehen, dass, obgleich die Erfindung in Verbindung mit den bevorzugten spezifischen Ausführungsformen derselben beschrieben wurde, die obige Beschreibung wie auch die folgenden Beispiele zur Erläuterung und nicht zur Beschränkung des Rahmens der Erfindung dienen sollen. Weitere Aspekte, Vorteile und Modifikationen innerhalb des Rahmens der Erfindung werden dem Fachmann auf dem Gebiet, das die Erfindung betrifft, einfallen.
  • Experimentelles:
  • Die vorliegende Erfindung wird in der Praxis herkömmliche Techniken der synthetischen organischen Chemie, Biochemie, Molekularbiologie und dergleichen, die im Rahmen des Fachwissens eines Fachmanns liegen, verwenden, wenn nichts anderes angegeben ist. Solche Techniken werden in der Literatur vollständig erläutert, siehe z. B. Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Herausg., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Haines et al., Herausg., 1984); und die Reihen Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
  • In den folgenden Beispielen wurden Anstrengungen unternommen, um die Genauigkeit bezüglich der verwendeten Zahlen (z. B. Mengen, Temperatur, usw.) sicherzustellen, allerdings müssen gewisse experimentelle Fehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Die Temperatur ist immer in Grad Celsius angegeben und, wenn nichts anderes angegeben ist, ist der Druck Atmosphärendruck oder in der Nähe von Atmosphärendruck.
  • Festphasen-Synthese:
  • Polynucleotide können unter Verwendung einer Kombination der direkten Festphasen-Oligonucleotid-Synthese, enzymatischer Ligationsverfahren und chemischer Lösungsphasensynthese zusammengebaut werden, wie es detailliert im US-Patent Nr. 5 710 264 von Urdea et al. beschrieben ist.
  • Alle chemischen Oligonucleotid-Synthesen können an einem automatischen DNA-Synthesizer (Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Modell 380B) durchgeführt werden. Die Phosphoramiditchemie des β-Cyanoethyltyps wurde eingesetzt, einschließlich einer 5'-Phosphorylierung, die PHOSTELTM-Reagens verwendet ((DMT-O-CH2CH2-(SO2)-CH2CH2-O-P (N(CH(CH3)CH2)2)-(-O-CH2CH2CN), worin DMT Dimethoxytrityl Isopropyl ist). Wenn nichts anderes angegeben ist, wurden die Standardprotokolle des Herstellers verwendet.
  • Herstellung von Einfang-Trägern:
  • Herstellung von CPG-Pr-NH-CO-(CH2)2-S-S-pyridin : CPG-(CH2)3-NH2 wurde wie von Horn, (1997), Nucleic Acids Research 25: 4835–4841), beschrieben, hergestellt. 2 g CPG-(CH2)3-NH2 wurden in DMF, das 200 mg 3,3'-Dithiodipropionsäure und 1,3-Diisopropylcarbodiimid (1 ml) enthielt, suspendiert und der Behälter wurde mit einen mechanischen Schüttler für 18 Stunden geschüttelt. CPG wurde in einen 100 ml-Trichter mit mittlerem Sinterfilter transferiert und mit 5 × 75 ml DMF, 5 × 75 ml Methanol gewaschen und an der Luft getrocknet. Der Träger, CPG-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-COOH wurde auf Amine (Ninhydrin) negativ getestet.
  • CPG-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-S-S-(CH2)2-COOH wurde mit 20 ml 0,1 M DTT in Maxim-Gilbert-Puffer behandelt und der Behälter wurde für 2 Stunden mit einem mechanischen Schüttler geschüttelt, um alle Disulfidbrücken zu reduzieren. Das CPG wurde ausgiebig mit 5 × 75 ml Maxim-Gilbert-Puffer, 5 × 75 ml Wasser, 5 × 75 ml Methanol gewaschen und an der Luft getrocknet. CPG-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-SH war bei einem Test auf Thiole mit Ellman's Reagens stark positiv.
  • CPG-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-SH wurde mit 20 ml 0,2 M Pyridin-S-S-pyridin in DMF behandelt und der Behälter wurde an einem mechanischen Schüttler für 2 Stunden geschüttelt. Das CPG wurde ausgiebig mit 5 × 75 ml DMF, 5 × 75 ml Methanol gewaschen und an der Luft getrocknet, wodurch CPG-(CH2)3-NH-CO-(CH2)2-S-S-pyridin ("CPG-SSPy") erhalten wurde.
  • Alternativ wurde der Einfang-Träger nach dem Verfahren von Hermanson et al., (1992), Immobilized Affinity Ligand Techniques (Academic Press, San Diego, CA), S. 274–279, hergestellt. Kurz gesagt, CPG-(CH2)3-NH2 (CPG Ing.; 5 g) wurde in 50 ml 1 M NaHCO3, das 5 g N-Acetylhomocystein-S-thiolacton enthielt, suspendiert und das CPG wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Der resultierende Träger wurde ausgiebig mit 50 mmol Triethylammoniumacetat, Wasser, Methanol, Acetonitril gewaschen und an der Luft getrocknet. Der CPG-SH-Träger enthielt 25 Mikromol/g an freien Amingruppen und 60 Mikromol/g Sulfhydryl-Gruppen.
  • Eine Aktivierung von CPG-SH erfolgte durch Behandlung von 3,5 g CPG-SH-Träger mit 30 ml 0,2 M 2,2'-Dipyridyldisulfid in N,N-Dimethylformamid (DMF) und das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur schütteln gelassen. Der aktivierte Träger wurde dann ausgiebig mit DMF, Methanol, Acetonitril gewaschen und an der Luft getrocknet.
  • Beispiel 1
  • Herstellung und Reinigung eines Oligomers mit einem freien 3'-OH
  • Oligomer-Synthese: Das Oligomer wurde an einem speziellen Träger, DMT-T-Si2-p-(CH2)3-SS-(CH2)3-O-Succ-NH-(CH2)3-CPG, synthetisiert. Am Schluss der Synthese wurde das endständige DMT abgetrennt. Vor der Entfernung des Oligomers vom Träger wurde das vom Träger getragene Oligomer mit 15% t-Butylamin in Acetonitril behandelt, um alle β-Cyanoethyl (BCE)-Phosphat-Schutzgruppen zu entfernen. Dies erfolgte, um eine mögliche Nebenreaktion von freigesetztem Acrylonitril mit Sulfhydryl- und Aminogruppen durch Michael-Addition (unter Beteiligung der Doppelbindung in Acrylonitril) zu vermeiden. Das Oligomer wurde dann vom festen Träger abgespalten und mit Ammoniumhydroxid bei 20°C und 55°C für 18 Stunden vollständig von Schutzgruppen befreit.
  • Reinigung: Das vollständig von Schutzgruppen befreite Oligomer wurde mit einem großen Überschuss an DTT in Maxim-Gilbert-Puffer für 1 Stunde behandelt. DTT und Maxim-Gilbert-Puffer wurden unter Verwendung einer reverse phase-Kartusche, Baker-Phenyl-SPE-Säule, enthaltend 500 mg Phenyl-derivatisiertes Siliziumdioxid, entfernt. Eine Elution mit 30% Methanol in 50 mmol Triethylammoniumacetat (30% McOH/TEAA) resultierte in einer unvollständigen Elution der Nicht-DMT-Oligomeren; 75% McOH/TEAA eluierte alle Nicht-DMT- und DMT-Oligomer-Spezies. Das 75% McOH/TEAA-Elutionsmittel wurde direkt auf den Einfang-Träger CPG-SSPy aufgebracht. Die Lösung (10 ml) wurde durch den Einfang-Träger perkolieren gelassen (über 30 Minuten); auf das Einfangen folgte UV, was anzeigte, dass das gesamte UV-Material am Einfang-Träger zurückgehalten wurde, während gleichzeitig Py-S-, das bei 350 nm absorbiert, freigesetzt wurde. Der Einfang-Träger wurde mit 75% McOH/TEAA (10 ml) und mit Maxim-Gilbert-Puffer (10 ml) gewaschen, wobei dieser durch den Einfang-Träger perkolieren gelassen wurde (über 30 Minuten). Die Maxim-Gilbert-Pufferwaschlösung wurde auf eine frische BP aufgetragen und oligomeres Material wurde wieder isoliert. Der Waschgang mit Maxim-Gilbert-Puffer entfernte alle Oligomere, in denen die 3'-Sulfhydryl-Einfang-Funktionalität fehlte, vollständig. Eingefangenes oligomeres Material wurde mit DTT/Maxim-Gilbert-Puffer (1 ml), der durch den Einfang-Träger perkolieren gelassen wurde (über 30 Minuten), entfernt. Die DTT/Maxim-Gilbert-Pufferlösung, die das freigesetzte oligomere Material enthielt, wurde mit Wasser (4 ml) verdünnt und es wurde 1 ml konzentriertes TEA/HF)3 zugesetzt und die Reaktion wurde für 2 Stunden ablaufen gelassen. Das Gemisch wurde direkt auf eine Oligonucleotid-Reinigungskartusche ("OPC") (ABI) aufgebracht und mit TEAA gewaschen. Eine Elution mit 30% McOH/TEAA entfernte Nicht-DMT-Oligomere vollständig und 75% McOH/TEAA eluierte das Produkt-Oligomer in reiner Form. Eine Einengung und Detritylierung lieferte das gereinigte Oligomer. Die Einfang-Effizienz wurde mit etwa 65% bestimmt.
  • Beispiel 2
  • Herstellung und Reinigung eines Oligomers mit einem 3'-Phosphat
  • Oligonucleotid-Synthese: Das Oligomer wurde an einem speziellen Träger, DMT-L1-p-(CH2)2-SS-(CH2)2-O-Succ-NH-(CH2)2-CPG, synthesiert. Am Ende der Synthese wurde das endständige DMT entfernt. Vor der Entfernung des Oligomer vom Träger wurde das am festen Träger gebundene Oligomer mit 15% t-Butylamin in Acetonitril behandelt, um alle BCE-Phosphat-Schutzgruppen zu entfernen; dies erfolgte, um eine mögliche Nebenreaktion von freigesetztem Acrylonitril mit Sulfhydryl und Aminogruppen durch Michael-Addition (die die Doppelbindung in Acrylonitril involviert) zu vermeiden. Das Oligomer wurde dann vom Träger abgespalten und mit Ammoniumhydroxid bei 20°C und 55°C für 18 Stunden vollständig von Schutzgruppen befreit.
  • Reinigung: Das vollständig von Schutzgruppen befreite Oligomer wurde mit einem großen Überschuss an DTT in Maxim-Gilbert-Puffer für 1 Stunde behandelt. DTT und Maxim-Gilbert-Puffer wurden unter Verwendung einer BP-reverse phase-Kartu-sche entfernt. Eine Elution mit 30% Methanol in 50 mmol Triethylammoniumacetat (30% McOH/TEAA) führte zu einer unvollständigen Elution von Nicht-DMT-Oligmeren; 75% McOH/TEAA eluierte alle Nicht-DMT- und DMT-Oligomer-Spezies. Das 75% McOH/TEAA-Elutionsmittel wurde direkt auf den Einfang-Träger CPG-SSPy aufgetragen. Die Lösung (10 ml) wurde durch den Einfang-Träger perkolieren gelassen (über 30 Minuten); auf das Einfangen folgte eine Bestrahlung mit UV, die anzeigte, dass das gesamte iN-Material an dem Einfang-Träger zurückgehalten worden war, während gleichzeitig Py-S-, das bei 350 nm absorbiert, freigesetzt wurde. Der Einfang-Träger wurde mit 75% McOH/TEAA (10 ml) und mit Maxim-Gilbert-Puffer (10 ml) gewaschen, die durch den Einfang-Träger perkolieren gelassen wurden (über 30 Minuten). Die Maxim-Gilbert-Pufferwaschlösung wurde auf eine frische BP aufgetragen und oligomeres Material wurde wieder isoliert. Der Waschgang mit Maxim-Gilbert-Puffer entfernte alle Oligomere, denen die 3'-Sulfhydryl-Einfang-Funktionalität fehlte, vollständig. (Eingefanges oligomeres Material konnte mit DTT/Maxim-Gilbert-Puffer (1 ml) freigesetzt werden, der durch den Einfang-Träger perkolieren gelassen wurde (über 10 Minuten); das freigesetzte oligomere Material konnte unter Verwendung einer BP-Säule wiedergewonnen werden.) Das eingefangene oligomere Material wurde in der 3'-Phosphatform durch ein Zweistufenverfahren vom Einfang-Träger freigesetzt. Eine Behandlung mit 1) Natriumperiodatlösung resultierte in der Oxidation des cis-Diol-Systems im CM1 des an den festen Träger gebundenen oligomeren Materials. Eine Freisetzung vom Einfang-Träger wurde mit 2) 20 mmol NaOH/Maxim-Gilbert-Puffer erreicht. Das Gemisch wurde direkt auf eine BP-Kartusche aufgetragen und mit TEAA gewaschen. Eine Elution mit 30% McOH/TEAA entfernte Nicht-DMT-Oligomere vollständig und 75% McOH/TEAA eluierte das Produkt Oligomer in reiner Form. Eine Einengung und Detritylierung lieferte das gereinigte Produkt. Die Einfang-Effizienz wurde mit etwa 65% bestimmt.
  • In einem alternativen Verfahren wurde das rohe, von Schutzgruppen befreite Oligomer mit DTT/MG behandelt, um die Bindung -S-S- zu spalöten und überschüssiges Reagens wurde unter Verwendung einer BP-Säule entfernt. Die Lösung, die das freie 3'-X-SH enthielt, wurde zur Trockne eingeengt und in Maxim-Gilbert-Puffer (1 ml) aufgelöst und direkt auf eine Säule aus CPB-Pr-SSPy (CPG Inc.) aufgebracht. Oligomer-Fragmente, denen die 3'-Sulfhydryl-Gruppe fehlte, wurden durch Waschen mit TEAA enthaltendem Methanol entfernt. Das Produkt Oligomer wurde freigesetzt und isoliert, wie es oben beschrieben wurde. Die Einfang-Effizienz war etwa 33%.
  • Beispiel 3
  • Herstellung und Reinigung eines Polypeptids das ein C-terminales Carboxyhydrazid und ein N-terminales Fmoc hat
  • Polypeptidsynthese: Das Oligomer wurde an einem (HN2-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymerträger des Wang-Typs synthetisiert. Eine Verlängerung des Polypeptids wird unter Verwendung von Monomereinheiten mit der Struktur Fmoc-NH-aa(benzyl)-COOH erreicht, worin "aa(benzyl)" eine Aminosäure mit einer Benzyl-Seitenkettenschutzgruppe ist. Das fertige immobilisierte Oligopeptid hatte die Struktur Fmoc-NH-[aa(benzyl)-CO]n-NH-aa1(benzyl)-CO-NH-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymer. Eine Standardschutzgruppenentfernung mit Säure führt zur Entfernung von Benzyl-Seitenkettengruppen und Freisetzung des Oligopeptids in partiell geschützter Form: Fmoc-NH-peptid-CO-NH-NH2.
  • Reinigung: Das partiell von Schutzgruppen befreite Oligopeptid wird an einem Einfang-Träger eingefangen, der Aldehyd-Gruppierungen trägt, wie es oben beschrieben wurde, um so ein Fmoc-NH-peptid-CO-NH-N=CH-Träger zu erhalten. Die Freisetzung von gebundenem Oligopeptid vom Einfang-Träger in derselben Form wie gebunden wird durch Abspaltung von CO-NH-N= über Austausch mit Formaldehyd (Teitelbaum, (1958), J. Org. Chem., 23: 646– 647) erreicht. Alternativ wird die freie Säureform des gebundenen Oligopeptids durch direkte Oxidation und Hydrolyse freigesetzt (Barton et al., (1972), J. Chem. Soc., Perkins Trans. I, 1972: 929).
  • Indem das partiell von Schutzgruppen befreite Oligopeptid, das vom Einfang-Träger freigesetzt wurde, über eine hydrophobe Chromatographiesäule geleitet wurde, wurde eine Retention der Fmoc-tragenden Spezies erreicht. Die Fmoc-Gruppe wird dann durch Behandlung mit einer Base entfernt und CO-NH-NH2 wird durch Oxidation und Hydrolyse (Teitelbaum, oben) entfernt, wenn es nicht bereits in der Carboxylatform vorliegt.
  • Beispiel 4
  • Herstellung und Reinigung eines Polypeptids das ein C-terminales Carboxyhydrazid und eine N-terminale Einfang-Gruppierung hat
  • Polypeptidsynthese: Das Oligomer wurde an einem (H2N-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymerträger des Wang-Typs synthetisiert. Eine Ausdehnung des Polypeptids wurde unter Verwendung von Monomereinheiten mit der Struktur Fmoc-NH-aa(benzyl)-COOH, wie oben in Beispiel 3 beschrieben, erreicht. Das fertige immobilisierte Oligopeptid hat die Struktur Fmoc-NH-[aa(ben-zyl)-CO]n-NH-aa,(benzyl)-CO-NH-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymer. Zusätzliche Syntheseverfahren sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und werden verwendet, um einen speziellen Linker, wenn erforderlich, und eine Einfang-Gruppierung ("CM") anzufügen, um so CM-NH-(CH2)2-S-(CH2)2-O-peptid-CO-NH-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymer zu erhalten. Standardverfahren mit Säure zur Entfernung von Schutzgruppen führt zur Entfernung von Benzyl-Seitenkettengruppen und zur Freisetzung des Oligopeptids in partiell geschützter Form: CM-NH-(CH2)2-S-(CH2)2-O-peptid-CO-NH-NH2.
  • Reinigung: Das partiell geschützte Oligopeptid wird an einem Einfang-Träger, der Aldehyd-Gruppierungen trägt, wie oben beschrieben eingefangen, um einen CM-NH-(CH2)2-S-(CH2)2-O-pep-tid-CO-NH-NH2-Träger zu erhalten. Die Freisetzung des gebundenen Oligopeptids vom Einfang-Träger in derselben Form wie gebunden wird durch Spaltung von CO-NH-N= über Austausch mit Formaldehyd erreicht (Teitelbaum, oben). Alternativ wird die freie Säureform des gebundenen Oligopeptids durch direkte Oxidation und Hydrolyse freigesetzt (Barton et al., oben).
  • Das partiell geschützte Oligopeptid, das die Einfang-Grup-pierung, die vom Einfang-Träger losgelöst ist, trägt, wird unter Verwendung eines Trägermediums eingefangen, welches eine Gruppierung trägt, mit der die Einfang-Gruppierung in spezifischer Weise wechselwirkt, wenn zum Beispiel die Einfang-Gruppierung Biotin ist, wird der feste Träger eine Avidin-Gruppierung tragen, wenn die Einfang-Gruppierung His6 ist, wird der feste Träger eine Ni-NTA-Gruppierung oder dergleichen tragen. Eine Freisetzung vom Einfang-Träger unter Erzielung des gereinigten Oligopeptids wird durch Oxidation mit anschließender Basenbehandlung erreicht.
  • Beispiel 5
  • Herstellung und Reinigung eines Polypeptids das ein C-terminales Sulfhydryl und ein N terminales Fmoc hat
  • Polypeptidsynthese: Das Oligomer wird an einem Fmoc-NH-CH(COOR)-CH2-S-S-R-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymerträger des Wang-Typs synthetisiert. Eine Ausdehnung des Polypeptids wird unter Verwendung von Monomereinheiten mit der Struktur Fmoc-NH-aa(benzyl)-COOH, wie es oben in Beispiel 3 beschrieben ist, durchgeführt, wobei das Fmoc-NH-peptid-CO-NH-CH(COOR)-CH2-S-S-R-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymer erhalten wird. Eine Entfernung der Schutzgruppen des gebundenen Polypeptids liefert Fmoc-NHpeptid-CO-NH-CH(COOR)-CH2-S-S-R-NH2. Eine Behandlung mit einem Reduktionsmittel, wie zum Beispiel Dithiothreitol, ergibt Fmoc-NH-peptid-CO-NH-CH(COOR)-CH2-SH.
  • Reinigung: Das partiell von Schutzgruppen befreite Oligopeptid wird an einem Einfang-Träger-S-S-pyridin wie oben beschrieben eingefangen, um den Fmoc-NH-peptid-CO-NH-CH(COOR)-CH2-S-S-Einfang-Träger zu erhalten. Eine Freisetzung des gebundenen Oligopeptids vom Einfang-Träger wird durch Behandlung mit DTT erreicht, wobei Fmoc NH-peptid-CO-NH-CH(COOR)-CH2-SH erhalten wird.
  • Ein Leiten des partiell geschützten Oligopeptids, das vom Einfang-Träger freigesetzt wurde, über eine hydrophobe Chromatographiesäule, führt zur Retention der Fmoc-tragenden Spezies. Die Fmoc-Gruppe wird dann durch Behandlung mit Base entfernt.
  • Alternativ wird ein Monomer mit der Struktur Fmoc-NH-CH(CH2-S-CH2-φ)-COOH als erster Rest an den festen Träger gebunden. Nach Peptidzusammenbau und Entfernung der Schutzgruppen kann das resultierende Fmoc-NH-peptid-CO-NH-CH(COOR)-CH2-SH eingefangen werden und, wie oben beschrieben, freigesetzt werden.
  • Beispiel 6
  • Herstellung und Reiniung eines Peptoids das ein C-terminales Carboxyhydrazid und eine N terminale Einfang-Gruppierung hat
  • Submonomer-Peptoidsynthese: Das Oligopeptid wird an einem HN2-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymerträger des Wang-Typs synthetisiert. Eine Ausdehnung des Oligopeptoids unter Verwendung von Monomereinheiten Br-CH2-COOH und R1-NH2 wird durchgeführt, wie es bei Zuckermann et al., (1992), J. Am. Chem. Soc., 114: 10646–10647, beschrieben ist, worin R einen Seitenkettensubstituenten darstellt. Das fertige immobilisierte Oligopeptoid hat die Struktur R(n+1)-NHCH-CO-[N(Rn)-CO]nNH-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymer. Zusätzliche Syntheseverfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, werden verwendet, um einen speziellen Linker, wenn erforderlich, und eine Einfang-Gruppierung ("CM") anzufügen, wobei CM-NH-(CH2)2-S-(CH2)2-O-CO-N(Rn+1)-CO-[N(Rn)-CO]n-NH-NH-CO-O-C(CH3)2-(CH2)2-φ-Polymer erhalten wird. Eine Spaltung des rohen Gemisches in Form von CM-NH-(CH2)2-S-(CH2)2-O-CO-peptoid-CO-NH-NH2 wird, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt.
  • Reinigung: CM-NH-(CH2)2-S-(CH2)2-O-CO-peptoid-CO-NH-NH2 wird an einem Einfang-Träger, der eine Aldehyd-Gruppierung trägt, eingefangen, wodurch CM-NH-(CH2)2-S-(CH2)2-O-CO-peptid-CO-NH-N=CH-Einfang-Träger erhalten wird. Eine Freisetzung des gebundenen Oligopeptids vom Einfang-Träger in derselben Form wie gebunden wird durch Spaltung von CO-NH-N= über Austausch mit Formaldehyd erreicht (Teitelbaum, oben). Alternativ wird die freie Säureform des gebundenen Oligopeptids durch direkte Oxidation und Hydrolyse (Barton et al., oben), wie es in Beispiel 3 beschrieben ist, freigesetzt.
  • Das partiell geschützte Oligopeptoid, das die Einfang-Gruppierung trägt, welche vom Einfang-Träger freigesetzt wurde, wird unter Verwendung hydrophober Chromatographie, wenn CM zum Beispiel Fmoc ist, oder unter Verwendung eines Trägermediums, das eine Gruppierung trägt, mit welcher die Einfang-Gruppierung in spezifischer Weise wechselwirken kann, eingefangen; wenn zum Beispiel CM Biotin ist, wird der feste Träger eine Avidin-Gruppierung tragen, wenn CM His6 ist, wird der feste Träger eine Ni-NTA-Gruppierung tragen, oder dergleichen. Eine Freisetzung vom Einfang-Träger unter Erhalt des gereinigten Oligopeptids wird durch Oxidation mit nachfolgender Behandlung mit Base erreicht.

Claims (16)

  1. Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Oligomersegments von Interesse, umfassend: (a) Bereitstellen eines Träger-gebundenen Oligomers, das eine erste selektierbar spaltbare Bindung, eine zweite selektierbar spaltbare Bindung und eine dritte selektierbar spaltbare Bindung hat, wobei das Oligomersegment von Interesse von der zweiten und dritten selektierbar spaltbaren Bindung flankiert wird und wobei eine erste Einfanggruppierung am freien Ende des Oligomers vorliegt und eine zweite Einfanggruppierung zwischen der ersten und dritten selektierbar spaltbaren Bindung vorliegt; (b) Spalten der ersten selektierbar spaltbaren Bindung unter Freisetzung des Oligomers vom Träger; (c) Inkubieren des freigesetzten Oligomers mit einem ersten Einfangmedium, das das freigesetzte Oligomer durch Bindung an die erste Einfanggruppierung selektiv zurückhält, wodurch ein erster Einfangmedium-Oligomer-Komplex gebildet wird; (d) Spalten der zweiten selektierbar spaltbaren Bindung; (e) Inkubieren des oligomeren Produktes von Stufe (d) mit einem zweiten Einfangmedium, das selektiv an die zweite Einfanggruppierung bindet, unter Bildung eines zweiten Einfangmedium-Oligomer-Komplexes; und (f) Spalten der dritten selektierbar spaltbaren Bindung unter Bereitstellung des Oligomersegments von Interesse in gereinigter Form.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligomer ein Oligonukleotid ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligomer ein Oligopeptid ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Oligomer ein Oligosaccharid ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das erste Einfangmedium und das zweite Einfangmedium unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Reverse-Phase-Chromatographiemedium, einem hydrophoben Wechselwirkungschromatographiemedium und Kombinationen davon, ausgewählt wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erste Einfanggruppierung ein 5'-Thiol oder ein 5'-Dialdehyd umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zweite Einfanggruppierung ein 5'-Thiol oder ein 5'-Dialdehyd umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die dritte selektierbar spaltbare Bindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus : (a) N4-(DMT-O-R5)-2',3'-O-Benzoyl-riboNu1, worin R5 Niedrigalkylen, Arylen, Aralkylen oder Alkarylen ist und riboNu1 für 5'-Riboadenin, 5'-Ribothymidin, 5'-Riboguanin, 5'-Ribocytidin oder 5'-Ribouridin steht, (b) -O-R6-O-Si(R7)(R8)-O-Si(R9)(R10)-5'-O, worin R6, R7, R8, R9, R10 unabhängig voneinander Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl, oder Alkaryl sind, und (c) eine abasische Stelle mit der folgenden Strukturformel:
    Figure 00610001
    worin: CP2 eine 5'-terminate Einfanggruppierung ist und R aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus 2-Nitrobenzyl, 4-Penten-1-yl, -CH2CH2Sφ, -CH2CH2Si(CH3)3, -P(O)O– 2, -CH2CH2-C6H4-NO2, und
    Figure 00620001
    besteht, worin R' Wasserstoff, Aryl oder Aralkyl ist, die Reste Ri, gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe bestehend aus Amino, Nitro, Halogen, Hydroxyl, Niedrigalkyl und Niedrigalkoxy, ausgewählt werden und die Reste Rj gleich oder unterschiedlich sind und aus der Gruppe bestehend aus Amino, Nitro, Halogen, Hydroxyl, Niedrigalkyl und Niedrigalkoxy ausgewählt werden, i 0, 1, 2 oder 3 ist und j 0, 1, 2, 3 oder 4 ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die dritte selektierbar spaltbare Bindung -O-R6-O-Si(R7)(R8)-O-Si(R9)(R10)-5'-O ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die dritte selektierbar spaltbare Bindung -O-(CH2)2-O-Si(CH(CH3)2)2-O-Si(CH(CH3)2)2-5'-O ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zweite selektierbar spaltbare Bindung aus der Gruppe, bestehend aus N4-(Phosphoryl-6-oxyhexyl)cytidin, 2',3'-Isopropylidin-N4-(phos phoryl-6-oxyhexyl)cytidin, -P-O-Alkylen-S-alkylen-O-p-, Nu2-R11-O-p-NH-R12, Allylphosphat-Linker, -Nu2-3'-O-Si(R13)(R14)-O-Si(R15)(R16)-O-, -Nu2-O-Si(R18)(R19)-2-O-, Nu2-O-Si(R21)(R22)-R23-Si(R24)(R25)-O-, 2'-O-PG-Ribonucleotid, Nu2-O-R27S-, Nu2-O-R29-O-R30(NO2) und Nu2-O-p-O-R31-NH(Allyloxycarbonyl)-O- ausgewählt wird, worin Nu2 das terminale 3'-Nukleotid des Oligomers ist, R11 ein Nukleosid ist, R12, R13, R14, R15, R16, R18, R19, R21, R22, R23, R24, R25, R27 unabhängig voneinander Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl sind, R29 und R31 Niedrigalkyl sind und R30 Aryl, Aralkyl oder Alkaryl ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zweite selektierbar spaltbare Bindung aus der Gruppe bestehend aus N4-(Phosphoryl-6-oxyhexyl)cytidin, 2',3'-Isopropylidin-N4-(phosphoryl-6-oxyhexyl)cytidin, -P-O-Alkylen1-S-alkylen2-O-p-, worin mindestens eines von Alkylen1 und Alkylen2 Ethylen ist, R11-O-p-NH-R12, worin R11 ein Nukleosid ist und R12 Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl ist, Allylphosphat-Linkern, -Nu2-3'-O-Si(R13)(R14)-O-Si(R15)(R16)-O-R17, worin Nu2 das terminale 3'-Nukleotid des Oligomers ist, R13, R14, R15 und R16 unabhängig voneinander Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl sind, und R17 eine Einfanggruppierung ist, -Nu2O-Si(R18)(R19)-2-O-R20, worin Nu2 wie oben definiert ist, R18 und R19 unabhängig voneinander Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl sind und R20 eine Einfanggruppierung ist, Nu2-O-Si(R21)(R23)-Si(R24)(R25)-O-R26, worin Nu2 das terminale 3'-Nukleotid des Oligomers ist, R21, R22, R23, R23 und R25 unabhängig voneinander Niedrigalkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl sind und R26 eine Einfanggruppierung ist, 2'-O-PG-Ribonukleotid, worin PG t-Butyl-dimethyl-silyl, Phosphat, 1-Methoxycyclohexylether, Methylthiomethylether, Siloxymethylether ist, Nu2-O-R27S-R28, worin Nu2 das terminale 3'-Nukleotid des Oligomers ist, R27 Niedrigalkyl, Aryl, Aralky oder Alkaryl ist und R28 eine Einfanggruppierung ist, Nu2-O-R29-O-R30 (NO2), worin Nu2 das terminale 3'-Nukleotid des Oligomers ist, R29 Niedrigalkyl ist und R30 Aryl, Aralkyl oder Alkaryl ist, Linker, die von Alkyldiolaminen abgeleitet sind, wobei das Derivat die Formel Nu2-O-p-O-R31-(NH(Allyloxycarbonyl)-O- hat, worin Nu2 das terminale 3'-Nukleotid des Oligomers ist, R31 Niedrigalkyl ist, und selektierbar spaltbaren abasischen Stellen mit der Formel:
    Figure 00640001
    worin R aus der Gruppe bestehend aus 2-Nitrobenzyl, 4-Penten-1-yl, -CH2CH2Sφ, -CH2CH2Si(CH3)3, -P(O)O– 2, -CH2CH2-C6H4-NO2 und
    Figure 00640002
    ausgewählt wird, worin R' Wasserstoff, Aryl oder Aralkyl ist, die Reste R1 gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe bestehend aus Amino, Nitro, Halogen, Hydroxyl, Niedrigalkyl und Niedrigalkoxy ausgewählt werden, die Reste Rj gleich oder unterschiedlich sein können und aus der Gruppe bestehend aus Amino, Nitro, Halogen, Hydroxyl, Niedrigalkyl und Niedrigalkoxy ausgewählt werden, i 0, 1, 2 oder 3 ist und j 0, 1, 2, 3 oder 4 ist, ausgewählt wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die erste Einfanggruppierung aus der Gruppe bestehend aus einer 3'-Thiolgruppierung, einer 3'-Bromacetylgruppierung einer 3'-Malimidogruppierung, einer 3'-Dialdehydgruppierung, einer Hydrazidgruppierung, einer (6-Histaminylpurin)6-Gruppierung, einer Diolgruppierung, einer Dinitrophenylgruppierung und einer Diels-Alder-Gruppierung, ausgewählt wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zweite Einfanggruppierung aus der Gruppe bestehend aus einer 3'-Thiolgruppierung, einer 3'-Bromacetylgruppierung, einer 3'-Malimidogruppierung, einer 3'-Dialdehydgruppierung, einer Hydrazidgruppierung, einer (6-Histaminylpurin)6-Gruppierung, einer Diolgruppierung, einer Dinitrophenylgruppierung und einer Diels-Alder-Gruppierung, ausgewählt wird.
  15. Träger-gebundenes Oligomer mit der Strukturformel (I): (I) S-[X1]n1-SC1-CP2-[x2]n2-SC3-T1-X-T2-SC2-CP1 worin T1 und T2 einen ersten bzw. zweiten Oligomer-Terminus darstellen; S einen festen Träger darstellt; X ein Oligomersegment von Interesse darstellt; X1 und X2 monomere oder oligomere Segmente sind; n1 und n2 unabhängig voneinander 0 oder 1 sind; SC1 eine erste selektierbar spaltbare Bindung darstellt; SC2 eine zweite selektierbar spaltbare Bindung darstellt; SC3 eine dritte selektierbar spaltbare Bindung darstellt; CP1 eine erste Einfanggruppierung darstellt und CP2 eine zweite Einfanggruppierung darstellt.
  16. Träger-gebundenes Oligomer nach Anspruch 15, wobei das Oligomer ein Oligonukleotid ist und wobei: T1 und T2 der 3'- bzw. 5'-Terminus sind; CP1 eine 5'-terminale Einfanggruppierung darstellt; SC2 einen 5'-spaltbaren Linker darstellt; SC3 einen 3'-spaltbaren Linker darstellt; CP2 eine 3'-Einfanggruppierung darstellt; SC1 eine Synthesefreisetzungsgruppierung darstellt; und S einen festen Syntheseträger darstellt.
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