JP2002525288A - ２重末端選択を用いるオリゴマーの精製 - Google Patents

２重末端選択を用いるオリゴマーの精製

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Abstract

(57)【要約】 オリゴマーは、第１の選択的に切断可能な結合、第１の捕捉部分および第２の選択的に切断可能な結合を通じて支持体に結合された成長する鎖に、モノマーを連続的に付加することによって、エラー配列が実質的にないように調製される。モノマー付加の完了時に、完成したオリゴマーは、支持体から第１の捕捉部分を示すために切断され、そして第２の捕捉部分（例えば、末端保護基）および第１の捕捉部分の存在によって精製される。構造式（Ｉ）Ｓ−［Ｘ１］n1−ＳＣ１−ＣＰ２−［Ｘ２］n2−ＳＣ３−Ｔ1−Ｘ−Ｔ2−ＳＣ２−ＣＰ１を有する、支持体結合オリゴマーもまた、提供される。ここで、Ｔ1、Ｔ2、Ｘ１、Ｘ２、ｎ１、ｎ２、ＳＣ１、ＳＣ２、ＳＣ３、ＣＰ１、およびＣＰ２は、本明細書中で定義されるとおりである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に生体高分子の分野に関し、そしてより具体的には、オリゴヌ
クレオチド、オリゴペプチド、オリゴサッカリドなどのようなオリゴマーの精製
に関する。
【０００２】 （背景技術） ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）プライマーとして、またはＳａｎｇｅｒ
（すなわちジデオキシ）配列決定における配列決定プライマーとして、核酸ハイ
ブリダイゼーションアッセイにおける使用のためのポリヌクレオチドに対する増
加した要求が存在する。調査目的の大量のオリゴヌクレオチドの合成および精製
は、慣用的に、９５％より高い純度を有する生成物を生じるが、この高い純度は
、長期にわたる、時間のかかる、そして労働集約な精製プロトコルを必要とする
。代表的に、０．２マイクロモルスケールの調製は、７工程の精製手順を必要と
する：１）精製ゲルを調製する工程；２）ゲルを精製されるべき反応混合物でロ
ードする工程、ｉｉｉ）このゲルを一晩作動させる工程；４）このゲルから適切
なバンドを可視化し、そして切り出す工程；５）このバンドを２日間溶出緩衝液
に浸漬して、ゲルマトリクスから所望の生成物を抽出する工程；６）抽出した生
成物を逆相（「ＲＰ」）カラム上で手動で脱塩し、そして溶媒を乾燥する工程；
および７）この生成物をこの溶媒から手動で沈澱させる工程。得られる生成物の
量は、ＵＶ分光計を使用して定量される。
【０００３】 これらの長期にわたる、時間のかかる、そして労働集約な精製プロトコルのい
ずれかの単純化は、非常に価値がある。さらに、オリゴヌクレオチド以外のオリ
ゴマーに対して自動化および適用される精製スキームも同様に望ましい。
【０００４】 （ＤＮＡオリゴマーの精製を単純化するための初期のアプローチ） オリゴヌクレオチド合成のプロセスの間、脱プリン化部位は、酸に対する長期
の曝露によって生じるランダム部位で導入される；最終の水酸化アンモニウム脱
保護工程は、脱プリン化部位でオリゴヌクレオチド鎖を切断する。ＭｃＨｕｇｈ
ら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３：１６６
４〜１６７０。ＤＮＡの精製を単純化するために考案された方法（例えば、Ｅｆ
ｃａｖｉｔｃｈら（１９８５）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ ４：２６７およびＭｃＢｒｉｄｅら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ ６：３６２〜３６７による）は、より短いＤＮＡオリゴマーを精製し得
るのみであった。なぜなら、彼らは、水酸化アンモニウム切断生成物の複雑な性
質を十分に考慮しなかったからである。
【０００５】 酵素的な精製スキームは、オリゴマーがまず固体支持体上で合成されることを
報告してきた。Ｕｒｄｅａら（１９８６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．
２７：２９３３〜２９３６。固体支持体に結合した所望の長さのオリゴヌクレオ
チドの調製に続き、オリゴマー中の環外のアミンおよびホスフェート基は、この
支持体への結合を切断することなく脱保護される。精製は、全長オリゴマー生成
物の末端５’ベンゾイル基を含まない欠損配列を消化するために脾臓ホスホジエ
ステラーゼを使用した。このプロセスによって改善された純度のオリゴマーを生
じるが、生成物オリゴマー中の無塩基部位は、残存した。
【０００６】 迅速なカートリッジ方法はまた、Ｈｏｒｎら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１１５５９〜１１５７１によって記載されている。こ
の手順の重要な工程は、固体支持体からの粗生成物の除去の前に、水性リジンの
溶液を用いてオリゴマー中の全てのアプリン部位を切断することである。結果と
して、本質的に全ての短縮型５’−Ｏ−ジメトキシトリチル（「ＤＭＩ」）−含
有オリゴマーは、切断されたオリゴマーの混合物から除去される。著者らは、１
１８塩基長までのＤＮＡオリゴマーがこの手順を使用してほぼ均質に精製された
ことを報告する。
【０００７】 Ｈｏｒｎら（１９８８）に記載されるアプローチに関連するアプローチは、ジ
シリルオキシ結合を有する固体支持体を使用する。非常に緩和な条件下でのオリ
ゴマー中の無塩基部位の切断は、このオリゴマーがなおこの支持体に付着される
とき、全ての５’−Ｏ−ＤＭＴ含有分子を確保し、この支持体から切断される場
合に、３’−末端および５’−末端を補正した。Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉら（１
９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：４６３２〜４６３８。
【０００８】 Ｎａｔｔら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５３：９６２９〜９６３６
は、合成の間に欠損配列をキャップ化するために脂肪親和性キャップ化試薬を使
用するオリゴマー精製に対するアプローチを記載する。欠損配列の脂肪親和性の
性質は、この配列を、クロマトグラフィー的に脱トリチル化全長オリゴマーから
キャップ化欠損配列を分離することを可能にする。しかし、この方法は、２つの
ファミリーの種（すなわち、脱トリチル化５’セグメントおよび脱トリチル化３
’セグメント）が脂肪親和性キャップ基を含まないので、脱プリン化した／切断
した配列に関して非効率的である。５’−Ｏ−保護基としての脂肪親和性特性を
増強されたトリチル基の使用は、ＲＰ−高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬ
Ｃ」）精製を容易にするために提唱される。Ｒａｍａｇｅ（１９９３）Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：７１３３〜７１３６。上記のアプローチを用
いて、このプロセスはまた、切断された無塩基部位に関して限定される。
【０００９】 「捕捉」工程を包含する精製アプローチが提案されている。各々の場合におい
て、精製されるべきオリゴマーの５’末端は、捕捉が影響を与え得る部分を保有
する。例えば、Ｂａｎｎｗａｒｔｈら（１９９０）、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃ
ｔａ ７３：１１３９〜１１４は、捕捉工程を含む、オリゴデオキシヌクレオチ
ドのための組合せの精製／リン酸化手順を記載した。特定のリボヌクレオチドで
あるＮ’−（ＭＭＴ−Ｓ−（ＣＨ2）10）−２’，３’−Ｂｚ2−ｒＵ−５’−β
−シアノエチル（ここで、「ＭＭＴ」は、モノメトキシトリチルを表し、そして
「Ｂｚ」は、ベンジルを表す）（保護されたチオールおよびジオール系を含む）
を、最終のＤＮＡ合成サイクルの間にオリゴヌクレオチドへ組み込んだ。脱保護
を完了し、そしてＭＭＴ保護基を除去した後、５’−ＳＨ基を有するオリゴマー
を、表面結合−Ｓ−Ｓ−ピリジン基を有する制御された細孔ガラス（「ＣＰＧ」
）支持体上で捕捉し得る；夾雑したオリゴマーを、洗浄によって除去した。精製
オリゴマーを、リボ−ジオール系の酸化的切断および塩基性条件下でのβ脱離の
後に、捕捉支持体から放出させた。
【００１０】 感光性５’−ビオチン試薬を使用してアビジン捕捉支持体上でオリゴマーを捕
捉するための精製手順もまた、記載されている。Ｏｌｅｊｎｉｋら（１９９６）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３６１〜３６６。連結
基は、５’−ホスフェート形態において生成物オリゴマーを放出するための光分
解によって切断され得る。
【００１１】 ５’−メルカプトアルキル化オリゴヌクレオチド合成および精製は、チオール
化オリゴマーが活性化スルフヒドリル支持体を使用する単一工程の共有的クロマ
トグラフィー手順によって精製されたことを記載している。Ｋｕｍｅｒら（１９
９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：６８３〜６８８。
【００１２】 さらに、６つの保存的ヒスチジン残基からなるアフィニティータグを用いる、
ニッケル−ニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）固体支持体の固有の選択性の
利点によるタンパク質の精製は、何年もの間公知である。この型の固定化金属ア
フィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ」）は、オリゴヒスチジン−ＰＮＡ
キメラ（ＰＮＡおよびペプチドアセンブリの化学は、本質的に同一である）を使
用するペプチド核酸（「ＰＮＡ」）制御化ハイブリッド選択による核酸の配列特
異的な単離のために使用されてきた。Ｏｒｕｍら（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ １９：４７２〜４８０。この系は、６つの保存的６−ヒスタミニル
プリン（「Ｈｉｓ」）ヌクレオチドを含む合成ＤＮＡオリゴマーに拡張され、変
換可能なヌクレオチドホスホロアミダイトを使用して導入され、そしてＨｉｓヌ
クレオチドを形成するためにさらに誘導体化されてきた。Ｍｉｎら（１９９６）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３８０６〜３８１０。
Ｈｉｓ6−タグ化鎖は、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロースクロマトグラフィーマトリク
スおよび捕捉されたＤＮＡによって選択的に保持され、その後樹脂から溶出され
た。
【００１３】 （技術の概要） 一般にオリゴヌクレオチドを合成するための方法に関するバックグラウンドの
参考文献には、β−シアノエチルホスフェート保護基の使用に基づく５’〜３’
合成に関連する参考文献（例えば、ｄｅ Ｎａｐｏｌｉら（１９８４）Ｇａｚｚ
．Ｃｈｅｍ．Ｉｔａｌ．１１４：６５、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら（１９８３）Ｔｅ
ｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２４：１６９１、Ｂｅｌａｇａｊｅら（１９７
７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６２９５）、ならびに液相５’〜３
’合成を記載する参考文献（例えば、Ｈａｙａｔｓｕら（１９５７）Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８９：３８８０、Ｇａｉｔら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．４：１１３５、Ｃｒａｍｅｒら（１９６８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．７：４７３、およびＢｌａｃｋｂｕｒｎら（１９
６７）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐａｒｔ Ｃ、２４３８）が挙げられる。
【００１４】 上記に列挙した技術に加えて、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（１９８１）Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５〜３１９１は、オリゴヌクレオチドの調製
の際のホスホコロリダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅ）の使用を記
載する。Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．
２２：１８５９〜１８６２および米国特許第４，４１５，７３２号は、オリゴヌ
クレオチドの調製の際のホスホロアミダイトの使用を記載する。Ｓｍｉｔｈら（
１９８３）ＡＢＬ １５〜２４、そこに引用される参考文献およびＷａｒｎｅｒ
ら（１９８４）ＤＮＡ ３：４０１〜４１１は、自動化固相オリゴデオキシリボ
ヌクレオチド合成を記載する。
【００１５】 Ｕｒｄｅａらの米国特許第４，４８３，９６４号および同第４，５１７，３３
８号は、管状反応領域において固相基材に試薬を選択的に導入することによって
ポリヌクレオチドを合成する方法を記載する。Ｈｏｒｎらの米国特許第４，９１
０，３００号はまた、ヌクレオチドモノマーを成長する鎖に連続的に付加するこ
とによってオリゴヌクレオチドを合成する方法を記載するが、予め決定された空
間の離れた位置で、標識されたＮ4−改変シトシン残基の組込みを含む。Ｈｏｒ
ｎらの米国特許第５，２５６，５４９号は、組合せ技術、すなわち所望のオリゴ
ヌクレオチドが本質的に合成され、そして同時に「精製され」、その結果、最終
生成物が実質的に純粋な形態で生成される技術を包含する、オリゴヌクレオチド
を調製する方法を記載する。
【００１６】 Ｈｏｒｎら（１９８６）ＤＮＡ ５（５）：４２１〜４２５は、ビス（シアノ
エトキシ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノホスフィンを使用する、固体に支
持されたＤＮＡフラグメントのリン酸化を記載する。また、Ｈｏｒｎら（１９８
６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２７：４７０５〜４７０８を参照のこ
と。
【００１７】 Ｈｏｒｎｅら（１９９０）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１２：２４３５〜
２４３７およびＦｒｏｅｈｌｅｒ（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１
：１６０３〜１６０９は、オリゴヌクレオチド指向型三重らせん形成に関する。
【００１８】 Ｕｒｄｅａらの米国特許第５，５９４，１１７号および同第５，４３０，１３
６号は、無塩基部位、選択的には切断可能部位を含むオリゴヌクレオチドを合成
するための方法および試薬（例えば、改変モノマー試薬）を開示する。このよう
な部位を有するように調製されたオリゴヌクレオチドは、光分解によってか、ま
たは化学的もしくは酵素的試薬（例えば、還元剤）によって選択的に切断可能で
ある。
【００１９】 オリゴサッカリドの生成方法は、同様に公知である。例えば、Ｋａｎｉｅら（
１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：６７４〜６８１
およびＤｉｎｇら（１９９５）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３７６：２
６１〜２６９は、オリゴサッカリドの化学的合成を記載する。規定された構造の
サッカリドオリゴマーを合成するために、直交性の保護基が、成長するオリゴサ
ッカリド鎖に連続的に付加されるモノサッカリドのヒドロキシル部分に提供され
る。アセチルおよびベンジル保護基は、一般に使用される。サッカリド部分はア
クセプターになり得、従って、ヒドロキシル水素の代わりに、例えばｐ−ｓ−φ
−ＣＨ3（ｐ−メチルフェニルチオ）、−（ＣＨ2）nＣＯＯＣＨ3、または−（Ｃ
Ｈ2）n−Ｏ−φ−ＯＣＨ3を用いることによって別のサッカリドと組み合わせら
れ得る。Ｇｒａａｆｌａｎｄの米国特許第４，７０１，４９４号はまた、水溶性
ビニルサッカリドポリマーの調製のためのプロセスを開示するとして興味深い。
【００２０】 従って、多くの手順がヌクレオチド、アミノ酸、サッカリド、および他のモノ
マーのオリゴマーを生成するために開発されてきたことは明らかである。これら
の手順の大部分は、最初のモノマーを付着することに依存する。次いで、各々の
引き続くモノマー単位が連続的に付加され、各付加は、多くの化学反応を包含す
る。
【００２１】 オリゴマーの合成の間の各段階において、多くの鎖が伸張され得ない、小さい
が有限の可能性が存在する。従って、全オリゴマー化プロセスの間、大量のエラ
ーが導入され得る。これらの誤った配列（すなわち「欠損配列」）は、多くの方
法においてそれら自体を明らかにし得る。欠損配列を除去するための適切な精製
プロセスを用いなければ、このエラーは、所望されない生成物、最適以下の性能
などを誘導し得る。
【００２２】 従って、近似しているが所望の配列と異なる配列を有するオリゴマーを含有す
る夾雑物を実質的に含まないことを保証する配列を有するオリゴマーを調製し得
ることが、重要性を増してきている。始めに誤った配列を除去することによって
続く精製工程（例えば、電気泳動）（これは、材料の損失を生じ得る）の必要性
を回避し得る；非常に少量の材料で作業する際に、材料の損失は、当然のことな
がら、深刻な問題であり得る。
【００２３】 （発明の開示） 従って、本発明の主な目的は、オリゴマーを精製するための、単純化され、効
率的な、そして汎用性のある方法を提供することによって当該分野における前述
の必要性に取り組むことである。
【００２４】 本発明の別の目的は、オリゴマーがオリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、オ
リゴサッカリドなどであるような方法を提供することである。
【００２５】 本発明のさらなる目的は、支持体結合オリゴマーが変更された切断および捕捉
工程を使用して精製されるような方法を提供することである。
【００２６】 本発明のさらに別の目的は、５’−選択工程および３’−選択工程の両方を実
施することによって合成オリゴヌクレオチドを精製する方法を提供することであ
る。
【００２７】 次いで、本発明の１つの局面において、精製された形態で目的のオリゴマーセ
グメントを調製するための方法を提供する。最初に、この方法は、所望の支持体
結合オリゴマーが得られるまで、成長する支持体結合オリゴマー鎖の末端にモノ
マーを連続的に結合する工程を包含する。支持体結合オリゴマーは、第１の選択
的に切断可能な結合、第２の選択的に切断可能な結合、および第３に選択的に切
断可能な結合を含み、ここで目的のオリゴマーセグメントは、第２および第３の
選択的に切断可能な結合に隣接するフラグメントであり、そしてここで、第１の
捕捉部分は、支持体結合オリゴマーの遊離の末端で存在し、そして第２の捕捉部
分は、第１の選択的に切断可能な結合と第３の選択的に切断可能な結合との間に
存在する。選択的に切断可能な結合および捕捉部分は、本明細書に記載される技
術および／または当業者に公知の技術を使用して合成の間に導入される。支持体
結合オリゴマーの合成の後に、以下の工程が、精製された形態において目的のオ
リゴマーセグメントを提供するために実施される：（ａ）第１の選択的に切断可
能な結合は、固体支持体からオリゴマー生成物を放出するように切断される；（
ｂ）放出されたオリゴマー生成物は、第１の捕捉部分に結合する第１の捕捉媒体
とともにインキュベートされ、次いで、「捕捉された」オリゴマー生成物は、単
離され、そして必要に応じて精製される；（ｃ）第２の選択的に切断可能な結合
は、第２の捕捉部分において終結する目的のオリゴマーセグメントを生成するた
めに切断される；（ｄ）工程（ｃ）で提供されたオリゴマーセグメントは、第２
の捕捉部分に結合する第２の捕捉媒体と共にインキュベートされ、次いで、捕捉
されたオリゴマーセグメントは、単離され、そして必要に応じて精製される；そ
して（ｅ）第３の選択的に切断可能な結合は、精製された形態において目的のオ
リゴマーセグメントを与えるように切断される。
【００２８】 本発明の別の局面は、ちょうど記載されるように合成され、そして精製された
目的のオリゴマーセグメントを提供する際の出発物質として有用な、支持体に結
合したオリゴマー生成物に関する。支持体結合オリゴマー生成物は以下の構造式
（Ｉ）を有する： （Ｉ）Ｓ−［Ｘ１］n1−ＳＣ１−ＣＰ２−［Ｘ２］n2−ＳＣ３−Ｔ1−Ｘ−Ｔ2−
ＳＣ２−ＣＰ１ 。ここでＳは、固体支持体を示し、Ｘ１およびＸ２はモノマーまたはオリゴマー
セグメントであり、ｎ１およびｎ２は、独立してゼロまたは１であり、ＳＣ１、
ＳＣ２およびＳＣ３は、第１選択切断部位、第２選択切断部位および第３選択切
断部位を示し、ＣＰ１およびＣＰ２は、第１捕捉部分および第２捕捉部分を示し
、Ｔ1は、目的のオリゴマーセグメントＸの第１の末端であり、そしてＴ2は、オ
リゴマーセグメントＸの第２の末端である。式（Ｉ）の支持体結合オリゴマー生
成物は、上記のプロセスで用いられ、目的のオリゴマーセグメントＸ（これは、
精製された形態でＴ1およびＴ2において終止する）を提供し得る。
【００２９】 本発明のさらなる目的、利点および新規の特徴は、以下の記載において部分的
に記載され、そして以下の実験に基づいて当業者にある程度は明白であるか、ま
たは本発明の実施により学習され得る。
【００３０】 明確化の目的のためであって、本発明をいかなる特定の実施態様に限定するこ
とを意図しないが、本発明の以下の考察は、オリゴヌクレオチドであるオリゴマ
ーの精製に関する。オリゴマーがオリゴヌクレオチドである場合、Ｔ2およびＴ1 は、それぞれ５’末端および３’末端を示す。ＳＣ２は、５’−切断可能結合を
示し、そしてＳＣ３は、３’−切断可能結合を示す。当業者は、本明細書におい
て記載および請求される方法が、わずかな改変を伴い、他のオリゴマー、および
例えば、オリゴペプチド、オリゴサッカリドなどの精製に適用され得ることを認
識する。
【００３１】 式（Ｉ）の構造を有するオリゴヌクレオチドが提供される。ここでＸは、目的
のオリゴヌクレオチドセグメントであり、そしてＸ１およびＸ２は、個々のヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチドセグメントである。目的のオリゴヌクレオチ
ドの精製は、目的のＴ1−Ｘ−Ｔ2の精製したオリゴヌクレオチドセグメントを得
るための、ｐＳＣ１での開裂、逆相クロマトグラフィー媒体または疎水性相互作
用クロマトグラフィー媒体からなる第１捕捉媒体ＣＭ１を用いての遊離産物ＣＰ
２−［Ｘ２］n2−ＳＣ３−Ｔ1−Ｘ−Ｔ2−ＳＣ２−ＣＰ１のインキュベーション
、ＳＣ２での切断、逆相クロマトグラフィー溶剤または疎水性相互作用クロマト
グラフィー溶剤からなる第２捕捉媒体ＣＭ２を用いての得られた産物ＣＰ２−［
Ｘ２］n2−ＳＣ３−Ｔ1−Ｘ−Ｔ2のインキュベーション、およびＳＣ３での切断
により影響される。
【００３２】 （発明の実施の様態） （定義および命名法：） 本発明を開示し、そして詳細に記載する前に、本発明が特定の反応条件、材料
または試薬（当然ながら、それ自体は変化し得る）に限定されないことが理解さ
れるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、単に特定の実施態様
を記載する目的のためであり、そして限定することを意図しないこともまた理解
されるべきである。
【００３３】 さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの
（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この、その（ｔｈｅ）」は、その文脈が
他に明白に示さない限り複数形を含む。
【００３４】 以下の本明細書および特許請求の範囲において、参考文献は、以下の意味を有
すると規定された多数の用語に構成される。
【００３５】 本明細書において用いる場合、用語「モノマー」は、１つ以上の他の物質に共
有結合してオリゴマーを形成し得る化学物質をいう。「モノマー」の例としては
、アミノ酸、ヌクレオチド、糖類、ペプトイドなどが挙げられる。一般に、本発
明と組み合わせて用いられるモノマーは、標準的化学反応（例えば、脱離基の求
核置換反応、縮合など）によって、他のモノマーに結合するのに適切な第１部位
および第２部位（例えば、５’末端および３’末端、Ｃ末端およびＮ末端など）
、ならびに同じ型の異なるモノマーから特定のモノマーを識別する多様な成分（
例えば、ヌクレオチド塩基、アミノ酸側鎖など）を有する。最初の支持体結合「
モノマー」は、一般に、多段階合成手順において構築ブロックとして用いられ、
完全なオリゴマーを形成する（例えば、オリゴヌクレオチド、オリゴペプチド、
オリゴ糖などの合成において）。
【００３６】 用語「オリゴマー」は、本明細書において、多数のモノマーを含む化学物質を
示すために用いられる。本明細書において用いる場合、用語「オリゴマー」およ
び「ポリマー」は、互換可能に用いられ、それは、通常（必然ではないが）本発
明の方法を用いて調製される、より小さい「ポリマー」である。オリゴマーおよ
びポリマーの例としては、ポリデオキシリボヌクレオチド、ポリリボヌクレオチ
ド、他のポリヌクレオチド（プリンまたはピリミジン塩基のＮグリコシドまたは
Ｃグリコシドである）、ポリペプチド、多糖類、および化学構造のような反復単
位を含む他の化学物質が挙げられる。本発明の実施において、オリゴマーは、通
常、約２〜５０モノマー、好ましくは２〜２０モノマー、そして最も好ましくは
約３〜１０モノマーを含む。
【００３７】 本明細書において用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌク
レオチド」は、以下のポリマーがＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるような
塩基対および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含むという条件下
で、ポリデオキシリボヌクレオチド（２’−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、
ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基の
Ｎ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチド、
および非ヌクレオチド結合を含む他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、
ペプチド核酸（「ＰＮＡ」）、ポリモルフォリノ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｏｌｉｎ
ｏ）（ＡＶＩ Ｂｉｏｐｈａｒｍ，Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，ＯｒｅｇｏｎからＮｅ
ｕｇｅｎｅTMポリマーとして市販）、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマー
の総称である。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間の長
さの違いは意図されず、そしてこれらの用語は互換可能に用いられる。これらの
用語は分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語は、二本鎖ＤＮＡおよ
び一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハ
イブリッド、およびＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを含み、
そしてまた公知の型の改変、例えば当該分野で公知の標識、メチル化、「キャッ
プ」、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログでの置換、例えば、非
荷電結合を有する改変（例えば、メチルホスホネート、リン酸トリエステル、ホ
スホラミダイト、カルバメートなど）、正に荷電した結合を有する改変（例えば
、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４
４７０〜４４７１に開示されるような、カチオン性に置換されたホスホラミダイ
ト結合、またはＦａｔｈｉら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．
２２：５４１６〜５４２４およびＦａｔｈｉら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ
ａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：４７〜５７に開示されるような、カチオン性に置換され
たホスホネート誘導体）、および負に荷電した結合を有する改変（例えば、ホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、３’−オキシまたは３’−デオ
キシリボース部分の２’−Ｏ−ヌクレオチド間結合を含有する改変、ペンダント
部分（例えば、タンパク質（核、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リ
ジンなどを含む）のような）を含む改変、インターカレーター（例えば、アクリ
ジン、ソラレンなど）を有する改変、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、
ホウ素、酸化金属など）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変結合（例え
ば、αアノマー性核酸など）を有する改変、のようなヌクレオチド間改変、なら
びにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの未改変形態を含む。
【００３８】 本明細書において用いる場合、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」
は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基を含むだけでなく、改変されたプリ
ン塩基およびピリミジン塩基ならびに改変された他の複素環式塩基を含む部分を
含む。このような改変は、メチル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリン
もしくはピリミジン、または他の複素環を含む。さらに、用語「ヌクレオシド」
および「ヌクレオチド」は、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖だけで
なく他の糖も同様に含む部分を含む。改変したヌクレオシドまたはヌクレオチド
はまた、糖部分に改変を含む。ここでは、例えば、１つ以上のヒドロキシル基が
ハロゲン、脂肪族基（２’−Ｏ−アルキル、例えば２’−Ｏ−メチルを含む）で
置換されるか、またはエステル、アミンなどとして官能基化されている。通常の
ヌクレオチドアナログとしては以下が挙げられるがこれらに限定されない：１−
メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ6−メチルアデニン、Ｎ6−イソペンチ
ルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ6−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−
メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグア
ニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、
８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグ
アニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−
クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラ
シル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキ
シヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（
カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−
２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ
酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュード（偽）ウラシル、１
−メチルシュードウラシル、クエオシン、イノシン、１−メチルイノシン、ヒポ
キサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、６
−チオプリンおよび２，６−ジアミノプリン。他の適切なアナログは当業者に公
知であり、そして適切なテキストおよび文献に記載されている。
【００３９】 さらに、ヌクレオチドの単位に対する改変としては、それぞれの相補的ピリミ
ジンまたはプリンに対して水素結合を形成する、プリンまたはピリミジン塩基上
の官能基の再配列、付加、置換、さもなければ変化が挙げられる。得られた改変
ヌクレオチドの単位は、他のこのように改変されたヌクレオチド単位を有するが
、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵは有さない塩基対を形成し得る。標準的なＡ−Ｔおよ
びＧ−Ｃ塩基対は、チミジンのＮ3−ＨおよびＣ4−オキシとアデノシンのＮ1お
よびＣ6−ＮＨ2それぞれとの間、ならびにシチジンのＣ2−オキシ、Ｎ3およびＣ 4 −ＮＨ2とグアノシンのＣ2−ＮＨ2、Ｎ1−Ｈ、およびＣ6−オキシそれぞれとの
間の水素結合の形成を可能にする条件下で形成する。従って、例えば、グアノシ
ン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）は、改変
され、イソグアンシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル
−プリン）を形成し得る。このような改変は、シトシンを有する標準的塩基対を
もはや効果的に形成しないヌクレオシド塩基を生じる。しかし、イソシトシン（
１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシ−ピリミジン）の形成の
ためのシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリ
ミジン）の改変は、グアノシンと効率的に塩基対合しないがイソグアノシンと塩
基対を形成する、改変したヌクレオチドを生じる。イソシトシンは、Ｓｉｇｍａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である；
イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３
２：１０４８９〜１０４９６およびその文献に引用された参考文献に記載された
方法で調製され得る；２’−デオキシ−５−メチル−イソシチジンは、Ｔｏｒら
（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１〜４４６７および
そこに引用される参考文献の方法により調製され得る；そしてイソグアニンヌク
レオチドは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３）（前出）およびＭａｎｔｓｃｈら（
１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３〜５６０１に記載の方法を用いて調
製され得る。κおよびπと呼ばれる非天然の塩基対は、２，６−ジアミノ−ピリ
ミジンおよびその相補体（１−メチルピラゾロ［４，３］ピリミジン−５，７−
（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）の合成についてのＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（１９９０
）Ｎａｔｕｒｅ ３４３：３３〜３７に記載の方法により合成され得る。特有の
塩基対を形成する他のこのような改変ヌクレオチド単位は、Ｌｅａｃｈら（１９
９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５〜３６８３およびＳｗｉ
ｔｚｅｒら（１９９３）（前出）に記載されているか、または当業者に明白であ
る。
【００４０】 ヌクレオシド間結合の構造的提示において用いる場合、表記「３’」は、結合
の５’側に位置するヌクレオシドのリボース部分の３’炭素への結合をいう。同
様に、ヌクレオシド間結合の構造的提示において用いる場合、表記「５’」は、
結合の３’側に位置するヌクレオシドのリボース部分の５’炭素への結合をいう
。しかし、上記のように、本発明は、リボース部分のみを含むオリゴヌクレオチ
ドに限定されない。当業者は、本明細書におけるオリゴヌクレオチドが伝統的な
３’および５’ヌクレオシド間結合に限定される必要はないことを認識する。例
えば、２’，５’−ホスホジエステル結合を通じて結合した３’−デオキシヌク
レオシドを含むＤＮＡの２’構造異性体は、記載されており（Ｐｒａｋａｓｈら
（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９６：１７９３〜１７９４）、そし
てこのような異性体は、本明細書における「オリゴヌクレオチド」の定義に含ま
れる。
【００４１】 「選択的に切断可能な」結合、例えば「無塩基部位（ａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅ
）」は、米国特許第４，７７５，６１９号、同第５，１１８，６０５号、同第５
，２５８，５０６号、同第５，３６７，０６６号、同第５，３８０，８３３号、
同第５，５８０，７３１号、および同第５，５９１，５８４号に記載のように、
酵素的に、化学的に、または光分解的に切断可能であり得るオリゴヌクレオチド
骨格中の部位である。無塩基部位は、例えば、米国特許第５，４３０，１３６号
に記載のように非ヌクレオチド性の部位である。「無塩基部位」とは、オリゴヌ
クレオチド鎖内に含まれるがプリン塩基またはピリミジン塩基を含まないモノマ
ー性単位を意味する。無塩基部位を提供するために本発明の方法と組み合わせて
用いるモノマー性単位は、リボースまたはデオキシリボース環を含むが、１’位
置に存在するプリンまたはピリミジン塩基を有さない。前述の特許において説明
されたように、多数の試薬および方法が、無塩基部位および／または化学的試薬
、制限酵素または光分解を用いて切断可能な部位を作製するために用いられ得る
。例えば、「Ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｉｎｃｏｒ
ｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｈａｉｎｓ
」と題された、Ｕｒｄｅａらの米国特許第５，２５８，５０６号；「Ｏｌｉｇｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｙ Ｃｌｅａｖａｂｌ
ｅ ａｎｄ／ｏｒ Ａｂａｓｉｃ Ｓｉｔｅｓ」と題された、Ｕｒｄｅａらの米
国特許第５，３６７，０６６号；「Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅａｇｅ
ｎｔｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓ
ｉｔｅｓ」と題されたＵｒｄｅａの米国特許第５，３８０，８３３号；「Ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｈａｖｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｙ Ｃｌｅａ
ｖａｂｌｅ Ａｎｄ／ｏｒ Ａｒｂａｓｉｃ Ｓｉｔｅｓ」と題された、Ｕｒｄ
ｅａらの米国特許第５，４３０，１３６号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓ ｗｉｔｈ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｓｉｔｅｓ」と題された、Ｕｒｄｅａらの
米国特許第５，５５２，５３８号；および「Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ
Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ａｎｄ
／ｏｒ Ａｂａｓｉｃ Ｓｉｔｅｓ ｉｎｔｏ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅｓ」と題された、Ｕｒｄｅａらの米国特許第５，５７８，７１７号を参照のこ
と。
【００４２】 本明細書において用いる場合、用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸
（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタ
ミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン
、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトフ
ァン、チロシン、バリン）のＬ型、Ｄ型および非鏡像異性型だけでなく、改変ア
ミノ酸、アミノ酸アナログおよび従来のオリゴペプチド合成に取り込まれ得る他
の化合物、例えば、Ｄアミノ酸および他の非天然アミノ酸または従来と異なるア
ミノ酸（例えば、４−ニトロフェニルアラニン、イソグルタミン酸、イソグルタ
ミン、ε−ニコチノイル−リジン、イソニペコ酸、テトラヒドロイソキノレイン
酸、α−アミノイソ酪酸、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチル
グリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、
β−アラニン、４−アミノ酪酸など）も含むことを意図する。
【００４３】 本明細書のオリゴペプチドに適用する場合、用語、「従来の」および「天然に
存在する」は、天然に存在するアミノ酸、すなわち、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、
Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、
Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒから構
築されたオリゴペプチドをいう。「オリゴペプチド」は、モノマーがアミド結合
を通して一緒に結合されるαアミノ酸であるオリゴマーをいう。
【００４４】 用語「糖類（サッカライド）」は、天然に存在する単糖類および二糖類だけで
なく改変サッカライドも含むことを意図する。単糖類の例としては、トリオース
（三炭糖）（例えば、グリセルアルデヒドおよびジヒドロキシアセトン）、テト
ロース（四炭糖）（例えば、エリトロースおよび、エリトルロース、トレオース
）、ペントース（五炭糖）（例えば、リボース、リブロース、アラビノース、キ
シロース、キシルロースおよびリキソース）、ヘキソース（六炭糖）（例えば、
アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラ
クトース、タロース、プシコース、フルクトース、ソルボース、およびタガトー
ス）、ヘプトース（七炭糖）（例えば、セデュヘプタロース（ｓｅｄｕｈｅｐｔ
ｕｌｏｓｅ））などが挙げられる。二糖類としては、α−１，２、α−１，３、
α−１，４、α−１，６、β−１，２、β−１，３、β−１，４、β−１，６結
合などの手段で付着する上記の任意の単糖類のダイマーが挙げられる。このよう
な二糖類の例としては、マルトース、ラクトース、スクロースなどが挙げられる
。改変糖類としては、１つ以上のヒドロキシル基がハロゲン、脂肪族基で置換さ
れているか、またはエステル、アミン、リン酸などで官能基化されている糖類が
挙げられる。「オリゴ糖（オリゴサッカライド）」は単糖類のオリゴマーである
。糖間の結合は、α−１，２、α−１，３、α−１，４、α−１，６、β−１，
２、β−１，３、β−１，４、β−１，６結合などであり得る。
【００４５】 「分子模倣物」としては、以下挙げられるがこれらに限定されない：小さい有
機化合物；核酸および核酸誘導体；糖類およびオリゴ糖類；ペプチド、タンパク
質およびその誘導体を含むペプチド模倣物（例えば、非ペプチド有機部分を含有
するペプチド、アミノ酸またはペプチド結合を含んでも含まなくともよいが、ペ
プチドリガンドの構造的特徴および機能的特徴を保持する合成ペプチド）；なら
びにＳｉｍｏｎら（１９９２）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８９：９３６７に記載のようなペプトイドおよびオリゴペプトイド；ならび
に抗イディオタイプ抗体を含む抗体。
【００４６】 「ペプトイド」は、少なくとも一部は、アミノ酸以外の任意の分子から構成さ
れるアミノ酸「置換」のモノマー単位から構成されるオリゴマーであるが、これ
はペプトイドポリマー中でアミノ酸を模倣するように働く。特に好ましいモノマ
ー単位はグリシンのＮ−アルキル化誘導体である。ペプトイドは、アミノ酸を有
する直鎖もしくは環状構造へのアミノ酸「置換」および／または他のアミノ酸置
換の結合により生成される。この結合は、限定なく、ペプチド結合、エステル結
合、エーテル結合、アミン結合、リン酸結合、硫酸結合、亜硫酸結合、チオエー
テル結合、チオエステル結合、脂肪族結合およびカルバミン酸結合を含み得る。
アミノ酸置換の例としては、制限なく、Ｎ−置換グリシン、Ｎ−アルキル化グリ
シン、Ｎ−置換アラニン、Ｎ−置換Ｄ−アラニン、ウレタンおよび置換ヒドロキ
シ酸（例えば、ヒドロキシ酢酸、２−ヒドロキシプロパン酸、３−ヒドロキシプ
ロパン酸、３−フェニル−２−ヒドロキシプロパン酸などが挙げられる。反応模
式図に関する化学が、一般に本明細書において記載される反応に適合しかつ包含
される場合、ペプトイドは１つ以上の型の結合を用いるアミノ酸置換を含み得る
。アミノ酸置換およびペプトイドの他の例は、例えば、Ｂａｒｔｌｅｔｔら、Ｐ
ＣＴ ＷＯ９１／１９７３５およびＺｕｃｋｅｒｍａｎｎら、ＰＣＴ ＷＯ９４
／０６４５１に記載される。
【００４７】 本明細書で用いられる場合、「保護基」または「ＰＧ」は、分子の断片化を防
ぐ種、またはこの部位に対して、特定の化学反応を受けることに対して保護基が
付着するが、反応の完了後の分子から除去され得る部位を意味する。これは「キ
ャッピング基」と対照的である。キャッピング基はまた、分子のセグメントとの
共有結合を形成するが、そのセグメントのどのようなさらなる化学変換も妨げる
。
【００４８】 本明細書において用いる場合、用語「保護」および「脱保護」は、それぞれ、
当該分野のおよび／または適切な文献に記載されている従来の材料および技術を
用いる化学的保護基の付加および除去に関する；例えば、Ｇｒｅｅｎｅら、Ｐｒ
ｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
，第２版（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９１）を
参照のこと。ヒドロキシル保護基を除去するために適切な方法としては、特に、
保護基を除去するのに十分な強さの酸での処理（ただし、これは、固体支持体ま
たはそれに結合する任意の成分の特性を変化しない）が挙げられるがこれに限定
されない。
【００４９】 本明細書において用いる場合、用語「アルキル」は、他に特定しない限り、１
〜２４、代表的には１〜１２の炭素原子の飽和直鎖、分枝または環状の炭化水素
基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソ
ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル
、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジ
メチルブチル、および２，３−ジメチルブチル）をいう。用語、「低級アルキル
」は、１〜６の炭素原子のアルキル基を意図し、そして例えば、メチル、エチル
、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチ
ル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、
シクロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、および２，３
−ジメチルブチルを含む。用語、「シクロアルキル」は、環状アルキル基（例え
ば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロ
ヘプチルおよびシクロオクチル）をいう。
【００５０】 本明細書において用いる場合、用語「アルケニル」は、他に特定しない限り、
２〜２４、代表的には２〜１２の炭素原子の分枝、非分枝または環状（Ｃ5およ
びＣ6の場合）の炭化水素基をいい、この炭化水素基子はエテニル、ビニル、ア
リル、オクテニル、デセニルなどのような少なくとも１つの二重結合を含む。用
語「低級アルケニル」は、２〜６の炭素原子のアルケニル基を意図し、そして例
えば、ビニルおよびアリルが挙げられる。用語「シクロアルケニル」は環状アル
ケニル基をいう。
【００５１】 本明細書において用いる場合、用語「アリール」は、１〜５の芳香族環を含む
芳香族種をいう。これは、融合するか結合するかのいずれか、そして代表的には
、アミノ、ハロゲンおよび低級アルキルからなる群より選択される１つ以上の置
換基で置換されてないか置換されたかのいずれかである。好ましいアリール置換
は、１〜３の融合した芳香族環を含み、そして特に好ましくはアリール置換は、
１つの芳香族環または２つの融合芳香族環を含む。本明細書において芳香族基は
複素環式であってもなくてもよい。
【００５２】 用語「アリーレン」は、アリールが上記のように規定される二官能性基をいう
。
【００５３】 用語「アラルキル」および「アルカリル」はアルキル種およびアリール種の両
方を含む部分をいう。これは、代表的には、約２４未満の炭素原子、そしてより
代表的にはこの部分のアルキルセグメントに約１２未満の炭素原子を含み、そし
て代表的には１〜５の芳香族環を含む。用語「アラルキル」は、アリール置換ア
ルキル基をいい、一方、用語「アルカリル」は、アルキル置換アリール基をいう
。用語「アラルキレン」および「アルカリレン」は、類似の様式で用いられ、ア
ルキレン種およびアリール種の両方を含む部分をいう。これは、代表的にアルキ
レン部分に約２４未満の炭素原子を、アリール部分に１〜５の芳香族環を含む；
「アラルキレン」は、アリール置換アルキレン結合をいい、一方、「アルカリレ
ン」は、アルキル置換アリーレン結合をいう。
【００５４】 用語「複素環式（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）」は、５員もしくは６員の単環
式構造、または８員〜１１員の二環式構造（飽和しているかまたは不飽和かのい
ずれかである）をいう。本明細書における複素環式基は、脂肪族または芳香族で
あり得る。それぞれの複素環は、炭素原子、ならびに窒素、酸素、およびイオウ
からなる群より選択される１〜４のヘテロ原子からなる。本明細書において用い
る場合、用語「窒素ヘテロ原子」および「イオウヘテロ原子」は、窒素およびイ
オウの任意の酸化形態、ならびに任意の塩基性窒素の４級化形態を含む。複素環
の例としては、ピロール、ピロリジン、ピリジン、ピペリジン、モルフォリン、
キノリン、インドール、ピリミジン、ピペラジン、ピペコリン、イミダゾール、
ベンジイミダゾール、プリンなどが挙げられるがこれらに限定されない。これら
の基はまた、上記に概説されるように置換され得る。
【００５５】 オリゴマー配列について言及する場合、「精製した」または「均一な」は、オ
リゴマー配列が同じタイプまたは立体異性の配置の他の生物学的高分子が実質的
に存在しない状態で存在することを示す。「目的の精製したオリゴマーセグメン
ト」の用語「精製した」は、目的のオリゴマーセグメントが組成物の少なくとも
約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、および最も好ましくは少な
くとも約９５重量％を表す組成物をいう。
【００５６】 用語「ハロ」または「ハロゲン」は、塩素、臭素、フッ素またはヨウ素の置換
基を言及するそれらの従来の意味で使用される。用語「ハロアルキル」、「ハロ
アルケニル」または「ハロアルキニル」（または「ハロゲン化アルキル」、「ハ
ロゲン化アルケニル」または「ハロゲン化アルキニル」）は、それぞれ、アルキ
ル、アルケニル、またはアルキニル基を言及し、ここで、これらの基のハロゲン
原子の少なくとも１個はハロゲン原子と置換されている。
【００５７】 本明細書中で使用される、用語「置換基」は、本明細書中の分子部分の原子に
結合した官能基または非水素置換基をいう。当業者は、本明細書中で描かれそし
て規定される化合物および分子セグメントが具体的に示されるように置換されて
も置換されなくてもよく、または他の置換基で置換されてもよいことを理解する
。本発明の化合物に存在し得る置換基の例としては、ハロ、特にクロロ；ヒドロ
キシ；アルコキシ（特に、メトキシ、ｎ−プロポキシおよびｔ−ブトキシのよう
な低級アルコキシ）；１級アミノ（ＮＨ2）；２級アミノ（代表的には、低級ア
ルキル置換アミノ）；第３アミノ（代表的には、低級アルキル二置換アミノ）；
ニトロ；アシルオキシ（Ｒ’ＣＯＯ−として表され得る）；アシルアミド（Ｒ’
ＣＯＮＨ−として表され得る）およびそれらのチオールアナログ（それぞれＲ’
ＣＳＯ−およびＲ’ＣＳＮＨ−）が挙げられるがこれらに限定されず、ここでＲ
’はアルキル、代表的には、低級アルキル；カルボキシ（−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）；ア
ルコキシホスホニル（−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’）；カルバミル（−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２）；
アルキルカルバミル（Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ’）；アルキルスルホニル（Ｒ’ＳＯ２−
）およびアルキルホスホニル（Ｒ’Ｐ（ＯＲ’）Ｏ−）である。本明細書中で使
用される、用語「アルキル」「アルケニル」「ヒドロカルビル」などは、非置換
基だけでなく、まさに規定されるような１個以上の「置換基」を含む置換基を包
含することが意図される。
【００５８】 「任意の」または「必要に応じて」は、後に記載される事象または状況が起こ
っても起こらなくてもよく、そしてこの記載が上記事象または状況が起こる事例
およびそれが起こらない事例を含むことを意味する。例えば、句「必要に応じて
存在する」選択可能な切断部位は、切断可能な部位は存在しても存在しなくても
よく、この記載は、選択可能な切断部位が存在する事例および選択可能な切断部
位が存在しない事例を含む。
【００５９】 目的のオリゴマーセグメントを精製した形態で調整するための新規の戦略が本
明細書中に、開示されそして請求される。初めに、本方法は、精製した形態で提
供されるべき目的のオリゴマーセグメントを含む支持体結合オリゴマーを調製す
る工程を包含する。この支持体結合オリゴマーは、所望の支持体結合オリゴマー
が得られるまで、成長する支持体結合オリゴマー鎖の末端にモノマーを実質的に
結合することによって合成される。支持体結合オリゴマーは、第１の選択的に切
断可能な結合、第２の選択的に切断可能な結合、および第３の選択的に切断可能
な結合を含み、ここで、目的のオリゴマーセグメントは、第２および第３の選択
的に切断可能な結合に隣接するセグメントであり、ここで、第１の捕捉部分は、
支持体結合オリゴマーの遊離末端に存在し、そして第２の捕捉部分は第１および
第３の選択的に切断可能な結合の間に存在する。選択的に切断可能な結合および
捕捉部分は、本明細書中に記載され、そして／または当該分野で公知の技術を使
用する合成の間に導入される。選択的に切断可能な結合および捕捉部分は、本明
細書中に記載され、そして／または当該分野で公知の技術を使用する合成の間、
導入される。精製プロセスの出発物質として使用される支持体−結合オリゴマー
分子は、図１Ａの上に概略的に示され、そして一般に以下の式（Ｉ）によって表
され得、 （Ｉ） Ｓ−［Ｘ１］n1−ＳＣ１−ＣＰ２−［Ｘ２］n2−ＳＣ３−Ｔ1−Ｘ−Ｔ2 −ＳＣ２−ＣＰ１ ここで、Ｓは、固体支持体を表し、Ｘ１およびＸ２は、モノマーまたはオリゴマ
ーセグメントであり、ｎ１およびｎ２は、独立して０または１であり、ＳＣ１、
ＳＣ２およびＳＣ３は第１、第２および第３の選択的に切断可能な部分を表し、
ＣＰ１およびＣＰ２は、第１および第２の捕捉部分を表し、Ｔ1は目的のオリゴ
マーセグメント「Ｘ」の第１の末端であり、そしてＴ2はオリゴマーセグメント
Ｘの第２の末端である。
【００６０】 合成（Ｉ）が完了した後、段階的プロセスが、目的のオリゴマーセグメント（
Ｔ1−Ｘ−Ｔ2）を精製した形態で提供するために実施される。このプロセスの工
程は、図１Ａおよび図１Ｂに概略的に例示される。始めに、第１の選択的に切断
可能な結合ＳＣ１は、固体支持体からオリゴマー生成物を放出するために切断さ
れる（図１Ａ、工程１）。次いで、放出したオリゴマー生成物は、第１の捕捉部
分ＣＰ１に結合する第１の捕捉媒体ＣＭ１と共にインキュベートされ、そして次
いで「捕捉した」オリゴマー生成物は、単離され、そして必要に応じて精製され
る（図１Ａ、工程２）。次に、第２の選択的に切断可能な結合ＳＣ２は、第２の
捕捉部分ＣＰ２で終結する目的のオリゴマーセグメントを生成するために切断さ
れる（図１Ａ、工程３）。このように提供されるオリゴマーセグメントは、第２
の捕捉部分ＣＰ２に結合する第２の捕捉媒体ＣＭ２と共にインキュベートされ、
次いで捕捉されたオリゴマーセグメントが単離され、そして必要に応じて精製さ
れる（図１Ｂ、工程４）。最終的には、第３の選択的に切断可能な結合（ＳＣ３
）は、目的のオリゴマーセグメントを精製した形態で与えるために切断される。
【００６１】 簡潔にするため、以下の記載は、オリゴヌクレオチドから構成されるオリゴマ
ーをいう。しかし、従来の技術および試薬を使用して、他のタイプの精製したオ
リゴマーを調製するためにこの方法論が容易に適応され得ることは当業者に理解
される。
【００６２】 次いで、１つの実施態様において、開始物質として式（Ｉ）の構造を有する支
持体結合オリゴヌクレオチドを使用して目的のオリゴヌクレオチドセグメントを
精製した形態で調製するための方法が提供される。この実施態様において、Ｔ1
−Ｘ−Ｔ2は、目的の所望のオリゴマーセグメントを表し、Ｔ１およびＴ２は、
それぞれ、オリゴヌクレオチド「Ｘ」の５’および３’末端を表す。従って、オ
リゴヌクレオチドの場合、本発明の方法を使用する精製は、３’−および５’−
の両方の選択技術を採用する。５’−選択は、ＤＭＴ／ＲＰクロマトグラフィー
の証明された技術に基づく。Ｈｏｒｎら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１６：１１５５９−７１．しかし、５’−選択のみは、生成物オリ
ゴマーを単離するために適切ではない。新しい戦略の重要な工程は、選択的にオ
リゴヌクレオチドをインタクトな３’末端と結合する３’捕捉であり、その結果
、捕捉は、所望の末端部分が存在する場合にのみ起こる。従って、脱保護の間に
発生するランダムに切断したオリゴヌクレオチドは捕捉されない。なぜなら、そ
れらは、３’捕捉部分にかけるためである。捕捉は、オリゴマーと捕捉支持体と
の間、すなわちＣＰ１とＣＭ１との間、そしてＣＰ２とＣＭ２との間の共有結合
の形成を生じる。共有結合によって結合されないオリゴマーを除去するために洗
浄した後、捕捉されたオリゴマーが特に放出される。
【００６３】 このスキームは、合成ＤＮＡオリゴマーの精製に使用され得るが、他のタイプ
のオリゴマー（ＲＮＡ、ＰＮＡ、ペプトイド、ペプチド、オリゴサッカリドおよ
び他）に潜在的に拡張され得る。本精製スキームの任意の２つの捕捉技術（例え
ば、５’−チオールおよび３’−アルデヒド捕捉、３’−アルデヒドおよび５’
−チオール捕捉など）を使用することがさらに可能である。当業者は、オリゴヌ
クレオチドが５’→３’または３’→５’のいずれかを合成し得、そして本明細
書中に記載される方法（３’→５’オリゴヌクレオチド合成を使用することを例
示するが）がいずれかの合成スキームを使用して実施され得ることを理解する。
【００６４】 本発明は、オリゴマーの精製を可能にし、その結果、エラーを含み不完全なオ
リゴマーが除去される。これは、完全な、すなわち保護基含有および捕捉部分含
有のオリゴマーおよびポリマーを分離するための方法を提供する５’末端保護基
および捕捉部分を採用することによって達成される。分離は、調整されるような
保護基含有オリゴマーおよび捕捉部分含有オリゴマーを使用して実施され得るか
、または必要に応じて、５’−保護基、３’−捕捉部分または両方がオリゴマー
を精製するための代替の手段を提供するために改変され得る。
【００６５】 （５’捕捉および５’捕捉部分） 好ましくは、必要ではないが、始めの精製スキームの「捕捉」工程は、５’−
選択工程である。代表的には、５’捕捉部分は、ジメトキシトリチル（「ＤＭＴ
」）、モノメトキシトリチル（「ＭＭＴ」）、トリチル、ピクシルなどであり、
ＤＭＴが好ましい。他のヒドロキシ保護基としては、Ｕｒｄｅａら、米国特許第
５，７０３，２１８号によって開示されるように、２−メチレン−９，１０−ア
ントラキノンカルボネートエステルおよびｐ−ニトロベンジルカルボネートエス
テルのような、カルボネートエステルが挙げられる。９−フルオレニル−メチル
カルボネート（「Ｆｍｏｃ」）基はまた、固相オリゴヌクレオチド合成における
５’−保護のために使用される（Ｆｕｋｕｄａら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．１９、１３およびＣ．Ｌｅ
ｈｍａｎｎら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２３８
９）。同様に、Ｒ．Ｌ．Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９６７）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．３２：２９６は、５’−ヒドロキシル保護のためのｐ−ニトロフェ
ニルオキシカルボニル基を使用することを記載する。ヒドラジン−不安定５’保
護基として、ベンゾイル−プロピオニル基（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９６７）
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８９：７１４７）、およびレブニリルエステル基
（ｄｅＲｏｏｉｊら、（１９７９）Ｒｅａｌ．Ｔｒａｃｋ．Ｃｈａｉｎ．Ｐａｙ
ｓ−Ｂａｓ．９８：５３７、Ｉｗａｉら．（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ
Ｌｅｔｔ．２９：５３８３；およびＩｗａｉら．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：９４４３）が挙げられる。５’選択工程は、逆相
クロマトグラフィー媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体などのような
捕捉媒体とのインキュベーションによって実施される。いいかえれば、逆相カー
トリッジまたはバルク相精製工程は、ＤＭＴ部分を含むオリゴマーについて選択
するために使用され得る。Ｈｏｒｎら．（１９８８）、前出。
【００６６】 例えば、逆相分離、疎水性相互作用分離などを使用して５’捕捉を実施するた
めに使用され得る５’捕捉部分としては、式２−（トリチルチオ）−Ｒ1−Ｏ−
ｐ−５’−Ｏ−Ｎｕ1を有する２−（トリチルチオ）アルキルリンカーが挙げら
れ、ここで、Ｒ1は、低級アルキルであり、ｐはＰ（Ｏ）2であり、そしてＮｕ1
は５’−ヌクレオチドである。この場合、５’−末端捕捉部分はトリチル基であ
り、そして５’−切断可能なリンカーはＳ−Ｒ1−Ｏ−ｐである。このような誘
導体（例えば、２−（トリチルチオ）−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ｐ−５’−Ｏ）はＣｏ
ｎｎｏｌｌｙら（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４
８５−４５０２に記載される。ＡｇＮＯ3を有するトリチル基の脱保護は、自発
的にエチレンスルフィドを除去して５’−リン酸化オリゴヌクレオチドを得るＨ
Ｓ−アルキル−Ｏ−ｐ−Ｏ−オリゴマーの発生を生じる。従って、このようなリ
ンカーは、ジシリルオキシリンカーと適合し（すなわち、ジシリルオキシに対し
て直交的に除去可能である）、これはフッ素試薬で選択的に切断され得る。
【００６７】 ＲＰ分離、疎水性相互作用分離などによって５’捕捉を実施するために使用さ
れ得、そして同様に切断可能リンカーとして作用する追加の５’捕捉部分は、（
ψ）3Ｓｉ−Ｒ2−Ｏ−ｐ−５’−Ｏ−Ｎｕ1であり、ここで、ψはフェニルであ
り、Ｒ2は低級アルキルであり、Ｎｕ1は上記の通りである。テトラブチルアンモ
ニウムフロリド（「ＴＢＡＦ」）およびトリエチルアミントリヒドロフロリド（
「ＴＥＡ（ＨＦ）3」）のようなフッ素試薬による処理は、（ψ）3Ｓｉ−Ｒ2−
Ｏ−ｐ−５’−Ｏ−オリゴマーの（ψ）3Ｓｉ−Ｆ、エチレンオキシド、および
５’−ｐ−Ｏ−オリゴマーへのフラグメンテーションを生じる。このようなリン
カー部分は、ジシリルオキシリンカーと適合せず、これはまた、フッ素試薬を使
用して切断される。（ψ）3Ｓｉ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ｐ−５’−Ｏ−Ｎｕのよう
なリンカーの例は、Ｃｅｌｅｂｕｓｋｉら（１９９２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．
５７：５５３５−５５３８、および１９９５年１月１０日に発行されたＣｅｌｅ
ｂｕｓｋｉらの米国特許５，３８０，８３５号に記載される。
【００６８】 このようなオリゴマーの５’−選択は、５’捕捉部分に対して特異的な捕捉ス
キームを使用して行われ、これによって、第１の捕捉媒体または補足支持体との
共有結合を形成する。この場合、５’切断リンカーは、オリゴマーの５’捕捉部
分と５’末端との間に組み込まれることが必要である。
【００６９】 従って、例えば、５’−チオール捕捉は、５’捕捉部分がＤＭＴ−Ｏ−Ｒ3−
Ｓ−Ｓ−Ｒ4−Ｏ−ｐである場合５’−末端リン酸を有するオリゴマーを得るよ
うに実施され得、ここでＲ3およびＲ4は、独立して低級アルキレン、アリーレン
、アラルキレン、またはアルカリレンであり、そして５’リンカーは「逆相Ｌ１
」であり（すなわち、Ｌ１リンカーに対して直交性である）、これは最後の縮合
モノマーＮ4−（ＤＭＴ−Ｏ−Ｒ5）−２’，３’−Ｏ−ベンゾイル−リボシチジ
ン５’−（β−シアノエチル）ホスホルアミダイトを使用して組み込まれ得、こ
こでＲ5は低級アルキレン、アリーレン、アラルキレン、またはアルカリレンで
ある。あるいは、Ｎ4−（ＤＭＴ−Ｏ−Ｒ5）−２’，３’−Ｏ−ベンゾイル−シ
チジン５’−（β−シアノエチル）ホスホルアミダイトまたはＮ4−（ＤＭＴ−
Ｏ−Ｒ5）−５−メチル−２’３’−Ｏ−ベンゾイル−シチジン５’−（β−シ
アノエチル）ホスホルアミダイトは、最後の縮合モノマーとして組み込まれ得る
。当業者は、同様に誘導体化したグアノシン、アデノシンまたはウリジン誘導体
（例えばＮ4−（ＤＭＴ−Ｏ−Ｒ5）−２’３’−Ｏ−ベンゾイル−グアノシン、
Ｎ4−（ＤＭＴ−Ｏ−Ｒ5）−２’３’−Ｏ−ベンゾイル−アデノシン、およびＮ 4 −（ＤＭＴ−Ｏ−Ｒ5）−２’３’−Ｏ−ベンゾイル−ウリジン）、または１−
Ｏ−（ＤＭＴ−Ｏ−Ｒ5）−２，３−Ｏ−ジベンゾイル−リボース５’−（β−
シアノエチル）ホスホルアミダイトまたは５−Ｏ−ＤＭＴ−２，３−ジベンゾイ
ル−リボース１−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｏ−Ｒ5）のような無塩基部位でさ
え最後の縮合モノマーとして組み込まれ得ることを理解する。
【００７０】 １つの好ましい実施態様において、５’リンカーは「逆相Ｌ１」であり、そし
てＲ3、Ｒ4およびＲ5は−Ｃ6Ｈ12−である。ジチオスレイトール（「ＤＴＴ」）
のような還元剤を使用する−Ｓ−Ｓ−結合の還元は、以下に記載されるように捕
捉が実施され得る活性チオール基を得る。５’−チオール捕捉が実施され得、５
’−ヒドロキシ部分を得、ここで、５’リンカーは、−Ｏ−Ｒ6−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ7 ）（Ｒ8）−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ9）（Ｒ10）−５’−Ｏであり、ここで、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ 8 、Ｒ9、Ｒ10は、独立して、低級アルキル、アリール、アラルキル、またはアル
カリルである。好ましくは、５’リンカーは、−Ｏ−（ＣＨ2）3−Ｏ−Ｓｉ（Ｃ
Ｈ（ＣＨ3）2）2−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ（ＣＨ3）2）2−５’−Ｏである。同様に、５
’−ジアルデヒド捕捉が実施され得、ここで５’捕捉部位は２’３’−Ｏ−（ベ
ンゾイル）2−リボＮｕ−５’−ｐであり、ここで、リボＮｕは、リボヌクレオ
チドであり、好ましくはリボＵであり、そして５’リンカーは、 −Ｏ−Ｒ6−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ7）（Ｒ8）−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ9）（Ｒ10）−５’−Ｏであ
り、好ましくは、−Ｏ−（ＣＨ2）3−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ（ＣＨ3）2）2−Ｏ−Ｓｉ
（ＣＨ（ＣＨ3）2）2−５’−Ｏである。
【００７１】 あるいは、５’結合は、米国特許第５，４３０，１３６号に開示される三択的
に切断可能な無塩基部位であり得る。例えば、オリゴヌクレオチド鎖は、以下の
構造を含み得；
【００７２】
【化５】 ここで、ＣＰ２は、上記のような５’捕捉部分であり、「オリゴマー」は、オリ
ゴヌクレオチドのセグメントであり、そしてＲは２−ニトロベンジル、４−ペン
テン−１−イル、−ＣＨ2ＣＨ2Ｓψ、−ＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（ＣＨ3）3、−Ｐ（Ｏ）
Ｏ- 2、−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2、および以下の２−メチレン−９、１０−
アントラキノン（「ＭＡＱ」）部分からなる群から選択され、
【００７３】
【化６】 ここで、Ｒ’は、水素、アリール、またはアラルキルであり、アリールまたはア
ラルキルの場合、好ましくはＣ1〜Ｃ8アリールまたはアラルキルの場合、Ｒiは
、同じかまたは異なり得、そしてアミノ、ニトロ、ハロゲノ、ヒドロキシ、低級
アルキルおよび低級アルコキシからなる群から選択され、Ｒjは同じかまたは異
なり得、そしてアミノ、ニトロ、ハロゲノ、ヒドロキシ、低級アルキルおよび低
級アルコキシからなる群から選択され、ｉは０、１、２、または３であり、そし
てｊは０、１、２、３または４である。このような無塩基部位を含有するオリゴ
ヌクレオチドの切断は、’１３６特許に記載のように実施され得る。すなわち、
Ｒが２−ニトロベンジルである場合、少なくとも３５０ｎｍの波長を有するＵＶ
光を使用する光分解を介して続いて、例えば水酸化アンモニウムなどを用いた塩
基性加水分解によって、切断が実施され得る。Ｒが−ＣＨ2ＣＨ2Ｓψ（ここで、
ψはフェニルを表す）である場合、例えば過ヨウ素酸ナトリウムによる−ＳＯ−
または−ＳＯ２−への硫黄原子の酸化、続いて塩基による処理によって、切断が
実施され得る。Ｒが−ＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（ＣＨ3）3である場合、オリゴヌクレオチ
ドは、例えばフッ素イオンによる処理、再び続いて塩基による処理によって切断
され得る。ＲがＭＡＱである場合、切断はＮａ2Ｓ2Ｏ4での酸化次いで塩基での
処理により実行され得る。Ｒが−ＣＨ2ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−ＮＯ2である場合、切断
は１，８−ジアザビシクロ［５．４．０ウンデカ−７−エン］を使用して実施さ
れ得る。Ｒがホスフェートである場合、アルカリホスファターゼによって、続い
て塩基による処理によって、除去が実施され得、その間、Ｒが４−ペンテン−１
−イルである場合、典型的にＮ−ブロモスクシンイミドを使用して、続いて塩基
による処理によって、切断が実施され得る。
【００７４】 本発明と組み合わせられる有用な他の選択的に切断可能な結合としては、例え
ば、酵素−切断可能部位（例えば、Ｕｒｄｅａらの米国特許４，７７５，６１９
号に記載の制限エンドヌクレアーゼにより切断可能な結合、およびピロホスファ
ターゼにより切断可能なピロホスファターゼジエステル結合）が挙げられる。さ
らなる選択的に切断可能な結合は、化学的に切断可能な部位であり、以下が挙げ
られるがこれらに限定されない：Ｅｌｌｍａｎ試薬などによる還元により切断可
能なジスルフィド結合；過ヨウ素酸によって切断可能な１，２−ジオール；およ
び−（ＣＯ）−ＣＨ（ＯＨ）−、−ＣＨ（ＮＨＲ）−ＣＨ（ＯＨ）−、−（ＣＯ
）−（ＣＯ）−および−ＣＨ（ＮＨＲ）−ＣＨ（ＮＨＲ）−のような他の過ヨウ
素酸で切断可能な結合（ここで、ＲはＨまたは低級アルキルである）。
【００７５】 好ましくは、５’捕捉部分は、３’捕捉部分と異なり、例えば、５’チオール
捕捉部分または５’ジアルデヒド捕捉部分は、それぞれ３’ジアルデヒド捕捉部
分または３’チオール捕捉部分を有するオリゴマーと共に使用される。さらに、
上記のように、存在する場合、５’切断可能リンカーは３’切断可能リンカーと
適合し、すなわち３’切断可能リンカーのような同じ処理によって切断されず、
または両方がオリゴマーに存在する場合、この合成は部分を放出することが好ま
しい。
【００７６】 （固体支持体） 広範な種々の支持体は、オリゴヌクレオチドの固相合成のために使用され得る
。適切な支持材料の例として、Ｕｒｄｅａらの米国特許第５，２５６，５４９号
、およびそこに提供される引用文献に記載される、アガロース（例えば、Ｐｈａ
ｍａｃｉａからＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）として市販されるもの）および
デキストラン（例えば、Ｐｈａｍａｃｉａからまた、商品名Ｓｅｐｈａｄｅｘ（
登録商標）、ＳｅｐｈａｄｅｘＬＨ−２０およびＳｅｐｈａｃｙｌ（登録商標）
として市販されるもの）、ポリアクリルアミド、ポリ（ジメチルアクリルアミド
）、ポリ（アクリルモルホリド）、ポリスチレン、ポリ（テトラフルオロエチレ
ン）上にグラフト化したポリスチレン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチ
ルメタクリレートとメチルメタクリレートとのコポリマー、シリカ、テフロン（ 登録商標）、ガラス、Ｐｏｒａｓｉｌ Ｃ、制御した細孔ガラス（「ＣＰＧ」） 、キースラガー、セルロース、Ｆｒａｃｔｏｓｉｌ５００などが挙げられるが、 これらに限定されない。
【００７７】 （３’−捕捉部分へオリゴマーを接続する切断可能リンカー） 合成および精製の間にオリゴマーを３’捕捉部分へ接続するために使用される
切断可能リンカーは、合成、固体支持体からの選択的切断、脱保護、逆相／脱塩
／疎水性相互作用クロマトグラフィー、および共有結合捕捉の条件に対して安定
でなければならない。この切断可能リンカーの切断は、使用されるリンカーに依
存して３’ホスフェートまたは遊離３’ヒドロキシル基のいずれかを有する最終
の精製オリゴマーを生成する。
【００７８】 捕捉部分へオリゴマーを接続させかつ３’ホスフェートを有するオリゴマーを
産生するために使用される、選択的に切断可能なリンカーには、Ｎ4−（ホスホ
リル−６−オキシヘキシル）シチジン（「Ｌ１」）および２’，３’−イソプロ
ピリジン−Ｎ4−（ホスホリル−６−オキシヘキシル）シチジン（「Ｌ２」）が
挙げられる。Ｌ１は、例えば、Ｋｅｉｔｈら（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ １３：３６０１−３６０６に記載されるように、２’，３’−ジオール系
の過ヨウ素酸塩酸化後のβ脱離を使用して切断され得る。Ｌ２は、イソプロピリ
ジン基を切断するための酸、２’，３’−ジオール系の過ヨウ素酸塩酸化、およ
び２’３’−ジオール系の過ヨウ素酸塩酸化後の塩基性条件下でのβ脱離を使用
して、切断され得る。Ｋｅｉｔｈら、前出。オリゴマーを３’捕捉部分と接続さ
せるために使用され得る他の切断可能なリンカー、または３’捕捉からオリゴマ
ーを切断して３’ホスフェートを生成する手段には、−Ｐ−Ｏ−アルキレン1−
Ｓ−アルキレン2−Ｏ−ｐ−および当該分野で周知である他のリンカーおよび切
断手段が挙げられ、ここで、アルキレン1およびアルキレン2のうちの少なくとも
１つは、エチレンであり、そしてここで、脱離が、−Ｓ−から−ＳＯ−への酸化
（過酸化ヨウ素酸塩またはＮ−クロロスクシンイミド（「ＮＣＳ」）を用いて、
続いて塩基での処理）（Ｋａｍａｉｋｅら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ
＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １２：１０１５−１０３２）、ホスホルアミデート
結合であるＲ11−Ｏ−ｐ−ＮＨ−Ｒ12の酸切断（Ｇｒｙａｚｎｏｖら（１９９３
）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．３４：１２６１−１２６４）の後に実施
され、ここで、Ｒ11は、ヌクレオシドであり、そしてＲ12は、パラジウム触媒で
切断され得るアルキル、アリール、アラルキルもしくはアルカリール、アリルホ
スフェートリンカーである（Ｚｈａｎｇら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：３９８０−３９８３）。
【００７９】 捕捉部分へオリゴマーを接続させかつ３’ヒドロキシル基を有するオリゴマー
を産生するために使用される、選択的に切断可能であるリンカーには、構造式−
Ｎｕ2−３’−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ13）（Ｒ14）−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ15）（Ｒ16）−Ｏ−Ｒ1 7 を有するリンカーが挙げられ、ここで、Ｎｕ2は、オリゴマーの末端３’ヌクレ
オチドであり、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15およびＲ16は、独立して、低級アルキル、アリ
ール、アラルキル、またはアルカリールであり、そしてＲ17は、本明細書中で記
載されるような捕捉部分（例えば、Ｋｗｉａｔｋｏｗｓｋｉら（１９９６）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４ ：４６３２−４６３８に記
載されるような、１，１，３，３、−テトラアルキル−ジシリルオキシ）である
。ジシリルオキシリンカーは、フッ化物試薬（例えば、Ｗｅｓｔｍａｎら（１９
９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：２４３０−２４３
１において記載されるようなＴＢＡＦおよびＴＥＡ（ＨＦ）3）を使用して切断
され得る。オリゴマーを３’捕捉部分と接触させるために使用され得る他の切断
可能リンカー（これは、切断されると、３’ホスフェートを産生する）には、−
Ｎｕ2−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ18）（Ｒ19）−２−Ｏ−Ｒ20（Ｗａｌｓｈら（１９９７）
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３８：６５１−１６５４）（ここで
、Ｎｕ2は上述の通りであり、Ｒ18およびＲ19は、独立して、低級アルキル、ア
リール、アラルキル、またはアルカリールであり、そしてＲ20は、本明細書中で
開示されるような捕捉部分である）およびＮｕ2−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ21）（Ｒ22）−
Ｒ23−Ｓｉ（Ｒ24）（Ｒ25）−Ｏ−Ｒ26（ここで、Ｎｕ2は上述の通りであり、
Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24およびＲ25は、独立して、低級アルキル、アリール、ア
ラルキル、またはアルカリールであり、Ｒ26は、本明細書中で開示されるような
捕捉部分であり、例えば、Ｎｕ2−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ3）2（ＣＨ2）2−Ｓｉ（ＣＨ3 ）2−Ｏ−Ｒ26）が挙げられ、これら各々は、フッ化物試薬を用いて切断可能で
あり；ならびに２’−Ｏ−ＰＧ−リボヌクレオチド（ここで、除去のための保護
基および処理が、ｔ−ブチル−ジメチル−シリル（フッ化物次いで塩基で処理）
、ホスフェート（アルカリホスフェート、塩基）、１−メトキシシクロヘキシル
エーテル（０．０１Ｍ ＨＣｌ、塩基；Ｒｅｅｓｅら（１９６７）Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．８９：３３６６）、メチルチオメチルエーテル（ＡｇＮＯ3、
塩基；Ｃｏｒｅｙら（１９７５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １
９７５：３２６９−３２７０）およびシロキシメチルエーテル（フッ化物、塩基
；Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎら（１９８９）Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．４３：
７０６）からなる群から選択される）。２’−Ｏ−ＰＧ基の除去後、このオリゴ
マーを、強塩基での処理によってリボシドから切断する（環状ホスフェートを残
す）（Ｃｒｅａら（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：２３
３１−４８；Ｓｃｈｗａｒｔｚら（１９９５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ ３６：２７−３０）；例えば式Ｎｕ2−Ｏ−Ｒ27Ｓ−Ｒ28を有するリ
ンカー（ここで、Ｎｕは上記に定義の通りであり、Ｒ27は、低級アルキル、アリ
ール、アラルキル、またはアルカリールであり、そしてＲ28は、捕捉部分である
）（例えば、Ｎｕ2−Ｏ−ＣＨ2Ｓ−Ｒ28のようなチオホルムアセタール誘導体、
この誘導体は、Ｋｅｃｋら（１９７８）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３１：１０３１
に記載されるように硝酸銀を用いて切断可能である）；式Ｎｕ2−Ｏ−Ｒ29−Ｏ
−Ｒ30（ＮＯ2）を有するリンカー（ここで、Ｎｕは上記の定義の通りであり、
そしてＲ29は、低級アルキルであり、そしてＲ30はアリール、アラルキル、また
はアルカリールである）、例えば、Ｎｕ2−Ｏ−ＣＨ2−ＯＣＨ2−Ｏ−Ｃ6Ｈ3（
ＮＯ2）のような４−ニトロベンジルオキシメチル誘導体（この誘導体は、Ｇｏ
ｕｇｈら（１９９６）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７：９８１
−９８２に記載されるように、フッ化物を用いて切断可能である）、ならびにＮ
ｕ2−Ｏ−ＣＨ2−Ｏ−Ｃ6Ｈ3（ＮＯ2）のような２−ニトロベンジルオキシメチ
ル誘導体（この誘導体は、Ｐｉｌｌａｉ（１９８０）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ１９８
０：１−２６に記載されるように光分解によって切断可能である）；アルキルジ
オールアミン（例えば、２，３−プロパンジオールアミン（ＨＯ−ＣＨ2−ＣＨ
ＯＨ−ＣＨ2−ＮＨ2））から誘導されるリンカー、ここで、この誘導体は、式Ｎ
ｕ2−Ｏ−ｐ−Ｏ−Ｒ31−ＮＨ（アリルオキシカルボニル）−Ｏ−を有し、ここ
で、Ｎｕは上記に定義の通りであり、そしてＲ31は低級アルキルであり、例えば
、Ｌｙｔｔｌｅら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
２４：２７９３−２７９８に記載されるようなＮｕ2−Ｏ−ｐ−Ｏ−ＣＨ2−Ｃ
Ｈ−ＣＨ2−ＮＨ（アリルオキシカルボニル）−Ｏ−）。
【００８０】 あるいは、３’−切断可能リンカーは、以下の式を有する選択的に切断可能な
無塩基部位であり得、
【００８１】
【化７】 ここで、ＰＧは、ＤＭＴなどであり得、そしてＲは上記に定義の通りである。３
’リンカーとして適切なさらに他の結合は、５’部位で有用であるとして上記に
記載されるものである；しかし、本明細書中で強調されるように、３’リンカー
および５’リンカーは、互いに対して直交的に（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ）切
断可能であるべきである。
【００８２】 （３’捕捉スキーム） 種々の３’捕捉スキームが、５’捕捉スキームと組み合わせて、オリゴマーを
精製するために使用される。このような３’捕捉スキームの例には、以下が挙げ
られるが、これらに限定されない：固体支持体−Ｓ−Ｓ−ピリジン、ブロモアセ
チル−固体支持体、固体支持体−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−フェニル−ＮＣＳおよび固
体支持体−エポキシからなる群から選択される捕捉媒体を使用する、チオール捕
捉スキーム（ここで、オリゴマーが、固体支持体から放出されて、チオール基を
有する）；「逆」チオール捕捉スキーム（ここで、放出されたオリゴマーは、３
’−ブロモアセチル−またはマレイミド（ｍａｌｉｍｉｄｏ）部分を含み、そし
てこのオリゴマーはチオール部分を有する支持体上に捕捉される）；オリゴマー
の捕捉（これは、固体支持体からの放出で、アルデヒド部分を有し、そして捕捉
は、固体支持体−ＣＯ−ＮＨＮＨ2を使用して実施される（Ｔｉｍｏｆｅｅｖら
（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３１４２
−３１４８；Ｈａｎｓｓｋｅら（１９７４）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ ３：３６７−３７６））；「逆」アルデヒド捕捉スキーム（ここで、
オリゴマーは、固体支持体から放出され、そしてヒドラジド基を有し、そしてこ
こで、捕捉が、アルデヒド支持体上で実施される）；（６−ヒスタミニルプリン
）6（Ｈｉｓ6）捕捉（これは、固定化した金属アフィニティークロマトグラフィ
ーによるニッケル−ニトリロトリ酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）を使用し、すなわち
、Ｏｒｕｍら（１９９５）Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９：４７２−４８０
に記載されるようなＣＰＧ−Ｎｉ−ＮＴＡ）；ＣＰＧ−ＤＩＴＣ（ＣＰＧ−フェ
ニル−ＮＣＳ）（Ｕｒｄｅａら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．１６：４９３７−５６）またはＣＰＧ−エポキシにおける、アミン捕捉；ホ
ウ酸支持体における、ジオール捕捉（Ｍａｚｚｅｏ（１９８９）Ｂｉｏ Ｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ４：１２４−１３０；Ｐａｃｅら（１９８０）Ａｎａｌｉｔｉ
ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０７：１２８−１３５）；アビジン支持
体におけるビオチン捕捉、またはビオチン支持体におけるアビジン捕捉；抗ＤＮ
Ｐ支持体におけるジニトロフェニル捕捉（Ｇｒｙｂｏｗｓｋｉら（１９９３）Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１７０５−１７１２）；
ならびにＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ捕捉（Ｗａｎｇら（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｃｏ
ｍｍｕｎ．１９９７：１４９５−１４９６において記載される）。上記に列挙し
た３’捕捉スキームの中で、チオール捕捉およびアルデヒド捕捉が好ましい。
【００８３】 （チオール捕捉）−この捕捉スキームにおいて、オリゴマーは、ジスルフィド
結合５’−ＤＭＴ−オリゴ−３’−ｐ−Ｏ−アルキレン−Ｓ−Ｓ−アルキレン−
Ｏ−スクシニル−ＣＰＧ（例えば、５’−ＤＭＴ−オリゴ−３’−ｐ−Ｏ−（Ｃ
Ｈ2）3−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）3−Ｏ−スクシニル−ＣＰＧ）を含む支持体上で合成
される。標準的な水酸化アンモニウム脱保護後、オリゴマーは、５’−ＤＭＴ−
オリゴ−３’−ｐ−Ｏ−（ＣＨ2）3−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）3−ＯＨとして存在する
。還元剤（例えば、ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリ
ド（「ＴＣＥＰ」）またはジチオトレイオール（「ＤＴＴ」））での引き続く処
理によって、ジスルフィド橋（ｂｒｉｄｇｅ）が切断され、５’−ＤＭＴ−オリ
ゴ−３’−ｐ−Ｏ− （ＣＨ2）3−ＳＨを得る。５’−チオール化（ｔｈｉｏｌ
ａｔｅｄ）したオリゴデオキシヌクレオチドの調製が、記載された（Ｋｕｍａｒ
ら（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．６：６８３−６８
８；Ｂｉｓｃｈｏｆｆら（１９８７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ １６４：３３６−３４４；Ｋｕｉｊｐｅｒｓら（１９９３）Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ ４９：１０９３１−４４）。３’−スルフヒドリル支持体を使
用する３’−チオールオリゴマーの固相合成は、当該分野において周知の技法に
よって達成され得る；例えば、Ｇｕｐｔａら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：３０１９−３０２５を参照のこと。
【００８４】 このスキームに従うオリゴマーの精製は、３工程プロセスを包含する。固体支
持体から放出されたオリゴマーを、５’捕捉およびＢｅｋｅｒＰｈｅｎｙｌカラ
ム（ＢＰ）または過剰の還元剤およびいくらかの非−ＤＭＴ種を除去する他の手
段を使用する精製に供す。全てのＤＭＴ含有種は、例えば７５％メタノール含有
５０ｍＭ ＴＥＡＡの溶液を用いて、溶出され得る。
【００８５】 あるいは、ＤＭＴ含有種は、脱塩カラム、疎水性相互作用カラム、またはサイ
ズ（例えば、脱塩のために）または疎水性（例えばＤＭＴ欠乏種からＤＭＴ含有
種を分離するために）に基づいて選択する他の分離手段を使用して、過剰の還元
剤から分離され得る。
【００８６】 ＤＭＴ含有種を含有する溶離液は、次いで、活性化チオール捕捉支持体（例え
ば、ＣＰＧ−Ｓ−Ｓ−ピリジン）における捕捉に供される。これは、この溶離液
を、活性化チオール捕捉支持体（ＣＰＧ−Ｓ−Ｓ−ピリジン）のショートカラム
へ適用することによって達成され得る。あるいは、この分離は、バッチ分離プロ
トコルを使用してなされ得る。結合されていない物質は、高塩緩衝液（例えば、
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８）を用いて洗い流される。
【００８７】 この捕捉されたオリゴマーを、次いで、以下のいずれかによって回収する：（
１）このオリゴマーを、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を使用して捕捉支持体配列か
ら溶液中へ放出し、次いで溶液中で３’切断可能リンカーを切断するか（例えば
、ジシリルオキシリンカーについて）、あるいは（２）捕捉されたオリゴマー内
のリンカー分子を、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化する、例えば、Ｌ１リンカーに
ついて、続いて高塩緩衝液中でマイルド塩基での処理。
【００８８】 オリゴマーのさらなる精製は、Ｈｏｒｎら（１９８８）前出に記載のように、
上記の３’捕捉工程の産物を、逆相または疎水性相互作用カラムへ適用し、５’
−Ｏ−ＤＭＴの存在を利用することによって実施され得る。
【００８９】 Ｌ１ ３’結合可能リンカーを使用する、組み合わせたチオール捕捉／ＤＭＴ
選択による、オリゴヌクレオチド精製の例は、スキーム１に示される。スキーム
１Ａは、固体支持体から放出され、かつ５’−Ｏ−ＤＭＴ基および３’−ＣＭ１
−ｐ−（ＣＨ2）3−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）3−ＯＨ部分を含むオリゴヌクレオチド産
物（Ｔ3ｄＡＴ3）を示す。所望のオリゴヌクレオチド種（１）に加えて、この産
物は、無塩基部位（２）を含むオリゴヌクレオチドと混入される。この無塩基部
位は、固体支持体からの放出の前の、オリゴマー内の環外アミン基およびホスフ
ェート基の脱保護から生じ得る。全長オリゴマーの水酸化アンモニウム脱保護処
理によって、以下のスキーム１Ｂにおいて示される少なくとも３種が生じる：（
ａ）５’−Ｏ−ＤＭＴ部分および３’−ＣＭ１−ｐ−（ＣＨ2）3−Ｓ−Ｓ−（Ｃ
Ｈ2）3−ＯＨ部分を有する、完全に脱保護されたインタクトな全長オリゴマー（
１）；（２）５’−Ｏ−ＤＭＴ部分および無プリン部分を有する３’末端を有す
る種（３）；ならびに（３）５’ホスフェートおよび３’−ＣＭ１−ｐ−（ＣＨ 2 ）3−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）3−ＯＨ部分を有する種（４）。脱保護種の還元剤（例
えば、ＤＴＴ）での処理によって、種（１）および（４）における３’−ＣＭ１
−ｐ−（ＣＨ2）3−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）3−ＯＨの３’−ＣＭ１−ｐ−（ＣＨ2）3 −ＳＨへの変換が生じる（スキーム１Ｃ）。
【００９０】 種（１）、（３）および（４）を含む溶液のＢＰ逆相カラムへの通過によって
、種（１）および（３）（これは、５’−Ｏ−ＤＭＴ部分を有する）のその上で
の保持が生じる。種（４）は、保持されない（スキーム１Ｄ）。スキーム１Ｄ〜
１Ｅにおいて示されるように、種（１）および（３）の活性化チオール捕捉支持
体（例えば、ＣＰＧ−Ｓ−Ｓ−ピリジン）への曝露によって、種（１）のみの共
有捕捉が生じて種（５）が生じ、それによって、５’および３’選択による全長
オリゴマーの精製が実施される。スキーム１Ｅは、種（６）が形成されるリボ−
ジオール系の過ヨウ素酸切断による、捕捉支持体からの精製オリゴマーの放出、
ならびに全長精製Ｔ3ｄＡＴ3−３’−ｐ（７）を生じる塩基性条件下でのβ脱離
を示す。スキーム１Ｅにおいて、種（６）および（７）の３’部分のみが示され
る。さらなる逆相カラム精製工程が、オリゴマーの脱トリチル化の前に、実施さ
れ得る。
【００９１】 スキーム２は、スキーム１において示されるプロセスと同様の３’チオール捕
捉プロセスの例を提供し、ここで、３’部分が、−Ｎｕ−３’−Ｏ−Ｓｉ（アル
キル）2−Ｏ−Ｓｉ（アルキル）2−ｐ−（アルキル）−Ｓ−Ｓ−（アルキル）−
ＯＨ、例えば−Ｎｕ−３’−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2）2−Ｏ−Ｓｉ（Ｃ
Ｈ（ＣＨ3）ＣＨ2）2−ｐ−（ＣＨ2）3−Ｓ−Ｓ−Ｐｒ−ＯＨである。精製を、
スキーム１に関して記載されるのと同様である。しかし、捕捉されたオリゴヌク
レオチドは、ＤＴＴを用いて支持体から放出され、続いてフッ化物試薬（例えば
、ＴＢＡＦおよびＴＥＡ（ＨＦ）3）を使用してジシリルオキシリンカーが切断
される。
【００９２】
【化８】
【００９３】
【化９】
【００９４】
【化１０】
【００９５】
【化１１】
【００９６】
【化１２】
【００９７】
【化１３】
【００９８】
【化１４】
【００９９】
【化１５】
【０１００】
【化１６】
【０１０１】
【化１７】
【０１０２】
【化１８】 （アルデヒド捕捉）−オリゴマーは、標準的なリボヌクレオシド固体支持体上
で合成され、そして放出される。オリゴマーの３’末端での過ヨウ素酸ナトリウ
ムによる末端リボヌクレオシドの処理は、２つの隣接するアルデヒド基を有する
反応性ヌクレオシド中間体を生成し；これらは、支持体上でヒドラジド基と協奏
して反応し、安定なモルホリノ中間体を形成し得る。アルデヒド捕捉を用いる精
製は、以下の工程を用いてもたらされる。
【０１０３】 ５’−ＤＭＴ−オリゴマー−３’−ｐ−リボヌクレオチドは、過ヨウ素酸ナト
リウムにより酸化されて、２つのアルデヒド基を有する５’−ＤＭＴ−オリゴマ
ー−３’−ｐ−リボヌクレオチド(OX)を生じる。例えば、Ｈａｎｓｓｋｅら、（
１９７４）、前出、を参照のこと。酸化された構築物は、ペンダントヒドラジド
基を有する固体支持体（例えば、固体支持体−ＣＯ−ＮＨＮＨ2）上で捕捉され
、それによって安定なモルホリノ中間体を形成する。非結合物質は、Ｈａｎｓｓ
ｋｅら、（１９７４）、前出、に記載されるように高塩緩衝液で洗い流される。
３’−捕捉配列は、リンカー部分の切断によって放出されるが、オリゴマーは直
交リンカー（例えば、ジシリルオキシリンカーおよびＬ２リンカー）に対する支
持体に付着される。しかし、Ｌ１リンカーは、この状況において直交リンカーと
みなされない。なぜならば、リボヌクレオチド捕捉部分の酸化は、これらに含ま
れるＬ１リボ−ジオール系の酸化もまた生じるからである。必要に応じて、放出
される物質を有する溶液は、Ｈｏｒｎら、（１９８８）、前出、に記載されるよ
うにＢａｋｅｒフェニルカートリッジに直接適用される。
【０１０４】 無塩基部位の３’切断可能なリンカーを用いて組み合わされたアルデヒド捕捉
／ＤＭＴ選択によるオリゴヌクレオチドの精製の例を、スキーム３に示す。スキ
ーム３Ａは、固体支持体から放出されており、そして５’−Ｏ−ＤＭＴ基および
３’−無塩基部位−ｐ−リボシチジン部分を含むオリゴヌクレオチド産物の調製
を示す。さらに、このオリゴヌクレオチドは、第２の無塩基部位を含む。これは
、上述のように、固体支持体からの放出の前の、オリゴマー中の環外アミンおよ
びリン酸基の脱保護の結果を示す。完全長オリゴマーの水酸化アンモニウム脱保
護処理は、スキーム３Ｂに示される少なくとも３つの種を生じる：（１）５’−
Ｏ−ＤＭＴ部分および３’−無塩基部位−ｐ−リボシチジン部分（１）を有する
完全に脱保護されたインタクトな完全長オリゴマー；（２）５’−Ｏ−ＤＭＴ部
分および３’−ＯＨ （３）を有する種；および（３）５’リン酸および３’−
無塩基部位−ｐ−リボシチジン部分（４）を有する種。
【０１０５】 種（１）、（３）および（４）を含む溶液のＢＰカラムの通過は、種（１）お
よび（３）（これらは、５’−Ｏ−ＤＭＴ部分を有する）のカラムでの保持を生
じる。第３の種は保持されない。種（１）および（３）のリボシチジン部分のリ
ボ−ジオール系の過ヨウ素酸酸化は、種（１’）におけるジアルデヒド部分の生
成を生じる。スキーム３Ｃに示されるように、種（１’）および（３）の支持体
結合ヒドラジド（例えば、ＣＰＧ−ヒドラジド）への曝露は、種（１’）のみの
捕捉を生じ、それによって、５’選択および３’選択による完全長オリゴマーの
精製をもたらす。スキーム３Ｄは、無塩基部位の切断による捕捉支持体からの精
製オリゴマーの放出を示す。さらなる逆相カラム精製工程は、オリゴマーの脱ト
リチル化の前に行われ得る。
【０１０６】
【化１９】
【０１０７】
【化２０】
【０１０８】
【化２１】
【０１０９】
【化２２】
【０１１０】
【化２３】 （オリゴヌクレオチドを精製するためのさらなるスキーム）−さらなる３’捕
捉スキームは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（すなわち、ＣＰ
Ｇ−Ｎｉ−ＮＴＡ（スキーム４を参照のこと）によるＮｉ−ＮＴＡを用いるＨｉ
ｓ6捕捉、一級アミン（例えば、ＤＩＴＣまたはフェニル−ＮＣＳ）と反応する
固定化部分を用いるアミン捕捉、固定化ホウ酸を用いるリボヌクレオチド捕捉、
ホウ酸カラムでの捕捉、アビジン誘導体化固体支持体での３’ビオチニル化オリ
ゴマー捕捉、抗ジニトロフェノール抗体保有固体支持体での３’−ジニトロフェ
ニル化オリゴマー捕捉などを含む。
【０１１１】 （ペプチド、ペプトイドおよびＰＮＡ：） （Ｎ末端）−Ｃａｎｎｅら、（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ ３８：３３６１−３３６４に記載されるような、適切な精製部分と共に
用いられ得るペプチド、ペプトイドおよびＰＮＡのＮ末端についての特殊なリン
カー。特殊な誘導体化アミノエチルスルホニルエチルオキシカルボニルハンドル
は、塩基で切断される。これはＨＦを含む強酸に安定である。
【０１１２】 好ましい実施態様では、アミノエチルチオエチルオキシカルボニル（「ＡＥＴ
ＥＯＣ」；ＮＨ−（ＣＨ2）2−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＣＯ−、）は、上記のように、
生体高分子を適切な捕捉部分に連結するために用いられる。ＡＥＴＥＯＣは、そ
のスルホニル対応物よりも塩基性条件により安定である。過ヨウ素酸による処理
の際に、ＡＥＴＥＯＣは、アミノエチルスルホエチルオキシカルボニル（−ＮＨ
−（ＣＨ2）2−ＳＯ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＣＯ−へと酸化される。これはＨＦを含
む強酸に安定であり、そして塩基で切断され得る。
【０１１３】 （Ｃ−末端）−ペプチド、ペプトイドおよびＰＮＡは、Ｃ末端が捕捉部分（例
えば、カルボキシヒドラジド部分、−Ｓ−Ｓ−結合、システイン残基など）を有
するように、当該分野で周知の方法によって調製され得る。このようなＣ末端捕
捉部分は、本明細書中に開示され、そして以下に例示されるような方法により、
生体高分子を精製するために用いられ得る。
【０１１４】 本発明は、オリゴマー（特に、オリゴヌクレオチド）の日常的な精製に関する
手作業の時間を劇的に減少させる簡便な２−カートリッジ精製法の概要を説明し
、そしてゲルおよびＨＰＬＣの使用を伴わずに、１マイクロスケールで合成３０
マーオリゴヌクレオチドについて、９５％を超える純度を有するオリゴマーを与
える。この単純化されたアプローチは自動化にもまた適する。
【０１１５】 本発明は、それらの好ましい特定の実施態様に関連して記載されるが、上の記
載および以下の実施例は、例示を目的とし、そして本発明の範囲を限定しないこ
とが理解される。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、発明が属する
当業者に明らかである。
【０１１６】 （実験） 本発明の実施は、他に言及しない限り、当外聞やの技術範囲内にある合成有機
化学、生化学、分子生物学などの従来の技術を用いる。そのような技術は、文献
において充分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
、第２版（１９８９）； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓら、編、１９８４）および一連のＭｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）を参
照のこと。
【０１１７】 以下の実施例において、使用した数字（例えば、量、温度など）に関して正確
さを確実にするための努力を行ったが、いくらかの実験誤差および偏差を考慮す
べきである。温度は、常に、摂氏度で与えられ、そして他に言及しない限り、圧
力は大気圧またはその付近である。
【０１１８】 （固相合成） ポリヌクレオチドを、米国特許第５，７１０，２６４号（Ｕｒｄｅａら）にお
いて詳細に説明されているように、固相での直接オリゴヌクレオチド合成、酵素
連結方法および溶液相化学合成の組合せを用いてアセンブルし得る。
【０１１９】 オリゴヌクレオチドの全ての化学合成は、自動ＤＮＡ合成機（Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｍｏ
ｄｅｌ ３８０Ｂ）において実施され得る。βシアノエチル型のホスホルアミダ
イト化学を、用いた。これには、５’−リン酸化（ここで、ＰＨＯＳＴＥＬTM試
薬（ＤＭＴ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−（ＳＯ2）−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−Ｐ（Ｎ（ＣＨ（Ｃ
Ｈ3）ＣＨ2）2）（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ）が含まれ、ＤＭＴはジメトキシトリ
チルであり、イソプロピルである)が含まれる。標準的な製造業者プロトコルを
、特に言及しない限り用いた。
【０１２０】 （捕捉支持体の調製） ＣＰＧ−Ｐｒ−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−Ｓ−Ｓ−ピリジンの調製：ＣＰＧ−
（ＣＨ2）3−ＮＨ2をＨｏｒｎ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓｅａｒｃｈ ２５：４８３５−４８４１に記載されるように調製した。２ｇの
ＣＰＧ−（ＣＨ2）3−ＮＨ2を、２００ｍｇの３，３’−ジチオジプロピ オン酸および１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（１ｍｌ）を含むＤＭＦ中
に懸濁し、そしてその容器を、１８時間機械的振盪器上で振盪した。このＣＰＧ
を、中程度のフリット付き濾紙を備える１００ｍｌの漏斗に移し、そして５×７
５ｍｌのＤＭＦ、５×７５ｍｌのメタノールで洗浄し、そして風乾した。支持体
ＣＰＧ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＣＯＯＨ
は、アミンについて陰性であると試験された（ニンヒドリン）。
【０１２１】 ＣＰＧ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ2）2−ＣＯＯ
Ｈを、Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液中の０．１Ｍ ＤＴＴ２０ｍｌで処理
し、そしてその容器を、２時間機械的振盪器上で振盪してすべてのジスルフィド
架橋を還元した。このＣＰＧを５×７５ｍｌのＭａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝
液、５×７５ｍｌの水、５×７５ｍｌのメタノールで徹底的に洗浄し、そして風
乾した。ＣＰＧ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＳＨは、Ｅｌｌｍａｎ
試薬を用いてチオールについて強度に陽性であると試験された。
【０１２２】 ＣＰＧ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−ＳＨを、ＤＭＦ中の０．２Ｍ
ピリジン−Ｓ−Ｓ−ピリジン２０ｍｌを用いて処理し、そしてその容器を２時間
機械的振盪器上で振盪した。このＣＰＧを、５×７５ｍｌのＭａｘｉｍ−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ緩衝液、５×７５ｍｌのメタノールで徹底的に洗浄し、そして風乾して
、ＣＰＧ−（ＣＨ2）3−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）2−Ｓ−Ｓ−ピリジン（「ＣＰＧ
−ＳＳＰｙ」）を得た。
【０１２３】 あるいは、この捕捉支持体を、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら（１９９２）Ｉｍｍｏｂ
ｉｌｉｚｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）２７４〜２７９頁の方
法に従って調製した。手短には、ＣＰＧ−（ＣＨ2）3ＮＨ2（ＣＰＧ Ｉｎｃ．
：５ｇ）を、５ｇのＮ−アセチルホモシステインＳ−チオラクトンを含有する、
５０ｍｌの１Ｍ ＮａＨＣＯ3中で懸濁し、そしてこのＣＰＧを室温で２４時間
振盪した。得られた支持体を５０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム、水、メタ
ノール、アセトニトリルで徹底的に洗浄し、そして風乾した。このＣＰＧ−ＳＨ
支持体は、２５μモル／ｇの遊離アミノ基および６０μモル／ｇのスルフヒドリ
ル基を含有していた。
【０１２４】 ＣＰＧ−ＳＨの活性化を、３．５ｇのＣＰＧ−ＳＨ支持体を、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）中の０．２Ｍの２，２’−ジピリジルジスルフィド３
０ｍｌで処理することによって行い、そしてその混合物を室温で２４時間振盪さ
せて放置した。活性化された支持体を、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルで
徹底的に洗浄し、そして風乾した。
【０１２５】 （実施例１：遊離の３’−ＯＨを有するオリゴマーの調製および精製） （オリゴマー合成） このオリゴマーを、特定の支持体ＤＭＴ−Ｔ−Ｓｉ2−ｐ−（ＣＨ2）3−ＳＳ
−（ＣＨ2）3−Ｏ−Ｓｕｃｃ−ＮＨ−（ＣＨ2）3−ＣＰＧ上で合成した。合成の
結果、最終のＤＭＴが残存した。その支持体からのそのオリゴマーの除去の前に
、固相に支持されたオリゴマーを、アクリロニトリル中の１５％ｔ−ブチルアミ
ンで処理して、すべてのβシアノエチル（ＢＣＥ）ホスフェート保護基を除去し
：これを行って、Ｍｉｃｈａｅｌ付加（アクリロニトリルにおける二重結合を含
む）を通じたスルフヒドリル基およびアミノ基と遊離したアセトニトリルの潜在
的な副反応を回避した。次いで、このオリゴマーを、その支持体から切断し、そ
して２０℃および５５℃で１８時間水酸化アンモニウムで完全に脱保護した。
【０１２６】 （精製） 完全に脱保護されたオリゴマーをＭａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液中の大過
剰のＤＴＴで、１時間処理した。このＤＴＴおよびＭａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ
緩衝液を、５００ｍｇのフェニル誘導体化されたシリカを含む逆相カートリッジ
Ｂａｋｅｒ Ｐｈｅｎｙｌ ＳＰＥカラムを用いて除去した。５０ｍＭの酢酸ト
リエチルアンモニウム中の３０％メタノール（３０％ＭｅＯＨ／ＴＥＡＡ）での
溶出によって、非ＤＭＴオリゴマーの不完全な溶出を生じ；７５％ＭｅＯＨ／Ｔ
ＥＡＡは、すべての非ＤＭＴオリゴマー種およびＤＭＴオリゴマー種を溶出した
。この７５％のＭｅＯＨ／ＴＥＡＡ溶出液を直接捕捉支持体ＣＰＧ−ＳＳＰｙに
適用した。その溶液（１０ｍｌ）を捕捉支持体全体に浸透させた（３０分かけて
）；この捕捉に続いてＵＶを照射し、これはすべてのＵＶ物質が、捕捉支持体上
に保持され、３５０ｎｍでのＰｙ−Ｓ−吸収の同時放出を伴ったことを示した。
この捕捉支持体を７５％のＭｅＯＨ／ＴＥＡＡ（１０ｍｌ）で洗浄し、そしてＭ
ａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液（１０ｍｌ）で洗浄し、これを、捕捉支持体全
体に浸透させた（３０分かけて）。このＭａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液によ
る洗浄物を、新鮮なＢＰに適用し、そしてオリゴマー物質を再単離した。このＭ
ａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液洗浄物は、３’−スルフヒドリル捕捉官能基を
欠くすべてのオリゴマーを完全に除去した。捕捉されたオリゴマー物質をＤＴＴ
／Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液（１ｍｌ）で遊離させ、これを捕捉支持体
全体に浸透させた（３０分かけて）。遊離したオリゴマー物質を含むこのＤＴＴ
／Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝溶液を、水（４ｍｌ）で希釈し、そして１ｍ
ｌの濃ＴＥＡ（ＨＦ）3を添加し、そしてその反応を２時間進ませた。その混合
物を、Ｏｒｉｇｏｎｕｃｌｅｒｏｔｉｄｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃａｒ
ｔｒｉｄｇｅ（「ＯＰＣ」（ＡＢＩ）に直接適用し、そしてＴＥＡＡで洗浄した
。３０％ＭｅＯＨ／ＴＥＡＡでの溶出は、非ＤＭＴオリゴマーを完全に除去し、
そして７５％ＭｅＯＨ／ＴＥＡＡは、その産物であるオリゴマーを純粋な形態で
溶出した。エバポレーションおよび脱トリチル化によって、精製されたオリゴマ
ーが得られた。捕捉効率は、約６５％であると決定された。
【０１２７】 （実施例２：３’−ホスフェートを有するオリゴマーの調製および精製） （オリゴヌクレオチド合成） このオリゴマーを、特定の支持体ＤＭＴ−Ｌ１−ｐ−（ＣＨ2）2−ＳＳ−（Ｃ
Ｈ2）2−Ｏ−Ｓｕｃｃ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−ＣＰＧ上で合成した。合成の結果、
最終のＤＭＴが残存した。その支持体からのそのオリゴマーの除去の前に、固相
に支持されたオリゴマーを、アセトニトリル中の１５％ｔ−ブチルアミンで処理
して、すべてのＢＣＥホスフェート保護基を除去し：これを行って、Ｍｉｃｈａ
ｅｌ付加（アクリロニトリルにおける二重結合を含む）を通じたスルフヒドリル
基およびアミノ基と遊離したアクリロニトリルの潜在的な副反応を回避した。次
いで、このオリゴマーを、その支持体から切断し、そして２０℃および５５℃で
１８時間水酸化アンモニウムで完全に脱保護した。
【０１２８】 （精製） 完全に脱保護されたオリゴマーをＭａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液中の大過
剰のＤＴＴで、１時間処理した。このＤＴＴおよびＭａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ
緩衝液を、ＢＰ逆相カートリッジを用いて除去した。５０ｍＭの酢酸トリエチル
アンモニウム中の３０％メタノール（３０％ＭｅＯＨ／ＴＥＡＡ）での溶出によ
って、非ＤＭＴオリゴマーの不完全な溶出を生じ；７５％ＭｅＯＨ／ＴＥＡＡは
、すべての非ＤＭＴオリゴマー種およびＤＭＴオリゴマー種を溶出した。この７
５％のＭｅＯＨ／ＴＥＡＡ溶出液を直接捕捉支持体ＣＰＧ−ＳＳＰｙに適用した
。その溶液（１０ｍｌ）を捕捉支持体全体に浸透させた（３０分かけて）；この
捕捉に続いてＵＶを照射し、これはすべてのＵＶ物質が、捕捉支持体上に保持さ
れ、３５０ｎｍでのＰｙ−Ｓ−吸収の同時放出を伴ったことを示した。この捕捉
支持体を７５％のＭｅＯＨ／ＴＥＡＡ（１０ｍｌ）で洗浄し、そしてＭａｘｉｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液（１０ｍｌ）で洗浄し、これを、捕捉支持体全体に浸透
させた（３０分かけて）。このＭａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液による洗浄物
を、新鮮なＢＰに適用し、そしてオリゴマー物質を再単離した。このＭａｘｉｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液洗浄物は、３’−スルフヒドリル捕捉官能基を欠くすべ
てのオリゴマーを完全に除去した。（捕捉されたオリゴマー物質をＤＴＴ／Ｍａ
ｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液（１ｍｌ）で遊離させ得、これを捕捉支持体全体
に浸透させた（１０分かけて）。遊離したオリゴマー物質は、ＢＰカラムを用い
て回収され得る。）。この捕捉したオリゴマー物質を、２段階手順によって３’
−ホスフェート形態においてその捕捉支持体から遊離させた。１）過ヨウ酸ナト
リウム溶液での処理は、固体に支持されたオリゴマー物質のＣＭ１でのシスジオ
ール系の酸化を生じた。２）２０ｍＭ ＮａＯＨ／Ｍａｘｉｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ
緩衝液での処理によって、その捕捉支持体からの遊離を生じた。この混合物を、
ＢＰカートリッジに直接適用し、そしてＴＥＡＡで洗浄した。３０％ＭｅＯＨ／
ＴＥＡＡでの溶出は、非ＤＭＴオリゴマーを完全に除去し、そして７５％ＭｅＯ
Ｈ／ＴＥＡＡは、純粋な形態においてその産物であるオリゴマーを溶出した。エ
バポレーションおよび脱トリチル化によって、精製されたオリゴマーが得られた
。捕捉効率は、約６５％であると決定された。
【０１２９】 代替の手順において、脱保護した粗オリゴマーを、ＤＴＴ／ＭＧで処理して、
−Ｓ−Ｓ−結合を切断し、そして過剰の試薬をＢＰカラムを用いて除去した。遊
離の３’−Ｘ−ＳＨを含む溶液をエバポレートして乾燥させ、そしてＭａｘｉｍ
−Ｇｉｌｂｅｒｔ緩衝液（１ｍｌ）中に溶解し、そしてＣＰＧ−Ｐｒ−ＳＳＰｙ
（ＣＰＧ Ｉｎｃ．）のカラムに直接適用した。３’スルフヒドリル基を欠くオ
リゴマーフラグメントを、メタノールを含有するＴＥＡＡを用いて洗浄すること
によって除去した。この産物であるオリゴマーを上記のように遊離させそして単
離した。捕捉効率は、約３３％であった。
【０１３０】 （実施例３：Ｃ末端カルボキシヒドラジドおよびＮ末端Ｆｍｏｃを有するポリ
ペプチドの調製および精製） （ポリペプチド合成） このオリゴマーを、Ｗａｎｇ型支持体（Ｈ2Ｎ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3） 2 −（ＣＨ2）2−φ−ポリマー上で合成する。そのポリペプチドの伸長を、構造
Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ａａ（ベンジル）−ＣＯＯＨを有するモノマー単位を用いて達
成する。ここで、「ａａ（ベンジル）」とは、ベンジル側鎖保護基を有するアミ
ノ酸である。最終の固定化されたオリゴペプチドは、構造Ｆｍｏｃ−ＮＨ−［ａ
ａ（ベンジル）−ＣＯ］n−ＮＨ−ａａ1（ベンジル）−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ
−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）2−（ＣＨ2）2−φ−ポリマーを有する。標準的な酸脱保護は
、ベンジル側鎖基の除去を生じ、そして、部分的に保護された形態：Ｆｍｏｃ−
ＮＨ−ペプチド−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2でのそのオリゴペプチドの遊離を生じる。
【０１３１】 （精製） 部分的に保護されたオリゴペプチドを、上記のようにアルデヒド部分を有する
捕捉支持体上で捕捉してＦｍｏｃ−ＮＨ−ペプチド−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−支
持体を得た。接着されるのと同じ形態における、結合したオリゴペプチドの捕捉
支持体からの遊離を、ホルムアルデヒドとの交換を介してＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝を切
断することによって達成する（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ（１９５８）Ｊ．Ｏｒｇ．
Ｃｈｅｍ．２３：６４６−６４７）。あるいは、結合したオリゴペプチドの遊離
酸形態を、直接の酸化および加水分解によって遊離する（Ｂａｒｔｏｎら（１９
７２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎｓ Ｔｒａｎｓ．Ｉ １９７２：
９２９）。
【０１３２】 捕捉支持体から遊離した部分的に保護されたオリゴペプチドを疎水性クロマト
グラフィーカラムに通過させることで、Ｆｍｏｃ保有種の保持が生じる。次いで
、このＦｍｏｃ基を、塩基での処理によって除去し、そしてそのＣＯ−ＮＨ−Ｎ
Ｈ2を、まだカルボキシレート形態ではない場合、酸化および加水分解によって
除去する（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ、前出）。
【０１３３】 （実施例４：Ｃ末端カルボキシヒドラジドおよびＮ末端捕捉部分を有するポリ
ペプチドの調製および精製） （ポリペプチド合成） このオリゴマーを、Ｗａｎｇ型支持体（Ｈ2Ｎ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3） 2 −（ＣＨ2）2−φ−ポリマー上で合成する。そのポリペプチドの伸長を、上記
実施例３に記載のように、構造Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ａａ（ベンジル）−ＣＯＯＨを
有するモノマー単位を用いて達成する。最終の固定化されたオリゴペプチドは、
構造Ｆｍｏｃ−ＮＨ−［ａａ（ベンジル）−ＣＯ］n−ＮＨ−ａａ1（ベンジル）
−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）2−（ＣＨ2）2−φ−ポリマーを有
する。当業者に周知のさらなる合成手順を使用して、必要に応じて特異的リンカ
ーおよび捕捉部分（「ＣＭ」）を付加して、ＣＭ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−Ｓ−（Ｃ
Ｈ2）2−Ｏ−ペプチド−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）2−（ＣＨ2
）2−Ｓ−（ＣＨ2）2−φ−ポリマーを得る。標準的な酸脱保護は、ベンジル側
鎖基の除去を生じ、そして、部分的に保護された形態：ＣＭ−ＮＨ−（ＣＨ2）2 −Ｓ−（ＣＨ2）2−ペプチド−ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2でのそのオリゴペプチドの遊
離を生じる。
【０１３４】 （精製） 部分的に保護されたオリゴペプチドを、上記のようにアルデヒド部分を有する
捕捉支持体上で捕捉してＣＭ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−Ｓ−（ＣＨ2）2−ペプチド−
ＣＯ−ＮＨ−ＮＨ2支持体を得る。接着されるのと同じ形態における、結合した
オリゴペプチドの捕捉支持体からの遊離を、ホルムアルデヒドとの交換を介して
ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝を切断することによって達成する（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，前
出）。あるいは、結合したオリゴペプチドの遊離酸形態を、直接の酸化および加
水分解によって遊離する（Ｂａｒｔｏｎら，前出）。
【０１３５】 その捕捉支持体から遊離した捕捉部分を有する部分的に保護されたオリゴペプ
チドをその捕捉支持体が特異的に相互作用し得る部分を保有する支持体媒体を用
いて捕捉する（例えば、その捕捉部分がビオチンである場合、その固体支持体は
、アビジン部分を有し、その捕捉部分がＨｉｓ6である場合、その固体支持体は
、Ｎｉ−ＮＴＡ部分を有するなど）。その捕捉支持体から遊離して精製されたオ
リゴペプチドを得ることは、酸化に続く塩基での処理によって達成される。
【０１３６】 （実施例５：Ｃ末端のスルフヒドリルおよびＮ末端Ｆｍｏｃを有するポリペプ
チドの調製および精製） （ポリペプチド合成） このオリゴマーを、Ｗａｎｇ型支持体（Ｆｍｏｃ−ＨＮ−ＣＨ（ＣＯＯＲ）−
ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）2−（ＣＨ2）2−φ−ポリマ
ー上で合成した。そのポリペプチドの伸長を、上記実施例３に記載のように、構
造Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ａａ（ベンジル）−ＣＯＯＨを有するモノマー単位を用いて
達成して、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ペプチド−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＲ）−ＣＨ2
−Ｓ−Ｓ−Ｒ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）2−（ＣＨ2）2−φ−ポリマーを得
る。結合したポリペプチドの脱保護によって、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ペプチド−ＣＯ
−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＲ）−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−Ｒ−ＮＨ2を得る。ジチオスレイト
ールのような還元剤での処理によって、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ペプチドーＣＯ−ＮＨ
−ＣＨ（ＣＯＯＲ）−ＣＨ2−ＳＨを得る。
【０１３７】 （精製） 部分的に保護されたオリゴペプチドを、上記のように捕捉支持体−Ｓ−Ｓ−ピ
リジン上で捕捉してＦｍｏｃ−ＮＨ−ペプチド−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＲ）
−ＣＨ2−Ｓ−Ｓ−捕捉支持体を得る。捕捉支持体からの結合したオリゴペプチ
ドの遊離を、ＤＴＴでの処理によって達成して、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ペプチド−Ｃ
Ｏ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＲ）−ＣＨ2−ＳＨを得る。
【０１３８】 その捕捉支持体から遊離した部分的に保護されたオリゴペプチドを疎水性クロ
マトグラフィーカラムに通過させることによって、Ｆｍｏｃ保有種の保持が生じ
る。次いで、このＦｍｏｃ基を塩基での処理によって除去する。
【０１３９】 あるいは、構造Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＣＨ（ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−φ）−ＣＯＯＨを
、最初の残基として有するモノマーを固体支持体に結合させる。ペプチドアセン
ブリおよび脱保護の後に、得られたＦｍｏｃ−ＮＨ−ペプチド−ＣＯ−ＮＨ−Ｃ
Ｈ（ＣＯＯＲ）−ＣＨ2−ＳＨを上記のように捕捉および遊離し得る。
【０１４０】 （実施例６：Ｃ末端カルボキシヒドラジドおよびＮ末端捕捉部分を有するペプ
トイドの調製および精製） （サブモノマーペプトイド合成） このオリゴペプトイドを、Ｗａｎｇ型支持体（Ｈ2Ｎ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（
ＣＨ3）2−（ＣＨ2）2−φ−ポリマー上で合成する。そのオリゴペプトイドの伸
長を、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１
４：１０６４６−１０６４７に記載されるように、モノマー単位Ｂｒ−ＣＨ2−
ＣＯＯＨおよびＲ1−ＮＨ2を用いて行う。ここで、Ｒは、側鎖の置換基を表す。
最終の固定化されたオリゴペプトイドは、構造Ｒ(n+1)−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−［
Ｎ（Ｒn）−ＣＯ］n−ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）2−（ＣＨ2）2−φ−
ポリマーを有する。当業者に周知のさらなる合成手順を使用して、必要に応じて
特異的リンカーおよび捕捉部分（「ＣＭ」）を付加して、ＣＭ−ＮＨ−（ＣＨ2
）2−Ｓ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＣＯ−Ｎ（Ｒ(n+1)）−ＣＯ［Ｎ（Ｒn）−ＣＯ］n−
ＮＨ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｃ（ＣＨ3）2−（ＣＨ2）2−φ−ポリマーを得る。ＣＭ
−ＮＨ−（ＣＨ2）2−Ｓ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＣＯ−ペプトイド−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ
Ｈ2の形態における粗混合物の切断は、実施例４に記載されるように行う。
【０１４１】 （精製） ＣＭ−ＮＨ−（ＣＨ2）2−Ｓ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＣＯ−ペプトイド−ＣＯ−Ｎ
Ｈ−ＮＨ2を、アルデヒド部分を有する捕捉支持体上で捕捉してＣＭ−ＮＨ−（
ＣＨ2）2−Ｓ−（ＣＨ2）2−Ｏ−ＣＯ−ペプトイド−ＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−捕
捉支持体を得る。接着されるのと同じ形態における、結合したオリゴペプチドの
捕捉支持体からの遊離を、ホルムアルデヒドとの交換を介してＣＯ−ＮＨ−Ｎ＝
を切断することによって達成する（Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，前出）。あるいは、
結合したオリゴペプトイドの遊離酸形態を、本明細書中の実施例３に記載される
ように、直接の酸化および加水分解によって遊離する（Ｂａｒｔｏｎら，前出）
。
【０１４２】 その捕捉支持体から遊離した捕捉部分を有する部分的に保護されたオリゴペプ
トイドを、例えばＣＭがＦｍｏｃか、または捕捉が特異的に相互作用し得る部分
を有する支持体媒体（例えば、ＣＭがビオチンである場合、その固体支持体はア
ビジン部分を有し、ＣＭがＨｉｓ6である場合、その固体支持体はＮｉ−ＮＴＡ
部分を有する等々）である場合に、疎水性クロマトグラフィーを用いて捕捉する
。その捕捉支持体から遊離して精製されたオリゴペプチドを得ることは、酸化に
続く塩基での処理によって達成される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、本発明の方法を使用する、目的のオリゴマーセグメントの精製の概
略図である。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、本発明の方法を使用する、目的のオリゴマーセグメントの精製の概
略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 5/04 Ｃ０７Ｋ 5/04 7/00 7/00 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C057 AA10 DD01 MM04 4H045 AA20 FA33 FA40 FA61 GA25

Claims (16)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の工程を包含する、目的の精製オリゴマーセグメントを
    調製するための方法： （ａ）第１の選択的に切断可能な結合、第２の選択的に切断可能な結合、および
    第３の選択的に切断可能な結合を有する、支持体結合オリゴマーを提供する工程
    であって、該目的のオリゴマーセグメントは、該第２の選択的に切断可能な結合
    および第３の選択的に切断可能な結合に隣接され、さらに第１の捕捉部分は、該
    オリゴマーの遊離末端に存在し、そして第２の捕捉部分は、該第１の選択的に切
    断可能な結合と第３の選択的に切断可能な結合との間に存在する、工程； （ｂ）該第１の選択的に切断可能な結合を切断して、該支持体から該オリゴマー
    を放出する工程； （ｃ）該放出されたオリゴマーを、該第１の捕捉部分に結合することによって該
    放出されたオリゴマーを選択的に保持する第１の捕捉媒体とインキュベートして
    、第１の捕捉媒体−オリゴマー複合体を形成する工程； （ｄ）該第２の選択的に切断可能な結合を切断する工程； （ｅ）工程（ｄ）の該オリゴマー産物を、該第２の捕捉部分に選択的に結合する
    第２の補足媒体とインキュベートして、第２の捕捉媒体−オリゴマー複合体を形
    成する工程；および （ｆ）該第３の選択的に切断可能な結合を切断して、精製形態の該目的のオリゴ
    マーセグメントを提供する工程。
  2. 【請求項２】 前記オリゴマーが、オリゴヌクレオチドである、請求項１に
    記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記オリゴマーが、オリゴペプチドである、請求項１に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 前記オリゴマーが、オリゴサッカリドである、請求項１に記
    載の方法。
  5. 【請求項５】 前記第１の捕捉媒体および前記第２の捕捉媒体が、逆相クロ
    マトグラフィー媒体、疎水性相互作用クロマトグラフィー媒体、およびそれらの
    組み合せからなる群から独立して選択される、請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記第１の捕捉部分が、５’−チオールまたは５’−ジアル
    デヒドを含む、請求項２に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記第２の捕捉部分が５’−チオールまたは５’−ジアルデ
    ヒドを含む、請求項２に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記第３の選択的に切断可能な結合が、以下からなる群から
    選択される、請求項２に記載の方法：（ａ）Ｎ4−（ＤＭＴ−Ｏ−Ｒ5）−２’，
    ３’−Ｏ−ベンゾイル−リボＮｕ1（ここで、Ｒ5は、低級のアルキレン、アリー
    レン、アラルキレン、またはアルカリーレン、およびリボＮｕ1は、５’−リボ
    アデニン、５’−リボチミジン、５’−リボグアニン、５’−リボシチジンもし
    くは５’−リボウリジンである）、（ｂ）−Ｏ−Ｒ6−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ7）（Ｒ8）
    −Ｏ−Ｓｉ（Ｒ9）（Ｒ10）−５’−Ｏ（ここで、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10は
    、独立して、低級のアルキル、アリール、アラルキル、またはアルカリールであ
    る）、ならびに（ｃ）以下の構造式を有する無塩基部位 【化１】 （ここで： ＣＰ２は、５’−末端捕捉部位であり；および Ｒは、以下からなる群から選択され、 【化２】 ここで、Ｒ’は、水素、アリール、またはアラルキルであり、Ｒiは、同じであ
    り得るかまたは異なり得、そしてアミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、低
    級アルキルおよび低級アルコキシからなる群から選択され、Ｒjは、同じであり
    得るかまたは異なり得、そしてアミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、低級
    アルキルおよび低級アルコキシからなる群から選択され、ｉは、０、１、２もし
    くは３、およびｊは、０、１、２、３もしくは４である）。
  9. 【請求項９】 前記第３の選択的に切断可能な結合が、−Ｏ−Ｒ6−Ｏ−Ｓ
    ｉ（Ｒ7）（Ｒ8）−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ9）（Ｒ10）−５’−Ｏである、請求項８に記
    載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記第３の選択的に切断可能な結合が、−Ｏ−（ＣＨ2）2 −Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ（ＣＨ3）2）2−Ｏ−（ＣＨ（ＣＨ3）2）2−５’−Ｏである、
    請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記第２の選択的に切断可能な結合が、以下からなる群か
    ら選択される請求項２に記載の方法： Ｎ4−（ホスホリル−６−オキシヘキシル）シチジン、２’，３’−イソプロピ
    リジン−Ｎ4−（ホスホリル−６−オキシヘキシル）シチジン、−Ｐ−Ｏ−アル
    キレン−Ｏ−Ｓ−アルキレン−Ｏ−ｐ−、Ｎｕ2−Ｒ11−Ｏ−ｐ−ＮＨ−Ｒ12、
    アリルリン酸リンカー、−Ｎｕ2−３’−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ13）（Ｒ14）−Ｏ−Ｓｉ
    （Ｒ15）（Ｒ16）−Ｏ−、−Ｎｕ2−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ18）（Ｒ19）−２−Ｏ−、Ｎ
    ｕ2−３’−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ21）（Ｒ22）−Ｒ23−Ｓｉ（Ｒ24）（Ｒ25）−Ｏ−、
    ２’−Ｏ−ＰＧ−リボヌクレオチド、Ｎｕ2−Ｏ−Ｒ27Ｓ−、Ｎｕ2−Ｏ−Ｒ29−
    Ｏ−Ｒ30（ＮＯ2）、およびＮｕ2−Ｏ−ｐ−Ｏ−Ｒ31−ＮＨ（アリルオキシカル
    ボニル）−Ｏ−、 ここで、 Ｎｕ2は、前記オリゴマーの３’末端ヌクレオチドであり、 Ｒ11は、ヌクレオシドであり、 Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15、Ｒ16、Ｒ18、Ｒ19、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ23、Ｒ24、
    Ｒ25、Ｒ27は、独立して、低級のアルキル、アリール、アラルキル、もしくはア
    ルカリールであり、 Ｒ29およびＲ31は、は低級アルキルであり、ならびに Ｒ30は、アリール、アラルキル、もしくはアルカリールである。
  12. 【請求項１２】 前記第２の選択的に切断可能な結合が、以下からなる群か
    ら選択される、請求項２に記載の方法： Ｎ4−（ホスホリル−６−オキシヘキシル）シチジン、２’，３’−イソプロピ
    リジン−Ｎ4−（ホスホリル−６−オキシヘキシル）シチジン、−Ｐ−Ｏ−アル
    キレン1−Ｓ−アルキレン2−Ｏ−ｐ−（ここで、少なくとも１つのアルキレン1
    およびアルキレン2は、エチレンである）、Ｒ11−Ｏ−ｐ−ＮＨ−Ｒ12（ここで
    、Ｒ11はヌクレオシドであり、およびＲ12はアルキル、アリール、アラルキルも
    しくはアルカリールである）、アリルリン酸リンカー、 −Ｎｕ2−３’ −Ｏ−Ｓｉ（Ｒ13）（Ｒ14）−Ｏ−Ｓｉ（Ｒ15）（Ｒ16）−Ｏ
    −Ｒ17（ここで、Ｎｕ2は、前記オリゴマーの３’末端ヌクレオチドであり、Ｒ1 3 、Ｒ14、Ｒ15、およびＲ16は、独立して、低級のアルキル、アリール、アラル
    キル、もしくはアルカリールであり、ならびにＲ17は捕捉部分である）、Ｎｕ2
    −Ｏ−Ｓｉ（Ｒ18）（Ｒ19）−２−Ｏ−Ｒ20（ここで、Ｎｕ2は、上記に定義れ
    るものであり、Ｒ18およびＲ19は、独立して、低級のアルキル、アリール、アラ
    ルキル、もしくはアルカリールであり、ならびにＲ20は捕捉部分である）、Ｎｕ 2 −Ｏ−Ｓｉ（Ｒ21）（Ｒ22）−Ｒ23−Ｓｉ（Ｒ24）（Ｒ25）−Ｏ−Ｒ26（ここ
    で、Ｎｕ2は、前記オリゴマーの３’末端ヌクレオチドであり、Ｒ21、Ｒ22、Ｒ2 3 、Ｒ24、およびＲ25は、独立して、低級のアルキル、アリール、アラルキル、
    もしくはアルカリールであり、ならびにＲ26は捕捉部分である）、２’−Ｏ−Ｐ
    Ｇ−リボヌクレオチド（ここで、ＰＧは、ｔ−ブチル−ジメチル−シリルである
    ）、リン酸、１−メトキシシクロヘキシルエーテル、メチルチオメチルエーテル
    、シロキシメチルエーテル、Ｎｕ2−Ｏ−Ｒ27Ｓ−Ｒ28（ここで、Ｎｕ2は、前記
    オリゴマーの３’末端ヌクレオチドであり、Ｒ27は低級のアルキル、アリール、
    アラルキル、もしくはアルカリールであり、ならびにＲ28は捕捉部分である）、
    Ｎｕ2−Ｏ−Ｒ29−Ｏ−Ｒ30（ＮＯ2）（ここで、Ｎｕ2は、前記オリゴマーの３
    ’末端ヌクレオチドであり、Ｒ29は、低級アルキルであり、ならびにＲ30は、ア
    リール、アラルキル、もしくはアルカリールである）、アルキルジオールアミン
    から誘導されたリンカー（ここで、該誘導体は、式Ｎｕ2−Ｏ−ｐ−Ｏ−Ｒ31−
    ＮＨ（アリルオキシカルボニル）−Ｏ−を有し、ここで、Ｎｕ2は、該オリゴマ
    ーの３’末端ヌクレオチドであり、およびＲ31は、低級アルキルである）、なら
    びに以下の式を有する選択的に切断可能な無塩基部位 【化３】 （ここで： Ｒは、以下からなる群から選択され、 【化４】 ここで、Ｒ’は、水素、アリール、またはアラルキルであり、Ｒiは、同じであ
    り得るかまたは異なり得、そしてアミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、低
    級アルキルおよび低級アルコキシからなる群から選択され、Ｒjは、同じであり
    得るかまたは異なり得、そしてアミノ、ニトロ、ハロゲン、ヒドロキシル、低級
    アルキルおよび低級アルコキシからなる群から選択され、ｉは、０、１、２もし
    くは３、およびｊは、０、１、２、３もしくは４である）。
  13. 【請求項１３】 前記第１の捕捉部分が、３’−チオール部分、３’−ブロ
    モアセチル部分、３’−マリミド部分、３’−ジアルデヒド部分、ヒドラジド部
    分、（６−ヒスタミニルプリン）6部分、ジオール部分、ジニトロフェニル部分
    、およびディールス−アルダー部分からなる群から選択される、請求項２に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】 前記第２の捕捉部分が、３’−チオール部分、３’−ブロ
    モアセチル部分、３’−マリミド部分、３’−ジアルデヒド部分、ヒドラジド部
    分、（６−ヒスタミニルプリン）6部分、ジオール部分、ジニトロフェニル部分
    、およびディールス−アルダー部分からなる群から選択される、請求項２に記載
    の方法。
  15. 【請求項１５】 以下の構造式（Ｉ）を有する支持体結合オリゴマー： （Ｉ） Ｓ−［Ｘ１］n1−ＳＣ１−ＣＰ２−［Ｘ２］n2−ＳＣ３−Ｔ1−Ｘ−Ｔ2 −ＳＣ２−ＣＰ１ ここで： Ｔ1およびＴ2は、各々、第１および第２のオリゴマー末端を表し； Ｓは、固体支持体を表し； Ｘは、目的のオリゴマーセグメントを表し； Ｘ１およびＸ２は、モノマーまたはＦ１−オリゴマーセグメントを表し； ｎ１およびｎ２は、独立して０または１を表し； ＳＣ１は、第１の選択的に切断可能な結合を表し； ＳＣ２は、第２の選択的に切断可能な結合を表し； ＳＣ３は、第３の選択的に切断可能な結合を表し； ＣＰ１は、第１の捕捉部分を表し；ならびに ＣＰ２は、第２の捕捉部分を表する。
  16. 【請求項１６】 前記オリゴマーがオリゴヌクレオチドである、請求項１５
    に記載の固体支持体結合オリゴマーであって、そしてここで： Ｔ1およびＴ2は、各々、前記３’末端および５’末端であり； ＣＰ１は、５’末端捕捉部分を表し； ＳＣ２は、５’切断可能なリンカーを表し； ＳＣ３は、３’切断可能なリンカーを表し； ＣＰ２は、３’末端捕捉部分を表し； ＳＣ１は、合成放出部分を表す；ならびに Ｓは、固体合成支持体を表する、 オリゴマー。
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