DE69930647T2

DE69930647T2 - Struktur-analoga von amin-basen und nucleosiden

Info

Publication number: DE69930647T2
Application number: DE69930647T
Authority: DE
Inventors: David Segev
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1998-08-07
Filing date: 1999-08-04
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2019-08-05
Also published as: EP1102782A1; JP4623828B2; WO2000008041A9; WO2000008041A1; US6335432B1; EP1102782B1; CA2339967C; JP2002522446A; CA2339967A1; DE69930647D1; EP1102782A4

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Verbindung gemäß den Ansprüchen 1, 8 und 18 und auf ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung gemäß den Ansprüchen 19, 20 und 21.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf fluoreszierende Strukturanaloga der nicht-fluoreszierenden Nukleobasen (Aminbasen, Stickstoffbasen) und Nukleoside, die herkömmlich in DNA und RNA gefunden werden, Verfahren ihrer Derivatisierung und anschließende Verwendung davon, Verwendung in der chemischen oder enzymatischen Synthese von fluoreszierenden Oligonukleotiden (Polynukleotiden) und auf ihre neue und nützliche Anwendung als Sonden in Hybridisierungs- und Sequenzierungs-Reaktionen und dergleichen. Zusätzlich bezieht sich die vorlegende Erfindung auf Anwendungen, in denen fluoreszierende Strukturanaloga für spezifische nicht fluoreszierende Nukleoside in vorgeschriebenen DNA- oder RNA-Sequenzen substituiert werden, und auf Verfahren zur Verwendung fluoreszierender Oligonukleotide als Hybridiesierungsreagenzien und -sonden für diagnostische und therapeutische Zwecke und als diagnostische und therapeutische Forschungswerkzeuge. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Maleimidderivate von Pyrimidinen, wie Uridin und Cytidin an ihrer C-5 Position, und auf Maleimidderivate von Purinen, wie Adenin und Guanin an ihrer 8-Position, und auf Verfahren zu ihrer Synthese und der Struktur und Synthese von Nukleosid-triphosphaten und -phosphoramidite, usw., die diese Derivate beinhalten.
Die sechs herkömmlich auftretenden N-Nukleoside, die in der Zusammensetzung von DNA und RNA aus sämtlichen Quellen vorherrschen, haben die folgenden Strukturen:
wobei: R₆ ist N für Inosin und NH₂ für Guanosin, R₉ ist H für Uridin und CH₃ für Thymidin. Außerdem, R₁₂, R₁₄ = OH für Ribonukleotide, R₁₂ = OH, R₁₄ = H für 2'-Deoxynukleotide, R₁₂ = H, R₁₄ = OH für 3'-Deoxynukleotide, und R₁₂, R₁₄ = N in Dideoxynukleotiden.
Die sechs herkömmlich auftretenden Nukleotide absorbieren kein Licht bei Wellenlängen >290 nm und sind effektiv nicht-fluoreszierend unter physiologischen Bedingungen. Derivate der herkömmlich auftretenden N-Nukleotide sind für eine Vielfalt von synthetischen, diagnostischen und therapeutischen Zwecken bekannt, einschließlich Substitutionen an sowohl der heterozyklischen Base als auch dem Furanosering. Diese Substitutionen können an folgenden gezeigten Positionen erfolgen:
wobei: R₄ ist eine reaktive Gruppe, derivatisierbar mit einer detektierbaren Markierung (NH₂, SN, =O, und die einen optionalen verknüpfenden Anteil einschließen kann, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, eine Amid, Thioether oder Disulfidverknüpfung oder eine Kombination davon, mit zusätzlichen variablen reaktiven Gruppen R₁ bis R₃, z.B. R₁-(CN₂)_x-R₂, oder R₁-R₂-(CH₂)_x-R₃-, worin: x ist eine ganze Zahl in dem Bereich von 1 und 25 einschließlich; und R₁, R₂ und R₃ können sein: ein H, OH, Alkyl, Acyl, Amid, Thioether oder Disulfid; R₅ ist H oder Teil einer Ethenoverknüpfung mit R₄; R₆ ist H, NH₂, SH, oder =O; R₉ ist Wasserstoff, Methyl, Brom, Fluor oder Iod, oder ein Alkyl oder aromatischer Substituent, oder ein optionaler verknüpfender Anteil, einschließlich eine Amid, Thioether oder Disulfidverknüpfung oder eine Kombination davon wie R₁-(CN₂)_x-R₂, oder R₁-R₂-(CN₂)_x-R₃-, worin: x ist eine ganze Zahl in dem Bereich von 1 und 25 einschließlich; R₁₀ ist Wasserstoff oder eine säureempfindliche basenstabile blockierende Gruppe oder ein Phosphorderivat, R₁₁=R₁₂=H; R₁₂ ist Wasserstoff, OH oder ein Phosphorderivat; R ist H, OH oder OR worin: R ist eine Schutzgruppe oder zusätzliches Fluorophor. Die Buchstaben N und C in den N-Nukleosiden und C-Nukleosiden bezeichnen das Atom, an dem die glykosidische kovalente Bindung den Zucker und die heterozyklische Base verbindet. In den Fällen der herkömmlich auftretenden Nukleoside sind die Basen entweder Adenin, Guanin, Cytosin, Inosin, Uracil oder Thymin. Die Basen sind an einen Furanosezucker gebunden, von der eine allgemeine Struktur im folgenden gezeigt ist.
Die Zuckersubstituenten für die fluoreszierenden Analoga haben das gleiche Nummerierungssystem für alle R-Gruppen, aber das Nummerierungssystem für manche der Heterozyklenanaloga kann verschieden sein.
Nukleotidsequenzen werden allgemein in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet, einschließlich diagnostische und therapeutische Sonden, die Ziel-DNA und -RNA hybridisieren, und die Amplifizierung von Zielsequenzen. Es ist oft erforderlich oder nützlich, Nukleotidsequenzen zu markieren.
Markierung von Oligonukleotidsonden mit Radioisotopen.
Hybridisierung spezifischer DNA- oder RNA-Sequenzen beinhaltet typischerweise ein Annealing von Oligonukleotiden mit Längen, die von so wenig wie 5 Basen zu mehr als 10.000 Basen (10 kb) reichen. Der Großteil der Oligonukleotidsonden, der gegenwärtig in der Forschung verwendet wird, ist radioaktiv markiert; aufgrund (i) der kurzen Halbzeiten der Isotope im allgemeinen Einsatz, (ii) der Sicherheitserfordernisse und (iii) der Kosten der Handhabung und Entsorgung radioaktiver Proben, sind jedoch bequeme und empfindliche nicht-isotopische Detektionsverfahren für diagnostische Hybridisierungsverfahren erforderlich, um eine breite Akzeptanz und Anwendung zu erreichen.
Nicht-isotopische Verfahren zur Markierung von Oligonukleotidsonden.
Allgemein hängen alle nicht-isotopischen Detektionsverfaren von Hybridisierungssonden, die gegenwärtig verfügbar sind, von irgendeiner Art der Derivatisierung der Nukleotide ab, um eine Detektion entweder durch Antikörperbindung oder enzymatische Verarbeitung oder über die Fluoreszenz oder Chemolumineszenz eines angebrachten "Reporter"-Moleküls zu gestatten. In den meisten Fällen wurden Oligonukleotide derivatisiert, um einzelne oder mehrere Moleküle der selben Reportergruppe allgemein an spezifischen zyklischen oder exozyklischen Positionen einzubringen.
Techniken zum Anfügen von Reportergruppen basierten größtenteils auf (i) Funktionalisierung der 5'- oder 3'-Enden entweder der monomeren Nukleoside oder der Oligonukleotidstränge über zahlreiche chemische Reaktionen unter Verwendung von entschützten Oligonukleotiden in wässrigen oder weitgehend wässrigen Medien (siehe Cardullo et al. [1988] PNAS 85:8790-8794); (ii) Synthese modifizierter Nukleoside enthaltend (a) geschützte reaktive Gruppen, wie NH₂, SH, CHO, oder COOH, (b) aktivierbare monofunktionelle Linker, wie NHS-Ester, Aldehyde oder Hydrazide, oder (c) Affinitätsbindungsgruppen, wie Biotin, entweder an die heterozyklische Base oder den Furanoseanteil angebracht. Modifikationen wurden an intakten Oligonukleotiden oder an monomeren Nukleosiden gemacht, die danach in Oligonukleotide während der chemischen Synthese über die Terminal-Transferase oder "Nick-Translation" eingeführt wurden (siehe, z.B. Brumbaugh et al. [1988] PNAS 85:5610-5614; Sproat, B.S., A.L. Lamond, B. Beijer, P. Neuner, P. Ryder [1989] Nucl. Acids Res. 17:3371-3386; Allen, D.J., P.L. Darke, S.J. Benkovic [1989] Biochemistry 28:4601-4607); (iii) Verwendung von passend geschützten chemischen Anteilen, die an dem 5'-Ende von geschützten Oligonukleotiden während der chemischen Synthese gekoppelt werden können, z.B. 5'-Aminohexyl-3'-O-phosphoramidit (Haralambidis, J., L. Duncan, G.W. Tregar [1990] Nucl. Acids Res. 18:493-499); und (iv) Zusatz von funktionellen Gruppen auf dem Zuckeranteil oder in dem Phosphodiester-Backbone des Polymeren (siehe Conway, N.E., J. Fidanza, L.W. McLaughlin [1989] Nucl. Acids Res. Symposium Series 21:43-44; Agrawal, S., P.C Zamecnik [1990] Nucl. Acids Res. 18:5419-5423).
Am einfachsten wurden nicht-nukleosidische Linker und Marker an das 3'- oder 5'-Ende von bestehenden Oligonukleotiden entweder durch enzymatische oder chemische Methoden angefügt. Modifikation von Nukleosidgruppen im Innern der Sequenz eines DNA- oder RNA-Strangs hat sich als ein schwieriges Verfahren herausgestellt, da die Reaktionsbedingungen mild genug sein müssen, um die RNA- oder DNA-Oligomere intakt zu lassen und dennoch Reaktionsprodukte zu ergeben, die an normaler Watson-Crick-Basenpaarung und Stapelwechselwirkungen teilnehmen können.
Derivatisierungen der heterozyklischen Base.
Zahlreiche Verfahren für sowohl zyklische als auch exozyklische Derivatisierung des N-Nukleosids wurden beschrieben, einschließlich der folgenden:
(i) Hapten-Markierung.
DNA-Sonden wurden Aminomodifiziert und danach derivatisiert, um ein Hapten zu tragen, wie 2,4-Dinitrophenol (DNP), an das enzym-konjugierte Anti-Hapten-Antikörper binden, die danach unter Verwendung eines kalorimetrischen Substrats als ein Marker verarbeitet werden können (Keller et al. [1988] Analytical Biochemistry 170:441-450).
(ii) Amino- und Thiol-derivatisierte Oligonukleotide.
Takeda und Ikeda ([1984) Nucl. Acids Research Symposium Series 15:101-104) verwendeten Phosphotriesterderivate von Putresceinylthymidin für die Herstellung von amino-abgeleiteten Oligomeren. Ruth und Kollegen beschrieben Verfahren zum Synthetisieren eines Deoxyuridinanalogons mit einem primären Amin-"Linkerarm", Länge 12 Kohlenstoffatome, bei C₅ (Jablonski et al. [1986] Nucl. Acids Res. 14:6115-6128). Diese wurden später mit Fluorescein umgesetzt, um ein fluoreszierendes Molekül herzustellen. Urdea und Horn erhielten ein Patent in 1990 (U.S. Patent Nr. 4,910,300), das Pyrimidinderivate abdeckt, an denen die 6-Aminogruppe an C₄ modifiziert wurde. 3'- und 5'-Aminomodifizierende Phosphoramidite oder derivatisierte Oligonukleotide wurden in der chemischen Synthese breit verwendet und sind kommerziell erhältlich.
(iii) Markierung mit Photobiotin und anderen biotinylierenden Mitteln.
Die hohe Affinität von Biotin für Avidin wurde verwendet, um enzymatische oder chemolumineszente Reagenzien an derivatisierte DNA-Sonden zu binden (Foster et al. [1985] Nucl. Acids Res. 13:745-761). Biotin, konjugiert an andere Linker, wurde auch breit verwendet, einschließlich Biotin-NHS-Ester (Bayer, E.A., M. Wilchek [1980] Methods in Biochemical Analysis 26:1), Biotinsuccinamide (Lee, W.T., D.H. Conrad [1984] J Exp. Med. 159:1790), und Biotinmaleimide (Bayer, E.A. et al. [1985] Anal. Biochem 149:529). Reisfeld et al. ([1987] BBRC 142:519-526) verwendete Biotinhydrazid, um die 4-Aminogruppe von Cytidin zu markieren. Ein Patent wurde an Klevan et al. in 1989 vergeben (U.S. Patent Nr. 4,828,979) für derartige Derivatisierungen an der 6-Position von Adenin, der 4-Position von Cytosin und der 2-Position von Guanin. Diese Derivatisierungen wechselwirken mit der Wasserstoffbrückenbindung und Basenpaarung und haben beschränkte Verwendungen bei der Herstellung von Oligomeren zur Verwendung in der Hybridisierung.
(iv) dU-Biotin-Markierung.
Nukleosid-5'-triphosphate oder 3'-Ophosphoramidite wurden mit einem Biotinanteil modifiziert, der an eine aliphatische Aminogruppe an der 5'-Position von Uracil konjugiert war (Langer et al. [1981] PNAS 78:6633-6637; Saiki et al. [1985] Science 230:1350-1354). Die Nukleotidtriphosphatderivate werden in Doppelstrang-DNA über standardmäßige Techniken der "Nick-Translation" wirksam eingebaut. In einem Oligonukleotid kann die Gruppe sodann durch Avidin, Streptavidin oder Antibiotin-Antikörper gebunden werden, das dann zur Detektion über Fluoreszenz, Chemolumineszenz oder enzymatische Verarbeitung verwendet werden kann.
(v) 11-Digotgenin-ddUTP-Markierung.
Das Enzym Terminal-Transferase wurde verwendet, um ein einzelnes Digoxigenin-11-dideoxyUTP an das 3'-Ende von Oligonukleotiden zu addieren. Nach Hybridisierung zu Zielnukleinsäuren wurden DIG-ddUTP-markierte Hybridisierungssonden unter Verwendung eines Anti-DIG-Antikörperkonjugats detektiert.
(vi) Immunofluoreszenzdetektion.
Immunofluoreszenzdetektion kann unter Verwendung von monoclonalen Fab'-Fragmenten gemacht werden, die für RNA:DNA-Hybride spezifisch sind, in denen die Sonde mit z.B. Biotin-11-UTP derivatisiert wurde (Bobo et al. [1990] J. Clin. Microbiol. 28:1968-1973; Viscidi et al. [1986] J. Clin. Microbiol. 23:311-317).
(vii) Bisulfitmodifizierung von Cytosin.
Draper und Gold ([1980] Biochemistry 19:1774-1781) führten aliphatische Aminogruppen auf Cytidin durch eine bisulfit-katalysierte Abbruchreaktion ein; die Aminogruppen wurden dann mit einem fluoreszierenden Marker markiert. In diesem Verfahren wird die Aminogruppe direkt an die Pyramidbase angefügt. Wie in der Derivatisierung von Uracil wechselwirken diese Derivatisierungen mit der Wasserstoffbrückenbindung und Basenpaarung und sind nicht notwendigerweise zur Herstellung effizienter Hybridisierungsoligomere brauchbar.
(viii) Fluorophor-derivatisierte DNA-Sonden.
Mit Texas Rot (Sulfochlorrhodamin) derivatisierte Sonden sind kommerziell erhältlich, die zu spezifischen Ziel-DNAs hybridisieren und die unter Verwendung eines Flusszytometers oder Mikroskops detektiert werden können. Zahlreiche Autorin berichteten über die Kopplung von Fluorophoren an chemisch synthetisierte Oligonukleotide, die einen 5'- oder 3'-terminale Amino- oder Thiolgruppe trugen (Brumbaugh et al. [1988] Nucl. Acids Res. 16:4937-4956).
(ix) Direkte Enzym-Markierung.
Chemische Kopplung eines Enzyms direkt an eine chemisch synthetisierte Sonde wurde für die direkte Detektion über Substratverarbeitung verwendet. Zum Beispiel beschrieben Urdea et al. einen Oligonukleotid-Sandwich-Assay, in dem mehrere DNA-Sondehybridisierungen verwendet wurden, um Ziel-DNA an eine Festphase zu binden, nachdem sie weiter mit zusätzlichen Alkalische-Phosphatase-derivatisierten Hybridisierungsonden markiert wurde (Urdea el al. [1989] Clin. Chem 35:1571-1575).
(x) Acridiniumester-Markierung.
Ein einzelner Phenylester von Methylacridinium wird an eine zentrale Position auf einer RNA- oder DNA-Sonde angefügt. Hydrolyse des Esters ergibt ein Acridon, CO₂ und Licht. Weil der Ester auf unhybridisierten Sonden schneller hydrolysiert als der Ester auf Sonden, die zu Ziel-RNA oder -DNA hybridisierten, kann die Chemolumineszenz der hybridisierten Sonden von der der freien Sonden unterschieden werden und wird in einem "Hybridisierung-Schutzassay" verwendet (Weeks et al. [1983] Clin. Chem. 29:1474-1479).
Derivatisierungen des Furanoserings.
Verfahren zur Derivatisierung des Furanoserings (R₁₁ bis R₁₄ hier oben) und des Phosphodiester-Backbone von Oligonukleotiden (R₁₀ hier oben) wurden berichtet.
(i) Internukleotidverbindung-Reportergruppen (R₁₀-Stelle)
Phosphorothioatester wurden verwendet, um eine Bindungsstelle für Fluorophore, wie Monobromobiman, vorzusehen (Conway et al. [1989] Nucl. Acids Res. Symposium Series 21:43-44). Agrawal und Zamecnik ([1990] Nucl. Acids Res. 18:5419-5423) berichteten über Verfahren zur Einbringung Amin-spezifischer Reportergruppen (z.B. Monobromobiman) und Thiolspezifischen Reportergruppen (z.B. Fluoresceinisothiocyanat) durch Modifizierung des Phosphodiester-Backbone von DNA zu Phosphoramiditen bzw. Phosphorothioatdiestern.
(ii) Glycosidische Reportergruppen (R₁₁- bis R₁₄-Stellen).
Smith, Fung und Kaiser ([1989] U.S. Patent Nr. 4,849,513) beschrieben Synthesen für eine Reihe von Derivaten und Markern auf dem glycosidischen Anteil von Nukleosiden und Nukleosidanaloga über die Einführung einer aliphatischen Aminogruppe bei R₁₀. Die Autoren berichteten oder beanspruchten keine Verwendungen oder Anwendungen von inhärent fluoreszierenden Oligonukleotiden, die entweder chemisch oder enzymatisch gemacht waren oder die fluoreszierenden Nukleosidanaloga oder ihre Derivate verwendeten.
Fluoreszierende N-Nukleoside und fluoreszierende Strukturanaloga
Formycin A (allgemein als Formycin bezeichnet), das prototypische fluoreszierende Nukleosidanalogon, wurde ursprünglich als ein Antitumor-Antibiotikum aus den Kulturfiltraten von Nocardia interforma (Hori et al. [1966] J. Antibiotics, Ser. A 17:96-99) isoliert und dessen Struktur als 7-Amino-3-b-D-ribofuranosyl (1H-Pyrazolo-[4,3d]-pyrimidin) identifiziert. Dieses Antibiotikum, das auch aus Kulturbrühen von Streptomyces lavendulae (Aizawa et al. [1965] Agr. Biol. Chem. 29:375-376) und Streptomyces gummaensis (japanisches Patent Nr. 10,928, vergeben in 1967 an Nippon Kayaku Co., Ltd.) isoliert wurde, ist eines aus zahlreichen mikrobiellen C-Ribonukleosidanaloga der N-Nukleoside, die allgemein in RNA aus allen Quellen gefunden werden. Die anderen natürlich vorkommenden C-Ribonukleoside, die aus Mikroorganismen isoliert wurden, schließen Formycin B (Koyama et al. [1996] Tetrahedron Lett. 597-602, Aizawa et al, oben; Umezawa et al. [1965] Antibiotics Ser. A 18:178-181), Oxoformycin B (Ishizuka et al. [1968] J. Antibiotics 21:1-4; Sawa et al. [1968] Antibiotics 21:334-339), Pseudouridin (Uematsu und Suahdolnik [1972] Biochemistry 11:4669-4674), Showdomycin (Darnall et al. [1967] PNAS 57:548-553), Pyrazomycin (Sweeny et al. [1973] Cancer Res. 33:2619-2623) und Minimycin (Kusakabe et al. [1972] J. Antibiotics 25:44-47). Formycin, Formycin B und Oxoformycin B sind Pyrazolopyrimidinnukleoside und sind strukturelle Analoga von Adenosin, Inosin bzw. Hypoxanthin; ein Pyrazopyrimidin-Strukturanalogon von Guanosin, aus natürlichen Quellen erhalten, wurde in der Literatur nicht berichtet. Ein vollständiger Review der Biosynthese dieser Verbindungen ist in Ochi et al. (1974) J. Antibiotics xxiv:909-916erhältlich.
Physikalische Eigenschaften der N-Nukleoside.
Weil mehrere der N-Nukleoside als aktive antibiotische, antivirale oder anti-tumorale Verbindungen bekannt waren, wurden ihre chemische Derivatisierung und physikalische Eigenschaften ausgiebig untersucht und mit den Strukturen und Synthesen der N-Nukleoside verglichen, die allgemein in DNA und RNA gefunden werden. In den späten 1960ern wurden mehrere Strukturanaloga der sechs allgemein vorkommenden N-Nukleoside als unter physiologischen Bedingungen fluoreszierend befunden; Fluoreszenz in den Analoga resultiert aus einer molekularen Starrheit der heterozyklischen Struktur selbst; nicht alle Strukturanaloga einer gegebenen Art, z.B. der C-Nukleoside, sind fluoreszierend, noch ist Fluoreszenz eine ausschließliche oder inhärente Eigenschaft irgendeiner bestimmten Klasse von Strukturanaloga.
Nukleinsäure-Hybridisierungen werden nun allgemein in der genetischen Forschung, biomedizinischen Forschung und klinischen Diagnostik verwendet. Im grundlegenden Nukleinsäure-Hybridisierungsassay wird eine Einzelstrang-Nukleinsäure (entweder Deoxyribonukleinsäure, DNA, oder Ribonukleinsäure, RNA) zu einer markierten Nukleinsäuresonde hybridisiert und die resultierenden markierten Doppel werden detektiert.
Chemische Verfahren zum Einbringen modifizierter Nukleotide sind hier oben und in der PCT-Anmeldung WO 84/03285 beschrieben. Die synthetischen Polynukleotide, die die modifizierten Nukleotide (allgemein als ein "Linkerarm-Nukleotid" bezeichnet) enthalten, können danach mit einem fluoreszierenden Anteil derivatisiert werden. Einen Review der Markierung von Oligonukleotiden mit einer Vielzahl von fluoreszierenden Molekülen ist von Kessler in Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, (1992) beschrieben.
Bisher wurden Nukleoside unter Verwendung eines Linkerarms markiert. Arbeiten sind nicht beschrieben, in denen eine Erhöhung der Fluoreszenz von z.B. Uridin und Cytidin durch Verlängern der Konjugation der Basenanteile davon durch Zufügen eines ungesättigten Anteils bewirkt wird, wie hier unten weiter detailliert wird.
Fluoreszierende Farbstoffe haben viele Verwendungen und sind als insbesondere geeignet für biologische Anwendungen bekannt, in denen die hohe Detektierbarkeit von Fluoreszenz wünschenswert ist. Für eine Diskussion des revolutionären Einflusses, den fluoreszierende Farbstoffe auf den heutigen Weg der Forschung hatten und weiterhin haben werden, siehe Taylor et al. (1992) The New Vision of Light Microscopy, American Scientist, Vol. 80, pp. 322-335.
Idealerweise könnte eine Verbessung bei der Detektierung fluoreszierender Sonden in einem Assaysystem erhalten werden, indem ein Fluorophor gewählt wird, das folgendes aufweist: (i) eine große Stokes-Verschiebung, d.h. eine große Trennung zwischen den Wellenlängen der Maximalexzitation (EX) und der Wellenlänge der Maximalemission (EM), z.B. EM-EX > 100 nm; (ii) eine hohe Quantenausbeute (z.B. QY > 0,5); (iii) einen hohen Extinktionskoeffizienten (z.B. EC > 30.000); und (iv) ein Exzitationsmaximum nahe einer Laserlinie (z.B. 442 nm des Helium-Cadmium-Lasers oder 448 nm des Argon-Lasers).
Unglücklicherweise gibt es keine bekannten Fluorophore, die diese Kriterien vollständig erfüllen. Zum Beispiel ist Fluorescein (EX: 495 nm, EM: 525 nm, QY = 0,5) ein hoch fluoreszierender Marker mit einem Exzitationsmaximum nahe einer Laserlinie, hat aber eine Stokes-Verschiebung von nur etwa 30 nm.
Es ist bekannt, dass eine größere Stokes-Verschiebung durhc Verwendung eines Paars von Donor/Akzeptor-Fluorophoren erhalten werden kann, die überlappende Spektren haben und die in enger Nachbarschaft für nicht-radioaktiven Transfer zwischen den Donor- und Akzeptor-Fluorophoren angeordnet sind.
Diese Form von Energietransfer wurde von Forster vorgeschlagen, der Gleichungen der Transfereffizienz im Verhältnis zu Separationsabständen zwischen den Fluorophoren entwickelte. Siehe z.B. Forster, Th., Ann. Phys. (Leipzig) 2:55-75 (1948). Eine neuere Zusammenfassung von Forsters nicht-radioaktivem Energietransfer ist in "Principles of Fluorescent Spectroscopy," J. R. Lakowicz, Kap. 10 (1983) gegeben. Die mathematische Forster-Analyse sagt vorher, dass je enger der Abstand der fluoreszierenden Anteile ist, umso größer ist die Effizienz des nicht-radioaktiven Energietransfers dazwischen. Der experimentelle Beweis bestätigte diese Voraussage.
Die Verwendung mehrerer fluoreszierender Farbstoffe in einer einzigen Messung ist stets wachsend, die Anzahl von unterscheidbaren Farbstoffen ist jedoch beschränkt. Aus diesem Grund waren anspruchsvolle Anfärbetechniken (kombinatorische Markierung oder Hybridisierung) und spektrale Bildgebungsgeräte notwendig, um eine unverkennbare fluoreszierende Färbung der 24 männlichen Humanchromosomen zu ermöglichen. Siehe E. Schroeck et al., 1996, Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes, Science, 273, 494-497.
Itahara T., Chemistry Letters, in: The Chemical Society of Japan, 00-00-1986, 239-242, beschreibt eine Behandlung von Uracilderivaten und -maleimidien in Gegenwart von Palladiumacetat zum Erhalt von Kopplungsprodukten.
US-A-4965350 beschreibt Pyridopyrimidinnukleotid-Derivate, angegeben durch Formel (I), die fluoreszieren und eine Basenpaarung mit Guanin oder Adenin und Oligo- oder Polynukleotide bilden können, die mindestens einen dieser Derivate in ihren Molekülen oder an ihren Molekülenden haben:
wobei: X₁ und Y₁ jeweils repräsentieren
(worin n eine ganze Zahl von 0, 1, 2 oder 3 angibt; jedoch in keinem Fall geben X₁ und Y₁ beide n = O an); Z₁ gibt ein Wasserstoffatom an oder
(worin n eine ganze Zahl von 1, 2 oder 3 angibt); W₁ gibt ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe an. Für R₁ und R₂, wenn R₁ eine Aminogruppe oder ein Halogen ist, gibt R₂ eine Einfachbindung zwischen dem Kohlenstoffatom an der 7-Position und dem Stickstoffatom an der 8-Position an, und wenn R₂ ein Wasserstoffatom oder eine niedere Alkylgruppe ist, gibt R₁ eine Carbonylbindung an
gebildet mit dem Kohlenstoffatom an der 7-Position.
Somit besteht ein breit erkanntes Erfordernis nach neuen fluoreszierenden Nukleobasen und Nukleosiden, die zu dem stets steigenden Repertoire an fluoreszierenden Farbstoffen beitragen, und es wäre sehr vorteilhaft diese zu haben.
Die neue Verbindung ist in den Ansprüchen 1, 8 und 18 definiert und das Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung ist in den Ansprüchen 19, 20 und 21 definiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf fluoreszierende Nukleobasen- und Nukleosid-Strukturanaloga. Die fluoreszierenden Nukleosid-Strukturanaloga der vorliegenden Erfindung sind als Monomere beim Synthetisieren und Markieren von Nukleosidsequenzen (Oligonukleotide, Polynukleotide) nützlich. Sei der Verwendung als Hybridiesierungssonden kann die Fluoreszenz solcher Nukleosidsequenzen als ein Forschungs- oder diagnostisches Werkzeug verwendet werden, um spezifische genetische Sequenzen zu detektieren und zu identifizieren. Diese Methodik unterscheidet sich von anderen nicht-radioaktiven Methoden der Sondendetektion darin, dass es keine Nukleoside verwendet, die an Enzyme oder andere reaktive Proteine gekoppelt wurden, und erfordert keine Post-Hybridisierungsverarbeitung für die Detektion von Hybridisierung. In ihrer Dideoxyform sind die fluoreszierenden Nukleosid-Strukturanaloga der vorliegenden Erfindung als fluoreszierende Kettenverlängerungsabbrecher in DNA-Sequenzierungsreaktionen nützlich.
Somit können die Nukleosidanaloga gemäß der vorliegenden Erfindung als folgendes verwendet werden: (i) spezifischer Ersatz für ein gegebenes nicht-fluoreszierendes Nukleosid in einer Oligonukleotid- oder Polynukleotidsonde, (ii) als Marker für die Identifizierung und Detektion spezifischer Sequenzen eines Templats; und (iii) für Nukleinsäuresequenzierung.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue, inhärent fluoreszierende Nukleobasen- und Nukleosidanaloga und die neuen Triphosphat- und Phosphoramiditformen davon bereitzustellen, die in der Synthese von markierten Polynukleosidsonden, Amplimeren, Diagnostika, Sequenzierung und Therapeutika nützlich sind.
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Verbindung mit einer Struktur bereitgestellt, gewählt aus der Gruppe bestehend aus:

wobei:
R₁ aus der aus Wasserstoff und einem Substituenten mit einer allgemeinen Struktur von: (P)_nA. bestehenden Gruppe gewählt ist,
während:
P aus der aus Alkyl, verzweigtem Alkyl, Aromatengruppe, substituierter Aromatengruppe und Kombinationen davon bestehenden Gruppe gewählt ist;
n eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 100 ist; und
A ein reaktiver chemischer Anteil ist, der in der Lage ist, mit einem Nucleophil zu reagieren.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen n eine ganze Zahl in einem Bereich von 2-50.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen n eine ganze Zahl in einem Bereich von 3-7.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen A in der Lage, mit einem Nucleophil zu reagieren.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen das Nucleophil aus der aus Amino- und Hydroxygruppen bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen A ausgelegt, um eine chemische Bindung mit dem Nucleophil zu bilden, wobei die Bindung aus der aus Etherbindung, Esterbindung, Amidbindung, Phosphonatbindung, Carbamatbindung und Sulfonbindung bestehenden Gruppe gewählt ist.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen A ein aktiver Ester.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen der aktive Ester aus der aus N-Hydroxysuccinimido-, Halogenoacyl-, Vinylsulfon-, Isothiocyanat-, Cyanat-, Chlormethylketon-, Iodacetamidyl-, Iodalkyl-, Bromalkyl- und aktiver Phosphatgruppe bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen sind in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z wobei:
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₄ aus der aus Alkyl und Aromatengruppe und Wasserstoff bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₅ aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Wasserstoff und einer Aminoschutzgruppe, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die Aminoschutzgruppe aus der aus Trifluoracetyl, Acetyl, Benzoyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, Chloracetyl, Acetoacetyl und 2,2,2-Trichlorethyloxycarbonyl bestehenden Gruppe gewählt.
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Verbindung mit einer Struktur bereitgestellt, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei:
R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z wobei:
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet; und
R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und
R₅, falls vorhanden, eine Aminoschutzgruppe ist, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist;
R₆ eine chemische Funktionalitätsgruppe ist, gewählt aus der aus Hydroxylgruppe OR₉ und Aminogruppe NR₁₀ bestehenden Gruppe, während
R₇ aus der aus Wasserstoff und OR₁₁ bestehenden Gruppe gewählt ist, während R₁₁ eine chemische Schutzgruppe ist;
R₈ aus der aus Methyl, Isopropyl, Morpholin, Pyrrolidin, 2,2,6,6,-Tetramethylpyrrolidin und heterozyklischem Alkyl bestehenden Gruppe gewählt ist; und
R₁₂ eine Phosphatschutzgruppe ist.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₆ eine chemische Funktionalitätsgruppe.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die chemische Funktionalitätsgruppe aus der aus Hydroxylgruppe OR₉ und Aminogruppe NR₁₀ bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₉ eine säurelabile Schutzgruppe.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die säurelabile Schutzgruppe aus der aus Triphenylmethyl, p-Anisyldiphenylmethyl, Di-p-Anisyldiphenylmethyl, p- Dimethoxytrityltrityl, Formyl, t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 4-Chlorbenzoyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzoyloxycarbonyl, Furfurylcarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxy-carbonyl, 2-Phenylpropyl-(2)-oxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)propyl-(2)-oxycarbonyl, 2-Nitrophenylsulfenyl und Diphenylphosphinyl bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₉ eine basenlabile Schutzgruppe.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die basenlabile Schutzgruppe aus der aus Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonylethyl-oxycarbonyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, Silylethern und 2,2,2-Trichlorethylcarbonat bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₁₀ eine Stickstoffschutzgruppe.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die Stickstoffschutzgruppe aus der aus Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonyl-ethyloxycarbonyl und 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, Chloracetyl, Acetoacetyl und 2,2,2-Trichlorethyloxycarbonyl bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₅ eine chemische Funktionalitätsgruppe.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die chemische Funktionalitätsgruppe eine Aminogruppe NR₁₀.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₁₀ eine säurelabile Schutzgruppe.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die säurelabile Schutzgruppe aus der aus Triphenylmethyl, p-Anisyldiphenylmethyl, Di-p-Anisyldiphenylmethyl, p-Dimethoxytrityl, Formyl, t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 4-Chlorbenzoyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, Furfurylcarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxy-carbonyl, 2-Phenylpropyl-(2)-oxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)propyl-(2)-oxycarbonyl, Di-p-Anisyldiphenyl-methyl, 2-Nitrophenylsulfenyl und Diphenylphosphinyl bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die basenlabile Schutzgruppe aus der aus Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, 4-Toluolsulfonylethyloxy-carbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl und 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₇ aus der aus Wasserstoff und OR₁₁ bestehenden Gruppe gewählt, während R₁₁ eine chemische Schutzgruppe ist.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die R₁₁ Schutzgruppe aus der aus Aryl und Alkyl bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die R₁₁ Schutzgruppe aus der aus Triphenylmethyl, Acetal, Tetrahydropyranyl, Silyl, Trimethylsilyl und t-Butyldimethylsilyl bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die R₁₁ Schutzgruppe Wasserstoff.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₈ aus der aus niedrigerem und heterozyklischem Alkyl bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₈ aus der aus Methyl, Isopropyl, Morpholin, Pyrrolidin und 2,2,6,6,-Tetramethylpyrrolidin bestehenden Gruppe gewählt.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₁₂ eine Phosphatschutzgruppe.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen die Phosphatschutzgruppe aus der aus Trichlorethyl, Allyl, Cyanoethyl und Sulfonylethyl bestehenden Gruppe gewählt.
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Verbindung bereitgestellt, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

wobei TPO eine Triphosphatgruppe ist;
R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe; und
R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und
R₇ und R₁₃ jedes unabhängig aus der aus Wasserstoff und Hydroxylgruppe bestehenden Gruppe gewählt sind.
Gemäß stets weiteren Merkmalen sind in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur: (CH=CH)_mCH₂Z wobei:
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe.
Gemäß stets weiteren Merkmalen ist in den beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen R₄ aus der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt.
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung einer folgenden allgemeinen Struktur bereitgestellt:
wobei:
R₁ aus der aus Wasserstoff und einem Substituenten mit einer allgemeinen Struktur von: (P)_nA. bestehenden Gruppe gewählt ist,
während:
P aus der aus Alkyl, verzweigtem Alkyl, Aromatengruppe, substituierter Aromatengruppe und Kombinationen davon bestehenden Gruppe gewählt ist;
n eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 100 ist; und
A ein reaktiver chemischer Anteil ist, der in der Lage ist, mit einem Nucleophil zu reagieren;
R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet; und
R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und
R₅, falls vorhanden, aus der aus Wasserstoff und Aminoschutzgruppe, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist, bestehenden Gruppe gewählt ist,
wobei das Verfahren die Schritte des Inkontaktbringens einer derivatisierten Base mit Quecksilberacetat und Kondensierens mit N-Alkylmaleimid umfasst.
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung einer folgenden allgemeinen Struktur bereitgestellt:
während:
R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet; und
R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und
R₅, falls vorhanden, eine Aminoschutzgruppe ist, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist;
R₆ eine chemische Funktionalitätsgruppe ist, gewählt aus der aus Hydroxylgruppe OR₉ und Aminogruppe NR₁₀ bestehenden Gruppe, während R₉ unabhängig aus der aus einer säurelabilen Schutzgruppe und einer basenlabilen Schutzgruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₁₀ unabhängig eine Stickstoffschutzgruppe ist;
R₇ aus der aus Wasserstoff und OR₁₁ bestehenden Gruppe gewählt ist, während R₁₁ eine chemische Schutzgruppe ist;
R₈ aus der aus niedrigerem und heterozyklischem Alkyl bestehenden Gruppe gewählt ist; und
R₁₂ eine Phosphatschutzgruppe ist,
wobei das Verfahren folgendes umfasst:

(a) Inkontaktbringen eines Nukleosids mit Quecksilbersalz, gefolgt von Kondensation mit N-Alkylmaleimid;
(b) Schützen von Aminogruppen besagten Nukleosids mit einer Schutzgruppe;
(c) Schutzen eines 5'-Hydroxyls besagten Nukleosids mit einer säurelabilen Gruppe; und
(d) Kondensieren mit Allyl-Phosphoramidatreagens.

Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Inkontaktbringen eines Nukleosids mit Quecksilbersalz, gefolgt von Kondensation mit N-Alkylmaleimid; (b) Schützen von Aminogruppen besagten Nukleosids mit einer Schutzgruppe (z.B. Allyloxycarbamat); (c) Schützen eines 5'-Hydroxyls besagten Nukleosids mit einer säurelabilen Gruppe (z.B. Dimethoxytrityl); und (d) Kondensieren mit Allyl-Phosphoramidatreagens.
Ferner wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung einer folgenden allgemeinen Struktur bereitgestellt:

wobei
TPO eine Triphosphatgruppe ist;
R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen; und
R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und
R₇ und R₁₃ jedes unabhängig aus der aus Wasserstoff und Hydroxylgruppe bestehenden Gruppe gewählt sind, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines 5'-Triphosphatnukleosids mit Quecksilbersalz und Kondensieren mit N-Alkylmaleimid umfasst.
Die vorliegende Erfindung behandelt erfolgreich die Nachteile der gegenwärtig bekannten Konfigurationen durch Bereitstellung neuer Nukleobasen und Nukleosid-Strukturanaloga, die verbesserte spektrale Qualitäten aufweisen, durch konjugieren eines Maleimidderivats an C5- oder C8-Positionen von Pyrimidinnukleobasen bzw. Purinnukleobasen.
Damit die Anmeldung vollständig verstanden wird, wird auf die begleitenden Zeichnungen Bezug genommen:
Die Erfindung wird hierin nur beispielhaft mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, worin:
1 ist ein Plot, der die Exzitations- (gepunktete Linie, Ex) und Emissionsdurchgehende Linie, Em) -Spektren von 2'-Deoxy-5-N-ethylmaleimidouridin gelöst in Methanol (10 μg/ml) gemäß der vorlegenden Erfindung zeigt;
3a-d sind Röntgendiffraktion-abgeleitete dreidimensionale Modelle von 2'-Deoxy-5-N-butylmaleimidouridin und Gittermodelle davon gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung stellt Derivate von Pyrimidin- und/oder Purinanaloga der allgemein auftrtenden Nukleosidbasen bereit, die in verschiedenen organischen Lösungsmitteln und in wässrigen Puffern oder in einer Mischung von organischen Lösungsmitteln und Wasser fluoreszieren.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Steigerung der Konjugation von Doppelbindungen an der C5-Position von Pyrimidinen, wie Uridin und Cytidin, und an der C8-Position von Purinen von Adenin und Guanin. Allgemein, mit steigendem Grad der Konjugation in Kohlenwasserstoffverbindungen, steigt die Intensität der Fluoreszenz oft und eine bathochrome Verschiebung wird beobachtet. Die fluoreszierenden Nukleosid- oder Nukleotidanaloga gemäß der vorliegenden Erfindung sind als Monomere in der Synthese und Markierung von Nukleotidsequenzen und Proteinen nützlich.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung neue fluoreszierende Nukleosidanaloga und die neuen Triphosphat- und Phosphoramiditformen davon bereit, die in der Synthese von markierten Polynukleotidsonden, in verzweigter DNA, in der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierungstechnologie und in der DNA-Sequenzierung nützlich sind.
In einem Aspekt der Erfindung werden fluoreszierende Strukturanaloga R, S, T, U der allgemein auftretenden Nukleoside und ihrer Derivate mit der folgenden Strukturformel bereitgestellt:
wobei die Strukturen R, S, T und U derivatisierende Gruppen R₁, R₂, R₃, R₄ und R₅ enthalten;
wobei R₁ Alkyl und Aromatengruppen sein kann, die mit einer reaktiven Gruppe mit einer Formel (P)_nA enden;
wobei P Alkyl, verzweigtes Alkyl, Aromatengruppe oder derivatisierte Aromatengruppe sein kann;
wobei n eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 100 ist, bevorzugt 2-50, am meisten bevorzugt 3-7; und
wobei A ein aktiver chemischer Anteil ist, der bevorzugt in der Lage ist, mit einem Nucleophil, Aminogruppe, Hydroxygruppe, Estergruppe, N-Hydroxysuccinimido-, Halogenoacyl-, Vinylsulfon-, Isothiocyanat-, Cyanat-, Chlormethylketon, Iodacetamidyl-, Iodalkyl-, Bromalkyl- und aktiver Phosphatgruppe, usw. zu reagieren;
wobei R₂ und R₃ Wasserstoff, Methyl, Halogen und ein ungesättigter Anteil mit einer folgenden Formel sein kann: (CH=CH)_mCH₂Z; wobei m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
worin Z Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehende Gruppe, ein Elektron anziehende Gruppe und eine Aromatengruppe sein kann, die mit den Wasserstoff , Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro- oder einer Elektron anziehenden Gruppe endet;
worin R₄ ein Alkyl oder Aromatengruppe sein kann;
worin R₅ ein Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein kann, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist, vorzugsweise Trifluoracetyl, Acetyl, Benzoyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, Chloracetyl, Acetoacetyl oder 2,2,2-Trichlorethyloxycarbonyl.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung neue fluoreszierende Phosphoramiditformen von Nukleosiden und Analoga davon bereit, die in der Synthese von fluoreszierend-markierten Polynukleotidsonden nützlich sind. Ihre Strukturen sind V, W, X, Y und Z und sie enthaften R₂, R₃, R₄, R₅, R₆, R₇, R₈ und R₁₂ derivatisierende Gruppen.

worin R₆ eine chemische Funktionalitätsgruppe ist, bevorzugt Hydroxylgruppe OR₉ oder Aminogruppe NR₁₀;
worin R₉ eine säurelabile Schutzgruppe ist, bevorzugt Triphenylmethyl, p-Anisyldiphenylmethyl, Di-p-Anisyldiphenylmethyl, p-Dimethoxytrityltrityl, Formyl, t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 4-Chlorbenzoyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzoyloxycarbonyl, Furfurylcarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxy-carbonyl, 2-Phenylpropyl-(2)-oxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)propyl-(2)-oxycarbonyl, 2-Nitrophenylsulfenyl oder Diphenylphosphinyl;
worin R₉ eine basenlabile Schutzgruppe ist, bevorzugt Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, Silylether oder 2,2,2-Trichlorethylcarbonat;
worin R₁₀ eine Stickstoffschutzgruppe ist, bevorzugt Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl und 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, Chloracetyl, Acetoacetyl oder 2,2,2-Trichlorethyloxycarbonyl;
worin R₅ eine chemische Funktionalitätsgruppe ist, bevorzugt eine Aminogruppe NR₁₀, wie, aber nicht darauf beschränkt, Triphenylmethyl, p-Anisyldiphenylmethyl, Di-p-Anisyldiphenylmethyl, p-Dimethoxytrityl, Formyl, t- Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 4-Chlorbenzoyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, Furfurylcarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxy-carbonyl, 2-Phenylpropyl-(2)-oxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)propyl-(2)-oxycarbonyl, Di-p-Anisyldiphenyl-methyl, 2-Nitrophenylsulfenyl und Diphenylphosphinyl, oder eine basenlabile Schutzgruppe, wie, aber nicht darauf beschränkt, Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl und 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl;
worin R₇ Wasserstoff oder OR₁₁ sein kann, wobei R₁₁ eine chemische Schutzgruppe ist, wie, aber nicht darauf beschränkt, Aryl oder Alkyl, bevorzugt Triphenylmethyl, Acetal, Tetrahydropyranyl, Silyl, Trimethylsilyl und t-Butyldimethylsilyl, oder R₁₁ kann Wasserstoff sein;
worin R₈ ein niedrigeres oder heterozyklisches Alkyl sein kann, wie, aber nicht darauf beschränkt, Methyl, Isopropyl, Morpholin, Pyrrolidin und 2,2,6,6,-Tetramethylpyrrolidin;
worin R₁₂ eine Phosphatschutzgruppe ist, wie aber nicht darauf beschränkt, Trichlorethyl, Allyl, Cyanoethyl und Sulfonylethyl.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung fluoreszierende Strukturanaloga der allgemein vorkommenden und analogen Nukleoside und ihrer Derivate bereit. Die Verbindungen dieser Strukturen F, G, H, I und J enthalten eine Triphosphatgruppe (TPO), R₂, R₃ und R₄ derivatisierende Gruppen und R₇ und R₁₃, die Wasserstoff oder Hydroxylgruppen sein können.
wobei R₂ und R₃ Wasserstoff, Methyl, Halogen oder ein ungesättigter Anteil mit einer folgenden Formel sein kann: (CH=CH)_mCH₂Z; wobei m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
worin Z Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehende Gruppe, ein Elektron anziehende Gruppen oder eine Aromatengruppe sein kann;
worin R₄ ein Alkyl oder Aromatengruppe sein kann.
Ferner werden gemäß der vorliegenden Erfindung Verfahren zum Herstellen der obigen Nukleobasen- und Nukleosidanaloga bereitgestellt.
Gemäß einem zweiten Aspekt wird ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit einer Struktur bereitgestellt, gewählt aus der Gruppe bestehend aus:
wobei:
R₁ aus der aus Wasserstoff und einem Substituenten mit einer allgemeinen Struktur von: (P)_nA. bestehenden Gruppe gewählt ist,
während:
P aus der aus Alkyl, verzweigtem Alkyl, Aromatengruppe, substituierter Aromatengruppe und Kombinationen davon bestehenden Gruppe gewählt ist;
n eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 100 ist; und
A ein reaktiver chemischer Anteil ist, der in der Lage ist, mit einem Nucleophil zu reagieren;
R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet; und
R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und
R₅, falls vorhanden, aus der aus Wasserstoff und Aminoschutzgruppe, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist, bestehenden Gruppe gewählt ist,
wobei das Verfahren die Schritte des Inkontaktbringens einer derivatisierten Base mit Quecksilberacetat und Kondensierens mit N-Alkylmaleimid umfasst.
Das Verfahren wird wie folgt durch Ausführen der folgenden Verfahrensschritte erzielt, in denen in einem ersten Schritt eine derivatisierte Base mit Quecksilberacetat kontaktiert wird und in einem zweiten Schritt das Produkt mit N-Alkylmaleimid kondensiert wird:
Gemäß einem dritten Aspekt wird ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit einer Struktur bereitgestellt, gewählt aus den Strukturen bestehend aus:

während:
R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH_ZZ, wobei
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet; und
R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und
R₅, falls vorhanden, eine Aminoschutzgruppe ist, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist;
R₆ eine chemische Funktionalitätsgruppe ist, gewählt aus der aus Hydroxylgruppe OR₉ und Aminogruppe NR₁₀ bestehenden Gruppe, während R₉ unabhängig aus der aus einer säurelabilen Schutzgruppe und einer basenlabilen Schutzgruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₁₀ unabhängig eine Stickstoffschutzgruppe ist;
R₇ auf der aus Wasserstoff und OR₁₁ bestehenden Gruppe gewählt ist, während R₁₁ eine chemische Schutzgruppe ist;
R₈ auf der aus niedrigerem und heterozyklischem Alkyl bestehenden Gruppe gewählt ist; und
R₁₂ eine Phosphatschutzgruppe ist,
wobei das Verfahren folgendes umfasst:

Das Verfahren wird wie folgt durch Ausführen der folgenden Verfahrensschritte erzielt, in denen in einem ersten Schritt ein Nukleosid mit Quecksilbersalz kontaktiert wird, gefolgt von Kondensation mit N-Alkylmaleimid. In einem zweiten Schritt werden Aminogruppen des Nukleosids mit einer Schutzgruppe (z.B. Allyloxycarbamat) geschützt. In einem dritten Schritt wird ein 5'-Hydroxyl des Nukleosids mit einer säurelabilen Gruppe (z.B. Dimethoxytrityl) geschützt. Während in einem letzten Schritt das Produkt mit Allyl-Phosphoramidatreagens kondensiert wird. Das ganze wie folgt:
Gemäß einem vierten Aspekt wird ein Verfahren zum Synthetisieren einer Verbindung mit einer Struktur bereitgestellt, gewählt aus der Gruppe bestehend aus:
wobei
TPO eine Triphosphatgruppe ist;
R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei
m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist;
Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe; und
R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und
R₇ und R₁₃ jedes unabhängig aus der aus Wasserstoff und Hydroxylgruppe bestehenden Gruppe gewählt sind, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines 5'-Triphosphatnukleosids mit Quecksilbersalz und Kondensieren mit N-Alkylmaleimid umfasst.
Das Verfahren wird wie folgt durch Ausführen der folgenden Verfahrensschritte erzielt, in denen in einem ersten Schritt ein 5'-Triphosphatnukleosid mit Quecksilbersalz kontaktiert wird und in einem zweiten Schritt das Produkt mit N-Alkylmaleimid kondensiert wird:
Die neuen fluoreszierenden Nukleosidanaloga-Farbstoffe der vorliegenden Erfindung sind Derivate von Uracil, Cytidin und anderen Pyrimidinderivaten an ihrer C5-Position und von Adenin und Guanin und anderen Purinderivaten an ihrer C8-Position.
Derivatisierung an diesen Stellen gemäß der vorliegenden Erfindung soll eine Konjugation von ausgeweiteten Doppelbindungen bilden, die in der Bildung von neuen fluoreszierenden Anteilen resultiert.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die Verwendung der neuen fluoreszierenden Nukleosidanaloga in der DNA-Sequenzierung.
PRÄPARATIVES BEISPIEL 1
Herstellung von 2'-Deoxy-5-N-ethylmaleimidouridin
Eine Lösung von 2'-Deoxyuridin (2,28 Gramm, 10 mmol) und Quecksilberacetat (3,19 Gramm, 10 mmol in 15 ml Wasser wurden unter Rühren bei 60°C für 5 Stunden erhitzt. Nach Entfernen der in der Reaktion gebildeten Essigsäure und des Wassers unter Vakuum wurde der weiße Rückstand mit N-Ethylmaleimid (3,76 Gramm, 30 mmol) und 110 ml 0,1 M Lithiumtetrachloropalladat in Methanol bei 60°C für 12 Stunden suspendiert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und eine Lösung von Schwefelwasserstoff (850 mg, 25 mmol) in Methanol (100 ml) wurde unter Rühren zugefügt und durch Celit filtriert und die Lösung wurde zur Trockne verdampft. Der gelbliche fluoreszierende feste Rückstand wurde in Methanol (100 ml) aufgelösft und mit 40 Gramm Silikagel, Grad 9385, 230-40 Mesh, 60 A (Merck), suspendiert und zur Trockne eingedampft.
Das beschichtete Silika wurde auf das Oberteil einer Silikasäule (5 × 60 cm) unter Verwendung einer Lösung von 10% Methanol in Dichlormethan als Eluent gegeben und der resultierende passende Rückstand wurde zur Trockne eingedampft.
Rf: 0,41.
Ausbeute: 947 mg. (27 %).
Massenspektrum m/e: 352 (Molekül-Ion), 236 (Uracyl-N-efihylmaleimide), 197, 179, 152, 126, 117 (Deoxyribose).
¹H NMR [CDCl₃ + CD₃OD] 9.21 (s, 1H, Vinylmaleimid), 7.35 (s, 1H, C-6), 6.28 (t, 1H, J = 7 Hz, C-1'), 4.45 (m, 1H, C-3'), 4.05 (m, 1H, C-4'), 3.81 (m, 2H, C-5'), 3.42 (q, 2H, J = 13 Hz, N-CH2-), 2.5-2.2 (m, 2H, C-2'), 1.21 (t, 3H, J = 13 Hz, CH3).
UV in Methanol – max – 285 nm.
Fluoreszenz – Exzitation 360 nm, Emission 500 nm, (siehe 1).
Die folgende Gleichung fasst die oben beschriebene Reaktion zusammen:
PRÄPARATIVES BEISPIEL 2
Herstellung von 5'-Dimethoxytrityl-2'-deoxy-5-N-ethylmaleimidouridin.
Zu einer gekühlten (0°C) Lösung von 2'-Deoxy-5-N-ethylmaleimidouridin (3,51 g, 10 mmol) in 50 ml trockenem Pyridin unter Rühren wurde eine Lösung von Dimethoxytritylchlorid (3,72 g, 11 mmol) in 50 ml Pyridin tropfenweise zugegeben. Nach der Zugabe ließ man die Reaktion langsam auf Raumtemperatur erwärmen und das Rühren wurde für 12 Stunden fortgesetzt. Das Pyridin wurde im Vakuum abgezogen und das resultierende braune Öl wurde in Ethylacetat (200 ml) aufgelöst und mit Wasser gewaschen (2 × 200 ml), gefolgt von Waschen mit gesättigter wässriger Natriumchloridlösung, und die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum abgezogen und das braune Rohöl wurde auf Silikagelsäule (4 × 80 cm) mit 5 % Methanol/0,5 % Pyridin in Dichlormethan als Eluent gereinigt. Die passende Fraktion wurde gesammelt und zur Trockne eingedampft.
Rf: 0,54.
¹H-NMR – [CDCl3] 9.00 (s, 1H, Vinylmaleimid), 7.20-743 (m, 13H, aromatische Protonen von DMTr), 6.79 (d, 4H, J = 9 Hz, Protonen ortho zu OCH3 von DMTr), 6.31 (t, 1H, J = 7 Hz, C-1'), 4.35 (m, 1H, C-3'), 4.07 (m, 1H, C-4'), 3.75 (s, 6H, 2OCH3), 3.41-3.65 (m, 4H, C-5'+ N-CH2), 2.26-2.52 (m, 2H, C-2'), 1.09 (t, 3H, J = 13 Hz – CH3).
Die folgende Gleichung fasst die oben beschriebene Reaktion zusammen:
PRÄPARATIVES BEISPIEL 3
Herstellung von 2'-Deoxy-5'-dimethoxytrityluridin-3'-(allyl-N,N-diisopropylphosphoramidit).
Das Reagenz (Allyloxy)bis(diisopropylamino)phosphin wird gemäß Hayakawa et al. in J. Am. Chem. Soc. (1990), 112:169 1 hergestellt. Zu einer Lösung von 5'-Dimethoxytrityl-2'-deoxy-5-N-ethylmaleimidouridin (6,03 g, 9,25 mmol) in Dichloromethan (60 ml) wurden Diisopropylamin (1,43 ml, 10,2 mmol), (Allyloxy)bis(diisopropylamino)phosphin (4,3 ml, 14.0 mmol) und 1H-Tetrazol (715 mg, 10,2 mmol) zugegeben. Nach 1,5 Stunden Rühren bei 25°C wurde die Mischung in Ethylacetat (300 ml) gegossen, mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die resultierende Lösung wurde bis zu einem gummiartigen Material konzentriert, das in Ethylacetat (20 ml) gelöst wurde. Die Lösung wurde tropfenweise in Hexan (800 ml) bei –78°C unter Rühren gegeben und ergab ein Pulver, das unter Vakuum über ein Papierfilter (Watman #1) unter Verwendung eines Buchner-Trichters gesammelt wurde. Der resultierende Kuchen wurde unter Hochvakuum getrocknet und ergab ein fahlgrünes Pulver, das gesammelt und unter Argon gespeichert wurde.
¹H NMR – [CDCl3] 9.02 (s, 1H, vinylisches Proton des Maleimids), 7.20-7.43 (m, 14H, aromatische Protonen des DMTr und C-6), 6.76 (d, 4H, J = 9Hz, Protonen ortho zu OCH3 des DMTr), 6.32 (s, 1H, C-1'), 5.91 (m, 1H, CH2-CH=CH2), 4.97-5.49 (m, 2H, CH2-CH=CH2), 3.90-4.27 (m, 4H, CH2CH=CH2, C-3' und C-4'), 3.74 (s, 6H, 2OCH3), 3.40-3.56 (m, 6H, 2CH(CH3)2, NCH2 und C-5'), 2.10-2.70 (m, 2H, C-2'), 1.03-1.28 (m, 15H, 2CH(CH3)2 und CH3).
³¹P NMR 149.61,149.75
Die folgende Gleichung fasst die oben beschriebene Reaktion zusammen:
PRÄPARATIVES BEISPIEL 5
Herstellung von 1-Ethanol-5-M-ethylmaleimidouracyl
Zu einer Lösung von Uracyl (10 Gramm, 89,2 mmol) in 100 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) wurden Ethylencarbonat (8,64 g, 98,1 mmol und Natriumhydroxid (70 mg, 1.8 mmol) zugegeben. Die Lösung wurde bei 140°C über Nacht unter Rühren gehalten. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und das DMF wurde unter vermindertem Druck abgezogen.
TLC – in MeOH 30% – Dichlormethan 70% Rf – 0,39
Ausbeute – 12,53 Gramm (90%).
Die folgende Gleichung fasst die oben beschriebene Reaktion zusammen:
PRÄPARATIVES BEISPIEL 6
Herstellung von 1-Hydroxyethyl-5-maleimidouracyl.
Zu einer Lösung von 1-Uracylethanol (2,38 g, 15,2 mmol) in 15 ml Wasser wurden Quecksilberacetat (4,84 g, 15,2 mmol) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Rühren bei 60°C für 12 Stunden erhitzt. Nach Entfernen der in der Reaktion gebildeten Essigsäure und des Wassers unter Vakuum wurde der weiße Rückstand mit N-Ethylmaleimid (5,0 g, 39,9 mmol) und 150 ml 0,1 M Lithiumtetrachloropalladat in Methanol bei 60°C für 12 Stunden suspendiert. Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und eine Lösung von Schwefelwasserstoff (1,02 g, 30 mmol) in Methanol 100 ml wurde unter Rühren zugefügt und durch Celit filtriert und die Lösung wurde zur Trockne verdampft. Der gelbliche fluoreszierende feste Rückstand wurde in Methanol 100 ml aufgelöst und mit 40 g Silikagel, Grad 9385, 230-40 Mesh, 60 A (Merck), suspendiert und zur Trockne eingedampft.
Das beschichtete Silika wurde auf das Oberteil einer Silikasäule (5 × 60 cm) unter Verwendung einer Lösung von 10% Methanol in Dichlormethan als Eluent gegeben und das resultierende fluoreszierende Produkt wurde eingesammelt und das Lösungsmittel wurde zur Trockne verdampft.
TLC – in 10% Methanol in Dichlormethan, Rf – 0,45
¹H-NMR [CDCl3] 8.91 (s, 1H, vinylisches Proton des Maleimids), 7.18 (s, 1H, C-6), 3.65-3.88 (m, 4H, N-Uracyl – CH2-CH2-OH), 3.54 und 3.98 (a-b Quartett, 2H, N-CH2-CH3) des Maleimids), 1.14 (t, 3H, N-CH2-CH3).
Die folgende Gleichung fasst die oben beschriebene Reaktion zusammen:
PRÄPARATIVES BEISPIEL 7
Herstellung von 1-(Hydroxyethylsuccinat)-5-N-ethylmaleimidouracyl.
Zu einer Lösung von 1-Hydroxyethyl-5-maleimidouracyl (0,28 Gramm, 1 mmol) und Triethylamin (0,561 ml) in trockenem Acetonitril (20 ml) wurden unter Argon N,N'-Disuccinimidylcarbonat (0,38 Gramm, 1,5 mmol) (Aldrich) zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde unter Argon bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum abgezogen und der Feststoff wurde in Ethylacetat (50 ml) gelöst und mit einer Lösung von 5 % Natriumcarbonat gewaschen, gefolgt von Waschen mit gesättigter Natriumchloridlösung und die organische Phase wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Ethylacetat wurde auf ein Volumen von 20 ml eingeengt und die Lösung wurde tropfenweise zu gerührtem Hexan zugegeben. Der ausgefallene Feststoff wurde unter Vakuum auf einem Watman-Papier #1 unter Verwendung eines Buchner-Trichters gesammelt. Das Pulver wurde gesammelt und unter Argon gelagert. Das Produkt was fluoreszierend.
Ausbeute: 0,48 Gramm (90 %).
Die folgende Gleichung fasst die oben beschriebene Reaktion zusammen:
PRÄPARATIVES BEISPIEL 8
Herstellung von 2'-Deoxy-5-N-butylmaleimidouridin.
Eine Lösung von 2'-Deoxouridin (2,28 Gramm, 10 mmol und Quecksilberacetat (3,19 Gramm, 10 mmol in 15 ml Wasser wurde unter Rühren bei 60 °C für 5 Stunden erwärmt. Nach Entfernen der in der Reaktion gebildeten Essigsäure und des Wassers unter Vakuum wurde der weiße Rückstand mit N-t-butylmaleimid (3,76 Gramm, 24,5 mmol und 110 ml 0,1 M Lithiumtetrachloropalladat in Methanol bei 60°C für 12 Stunden suspendiert.
Die Mischung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und eine Lösung von Schwefelwasserstoff (850 mg, 25 mmol) in Methanol (100 ml) wurde unter Rühren zugefügt und durch Celit filtriert und die Lösung wurde zur Trockne verdampft. Der gelbliche fluoreszierende feste Rückstand wurde in Methanol (100 ml) aufgelöst und mit 40 Gramm Silikagel, Grad 9385, 230-40 Mesh, 60 A (Merck), suspendiert und zur Trockne eingedampft.
Das beschichtete Silika wurde auf das Oberteil einer Silikasäule (5 × 60 cm) unter Verwendung einer Lösung von 10 % Methanol in Dichlormethan als Eluent gegeben und der resultierende passende Rückstand wurde zur Trockne eingedampft.
Rf: 0,41
Ausbeute: 947 mg (27 %).
Massenspektrum m/e: 380 (Molekül-Ion), 236 (Uracyl-N-butylmaleimid), 197, 179, 152, 126, 117 (Deoxyribose).
¹H NMR [CDCl₃ + CD₃OD] 9.21 (s, 1H, Vinylmaleimid), 7.35 (s, 1H, C-6), 6.28 (t, 1H, J = 7 Hz, C-1'), 4.45 (m, 1H, C-3'), 4.05 (m, 1H, C-4'), 3.81 (m, 2H, C-5'), 3.42 (q, 2H, J = 13 Hz, N-CH2-), 2.5-2.2 (m, 2H, C-2'), 1.21 (t, 3H, J = 13 Hz, CH3).
UV in Methanol – max – 285 nm.
Fluoreszenz – Exzitation 360 nm, Emission 500 nm.
Die folgende Gleichung fasst die oben beschriebene Reaktion zusammen:
PRÄPARATIVES BEISPIEL 9
Kristallisation con 2'-Deoxy-5-N-butylmaleimidouridin und Röntgendiffraktions-Analyse davon
Datensammlung und Behandlung: Rigaku AFC5R Vierzyklen-Diffraktometer, MoKα, Graphit-Monochromator (λ = 0,71073 Angström), 7962 gesammelte Reflexionen, 1,49° ≤ Θ ≤ 27,50°, –7 ≤ h ≤ 7, 0 ≤ k ≤ 13, 0 ≤ 1 ≤ 35, ω Scanverfahren, Scanbreite = 2,0°, Scangeschwindigkeit 4°/min, typische Halbhöhen-Peakbreite = 0,85°, 3 Standarde wurden jeweils 27 mal gesammelt, mit einer 3 % Intensitätsänderung, 4081 unabhängige Reflexionen (R-int = 0,0134).
Lösung und Verfeinerung: Struktur über das Patterson-Verfahren gelöst (SHELXS-93). Vollmatrix-Verfeinerung der kleinsten Quadrate basierend auf F² (SHELXL-93). Idealisierte Wasserstoffe wurden in einem "riding mode" platziert und verfeinert. 228 Parameter mit 19 Einschränkungen wurden verwendet.

Die Tabellen 1-33 unten liefern die kristallographischen Daten. Die 3a-d liefern die Röntgendiffraktion-abgeleiteten dreidimensionalen Modelle von 2'-Deoxy-5-N-butylmaleimidouridin und Gittermodelle davon gemäß der vorliegenden Erfindung. TABELLE 1 Kristalldaten und Strukturverfeinerung

Empirische Formel:	C₃₄H₄₂N₆O₁₄
Farbe:	gelb
Art:	Nadeln
Formelmasse:	758,74
Temperatur:	110°K
Wellenlänge:	0,71073 Angström
Kristallsystem:	monolitisch
Raumgruppe:	P2(1) (Nr. 4)

Einheitszelle Dimensionen:	a = 5.9980(10) Angström; α = 90°
	b = 10.401(2) Angström; β = 91.43 (3)°
	c = 27.403(5) Angström; γ = 90°
Volumen:	1709.0(5) Angström³
Z:	2
Dichte (berechnet):	1.474 Mg/m³
Absorptionskoeffizient:	0.116 mm^–1
F(000):	800
Kristallgröße:	0.05 × 0.05 × 0.03 mm³
Theta-Bereich für Datensammlung:	1.49° bis 27.50°
Indexbereiche:	–7 ≤ h ≤ 7, –13 ≤ k ≤ 2, –4 ≤ 1 ≤ 35
Gesammelte Reflexionen:	4239
Unabhängige Reflexionen:	4081 [R(int) = 0.0134]
Verfeinerungsmethode:	Vollmatrix-Verfeinerung kleinste Quadrate auf F²
Daten/Einschränkungen/Parameter:	2558/19/228
Anpassungsgüte auf F²:	1,027
Endgültige R-Indizes [I>2Σ(I)]:	R1 = 0.1609, wR2 = 0.4028
R-Indizes (alle Daten):	R1 = 0.2480, wR2 = 0.5444
Absolute Strukturparameter:	1(7)
Größter Diffraktionspeak und Loch:	1.439 und –1.1333 e Angström³
Fw:	379.37
Dc:	1.474 Mg/M³
μ:	0.116 mm^–1

TABELLE 2 Atomkoordinaten (×10⁴) und äquivalentisotrope Verschiebungsparameter (A² × 10³). U(eq) ist definiert als ein Drittel der Spur des orthogonalisierten Uij-Tensors
TABELLE 3 Bindungslängen [Angström] und Winkel [°]
PRÄPARATIVES BEISPIEL 10
Herstellung der Deoxy, Dideoxy und phosphorylierten Formen von fluoreszierenden Nukleosidanaloga
Die chemischen Synthesen sind in der Literatur für die Derivatisierung als 2'-Deoxyformen und 3'-Deoxyformen von N-Nukleosiden, Ethenonukleosiden sowie von C-Nukleosiden erhältlich, siehe z.B. Robins et al. (1973) Can. J Chem. 51:1313; Jain et al. (1973) J. Org. Chem. 38:3719; DeClerq et al. (1987) J. Med. Chem. 30:481.
Protokolle zur Synthese von 2',3'-Dideoxyanaloga sind von Lin et al. (1987) J. Med. Chem. 30:440 und Serafinowski, P. (1987) Synthesis 10:879 berichtet.
Enzymatische Synthesen wandeln die Monophosphat- in die Triphosphatanaloga um, mit z.B. Polynukleotid-Kinase unter Verwendung von etablierten Prozeduren, wie von Schobert B. (1995) Analytical Biochemistry 226:288 beschrieben.
Allgemein werden die 5'-Monophosphate chemisch durch POCl₂ hergestellt und sind in Lin und Brown (1989) Nucl. Acids Res. 17:10373; Yoshikawa et al. (1967) Tetrahedron Lett. 5095 beschrieben. Die korrespondierenden Triphosphate können chemisch gemäß den gleichen Autoren oder durch Hoard und Ott (1965) J. Am. Chem. Soc. 87:1785 und Michelson (1964) Biochim. Biophys. Acta 91:1 synthetisiert werden.
Das heißt, dass die Monophosphate mit 1,1'-Carbonildiimidazol behandelt werden, gefolgt mit Tributylammoniumpyrophosphat in Dimethylformamid unter wasserfreien Bedingungen und geben die triphosphorylierte Form.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Eine Verbindung mit einer Struktur, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei: R₁ aus der aus Wasserstoff und einem Substituenten mit einer allgemeinen Struktur von: (P)_nA. bestehenden Gruppe gewählt ist, während: P aus der aus Alkyl, verzweigtem Alkyl, Aromatengruppe, substituierter Aromatengruppe und Kombinationen davon bestehenden Gruppe gewählt ist; n eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 100 ist; und A ein reaktiver chemischer Anteil ist, der in der Lage ist, mit einem Nucleophil zu reagieren; R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist; Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet; und R₄ auf Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₅, falls vorhanden, aus der aus Wasserstoff und Aminoschutzgruppe, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist, bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 1 , wobei n eine ganze Zahl in einem Bereich von 2-50 ist.
Die Verbindung von Anspruch 2, wobei n eine ganze Zahl in einem Bereich von 3-7 ist.
Die Verbindung von Anspruch 1, wobei besagtes Nucleophil aus der aus Amino- und Hydroxygruppen bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 1, wobei besagte chemisch reaktive Gruppe in der Lage ist, mit besagtem Nucleophil zu reagieren, um dadurch eine chemische Bindung zu bilden, gewählt aus der aus Etherbindung, Esterbindung, Amidbindung, Phosphonatbindung, Carbamatbindung und Sulfonbindung bestehenden Gruppe.
Die Verbindung von Anspruch 1, wobei besagtes A aus der aus N-Hydroxysuccinimido-, Halogenoacyl-, Vinylsulfon-, Isothiocyanat-, Cyanat-, Chlormethyl-keton_, Iodacetamidyl-, Iodalkyl-, Bromalkyl- und aktiver Phosphatgruppe bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 1, wobei besagte Aminoschutzgruppe aus der aus Trifluoracetyl, Acetyl, Benzoyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, Chloracetyl, Acetoacetyl und 2,2,2-Trichlorethyloxycarbonyl bestehenden Gruppe gewählt ist.
Eine Verbindung mit einer Struktur, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

wobei: R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist; Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet; und R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₅, falls vorhanden, eine Aminoschutzgruppe ist, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist; R₆ eine chemische Funktionalitätsgruppe ist, gewählt aus der aus Hydroxylgruppe OR₉ und Aminogruppe NR₁₀ bestehenden Gruppe, während R₉ unabhängig aus der aus einer säurelabilen Schutzgruppe und einer basenlabilen Schutzgruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₁₀ unabhängig eine Stickstoffschutzgruppe ist; R₇ aus der aus Wasserstoff und OR₁₁ bestehenden Gruppe gewählt ist, während R₁₁ eine chemische Schutzgruppe ist; R₈ aus der aus Methyl, Isopropyl, Morpholin, Pyrrolidin, 2,2,6,6,-Tetramethylpyrrolidin und heterozyklischem Alkyl bestehenden Gruppe gewählt ist; und R₁₂ eine Phosphatschutzgruppe ist.
Die Verbindung von Anspruch 8, wobei besagte säurelabile Schutzgruppe aus der aus Triphenylmethyl, p-Anisyldiphenylmethyl, Di-p-Anisyldiphenylmethyl, p-Dimethoxytrityltrityl, Formyl, t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 4-Chlorbenzoyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzoyloxycarbonyl, Furfurylcarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxy-carbonyl, 2-Phenylpropyl-(2)-oxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)propyl-(2)-oxycarbonyl, 2-Nitrophenylsulfenyl und Diphenylphosphinyl bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 8, wobei besagte basenlabile Schutzgruppe aus der aus Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl, 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, Silylethern und 2,2,2-Trichlorethylcarbonat bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 8, wobei besagte Stickstoffschutzgruppe aus der aus Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl 4-Toluolsulfonylethyloxycarbonyl, Methylsulfonyl-ethyloxycarbonyl und 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl, Chloracetyl, Acetoacetyl und 2,2,2-Trichlorethyloxycarbonyl bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 8, wobei besagte Aminoschutzgruppe aus der aus einer säurelabilen Schutzgruppe und einer basenlabilen Schutzgruppe bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 12, wobei besagte säurelabile Schutzgruppe aus der aus Triphenylmethyl, p-Anisyldiphenylmethyl, Di-p-Anisyldiphenylmethyl, p-Dimethoxytrityl, Formyl, t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Chlorbenzyloxycarbonyl, 4-Chlorbenzoyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, Furfurylcarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxy-carbonyl, 2-Phenylpropyl-(2)-oxycarbonyl, 2-(4-Biphenyl)propyl-(2)-oxycarbonyl, Di-p-Anisyldiphenyl-methyl, 2-Nitrophenylsulfenyl und Diphenylphosphinyl bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 12, wobei besagte basenlabile Schutzgruppe aus der aus Trifluoracetyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl, 4-Toluolsulfonylethyloxy-carbonyl, Methylsulfonylethyloxycarbonyl und 2-Cyano-t-butyloxycarbonyl bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 8, wobei besagte R₁₁ chemische Schutzgruppe aus der aus niedrigerem Aryl und Alkyl bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 8, wobei besagte R₁₁ chemische Schutzgruppe aus der aus Triphenylmethyl, Acetal, Tetrahydropyranyl, Silyl, Trimethylsilyl und t-Butyldimethylsilyl bestehenden Gruppe gewählt ist.
Die Verbindung von Anspruch 8, wobei besagte Phosphatschutzgruppe aus der aus Trichlorethyl, Allyl, Cyanoethyl und Sulfonylethyl bestehenden Gruppe gewählt ist.
Eine Verbindung, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei TPO eine Triphosphatgruppe ist; R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist; Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe; und R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₇ und R₁₃ jedes unabhängig aus der aus Wasserstoff und Hydroxylgruppe bestehenden Gruppe gewählt sind.
Ein Verfahren zum Synthetisieren der Verbindung von Anspruch 1, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei: R₁ aus der aus Wasserstoff und einem Substituenten mit einer allgemeinen Struktur von: (P)_nA. bestehenden Gruppe gewählt ist, während: P aus der aus Alkyl, verzweigtem Alkyl, Aromatengruppe, substituierter Aromatengruppe und Kombinationen davon bestehenden Gruppe gewählt ist; n eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 100 ist; und A ein reaktiver chemischer Anteil ist, der in der Lage ist, mit einem Nucleophil zu reagieren; R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist; Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet; und R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₅, falls vorhanden, aus der aus Wasserstoff und Aminoschutzgruppe, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist, bestehenden Gruppe gewählt ist, wobei das Verfahren die Schritte des Inkontaktbringens einer derivatisierten Base mit Quecksilberacetat und Kondensierens mit N-Alkylmaleimid umfasst.
Ein Verfahren zum Synthetisieren der Verbindung von Anspruch 8, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
während: R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist; Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen und einer Aromatengruppe, die mit den Wasserstoff-, Hydroxyl-, Amin-, Amid-, Nitro-, ein Elektron anziehenden Gruppen endet; und R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₅, falls vorhanden, eine Aminoschutzgruppe ist, die beim Schutz von Aminosäuren in der Peptidsynthese nützlich ist; R₆ eine chemische Funktionalitätsgruppe ist, gewählt aus der aus Hydroxylgruppe OR₉ und Aminogruppe NR₁₀ bestehenden Gruppe, während R₉ unabhängig aus der aus einer säurelabilen Schutzgruppe und einer basenlabilen Schutzgruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₁₀ unabhängig eine Stickstoffschutzgruppe ist; R₇ aus der aus Wasserstoff und OR₁₁ bestehenden Gruppe gewählt ist, während R₁₁ eine chemische Schutzgruppe ist; R₈ aus der aus Methyl, Isopropyl, Morpholin, Pyrrolidin, 2,2,6,6,-Tetramethylpyrrolidin und heterozyklischem Alkyl gewählten Gruppe gewählt ist; und R₁₂ eine Phosphatschutzgruppe ist, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) Inkontaktbringen eines Nukleosids mit Quecksilbersalz, gefolgt von Kondensation mit N-Alkylmaleimid; (b) Schützen von Aminogruppen besagten Nukleosids mit einer Schutzgruppe; (c) Schutzen eines 5'-Hydroxyls besagten Nukleosids mit einer säurelabilen Gruppe; und (d) Kondensieren mit Allyl-Phosphoramidatreagens.
Ein Verfahren zum Synthetisieren der Verbindung von Anspruch 18, gewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei TPO eine Triphosphatgruppe ist; R₂ und R₃ jedes unabhängig aus der Gruppe gewählt sind, bestehend aus Wasserstoff, Methyl, Halogen und einem ungesättigten Anteil mit einer Struktur (CH=CH)_mCH₂Z, wobei m eine ganze Zahl in einem Bereich von 1 bis 6 ist; Z aus der Gruppe gewählt ist, bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl, Amin, Amid, Nitro, ein Elektron abziehenden Gruppe, ein Elektron anziehenden Gruppen; und R₄ aus Wasserstoff und der aus Alkyl und Aromatengruppe bestehenden Gruppe gewählt ist, und R₇ und R₁₃ jedes unabhängig aus der aus Wasserstoff und Hydroxylgruppe bestehenden Gruppe gewählt sind, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen eines 5'-Triphosphatnukleosids mit Quecksilbersalz und Kondensieren mit N-Alkylmaleimid umfasst.