DE3750792T2 - Alkynylamino-nukleotide. - Google Patents

Alkynylamino-nukleotide.

Info

Publication number
DE3750792T2
DE3750792T2 DE3750792T DE3750792T DE3750792T2 DE 3750792 T2 DE3750792 T2 DE 3750792T2 DE 3750792 T DE3750792 T DE 3750792T DE 3750792 T DE3750792 T DE 3750792T DE 3750792 T2 DE3750792 T2 DE 3750792T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
added
alkynyl
nmr
mmol
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE3750792T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3750792D1 (de
Inventor
Anthony Joseph Cocuzza
Frank Worden Hobbs
George Leonard Trainor
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Revvity Health Sciences Inc
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26736630&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE3750792(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by EI Du Pont de Nemours and Co filed Critical EI Du Pont de Nemours and Co
Publication of DE3750792D1 publication Critical patent/DE3750792D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE3750792T2 publication Critical patent/DE3750792T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6509—Six-membered rings
    • C07F9/6512—Six-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65586—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system at least one of the hetero rings does not contain nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf Alkinylaminonucleotide und insbesondere auf ihre Verwendung beim Herstellen fluoreszenzmarkierter Nucleotide als kettenabbrechende Substrate für ein DNA-Sequenzierungsverfahren auf Fluoreszenzgrundlage. Diese Erfindung ist mit der mitanhängigen EP-A-25-2683 verwandt.
  • Das DNA-Sequenzieren ist eine der grundlegenden analytischen Techniken der modernen Molekularbiologie. Die Entwicklung verläßlicher Verfahren zum Sequenzieren hat zu großen Fortschritten beim Verstehen der Organisation der genetischen Information geführt und hat die Manipulation genetischen Materials (d. h. Gentechnologie) möglich gemacht.
  • Es gibt gegenwärtig zwei allgemeine Verfahren zum Sequenzieren von DNA: das chemische Maxam-Gilbert-Abbauverfahren [A. M. Maxam et al., Meth. in Enzym., Bd. 65, 499-559 (1980)] und das Dideoxy-Kettenabbruchsverfahren von Sanger [F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad, Sci., USA, Bd. 74, 5463-5467 (1977)]. Ein gemeinsames Merkmal dieser beiden Techniken ist die Erzeugung eines Satzes DNA-Fragmente, die durch Elektrophorese analysiert werden. Die Techniken unterscheiden sich in den zum Herstellen dieser Fragmente verwendeten Verfahren.
  • Mit der Maxam-Gilbert-Technik werden DNA-Fragmente durch basenspezifische chemische Spaltung des zu sequenzierenden DNA-Stücks hergestellt. Das zu sequenzierende DNA-Stück wird zuerst mit ³²P am 5'-Ende markiert und anschließend in vier Teile aufgeteilt. Jeder Teil wird einer unterschiedlichen Zusammenstellung chemischer Behandlungen unterzogen, die zum Spalten der DNA an Positionen ausgelegt sind, die einer vorgegebenen Base (oder Basen) benachbart sind. Das Ergebnis ist, daß alle markierten Fragmente denselben 5'-Terminus wie das ursprüngliche DNA-Stück besitzen und durch die Spaltungsstelle definierte 3'-Termini besitzen. Diese Behandlung wird unter Bedingungen durchgeführt, die DNA-Fragmente erzeugen, die von zur Trennung durch Gelelektrophorese geeigneter Länge sind.
  • Mit der Sangerschen Technik werden DNA-Fragmente durch teilweises enzymatisches Kopieren (d. h. Synthese) des zu sequenzierenden DNA-Stücks hergestellt. Bei der gebräuchlichsten Art wird das zu sequenzierende DNA-Stück mittels Standardtechniken in einen "Sequenzierungsvektor", ein langes, kreisförmiges, einsträngiges DNA-Stück wie etwa der Bakteriophage M13, inseriert. Dies wird die Vorlage für den Kopiervorgang. Ein kurzes DNA- Stück wird mit seiner Sequenz, die zu einer unmittelbar stromaufwärts des Inserts gelegenen Region der Matrize komplementär ist, an die Matrize angefügt, um als Starter für die Synthese zu dienen. In Anwesenheit der vier natürlichen Deoxyribonucleosidtriphosphate (dNTP) verlängert eine DNA-Polymerase den Starter vom 3'-Ende aus unter Produzieren einer komplementären Kopie der Matrize im Bereich des Inserts. Zum Herstellen eines kompletten Satzes Sequenzierungsfragmente werden vier Reaktionen parallel durchgeführt, wobei jede die vier dNTP zusammen mit einem einzigen Dideoxyribonucleosidtriphosphat (ddNTP) -Terminator - jeweils einen für jede Base - enthält. (³²P-markiertes dNTP wird zum Liefern markierter Fragmente zugesetzt.) Wenn ein dNTP durch die Polymerase eingebaut ist, kann die Kettenverlängerung weitergehen. Wenn das entsprechende ddNTP ausgewählt ist, wird die Kette abgebrochen. Das Verhältnis von ddNTP zu dNTP wird zum Erzeugen von DNA-Fragmenten geeigneter Länge eingestellt. Jedes der vier Reaktionsgemische enthält auf diese Weise eine Fragmentverteilung mit demselben Dideoxynucleosidrest am 3'-Terminus und am starterdefinierten 5'-Terminus.
  • Die Ausdrücke "Terminator", "Kettenterminator" und "kettenabbrechendes Substrat" werden durchgängig austauschbar zum Bezeichnen eines Substrats verwendet, welches durch ein Enzym, das Nucleinsäuren in einer matrizenausgerichteten Weise vermehrt, aber sobald es einmal eingebaut ist, eine weitere Kettenverlängerung verhindert, in das 3'-Ende einer DNA- oder RNA-Kette eingebaut werden kann. Im Gegensatz dazu können die natürlichen Deoxynucleotidsubstrate als "kettenwachstumsfördernde Substrate" angesehen werden.
  • Der Ausdruck "Nucleosid" wird durchgängig zum Bezeichnen einer heterocyclischen Base-Zucker-Einheit verwendet, die aus einem Molekül Pyrimidin oder Purin (oder Derivaten derselben) und einem Molekül eines Ribosezuckers (oder Derivaten oder funktionellen Äquivalenten desselben) zusammengesetzt ist. Der Ausdruck "Nucleotid" wird durchgängig zum Bezeichnen entweder eines Nucleosids oder seines phosphorylierten Derivats verwendet.
  • Sowohl bei dem Sanger- als auch Maxam-Gilbert-Verfahren ist die Basensequenzinformation, die im allgemeinen nicht direkt durch physikalische Verfahren bestimmt werden kann, in Kettenlängeinformation überführt worden, die bestimmt werden kann. Diese Bestimmung kann durch elektrophoretische Trennung bewerkstelligt werden. Unter Denaturierungsbedingungen (hohe Temperatur, Harnstoff vorhanden usw.) wandern kurze DNA-Fragmente so, als ob sie steife Stäbchen wären. Wenn eine Gelmatrix zur Elektrophorese eingesetzt wird, werden die DNA-Fragmente der Größe nach sortiert. Die zum Sequenzieren erforderliche Einzelbasenauflösung kann üblicherweise für DNA-Fragmente erhalten werden, die bis zu mehrere hundert Basen enthalten.
  • Um eine vollständige Sequenz zu bestimmen, werden die vier Sätze von Fragmenten, die entweder durch die Maxam-Gilbert- oder Sanger-Methodik erzeugt wurden, der Elektrophorese auf vier parallelen Bahnen unterzogen. Dies führt zu Fragmenten, die entlang der Länge des Gels räumlich getrennt sind. Das Muster der markierten Fragmente wird typischerweise durch Autoradiographie auf einen lichtempfindlichen Film überführt (z. B. wird eine Belichtung durch Aufeinanderlegen des Gels und des Films während eines Zeitraums hergestellt). Der entwickelte Film zeigt ein Kontinuum von Banden, die auf den vier Bahnen verteilt sind, welche oft als Sequenzierungsleiter bezeichnet werden. Die Leiter wird durch visuelles Betrachten des Films (ausgehend von den kürzeren, sich schneller bewegenden Fragmenten) und Bestimmen der Bahn, in welcher die nächste Bande für jeden Schritt auf der Leiter auftritt, gelesen. Da jede Bahn mit einer vorgegebenen Base (oder im Fall von Maxam-Gilbert einer Basenkombination) verknüpft ist, wird der lineare Fortschritt der Bahnzuordnungen direkt in eine Basensequenz übersetzt.
  • Das Sanger und Maxam-Gilbert-Verfahren zum DNA-Sequenzieren sind konzeptionell elegant und wirkungsvoll, sie sind aber beim Einsatz schwierig und zeitraubend. Die Analyse dieser Techniken zeigt, daß viele Probleme aus der Verwendung eines einzelnen Radioisotopenreporters herstammen. [Ein Reporter kann als eine chemische Gruppe definiert werden, die eine physikalische oder chemische Eigenschaft besitzt, welche leicht durch geeignete physikalische oder chemische Nachweissysteme oder Verfahren gemessen oder nachgewiesen werden kann. Eine leichte Nachweisbarkeit kann durch solche Eigenschaften wie Farbänderung, Lumineszenz, Fluoreszenz oder Radioaktivität geliefert werden, oder sie kann durch die Fähigkeit des Reporters zum Dienen als Ligandenerkennungsstelle unter Bilden spezifischer Ligand-Ligand-Komplexe, die Gruppen enthalten, die durch herkömmliche (z. B. kolorimetrische, spektrophotometrische, fluorometrische oder radioaktive) Nachweisverfahren nachweisbar sind, geliefert werden. Die Ligand-Ligand-Komplexe können in Form von Protein- Ligand-, Enzym-Substrat-, Antikörper-Antigen-, Kohlenhydrat-Lectin-, Protein-Cofaktor-, Protein-Effektor-, Nucleinsäure-Nucleinsäure- oder Nucleinsäure-Ligand-Komplexen vorliegen.]
  • Die Verwendung kurzlebiger Radioisotope wie etwa ³²P mit hoher spezifischer Aktivität ist sowohl vom logistischen als auch Gesundheits- und Sicherheitsstandpunkt problematisch. Die kurze Halbwertszeit von ³²P erfordert das Vorhersehen des Reagenzienbedarf s mehrere Tage im voraus und die unmittelbare Verwendung des Reagenzes. Sobald ³²P-markierte DNA-Sequenzierungsfragmente erzeugt worden sind, sind sie gegenüber Selbstzerstörung anfällig und müssen sofort der elektrophoretischen Analyse unterzogen werden. Die zum Erreichen einer Einzelbasentrennung erforderlichen großen Elektrophoresegele führen zu großen Volumina verunreinigten Puffers, der zu Abfallentsorgungsproblemen führt. Die zur nachfolgenden Sichtbarmachung der markierten DNA-Fragmente in dem Gel erforderliche Autoradiographie ist ein langsamer Vorgang (Belichtungen über Nacht sind üblich) und fügt dem Gesamtarbeitsgang beträchtliche Zeit hinzu. Schließlich gibt es mögliche Gesundheitsrisiken, die mit der Verwendung derartiger starker Radioisotope verbunden sind.
  • Die Verwendung nur eines einzelnen Reporters zum Analysieren der Position der vier Basen verleiht dem Gesamtverfahren eine beträchtliche Komplexität der Durchführung. Die chemischen/enzymatischen Schritte müssen in getrennten Gefäßen durchgeführt werden und die elektrophoretische Analyse muß in vier parallelen Bahnen durchgeführt werden. Thermisch ausgelöste Störungen der Mobilität führen zu schiefen Abbildungen der markierten DNA- Fragmente (z. B. dem Smile-Effekt), was wiederum zu Schwierigkeiten beim Vergleichen der vier Bahnen führt. Diese Störungen begrenzen oft die Basenzahl, die auf einem einzigen Gel abgelesen werden kann.
  • Die langen Zeiten, die für das autoradiographische Abbilden erforderlich sind, zusammen mit der Notwendigkeit des Verwendens vier paralleler Bahnen zwingt zu einem "Schnappschuß"-Modus bei der Sichtbarmachung. Da die gleichzeitige räumliche Auflösung einer großen Bandenzahl benötigt wird, müssen sehr große Gele verwendet werden. Dies führt zu zusätzlichen Problemen: große Gele sind schwierig handzuhaben und sind langsam zu verarbeiten, wodurch dem Gesamtverfahren weitere Zeit hinzugefügt wird.
  • Schließlich gibt es das Problem einer manuellen Interpretation. Die Überführung einer Sequenzierungsleiter in eine Basensequenz ist ein zeitintensives, fehleranfälliges Verfahren, das die vollständige Aufmerksamkeit eines sehr erfahrenen Wissenschaftlers erfordert. Zahlreiche Versuche sind unternommen worden, um das Ablesen zu automatisieren und einige mechanische Hilfen existieren tatsächlich, aber das Verfahren des Interpretierens eines Sequenzgels ist immer noch mühsam und langsam.
  • Um diese Probleme anzusprechen, ist der Ersatz der ³²P/Autoradiographie durch ein alternatives Nachweissystem mit einem nichtradioisotopen Reporter-/Nachweissystem in Erwägung gezogen worden. Ein derartiges Nachweissystem müßte außergewöhnlich empfindlich sein, um eine Empfindlichkeit zu erreichen, die ³²P vergleichbar ist. Jede Bande auf einem Sequenzierungsgel enthält DNA in der Größenordnung von 10-16 Mol. Ein Verfahren zum Nachweis, das diesen Empfindlichkeitswert erreichen kann, ist die Fluoreszenz. DNA-Fragmente könnten mit einer oder mehreren Fluoreszenzmarkierungen (fluoreszierende Farbstoffe) markiert werden. Die Anregung mit einer geeigneten Lichtquelle führte zu einer charakteristischen Emission aus der Markierung, wodurch die Bande nachgewiesen wird.
  • Die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen erlaubt im Gegensatz zu radioisotopen Markierungen das leichtere Maßschneidern des Nachweissystems auf diese besondere Anwendung. Zum Beispiel erlaubte die Verwendung von vier verschiedenen Fluoreszenzmarkierungen, die auf der Grundlage irgendwelcher Emissionseigenschaften (z. B. Spektralverteilung, Lebensdauer, Polarisation) unterscheidbar sind, das eindeutige Verknüpfen einer gegebenen Markierung mit den Sequenzierungsfragmenten, die mit einer gegebenen Base verbunden sind. Wenn diese Verknüpfung aufgestellt ist, könnten die Fragmente vereinigt und auf einer einzigen Bahn aufgetrennt werden und die Basenzuordnung könnte direkt auf der Grundlage der gewählten Emissionseigenschaft durchgeführt werden.
  • Bis jetzt sind zwei Versuche zum Entwickeln eines DNA-Sequenzierungssystems auf Fluoreszenzgrundlage beschrieben worden. Das erste, am California Institute of Technology entwickelte System ist bei L. M. Smith, westdeutsche Pat.-Anm. DE 3446635 A1 (1984); L. E. Hood et al., westdeutsche Pat.-Anm. DE 3501306 A1 (1985); L. M. Smith et al., Nucleic Acids Research, Bd. 13, 2399-2412 (1985); und L. M. Smith et al., Nature, Bd. 321, 674-679 (1986) offenbart worden. Dieses System richtet sich im Entwurf an die im vorhergehenden Abschnitt beschriebenen Probleme, aber die Einzelheiten der Ausführung machen den Weg von Smith nur teilweise erfolgreich. Zum Beispiel macht es der große Wellenlängenbereich der Emissionsmaxima der fluoreszenzmarkierten DNA-Sequenzierungsfragmente, die in diesem System verwendet werden, schwierig, alle vier Farbstoffe wirksam mit einer einzigen monochromatischen Quelle anzuregen. Was wichtiger ist, die bedeutenden differentiellen Störungen der elektrophoretischen Beweglichkeit, die von Farbstoffen mit unterschiedlichen Nettoladungen herrühren, machen es schwierig oder unmöglich, ein Einzelbahnsequenzieren mit dem in diesem System verwendeten Satz Farbstoffe auszuführen. Diese Schwierigkeiten werden durch Smith et al. ausdrücklich angesprochen.
  • Im allgemeinen schafft die zum Herstellen der fluoreszenzmarkierten Sequenzierungsfragmente verwendete Methodik Schwierigkeiten. Für das Maxam-Gilbert-Sequenzieren werden 5'-markierte Oligonucleotide enzymatisch an doppelsträngige DNA-Fragmente mit "klebrigen Enden", die durch Restriktionsspaltung hergestellt wurden, enzymatisch ligiert. Dies beschränkt einen auf das Sequenzieren von Fragmenten, die auf diese Weise hergestellt wurden. Für das Sanger-Sequenzieren werden 5'-markierte Oligonucleotide als Starter verwendet. Vier spezielle Starter werden benötigt. Um ein neues Vektorsystem zu verwenden, muß man das komplexe Verfahren des Synthetisierens und Reinigens vier neuer farbstoffmarkierter Starter durchlaufen. Dasselbe trifft immer dann zu, wenn ein besonderer Starter benötigt wird.
  • Die Verwendung markierter Starter ist auch in anderer Hinsicht schlecht. Die Polymerisationsreaktionen müssen immer noch in getrennten Gefäßen durchgeführt werden. Wie bei dem Maxam-Gilbert- und Sanger-Sequenzierungssystem müssen im wesentlichen alle von dem markierten Starter stammenden Fragmente fluoreszierend markiert sein. Somit behält das sich daraus ergebende Sequenzierungsmuster die meisten der üblichen Nebenprodukte (z. B. falsche oder Schattenbanden, Pile-ups), die entstehen, wenn die enzymatische Kettenverlängerung durch andere Verfahren als den Einbau eines Kettenterminators unterbrochen wird.
  • Bei einem zweiten Weg haben W. Ansorge et al., J. Biochem. Biophys. Methods, Bd. 13, 315-323 (1986) eine nichtradioisotope DNA-Sequenzierungstechnik offenbart, bei der eine einzige 5'-Tetramethylrhodamin-Fluoreszenzmarkierung an das 5'-Ende eines 17-Basen-Oligonucleotidstarters kovalent gebunden wird. Dieser Starter wird in vier Gefäßen durch Standard-Dideoxynucleotid- Sequenzierungschemie enzymatisch verlängert, um eine Reihe enzymatisch kopierter DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge herzustellen. Jedes der vier Gefäße enthält einen Dideoxynucleotid-Kettenterminator, der einer der vier DNA-Basen entspricht, was die terminale Basenzuordnung aus einer herkömmlichen elektrophoretischen Trennung in vier Gelbahnen erlaubt. Die 5'-Tetramethylrhodamin-Fluoreszenzmarkierung wird durch einen Argonionen-Laserstrahl angeregt, der durch die Breite des gesamten Gels hindurchgeht. Obschon dieses System den Vorteil hat, daß ein Fluoreszenzreporter anstelle eines radioaktiven Reporters verwendet wird, bleiben noch alle Nachteile, die mit dem herkömmlichen Sequenzieren und mit dem Herstellen markierter Starter verbunden sind, bestehen.
  • Bis jetzt hat niemand ein DNA-Sequenzierungssystem geschaffen, das die Vorteile des Fluoreszenznachweises mit einer Terminatormarkierung verbindet. Falls geeignete fluoreszenzmarkierte Kettenterminatoren mitgeteilt werden können, würden markierte Sequenzierungsfragmente nur erzeugt, wenn ein markierter Kettenterminator enzymatisch in ein Sequenzierungsfragment eingebaut wird, wodurch viele der mit anderen Markierungsverfahren verbundenen Nebenprodukte ausgeschaltet würden. Wenn jeder der vier Kettenterminatoren, die zum Sequenzieren von DNA benötigt werden, an einen unterschiedlichen unterscheidbaren Fluoreszenzreporter kovalent gebunden wären, sollte es im Prinzip möglich sein, alle vier Terminatoren während einer einzigen Starterverlängerungsreaktion einzubauen und die sich daraus ergebenden Sequenzierungsfragmente auf einer einzigen Gelbahn zu analysieren. Falls derartige fluoreszensmarkierte Kettenterminatoren bereitgestellt würden, wären diese Verbindungen wahrscheinlich auch für andere Typen enzymatischer Markierung von Nucleinsäuren nützlich. Insbesondere könnten Analoga fluoreszenzmarkierter Kettenterminatoren entworfen werden zum Verwenden anderer nichtfluoreszierender Reporter oder um als kettenverlängernde Substrate für Enzyme zu dienen, die Nucleinsäuren in einer matrizengerichteten Weise (z. B. reverse Transkriptase, RNA-Polymerase oder DNA-Polymerase) vermehren. Das Einführen eines Reporters in eine DNA in einer zum Sequenzieren nützlichen Weise ist eines der schwierigsten Nucleinsäure-Markierungsprobleme. Verbindungen und/oder Strategien, die für das DNA-Sequenzieren entworfen sind, sind wahrscheinlich auch auf viele andere Markierungsprobleme anwendbar.
  • Um als kettenabbrechendes Substrat für das DNA-Sequenzieren auf Fluoreszenzgrundlage nützlich zu sein, muß ein Substrat eine Fluoreszenzmarkierung enthalten und es muß durch ein zum Sequenzieren von DNA brauchbares Enzym angenommen werden. Von geeigneten Substratkandidaten wird erwartet, daß sie Derivate oder Analoga der natürlich vorkommenden Nucleotide sind. Aufgrund der Erwartung, daß eine Fluoreszenzmarkierung und ein Nucleotid nicht in die aktive Stelle eines Replikationssystems zur selben Zeit passen, muß ein gut entworfenes Substrat die Fluoreszenzmarkierung durch eine Verbindungsgruppe ausreichender Länge und geeigneter Geometrie von dem Nucleotid getrennt enthalten, um die Fluoreszenzmarkierung von der aktiven Stelle des Enzyms entfernt anzuordnen. Die Natur der Verbindungsgruppe kann sowohl mit der Markierung als auch dem verwendeten Enzym schwanken. Zur leichten Synthese und Anpaßbarkeit an Änderungen bei den Markierungs- und/oder Enzymerfordernissen ist es jedoch am bequemsten, die Verbindungsgruppe als aus einem Linker bestehend anzusehen, der an das Nucleotid und die Fluoreszenzmarkierung gebunden ist.
  • Beim Aufbau der fluoreszenzmarkierten Kettenterminatoren für das DNA-Sequenzieren muß der Linker mehrere Erfordernisse erfüllen:
  • 1) er muß denselben oder einen funktionell äquivalenten Linker an alle vier in DNA vorgefundenen Basen binden können;
  • 2) der Linker darf das markierte Nucleotid nicht daran hindern, wirksam als kettenabbrechendes Substrat für ein Enzym, das zum DNA-Sequenzieren brauchbar ist, verwendet zu werden;
  • 3) der Linker (plus wahlfreiem Abstandsstück und Markierung) dürfen die Elektrophorese der Oligonucleotide, an welche er gebunden ist, nur auf eine Weise stören, die von der Base, an die er gebunden ist, unabhängig ist;
  • 4) die Bindung des Linkers an die Base und das Abstandsstück oder die Markierung muß stereoselektiv und regioselektiv sein, um ein einziges gut definiertes Nucleotidsubstrat zu erzeugen; und
  • 5) der Linker sollte vorzugsweise ein primäres oder sekundäres Amin zum Kuppeln mit der Markierung enthalten.
  • Obschon fünf verschiedene Typen Aminlinker zum Binden von Markierungen an Nucleotide und Oligonucleotide offenbart worden sind (siehe nachstehend), erfüllt keiner dieser Linker alle vorstehend aufgeführten Erfordernisse zur Verwendung als kettenabbrechendes Substrat, das beim DNA-Sequenzieren brauchbar ist.
  • Bergstrom et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 98, 1587 (1976) offenbaren ein Verfahren zum Binden von Alkenamino- und Acrylatseitenketten an Nucleoside durch Pd(II)-katalysiertes Kuppeln von 5-Mercuriouridinen an Olefine. Ruth, PCT/US84/00279, offenbart die Verwendung der vorstehenden Seitenketten als Linker für die Bindung von Reportern an nicht-enzymatisch synthetisierte Oligonucleotide. Langer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bd. 78, 6633 (1981) offenbaren die Verwendung von Allylaminolinkern zur Bindung von Reportern an Nucleotide. Die Nachteile dieser Linker schließen die Schwierigkeit des regioselektiven Herstellens der geeigneten Quecksilbernucleotid-Vorläufer, die Schwierigkeit des Trennens der Produktgemische, welche durch einige dieser Nucleotid/Olefin-Kupplungsreaktionen erzeugt werden, und die mögliche Labilität vinylsubstituierter Nucleoside ein. Klevan et al., WO 86/02929, offenbaren ein Verfahren zum Binden von Linkern in der N4-Stellung von Cytidin und der N6-Stellung von Adenosin. Der Nachteil dieses Verfahren ist, daß es in Uridin und Guanosin zum Binden eines Linkers keine analoge Stelle gibt.
  • Ein weiterer möglicher Linker, der die fünf vorstehend aufgeführten Erfordernisse erfüllen könnte, ist ein Alkinylaminolinker, in dem ein Ende der Dreifachbindung an das Nucleotid gebunden ist und das andere Ende der Dreifachbindung an eine Gruppe gebunden ist, die ein primäres oder sekundäres Amin enthält. Um die chemische Stabilität sicherzustellen, sollte das Amin nicht direkt an die Dreifachbindung gebunden sein. Einige Verfahren des Bindens von Alkingruppen an Nucleoside sind offenbart worden (siehe nachstehend).
  • Barr et al., J. Chem. Soc., Perkins Trans. 1, 1263-1267 (1978) offenbaren die Synthesen von 5-Ethinyluridin, 2'-Deoxy-5- ethinyluridin, 5-Ethinylcytosin, 5-Ethinylcytidin, 2'-Deoxy-5- ethinylcytidin und den α-Anomeren der 2'-Deoxyribonucleoside. Die 2'-Deoxyribonucleoside wurden durch Aufbauen der Heterocyclen, Kuppeln mit einem funktionalisierten 2-Deoxyzucker, Trennen der anomeren Gemische und Entfernen der Schutzgruppen an den Zuckern hergestellt.
  • Bergstrom et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 100, 8106 (1978) offenbaren das palladiumkatalysierte Kuppeln von Alkenen mit 5-Mercuri- oder 5-Iodderivaten von Uracilnucleosiden. Von diesem Verfahren wurde berichtet, daß es in analogen Reaktionen von Alkinen mit Uracilnucleosidderivaten fehlschlägt.
  • Vincent et al., Tetrahedron Letters, Bd. 22, 945-94? (1981) offenbaren die Synthese von 5-Alkinyl-2'-deoxyuridinen durch die Reaktion von O-3',5'-Bis(trimethylsilyl)deoxyuridin mit Alkinylzinkreagenzien in Anwesenheit von Palladium- oder Nickelkatalysatoren [Dichlor-bis(triphenylphosphin)palladium(II), Dichlorbis(benzonitril)palladium(II) oder Dichlor(ethylen-(bis(diphenylphosphin))nickel(II)].
  • Robins et al., J. Org. Chem., Bd. 48, 1854-1862 (1983) offenbaren ein Verfahren zum Kuppeln terminaler Alkine, HCECR (R = H, Alkyl, Phenyl, Trialkylsilyl, Hydroxyalkyl oder geschütztes Hydroxyalkyl) mit 5-Iod-1-methyluracil- und 5-Ioduracilnucleosiden (geschützt als ihre p-Toluylester) in Anwesenheit von Bis(triphenylphosphin)palladium(II)-chlorid und Kupfer(I)-iodid in warmem Triethylamin. Als 3',5'-Di-O-acetyl-5-iod-2'-deoxyuridin mit Hexin, 4-(p-Toluyloxy)butin, 4-(Tetrahydropyranyloxy)- oder 4-(Trityloxy)butin umgesetzt wurde, waren die Hauptprodukte die cyclisierten Furano[2,3-d]pyrimidin-2-one statt der gewünschten Alkinyluridine.
  • Keine der vorstehenden Literaturstellen offenbart ein Verfahren zum Binden eines Alkinylaminolinkers an Nucleoside. die Methodik von Bergstrom schlägt fehl und diejenige von Barr ist nicht direkt anwendbar. Die von Robins et al. und Vincent et al. verwendeten Katalysatoren besitzen die Kraft zum Fördern zahlreicher unerwünschter Nebenreaktionen (z. B. Cyclisierung oder intermolekulare nucleophile Addition des Amins an ein Alkin), wenn das Alkin eine Aminogruppe enthält. Von Kupplungsreaktionen ist nur mit Iodnucleosiden berichtet worden, die eine elektronenarme Uracilbase enthalten. Da Pd-katalysierte Kupplungsreaktionen im allgemeinen am besten mit elektronenarmen Aryliodiden arbeiten, können Probleme beim Kuppeln von Alkinen an die anderen drei Basen (die alle elektronenreicher als Uracil sind) erwartet werden.
  • Es besteht ein Bedürfnis nach Alkinylaminonucleotiden und nach Verfahren, die ihre Herstellung erlauben.
  • Die Verbindungen dieser Erfindung sind Alkinylaminonucleotide mit der Struktur:
  • Nuc-C C-R&sub1;-NR&sub2;R&sub3; (I)
  • worin R&sub1; eine substituierte oder unsubstituierte zweibindige Struktureinheit mit 1-20 Atomen ist,
  • R&sub2; und R&sub3; unabhängig H, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder eine Schutzgruppe sind und
  • Nuc (Nucleotid) R&sub4;-Het (heterocyclische Base) mit der Struktur
  • ist,
  • Z H oder NH&sub2; ist und
  • R&sub4; ein Zucker oder eine zuckerähnliche Struktureinheit
  • ist, worin R&sub5; H, PO&sub3;H&sub2;, P&sub2;O&sub6;H&sub3;, P&sub3;O&sub9;H&sub4; oder Salze davon ist und es gilt:
  • (I) wenn R&sub7; = R&sub8; = H, dann ist R&sub6; = H, OH, F, N&sub3; oder NH&sub2;; oder
  • (II) wenn R&sub7; = H und R&sub8; = OH, dann ist R&sub6; = H oder OH; oder
  • (III) wenn R&sub7; = OH und R&sub8; = H, dann ist R&sub6; = OH.
  • Zum Beispiel kann R&sub1; geradkettiges C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylen sein, das gegebenenfalls innerhalb der Kette Doppelbindungen, Dreifachbindungen, Arylgruppen oder Heteroatome wie etwa N, O oder S enthält. Die Heteroatome können Teil solcher funktioneller Gruppen wie Ether, Thioether, Ester, Amine oder Amide sein. Vorzugsweise ist R&sub1; geradkettiges C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylen; am bevorzugtesten ist R&sub1; -CH&sub2;-. Substituenten an R&sub1; können C&sub1;-C&sub6;-Alkyl, Aryl, Ester, Ether, Amin, Amid oder Chlorgruppen enthalten. Beispiele durch R&sub2; und R&sub3; dargestellter Schutzgruppen sind Acyl, Alkoxycarbonyl oder Sulfonyl. Vorzugsweise ist R&sub2; H und R&sub3; ist H oder Trifluoracetyl.
  • Die Alkinylaminonucleotide dieser Erfindung können zum Liefern markierter Alkinylaminonucleotide verwendet werden, wobei R&sub3; in Formel (I) durch eine Reportergruppe (Markierung) ersetzt ist.
  • Die zum Einbauen von Reportern in basenspezifischer Weise in die DNA-Sequenzierungsfragmente angewandte Strategie ist ein kritisches Merkmal jedes DNA-Sequenzierungssystems. Die Verwendung der Alkinylaminonucleotide dieser Erfindung gestattet die Abwandlung der Sanger-Methodik auf äußerst vorteilhafte Weise durch Binden eines Reporters (Markierung) an einen Alkylaminonucleotid-Kettenterminator. Obschon der Reporter aus einer breiten Vielfalt leicht nachweisbarer Gruppen (Markierungen) ausgewählt werden kann, wird der bevorzugte Weg aus Bequemlichkeit nachstehend mittels Fluoreszenzreportern veranschaulicht.
  • Dieser Weg bietet eine Anzahl von Vorteilen in der Arbeitsweise. Am wichtigsten verknüpft das Terminatormarkieren den gebundenen Reporter fest mit dem basenspezifischen Abbruchsvorgang. Nur DNA-Sequenzierungsfragmente, die aus richtigen Abbruchsvorgängen folgen, tragen einen Reporter. Dies beseitigt viele der Nebenprodukte, die beim herkömmlichen Sequenzieren beobachtet werden. Dieser Weg bietet auch eine vollständige Flexibilität bei der Auswahl des Sequenzierungsvektors, da keine besonderen Starter beteiligt sind. Die Automatisierung wird durch die Tatsache erleichtert, daß die Reporter von vier niedrigmolekularen Reagenzien getragen werden, die selektiv in einer einzigen Reaktion eingeführt werden können.
  • Es gibt keine der Arbeitsweise innewohnenden Nachteile. Die Probleme mit diesem Weg werden in der Planungsstufe angetroffen. Im allgemeinen sind die zum Sequenzieren von DNA verwendeten Enzyme hochsubstratselektiv und es gibt von vornherein keinen Grund zu erwarten, daß sie zum Herstellen eines Nucleosidtriphosphats mit einem kovalent gebundenen Reporter befähigt sind, der ein wirksames kettenabbrechendes Substrat für ein Sequenzierungsenzym ist. Es könnte angenommen werden, daß die Bindung eines Reporters an ein Substrat genügend große Änderungen im sterischen und elektronischen Charakter des Substrats hervorruft, um ihn für das Enzym unannehmbar zu machen oder, selbst wenn er angenommen wird, er nicht in die DNA-Kette eingebaut wird. Es ist jedoch gefunden worden, daß die geringe Größe des Alkinylaminolinkers dieser Erfindung und die Fähigkeit, den Alkinylaminolinker an die 5-Stellung der Pyrimidinnucleotide und der 7-Stellung der Purinnucleotide zu binden, markierte kettenabbrechende Substrate liefert, die den Zuverlässigkeitsgrad des Substrateinbaus nicht übermäßig stören.
  • Die Alkinylaminonucleotide dieser Erfindung werden durch die Beschreibung fluoreszierend markierter Alkinylaminonucleotid- Kettenterminatoren veranschaulicht. Um den strukturellen Umfang und die Ausgestaltung der fluoreszierend markierten Alkinylaminonucleotide dieser Erfindung darzustellen, ist es nützlich, die markierte Struktur (I) in fünf Bestandteile aufzubrechen:
  • Triphosphat-Zucker-Het-C -CR&sub1;-NR&sub2;-Markierung (fluoreszierend)
  • (I) (II) (III) (IV) (V)
  • (i) eine Triphosphat-Struktureinheit, R&sub5;,
  • (ii) ein "Zucker", R&sub4;,
  • (iii) eine heterocyclische Base (Het),
  • (iv) ein Linker (-C -CR&sub1;NR&sub2;-), und
  • (V) eine fluoreszierende Markierung, R&sub3;.
  • (i) Triphosphat-Struktureinheit (R&sub5;)
  • Die Triphosphat-Struktureinheit oder ein enges Analogon (z. B. α-Thiotriphosphat) ist eine zwingende Funktionalität für jedes kettenabbrechende oder andere Enzymsubstrat. Diese Funktionalität stellt viel Bindungsenergie für das Substrat bereit und ist die tatsächliche Stelle der Enzym-Substratreaktion.
  • (ii) Zucker (R&sub4;)
  • Der "Zuckerteil" entspricht dem 2'-Deoxyribofuranose-Strukturfragment in den natürlichen Enzymsubstraten. Dieser Teil des Moleküls trägt zur Enzymerkennung bei und ist zum Erhalten der richtigen räumlichen Beziehung zwischen der Triphosphatstruktureinheit und der heterocyclischen Base wesentlich. Um zum DNA- Sequenzieren nützlich zu sein, darf die 3'-α-Stellung, wenn der "Zucker" eine Ribofuranose ist, keine Hydroxylgruppe besitzen, die nachfolgend von dem Enzym verwendet werden kann. Die Hydroxylgruppe muß entweder abwesend, durch eine andere Gruppe ersetzt oder auf andere Weise unbrauchbar gemacht worden sein. Derartige Zucker werden als kettenabbrechende Zucker bezeichnet. Es ist bekannt, daß eine Anzahl abgeänderter Furanosefragmente dieses Erfordernis erfüllen können, welche
  • 2',3'-Dideoxy-β-D-ribofuranosyl [(a), F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bd. 74, 5463-5467 (1977)],
  • β-D-Arabinofuranosyl [(b) F. Sanger et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, Bd. 74, 5463-5467 (1977)],
  • 3'-Deoxy-β-D-ribofuranosyl [(c), Klement et al., Gene Analysis Technology, Bd. 3, 59-66 (1986)],
  • 3'-Amino-2',3'-dideoxy-β-D-ribofuranosyl [(d), Z. G. Chidgeavadze et al., Nuc. Acids Res., Bd. 12, 1671-1686 (1984)],
  • 2',3'-Dideoxy-3'-fluor-β-D-ribofuranosyl [(e), Z. G. Chidgeavadze et al., FEBS Lett., Bd. 183, 275-278 (1985)], und
  • 2',3'-Dideoxy-2',3'-didehydro-β-D-ribofuranosyl [(f), Atkinson et al., Biochem., Bd. 8, 4897-4904 (1961)] einschließen.
  • Acyclonucleosidtriphosphate (AcyNTP), in denen der sogenannte Zucker eine acyclische Gruppe [z. B. 2-Oxyethoxymethyl, (g)] ist, können ebenfalls als Kettenterminatoren beim DNA-Sequenzieren durch die Sanger-Methodik verwendet werden. Die Verwendung von AcyNTP als kettenterminierende Substrate ist gezeigt worden, indem ein herkömmliches Sanger-Sequenzieren (³²P-Reporter) mit den AcyNTP durchgeführt wurde, die die ddNTP ersetzen. Die mit AcyNTP hergestellten Sequenzleitern waren praktisch mit denen identisch, die mit ddNTP hergestellt wurden, außer daß eine höhere AcyNTP-Konzentration (ungefähr 10 x) erforderlich war, um eine ähnliche DNA-Fragmentverteilung zu erhalten. Die AcyNTP sind sowohl mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) als auch AMV-reverser Transkriptase wirksam. Von den Alkinylaminode rivaten von AcyNTP wird deshalb ebenfalls erwartet, daß sie als kettenabbrechende Substrate wirksam sind.
  • Die AcyNTP besitzen den Vorteil, daß sie leichter als die ddNTP synthetisiert werden. Während die Synthese der ddNTP kein Hauptproblem beim herkömmlichen Sequenzieren ist, ist es von Bedeutung, wenn strukturell komplexe, fluoreszierend markierte Kettenterminatoren hergestellt werden. Die Verwendung der 2-Oxyethoxymethylgruppe als Zucker vereinfacht die Synthese des Reagenzes stark, während ein annehmbares Leistungsvermögen erhalten wird.
  • Die medizinische Forschung hat weitere Zuckerabwandlungen angegeben, die zum DNA-Sequenzieren brauchbar sein können. Zum Beispiel sind ³¹-Azido-2',3'-dideoxythymidin [AZT: Mitsuya et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, Bd. 82, 7096-7190 (1985)] und 9- [2'-Hydroxy-1'-(hydroxymethyl)ethoxymethyl]guanin [DHPG: Aston et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 108, 1716-1721 (1982)], zwei antivirale Mittel, von denen vermutet wird, daß sie dadurch wirksam sind, daß sie in Triphosphate überführt werden, die einen Kettenabbruch der DNA-Vermehrung hervorrufen. Nucleosidtriphosphate mit derartigen Zuckereinheiten können ebenfalls zum DNA-Sequenzieren brauchbar sein.
    • (iii) Heterocyclische Base (Het)
  • Die heterocyclische Base wirkt als kritisches Erkennungselement bei Nucleinsäuren, indem sie als wasserstoffbindender Akzeptor und Donor in einer besonderen räumlichen Anordnung wirkt. Die heterocyclischen Basenelemente sind zum Einarbeiten mit der hohen Genauigkeit wesentlich, die für eine genaue Sequenzierung notwendig ist. Dieser strukturelle Teil ist auch der Ort der Bindung des Linkers.
  • Bevorzugte heterocyclische Basen schließen ein: Uracil (h), Cytosin (i), 7-Deazaadenin (j), 7-Deazaguanin (k) und 7-Deazahypoxanthin (l). Die unnatürlichen 7-Deazapurine können zum Binden des Linkers ohne Hinzufügen einer Nettoladung zum Basenteil und dadurch dem Destabilisieren der Glycosidbindung eingesetzt werden. Außerdem können andere heterocyclische Basen, die als wasserstoffbindende Donoren und Akzeptoren funktionell äquivalent sind, verwendet werden, z. B. können 8-Aza-7-deazapurine und 3,7-Dideazaadenin anstelle von 7-Deazapurinen verwendet werden und 6-Azapyrimidine können anstelle von Pyrimidinen verwendet werden. (Um die Nomenklatur zu vereinfachen, werden die heterocyclischen Basen durchgehend als 7-Deazapurine benannt und numeriert.)
    • (iv) Linker
  • Der Linker ist eine Alkinylaminogruppe, in dem ein Ende der Dreifachbindung an ein Amin über eine substituierte oder unsubstituierte Diradikalstruktureinheit, R&sub1;, mit 1-20 Atomen gebunden ist. Das andere Ende der Dreifachbindung ist an die heterocyclische Base in der 5-Stellung bei Pyrimidinen oder der 7-Stellung (Purinnumerierung) bei den 7-Deazapurinen gebunden. Der Aminstickstoff der Alkinylaminogruppe ist an eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe (z. B. Carbonyl) an der Fluoreszenzmarkierung gebunden. Der Linker darf das Binden oder den Einbau durch die DNA-Polymerase nicht wesentlich stören. Die Diradikalstruktureinheit kann geradkettiges C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylen sein, das gegebenenfalls in der Kette Doppelbindungen, Dreifachbindungen, Arylgruppen oder Heteroatome wie etwa N, O oder S enthält. Die Heteroatome können Teil solcher funktioneller Gruppen wie Ether, Thioether, Ester, Amine oder Amide sein. Substituenten an der Diradikalstruktureinheit können C&sub1;-C&sub6;-Alkyl, Aryl, Ester, Ether, Amin, Amid oder Chlorgruppen einschließen. Vorzugsweise ist die Diradikalstruktureinheit geradkettiges C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylen, am bevorzugtesten ist das Diradikal -CH&sub2;-.
    • (v) Fluoreszenzmarkierung (R&sub3;)
  • Die Fluoreszenzmarkierung stellt nachweisbare, ausgesandte Strahlung bereit, die auf die Anregung durch die Absorption von Energie aus einer geeigneten Quelle wie etwa einem Argonionenlaser folgt. Es ist erwünscht, für jede in den Sequenzierungsanwendungen angetroffene DNA-Base einzelne unterscheidbare Fluoreszenzreporter zu besitzen.
  • Eine Reporterfamilie, die zum Fluoreszenzmarkieren in einem DNA-Sequenzierungsverfahren brauchbar ist, das sich auf markierte Kettenterminatoren stützt, kann von dem bekannten Farbstoff 9-Carboxyethyl-6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen [S. Biggs et al., J. Chem. Soc., Bd. 123, 2934-2943 (1923)] abgeleitet werden. Diese Xanthen-Familie besitzt die allgemeine Struktur 1
  • worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; H, Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen und Cyano einschließen.
  • Ein bevorzugter Satz Farbstoffe, die zum DNA-Sequenzieren geeignet sind, ist die Struktur 1
  • a) R&sub9; = R&sub1;&sub0; = H, Abs. 487 nm, Emis. 505 nm;
  • b) R&sub9; = H, R&sub1;&sub0; = CH&sub3;, Abs. 494 nm, Emis. 512 nm;
  • c) R&sub9; = CH&sub3;, R&sub1;&sub0; = H, Abs. 501 nm, Emis. 519 nm; und
  • d) R&sub9; = R&sub1;&sub0; = CH&sub3;, Abs. 508 nm, Emis. 526 nm.
  • Die von L. M. Smith, L. E. Hood et al., L. M. Smith et al. und W. Ansorge et al. beschriebenen Instrumente sind zum Nachweisen von Sequenzierungsfragmenten fähig, die mit irgendeinem dieser Farbstoffe bei Konzentrationen markiert sind, die zum DNA-Sequenzieren geeignet sind, aber diese Instrumente können nicht zwischen dem vorstehenden Satz von vier Farbstoffen unterscheiden. Ein Verfahren zum Unterscheiden der Farbstoffe und Verwenden dieser Information zum Bestimmen von DNA-Sequenzen wird in der EP-A-25-2683 offenbart.
  • Diese Anmeldung offenbart ein System zum Sequenzieren von DNA, das ein Mittel zum Nachweisen der Anwesenheit von Strahlungsenergie aus nahe verwandten, aber unterscheidbaren Reportern umfaßt, die kovalent an Verbindungen gefunden sind, die als kettenabbrechende Nucleotide in einem modifizierten Sanger-Verfahren zur DNA-Kettenverlängerung wirken. Ein unterscheidbarer Fluoreszenzreporter ist an jede der vier Dideoxynucleotidbasen gebunden, die in den Sanger-DNA-Sequenzierungsreaktionen dargestellt werden, z. B. Dideoxynucleotide von Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin. Diese reportermarkierten kettenabbrechenden Reagenzien ersetzen unmarkierte Kettenterminatoren in dem herkömmlichen Sanger-Verfahren und werden in Reaktionen- mit den entsprechenden Deoxynucleotiden, einem geeigneten Starter, Matrize und Polymerase kombiniert. Das sich daraus ergebende Gemisch enthält DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, welche sich voneinander durch eine Base unterscheiden, die am 3'-Ende mit einmalig markierten Kettenterminatoren terminiert, die jedem der vier DNA-Basen entsprechen. Dieses neue Markierungsverfahren erlaubt die Eliminierung der gebräuchlichen radioaktiven Markierung, die in einem der Deoxynucleotide der herkömmlichen Sanger- Methode enthalten ist.
  • Der Nachweis dieser Reportermarkierungen kann mit zwei stationären Fotovervielfacherröhren (PMT) bewerkstelligt werden, die nahe auseinanderliegende fluoreszierende Emissionen aus laserstimulierten Reportern empfangen, die an Kettenterminatoren an DNA-Fragmente gebunden sind. Diese Fragmente können elektrophoretisch nach Raum und/oder Zeit getrennt werden und sich entlang einer senkrechten Achse zur Nachweisfläche der PMT bewegen. Die fluoreszierenden Emissionen gehen zuerst durch ein dichroitisches Filter mit sowohl einer Transmissions- als auch Reflexionseigenschaft, welche so angeordnet ist, daß es ein Merkmal (Transmission) zu einer PMT und das andere Merkmal (Reflexion) zu der anderen PMT lenkt. Auf diese Weise werden unterschiedliche digitale Signale in jeder PMT erzeugt, die so ins Verhältnis gesetzt werden können, daß sie ein drittes Signal erzeugen, welches gegenüber einem vorgegebenen Fluoreszenzreporter einmalig ist, selbst wenn eine Reihe von Fluoreszenzreportern mit nahe beieinanderliegenden Emissionen verwendet wird. Dieses System kann Reporter nachweisen, die alle wirksam durch eine einzige Laserlinie, wie etwa 488 nm, angeregt werden und die nahe beieinanderliegende Emissionen besitzen, deren Maxima üblicherweise sich voneinander durch nur 5 bis 7 nm unterscheiden. Daher können die sequentiellen Basenzuordnungen in einem DNA-Strang von Interesse auf der Grundlage des einzigartigen Verhältnisses getroffen werden, daß für jeden der vier reportermarkierten Kettenterminatoren abgeleitet ist, die jeder der vier Basen in der DNA entsprechen.
  • Da diese Xanthen-Farbstoffe reaktionsfähige funktionelle Gruppen enthalten, offenbart die EP-A-252 683 ferner den Aufbau und die Herstellung von Reagenzien, die zum Binden dieser Farbstoffe an die Aminogruppe eines Alkinylaminolinkers nützlich sind.
  • N-Hydroxysuccinimidester 2 (worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; wie Struktur 1 definiert sind) sind bevorzugte Beispiele derartiger Reagenzien. Während der Herstellung von 2 wird eine Sarcosingruppe der basischen Farbstoffstruktur zugefügt, um Nebenreaktionen auf ein Minimum zurückzuführen. In der vorstehenden mitanhängigen Anmeldung wird diese wahlfreie Sarcosingruppe als "Spacer" bezeichnet. Da nur die bevorzugten Reagenzien hier verwendet werden, wird der fluoreszierende Teil eines markierten Alkinylamino- Kettenterminators als einen Sarcosinspacer enthaltend angesehen. Nachdem die N-Hydroxysuccinimid-Abgangsgruppe durch die Aminogruppe des Linkers ersetzt worden ist, wird der fluoreszierende Farbstoff (Teilstruktur 1) durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid freigesetzt. N-Hydroxysuccinimidester sind Acylierungsmittel, die selektiv mit stark nucleophilen Aminogruppen, wie etwa denjenigen, die in den vorstehend beschriebenen Alkinylaminolinkern vorliegen, reagieren. Kontrollexperimente haben gezeigt, daß 2 ähnliche N-Hydroxysuccinimidester viel langsamer mit den Aminogruppen der heterocyclischen Base als mit der Linkeraminogruppe reagieren. Falls die Reaktion mit den heterocyclischen Aminogruppen in einem geringen Ausmaß auftritt, ist entdeckt worden, daß die sich daraus ergebenden Amide durch die Ammoniumhydroxid-Behandlung hydrolysiert werden, was den Farbstoff freisetzt. Es ist daher möglich, Ester wie etwa 2 zum selektiven Binden irgendeines Reporters, wie etwa ein fluoreszierender Farbstoff, an die Aminogruppe des Linkers zu verwenden, ohne das Nucleotid in einer unerwünschten Weise zu modifizieren.
  • Fluoreszierend markierte Alkinylaminonucleotid-Kettenterminatoren dieser Erfindung wirken sowohl beim DNA-Sequenzieren mit AMV-reverser Transkriptase als auch den entsprechenden Substraten, die Allylaminolinker enthalten, welche in der EP-A-252 683 offenbart werden. Die Verbindungen dieser Erfindung sind jedoch leichter zu synthetisieren, als die entsprechenden Substrate, die Allylaminolinker enthalten, weil die Alkinylaminolinker leichter an eine vorgewählte Stellung an den verschiedenen Basen, die zum DNA-Sequenzieren benötigt werden, gebunden werden. Außerdem können die Alkinylaminolinker an die Nucleotide in höherer Ausbeute gebunden werden. Schließlich wird von Nucleotiden, die ein Alkin in Konjugation mit einem heterocyclischen Ring enthalten, erwartet, daß sie stabiler sind als entsprechende Nucleotide, die ein Alken enthalten. Geeignete fluoreszierend markierte Kettenterminatoren, die von Alkinylaminonucleotiden abgeleitet sind, werden durch die Struktur 3 dargestellt, worin Nuc, R&sub1;-R&sub4; und R&sub6;-R&sub8; wie vorstehend definiert sind, R&sub5; = HO&sub9;P&sub3; und vorausgesetzt, daß wenn R&sub8; H oder OH ist, R&sub6; nicht OH sein darf. Fluoreszenzmarkierung
  • Schema 1 beschreibt Verfahren zum Herstellen der Alkinylaminonucleotide dieser Erfindung, worin der Zucker eine 2,3-Dideoxyribofuranosylgruppe ist. Diese Verfahren sind mit allen Zuckern dieser Erfindung verträglich. Wenn diese Verfahren mit bekannten Verfahren zum Modifizieren der Zucker von Nucleotiden verwendet werden, können sie zum Herstellen von Alkinylaminonucleotiden verwendet werden, in denen die 2,3-Dideoxyribofuranosylgruppe durch die anderen Zucker der Erfindung ersetzt sind. Schema 1 Fluoreszenzmarkierung
  • Eine Vielfalt von Wegen kann zum Herstellen der ersten Schlüsselzwischenprodukte, der Iodnucleoside (i), verwendet werden. (In einigen Fällen können die entsprechenden Bromnucleoside anstelle der Iodnucleoside verwendet werden.)
  • 5-Iod-2',3'-dideoxyuridin kann durch Behandeln von 2',3'-Dideoxyuridin [Pfitzer et al., J. Org. Chem., Bd. 29, 1508 (1964)] mit ICl [Robins et al., Can. J. Chem., Bd. 60, 554-557 (1982)] hergestellt werden.
  • 5-Iod-2',3'-dideoxycytidin kann durch Überführen von 2',3'-Dideoxycytidin (Rayco Co.) in das entsprechende 5-Mercurionucleosid [Bergstrom et al., J. Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides, Bd. 4, 257-269 (1977)] und anschließend Behandeln mit Iod hergestellt werden.
  • Obschon Verfahren zum Herstellen von 7-Deazaguanosin und 2'-Deoxy-7-deazaguanosin bekannt sind, ist gezeigt worden [Seela et al., Chem. Ber., Bd. 111, 2925-2930 (1978)], daß der elektrophile Angriff auf 7-Deazaguanine sowohl an der 7- als auch 8- Stellung erfolgt. Es ist jedoch jetzt gefunden worden, daß die gewünschten 7-Iod-7-deazapurine durch Behandlung von 6-Methoxy- 2-thiomethyl-7-deazapurinen mit N-Iodsuccinimid, gefolgt vom Ersatz des 2-Thiomethyl und 6-Methoxysubstituenten, wie in Schema 2 dargestellt und in Beispiel 3 beschrieben, erhalten werden können. Die Verwendung von N-Iodsuccinimid zur regioselektiven Iodierung eines 7-Deazapurin-Ringsystems ist ohne Beispiel. Schema 2
  • 7-Iod-2',3'-dideoxy-7-deazaadenosin kann durch Deoxygenierung von Tubercidin, gefolgt von der Mercurierung/Iodierung (Schema 3) hergestellt werden. Die Deoxygenierungsreaktionen wurden von Verfahren angepaßt, die von Moffatt et al., [J. Am. Chem. Soc., Bd. 95, 4016-4030 (1972)] und Robins et al., [Tetrahedron Lett., Bd. 25, 367-340 (1984)] offenbart wurden, um eine verbesserte Synthese von 2',3'-Dideoxy-7-deazaadenosin anzugeben, wie in Schema 3 gezeigt und in Beispiel 4 beschrieben wird.
  • 7-Iod-7-deazaadenosin kann durch regioselektive Mercurierung/- Iodierung von Tubercidin (7-Deazaadenosin) hergestellt werden, wie von Bergstrom et al., J. Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides, Bd. 5, 285-296 (1978) und Bergstrom et al., J. Org. Chem., Bd. 46, 1424 (1981) berichtet wird. Schema 3
  • Alternative Wege zu 7-Iod-2',3'-dideoxy-7-deazaadenosin können verwendet werden, die kein Tubercidin, ein teures Fermentationsprodukt, als Ausgangsmaterial verwenden. Diese Wege werden in Schema 4 und 5 dargestellt und in Beispiel 5 und 6 beschrieben. In einem dieser Wege wurde das Problem des regioselektiven Einführens von Iod in der 7-Stellung durch eine weitere Iodierung ohne Beispiel gelöst. In diesem Fall lieferte die Behandlung von 6-Chlor-7-deazapurin 32 mit Iodmonochlorid nur das 7-Iod-Regioisomer 33. Schema 4 Schema 5
  • Obschon ein Verfahren zum Kuppeln terminaler Alkine mit geschützten 5-Ioduracilnucleosiden mittels eines Pd(II)/Cu(I)- Katalysators durch Robins et al. [Tetrahedron Lett., Bd. 22, 421-424 (1981)] berichtet wurde, bewirkt dieses Verfahren nicht das gewünschte Kuppeln zwischen Alkinylaminen (z. B. Propargylamin) und dem ungeschützten 5-Iodpyrimidin- oder 7-Iod-purinnucleosid. Die Fähigkeit, Alkinylamine beim direkten Kuppeln zu verwenden, war zum direkten Bereitstellen von Verbindungen mit einer Amingruppe für das nachfolgende Binden der Fluoreszenzmarkierung äußerst erwünscht. Ähnlich wurde ein Verfahren mittels ungeschützter Nucleoside gesucht, um einen direkteren Weg zu den gewünschten Verbindungen durch Eliminieren einer sonst unnötigen Reihe von Reaktionen zum Schützen/Entschützen bereitzustellen.
  • Unter den nachstehend beschriebenen Bedingungen wurden Alkinylamine erfolgreich mit einer Vielfalt Halogennucleoside in ausgezeichneten Ausbeuten mittels eines Pd(O)/Cu(I)-Katalysators gekuppelt. Diese Kupplungsreaktion war auch erfolgreich, wenn der Alkinylaminstickstoff durch eine Acylgruppe wie etwa Acetyl und Trifluoracetyl, Alkoxycarbonylgruppe wie etwa 9-Fluorenylmethyloxycarbonylgruppe, und eine Sulfonylgruppe wie etwa p- Toluolsulfonylgruppe geschützt war. Unerwarteterweise wurde gefunden, daß die Anzahl der Kohlenstoffatome zwischen der Aminogruppe und der Dreifachbindung in dem nachstehend beschriebenen Verfahren nicht kritisch war.
  • 3-Amino-1-propin (Propargylamin), 5-Amino-1-pentin,
  • N-(2-Propinyl)trifluoracetamid,
  • N-(4-Pentinyl)trifluoracetamid und
  • N-(11-Dodecinyl)trifluoracetamid
  • wurden in den Kupplungsreaktionen alle erfolgreich verwendet.
  • Der breite Erfolg dieser Pd(O)/Cu(I)-katalysierten Kupplungsreaktion ist im Hinblick auf die Technik unerwartet. Zum Beispiel merkten Bergstrom et al. [J. Am. Chem. Soc., Bd. 100, 8106 (1978)] an, daß Alkine beim Kuppeln an 5-Mercuri- oder 5-Iodderivate von Uracilnucleosiden mittels Pd-Katalysatoren fehlschlugen. Ferner offenbarten Robins et al. [J. Org. Chem., Bd. 48, 1854-1862 (1983)], daß die Pd(II)/Cu(I)-katalysierten Reaktionen von 3',5'-Di-O-acetyl-5-iod-2'-deoxyuridin häufig cyclisierte Produkte ergaben. Wenn das nachstehend beschriebene Verfahren verwendet wird, ist die Kupplung selbst mit Alkinylaminen (wie etwa 5-Amino-1-pentin), welche die Möglichkeit zum leichten Cyclisieren besitzen, erfolgreich.
  • Typischerweise können die Alkinylaminonucleoside dieser Erfindung durch Einbringen des Halogennucleosids und Cu(I) in einen Kolben, Spülen mit Ar zum Entfernen von Luft, Hinzufügen von trockenem Dimethylformamid, gefolgt von der Zugabe des Alkinylamins, Triethylamin und Pd(O) hergestellt werden. Das Reaktionsgemisch kann mehrere Stunden, oder bis die Dünnschichtchromatographie (DSC) den Verbrauch des Halogennucleosids angezeigt, gerührt werden. Wenn ein ungeschütztes Alkinylamin verwendet wird, kann das Alkinylaminonucleosid durch Einengen des Reaktionsgemisches und Chromatographieren auf Kieselgel mittels eines Elutionslösungsmittels, das Ammoniumhydroxid zum Neutralisieren des Halogenwasserstoffs enthält, welcher bei der Kupplungsreaktion erzeugt wird, isoliert werden. Wenn ein geschütztes Alkinylamin verwendet wird, können Methanol/Methylenchlorid dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden, gefolgt von der Bicarbonatform eines stark basischen Anionenaustauschharzes. Die Anschlämmung kann anschließend etwa 45 Min. gerührt, filtriert werden und das Harz kann mit zusätzlichem Methanol/Methylenchlorid gewaschen werden. Die vereinigten Filtrate können eingeengt und rasch durch Blitzchromatographie an Kieselgel mittels eines Methanol/Methylenchlorid-Gradienten gereinigt werden.
  • Die Alkinylaminonucleotide dieser Erfindung werden vorzugsweise aus 5-Iodpyrimidin- oder 7-Iod-7-deazapurinnucleosiden hergestellt, aber die analogen Bromnucleoside können ebenfalls verwendet werden. [Die Pd(O)/Cu(I)-katalysierte Kupplungsreaktion kann auch zum Einführen von Alkinylaminogruppen an anderen Stellungen an dem aromatischen oder heteroaromatischen Ring verwendet werden, nur vorausgesetzt, daß das entsprechende Halogennucleotid verfügbar ist.]
  • Geeignete Alkinylamine für die Pd(O)/Cu(I)-katalysierte Kupplungsreaktion sind terminale Alkine, in denen die Dreifachbindung an ein Amin durch eine Diradikalstruktureinheit mit 1-20 Atomen gebunden ist. Die Diradikalstruktureinheit kann geradkettiges Alkylen (C&sub1;-C&sub2;&sub0;, z. B. -C&sub3;H&sub6;-) sein, oder kann Doppelbindungen (z. B. wie in -CH=CHCH&sub2;-), Dreifachbindungen (z. B. wie in -C=-C-CH&sub2;-) oder Arylgruppen [z. B. (para)-C&sub6;H&sub4;-, oder para-CH&sub2;- C&sub6;H&sub3;-] enthalten. Das Diradikal kann auch Heteroatome wie etwa N, O oder S in der Kette als Teil von Ether-, Ester-, Amino- oder Amidogruppen enthalten. Geeignete Substituenten an der Diradikalstruktureinheit können C&sub1;-C&sub6;-Alkyl, Aryl, Ester, Ether, Amin, Amid oder Chlorgruppen einschließen. Vorzugsweise ist das Diradikal geradkettiges Alkylen (C&sub1;-C&sub1;&sub0;), am bevorzugtesten ist das Diradikal -CH&sub2;-. Geeignete Substituenten an dem Amin sind Niederalkyl (C&sub1;-C&sub4;) und Schutzgruppen wie etwa Trifluoracetyl. Im allgemeinen kann das Amin des Alkinylamins primär, sekundär oder tertiär sein. Zur Verwendung als Linker ist das Alkinylamin jedoch vorzugsweise ein primäres Amin. Das Amin des Alkinylamins wird üblicherweise geschützt, da ein Aminschutz im nächsten Schritt erforderlich ist. Das gekuppelte Produkt wird auch leichter gereinigt, wenn dieses Amin in geschützter Form eingeführt wird. Eine Trifluoracetylschutzgruppe ist bevorzugt, weil sie, nachdem das Kupplungsprodukt in das entsprechende 5'-Triphosphat überführt worden ist, leicht entfernt wird. Im allgemeinen kann ein 1,5-3,0facher Überschuß Alkinylamin (bezogen auf Iodnucleosid) eingesetzt werden, um die vollständige Überführung des Iodnucleosids in ein Alkinylaminonucleosid sicherzustellen.
  • Geeignete Lösungsmittel für die Kupplungsreaktion schließen polare Lösungsmittel ein, welche das Iod- oder Bromnucleosid lösen und das Pd(O)/Cu(I)-Katalysatorsystem nicht zersetzen. N,N-Dimethylformamid (DMF), Acetonitril, THF, Dimethylsulfoxid (DMSO), Hexamethylphosphoramid (HMPA) und Alkohole können alle verwendet werden. Lösungsmittel, die geringe Mengen Wasser enthalten, sind ebenfalls annehmbar. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel DMF. Vorzugsweise ist die Konzentration des Halogennucleosids 0,02-1,0 M, am bevorzugtesten 0,2-0,5 M.
  • Geeignete Pd-Katalysatoren sind Pd(O)-Komplexe, zum Beispiel Tetrakis(triarylphosphin)Pd(O). Vorzugsweise ist der Pd(O)-Katalysator Tetrakis(triphenylphosphin)Pd(O). Die Menge an verwendetem Pd-Katalysator beträgt im allgemeinen 1-25 Mol% (bezogen auf Iodnucleosid), vorzugsweise 5-15 Mol%. Die größeren Katalysatormengen werden zum Ausführen der Reaktion in einem sehr kleinen Maßstab oder zum Erniedrigen der Reaktionszeit für das Kuppeln verwendet.
  • Der Cu(I)-Cokatalysator ist vorzugsweise ein Kupferhalogenid oder Pseudohalogenid (wie etwa Kupfercyanid), am bevorzugtesten CuI.
  • Das Molverhältnis von Cu(I)-Cokatalysator zu Pd(O)-Katalysator beträgt mehr als 1,0, aber weniger als 20. Wenn ein geschütztes Alkinylamin verwendet wird, beträgt das bevorzugte Molverhältnis Cu/Pd 2. Wenn das Alkinylamin ungeschützt ist, vermindert das ungehinderte basische Stickstoffatom die katalytische Aktivität des Kupfers. In diesem Fall ist ein Cu/Pd-Verhältnis von 5 bevorzugt. In jedem Fall wird bei Raumtemperatur keine Reaktion beobachtet, wenn Cu/Pd = 1. Die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht sich im allgemeinen, wenn sich das Cu/Pd-Verhältnis erhöht. Mit geschützten Alkinylaminen und Cu/Pd-Verhältnissen größer als 2 wird diese Erhöhung jedoch von vermehrten Nebenprodukten begleitet, wie durch DSC angezeigt wird.
  • Triethylamin dient möglicherweise als Säurefänger in dieser Reaktion. Andere stark basische Amine können ebenfalls verwendet werden. Ein Überschuß des ungeschützten Alkinylamins kann auch als Säurefänger dienen, aber vorzugsweise wird ebenfalls Triethylamin zugesetzt.
  • Geschützte Alkinylaminonucleoside können in die entsprechenden 5'-Triphosphate durch Behandlung mit Phosphoroxychlorid und anschließend Tri-n-butylammoniumpyrophosphat überführt werden [Ruth et al., Mol. Pharmacol., 415 (1981)]. Das sich daraus ergebende rohe Triphosphat kann auf dieser Stufe durch Ionenaustauschchromatographie durch Eluieren mit einem flüchtigen Puffer wie etwa Triethylammoniumbicarbonat gereinigt werden. Das gewünschte Nucleosidtriphosphat wird von Nebenprodukten gut abgetrennt, aber die Lyophilisierung führt zu einem gewissen Entfernen der Schutzgruppe am Linkerstickstoff, wenn diese Schutzgruppe eine Trifluoracetylgruppe ist. Das Entschützen kann durch Behandlung mit 14%igem wäßrigem Ammoniak vervollständigt werden und das Produkt kann erneut durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden. Da die Natur des Linkers und seiner Schutzgruppe die Überführung in ein Triphosphat nicht zu blockieren scheint, kann diese Methodik zum Herstellen einer breiten Vielfalt von Nucleosidmono-, di- und triphosphaten mit geschützten oder ungeschützten Alkinylaminolinkern verwendet werden.
  • Nach der Herstellung der Alkinylaminonucleotide dieser Erfindung wird die Herstellung eines gewünschten reportermarkierten Alkinylaminonucleotids dieser Erfindung vorbereitet.
  • Der bevorzugte Satz von vier fluoreszierend markierten Alkinylaminonucleotid-Kettenterminatoren (34-37), die nachstehend gezeigt sind, wird aus Alkinylaminonucleotiden dieser Erfindung abgeleitet. Dieser Satz markierter Verbindungen wird, wie in Beispiel 19 beschrieben, durch Kuppeln der N-Hydroxysuccinimidester 2 mit dem Alkinylaminonucleosidtriphosphat 6, gefolgt vom Ammoniak-Entschützen hergestellt.
  • Diese vier fluoreszierend markierten Kettenterminatoren wurden anstelle der Standard-Dideoxynucleotid-Kettenterminatoren verwendet, wenn DNA mittels AMV-reverser Transkriptase gemäß dem Verfahren von Zagursky et al., Gene Analysis Techniques, Bd. 2, 89-94 (1985) sequenziert wurde. Die sich daraus ergebenden fluoreszierend markierten Sequenzierungsleitern können durch ein Instrument analysiert werden, das zum Nachweisen fluoreszierender Moleküle, wenn sie während der Gelelektrophorese wandern, aufgebaut ist. Ein System dieses Typs, das zwei Filter verwendet, wird in der US-A-4833332 beschrieben. Wie in der US-A-4833332 beschrieben, wird ein Paar Module über und unter einer Ebene angeordnet, in welcher der den Reporter anregende Lichtstrahl mehrere Bahnen auf einem Elektrophoresegel abtastet. Jeder Kanal enthält reportermarkierte DNA-Fragmente. Jedes Nachweismodul umfaßt eine Fotoverstärkerröhre (PMT) mit einer breiten Eintrittsfläche und einem getrennten wellenlängenempfindlichen Filter, das zwischen seiner PMT und der fluoreszierenden Spezies in dem Gel angebracht ist. Diese Filter sind Interferenzfilter mit komplementären Transmissionsbandeneigenschaften, welche die Wirkung eines dichroitischen Filters nachahmen. Die Filter erlauben den PMT das Erzeugen von Signalen, die in der Amplitude in unterschiedlichem Sinn als Funktion der Natur der Spezies schwanken. Ein Filter läßt hauptsächlich die niederen Emissionswellenlängen durch und weist die hohen Emissionswellenlängen zurück, während der andere Filter genau das Gegenteil tut. Transmissionsfilter können mit jedem Interferenzfilter verwendet werden, um Licht aus Achsenwinkeln, die größer als ein vorbestimmter Winkel sind, zurückzuweisen. Die Wellenlängenfilter besitzen grobkomplementäre Durchlässe gegenüber den Wellenlängeneigenschaften im Emissionsbereich der vier Farbstoffe, wobei die Übergangswellenlängen in der Nähe des Zentrums der Strahlungsenergiespektren der Spezies auftreten.
  • Der Nachweis der Fragmente kann ferner durch die durch Smith et al., Hood et al. und Ansorge et al. beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Die gleichzeitige Analyse von vier Basen in einer einzigen Bahn mittels der Information, die durch diesen besonderen Satz von vier fluoreszierenden Farbstoffen geliefert wird, kann jedoch nur mittels des Signalverarbeitungssystems durchgeführt werden, das in der vorstehenden mitanhängigen Patentanmeldung beschrieben wird.
  • Um die Ergebnisse, welche durch den Fluoreszenznachweis erhalten wurden, mit denjenigen zu vergleichen, die durch Standard-Sequenzierungstechniken erhalten wurden, ist dieser Satz von vier markierten Kettenterminatoren auch zum Erzeugen fluoreszierend markierter Sequenzierungsfragmente verwendet worden, die ebenfalls einen ³²P-Reporter enthalten können. (Der ³²P-Reporter kann während der Starterverlängerung durch Hinzufügen markierter dNTP oder durch 5'-Markieren des Starters mit einer Kinase enzymatisch eingebaut werden.) Die sich daraus ergebenden, doppelt markierten Sequenzierungsleitern können sowohl durch Autoradiographie als auch durch einen Fluoreszenzgelleser analysiert werden. Diese fluoreszierend markierten Sequenzierungsleitern sind den Leitern, die durch die Standard-Dideoxynucleotid-Kettenterminatoren erzeugt werden, sehr ähnlich und funktionell äquivalent, ausgenommen daß alle Banden ungefähr zwei Basen langsamer laufen. Die relative Intensität verschiedener Banden in diesen Sequenzierungsleitern wird durch Zusatz eines Linkers und Farbstoffs abgeändert, aber der abgeänderte Kettenterminator scheint nicht zu bewirken, daß irgendwelche Banden ausgelassen werden. Unter geeigneten Gelelektrophoresebedingungen bewirken der Linker und Farbstoff auf diesen Kettenterminatoren nicht, daß irgendwelche Banden abnormal wandern: eine sich schneller bewegende Bande enthält weniger Basen, als eine sich langsamer bewegende Bande. Der Abstand zwischen benachbarten Banden mit verschiedenen Farbstoffen schwankt leicht in Abhängigkeit davon, welche Farbstoffe sich nebeneinander befinden. Wenn unter optimalen Bedingungen entweder ein Fluoreszenz- oder Radioaktivitätsnachweis verwendet wird, stören sich diese geringen Unterschiede in der relativen Bandenintensität und Position nicht mit der Verwendung dieser Kettenterminatoren zum Sequenzieren von DNA.
  • Die Brauchbarkeit von Alkinylaminonucleotiden zur Herstellung markierter kettenabbrechender Substrate zum DNA-Sequenzieren ist nicht nur auf die Synthese des Satzes der vier vorstehend dargestellten Verbindungen (34-37) begrenzt. Andere Kombinationen von Zuckern, Basen und Farbstoffen sind mittels eines Alkinylaminolinkers zusammengesetzt worden und diese Verbindungen sind ebenfalls zum Sequenzieren von DNA brauchbar.
  • Außer ihrer Verwendung beim Herstellen fluoreszierend markierter Kettenterminatoren sind die Alkinylaminonucleotide dieser Erfindung allgemein brauchbar zum Binden einer Vielfalt von Reportern an Nucleotide oder Oligonucleotide. Da die nucleophilste Stelle in diesen Molekülen die mit dem Linker eingeführte Aminogruppe ist, kann ein Reporter, der eine aktivierte Carbonsäure (z. B. N-Hydroxysuccinimidester), ein Isocyanat, ein Isothiocyanat, ein aktiviertes Arylhalogenid (z. B. 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol) oder andere elektrophile funktionelle Gruppen geeigneter Reaktionsfähigkeit enthält, selektiv an dieses Stickstoffatom gebunden werden. Die sich daraus ergebenden markierten Addukte können anschließend in anderen, nachstehend zu beschreibenden Anwendungen verwendet werden.
  • Da die heterocyclische Basenuntereinheit der Nucleotide im genetischen Code verwendet wird, wird die Funktion vieler Nucleotide oft durch die Natur der Zuckeruntereinheit bestimmt. Gleichermaßen hängt die Verwendung der Alkinylaminonucleotide spezifisch davon ab, welcher Typ Zuckeruntereinheit vorhanden ist. Diese Brauchbarkeit wird vermindert, falls der Alkinylaminolinker und/oder -reporter eine benötigte Funktion des Nucleotids stört.
  • Die Alkinylaminolinker-haltigen Nucleotide dieser Erfindung besitzen ausgeprägte Vorteile wie etwa: die geringe sterische Raumerfüllung des Alkinylaminolinkers führt die Störung der Nucleotide auf ein Mindestmaß zurück; das Anbringen des Linkers an der 5-Stellung von Pyrimidinnucleotiden und der 7-Stellung von 7-Deazapurinnucleotiden bringt den Linker und Reporter schließlich in den Haupteinschnitt, wenn das Nucleotid in doppelsträngige DNA eingebaut wird (dies dient dazu, eine Störung der Hybridisierung und anderer Vorgänge, die erfordern, daß eine doppelsträngige Konformation möglich ist, auf ein Mindestmaß zurückzuführen); und Alkinylaminonucleotide mit einem daran gebundenen Reporter sind ausgezeichnete Substrate für AMV-reverse Transkriptase. Da funktionsbezogene Enzyme dazu neigen, mit ihren Substraten auf ähnliche Weise in Wechselwirkung zu treten, ist es wahrscheinlich, daß diese Nucleotide auch für andere brauchbare Enzyme (wie etwa andere reverse Transkriptasen, DNA- Polymerasen und RNA-Polymerasen) Substrate sind, welche eine matrizengerichtete Nucleotidpolymerisation ausführen.
  • Die Alkinylaminonucleotide dieser Erfindung bieten eine attraktive Alternative für die chemische (nichtenzymatische) Synthese markierter 2'-Deoxyoligonucleotide. Ruth, internationale Anmeldung Nummer PCT/US84/00279, offenbart ein Verfahren zum Einbringen einer Reportergruppe in eine definierte Sequenz eines einzelsträngigen Oligonucleotids. Das Verfahren schließt die Herstellung geeignet geschützter und aktivierter monomerer Nucleotide, die einen Linker mit einer geschützten Aminogruppe besitzen, die Verwendung dieser monomeren Nucleotide zum chemischen Synthetisieren von Oligonucleotiden, gefolgt von der selektiven Bindung eines Reporters an die Linkeraminogruppe ein. Von der geringen Größe der Alkinylaminolinker und ihrer Lage an der 5- Stellung von Pyrimidinnucleotiden und der 7-Stellung von 7- Deazapurinnucleotiden wird erwartet, daß sie das Leistungsvermögen von sie enthaltenden Oligonucleotiden verbessern. Ein geeignet geschütztes und aktiviertes Monomer, (38), das dem von Roth beschriebenen ähnlich ist, konnte aus im Handel erhältlichem 5-Iod-2'-deoxyuridin durch die Pd(O)/Cu(I)-katalysierte Bindung eines Alkinylaminolinkers, gefolgt von der selektiven Dimethoxytritylierung des 5'-Alkohols und schließlich der Umwandlung in ein 3'-Phosphoramidit mit Chlor(diisopropylamino)methoxyphosphin hergestellt werden. Von diesem Monomer und anderen ähnlichen Alkinylamino-haltigen Monomeren wird erwartet, daß sie bei der Oligonucleotidsynthese und Reporterbindung gemäß den durch Ruth beschriebenen Verfahren brauchbar sind. (Die Trifluoracetyl-Schutzgruppe am Linkerstickstoff wird durch die normalerweise zur abschließenden Entschützung während der chemischen Synthese von Oligonucleotiden verwendeten basischen und/oder nucleophilen Reagenzien entfernt.) Falls der Reporter durch die in Oligonucleotidsynthesen verwendeten Reaktionen nicht angegriffen wird, kann er auch auf einer früheren Stufe an den Alkinylaminolinker gebunden sein.
  • 38: R = H 39: R = OTHP
  • Obschon die chemische Synthese von Oligoribonucleotiden gegenwärtig nicht so wirksam oder brauchbar ist, wie die Synthese von 2'-Deoxyoligonucleotiden, konnte ein geeignetes Monomer [(39), -O-Tetrahydropyranyl (OTHP)] hergestellt und zum Herstellen markierter RNA verwendet werden.
  • In noch einer weiteren Anwendung kann das enzymatische Markieren doppelsträngiger Nucleinsäuren durch die Verwendung der Alkinylaminolinker erleichtert werden. Langer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78, 6633 (1981) offenbarten ein Nick-Translationsverfahren zum Markieren doppelsträngiger DNA mit Biotinreportern. Ein Allylaminolinker wurde zum Binden von Biotin an die 5-Stellung von 2'-Deoxyuridintriphosphat und Uridintriphosphat verwendet. Die sich daraus ergebenden biotinylierten Nucleotide sind Substrate für DNA- und RNA-Polymerasen. Wahlweise konnte ein Alkinylaminolinker zur Biotinbindung oder allgemein zur Bindung anderer Reporter wie etwa fluoreszierende Farbstoffe verwendet werden. Adenosintriphosphat-Analoge (40) und (41) mit Alkinylaminolinkern konnten leichter als Adenosin-Analoge mit einem Allylaminolinker hergestellt werden. Die Nucleotidtriphosphat-Analogen von (4()) und (41) konnten zum Nick-Translationsmarkieren von DNA oder RNA durch die enzymatischen Verfahren von Langer et al. verwendet werden.
  • 40: R = H 41: R = OH
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
  • Alle Temperaturen sind in Grad Celsius (25º bezieht sich auf Umgebungs- oder Raumtemperatur). Alle Teile und Prozentangaben sind, sofern nicht anders angegeben, in Gewicht, außer bei Gemischen von Flüssigkeiten, die in Volumen sind. Die folgenden Abkürzungen werden verwendet:
  • DMF-Dimethylformamid; DMSO-Dimethylsulfoxid; NHTFA-Trifluoracetamidogruppe; TEAB-Triethylammoniumbicarbonat; Tris- Tris(hydroxymethyl)aminomethan; SF-Succinylfluorescein; NMR- Magnetisches Kernresonanzspektrum; IR-Infrarotspektrum; UV-Ultraviolettspektrum oder -nachweis; DSC-Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel; HPLC-Hochdruckflüssigkeitschromatographie; GC-Gaschromatographie; Schmp.-Schmelzpunkt; Schmp.
  • Zers.-Schmelzpunkt unter Zersetzung; Kp.-Siedepunkt. Bei der Angabe von NMR-Daten werden chemische Verschiebungen in ppm angegeben und Kopplungskonstanten (J) werden in Hertz angegeben. Alle Schmelzpunkte sind unkorrigiert. Ionenaustauschharze wurden mit geeigneten wäßrigen und organischen Lösungsmitteln vor Gebrauch gewaschen. Die Identität aller hier beschriebener Verbindungen wurde durch geeignete spektroskopische und analytische Techniken festgestellt. Solange nicht anders angegeben, wurde die Reinigung durch Chromatographie an Kieselgel, wie von Still et al., J. Org. Chem., 43, 2923-2926 (1978) beschrieben, ausgeführt.
    • BEISPIEL 1 HERSTELLUNG von 5-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2',3'-DIDEOXYCYTIDIN-5'- TRIPHOSPHAT (42)
  • (Verbindung 42 ist ein Beispiel der Struktur 6, worin Het Cytosin (i) ist und R&sub1; -CH&sub2;- ist. Es ist der unmittelbare Vorläufer für den markierten Kettenterminator 35.)
    • A. HERSTELLUNG VON N-PROPARGYLTRIFLUORACETAMID (43)
  • Propargylamin (24,79 g, 0,450 Mol; Aldrich 99%) wurde tropfenweise während 1 h Trifluoressigsäuremethylester (69,19 g, 0,540 Mol, 1,2 Äq., Aldrich) bei 0º zugetropft. Nach Rühren einer weiteren Stunde bei 0º lieferte die Destillation durch eine 15- cm-Vigreux-Säule 62,12 g (91%) des Trifluoracetamids 43 als eine farblose Flüssigkeit (Kp. 68,5-69,5º bei 11 Torr). Dieses Material war nach NMR und GC homogen und wurde wechselweise mit spektroskopisch identischem Material verwendet, das durch Acylieren von Propargylamin mit Trifluoressigsäureanhydrid hergestellt wurde.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 6,85 (breit s, 1H, NHTFA), 4,17 (dd, J = 5,6 und 2,5, 2H, CH&sub2;), 2,35 (t, J = 2,5, 1H, CH), IR (unverdünnt; cm&supmin;¹): 3300 (N-H), 3095 und 2935 (C-H), 2130 (Acetylen), 1720 (C=O), 1550 (N-H), 1430, 1365, 1160, 1040, 998, 918, 857, 829, 772 und 725.
    • B. HERSTELLUNG VON 5-IOD-2',3'-DIDEOXYCYTIDIN (44)
  • Eine Lösung von 2',3'-Dideoxycytidin (2,11 g, 10 mMol, Raylo) und Quecksilberacetat (3,35 g, 10,5 mMol, Fisher) in 50 ml Methanol wurde 19 h unter Rückfluß erhitzt. Die sich daraus ergebende weiße Suspension wurde mit Methanol (50 ml) und Dichlormethan (100 ml) verdünnt. Iod (3,05 g, 12 mMol) wurde zugesetzt und die Suspension wurde bei 25º gerührt, bis eine klare purpurfarbene Lösung vorlag. Nach 4 h wurde die freie Basenform von AG3 X4A-Harz (20 ml, 38 mÄq., Bio-Rad; ein schwach basisches Polystyrolharz) zugesetzt und Schwefelwasserstoff wurde 15 Min. in die Reaktion eingeblasen. Die völlige Fällung von Quecksilber(II) wurde durch DSC bestätigt. Die Reaktion wurde durch Filterhilfsmittel filtriert und das Filterhilfsmittel wurde mit 1 : 1 Methanol-Dichlormethan gewaschen. Das Filtrat wurde auf Kieselgel (10 g) eingedampft und das beladene Kieselgel wurde auf das obere Ende einer Säule mit 150 g Kieselgel verbracht. Die Elution mit 5%, 10% und 20% Methanol in Dichlormethan lieferte 2,79 g (83%) Iodid 44 als farblosen kristallinen Feststoff. Zwei Umkristallisationen aus siedendem Wasser lieferten nach Vakuumtrocknen bei 50º große, analytisch reine Prismen (Schmp.: Zers. 178º).
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 8,50 (s, 1H, H6), 7,73 (breit s, 1H, -NH&sub2;a), 6,53 (breit s, 1H, -NH&sub2;b), 5,86 (dd, J = 6,5 und 2,1, 1H, H1'), 5,19 (t, 1H, 5'OH), 4,04 (m, 1H, H4'), 3,75 (ddd, J = 12,1, 5,2 und 2,9, 1H, H5'a), 3,53 (dt, J = 12,1 und 3,8, 1H, H5'b) und 2,3-1,7 (m, 4H, H2' und H3'). Berechnet für C&sub9;H&sub1;&sub2;N&sub3;O&sub3;I: C 32,07%, H 3,59%, N 12,46%. Gefunden: C 32,95%, H 3,80%, N 12,46%.
    • C. EIN ALLGEMEINES VERFAHREN ZUM KUPPELN VON AMINOALKINEN AN IODNUCLEOSIDE. HERSTELLUNG VON 5-(3-TRIFLUORACETAMIDO-1-PROPI- NYL-2',3'-DIDEOXYCYTIDIN (45).
  • Ein 50-ml-Dreihalskolben wurde mit Iodcytidin 44 (770 mg, 2,00 mMol) und Kupferiodid (76,2 mg, 0,400 mMol, 0,20 Äq.; Aldrich, Gold Label) beschickt. Nach Spülen des Kolbens mit Argon wurde trockenes Dimethylformamid (10 ml, Aldrich) unter Erzeugen einer 0,2-M-Lösung von Iodcytidin zugesetzt, welche suspendiertes Kupferiodid enthielt. N-Propargyltrifluoracetamid (0,70 ml, 6,00 mMol, 3,0 Äq.) und Triethylamin (0,56 ml, 4,00 mMol, 2,0 Äq., über Molekularsieb aufbewahrt) wurden durch eine Spritze zugesetzt. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) (231 mg, 0,20 mMol, 0,10 Äq.) wurde in ein Glas in einer Trockenkammer eingewogen und dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Kupferiodid löste sich, wodurch eine gelbe Lösung geliefert wurde, die sich während mehrerer Stunden allmählich dunkel färbte. Man erlaubte der Reaktion abzulaufen, bis die DSC anzeigte, daß das Ausgangsmaterial vollständig verbraucht war. Nach 4 h wurde die Reaktion mit 20 ml Methanol-Dichlormethan 1 : 1 verdünnt und die Bicarbonatform von AG1 X8-Harz (Bio-Rad, 2,0 g, ca. 6 Äq.; ein stark basisches Anionenaustausch-Polystyrolharz) wurde zugesetzt. Nach etwa 15 Min. Rühren hörte die Gasentwicklung auf. Nach 30 Min. wurde das Reaktionsgemisch filtriert und das Harz wurde mit Dichlormethan-Methanol 1 : 1 gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden rasch mit einem Rotationsverdampf er eingeengt. (Das Entfernen von Dimethylformamid erforderte etwa 10 Min. bei 45º und 2 Torr.) Der Rückstand wurde sofort durch Chromatographie an 100 g Kieselgel mittels 10%, 15% und 20% Methanol in Dichlormethan gereinigt. Das Entfernen von Lösungsmittel aus den entsprechenden Fraktionen lieferte 651 mg (90%) des Alkinylaminonucleosids 45 als blaßgelben kristallinen Schaum, der nach DSC und NMR homogen war. Von dem Produkt aus einer ähnlichen Herstellung wurde durch Elementaranalyse festgestellt, daß es ein Hemihydrat war.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 9,96 (breit s, 1H, NHTFA), 8,32 (s, 1H, H6), 7,76 (breit s, 1H, NH&sub2;a), 6,78 (breit s, 1H, NH&sub2;b), 5,88 (dd, J = 6,5 und 2,5, 1H, H1'), 5,13 (t, J = 5,1, 1H, 5'OH), 4,28 (d, J = 5,0, 2H, -CH&sub2;-), 4,04 (m, 1H, H4'), 3,73 (ddd, J = 12,0, 5,0 und 3,1, 1H, H5'a), 3,53 (dt, J = 12,1 und 4,0, 1H, H5'b), 2,3-1,7 (m, 4H, H2' und H3'). ¹&sup9;F-NMR (DMSO-d&sub6;): -74,0 (s). UV (MeOH): Maximum bei 238,5 (17100) und 295,5 (9300). Berechnet für C&sub1;&sub4;H&sub1;&sub5;N&sub4;O&sub4;F&sub3;·½H&sub2;O: C 45,53, H 4,37, N 15,17. Gefunden: C 45,56, H 4,52, N 15,26.
    • D. HERSTELLUNG VON TRIS(TRI-N-BUTYLAMMONIUM)PYROPHOSPHAT
  • Tetranatriumpyrophosphat-decahydrat (4,46 g, 10 mMol) wurde in der Mindestmenge Wasser (etwa 50 ml) gelöst und durch eine Säule aus AG50W X8-Harz (100-200 Mesh, 4 x 10 cm Bett; ein stark saures Kationenaustausch-Polystyrolharz) geleitet, das in Wasser gegossen war. Die Säule wurde mit Wasser eluiert und das Eluat wurde in einem eisgekühlten Kolben gesammelt, bis der pH des Eluats sich dem Neutralpunkt näherte. Tri-n-butylamin (Aldrich Gold Label, 7,1 ml, 30 mMol) wurde dem Eluat zugesetzt und die zwei Phasen wurden heftig gerührt, bis alles Amin gelöst war. Die sich daraus ergebende Lösung wurde lyophilisiert. Der Rückstand wurde zweimal zusammen mit trockenem Pyridin und einmal mit trockenem Dimethylformamid eingedampft. Der Rückstand wurde in trockenem Dimethylformamid (10 ml) gelöst und die sich daraus ergebende 1,0M Lösung wurde, bis sie verwendet wurde, bei 0º unter Argon gelagert (bis zu einem Monat lang)
    • E. EIN ALLGEMEINES VERFAHREN ZUM ÜBERFÜHREN GESCHÜTZTER ALKI- NYLAMINONUCLEOSIDE IN DIE ENTSPRECHENDEN 5'-TRIPHOSPHATE UND ENTFERNEN DER TRIFLUORACETYL-SCHUTZGRUPPE. HERSTELLUNG VON 5-(3- AMINO-1-PROPINYL)-2',3'-DIDEOXYCYTIDIN-5'-TRIPHOSPHAT (42).
  • Das Alkinylaminonucleosid 45 (361 mg, 1,00 mMol) wurde in Trimethylphosphat (2,0 ml, Aldrich Gold Label) unter Rühren unter Argon in einem ofengetrockneten Kolben gelöst. Die Lösung wurde auf -10º gekühlt und Phosphoroxychlorid (0,0,93 ml, 1,00 mMol, Aldrich Gold Label) wurde durch eine Spritze zugesetzt. Nach 30 Min. Rühren des Reaktionsgemischs bei -10º wurde eine zweite aliquote Menge Phosphoroxychlorid (0,093 ml, 1,00 mMol) zugesetzt und der Lösung wurde gestattet, sich unter Rühren langsam auf 25º zu erwärmen. Aliquote Mengen aus dem Reaktionsgemisch wurden mit IN wäßrigem Hydroxid abgebrochen und durch HPLC analysiert. Wenn die Überführung in das entsprechende Nucleotidmonophosphat auf einem Höchstwert war (in diesem Fall 100 Min. nach der zweiten Phosphoroxychlorid-Zugabe) wurde das Reaktionsgemisch tropfenweise einer vorgekühlten (-10º) Lösung von Tris(tri-n-butylammoniumpyrophosphat (6,0 ml der vorstehenden 1,0 M Lösung in trockenem Dimethylformamid) zugesetzt. Man ließ die Lösung langsam unter Rühren unter Argon auf 25º erwärmen. Nach 100 Min. wurde die Reaktionslösung langsam einer vorgekühlten (0º) Lösung von Triethylamin (1,4 ml) in Wasser (20 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde unter Eiskühlen 15 Min. gerührt und anschließend über Nacht bei etwa 2º Stehenlassen.
  • Das Flüchtige wurde durch Vakuumeindampfen bei 25º und 0,5 Torr entfernt. Der Rückstand wurde erneut in Wasser (75 ml) gelöst und auf eine Säule eines DEAE-SEPHADEX-Ionenaustauschers (A-25- 120, 2,6 x 65 cm Bett) aufgebracht, der mit: 1) pH 7,6, 1,0 M wäßrigem TEAB (300 ml), 2) 1,0 M wäßrigem Kaliumbicarbonat (300 ml), und 3) pH 7,6, 0,1 M wäßrigem TEAB (300 ml) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten von pH 7,6 wäßrigen TEAB Von 0,1 M (1 l) bis 1,0 M (1 l) eluiert. Die Säule wurde bei 100 ml/h betrieben, während alle 12 Min. Fraktionen gesammelt wurden. Die Elution wurde durch die Absorption bei 270 nm (40 AUFS) überwacht. Das gewünschte Material wurde als gut getrennte Hauptbande in der Nähe des Endes des Gradienten (Fraktionen 73-80) eluiert. Die produkthaltigen Fraktionen wurden zusammengefaßt, eingeengt (unter 30º) und zweimal zusammen mit absolutem Ethanol eingedampft. Der Rückstand wurde in Wasser (20,4 ml) aufgenommen und lyophilisiert.
  • Das Zwischenprodukt wurde in Wasser (12,5 ml) aufgenommen und konzentriertes Ammoniumhydroxid (12,5 ml) wurde zugesetzt. Nach 3,5 h Rühren wurde die Lösung im Wasserstrahlvakuum 2 h gerührt, um das überschüssige Ammoniumgas zu entfernen, und anschließend lyophilisiert. Der Rückstand wurde in pH 7,6 0,1 M wäßrigen TEAB (10 ml) aufgenommen und auf eine Säule aus DEAE-SEPHADEX-Ionenaustauschharz (A-25-120, 1,6 x 55 cm Bett) aufgebracht, der wie Vorstehend beschrieben vorbereitet worden war. Die Säule wurde eluiert, während 6-ml-Fraktionen mit einem linearen TEAB-Gradienten von 0,1 M (280 ml) bis 1,0 M (280 ml) gesammelt wurden. Das Produkt wurde als einzelner Hauptpeak eluiert. Die Fraktionen, von denen angenommen wurde, daß sie reines Produkt enthalten (# 39-45) wurden zusammengefaßt, eingeengt (bei unter 30º), zusammen mit absolutem Ethanol eingedampft (2 x) und in Wasser (9,8 ml) aufgenommen. Die Lösung wurde durch UV-Absorption und HPLC bestimmt und anschließend lyophilisiert.
  • Eine verdünnte Lösung des Produkts zeigte Absorptionsmaxima bei 240 und 293,5 nm in pH 8,2 50 mM wäßrigem Tris-Puffer. Unter der Annahme eines Absorptionskoeffizienten für das Produkt, der dem des Ausgangsmaterials (9300) gleich ist, betrug die Produktausbeute, bezogen auf die Absorption bei 293,5 nm, 0,32 mMol (32%). HPLC (Zorbax SAX, 0,2 M-pH 6,5 wäßriges Kaliumphosphat, Überwachen bei 270 nm) des Endprodukts zeigte im wesentlichen einen einzelnen Peak (> 99%).
  • ¹H-NMR (D&sub2;O): 8,57 (s, 1H, H6), 6,03 (dd, J = 6,4 und 1,6, 1H, H1'), 4,42 (m, 2H, H4' und H5'a), 4,18 (ddd, J = 12, 5,5 und 3, 1H, H5'b), 4,036 (s, 2H, -CH&sub2;-), 2,5-1,9 (m, 4H, H2' und H3'), plus Peaks des Gegenions (Triethylammonium). ³¹P-NMR (D&sub2;O): -9,02 (d, J = 20, IP), -9,74 (d, J = 20, 1P), -21,37 (t, J = 20, 1P) UV (pH 8,2 wssr. Tris): Maxima bei 240 und 293,5 nm.
    • BEISPIEL 2 HERSTELLUNG VON 5-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2',3'-DIDEOXYURIDIN-5'- TRIPHOSPHAT (46).
  • (Verbindung 46 ist ein Beispiel von Struktur 6, worin Het Uracil (h) ist und R&sub1; -CH&sub2;- ist. Sie ist der unmittelbare Vorläufer für den markierten Kettenterminator 34.)
    • A. Herstellung von 5-Iod-2',3'-dideoxyuridin (47):
  • Dideoxyuridin (2,122 g, 10,0 mMol) wurde in 30 ml warmem Methanol gelöst und nach Kühlen auf 25º wurde Iodmonochlorid (4,06 g, 25 mMol, 2,5 Äq., Fisher) in Methanol (20 ml) während 5 Min. zugesetzt. Das dunkelpurpurfarbene Reaktionsgemisch wurde in einem Bad von 50º unter Stickstoff 20 Min. erhitzt und anschließend sofort in einem Eiswasserbad gekühlt. Nach 165 Min. Stehen ohne Rühren wurde der sich daraus ergebende Niederschlag durch Filtration gesammelt und mit kaltem Methanol gewaschen (2 x 10 ml). Das Vakuumtrocknen über Nacht lieferte 2,232 g (66%) Iodid 47 als schmutzigweiße Mikrokristalle. Dieses Material wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Reaktion verwendet, aber andere Herstellungen wurden durch Chromatographie oder Umkristallisation aus siedendem Methanol (30 ml/g) unter Ergeben weißer Nadeln (Schmp.: Zers. 160-164º) gereinigt. Das NMR zeigte an, daß der rohe Niederschlag homogen war, aber auch daß das 5'-Hydroxylproton aufgrund des Austausches, der durch Spurenverunreinigungen katalysiert wurde, sehr breit war. Chromatographierte oder umkristallisierte Materialien ergaben Spektren, in denen dieses Proton wie üblich ein scharfes Triplett war.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 11,60 (breit s, 1H, H3), 8,57 (s, 1H, H6), 5,90 (dd, J = 2,0 und 6,6, 1H, H1'), 5,2 (breit s, 1H, 5'OH), 4,06 (m, 1H, H4'), 3,75 und 3,53 (m, 2H, H5'), 2,26, 2,02 und 1,84 (m, 4H, H2' und H3').
    • B. HERSTELLUNG VON 5-(3-TRIFLUORACETAMIDO-1-PROPINYL)-2',3'- DIDEOXYURIDIN (48).
  • Ioduridin 47 wurde 3 h mit N-Propargyltrifluoracetamid gekuppelt, indem dem in Beispiel 1C angegebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde. Die Chromatographie mit einem Gradienten von 0-5% Methanol in Dichlormethan lieferte Material, das nach DSC homogen war, aber das schwierig zu trocknen war. Nach mehrmaligem Eindampfen des chromatographierten Produkts zusammen mit Chloroform und Vakuumtrocknen, wurden 536,5 mg Alkinylaminonucleosid 48 als weißer Schaum erhalten. Dieses Material war nach DSC homogen und war nach NMR rein, außer einer geringen Menge (39 Mol%; korrigierte Ausbeute 66%) Chloroform.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 11,61 (s, 1H, H3), 10,07 (verzerrtes t, 1H, NHTFA), 8,35 (s, 1H, H6), 7,26 (s, 0,39H, CHCl&sub3;), 5,89 (dd, J = 6,6 und 3,2, 1H, H1'), 5,15 (t, J = 5,2, 1H, 5'OH), 4,22 (breit d, 2H, -CH&sub2;N-), 4,04 (offensichtliches Hept, J = 3,5, 1H, H4'), 3,73 und 3,53 (m, 2H, H5'), 2,26, 2,03 und 1,84 (m, 4H, H2' und H3'). DSC (95 : 5 Dichlormethan-Methanol, zwei Elutionen, UV)
  • Ausgangsiodid 47, Rf = 0,37; Produkt 48, 0,28; Katalysatoren, 0,95 und 0,80 plus eine leichte Streifigkeit.
    • C. HERSTELLUNG VON 5-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2',3'-DIDEOXYURIDIN- 5'-TRIPHOSPHAT (46).
  • Das Alkinylaminonucleosid 48 (0,30 mMol) wurde in das entsprechende Triphosphat überführt und seine Trifluoracetylgruppe wurde entfernt, indem dem in Beispiel 1E angegebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde. Nach Zusatz der zweiten aliquoten Menge Phosphoroxychlorid ließ man die Phosphorylierung insgesamt 210 Min. ablaufen. Unter der Annahme eines Absorptionskoeffizienten des Produkts, der demjenigen des Ausgangsmaterials gleich ist (13000), betrug die Ausbeute an Triphosphat 46 bezogen auf seine UV-Absorption bei 291,5 nm, 18%.
    • BEISPIEL 3 (HERSTELLUNG VON 7-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2',3'-DIDEOXYGUANOSIN- 5'-TRIPHOSPHAT (49).
  • Verbindung 49 ist ein Beispiel von Struktur 6, worin Het 7- Deazaguanin (k) ist und R&sub1; -CH&sub2;- ist. Sie ist der unmittelbare Vorläufer des markierten Kettenterminators (37).
    • A. HERSTELLUNG VON 6-METHOXY-2-METHYLTHIO-9-(3,5-DI-o-p-TOLUO- YL-2-DEOXY-β-D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (9).
  • 6-Methoxy-2-methylthio-7-deazapurin (8, 9,2 g, hergestellt, indem dem Verfahren von F. Seela et al., Chem. Ber., -Bd. 111, 2925 (1978), gefolgt wurde) wurde durch Lösen in 150 ml trockenem Pyridin und Eindampfen zur Trockene bei 30-35º azeotrop getrocknet. Dieses Material wurde in 450 ml trockenem Acetonitril bei Raumtemperatur unter Stickstoff suspendiert und Natriumhydrid (2,16 g einer 60%igen Suspension in Öl) wurde unter Rühren zugesetzt. Nach 45 Min. wurde 1-Chlor-2-deoxy-3,5-di-O-p- toluoyl-α-D-ribofuranose (18,6 g, hergestellt, indem dem Verfahren von M. Hoffer, Chem. Ber., Bd. 93, 2777 (1960) gefolgt wurde) in drei gleichen Anteilen während 20 Min. zugesetzt. Nach weiteren 45 Min. Rühren des Reaktionsgemischs bei Raumtemperatur wurden Essigsäure (1 ml) und Dichlormethan (300 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde durch ein Bett aus Filterhilfsmittel saugfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Benzol gelöst und diese Lösung wurde mit Wasser (2 x) und Kochsalzlösung (1 x) gewaschen. Nach Trocknen der organischen Schicht über Natriumsulfat und Eindampfen wurde der Rückstand in Methanol (400 ml) gelöst und Kristallisieren lassen, was 19,24 g (73,8%) ribosyliertes Produkt 9 als farblose Kristalle (Schmp. 106-107º) lieferte.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,42 (s, 3H, Toluoyl-CH&sub3;), 2,44 (s, 3H, Toluoyl- CH&sub3;), 2,64 (s, 3H, SCH&sub3;), 2,70 und 2,89 (m, 2H, H2'), 4,08 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,56 (m, 1H, H3'), 4,65 (m, 2H, H5'), 5,74 (m, 1H, H4'), 6,44 (d, J = 4, 1H, H7), 6,77 (dd, J = 8 und 6, 1H, H1'), 7,05 (d, J = 4, 1H, H8) und 7,25 und 7,95 (m, 8H, Toluoyl-H).
  • Die Umkristallisation einer Probe des vorstehenden Materials aus Methanol, das eine geringe Menge Dichlormethan enthielt, lieferte Kristalle mit Schmp. 109-110º.
    • B. HERSTELLUNG VON 6-METHOXY-2-METHYLTHIO-9- (2-DEOXY-β-D- RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (10).
  • Eine Suspension von Ester 9 (19 g) und der Hydroxidform von REXYN 201-Harz (38 g; ein stark basisches Anionenaustausch-Polystyrolharz) in 600 ml Methanol wurde 1,5 h unter Stickstoff zum Rückfluß erhitzt. Die heiße Suspension wurde zum Entfernen des Harzes saugfiltriert und das Filtrat wurde zur Trockene eingedampft. Der feste Rückstand wurde in Ether (450 ml) gelöst und nach 10 Min. wurde die Lösung durch ein Bett aus Filterhilfsmittel zum Entfernen einer geringen Menge einer gefärbten Verunreinigung filtriert. Die Lösung wurde mit Kristallen des gewünschten Produkts geimpft, das aus einer vorigen Reaktion erhalten wurde, und über Nacht bei 250 stehengelassen. Kristallines Diol 10 wurde durch Filtration gesammelt und die Mutterlauge wurde zum Liefern einer zweiten Menge eingeengt. Jede Menge wurde gründlich mit Ether gewaschen und getrocknet, um insgesamt 8,43 g (78,0%) Diol 10 als farblose Kristalle (Schmp. 129-130º) zu liefern.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 2,21 und 2,55 (m, 2H, H2'), 2,56 (s, 3H, SCH&sub3;), 3,53 (m, 2H, H5'), 3,82 (m, 1H, H3'), 4,02 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,36 (m, 1H, H4¹), 4,90 (t, J = 5,5, 1H, 5'OH), 5,30 (d, J = 5,5, 1H, 3'OH), 6,48 (d, J = 4, 1H, H7), 6,55 (dd, J = 8 und 6, 1H, H1'), 7,48 (d, J = 4, 1H, H8). Die Umkristallisation einer Probe dieses Materials aus Dichlormethan, das eine geringe Menge Methanol enthielt, lieferte Kristalle mit Schmp. 130-131º.
    • C. HERSTELLUNG VON 6-METHOXY-2-METHYLTHIO-9-(5-O-TRIPHENYL- METHYL-2-DEOXY-β-D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (11).
  • Diol 10 (7,2 g) wurde durch Lösen in trockenem Pyridin und Eindampfen der Lösung zur Trockene bei 35º azeotrop getrocknet. Der Rückstand wurde in trockenem Pyridin (100 ml) gelöst und Triphenylmethylchlorid (8,0 g), Triethylamin (4,0 ml) und 4-(Dimethylamino)pyridin (300 mg) wurden zugesetzt. Nach 30 Min. Erhitzen des Reaktionsgemischs auf 650 unter Stickstoff wurde ein zweiter Zusatz von Triphenylmethylchlorid (1,0 g) durchgeführt und das Erhitzen wurde 16,5 h fortgesetzt. Nach Kühlen wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan und Wasser verteilt. Die wäßrige Schicht wurde mit Dichlormethan extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden mit 0,3 N Salzsäure, wäßrigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Einengen lieferte die Reinigung des Rohprodukts durch Chromatographie an Kieselgel mit 0%, 1%, 1,5% und 2% Methanol in Dichlormethan 12,1 g (94,5%) Monotritylether 11 als farbloses Glas.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,58 (s, 3H, SCH&sub3;), 2,42 und 2,62 (m, 2H, H2'), 3,37 (m, 2H, H5'), 4,04 (m, 1H, H3'), 4,08 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,60 (m, 1H, H4'), 6,40 (d, J = 4, 1H, H7), 6,68 (offensichtliches t, J = 7, 1H, H1'), 7,00 (d, J = 4, 1H, H8), 7,27 und 7,43 (m, 15H, Trityl-H). Diese Daten wurden aus einem anderen Ansatz von 11 erhalten, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde.
    • D. HERSTELLUNG VON 6-METHOXY-2-METHYLTHIO-9-(5-O-TRIPHENYL- METHYL-2,3-DIDEOXY-β-D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (12).
  • Eine Lösung von Tritylether 11 (12,1 g), 4-Dimethylaminopyridin (9,2 g) und Chlorthionkohlensäurephenylester (7,5 ml, Aldrich) in trockenem Dichlormethan (220 ml) wurde 2 h unter Stickstoff bei 25º gerührt. Da die DSC-Analyse anzeigte, daß die Reaktion unvollständig war, wurde Chlorthionkohlensäurephenylester (4,0 ml) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 1 weitere h gerührt. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (280 ml) verdünnt und wurde nacheinander mit 0,5 N Salzsäure (500 ml), 0-5 N Natriumhydroxid (500 ml) und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft.
  • Das sich daraus ergebende rohe Thionocarbonat wurde in trockenem Toluol (350 ml) gelöst und Azoisobisbutyronitril (350 mg) und Tri-n-butylzinnhydrid (10 ml) wurden zugesetzt. Die sich daraus ergebende Lösung wurde 10 Min. auf 100-105º erhitzt. Nach Kühlen wurde die Lösung mit wenig Ether verdünnt und mit 10%igem wäßrigem Kaliumfluorid (350 ml) geschüttelt. Die beiden Schichten wurden durch ein Bett aus Filterhilfsmittel filtriert (um einen dunklen Schlamm zu entfernen) und getrennt. Die organische Schicht wurde mit 0,75 N Kaliumhydroxid und Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Chromatographie des sich daraus ergebenden Öls an Kieselgel mit Dichlormethan-Ether 1 : 1 und anschließend mit Dichlormethan lieferte 9,93 g (84,5%) Dideoxynucleosid 12 als farblosen Feststoff (Schmp. 122-124º).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,10, 2,33 und 2,43 (m, 4H, H2' und H3'), 2,60 (s, 3H, SCH&sub3;), 3,30 (m, 2H, H5'), 4,08 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,29 (m, 1H, H4'), 6,36 (d, J = 3,7, 1H, H7), 6,53 (dd, J = 7 und 4, 1H, H1'), 7,09 (d, 1H, J = 3,7, H8), 7,25 und 7,45 (m, 15H, Trityl- H).
    • E. HERSTELLUNG VON 7-IOD-6-METHOXY-2-METHYLTHIO-9-(5-O-TRI- PHENYLMETHYL-2,3-DIDEOXY-β-D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (13).
  • N-Iodsuccinimid (10,0 g) wurde einer Lösung von Deazapurin 12 (9,9 g) in trockenem Dimethylformamid (550 ml) zugesetzt. Nach 16 h Rühren unter Stickstoff im Dunkeln wurde 10%iges wäßriges Natriumbicarbonat (2,5 ml) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum bei 50º auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Diese Lösung wurde zwischen Wasser und Essigsäureethylester verteilt. Die organische Schicht wurde mit 5%igem wäßrigem Natriumhydrosulfit und Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Chromatographie des leicht unreinen Produkts an Kieselgel mit Dichlormethan lieferte 11,68 g (95,6%) Iodid 13 als farblosen glasartigen Feststoff.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,06, 2,24 und 2,41 (m, 4H, H2' und H3'), 2,58 (s, 3H, SCH&sub3;), 3,30 (m, 2H, H5'), 4,10 (s, 3H, OCH&sub3;), 4,29 (m, 1H, H4'), 6,47 (dd, J = 6 und 4, 1H, H1'), 7,19 (s, 1H, H8), 7,30 und 7,46 (m, 15H, Trityl-H). Diese Daten wurden aus einem anderen Ansatz von 13 erhalten, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde.
    • F. HERSTELLUNG VON 7-IOD-2-METHYLTHIO-9-(5-O-TRIPHENYLMETHYL- 2,3-DIDEOXY-β-D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN-4-ON (14).
  • Natriumthiocresolat wurde durch Hinzufügen von Natriummethoxid (1 Äq.) zu einer Lösung von Thiocresol in Methanol und anschließend Eindampfen zur Trockene hergestellt. Ein Gemisch des Methylethers 13 (4,0 g), Natriumthiocresolat (4,0 g) und Hexamethylphosphoramid (10 ml) in trockenem Toluol (150 ml) wurde 4,5 h unter Stickstoff zum Rückfluß erhitzt. Nach Kühlen wurde das Gemisch zwischen Essigsäureethylester und Wasser verteilt. Die organische Schicht wurde mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Chromatographie des sich daraus ergebenden Rohprodukts an Kieselgel mit 0% und 2% Methanol in Dichlormethan lieferte 3,80 g (97%) Deazapurinon 14 als farblosen glasartigen Feststoff.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2, 05, 2,25 und 2,42 (m, 4H, H2' und H3'), 2,60 (s, 3H, SCH&sub3;), 3,30 (m, 2H, H5'), 4,28 (m, 1H, H4'), 6,40 (dd, J = 7 und 4, 1H, H1'), 7,05 (s, 1H, H8), 7,30 und 7,46 (m, 15H, Trityl-H), 10,00 (breit s, 1H, H1).
    • G. HERSTELLUNG VON 7-IOD-5'-O-TRIPHENYLMETHYL-2',3'-DIDEOXY-7- DEAZAGUANOSIN (15).
  • m-Chlorperoxybenzoesäure (1,23 g, 85%, Aldrich) wurde einer gerührten Lösung des Methylthioethers 14 (3,6 g) in trockenem Dichlormethan (150 ml) bei 0 unter Stickstoff zugesetzt. Nach 15 Minuten wurde das Kühlbad entfernt und das Rühren wurde 40 Min. bei 25º fortgesetzt. Diese Lösung wurde mit wäßrigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Methanol (zwei Volumenprozent) wurde zugesetzt und die sich daraus ergebende Lösung wurde durch eine kurze Schicht Kieselgel zum Entfernen polarer Verunreinigungen durchgeleitet. Das sich daraus ergebende rohe Sulfoxid (3,07 g) wurde in Dioxan (40 ml) gelöst und in eine mit Glas ausgekleidete Bombe verbracht. Ammoniak (10,0 g) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 2 h in einem Autoklaven auf 100º erhitzt. Die sich daraus ergebende Lösung wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (20 ml) gelöst und durch eine Schicht aus Filterhilfsmittel filtriert. Methanol (40 ml) wurde der Lösung zugesetzt und beim Kühlen kristallisierten 1,57 g farbloses Produkt. Die Mutterlauge wurde eingedampft und durch Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie an Kieselgel mit 5% Methanol in Dichlormethan gereinigt, um weitere 328 mg Produkt als farblose Kristalle zu liefern. Die Gesamtausbeute an Deazaguanosin 15 betrug 1,90 g (55,4%)
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,05, 2,23 und 2,35 (m, 4H, H2' und H3'), 3,29 (m, 2H, H5'), 4,26 (m, 1H, H4'), 5,90 (breit s, 2H, NH2), 6,24 (dd, J = 7 und 4, 1H, H1'), 6,90 (s, 1H, H8), 7,30 und 7,46 (m, 15H, Trityl-H), 10,90 (breit s, 1H, H1). Die Umkristallisation einer Probe dieses Materials aus Methanol-Dichlormethan lieferte Kristalle vom Schmp. 201-203º.
    • H. HERSTELLUNG VON 2',3'-DIDEOXY-7-IOD-7-DEAZAGUANOSIN (16):
  • Eine Lösung des Tritylethers 15 (1,7 g) in Ameisensäure (12 ml) wurde 10 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Die sich daraus ergebende gelbe Suspension wurde anschließend rasch im Vakuum bei 30º zur Trockene eingedampft. Die Chromatographie des Rückstands an Kieselgel mit 5%, 7% und 10% Methanol in Dichlormethan lieferte 940 mg eines farblosen Feststoffs. Das Anreiben dieses Feststoffs mit Ether, welcher wenig Dichlormethan enthielt, lieferte 838 mg (81,0%) Nucleosid 16 als farblose Kristalle.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 1,95, 2,09 und 2,26 (m, 4H, H2' und H3'), 3,48 und 3,54 (m, 2H, H5'), 3,98 (m, 1H, H4'), 4,90 (breit t, J = 5, 1H, 5'OH), 6,08 (m, 1H, H1'), 6,32 (breit s, 2H, NH&sub2;), 7,12 (s, 1H, H8), 10,46 (breit s, 1H, H1).
    • I. HERSTELLUNG VON 7-(3-TRIFLUORACETAMIDO-1-PROPINYL)-2',3'- DIDEOXY-7-DEAZAGUANOSIN (50).
  • Iodid 16 (376 mg, 1,00 mMol) wurde 2,25 h an N-Propargyltrifluoracetamid durch das in Beispiel 1C angegebene allgemeine Verfahren gekuppelt. Produkt und Ausgangsmaterial waren durch DSC nicht unterscheidbar, so daß die Reaktion durch Umkehrphasen- HPLC (10 cm ODS, 1 ml/Min., Gradient von 100% Wasser zu 100% Methanol während 5 Min., anschließend 100% Methanol, unter UV-Nachweis bei 280 nm: Ausgangsiodid 16, 5,49 Min.; Produkt 50 5,75 Min.; Zwischenprodukt 6,58 Min.) überwacht wurde. Das Rohprodukt war in Dichlormethan schlecht löslich, deshalb wurde es aus einer Dichlormethan-Methanol-Lösung an Kieselgel (5 g) eingeengt, bevor es auf die Chromatographiesäule geladen wurde. Die Elution mit 2%, 5%, 7% und 10% Methanol in Dichlormethan lieferte 300 mg (78%) des Alkinylaminonucleosids 50 als gelben Feststoff.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 1,96, 2,08 und 2,28 (m, 4H, H2' und H3'), 3,47 und 3,55 (m, 2H, H5'), 3,99 (m, 1H, H4'), 4,22 (breit s, 2H, -CH&sub2;-), 4,90 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 6,09 (dd, J = 6 und 4, 1H, H1'), 6,33 (breit s, 2H, NH&sub2;), 7,30 (s, 1H, H8), 10,05 (breit s, 1H, NHTFA), 10,50 (breit s, 1H, H1). ¹H-entkoppeltes ¹³C-NMR (DMSO-d&sub6;): 155,5 (q, J = 36,5, Trifluoracetylcarbonyl), 157,8, 153,1 und 149,9 (C2, C4 und C6), 122,6 (C8), 115,9 (q, J = 288, CF3), 99,4 und 97,5 (C7 und C5), 84,2 und 77,4 (acetylenisch), 83,2 und 81,0 (C1' und C4'), 62,9 (C5'), 29,7 (propargylisch), 31,8 und 25,8 (C2' und C3'). Diese ¹³C-NMR-Daten wurden aus einem anderen Ansatz von 50 erhalten, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde.
    • J. HERSTELLUNG VON 7-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2',3'-DIDEOXY-7- DEAZAGUANOSIN-5'-TRIPHOSPHAT (49).
  • Das Alkinylaminonucleosid 50 (0,90 mMol) wurde in das entsprechende 5'-Triphosphat überführt und die Trifluoracetyl-Schutzgruppe wurde anschließend entfernt, indem man dem in Beispiel 1E angegebenen allgemeinen Verfahren folgte. Nach der zweiten Phosphoroxychlorid-Zugabe wurde die Reaktion weitere 165 Min. gerührt. Unter der Annahme eines Absorptionskoeffizienten für das Produkt, der demjenigen des Ausgangsmaterials gleich ist (11900), betrug die Ausbeute an 5'-Triphosphat 49, bezogen auf seine Absorption bei 272,5 nm, 18%.
    • BEISPIEL 4 HERSTELLUNG VON 7-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2',3'-DIDEOXY-7-DEAZAADE- NOSIN-5'-TRIPHOSPHAT (51).
  • (Verbindung 51 ist ein Beispiel von Struktur 6, worin Het 7-Deazaadenin (j) ist und R&sub1; -CH&sub2;- ist. Sie ist der unmittelbare Vorläufer des markierten Kettenterminators 36.)
    • A. HERSTELLUNG VON 2'-ACETOXY-3'-BROM-5'-(2-ACETOXYISOBUTY- RYL)ADENOSIN (18).
  • 2-Acetoxyisobutyrylbromid (19,5 ml, 150 mMol, 5 Äq., hergestellt gemäß dem Verfahren von Russell et al., J. Am. Chem. Soc., 95, 4016-4030 (1973)) wurde während 15 Min. einer Suspension von Tubercidin (17, 7-Deazaadenosin, 6,66 g, 25,0 mMol, Sigma) in trockenem Acetonitril (250 ml, Aldrich) zugesetzt. Der suspendierte Feststofflöste sich in etwa 5 Min. auf und die Reaktion wurde unter Stickstoff 22 h bei 25º gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Lösung von Dikaliumhydrogenphosphat (43,55 g, 300 mMol, 6 Äq.) in Wasser (400 ml) zugesetzt. Nach 30 Min. Rühren wurde die Lösung mit Essigsäureethylester (1 x 400 ml und 2 x 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft, um 14,73 g (118%) weißen Schaum zu liefern. Dieses Material war nach DSC zu mehr als 95% ein leicht verbreiteter Fleck (mit UV-Nachweis), aber das NMR zeigte, daß ein Haupt- und wenigstens ein Nebenprodukt vorhanden war. Das NMR-Spektrum war damit im Einklang, daß das Hauptprodukt das Bromacetat 18 ist.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) für den Hauptbestandteil 18 : 8,08 (s, 1H, H2), 7,34 (d, J = 3,7, 1H, H8), 7,12 (breit s, 2H, -NH&sub2;), 6,70 (d, J = 3,7, 1H, H7), 6,32 (d, J = 3,8, 1H, H1'), 5,61 (dd, J = 2,4 und 3,8, 1H, H2'), 4,89 (dd, J = 2,4 und 4,5, 1H, H3'), 4,43 (m, 1H, H4'), 4,35 (dd, J = 12 und 4, 1H, H5'a), 4,29 (dd, J = 12 und 7, 1H, H5'b), 2,08 (s, 3H, OAc), 2,00 (s, 3H, OAc), und 1,49 (s, 6H, 2CH&sub3;).
    • B. HERSTELLUNG VON 2',3'-DIDEOXY-2',3'-DIDEHYDRO-7-DEAZAADENO- SIN (19)
  • Zink-Kupfer-Paar wurde frisch durch rasches (insgesamt verstrichene Zeit etwa 10 Min.) Waschen von Zinkstaub (20 g, Mallinckrodt) mit 1 N Salzsäure (3 x 50 ml), Wasser (2 x 50 ml), 2%igem Kupfersulfat (2 x 50 ml), Wasser (4 x 50 ml), Ethanol (3 x 50 ml) und Ether (2 x 50 ml) hergestellt. Während-jedes Waschvorgangs wurde der Zinkstaub in einem Frittentrichter solange gerührt bis er suspendiert war und die Waschflüssigkeit wurde durch Saugen entfernt, während das Aussetzen des Zinks der Luft auf einem Mindestmaß gehalten wurde. Das Paar wurde 30 Min. im Vakuum getrocknet. Das vorstehende rohe Bromacetat (14,63 g) wurde in trockenem Dimethylformamid (150 ml, Aldrich) gelöst und etwa 25 ml Lösungsmittel wurden mit einem Rotationsverdampfer entfernt (45º, 2 Torr). Frisches Zink-Kupfer-Paar (14,63 g, etwa 9 Äq.) wurde zugesetzt und die sich daraus ergebende Suspension wurde bei 25' unter Stickstoff gerührt. In Abhängigkeit von der Qualität des Zink-Kupfer-Paars kann diese Reaktion eine Induktionsperiode und/oder schwankende Geschwindigkeit zeigen, so daß man die Reaktion ablaufen ließ, bis die DSC (90 : 9 : 1 Dichlormethan-Methanol-konzentriertes Ammoniumhydroxid; Ausgangsmaterial Rf = 0,45 und Produkte Rf = 0,39 und 0,36) anzeigte, daß das Ausgangsmaterial vollständig verbraucht war. In diesem Fall war die Reaktion in weniger als 15 Min. vollständig. Nach 100 Min. wurde gesättigtes wäßriges Natriumbicarbonat (75 ml) sorgfältig während 10 Min. dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch ein Filterhilfsmittel filtriert und das Filterhilfsmittel wurde mit Methanol (2 x 50 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde zwischen Wasser (150 ml) und Essigsäureethylester (150 ml) verteilt. Die wäßrige Schicht wurde mit Essigsäureethylester (2 x 100 ml) extrahiert und die vereinigten organischen Extrakte wurden über Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und 1 h im Vakuum getrocknet.
  • Der sich daraus ergebende dunkelorangefarbene halbfeste Stoff wurde in Methanol (100 ml) gelöst und anschließend wurden Wasser (25 ml) und REXYN 201-Harz (29 g, 4,3 mÄq./g, 5 Äq., Hydroxidform) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde insgesamt 210 Min. unter Rückfluß erhitzt. Das Überwachen durch DSC (Dichlormethan- Methanol-konzentriertes Ammoniumhydroxid 85 : 13 : 2; Zwischenprodukt, Rf = 0,49; Endprodukt 19, 0,24) zeigte an, daß die Reaktion bei etwa 70% Umsatz rasch anhielt, so daß nach 165 Min. weiteres Harz (29 g) zugesetzt wurde. Ohne Kühlen wurde das Harz durch Filtration entfernt und mit Dichlormethan-Methanol 1 : 1 gewaschen (2 x 75 ml). Die vereinigten Filtrate wurden zur Trockene eingeengt und der sich daraus ergebende purpurfarbene Feststoff wurde aus siedendem Isopropanol (150 ml) umkristallisiert, um 3,778 g Olefin 19 als schmutzigweiße Nadeln (Schmp. 205-206º) zu liefern. Eine zweite Menge von 0,631 g Produkt (blaßpurpurfarbene Nadeln, Schmp. 202-203º) wurde durch Einengen der Mutterlaugen auf 25 ml erhalten. Beide Mengen (insgesamt 4,409 g, 76%) waren nach DSC homogen und nach NMR rein, außer einer Spur Isopropanol.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 8,07 (s, 1H, H2), 7,15 (d, J = 3,6, 1H, H8), 7,12 (breit s, 1H, H1'), 7,01 (breit s, 2H, NH&sub2;), 6,57 (d, J = 3,6, 1H, H7), 6,43 und 6,02 (breit d, J = 6,0, jeweils 1H, H2' und H3'), 4,95 (t, J = 6,5, 1H, 5'OH), 4,79 (m, 1H, H4'), und 3,52 (m, 2H, H5').
    • C. HERSTELLUNG VON 2',3'-DIDEOXY-7-DEAZAADENOSIN (20).
  • Eine 450-ml-Parr-Flasche wurde mit Olefin 19 (3,80 g), Ethanol (76 ml), 10% Palladium auf Kohle (380 mg, Aldrich) und 40 psi Wasserstoff beschickt. Nach 4,67 h Schütteln bei 25º waren 14,5 psi Wasserstoff absorbiert worden und die Wasserstoffaufnahme hatte aufgehört. Die DSC (zwei Elutionen mit Dichlormethan- Methanol-konzentriertem Ammoniumhydroxid 85 : 13 : 2, Ausgangsmaterial 19, 0,45; Produkt 20, 0,48) zeigte die vollständige Überführung in ein einziges UV-aktives neues Produkt. Der Katalysator wurde durch Filtration durch Filterhilfsmittel entfernt und mit Ethanol gewaschen. Das Entfernen von Lösungsmittel aus dem Filtrat und das Vakuumtrocknen über Nacht lieferte 3,98 g (104%) Dideoxynucleosid 20 als weißen Schaum. Das NMR zeigte an, daß das Produkt homogen war, außer der Anwesenheit von 8 Gew. -% Ethanol (96% korrigierte Ausbeute). Ähnliche Ansätze dieses Materials widerstanden der Kristallisation und wurden beim azeotropen Trocknen mit wasserfreien Lösungsmitteln äußerst hygroskopisch. Deshalb wurde dieses Material etwa I Woche im Vakuum gelagert und verwendet, wenn das NMR anzeigte, daß das Material 5 Gew.-% Ethanol enthielt. Das Fehlen einer Kristallinität und die spektralen Eigenschaften, die bei diesem Produkt beobachtet wurden, waren mit denjenigen im Einklang, die zuvor von Robins et al., Can. J. Chem., Bd. 55, 1259 (1977) mitgeteilt wurden.
  • ¹M-NMR (DMSO-d&sub6;) : 8,04 (s, 1H, H2), 7,33 (d, J = 3,6, 1H, H8) 6,97 (breit s, 2H, NH&sub2;), 6,56 (d, J = 3,6, 1H, H7), 6,34 (dd, J = 5,2 und 6,4, 1H, H1'), 4,96 (t, J = 5,6, 1H, 5'OH), 4,33 (t, J = 5,1, 0,43H, Ethanol-OH), 4,04 (m, 1H, H4'), 3,4-3,6 (m, 2,86H, H5' und Ethanol-CM&sub2;), 2,33, 2,21 und 2,02 (m, 4H, H2' und H3'), und 1,06 (t, J = 7,0, 1,3H, Ethanol-CH&sub3;).
    • D. HERSTELLUNG VON 7-IOD-2',3'-DIDEOXY-7-DEAZAADENOSIN (21).
  • Eine mechanisch gerührte Lösung von 95% reinem Dideoxynucleosid 20 (2,95 g, 11,96 mMol), wasserfreiem Natriumacetat (4,13 g, 50,3 mMol, 4 Äq.) und Quecksilberacetat (3,81 g, 11,95 mMol, 1,00 Äq., Fisher, 99,9%) in Wasser (190 ml) wurde 2 h unter Stickstoff auf 65 erhitzt. Nach Kühlen der sich daraus ergebenden weißen Suspension der Quecksilberverbindung auf 25º wurden Iod (4,79 g, 18,9 mMol, 1,6 Äq.) und Essigsäureethylester (190 ml) zugesetzt. Nach 1 h war die suspendierte Quecksilberverbindung verbraucht worden und eine klare purpurfarbene Lösung blieb zurück. Nach 2 h wurde Natriumsulfit (6,35 g) zugesetzt und die Purpurfärbung verschwand. Nach 30 Min. Rühren wurde Schwefelwasserstoffgas langsam 15 Min. in die Reaktion eingeblasen. Quecksilbersulfid (ein schwarzes Kolloid) und Iodid 21 (ein weißes Pulver) fielen aus der Reaktion aus. Die vollständige Fällung von Quecksilber(II) wurde durch DSC durch Beobachten des Verschwindens eines der beiden UV-aktiven Hauptflecken festgestellt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Filterhilfsmittel filtriert und in zwei Schichten getrennt. Das Filterhilfsmittel wurde mit siedendem Essigsäureethylester (9 x 100 ml) gewaschen, bis die DSC anzeigte, daß kein weiteres Produkt extrahiert wurde. Jeder Essigsäureethylesterextrakt wurde mit der wäßrigen Schicht gewaschen. Die vereinigten Essigsäureethylesterschichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der sich daraus ergebende rohe Feststoff färbte sich beim Aussetzen gegenüber Luft rot. Dieses Material wurde in Dichlormethan-Methanol 3 : 1 (100 ml) gelöst und die freie Basenform des AG3-X4A-Anionenaustauschharzes (5,0 g, BioRad, 2,9 mÄq/g trocken) wurde zugesetzt. Schwefelwasserstoff wurde 10 Min. in die rote Lösung eingeblasen und die rote Färbung wurde entfärbt. Eine leichte Trübe wurde durch kurzes Erwärmen beseitigt und die Lösung wurde rasch durch ein Bett von 2 cm (15 g) Kieselgel filtriert. Das Kieselgel wurde mit weiterem Dichlormethan-Methanol 3 : 1 (100 ml) eluiert. Kieselgel (50 g) wurde dem Filtrat zugesetzt und Schwefelwasserstoff wurde 10 Min. eingeblasen. Das Lösungsmittel wurde aus diesem Gemisch mit einem Rotationsverdampfer entfernt und das Kieselgel wurde durch gleichzeitiges Eindampfen mit Chloroform (200 ml) getrocknet
  • Dieses Kieselgel wurde rasch auf eine Kieselgelsäule (500 g) geladen, die mit einem Stickstoffstrom entgast worden war. Die Elution unter Stickstoff mit 5% (6 l) und 10% (4 l) siedendem Methanol in Dichlormethan lieferte 2,92 g (64%) Iodid 21 als weißes Pulver und 456 mg (7,5%) weniger polares 7,8-Diiod-2',3'- dideoxy-7-deazaadenosin. Die Umkristallisation des Hauptprodukts aus siedendem Essigsäureethylester (200 ml) lieferte 2,626 g weiße Nadeln (Schmp. 158-160º). Das Einengen der Mutterlaugen auf 10 ml lieferte eine zweite Menge von 0,391 g hellroter Nadeln (Schmp. 156-158º). Beide Mengen waren gemäß NMR und DSC homogen und stellten zusammen eine Gesamtausbeute von 64% Iodnucleosid 21 aus Olefin 19 dar.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;) : 8,09 (s, 1H, H2), 7,67 (s, 1H, H8), 6,65 (breit s, 2H, NH&sub2;), 6,34 (dd, J = 4,4 und 6,8, 1H, H1' ), 4,95 (t, J = 5,5, 1H, 5'OH), 4,04 (offensichtliches Mept, J = 3,5, 1H, H4'), 3,59 und 3,49 (m, 2H, H5'), 2,30, 2,28 und 2,00 (m, 4M, H2' und H3').
    • E. HERSTELLUNG VON 7- (3-TRIFLUORACETAMIDO-1-PROPINYL)-2',3'- DIDEOXY-7-DEAZAADENOSIN (52).
  • Iodid 21 (720,3 mg, 2,00 mMol) wurde 90 Min. mit N-Propargyl trifluoracetamid gekuppelt, indem dem in Beispiel 1C angegebenen Standardverfahren gefolgt wurde. Die Chromatographie mit 7% Methanol in Dichlormethan lieferte 705,8 mg (92%) Kupplungsprodukt 52 als schmutzigweißes Pulver, das gemäß NMR und DSC homogen war. Die Umkristallisation aus siedendem Essigsäureethylester (10 ml) lieferte 372 weiße Mikrokristalle (Schmp. 169-171º).
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 10,1 (verzerrtes t, 1H, NHTFA), 8,10 (s, 1H, H2), 7,78 (s, 1H, H8), 6,0-7,5 (sehr breit s, 2H, NH&sub2;), 6,34 (dd, J = 4,5 und 7,0, 1H, H1'), 4,98 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 4,31 (leicht verbreitertes s, 2H, -CH&sub2;N-), 4,10 offensichtliches Hept, J = 3,5, 1H, H4'), 3,60 und 3,40 (m, 2H, H5'), 2,37, 2,18 und 2,00 (m, 4H, H2' und H3'). DSC (Dichlormethan-Methanol-konzentriertes Ammoniumhydroxid 90 : 9 : 1; UV): Ausgangsiodid 21, Rf = 0,36; Produkt 52, 0,26).
    • F. HERSTELLUNG VON 7-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2',3'-DIDEOXY-7- DEAZAADENOSIN-5'-TRIPHOSPHAT (51).
  • Das Alkinylaminonucleosid 52 (1,00 mMol) wurde in das entsprechende 5'-Triphosphat überführt und die Trifluoracetylgruppe wurde entfernt, indem dem in Beispiel 1E beschriebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde. Nach Zusatz der zweiten aliquoten Menge Phosphoroxychlorid wurde die Lösung 120 Min. gerührt. Unter der Annahme eines Absorptionskoeffizienten für das Produkt, der demjenigen des Ausgangsmaterials gleich ist (12700), betrug die Ausbeute des Triphosphats 51, bezogen auf die Absorption bei 279,5 nm, 40%.
  • ¹H-NMR (D&sub2;O): 7,97 (s, 1H, H2), 7,80 (s, 1H, H8), 6,33 (m, 1H, H1'), 4,44 (m, 1H, H4'), 4,27 (m, 1H, H5'a), 4,14 (m, 1H, H5'b), 4,11 (breit s, 2H, -CH&sub2;-), 2,6-2,0 (m, 4H, H2' und H3'), plus Peaks des Gegenions (Triethylammonium). ³¹P-NMR (D&sub2;O: -8,59 (breit d, J = 20, 1P), -9,56 (d, J = 20, 1P) und -21,38 (m, 1P). UV (pH 8,2 wssr. Tris): Maxima bei 238 und 279,5 nm.
    • BEISPIEL 5 EINE ZWEITE HERSTELLUNG VON 7-IOD-2',3'-DIDEOXY-7-DEAZAADENOSIN (21).
  • (Verbindung 21 ist ein Zwischenprodukt, das in Beispiel 4 hergestellt und verwendet wurde.)
    • A. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-2-METHYLTHIO-9-(2-DEOXY-p-D-RIBO- FURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (23).
  • Methanol (210 ml) und konzentriertes Ammoniumhydroxid (210 ml) wurden einer Lösung von 6-Chlor-2-methylthio-9-(3,5-di-O-p- toluoyl-2-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-7-deazapurin (22, 26,8 g, hergestellt wie von Kazamierczuk et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 106, 6379 (1984) beschrieben) in Dichlormethan (210 ml) zugesetzt. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde 5 Tage bei Raumtemperatur gerührt und anschließend zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde durch Eindampfen zusammen mit Ethanol getrocknet. Das Rohprodukt wurde in Dichlormethan gelöst und beim Stehen schieden sich farblose Kristalle ab. Der Niederschlag wurde gesammelt und mit Ether gründlich gewaschen, um 14,5 g (79,1%) Diol 23 (Schmp. : Zers. 190-192º) zuliefern.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 2,26 und 2,55 (m, 2H, H2'), 2,57 (s, 3H, SCH&sub3;) 3,54 (m, 2H, H5'), 3,84 (m, 1H, H3'), 4,37 (m, 1H, H4'), 4,95 (m, 1H, OH), 5,34 (m, 1H, OH), 6,57 (m, 1H, H1'), 6,63 (m, 1H, H7), 7,80 (m, 1H, H8). Diese Daten wurden aus einem anderen Ansatz Diol 23 erhalten, das wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde.
    • B. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-2-METHYLTHIO-9-(5-O-TRIPHENYLME- THYL-2-DEOXY-β-D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (24).
  • Diol 23 (14,5 g) wurde durch Eindampfen zusammen mit Pyridin getrocknet. Triphenylmethylchlorid (16 g), 4-(Dimethylamino)pyridin (600 mg) und Triethylamin (8,0 ml) wurden einer Lösung des trockenen Diols in trockenem Pyridin (200 ml) zugesetzt. Nach 6 h Rühren des Reaktionsgemischs bei 65º unter Stickstoff wurde weiteres Triphenylmethylchlorid (2,0 g) und Triethylamin (1,0 ml) zugesetzt und das Erhitzen wurde 17 h fortgesetzt. Nach Kühlen wurde Methanol (3 ml) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan und 0,3 N Salzsäure verteilt. Die organische Schicht wurde mit wäßrigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Chromatographie des sich daraus ergebenden Rohprodukts an Kieselgel mit 1% und 1,5% Methanol in Dichlormethan lieferte 22,7 g (88,6%) Monotritylether (24) als glasartigen Feststoff.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,48 und 2,60 (m, 2H, H2'), 2,59 (s, 3H, SCH&sub3;) 3,40 (m, 2H, H5'), 4,08 (m, 1H, H3'), 4,61 (m, 1H, H4'), 6,43 (m, 1H, H7), 6,68 (m, 1H, H1'), 7,2-7,5 (m, 16H, Trityl-H und H8). Diese Daten wurden aus einem anderen Ansatz von 24 erhalten, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde.
    • C. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-2-METHYLTHIO-9-(5-O-TRIPHENYLME- THYL-2,3-DIDEOXY-β-D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (25).
  • 4-(Dimethylamino)pyridin (16,5 g) und Chlorthionkohlensäurephenylester (13,5 ml) wurden einer Lösung von Tritylether 24 in trockenem Dichlormethan (300 ml) zugesetzt. Nach 2,25 h Rühren des Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur unter Stickstoff wurde Dichlormethan (200 ml) zugesetzt. Die Lösung wurde mit 0,5 N Salzsäure (700 ml), 0,5 N Natriumhydroxid (700 ml) und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft.
  • Das sich daraus ergebende rohe Thiocarbonat wurde in trockenem Toluol (450 ml) gelöst und die Lösung wurde zu mäßigem Rückfluß erhitzt. Azoisobisbutyronitril (600 mg) und Tri-n-butylzinnhydrid (17,7 ml) wurden zugesetzt. Nach 15 Min. Rühren unter Rückfluß unter Stickstoff wurde weiteres Tri-n-butylzinnhydrid (2,0 ml) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde weitere 15 Min. zum Rückfluß erhitzt. Nach Kühlen wurde das Reaktionsgemisch mit Ether (200 ml) verdünnt und mit 10%igem wäßrigem Kaliumfluorid (500 ml), 0,75 N Kaliumhydroxid (500 ml) und Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Einengen lieferte die Chromatographie des sich daraus ergebenden Rohprodukts an Kieselgel mit Dichlormethan-Ether 2 : 1 und Dichlormethan 10,1 g Dideoxynucleosid 25. Die unreinen Fraktionen wurden vereinigt und erneut unter Ergeben von zusätzlichen 3,76 g reinem Produkt chromatographiert. Diese Produkte wurden vereinigt, um 13,9 g (63,0%) 25 als farblosen Feststoff (Schmp. 140-142,5º) zu liefern.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,11, 2,36 und 2,46 (m, 4H, H2' und H3'), 2,60 (s, 3H, SCH&sub3;), 3,33 (offensichtliches d, J = 4, 2H, H5'), 4,32 (m, 1H, H4'), 6,39 (d, J = 3,7, 1H, H7), 6,52 (dd, J = 6,7 und 3,7, 1H, H1'), 7,25 und 7,45 (m, 15H, Trityl-H), 7,32 (d, 1H, J = 3,7, H8). Diese Daten wurden aus einem anderen Ansatz von 25 erhalten, der wie vorstehend beschrieben erhalten wurde.
    • D. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-2-METHYLTHIO-9-(2',3'-DIDEOXY-β-D- RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (26).
  • Trifluoressigsäure (10 ml) wurde einer Lösung von Tritylether 25 (7,58 g) in Methanol-Dichlormethan 1 : 1 (100 ml) zugesetzt und die Lösung wurde 17 h unter Stickstoff bei 25º gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen Dichlormethan (500 ml) und wäßrigem Natriumbicarbonat verteilt und die wäßrige Schicht wurde erneut mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Chromatographie des Rückstands an Kieselgel mit 0% und 5% Methanol in Dichlormethan lieferte 4,07 g (97,1%) Nucleosid 26 als dickes farbloses Glas.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,16, 2,26 und 2,50 (m, 4H, H2' und H3'), 2,63 (s, 3H, SCH&sub3;), 2,76 (breit s, 1H, OH), 3,67 und 3,93 (m, 2H, H5'), 4,27 (m, 1H, H4'), 6,38 (dd, J = 6,7 und 5,2 Hz, 1H, H1'), 6,51 (d, J = 3,7 Hz, 1H, H7), 7,26 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H8). Diese Daten wurden aus einem anderen Ansatz von 26 erhalten, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde.
    • E. HERSTELLUNG VON 2',3'-DIDEOXY-2-METHYLTHIO-7-DEAZAADENOSIN (27).
  • Ammoniak (10 g) wurde in eine Lösung von Chlorid 26 (1,83 g) in Methanol (50 ml) in einer mit Glas ausgekleideten Bombe destilliert. Die Lösung wurde 15 h in einem Autoklaven bei 100º erhitzt. Nach Kühlen wurde das Reaktionsgemisch zu Trockene eingedampft. Die Reinigung des sich daraus ergebenden Rohprodukts an Kieselgel mit 0%, 3% und 5% Methanol in Dichlormethan lieferte 1,27 g (80,4%) Deazaadenosin 27 als farblosen Feststoff (Schmp. 184-185º).
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 2,01, 2,21 und 2,39 (m, 4H, H2' und H3'), 2,45 (s, 3H, SCH&sub3;), 3,50 (m, 2H, H5'), 4,02 (m, 1H, H4'), 4,83 (t, J = 5,5, 1H, 5'OH), 6,32 (dd, J = 7 und 4,5, 1H, H1'), 6,50 (d, J = 3,7, 1H, H7), 7,07 (breit s, 2H, NH&sub2;), 7,20 (d, 1H, J = 3,7, H8).
    • F. HERSTELLUNG VON 2',3'-DIDEOXY-7-DEAZAADENOSIN (20).
  • Ein Gemisch von 600 mg 27 und überschüssigem Raney-Nickel (Aldrich, mit Wasser und Methanol vorgewaschen) wurde unter Stickstoff zum Rückfluß erhitzt, bis die DSC das Verschwinden des Ausgangsmaterials anzeigte (6 h). Die heiße Lösung wurde durch Filterhilfsmittel filtriert und das gesammelte Raney-Nickel wurde gut mit Methanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden eingedampft, um 424 g (84,9%) 20 als farblosen glasartigen Feststoff zu liefern, der mit dem in Beispiel 4C hergestellten Material identisch war.
    • G. HERSTELLUNG VON 7-IOD-2',3'-DIDEOXY-7-DEAZAADENOSIN (21).
  • Dideoxy-7-deazaadenosin 20 wurde iodiert, indem dem in Beispiel 4D angegebenen Verfahren gefolgt wurde.
    • BEISPIEL 6 EINE DRITTE HERSTELLUNG VON 7-IOD-2',3'-DIDEOXY-7-DEAZAADENOSIN (21).
  • (Verbindung 21 ist eine Zwischenstufe, die in Beispiel 4 hergestellt und verwendet wurde.)
    • A. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-9-(2-DEOXY-β-D-RIBOFURANOSYL)-7- DEAZAPURIN (29).
  • Eine Lösung von konzentriertem Ammoniumhydroxid (100 ml) in Methanol (175 ml) wurde einer Lösung von 6-Chlor-9-(3,5-di-O-p- toluoyl-2-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-7-deazapurin (28, 10,0 g; hergestellt wie durch Z. Kazimierczuk et al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 106, 6379 (1984) beschrieben) in Dichlormethan (100 ml) zugesetzt. Nach 24 h Rühren des sich daraus ergebenden Gemisches bei 25º wurde weiteres konzentriertes Ammoniumhydroxid (50 ml) zugesetzt. Nach Rühren über insgesamt 5 Tage wurde das Reaktionsgemisch zur Trockene eingedampft und das Rohprodukt wurde mit Ethanol zusammen eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und das gewünschte Produkt kristallisierte. Filtration und Trocknen lieferten 4,90 g (92%) Nucleosid 29 als farblose Kristalle (Schmp. 155,5-158,5º).
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 2,30 und 2,55 (m, 2H, H2'), 3,58 (m, 2H, H5'), 3,85 (m, 1H, H3'), 4,40 (m, 1H, H4'), 4,97 (m, 1H, OH), 5,35 (m, 1H, OH), 6,65 (m, 1H, H1'), 6,75 (d, 1H, H7), 8,00 (m, 1H, H8), 8,65 (s, 1H, H2). Diese Daten wurden aus einem anderen Ansatz von 29 erhalten, der wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde.
    • B. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-9-(5-O-TRIPHENYLMETHYL-2-DEOXY-β-D- RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (30).
  • Nucleosid 29 (2,5 g) wurde durch Eindampfen zusammen mit trockenem Pyridin getrocknet. Der Rückstand wurde erneut in trockenem Pyridin (40 ml) gelöst und Triphenylmethylchlorid (2,5 g), 4- (Dimethylamino)pyridin (120 mg) und Triethylamin (1,6 ml) wurden zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 4 h unter Stickstoff bei 65 gerührt. Weiteres Triphenylmethylchlorid (1,0 g) und Triethylamin (0,6 ml) wurden zugesetzt und die Reaktion wurde 18 h bei 75º gerührt. Nach Kühlen wurde Methanol (2 ml) zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde zwischen Dichlormethan und 0,5 N Salzsäure verteilt. Die organische Schicht wurde mit wäßrigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Chromatographie an Kieselgel mit 0%, 1,5% und 3% Methanol in Dichlormethan lieferte 2,26 g (48%) Tritylether 30 als glasartigen Feststoff.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,46 und 2,65 (m, 2H, H2'), 3,40 (m, 2H, H5'), 4,10 (m, 1H, H3'), 4,65 (m, 1H, H4'), 6,55 (d, 1H, H7), 6,72 (m, 1H, H1'), 7,2-7,5 (m, 16H, Trityl-H und H8) und 8,60 (s, 1H, H2).
    • C. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-9-(5-O-TRIPHENYLMETHYL-2-DEOXY-3- THIONCARBOPHENOXY-p-D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (30a).
  • 4-(Dimethylamino)pyridin (1,35 g) und Chlorthionkohlensäurephenylester (1,20 ml) wurden einer Lösung des Tritylesters 30 in trockenem Dichlormethan (30 ml) zugesetzt. Nach 2 h Rühren des Reaktionsgemisches unter Stickstoff bei 25º wurde weiteres Dichlormethan (20 ml) zugesetzt und die Lösung wurde mit 0,5 N Salzsäure, 0,5 N Natriumhydroxid und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Das Anreiben des Rückstands mit Dichlormethan-Ether lieferte 1,53 g (76%) Thiocarbonat 30a als farblose Kristalle (Schmp. 186,5-188,5º).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,85 und 3,00 (m, 2H, H2'), 3,55 (m, 2H, H5'), 4,50 (m, 1H, H4'), 6,00 (m, 1H, H3'), 6,60 (d, 1H, H7), 6,85 (m, 1H, H1'), 7,1-7,5 (m, 20H, Trityl- und Phenyl-H), 7,50 (d, 1H, H8) und 8,6-0 (s, 1H, H2).
    • D. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-9-(5-O-TRIPHENYLMETHYL-2,3-DIDEOXY- p-D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (31).
  • Eine Lösung von Thiocarbonat 30a (1,2 g), Azoisobisbutyronitril (50 mg) und Tri-n-butylzinnhydrid (0,60 ml) in trockenem Toluol (50 ml) wurde 15 Min. auf 110º erhitzt. Nach Kühlen wurde das Reaktionsgemisch mit 50 ml Ether verdünnt und mit 10%igem wäßrigem Kaliumfluorid (50 ml) und Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Die Chromatographie des sich daraus ergebenden Rohprodukts an Kieselgel mit 0% und 1,5% Methanol in Dichlormethan lieferte 0,84 g (92%) Dideoxynucleosid 31 als farblosen Feststoff (Schmp. 60-63,5º).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,11, 2,36 und 2,50 (m, 4H, H2' und H3'), 3,37 (m, 2H, H5'), 4,35 (m, 1H, H4'), 6,50 (d, J = 3,7, 1H, H7), 6,58 (dd, 1H, H1'), 7,25 und 7,45 (m, 15H, Trityl-H), 7,55 (d, 1H, J = 3,7, H8) und 8,60 (s, 1H, H2).
    • E. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-9-(2,3-DIDEOXY-β-D-RIBOFURANOSYL)- 7-DEAZAPURIN (31a).
  • Trifluoressigsäure (1,5 ml) wurde einer Lösung von Tritylether 31 (700 mg) in Methanol-Dichlormethan 1 : 1 (20 ml) zugesetzt. Nach 17 h Rühren unter Stickstoff bei 25º wurde Natriumbicarbonat (1,5 g) zugesetzt und das Gemisch wurde 30 Min. gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und zur Trockene eingedampft. Die Chromatographie des sich daraus ergebenden Rohprodukts an Kieselgel mit 0% und 2% Methanol in Dichlormethan lieferte 300 mg (84%) Alkohol 31a als farbloses Glas.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,20, 2,40 und 2,65 (m, 4H, H2' und H3'), 3,65 und 4,00 (m, 2H, H5'), 3,95 (breit s, 1H, OH), 4,35 (m, 1H, H4'), 6,28 (dd, 1H, H1'), 6,62 (d, J = 4, 1H, H7), 7,40 (d, 1H, J = 4, H8) und 8,65 (s, 1H, H2).
    • F. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-9-(5-ACETOXY-2,3-DIDEOXY-β-D-RIBO- FURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (32).
  • Acetanhydrid (2,0 mMol) wurde einer Lösung von Alkohol 31a (284 mg) in trockenem Pyridin (10 ml) zugesetzt. Nach 1,25 h Rühren der Lösung bei 25º wurde Methanol (10 ml) zugesetzt. Nach weiteren 30 Min. Rühren wurde das Reaktionsgemisch zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan gelöst und diese Lösung wurde mit 1 N Salzsäure (2 x) und Kochsalzlösung (1 x) gewaschen. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft, um 295 mg (89%) rohes Acetat 32 als farbloses Glas zu liefern.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,07 (s, 3H, Acetyl), 2,20, 2,45 und 2,55 (m, 4H, H2' und H3'), 4,25 und 4,35 (m, 2H, H5'), 4,40 (m, 1H, H4'), 6,55 (dd, 1H, H1'), 6,65 (d, 1H, H7), 7,50 (d, 1H, H8) und 8,60 (s, 1H, H2).
    • G. HERSTELLUNG VON 6-CHLOR-7-IOD-9-(5-O-ACETYL-2,3-DIDEOXY-β- D-RIBOFURANOSYL)-7-DEAZAPURIN (33).
  • Eine Lösung von Iodmonochlorid (340 mg) in Dichlormethan (etwa 1 ml) wurde einer Lösung von Acetat 32 (200 mg) in trockenem Dichlormethan (20 ml) zugesetzt. Nach 3 h Rühren bei 25º wurde das Reaktionsgemisch zwischen Dichlormethan und wäßrigem Natriumhydrosulfit verteilt. Die organische Schicht wurde mit wäßrigem Natriumbicarbonat und Kochsalzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde mit Dichlormethan-Ether angerieben, um 135 mg (47%) farblose Kristalle (Schmp. 132,5-134º) zu liefern.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,10, 2,40 und 2,55 (m, 4H, H2' und H3'), 2,17 (s, 3H, COCH&sub3;), 4,27 und 4,37 (m, 2H, H5'), 4,40 (m, 1H, H4'), 6,55 (dd, 1H, H1'), 7,72 (s, 1H, H8) und 8,60 (s, 1H, H2).
    • H. HERSTELLUNG VON 7-IOD-2',3'-DIDEOXY-7-DEAZAADENOSIN (21).
  • Ammoniak (4 g) wurde einer Lösung von 125 mg Chlorid 33 in Methanol (20 ml) in einer mit Glas ausgekleideten Bombe zugesetzt. Die Bombe wurde in einem Autoklaven 3 h auf 100º erhitzt. Nach Kühlen wurde das Reaktionsgemisch zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in heißem Essigsäureethylester gelöst und die heiße Lösung wurde durch eine Schicht aus Filterhilfsmittel filtriert. Nach Eindampfen des Filtrats zur Trockene wurde der Rückstand mit Ether angerieben, um 85 mg leicht unreines Produkt 21 als farblose Kristalle zu liefern. Die weitere Reinigung dieses Materials durch präparative DSC an Kieselgel mit 5% Methanol in Dichlormethan lieferte 67 mg (63%) Iodid 21 als farblosen Feststoff. Dieses Material war mit dem in Beispiel 4D hergestellten identisch.
    • BEISPIEL 7 HERSTELLUNG VON 7-IOD-2',3'-DIDEOXY-7-DEAZAINOSIN (53)
  • (Verbindung 53 ist ein Beispiel von Struktur 4, worin Met 7- Deazahypoxanthin (1) ist.)
  • Wasser (18 ml) wurde tropfenweise einer Suspension von Deazaadenosin 21 (720,3 mg, 2,00 mMol) in Eisessig (2,0 ml) unter Argon unter Herstellen einer klaren Lösung zugesetzt. Festes Natriumnitrit (1,38 g, 20,0 mMol, 10 Äq.) wurde durch einen Argonstrom in kleinen Anteilen während 10 Min. zugesetzt. Das sich daraus ergebende trübe Reaktionsgemisch wurde mechanisch unter Argon gerührt und ein gummiartiger Niederschlag bildete sich allmählich. Nach 18 h wurde die Reaktion filtriert und der Niederschlag wurde gründlich mit Essigsäureethylester (100 ml) und Wasser (etwa 10 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden verteilt und die wäßrige Schicht wurde mit Essigsäureethylester (2 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Gemäß DSC bestanden sowohl der Niederschlag als auch die Essigsäureethylesterextrakte aus Produkt 53 und waren mit weniger als 5% unumgesetztem 21 verunreinigt. Beide Mengen Produkt wurden in Methanol-Dichlormethan 1 : 1 gelöst, vereinigt und auf Kieselgel (7 g) eingedampft. Das Kieselgel wurde zusammen mit Chloroform (50 ml) eingedampft und auf eine Kieselgelsäule (50 g) aufgebracht. Die Elution mit 8% Methanol in Dichlormethan lieferte 558,3 mg (78%) Deazainosin 53 als blaßgelben Feststoff. Zwei Mengen weißer Nadeln wurden durch Umkristallisieren dieses Materials aus siedendem Isopropanol erhalten. Diese Nadeln zeigten einen Schmelzpunkt unter Zersetzung, welcher zwischen 200º und 210º schwankte. Die chromatographierten und umkristallisierten Produkte waren nach DSC und NMR homogen, außer der Anwesenheit von Isopropanol (5 Mol%).
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 12,04 (breit s, 1H, H1), 7,93 (s, 1H, H2), 7,56 (s, 1H, H8), 6,29 (dd, J = 4,0 und 6,8, 1H, H1'), 4,94 (t, J = 5,0, 1H, 5'OH), 4,04 (offensichtliches Hept, J = 3,5, 1H, H4'), 2,36, 2,18 und 1,99 (m, 4H, H2' und H3').
    • BEISPIEL 8 HERSTELLUNG VON 5-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2'-DEOXYCYTIDIN-5'-TRI- PHOSPHAT (54).
  • (Verbindung M) ist ein Beispiel eines Alkinylaminonucleotids worin R&sub1; -CH&sub2;- ist, Het Cytosin (i) ist, R&sub2;, R&sub3;, R&sub7; und R&sub8; H sind, R&sub6; OH ist und R&sub5; P&sub3;O&sub9;H³- ist.)
    • A. HERSTELLUNG VON 5-IOD-2'-DEOXYCYTIDIN (55).
  • Eine Lösung von 2'-Deoxycytidinmonohydrat (1,226 g, 5,00 mMol, Aldrich) und Queckersilberacetat (1,753 g, 5,5 mMol, 1,1 Äq., Fisher) in Methanol (20 ml) wurde 14,5 h unter Rückfluß erhitzt. Die sich daraus ergebende weiße Suspension wurde mit Methanol (30 ml) und Dichlormethan (50 ml) verdünnt und anschließend wurde Iod (1,522 g, 6,00 mMol, 1,2 Äq.) zugesetzt. Nach 60 Min. Rühren hatte sich die daraus ergebende purpurfarbene Lösung entfärbt und unumgesetzte Quecksilberverbindung war immer noch als weiße Suspension sichtbar. Nach 100 Min. und 240 Min. wurden weitere Iod-Zusätze (0,381 g, 1,5 mMol, 0,3 Äq. beziehungsweise 0,122 g, 0,50 mMol, 0,1 Äq.) durchgeführt. Nach insgesamt 5 h war die Reaktion kristallklar und purpurfarben. AG3-X4A-Harz in freier Basenform (5,17 g, 2,9 mÄq./g, 3 Äq., Bio-Rad) wurde zugesetzt und anschließend wurde Schwefelwasserstoff 5 Min. in das Reaktionsgemisch eingeblasen. Die völlige Fällung von Quecksilber(II) wurde durch DSC bestätigt. Die Reaktion wurde durch Filterhilfsmittel filtriert und das Filterhilfsmittel wurde mit Methanol-Dichlormethan 1 : 1 gewaschen. Kieselgel (5 g) wurde den vereinigten Filtraten zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde zur Trockene eingedampft. Das Kieselgel wurde zusammen mit Chloroform (50 ml) eingedampft und auf eine Kieselgelsäule (50 g) aufgebracht. Die Elution mit 15%, 20% und 30% Methanol in Dichlormethan lieferte 1,378 g (78%) Iodcytidin 55 als weißes Pulver. Die Umkristallisation aus siedendem Methanol (35 ml) lieferte nach Vakuumtrocknen über Nacht 0,953 g weiße Nadeln (Schmp. 179-180º). Einengen der Mutterlaugen auf 10 ml lieferte eine zweite Menge von 0,140 g blaßgelben Nadeln (Schmp. 172-174º). Mit Ausnahme einer Spur Methanol waren beide Mengen (Gesamtausbeute 62%) gemäß DSC und NMR homogen.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 8,28 (s, 1H, H6), 7,8 und 6,6 (breit s, 2H, NH&sub2;), 6,08 (t, J = 6,3, 1H, H1'), 5,20 (d, J-4 1H, 3'OH), 4,90 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 4,20 (m, 1H, H4'), 3,77 (verzerrtes q, 1H, H3'), 3,60 und 3,54 (m, 1H, H5'), 2,12 und 1,98 (m, 1H, H2'). DSC (Dichlormethan-Methanol-konzentriertes Ammoniumhydroxid 75 : 20 : 5; UV): Ausgangsmaterial, Rf = 0,15; Produkt 55, 0,33; Quecksilber(II), 0,54.
    • B. HERSTELLUNG VON 5-(3-TRIFLUORACETAMIDO-1-PROPINYL-2'-DEOXY- CYTIDIN (56).
  • Iodid 55 (353,1 mg, 1,00 mMol) wurde 4 h mit N-Propargyltrifluoracetamid gekuppelt, indem dem in Beispiel 1C angegebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde. Die Chromatographie des Rohprodukts mit einem Gradienten von 0-20% Methanol in Dichlormethan lieferte 3,84 g (102%) weißes Pulver nach Vakuumtrocknen über Nacht. Dieses Material war nach DSC homogen, aber hielt hartnäckig Lösungsmittel zurück. Die Umkristallisation dieses Pulvers aus siedendem Isopropanol (10 ml) und Kühlen auf -20º lieferte 299,6 mg (74%) Alkinylaminonucleosid 56 als weiße Nadeln (Schmp. 168-170º). Das NMR zeigte, daß das umkristallisierte Produkt homogen war und daß die Kristalle 0,5 Moleküle Isopropanol je Molekül Produkt 56 enthielten.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 9,96 (breit s, 1H, NHTFA), 8,15 (s, 1H, H6) 7,83 und 6,86 (breit s, 2H, NH&sub2;), 6,10 (t, J = 6,5, 1H, H1'), 5,21 (d, J = 4,5, 1H, 3'OH), 5,06 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 4,35 (d, J = 4, 0,5H, Isopropanol-OH), 4,28 (breit s, 2H, -CH&sub2;N-), 4,20 (offensichtliches Hex, J = 3,5, 1H, H4'), 3,79 (m, 1,5H, H3' und Isopropanol-CH), 3,56 (m, 2H, H5'), 2,13 und 1,97 (m, 1H, H2') und 1,04 (d, J = 6, 3H, Isopropanol-CH&sub3;). DSC (Dichlormethan- Methanol-konzentriertes Ammoniumhydroxid 85 : 13 : 2, zwei Elutionen; UV): Ausgangsiodid ins, Rf = 0,31; Produkt 56 0,27.
    • C. HERSTELLUNG VON 5-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2'-DEOXYCYTIDIN-5'- TRIPHOSPHAT (54).
  • Alkinylaminonucleosid 56 (0,275 mMol) wurde in das entsprechende 5'-Triphosphat überführt und seine Trifluoracetylgruppe wurde entfernt, indem dem in Beispiel 1E angegebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde. Nach Zusatz der zweiten aliquoten Menge Phosphoroxychlorid ließ man die Phosphorylierung 3,5 h ablaufen. Unter der Annahme eines Absorptionskoeffizienten für das Produkt, der demjenigen des Ausgangsmaterials gleich ist (8780), betrug die Ausbeute des Triphosphats 54, bezogen auf seine UV-Absorption bei 293 nm, 17%.
    • BEISPIEL 9 HERSTELLUNGVON 5-(3-(TRIFLUORACETAMIDO-1-PROPINYL)-2'-DEOXYURI- DIN (57).
  • (Verbindung 57 ist ein Beispiel eines Alkinylaminonucleotids (1), worin R&sub1; -CH&sub2;- ist, R&sub2; COCF&sub3; ist, Het Uracil (h) ist, R&sub3;, R&sub5;, R&sub7; und R&sub8; H sind und R&sub6; OH ist.)
  • 5-Iod-2'-deoxyuridin (7,08 g, 20,0 mMol, Aldrich) wurde 4 h mit N-Trifluoracetylpropargylamin gekuppelt, indem dem in Beispiel 1C angegebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde, außer daß die Reaktion 2,5 Mal konzentrierter als üblich durchgeführt wurde. Die Chromatographie des Rohprodukts an Kieselgel (500 g) mit 10-20% Methanol in Dichlormethan lieferte 3,50 g (46%) Alkinylaminonucleosid 57 als lohfarbenen Feststoff. Gemäß NMR und DSC war dieses Material > 95% rein, außer der Anwesenheit von Methanol (etwa 50 Mol%), welches durch Vakuumtrocknen nicht entfernt wurde.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 11,63 (s, 1H, H3), 10,06 (verzerrtes t, 1H, NHTFA), 8,19 (s, 1H, H6), 6,10 (offensichtliches t, 1H, H1'), 5,23 (d, J = 4, 1H, 3'OH), 5,07 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 4,23 (m, 3H, -CH&sub2;- und H4'), 3,8 (offensichtliches q, J = 4, 1H, H3'), 3,58 (m, 2H, H5') und 2,12 (m, 2H, H2').
    • BEISPIEL 10 HERSTELLUNG VON 5-(5-TRIFLUORACETAMIDO-1-PENTINYL)-2',3'-DIDE- OXYURIDIN (58).
  • (Verbindung 58 ist ein Beispiel von Struktur 5, worin Het Uracil (h) ist und R&sub1; -(CH&sub2;)&sub3;- ist.)
    • A. HERSTELLUNG VON 5-TRIFLUORACETAMIDO-1-PENTIN (59)
  • Natriumhydrid (60%ige Dispersion in Öl, Alfa) wurde durch gründliches und rasches Waschen mit Pentan und anschließendes Vakuumtrocknen ölfrei gemacht. Ölfreies Natriumhydrid (4,40 g, 0,110 Mol, 1,1 Äq.) wurde in etwa 20 Portionen während 25 Min. einer Lösung von 5-Chlorpentin (10,6 ml, 0,100 Mol, 1,0 Äq.), Trifluoracetamid (14,13 g, 0,125 Mol, 1,25 Äq.) und Natriumiodid (14,99 g, 0,100 Mol, 1,0 Äq.) in trockenem Dimethylformamid (250 ml, Aldrich) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 4,5 h bei 25º und 21 h bei 60º gerührt. Nach Kühlen wurde das Reaktionsgemisch einer Lösung von Kaliumdihydrogenphosphat (43,5 g, 0,250 Mol, 2,0 Äq.) in Wasser (500 ml) zugesetzt. Diese Lösung wurde mit Pentan (2 x 500 ml) und Ether (3 x 500 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen (1 x 100 ml), über Magnesiumsulfat getrocknet und mit einem Rotationsverdampfer eingeengt. Die zweimalige fraktionierende Destillation über eine 20-cm-Vigreux-Kolonne lieferte 8,09 g (45%) 5-Trifluoracetamido-1-pentin (58) als farblose bewegliche Flüssigkeit (Sp. 68-69º bei 13 Torr.)
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 6,77 (breit s, 1H, NHTFA), 3,53 (q, J = 6,7 und 2,7, 2H, -CH&sub2;-NHTFA), 2,31 (td, J = 6,7 und 2,7, 2H, HCCCH&sub2;-), 2,04 (t, J = 2,7, 1H, HCCCH&sub2;-) und 1,83 (Quintett, J = 6,7, 2H, - CH2CH2CH2-).
    • =B. HERSTELLUNG VON 5-(5-TRIFLUORACETAMIDO-1-PENTINYL)-2',3,- DIDEOXYURIDIN (58).
  • 5-Trifluoracetamido-1-pentin (59) wurde 4 h mit 5-Iod-2',3'- dideoxyuridin (47, hergestellt wie in Beispiel 2A beschrieben) gemäß dem in Beispiel 1C beschriebenen allgemeinen Verfahren gekuppelt. Die Chromatographie an Kieselgel (100 g) mit einem Gradienten von 0-5% Methanol in Dichlormethan lieferte 647,7 mg Alkinylaminonucleosid 58 als hellohfarbenen Schaum. Dieses Material war nach DSC und NMR homogen, außer der Anwesenheit von etwa 16 Mol% Dimethylformamid. Auf die Anwesenheit von Dimethylformamid korrigiert, betrug die Ausbeute des gewünschten Produkts 80%.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 11,52 (s, 1H, H3), 9,47 (verzerrtes t, 1H, NHTFA), 5,90 (q, 1H, H1'), 5,12 (t, 1H, 5'OH), 4,04 (m, 1H, H4'), 3,71 und 3,52 (m, 2H, 5'H), 3,30 (m, 2H, -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;NHTFA), 2,40 (t, 2H, -CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;NHTFA), 2,23, 2,01 und 1,85 (m, 4H, H2' und H3') und 1,73 (Quintett, 2H, -CH2CH2CH2NHTFA).
    • BEISPIEL 11 HERSTELLUNG VON 5- (12-TRIFLUORACETAMIDO-1-DODECINYL-2',3'-DIDE- OXYURIDIN (60).
  • (Verbindung 60 ist ein Beispiel von Struktur 5, worin Het Uracil (h) ist und R&sub1; -(CH&sub2;)&sub1;&sub0;- ist.)
    • A. HERSTELLUNG VON 11-DODECIN-1-OL (61).
  • 1-Brom-10-tetrahydropyranyloxydecan (64,26 g, 0,200 Mol, Lancaster, "97+%") wurde während 140 Min. tropfenweise einer vorgekühlten Suspension von Lithiumacetylid-Ethylendiamin-Komplex (23,94 g, 0,260 Mol, 1,3 Äq., Aldrich, 90%) in trockenem Dimethylsulfoxid (100 ml) so zugetropft, daß die Innentemperatur bei 5-10º blieb. Nachdem die Zugabe vollständig war, wurde das Kühlbad entfernt und das Reaktionsgemisch wurde 4,5 h gerührt. Wasser (20 ml) wurde dem Reaktionsgemisch tropfenweise zugesetzt. Nach 10 Min. Rühren wurde das Reaktionsgemisch in Wasser (300 ml) gegossen. Diese Lösung wurde nacheinander mit Pentan (2 x 300 ml) und Ether (2 x 300 ml) extrahiert. Jede organische Schicht wurde einzeln mit Wasser (etwa 20 ml) gewaschen und die wäßrigen Waschflüssigkeiten wurden mit der wäßrigen Hauptschicht zur Rückextraktion vereinigt. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft, um 51,38 g (96%) rohes 12-(Tetrahydropyranyloxy)-1- dodecin als Öl zu liefern.
  • Ein stark saures Ionenaustauschharz (AG-50W-X8, 50 g, 5,1 mÄq.-/g, Bio-Rad) wurde einer Lösung des vorstehenden Rohprodukts (49,96 g) in einem Gemisch aus Chloroform (260 ml) und Methanol (260 ml) zugesetzt. Die Suspension wurde 4,5 h zum Rückfluß erhitzt und anschließend abgekühlt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat wurde eingeengt. Die Chromatographie des Rückstands an Kieselgel (500 g) mit 10%, 20% und 30% Essigsäureethylester in Hexan lieferte 31 g eines Öls, das nach DSC mit Nachweis durch Phosphomolybdänsäure > 95% ein Fleck war. Die Destillation dieses Materials über eine 20-cm-Vigreux-Kolonne lieferte nach 0,78 g Vorlauf 17,91 g 11-Dodecin-1-ol (61) als dickes farbloses Öl (Sp. 104-108 bei 1,4 Torr), das sich beim Stehen zu einem weißen Feststoff verfestigte. Dieses Material war nach GC zu 98% ein Peak.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;) des chromatographierten Produkts vor der Destillation: 3,64 (t, 2H, -CH&sub2;OH), 3,37 und 3,33 (m, etwa 0,2H, Verunreinigung), 2,17 (td, 2H, HCCCH&sub2;-), 1,92 (t, 1H, HCCCH&sub2;-) und 1,2-1,6 (m, 17H, (CH&sub2;)&sub8; und OH). IR (dünner Schmelzfilm): 3392 (O-H), 3311, 2930 und 2854 (C-H), 2160 (Acetylen), 1466, 1432, 1394, 1371, 1352, 1328, 1303, 1103 und 1001.
    • B. HERSTELLUNG VON 12-IOD-1-DODECIN (62).
  • Iod (43,16 g, 170 mMol, 2,0 Äq.) wurde einer Suspension des destillierten Alkohols 61 (15,50 g, 85 mMol), Imidazol (17,36 g, 255 mMol, 3,0 Äq.) und Triphenylphosphin (66,90 g, 255 mMol, 3,0 Äq.) in trockenem Toluol (425 ml, über Molekularsieb aufbewahrt) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 25 Min. unter heftigem Rühren zum Rückfluß erhitzt, was eine gelbe Lösung mit einem öligen schwarzen Niederschlag erzeugte. Nach Kühlen auf 250 wurde gesättigtes wäßriges Natriumbicarbonat (200 ml) und Iod (23,73 g, 93,5 mMol, 1,1 Äq.) zugesetzt und die Reaktion wurde 1 h heftig gerührt. Gesättigtes wäßriges Natriumsulfit (40 ml) wurde zugesetzt, was die Purpurfarbe auslöschte. Man ließ das Reaktionsgemisch sich in zwei Schichten trennen und die organische Schicht wurde mit Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) gelöst und Ether (200 ml) wurde zugesetzt. Nach 30 Min. Stehen wurde der sich daraus ergebende Niederschlag (Triphenylphosphinoxid) durch Filtration entfernt und mit Ether gewaschen (100 ml). Beim weiteren Stehen schieden die vereinigte Mutterlauge und die Ether-Waschflüssigkeit eine zweite Menge Kristalle aus, die wie zuvor entfernt wurden. Die vereinigten Mutterlaugen und Ether-Waschflüssigkeiten wurden eingeengt und in warmem Toluol (200 ml) gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Kieselgelsäule (500 g) aufgebracht und mit Toluol (3 l) eluiert, um 13,55 g (55%) Iodid 62 als blaßgelbe bewegliche Flüssigkeit zu liefern. Dieses Material war nach GC zu 96% ein Peak.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 3,20 (t, 2H, -CH&sub2;I), 2,17 (td, 2H, HCCCH&sub2;-), 1,94 (t, 1H, HCCCH&sub2;-), 1,82, 1,51 und 1,20-1,42 (m, 16H, (CH&sub2;)&sub8;).
    • C. HERSTELLUNG VON 12-TRIFLUORACETAMIDO-1-DODECIN (63).
  • Natriumhydrid (60%ige Dispersion in Öl, Alfa) wurde durch rasches und gründliches Waschen mit Pentan und Vakuumtrocknen ölfrei gemacht. Trifluoracetamid (22,61 g, 200 mMol, 5 Äq.) wurde in etwa 10 Portionen während 50 Min. einer Suspension von ölfreiem Natriumhydrid (3,84 g, 160 mMol, 4 Äq.) in trockenem Dimethylformamid (90 ml, Aldrich) zugesetzt. Wenn zu Anfang dieser Zugabe festgestellt wurde, daß das Reaktionsgemisch warm wurde, wurde ein Eiswasserbad hinzugesetzt und der Rest der Zugabe wurde bei einer Innentemperatur von etwa 10º ausgeführt. Das Eiswasserbad wurde entfernt und das Reaktionsgemisch wurde gerührt, bis die Wasserstoffentwicklung aufhörte. Nach weiteren 15 Min. Rühren wurde eine Lösung von Iodid 63 (11,69 g, 40,0 mMol) in trockenem Dimethylformamid (10 ml) während 10 Min. tropfenweise dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Nach 4 h Rühren bei 25º wurde das Reaktionsgemisch rasch in ein gerührtes Gemisch aus gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid (200 ml), Wasser (200 ml) und Pentan (200 ml) zugesetzt. Das Reaktionsgefäß wurde mit einem Gemisch aus Wasser (50 ml), gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid (50 ml) und Pentan (200 ml) gewaschen. Man ließ die vereinigten Lösungen sich in zwei Schichten trennen und die wäßrige Schicht wurde mit Pentan (2 x 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft, um 10,42 g (94%) Trifluoracetamid 63 als Öl zu liefern, das beim Stehen zu einem wachsartigen Feststoff verfestigte.
  • Umkristallisation dieses Materials aus siedendem Hexan (100 ml) mit langsamem Abkühlen auf -20º lieferte 8,145 g (73%) Trifluoracetamid 63 als blaßgelbe Nadeln (Schmp. 46-47º).
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 6,27 (breit s, 1H NHTFA), 3,34 offensichtliches q, 2H -CH&sub2;NHTFA), 2,18 (td, 2H, HCCCH&sub2;-), 1,94 (t, 1H, HCCCH&sub2;-), 1,20-1,65 (m, 16H, (CH&sub2;)&sub8;). TR (dünner Schmelzfilm): 3312, 3298, 2932 und 2857 (C-H und N-H), 2117 (Acetylen), 1706 (C=O) 1675, 1563, 1460, 1448, 1208, 1182, 1166, 722 und 634.
    • D. HERSTELLUNG VON 5-(12-TRIFLUORACETAMIDO-1-DODECINYL)-2',3'- DIDEOXYURIDIN (60).
  • Das geschützte Alkinylamin 63 wurde 24 h mit 5-Iod-2',3'-dideoxyuridin (47, 676,2 mg, 2,00 mMol, hergestellt wie in Beispiel 2A beschrieben) gekuppelt, indem dem in Beispiel 1C beschriebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde. Die Chromatographie an Kieselgel (100 g), wobei mit einem Gradienten von 0-5% Methanol in Dichlormethan eluiert wurde, lieferte einen dunkelroten Schaum. Die rote Verunreinigung wurde durch Chromatographie an einer Umkehrphasensäule (100 g, Octadecylsilan auf 40 Mikrometer Kieselgel, Baker) mit 40% Wasser in Methanol entfernt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, eingeengt und zweimal zusammen mit absolutem Ethanol eingedampft, um 731 mg Alkinylaminonucleosid 60 als klares Öl zu liefern. Dieses Material war nach DSC und NMR homogen, außer der Anwesenheit von Restethanol (25 Mol%, korrigierte Ausbeute 73%).
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 11,49 (breit s, 1H, H3), 9,38 (verzerrtes t, 1H, NHTFA), 8,15 (s, 1H, H6), 5,90 (dd, 1H, H1'), 5,12 (verzerrtes t, 1H, 5'OH), 4,35 (t, 0,25H, CH&sub3;CH&sub2;OH), 4,03 (m, 1H, H4'), 3,72 und 3,52 (m, 2H, H5'), 3,43 (m, 0,5H, CH&sub3;CH&sub2;OH), 3,16 (Quintett, 2H, -CH&sub2;NHTFA), 2,34 (t, 2H, propargylisch H), 2,16, 2,01 und 1,86 (m, 4H, H2' und H3'), 1,65-1,15 (m, 16H, (CH&sub2;)&sub8;) und 1,06 (t, 0,75H, CH3tCH&sub2;OH).
    • BEISPIEL 12 HERSTELLUNG VON 5-(5-AMINO-1-PENTINYL)-2',3'-DIDEOXYURIDIN (64)
  • (Verbindung 64 ist ein Beispiel eines Alkinylaminonucleotids (I), worin Het Uracil (h) ist, R&sub1; (CH&sub2;)&sub3; ist und R&sub2;, R&sub3;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub7; und R&sub8; H sind.)
    • A. HERSTELLUNG VON 5-AMINO-1-PENTIN (65).
  • Ammoniak (340 g, 20 Mol) wurde in eine Bombe destilliert, die 5- Chlorpentin (20,51 g, 0,200 Mol) und Natriumiodid (7,49 g, 0,050 Mol, 0,25 Äq.) enthielt. Die Bombe wurde verschlossen und in einem Autoklaven 12 h auf 100º erhitzt. Man ließ den Ammoniak abdampfen und der Rückstand wurde mit einem Zweiphasengemisch gerührt, das aus Natriumhydroxid (40 g, 1,0 Mol, 5 Äq.), Wasser (100 ml) und Ether (100 ml) bestand. Das sich daraus ergebende Gemisch wurde filtriert und in zwei Schichten trennenlassen. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und über eine 20-cm-Vigreux-Kolonne destilliert. Von vier Fraktionen (12,46 g, Sp. 95-127º, Atmosphärendruck) wurde durch GC gefunden, daß sie bedeutende Mengen Produkt enthalten. Diese Fraktionen wurden vereinigt und sorgfältig über eine Drehbandkolonne destilliert, um 6,55 g (39%) 5-Amino-1-pentin (65) als farblose bewegliche Flüssigkeit zu liefern (Sp. 125,5-126º). Dieses Material war nach GC > 99% ein Peak.
  • ¹H-NMR (CDCl&sub3;): 2,81 (t, J = 7,5, 2H, -CH&sub2;NH&sub2;), 2,27 (td, J = 7,5 und 2,5, 2H, HCCCH&sub2;-), 1,96 (t, J = 2,5, 1H, HCCCH&sub2;-), 1,66 (Quintett, J = 7,5, 2H, -CH2CH2CH2-) und 1,07 (breit s, 2H, NH&sub2;).
    • B. EIN ALLGEMEINES VERFAHREN ZUM KUPPELN UNGESCHÜTZTER ALKI- NYLAMINE AN IODNUCLEOSIDE. HERSTELLUNG VON 5-(5-AMINO-1-PENTIN)- 2',3'-DIDEOXYURIDIN (64).
  • Ein trockener 35-ml-Rundkolben wurde mit 5-Iod-2',3'-dideoxyuridin (47, 676,2 mg, 2,00 mMol, hergestellt wie in Beispiel 2A beschrieben) beschickt und anschließend mit Argon gespült. Trockenes Dimethylformamid (10 ml, Aldrich), trockenes Triethylamin (0,56 ml, 4,0 mMol, 2,0 Äq., über Sieb aufbewahrt), 5- Amino-1-pentin (0,59 ml, 6,03 mMol, 3,0 Äq.) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(O) (231 mg, 0,200 mMol, 0,1 Äq., in einer Trockenbox in ein Gläschen eingewogen) wurden zugesetzt. Die sich daraus ergebende Suspension wurde 45 Min. gerührt, aber der Palladiumkatalysator blieb zumindest teilweise ungelöst. Kupferiodid (190,4 mg, 1,00 mMol, 0,5 Äq., Aldrich Gold Label) wurde zugesetzt. Nach 15 Min. Rühren hatte sich eine homogene blaue Lösung gebildet und nach etwa 150 Min. wurde die Lösung trübe. Nach 200 Min. zeigte die DSC, daß alles Ausgangsiodid 47 verbraucht worden war. Nach 4 h wurde das Reaktionsgemisch mit einem Rotationsverdampfer etwa 10 Min. bei 45º und 2 Torr eingeengt. Der Rückstand wurde sofort auf eine Kieselgelsäule (100 g) absorbiert und mit einem Gemisch aus Dichlormethan, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxid (jeweils 400 ml mit 90 : 9 : 1, 85 : 13 : 2, 75 : 20 : 5, 65 : 30 : 5 und 50 : 45 : 5) eluiert. Die Fraktionen, welche gemäß der DSC das polare Hauptprodukt enthielten, wurden vereinigt, zweimal zusammen mit Ethanol eingedampft und über Nacht vakuumgetrocknet, um 395,9 g (67%) Alkinylaminonucleosid 64 als gelben Feststoff zu liefern. Dieses Material war nach DSC und NMR homogen, außer der Anwesenheit von Ethanol (33 Mol%), das durch Vakuumtrocknen nicht entfernt wurde. Die auf die Anwesenheit von Ethanol korrigierte Ausbeute an 64 betrug 64%.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 8,33 (s, 1H, H6), 5,90 (dd, J = 6,6 und 3,0, 1H, H1'), 4,05 (m, 1H, H4'), 3,73 (dd, J = 12,1 und 2,8, 1H, H5'a), 3,53 (dd, J = 12,1 und 3,1, 1H, H5'b), 2,80 (breit s, 2H, -CH&sub2;H&sub2;), 2,45 (t, J = 7,0, 2H, propargylisch H), 2,28, 2,02 und 1,86 (m, 4H, H2' und H3'), und 1,70 (Quintett, J = 7,0 Hz, 2H, - CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;-). Diese NMR-Daten wurden aus einem anderen Ansatz von 64 erhalten, der in einer zu der vorstehend beschriebenen ähnlichen Weise hergestellt wurde. Die Signale für die austauschbaren Wasserstoffe (H3, 5'OH und -NH&sub2;) in NMR-Proben beider Materialien waren zu einem einzigen breiten (> 2 ppm breit) Signal vereinigt, das von der Grundlinie kaum getrennt war.
    • BEISPIEL 13 HERSTELLUNG VON 5-(3-AMINO-1-PROPINYL)-2',3'-DIDEOXYURIDIN (66).
  • (Verbindung 66 ist ein Beispiel eines Alkinylaminonucleotids (I), worin Het Uracil (h) ist, R&sub1; CH&sub2; ist und R&sub2;, R&sub3;, R&sub5;, R&sub6;, R&sub7; und R&sub8; H sind.)
  • 5-Iod-2',3'-dideoxyuridin (47, 2,00 mMol) wurde 3 h mit Propargylamin (6,00 mMol, Aldrich) gemäß dem in Beispiel 12B beschriebenen Verfahren gekuppelt, außer daß Propargylamin anstelle von 5-Amino-1-pentin verwendet wurde. Die Chromatographie, wie vorstehend beschrieben, lieferte 794,5 mg unreines Alkinylaminonucleosid 66 als gelben Feststoff, der einen einzigen Fleck lieferte, wenn er durch DSC analysiert wurde. NMR und Massenbilanz der Reaktion zeigten, daß dieses Material durch Ethanol und möglicherweise anorganische Verunreinigungen verunreinigt war.
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 11,70 (breit s, 1H, H3), 8,40 (s, 1H, H6), 8,25 (breit s, 2H, NH&sub2;), 5,89 (dd, J = 6,6 und 3,0, 1H, H1'), 5,13 (t, J = 5,0, 1H, 5'OH), 4,07 (m, 1H, H4'), 3,96 (s, 2H, -CH&sub2;NH&sub2;), 3,71 und 3,56 (m, 2H, H5'), 2,30, 2,04 und 1,85 (m, 4H, H2' und H3') und Signale für Ethanol und eine unbekannte Verunreinigung. Die vorstehenden NMR-Daten wurden aus einer anderen Herstellung von 66 genommen, die wie vorstehend ausgeführt wurde, außer daß 0,2 Äq. Kupferiodid verwendet wurden und die Reaktion nicht bis zur Vollständigkeit ablief.
    • BEISPIEL 14 HERSTELLUNG VON 1-(2-HYDROXYETHOXYMETHYL)-5-(3-AMINO-1-PROPI- NYL)CYTOSINTRIPHOSPHAT (67)
  • (Verbindung 67 ist ein Beispiel eines Alkinylaminonucleotids (I), worin R&sub1; -CH&sub2;- ist, R&sub2; und R&sub3; H sind, Het Cytosin (i) ist, R&sub4; (g) ist und R&sub5; P&sub3;O&sub9;H³ H ist.)
    • A. HERSTELLUNG VON 1-(2-HYDROXYETHOXYMETHYL)-5-IODCYTOSIN (68).
  • Ein Gemisch von 1-(2-Hydroxyethoxymethyl)cytosin (1,85 g, 10,0 mMol) und Quecksilberacetat (3,35 g, 10,5 mMol) wurde in Methanol (50 ml) und Dichlormethan (100 ml) zum Rückfluß erhitzt. Iod (3,05 g, 12,0 mMol) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 1 h gerührt. Die freie Basenform von AG3-X4-Harz (38 mÄq.) wurde zugesetzt und in die Lösung wurde 15 Min. Schwefelwasserstoff eingeblasen. Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt und das Filtrat wurde auf Kieselgel (10 g) abgezogen. Das Kieselgel wurde auf eine Kieselgelsäule (4 x 25 cm) geladen und mit 5%, 10% und 20% Methanol in Dichlormethan eluiert. Das Eindampfen, gefolgt vom Vakuumtrocknen lieferte einen farblosen Feststoff (1,73 g, 56%).
  • Die Umkristallisation aus 95%igem Ethanol lieferte analytisch reines Material (Schmp. 172º). Berechnet für C&sub7;H&sub1;&sub0;N&sub3;O&sub3;I: C 27,03%, H 3,24%, N 13,51%. Gefunden: C 27,08%, H 3,41%, N 13,51%. UV (Methanol): Maximum bei 292,5 (5300).
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 3,481 (m, 4H), 4,659 (t, J = 5, 1H), 5,070 (s, 2H), 6,665 (breit s, 1H), 7,869 (breit s, 1H) und 8,107 (s, 1H)
    • B. HERSTELLUNG VON 1-(2-HYDROXYETHOXYMETHYL)-5-(3-TRIFLUOR- ACETAMIDO-1-PROPINYL) CYTOSIN (69).
  • Iodid 68 (311 mg, 1,00 mMol) wurde mit N-Propargyltrifluoracetamid (43) gemäß dem in Beispiel 1C beschriebenen allgemeinen Verfahren gekuppelt. Die Blitzchromatographie an Kieselgel (3 x 20 cm) mit 5%, 10% und 20% Methanol in Dichlormethan lieferte das Alkinylaminonucleotid 69 als blaßgelben Schaum (77,4 mg, 23,%).
  • ¹H-NMR (DMSO-d&sub6;): 3,472 (breit s), 4,276 (d, J = 5,0, 2H), 4,653 (breit t, J = 4,5, 1H), 5,091 (s, 2H), 6,925 (breit s, 1H), 8,037 (s, 1H) und 9,964 (breit s, 1H).
    • C. HERSTELLUNG VON 1-(2-HYDROXYETHOXYMETHYL)-5-(3-AMINO-1- PROPINYL)CYTOSIN (67).
  • Die Hydroxylgruppe des Zuckerteils des Alkinylaminonucleosids 69 (0,167 mMol) wurde in ein Triphosphat überführt und die Trifluoracetylgruppe wurde entfernt, indem dem in Beispiel 1E angegebenen allgemeinen Verfahren gefolgt wurde. Nach Zugabe der zweiten aliquoten Menge Phosphoroxychlorid ließ man die Phosphorylierung 75 Min. ablaufen. Unter der Annahme eines Absorptionskoeffizienten für das Produkt, welcher demjenigen des Ausgangsmaterials gleich ist (7790), betrug die Ausbeute an Triphosphat 67 bezogen auf seine UV-Absorption bei 291 nm, 21%.
    • BEISPIEL 15 Herstellung des n-Hydroxysuccinimidesters 2a
  • (Ein bevorzugtes Reagenz zum Binden eines bei 505 nm fluoreszierenden Farbstoffs an ein Alkinylaminonucleotid, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; H sind.)
    • A. Herstellung von 9-(Carboxyethyliden-3,6-dihydroxy-9H-xanthen (SF-505)
  • Resorcin (33,0 g, 0,300 Mol) und Succinanhydrid (30,0 g, 0,300 Mol) wurden in einen Rundkolben eingebracht und mit Stickstoff gespült. Methansulfonsäure (150 ml) wurde zugesetzt und die Lösung wurde 2 Stunden bei 65 unter einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde tropfenweise rasch gerührtem, eiskaltem Wasser (1 l) unter gleichzeitiger Zugabe von 50%igem wäßrigem Natriumhydroxid zum Halten des pH bei 2,5 +/- 0,5 zugesetzt. Das Produkt, das als körniger Niederschlag erschien, wurde durch Filtration gesammelt und mit Wasser (3 x 100 ml), anschließend Aceton (3 x 100 ml) gewaschen. Das Produkt wurde luftgetrocknet, anschließend 18 Stunden bei 110º vakuumgetrocknet (Vakuumofen), um ein dunkelrotes Pulver (37,7 g, 88%) zu liefern.
  • Eine analytische Probe wurde durch Lösen von 1,0 g Produkt in 25 ml heißer 0,3 N HCl hergestellt. Der Niederschlag, der sich beim Kühlen bildete, wurde durch Filtration entfernt und verworfen. Verdünntes wäßriges Natriumhydroxid wurde zum Erhöhen des pH auf 1,25 zugesetzt. Der sich daraus ergebende Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, mit Wasser gewaschen, luftgetrocknet, anschließend 36 Stunden über P&sub2;O&sub5; bei 140º vakuumgetrocknet.
  • Anal. : Ber. [C(16)H(12)O(5)] C 67,60, H 4,26.
  • Gefunden: C 67,37, H 4,34, 0,52% Wasser (K-F).
  • NMR (DMSO-d&sub6;): (hauptsächlich Spirolactonform) δ 2,690 (t, J = 8,6 Hz, 2H), 3,070 (t, J = 8,6 Hz, 2H), 6,530 (d, J = 1,8 Hz, 2H), 6,676 (dd, J = 8,7, 1,8 Hz, 2H), 7,432 (d, J = 8,7, 1,8 Hz, 2H), 7,432 (d, J = 8,7 Hz, 2H) und 9,964 (s, 2H). Sichtb. Abs. (pH 8,2; 50 mM wssr. Tris/HCl): max. 486 nm (72600).
    • B. Herstellung von 9-(2-Carboxyethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy- 9H-xanthen (Ac2EtSF-505)
  • SF-505 (29,3 g, 103 mMol) wurde eiskaltem Acetanhydrid (500 ml) zugesetzt, gefolgt von Pyridin (100 ml). Das Gemisch wurde 20 Minuten in Eis gerührt, anschließend während 20 Minuten rasch gerührtem, eiskaltem Wasser (7 l) zugesetzt. Nach weiteren 30 Minuten Rühren wurde das Zwischenprodukt filtriert und erneut in Wasser (4 l) suspendiert und weitere 30 Minuten gerührt. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, in absolutem Ethanol (1 l) gelöst und 45 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde an einem Rotationsverdampfer auf 200 ml eingeengt, was zur Kristallisation führte. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt, luftgetrocknet, anschließend vakuumgetrocknet, um blaßorangfarbene Mikrokristalle (21,9 g, 51%) zu liefern.
  • Die Umkristallisation aus Methylenchlorid/Cyclohexan ergab farblose Mikrokristalle. Schmp.: 142-143ºC.
  • Anal.: Ber. [C(22)H(22)O(8)] C 6,63,76, H 5,35.
  • Gefunden: C 63,58, H 5,39.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,035 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,667 (m, 2H), 2,232 (m, 2H), 2,294 (s, 6H), 2,888 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 7,0-7,1 (m, 4H) und 7,575 (d, J = 9,1 Hz, 2H).
    • C. Herstellung von 9-(2-(N-Succinimidyloxycarbonyl))ethyl)- 3,6-diacetoxy-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-505-NHS)
  • Ac2EtSF-505 (10,4 g, 25,1 mMol) wurde mit Methylenchlorid (300 ml) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (9,70 g, 50,6 mMol) gemischt und N-Hydroxysuccinimid (4,32 g, 37,5 mMol) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde eine Stunde gerührt und anschließend mit Wasser (5 x 50 ml) gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Schichten wurden mit Methylenchlorid (50 ml) zurückextrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und abgezogen. Das Anreiben mit Ethanol (75 ml), gefolgt von der Filtration und dem Lufttrocknen lieferte das Rohprodukt als hellgelben Feststoff (ca. 10 g). Dieses Material wurde in Methylenchlorid (50 ml) gelöst und Cyclohexan (50 ml) wurde zugesetzt. Ein Teelöffel Aktivkohle wurde zugesetzt, das Gemisch wurde filtriert und das Produkt wurde mit einer weiteren Portion Cyclohexan (100 ml) ausgeschieden. Das Sammeln durch Filtration, Lufttrocknen und Vakuumtrocknen lieferte farblose Kristalle (6,94 g, 54%)
  • Eine zweite Kristallisation aus Ethanol lieferte eine analytische Probe. Schmp.: 162-3ºC.
  • Anal.: Ber. [C(26)H(25)N(1)O(10)] C 61,05, H 4,93, N 2,74.
  • Gefunden: C 60,78, H 5,01, N 2,65.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,056 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 2,4-2,1 (m, 4H), 2,293 (s, 6H), 2,757 (s, 4H), 2,922 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 7,069 (m, 4H) und 7,617 (p d, J = 9,1 Hz, 2H).
    • D. Herstellung von 9-(2-(N-Methyl-N-(benzyloxycarbonylmethyl)carboxamido)ethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF- 505-Sar-OBn)
  • Einer Lösung von Sarcosinbenzylester * (1,13 g, 6,31 mMol) in Methylenchlorid (50 ml) wurde Ac2EtSF-505-NHS (2,58 g, 5,05 mMol) und 5%ige wssr. Natriumbicarbonatlösung (30 ml) zugesetzt. Das Zweiphasengemisch wurde rasch 20 Stunden gerührt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht mit 3 x 15 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf 25 ml eingeengt. Die Lösung wurde mit Cyclohexan auf 150 ml verdünnt, mit Aktivkohle behandelt und unter einem Stickstoffstrom auf 75 ml eingeengt, was zur Fällung des Produkts führte. Der Überstand wurde abdekantiert und der Rückstand wurde zusammen mit Methylenchlorid eingedampft, um einen farblosen Schaum (1,70 g, 58%) zu liefern.
  • Ausgedehntes Vakuumtrocknen lieferte eine analytische Probe.
  • Anal.: Ber. [C(32)H(33)N(1)O(9)] C 66,77, H 5,78, N 2,43.
  • Gefunden: C 66,66, H 5,89, N 2,25.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): (zeigt 5 : 2-Gemisch der Amidbindungsrotameren an.) δ (Haupt- und Neben-) 1,040 und 1,018 (t, J = 6,7 Hz, 3H), 1,789 und 1,670 (m, 2H), 2,211 (m, 2H), 2,290 und 2,276 (s, 6H), 2,713 und 2,695 (s, 3H), 2,893 (q, J = 6,7 Hz, 2H), 3,963 (s, 2H), 5,075 und 5,039 (s, 2H), 7,044 (m, 4H), 7,324 (m, 5) und 7,573 und 7,516 (p d, J = 9,2 Hz, 2H).
  • * Sarcosinbenzylester-p-tosylat-Salz (Adams Chemical Co.) wurde in Methylenchlorid aufgenommen und wiederholt mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen, anschließend mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und abgedampft.
    • E. Herstellung von 9-(2-(N-Methyl-N-(N'-succinimidyloxycarbonylmethyl)carboxamido)ethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-505-Sar-NHS, Struktur 2a)
  • Einer Lösung von Ac2EtSF-505-Sar-OBn (1,55 g, 2,69 mMol) in absolutem Ethanol (60 ml) wurde 10% Palladium auf Kohle (0,15 g) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter einem Ballondruck Wasserstoff 30 Minuten gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Ethanol wurde abgezogen, um einen sirupartigen Rückstand zu liefern.
  • Dieser Rückstand wurde in Methylenchlorid (85 ml) gelöst und N-Hydroxysuccinimid (0,495 g, 4,30 mMol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (1,12 g, 5,84 mMol) wurden zugesetzt (4 x 25 ml). Die Lösung wurde auf 25 ml eingeengt, mit 175 ml Cyclohexan verdünnt, mit Aktivkohle behandelt und unter einem Stickstoffstrom auf ein Volumen von 75 ml eingeengt. Das feste Produkt wurde durch Filtration gesammelt, luftgetrocknet und vakuumgetrocknet, um ein farbloses Pulver (0,97 g, 62%) zu liefern.
  • Das Eindampfen zusammen mit Methylenchlorid, gefolgt vom ausgedehnten Vakuumtrocknen bei 40ºC entfernte Spuren von Cyclohexan und lieferte eine analytische Probe als amorphen Feststoff.
  • Anal.: Ber. [C(29)H(30)N(2)O(11)] C 59,79, H 5,19, N 4,81.
  • Gefunden: C 59,37, H 4,62, N 4,62, 0,93% Wasser (K-F).
  • NMR (DMSO-d&sub6;): (Zeigt ein 4 : 1-Gemisch von Amidbindungsrotameren.) δ (Haupt- und Neben-) 1,034 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,827 und 1,935 (m, 2H), 2,223 (m, 2H), 2,289 (s, 6H), 2,758 (s, 4H), 2,779 und 2,824 (s, 3H), 2,888 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 4,333 und 4,473 (s, 2H), 7,043 (m, 4H) und 7,587 (jeweils d, J = 9,1 Hz, 2H).
    • BEISPIEL 16 Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters 2b
  • (Ein bevorzugtes Reagenz zum Binden eines bei 512 nm fluoreszierenden Farbstoffs an ein Alkinylaminonucleotid, in dem R&sub9; H ist und R&sub1;&sub0; CH&sub3; ist.)
    • A. Herstellung von 4-Methylresorcin
  • 2,4-Dihydroxybenzaldehyd (33,97 g, 0,246 Mol) (aus Toluol umkristallisiert) wurde in 2-Propanol (3 l) von spektroskopischer Reinheit in einem Rundkolben gelöst, der mit einem Gaseinlaß und einem Blasenzählerauslaß versehen war. 10% Palladium auf Kohle (1,35 g) wurde zugesetzt, gefolgt von Phosphorsäure (3 ml) und in das Gemisch wurde Stickstoff eingeblasen. Der Stickstoffdurchfluß wurde gegen Wasserstoff ausgetauscht und das Gemisch wurde rasch unter Eiskühlen gerührt. Nach 3 Stunden war die Wasserstoffaufnahme beendet und der Katalysator wurde durch Filtration entfernt. Das Filtrat wurde auf 200 ml abgezogen und 200 ml Essigsäureethylester wurden zugesetzt. Die Lösung wurde mit 4 x 200 ml Wasser gewaschen und die vereinigten Wasserextrakte wurden mit Essigsäureethylester zurückextrahiert. Diese organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen und die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und abgezogen, um das Produkt als farblosen kristallinen Feststoff (29,95 g, 98%) zu liefern. Schmp.: 106ºC (Lit. 106-107ºC [J. C. Bell, W. Bridge und A. Robertson, J. Chem. Soc., 1542-45 (1937)]).
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,961 (s, Me), 6,076 (dd, H-6, J[5,6] = 8 Hz, J[2,6] = 2 Hz), 6,231 (d, H-2), 6,760 (d, H-5), 8,867 (s, OH) und 9,008 (s, OH).
    • B. Herstellung von 9-Carboxyethyliden-3,6-dihydroxy-2,7-dimethyl-9H-xanthen (SF-512)
  • 4-Methylresorcin (25,8 g, 0,208 Mol) und Succinanhydrid (20,8 g, 0,208 g) wurden in einen Rundkolben eingebracht und der Kolben wurde mit Stickstoff gespült. Methansulfonsäure (150 ml) wurde zugesetzt und die Lösung wurde 2 Stunden unter Stickstoff auf 65º erhitzt. Die Lösung wurde tropfenweise 1 l rasch gerührtem, eiskaltem Wasser unter gleichzeitiger Zugabe von 50%igem wäßrigem Natriumhydroxid zum Erhalten des pH bei 2,25 ± 0,25 zugesetzt. Das Produkt wurde durch Zentrifugieren gesammelt und mit Wasser (3 x) und Aceton (2 x) gewaschen. Der Feststoff wurde luftgetrocknet, anschließend bei 110º vakuumgetrocknet, um ein ziegelrotes Pulver (24,1 g, 74%) zu liefern.
  • Die Reinigung wurde dadurch bewirkt, daß man Essigsäureethylester langsam in eine Lösung des Produkts in Dimethylsulfoxid diffundieren ließ. Der Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt, luftgetrocknet, anschließend vakuumgetrocknet.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): (zeigt reine Deltaform zusammen mit jeweils einem Mol Wasser und Dimethylsulfoxid an) δ 2,124 (s, 6H), 3,421 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 5,769 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 6,512 (s, 1H), 6,573 (s, 1H), 7,295 (s, 2H), 9,681 (s, 1H), 9,825 (s, 1H) und 12,346 (bs, 1H), Sichtb. Ans. (pH 8,2 wssr. Tris): max. 493,5 nm.
    • C. Herstellung von 9-Carboxyethyl-3,6-diacetoxy-2,7-dimethyl- 9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-512)
  • Eine Probe von SF-512 (20,0 g, 64,0 mMol) wurde Acetanhydrid (350 ml) zugesetzt, gefolgt von Pyridin (80 ml). Dieses wurde 1 Stunde gerührt und anschließend zum Entfernen Spuren unumgesetzten Farbstoffs filtriert. Das Filtrat wurde in 3,5 1 rasch gerührtes Wasser gegossen. Das feste Zwischenprodukt wurde durch Filtration gesammelt, erneut in 2 l kaltem Wasser suspendiert, 15 Minuten gerührt, anschließend wieder gesammelt und luftgetrocknet, um das Spirolacton-Zwischenprodukt (20,8 g) zu liefern. Dieses wurde in absolutem Ethanol (600 ml) gelöst und 45 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde mit Aktivkohle behandelt und auf 300 ml eingeengt. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt, mit kaltem Ethanol (2 x 50 ml) gewaschen, luftgetrocknet und anschließend vakuumgetrocknet, um farblose Mikrokristalle (14,9 g, 53%) zu liefern. Schmp.: 143ºC.
  • Anal.: Ber. [C(24)H(26)O(8)] C 65,15, H 5,92.
  • Gefunden: C 65,31, H 5,97.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,027 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,628 (m, 2H), 2,136 (s, 6H), 2,207 (m, 2H), 2,303 (s, 6H), 2,884 (q, 6,9 Hz, 2H), 6,939 (s, 2H) und 7,417 (s, 2H).
    • D. Herstellung von 9-(2-(N-Succinimidyloxycarbonyl)ethyl-3,6- diacetoxy-2,7-dimethyl-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-512-NHs)
  • Einer Lösung von Ac2EtSF-512 (9,42 g, 21,3 mMol) in Methylenchlorid (175 ml) wurde N-Hydroxysuccinimid (3,62 g, 31,5 mMol) zugesetzt, unmittelbar gefolgt von 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimid-hydrochlorid (8,05 g, 42,0 mMol). Die Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser (4 x 100 ml) gewaschen und die wäßrigen Waschflüssigkeiten wurden mit Methylenchlorid (2 x 50 ml) zurückextrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und zu einem Öl abgezogen. Absolutes Ethanol wurde zugesetzt und die Kristallisation wurde durch Kratzen ausgelöst. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt, luftgetrocknet, anschließend vakuumgetrocknet, um blaßorangefarbene Mikrokristalle (9,80 g, 85%) zu liefern.
  • Eine analytische Probe wurde durch Lösen von 1 g in Methylenchlorid (10 ml) und Zusetzen von Cyclohexan (40 ml) hergestellt. Die Behandlung mit Aktivkohle, gefolgt vom Kühlen und Kratzen löste die Kristallisation aus und lieferte einen farblosen kristallinen Feststoff. Schmp.: 159ºC.
  • Anal.: Ber. [C(28)H(29)N(1)O(10)] C 62,33, H 5,42, N 2,60.
  • Gefunden: C 62,06, H 5,71, N 2,39.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,053 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 2,149 (s, 6H), 2,304 (s, 6H), 2,1-2,4 (m, 4H), 2,747 (s, 4H), 2,920 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 6,975 (s, 2H) und 7,464 (s, 2H).
    • E. Herstellung von 9-(2-(N-Methyl-N-(benzyloxycarbonylmethyl)carboxamido)ethyl)-3,6-diacetoxy-2,7-dimethyl-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-512-Sar-OBn)
  • Einer Lösung von Sarcosinbenzylester (0,72 g, 4,02 mMol) in Methylenchlorid (25 ml) wurden Ac2EtSF-512-NHS (1,73 g, 3,21 mMol) und 5%ige wäßrige Natriumbicarbonatlösung (20 ml) zugesetzt. Das Zweiphasengemisch wurde 20 Stunden rasch gerührt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit 3 x 15 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf 10 ml eingeengt. Die Lösung wurde mit Cyclohexan auf 60 ml verdünnt, mit Aktivkohle behandelt und unter einem Stickstoffstrom auf 25 ml eingeengt, was zur Ausfällung des Produkts führte. Der Überstand wurde dekantiert und der farblose Feststoff wurde vakuumgetrocknet (1,44 g, 74%).
  • Die Umkristallisation aus Methylenchlorid/Cyclohexan mit Aktivkohle-Behandlung lieferte eine analytische Probe. Schmp.: 150-2ºC.
  • Anal. : Ber. [C(34)H(37)N(1)O(9)] C 67,65, H 6,18, N 2,32.
  • Gefunden: C 67,42, H 6,08, N 2,33.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): (Zeigt 5 : 2-Gemisch der Amidbindungsrotameren.) δ (Haupt- und Neben-) 1,049 und 1,008 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,747 und 1,66 (m, 2H), 2,144 und 2,115 (s, 6H), 2,18 (m, 2H), 2,314 und 2,303 (s, 6H), 2,694 (s, 3H), 2,907 und 2,884 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 3,961 (s, 2H), 5,075 und 5,016 (s, 2H), 6,960 und 6,917 (s, 2H), 7,430 und 7,396 (s, 2H) und 7,30 (m, 5H).
    • F. Herstellung von 9-(2-(N-Methyl-N-(N'-succinimidyloxycarbonylmethyl)carboxamido)ethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy-2,4,5,7- tetramethyl-9H-xanthen (Ac2EtSF-512-Sar-NHS, Struktur 2b)
  • Einer Suspension von Ac2EtSF-512-Sar-OBn (0,45 g, 0,745 Mol) in absolutem Ethanol (20 ml) wurde 10% Palladium auf Kohle (0,05 g) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Wasserstoff mit Ballondruck 30 Minuten gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Ethanol wurde abgezogen, um einen sirupartigen Rückstand zu liefern.
  • Dieser Rückstand wurde in Methylenchlorid (25 ml) gelöst und N-Hydroxysuccinimid (0,129 g, 1,12 mMol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (0,292 g, 1,52 mMol) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und anschließend mit Wasser (3 x 15 ml) gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, auf 10 ml eingeengt, mit Cyclohexan auf 40 ml verdünnt, mit Aktivkohle behandelt und unter einem Stickstoffstrom auf ein Volumen von 20 ml eingeengt. Der Überstand wurde dekantiert und der Rückstand wurde einer zweiten Fällung aus Methylenchlorid unterzogen, um ein farbloses Pulver (0,27 g, 59%) zu liefern.
  • Anal. : Ber. [C(31)H(34)N(2)O(ll)] C 60,98, H 5,61, N 4,59.
  • Gefunden: C 60,28, H 5,71, N 4,40, 1,08% Wasser (K-F).
  • NMR (DMSO-d&sub6;): (Zeigt ein 5 : 1-Gemisch von Rotameren über der Amidbindung.) δ (Haupt- und Neben-) 1,043 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,793 und 1,933 (m, 2H), 2,145 und 2,133 (s, 6H), 2,198 (m, 2H), 2,314 (s, 6H), 2,740 (s, 4H), 2,778 und 2,821 (s, 3H), 2,900 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 4,334 und 4,469 (s, 2H), 6,960 und 6,925 (s, 2HO) und 7,441 (s, 2H).
    • BEISPIEL 17 Herstellung von N-Hydroxysuccinimidester 2c
  • (Ein bevorzugtes Reagenz zum Binden eines bei 519 nm fluoreszierenden Farbstoffs an ein Alkinylaminonucleotid, in dem R&sub9; CH&sub3; ist und R&sub1;&sub0; H ist.)
    • A. Herstellung von 9-(2-Carboxyethyliden)-3,6-dihydroxy-4,5- dimethyl-9H-xanthen (SF-519)
  • 2-Methylresorcin (37,2 g, 0,300 Mol) und Succinanhydrid (30,0 g, 0,300 Mol) wurden in einen Rundkolben eingebracht und mit Stickstoff gespült. Methansulfonsäure (150 ml) wurde zugesetzt und die Lösung wurde 4 Stunden unter einer Stickstoffatmosphäre bei 65ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde tropfenweise rasch gerührtem, eiskaltem Wasser (1 l) unter gleichzeitiger Zugabe 50%igen wäßrigen Natriumhydroxids zum Halten des pH bei 6,0 ± 0,5 zugesetzt. Der feinverteilte Feststoff wurde durch Zentrifugieren gesammelt und mit Wasser gewaschen (4 x 250 ml), wobei jedes Mal erneut suspendiert, zentrifugiert und der Überstand verworfen wurde. Das Rohprodukt wurde in Wasser (1 l) suspendiert und genügend wäßriges Natriumhydroxid (50%) wurde zum Erhöhen des pH auf 10,2 zugesetzt. Die Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde mit konzentrierter HCl auf pH 1,2 gebracht. Das Produkt wurde durch Zentrifugieren gesammelt und mit Wasser (3 x 350 ml) und Aceton (3 x 250 ml) wie zuvor beschrieben gewaschen. Der sich daraus ergebende Feststoff wurde mit Toluol azeotrop destilliert, durch Filtration gesammelt und bei 110ºC vakuumgetrocknet, um ein ziegelrotes Pulver (24,6 g, 53%) zu liefern.
  • Anal. : Ber. [C(18)H(16)O(5)] C 69,22, H 5,16.
  • Gefunden: C 68,95, H 5,30, 0,80% Wasser (K-F).
  • NMR (DMSO-d&sub6;) (hauptsächlich Deltaform): δ 2,164 (s, 3H), 2,177 (s, 3H), 3,376 (d, J = 7,1 Hz, 2H), 5,749 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 6,642 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,672 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,216 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,227 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 9,602 (bs, 1H) und 9,758 (bs, 1H). Sicht. Abs. (pH 8,2; 50 mM wssr. Tris/HCl) max. 500 nm (69800)
    • B. Herstellung von 9-(2-Carboxyethyl)-3,6-diacetoxy-4,5-dimethyl-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-519)
  • SF-519 (15,0 g, 48,0 mMol) wurde Acetanhydrid (250 ml) zugesetzt und der Feststoff wurde pulverisiert. (Eine Beschallung ist zum Dispergieren des äußerst unlöslichen SF-519 nützlich.) Die Suspension wurde eisgekühlt, Pyridin (50 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 20 Minuten gerührt. Die Lösung wurde filtriert und in langsamem aber ständigen Strom rasch gerührtem, eiskaltem Wasser (4 l) zugesetzt. Nach weiteren 20 Minuten Rühren wurde das Zwischenprodukt filtriert, erneut in Wasser (3 l) suspendiert und weitere 25 Minuten gerührt. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und luftgetrocknet. Das getrocknete Zwischenprodukt wurde in absolutem Ethanol (600 ml) gelöst und 1 Stunde unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde am Rotationsverdampf er auf 200 ml eingeengt, was zur Kristallisation führte. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt, luftgetrocknet, anschließend vakuumgetrocknet, um farblose Mikrokristalle (12,13 g, 57%) zu liefern.
  • Eine analytische Probe wurde durch Fällung aus Methylenchloridlösung mit Cyclohexan hergestellt.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,033 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,674 (m, 2H), 2,189 (s, 6H), 2,19 (m, 2H), 2,348 (s, 6H), 2,878 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 7,006 (d, J = 8,6 Hz, 2H) und 7,399 (d, J = 8,6 Hz, 2H).
    • C. Herstellung von 9-(2-(N-Succinimidyloxycarbonyl)ethyl-3,6- diacetoxy-4, 5-dimethyl-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-519-NHS)
  • Ac2EtSF-519 (7,80 g, 17,6 mMol) wurde mit Methylenchlorid (175 ml) gemischt und N-Hydroxysuccinimid (2,75 g, 23,9 mMol) und 1- (3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (7,00 g, 36,5 mMol) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 90 Minuten gerührt und anschließend mit Wasser (5 x 100 ml) gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Schichten wurden mit Methylenchlorid (2 x 50 ml) zurückextrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und abgezogen. Das Anreiben mit Ethanol (100 ml), gefolgt von der Filtration und dem Lufttrocknen lieferte das Produkt als hellgelben Feststoff (7,45 g, 78%).
  • Zwei Umkristallisationen aus Cyclohexan/Methylenchlorid mit Aktivkohlebehandlung lieferten eine analytische Probe. Schmp.: 164-5ºC.
  • Anal.: Ber. [C(28)H(29)N(1)O(10)] C 62,33, H 5,42, N 2,60.
  • Gefunden: C 62,17, H 5,47, N 2,48.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,051 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 2,4-2,1 (m, 4H), 2,191 (s, 6H), 2,337 (s, 6H), 2,715 (s, 4H), 2,912 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 7,015 (d, J = 8,6 Hz, 2H) und 7,429 (d, J = 8,6 Hz, 2H).
    • D. Herstellung von 9-(2-(N-Methyl-N-(benzyloxycarbonylmethyl)carboxamido)ethyl)-3,6-diacetoxy-4,5-dimethyl-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-519-Sar-OBn)
  • Einer Lösung von Sarcosinbenzylester (0,557 g, 3,11 mMol) in Methylenchlorid (19 ml) wurden Ac2EtSF-519-NHS (1,30 g, 2,41 mMol) und 5%ige wäßrige Natriumbicarbonatlösung (15 ml) zugesetzt. Das Zweiphasengemisch wurde 18 Stunden rasch gerührt. Die Schichten wurden getrennt und die organische Schicht wurde mit 3 x 10 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf 10 ml eingeengt. Die Lösung wurde mit Cyclohexan auf 40 ml verdünnt, mit Aktivkohle behandelt und unter einem Stickstoffstrom auf 20 ml eingeengt, was zur Fällung des Produkts als klebrigem Feststoff führte. Der Überstand wurde abdekantiert und der Rückstand wurde zusammen mit Methylenchlorid unter Liefern eines farblosen Schaums (0,97 g, 67%) eingedampft.
  • Ausgedehntes Vakuumtrocknen lieferte eine analytische Probe.
  • Anal. : Ber. [C(34)H(37)N(1)O(9)] C 67,65, H 6,18, N 2,32.
  • Gefunden: C 67,43, H 6,37, N 2,32.
  • NMR (DMSO-d&sub6;) (Zeigt 5 : 2-Gemisch von Amidbindungsrotameren.): δ (Haupt- und Neben-) 1,044 und 1,020 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 1,824 und 1,714 (m, 2H), 2,17 (m, 2H), 2,195 und 2,169 (s, 6H), 2,346 und 2,337 (s, 6H), 2,720 und 2,691 (s, 3H), 2,889 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,959 und 3,988 (s, 2H), 5,073 und 5,048 (s, 2H), 7,000 und 6,954 (d, J = 8,6 Hz, 2H) und 7,45-7,25 (m, 7H).
    • E. Herstellung von 9-(2-(N-Methyl-N-(N'-succinimidyloxycarbonylmethyl)carboxamido)ethyl)-3,6-diacetoxy-4,5-dimethyl-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-519-Sar-NHS, Struktur 2c)
  • Einer Lösung von Ac2EtSF-519-Sar-OBn (1,35 g, 2,24 mMol) in absolutem Ethanol (50 ml) wurde 10% Palladium auf Kohle (0,13 g) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Wasserstoff mit Ballondruck 20 Minuten gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Ethanol wurde abgezogen, um einen sirupartigen Rückstand zu liefern.
  • Dieser Rückstand wurde in Methylenchlorid (50 ml) gelöst und N- Hydroxysuccinimid (0,39 g, 3,39 mMol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (1,57 g, 8,19 mMol) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 75 Minuten gerührt und anschließend mit Wasser (4 x 15 ml) gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, auf 25 ml eingeengt, mit Cyclohexan auf 125 ml verdünnt, mit Aktivkohle behandelt und auf ein Volumen von 50 ml unter einem Stickstoffstrom eingeengt. Der Überstand wurde dekantiert und das zurückbleibende Öl wurde in Methylenchlorid (5 ml) aufgenommen und tropfenweise rasch gerührtem Cyclohexan (75 ml) zugesetzt, um ein farbloses Pulver (0,587 g, 43%) zu liefern.
  • Um eine analytische Probe zu liefern, wurde ein Teil des Produkts in Methylenchlorid aufgenommen, über Molekularsieb getrocknet, unter einem Stickstoffstrom eingedampft und schließlich in einer Trockenpistole 20 Stunden bei 48ºC über Phosphorpentoxid getrocknet.
  • Anal. : Ber. [C(31)H(34)N(2)O(11)] : C 60,98, H 5,61, N 4,59.
  • Gefunden: C 60,15, H 5,71, N 4,51, Wasser (K-F) 1,51%.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): (Zeigt ein 4 : 1-Gemisch von Amidbindungsrotameren.): δ (Haupt- und Neben-) 1,039 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,841 und 1,945 (m, 2H), 2,19 (m, 2H), 2,194 (s, 6H), 2,345 (s, 6H), 2,767 und 2,744 (s, 4), 2,778 und 2,825 (s, 3H), 2,888 (q, J = 6,9 Hz, 2H), 4,328 und 4,461 (s, 2H), 7,000 (d, J = 8,6 Hz, 2H) und 7,410 (d, J = 8,6 Hz, 2H).
    • BEISPIEL 18 Herstellung von N-Hydroxysuccinimidester 2d
  • (Ein bevorzugtes Reagenz zum Binden eines 526-nm-Farbstoffs an ein Alkinylaminonucleotid, worin R&sub9; und R&sub1;&sub0; CH&sub3; sind.)
    • A. Herstellung von 2,4-Dihydroxy-3-methylbenzaldehyd
  • Phosphoroxychlorid (80 ml, 0,86 Mol) wurde einem gerührten Gemisch aus N-Methylformanilid (102 ml, 0,82 Mol) in Ether (250 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und anschließend in Eis gekühlt. 2-Methylresorcin (Aldrich, 100 g, 0,81 Mol) wurde zugesetzt und man ließ das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen, während über Nacht gerührt wurde. Das ausgefallene Zwischenprodukt wurde durch Filtration gesammelt und mit Ether (3 x) gewaschen. Das Zwischenprodukt wurde durch Lösen in einem Gemisch aus Aceton (250 ml) und Wasser (250 ml) und 30 Minuten Rühren hydrolysiert. Wasser (2 l) wurde zugesetzt, das Gemisch wurde zum Sieden gebracht und anschließend kühlen- und ein kristallines Produkt abscheiden lassen. Dieses wurde ein zweites Mal aus Wasser (4 l) umkristallisiert, um reines Produkt (70 g, 57%) zu liefern. Schmp. 150ºC (Lit. 152-3ºC [W. Baker et al., J. Chem. Soc., 2834-5 (1949)]).
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,973 (s, 3H), 6,551 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,428 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 9,703 (s, 1H), 10,745 (s, TH) und 11,592 (s, 1H).
    • B. Herstellung von 2,4-Dimethylresorcin
  • Eine Lösung von 2,4-Dihydroxy-3-methylbenzaldehyd (30,0 g, 197 mMol) mit Isopropanol (3 l) wurde in einem 5-l-Dreihalskolben, der mit einem Magnetrührer ausgerüstet war, eisgekühlt. Phosphorsäure (4 ml) und 10% Palladium auf Kohle wurden zugesetzt und die Lösung wurde mit Stickstoff, anschließend Wasserstoff gespült. Wenn die Aufnahme als beendet erachtet wurde (ca. 1,5 Stunden), wurde die Lösung erneut mit Stickstoff gespült und anschließend durch Celite® filtriert. Das Lösungsmittel wurde abgezogen, der Rückstand wurde in Essigsäureethylester aufgenommen und die sich daraus ergebende Lösung wurde mit Wasser (4 x 100 ml) gewaschen. Die Wasser-Waschflüssigkeiten wurden mit Essigsäureethylester zurückextrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und abgezogen. Die Sublimation (95º, 0,05 Torr) lieferte einen farblosen Feststoff (19,6 g, 72%). Schmp. 107-8ºC (Lit. 108-109ºC [W. Baker et al., J. Chem. Soc., 2834-5 (1949)]).
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,969 (s, 3H), 2,037 (s, 3H); 6,220 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 6,637 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 7,929 (s, 1H) und 8,785 (s, 1H).
    • C. Herstellung von 9-(2-Carboxyethyliden)-3,6-dihydroxy-2,4,- 5,7-tetramethyl-9H-xanthen (SF-526)
  • 2,4-Dimethylresorcin (28,4 g, 0,205 Mol) und Succinanhydrid (20,0 g, 0,200 Mol) wurden in einen Rundkolben verbracht und mit Stickstoff gespült. Methansulfonsäure (231 ml) wurde zugesetzt und die Lösung wurde unter einer Stickstoffatmosphäre 20 Stunden bei 70ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde tropfenweise einem rasch gerührten Gemisch aus wäßrigem Natriumhydroxid (95 g in 150 ml Wasser) und Eis (3 l) zugesetzt. Genügend Methansulfonsäure wurde zugesetzt, um den End-pH von 4,7 auf 1,5 zu bringen. Der sich daraus ergebende Feststoff wurde durch Zentrifugieren gesammelt und durch Suspendieren, Zentrifugieren und Dekantieren aus Wasser (5 x 1,2 1) gewaschen. Die Endsuspension wurde durch Filtration gesammelt, luftgetrocknet, anschließend 6 Stunden bei 110ºC ofengetrocknet, um einen ziegelroten Feststoff (30,6 g, 44%) zu liefern.
  • Eine zweite Fällung aus alkalischer Lösung, gefolgt vom Zentrifugieren und Waschen mit Wasser lieferte eine analytische Probe.
  • Anal. : Ber. [C(16)H(12)O(5)] C 70,57, H, 5,92.
  • Gefunden C 70,39, H 6,00, 0,21% Wasser (K-F).
  • NMR (DMSO-d&sub6;): (hauptsächlich Spirolactonform): δ 2,172 (s, 12H), 2,508 (m, 2H), 3,342 (m, 2H) und 7,604 (s, 2H). Sicht. Abs. (pH 8,2; 50 mM wssr. Tris/HCl): 509 nm (71300)
    • D. Herstellung von 9-(2-Carboxyethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy- 2,4,5,7-tetramethyl-9H-xanthen (Ac2EtSF-526)
  • SF-526 (25,2 g, 74 mMol) wurde eiskaltem Acetanhydrid (450 ml), gefolgt von Pyridin (100 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde 150 Minuten unter Eiskühlen gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, anschließend in langsamem ständigem Strom rasch gerührtem, eiskaltem Wasser (7 l) zugesetzt. Nach weiteren 30 Minuten Rühren wurde das Zwischenprodukt filtriert, mit Wasser gewaschen, erneut in Wasser (4 l) suspendiert und weitere 30 Minuten gerührt. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt und luftgetrocknet, um das Spirolacton-Zwischenprodukt (28,9 g) zu liefern. Ein Teil dieses Zwischenprodukts (18,6 g) wurde in absolutem Ethanol (1 l) gelöst und 90 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung wurde an einem Rotationsverdampfer auf 300 ml eingeengt, was zur Kristallisation führte. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt, mit Ethanol gewaschen, luftgetrocknet, anschließend vakuumgetrocknet, um farblose Mikrokristalle (11,6 g, 52% bezogen auf verwendetes Zwischenprodukt) zu liefern.
  • Die Umkristallisation aus Methylenchlorid/Cyclohexan unter Aktivkohlebehandlung ergab farblose Mikrokristalle. Schmp.: 154-155ºC. Zwei Eindampfungen aus Methylenchlorid entfernten Spuren von Cyclohexan zur Analyse.
  • Anal.: Ber. [C(20)H(20)O(5)] C 70,57, H 5,92.
  • Gefunden: C 70,39, H 6,00, 0,21% Wasser (K-F).
  • NMR (DMSO-d&sub6;) (hauptsächlich Spirolactonform): δ 2,172 (s, 12H), 2,508 (m, 2H), 3,342 (m, 2H) und 7,604 (s, 2H). Sichtb. Abs. (pH 8,2; 50 mM wssr. Tris/HCl): 509 nm (71300).
    • E. Herstellung von 9-(2-(N-Succinimidyloxycarbonyl)ethyl)-3,6- diacetoxy-9-ethoxy-2,4,5,7-tetramethyl-9H-xanthen (Ac2EtSF-526- NHS)
  • Ac2EtSF-526 (4,70 g, 9,99 mMol) wurde mit Methylenchlorid (75 ml) gemischt und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (3,10 g, 16,2 mMol) und N-Hydroxysuccinimid (1,50 g, 13,0 mMol) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 90 Minuten gerührt und anschließend mit Wasser (4 x 50 ml) gewaschen. Die vereinigten wäßrigen Schichten wurden mit Methylenchlorid (50 ml) zurückextrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet und abgezogen. Das Anreiben mit Ethanol (75 ml), gefolgt von der Filtration und dem Lufttrocknen lieferte das Rohprodukt als hellgelben Feststoff (ca. 4,7 g). Dieses Material wurde in Methylenchlorid (50 ml) gelöst und Cyclohexan (50 ml) wurde zugesetzt. Ein Teelöffel Aktivkohle wurde zugesetzt, das Gemisch wurde filtriert und das Produkt wurde mit einer weiteren Portion Cyclohexan (25 ml) ausgefällt. Das Sammeln durch Filtration, Lufttrocknen und Vakuumtrocknen lieferte farblose Kristalle (3,14 g, 55%).
  • Eine zweite Fällung aus Methylenchlorid mit Cyclohexan lieferte eine analytische Probe.
  • Anal. : Ber. [C(30)H(33)N(1)O(10)] C 63,48, H 5,86, N 2,47.
  • Gefunden: C 63,08, H 6,00, N 2,37.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,058 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 2,136 (s, 6H), 2,155 (s, 6H), 2,228 (m, 4H), 2,371 (s, 6H), 2,748 (s, 4H), 2,918 (q, J = 6,9 Hz, 2H) und 7,300 (s, 2H).
    • F. Herstellung von 9-(2-(N-Methyl-N-(benzyloxycarbonylmethyl)carboxamido)ethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2ETSF- 505-SarOBn)
  • Einer Lösung von Sarcosinbenzylester (0,72 g, 4,02 mMol) in Methylenchlorid (40 ml) wurde Ac2EtSF-526-NHS (1,82 g, 3,21 mMol) und 5%ige wssr. Natriumbicarbonatlösung (30 ml) zugesetzt. Das Zweiphasengemisch wurde 20 Stunden rasch gerührt. Die Schichten wurden abgetrennt und die organische Schicht wurde mit 4 x 15 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf 15 ml eingeengt. Die Lösung wurde mit Cyclohexan auf 100 ml verdünnt, mit Aktivkohle behandelt und auf 50 ml unter einem Stickstoffstrom eingeengt, was zur Ausfällung des Produkts führte. Die Filtration, gefolgt vom Lufttrocknen lieferte einen farblosen Feststoff (0,96 g, 47%).
  • Das Eindampfen zusammen mit Methylenchlorid, gefolgt vom ausgedehnten Vakuumtrocknen lieferte eine analytische Probe.
  • Anal. : Ber. für [C(36)H(41)N(1)O(9)] C 68,45, H 6,54, N 2,22.
  • Gefunden: C 68,29, H 6,70, N 2,07.
  • NMR (DMSO-d&sub6;) (Zeigt 5 : 2-Gemisch von Amidbindungsrotameren.): δ (Haupt- und Neben-) 1,049 und 1,027 (t, J = 6,8 Hz, 3H), 1,783 und 1,700 (m, 2H), 2,129 und 2,099 (s, 6H), 2,159 und 2,129 (s, 6H), 2,14 (m, 2H), 2,379 und 2,371 (s, 6H), 2,699 und 2,690 (s, 3H), 2,873 (q, J = 6,8 Hz, 2H), 3,958 und 3,976 (s, 2H), 5,075 und 5,019 (s, 2H), 7,266 und 7,233 (s, 2H) und 7,25-7,40 (m, 5H).
    • G. Herstellung von 9-(2-(N-(Methyl-N-(N'-succinimidyloxycarbonylmethyl)carboxamido)ethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy-2,4,5,7- tetramethyl-9H-xanthen (Ac2EtSF-526-Sar-NHS, Struktur 2d)
  • Einer Lösung von Ac2EtSF-526-Sar-OBn (0,96 g, 1,52 mMol) in absolutem Ethanol (40 ml) wurde 10% Palladium auf Kohle (0,10 g) zugesetzt. Das Gemisch wurde unter Wasserstoff mit Ballondruck 30 Minuten gerührt. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Ethanol wurde unter Liefern eines sirupartigen Rückstands abgezogen.
  • Dieser Rückstand wurde in Methylenchlorid (40 ml) gelöst und N- Hydroxysuccinimid (0,26 g, 2,26 mMol) und 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydrochlorid (0,59 g, 3,08 mMol) wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und anschließend mit Wasser (4 x 15 ml) gewaschen. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet, auf 15 ml eingeengt, mit Cyclohexan auf 100 ml verdünnt, mit Aktivkohle behandelt und auf ein Volumen von 50 ml unter einem Stickstoffstrom eingeengt. Das Produkt wurde durch Filtration gesammelt, luftgetrocknet und vakuumgetrocknet, um farblose Mikrokristalle (0,573 g, 59%) zu liefern.
  • Das Eindampfen zusammen mit Methylenchlorid, gefolgt vom ausgedehnten Vakuumtrocknen bei 40ºC entfernte Cyclohexanspuren und lieferte eine analytische Probe als amorpher Feststoff.
  • NMR (DMSO-d&sub6;): δ 1,043 (t, J = 6,7 Hz, 3H), 1,82 (m, 2H), 2,130 (s, 6H), 2,157 (s, 6H), 2,15 (m, 2H), 2,378 (s, 6H), 2,748 (s, 4H), 2,778 (s, 3H), 2,891 (q, J = 6,7 Hz, 2H), 4,327 (s, 2H) und 7,275 (s, 2H)
    • BEISPIEL 19 EIN ALLGEMEINES VERFAHREN ZUM KUPPELN VON ALKINYLAMINONUCLEOTI- DEN MIT N-HYDROXYSUCCINIMIDESTERN 2. HERSTELLUNG VON FLUORESZIEREND MARKIERTEN, KETTENABBRECHENDEN ALKINYLAMINONUCLEOTIDEN 34-37.
  • Das Alkinylaminonucleotidtrisphosphat 49 (10 Mikromol, aus Beispiel 3J) wurde in Wasser (0,050 ml) aufgenommen und mit Dimethylformamid (0,100 ml) verdünnt. Eine Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters 2a (12,3 mg, 21 Mikromol, 2,1 Äq., aus Beispiel 15E) in Dimethylformamid (0,100 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch wurde 4 Stunden bei 50º gerührt. Konzentriertes Ammoniumhydroxid (0,25 ml) wurde zugesetzt, das Reaktionsgefäß wurde dicht verschlossen und das Erhitzen wurde 25 Minuten bei 50 fortgesetzt. Die sich daraus ergebende rote Lösung wurde mit Wasser auf 10 ml verdünnt und auf eine Säule von DEAE-Sephadex A-25-120 (1 x 19 cm Bett), das mit 1,0 M pH 7,6 wäßrigem TEAB (50 ml) und anschließend 0,2 M pH 7,6 wäßrigem TEAB (50 ml) äquilibriert worden war, aufgebracht. Die Säule wurde mit einem linearen Gradienten aus pH 7,6 wäßrigem TEAB von 0,4 M (150 ml) bis 0,7 M (150 ml) eluiert. Die Säule wurde bei 100 ml/h betrieben, wobei alle 3 Minuten Fraktionen gesammelt wurden. Das Eluat wurde durch die Absorption bei 498 nm (40 AUFS) überwacht. Zwei geringere Nebenproduktbanden wurden zuerst eluiert, gefolgt von der stärkeren Produktbande mit Grundlinienauflösung. Die Fraktionen, von denen angenommen wurde, daß sie reines Produkt enthalten, wurden zusammengefaßt, abgezogen (T < 30º), dreimal zusammen mit absolutem Ethanol eingedampft und in Wasser (0,74 ml) aufgenommen. Die Lösung wurde durch die sichtbare Absorption (pH 8,2, 50 mMol wäßriger Tris-Puffer) bestimmt und lyophilisiert. Eine verdünnte Lösung des Produkts zeigte ein Absorptionsmaximum bei 487,5 nm. Unter der Annahme eines Absorptionskoeffizienten für das Produkt, der demjenigen des freien Farbstoffs gleich war (72600), betrug die Ausbeute an markiertem Alkinylaminonucleotid 37 4,2 Mikromol (42%).
  • Das vorstehende Verfahren erzeugte den fluoreszierend markierten Kettenterminator 37, in dem Het ein 7-Deazaguanin (k) ist. Markierte Kettenterminatoren 34 (Het ist Uracil (h)), 35 (Cytosin (i)) und 36 (7-Deazaadenosin (j)) wurden durch Kuppeln der Alkinylaminonucleotidtriphosphate 46, 42 und 51 mit den N-Hydroxysuccinimiden 2d, 2c beziehungsweise 2b hergestellt, indem ähnlichen Verfahren gefolgt wurde. Andere fluoreszierend markierte Nucleotidtriphosphate wurden ebenfalls durch dieselben Verfahren hergestellt.

Claims (12)

1. Alkinylaminonucleotid mit der Struktur:
Nuc-C -C-R&sub1;-NR&sub2;R&sub3;,
worin R&sub1; eine zweibindige Struktureinheit mit 1-20 Atomen ist,
R&sub2; und R&sub3; unabhängig H, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl oder eine Schutzgruppe sind und
Nuc R&sub4;-Het mit der Struktur
ist,
Z H oder NH&sub2; ist und
R&sub4;
ist, worin
R&sub5; H, PO&sub3;H&sub2;, P&sub2;O&sub6;H&sub3;, P&sub3;O&sub9;H&sub4; oder Salze davon ist und es gilt:
(I) wenn R&sub7; = R&sub8; = H, dann ist R-H OH, F, N&sub3; oder NH&sub2;; oder
(II) wenn R&sub7; = H und R&sub8; = OH, dann ist R&sub6; = H oder OH; oder
(III) wenn R&sub7; = OH und R&sub8; = H, dann ist R&sub6; = OH.
2. Alkinylaminonucleotid gemäß Anspruch 1, worin R&sub1; eine geradkettige C&sub1;-C&sub1;&sub0;-Alkylenstruktureinheit ist.
3. Alkinylaminonucleotid gemäß Anspruch 2, worin R&sub1; -CH&sub2;- ist.
4. Alkinylaminonucleotid gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, worin R&sub2; H ist und R&sub3; H oder eine Schutzgruppe ist.
5. Alkinylaminonucleotid gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, worin R&sub4; ein kettenbeendender Zucker ist.
6. Markiertes Alkinylaminonucleotid, worin R&sub3; in einem Alkinylaminonucleotid gemäß einem der vorstehenden Ansprüche durch eine Reportergruppe ersetzt ist.
7. Markiertes Alkinylaminonucleotid gemäß Anspruch 6, worin R&sub3; eine fluoreszierende Gruppe ist.
8. Verfahren zur Herstellung von 2-Thioalkoxy-6-alkoxy-7-iod- 7-desazapurinen, das den Schritt der Behandlung von 2- Thioalkoxy-6-alkoxy-7-desazapurinen mit N-Iodsuccinimid zur regioselektiven Einführung von Iod in die 7-Position beinhaltet.
9. Verfahren zur Herstellung von 7-(3-Amino-1-propinyl)- 2',3'-didesoxy-7-desazaguanosin-5'-triphosphat, umfassend die Schritte:
(A) in-Kontakt-Bringen von 6-Methoxy-2-methylthio-7-desazapurinmit 1-Chlor-2-desoxy-3,5-bis(O-p-toluoyl)-&alpha;- D-Ribofuranose in Gegenwart von Natriumhydrid;
(B) Hydrolysieren des Esterprodukts
von Schritt (A) unter basischen Bedingungen zum Diol
(C) Schützen der 5-OH-Position in
mit einer Tritylgruppe;
(D) Entfernen der 3-OH-Gruppe durch Reduzieren eines als Zwischenprodukt auftretenden Thionocarbonats mit einem Zinnhydrid-Reduktionsmittel;
(E) Behandeln des aus Schritt (D) resultierenden Didesoxydesazapurins
mit N-Iodsuccinimid unter Bildung des 7-Iodderivats
(F) In-Kontakt-Bringen der Verbindung
mit Natriumthiokresolat in Hexamethylphosphorsäureamid unter Bildung des 7-Desazapurin-6-ons
(G) Behandeln der Verbindung
nacheinander mit meta-Chlorperbenzoesäure und Ammoniak, wobei man das 7-Desazaguanosin
erhält;
(H) Koppeln von N-Propargyltrifluoracetamid mit der von der Schutzgruppe befreiten 7-Iodverbindung
wobei man 7-(3-Trifluoracetamido-1-propinyl)-2',3'- didesoxy-7-desazaguanosin erhält, und
(I) Umsetzen des Produkts von Schritt (H) zum 5'-Triphosphat und anschließende Entfernung der Schutzgruppe.
10. Verfahren zur Herstellung von 6-Chlor-7-iod-7-desazapurinen, das den Schritt der Behandlung von 6-Chlor-7-desazapurinen mit Iodmonochlorid zur regioselektiven Einführung von Iod in die 7-Position beinhaltet.
11. Verfahren zur Herstellung von Alkinylaminonucleotiden durch Koppeln von Iodnucleotiden, die ein an ein Kohlenstoffatom innerhalb der heterocyclischen Base gebundenes Iodatom besitzen, mit terminalen Alkinylaminen unter Verwendung eines Palladiumverbindung/Kupfer(I)iodid-Katalysators, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Tetrakis- (triphenylphosphin)palladium(O)/Kupfer(I)iodid-Katalysators.
12. 7-Iodnucleotide mit der Struktur
worin Z und R&sub4; wie in Anspruch 1 definiert sind.
DE3750792T 1986-07-02 1987-07-01 Alkynylamino-nukleotide. Expired - Lifetime DE3750792T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US88137286A 1986-07-02 1986-07-02
US07/057,565 US5047519A (en) 1986-07-02 1987-06-12 Alkynylamino-nucleotides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3750792D1 DE3750792D1 (de) 1995-01-12
DE3750792T2 true DE3750792T2 (de) 1995-05-04

Family

ID=26736630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3750792T Expired - Lifetime DE3750792T2 (de) 1986-07-02 1987-07-01 Alkynylamino-nukleotide.

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5047519A (de)
EP (1) EP0251786B1 (de)
JP (1) JPH085908B2 (de)
KR (1) KR960001528B1 (de)
AT (1) ATE114651T1 (de)
CA (1) CA1340022C (de)
DE (1) DE3750792T2 (de)
DK (3) DK337587A (de)
ES (1) ES2066760T3 (de)
GR (1) GR3015197T3 (de)
IE (1) IE68058B1 (de)
NO (1) NO171981C (de)
PT (1) PT85237B (de)

Families Citing this family (237)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2990920A (en) * 1958-01-21 1961-07-04 Republic Steel Corp Structural building elements
US3003600A (en) * 1958-04-10 1961-10-10 James A Mackenzie Constructional element
US3355848A (en) * 1964-12-30 1967-12-05 Logan Co Adjustable partitions
US5863403A (en) * 1984-03-29 1999-01-26 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Digital DNA typing
US6004446A (en) * 1984-03-29 1999-12-21 Li-Cor, Inc. DNA Sequencing
US5571388A (en) * 1984-03-29 1996-11-05 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescense labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels thereof
US4729947A (en) * 1984-03-29 1988-03-08 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska DNA sequencing
US5360523A (en) * 1984-03-29 1994-11-01 Li-Cor, Inc. DNA sequencing
US6086737A (en) * 1984-03-29 2000-07-11 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescence labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels therefor
US6207421B1 (en) 1984-03-29 2001-03-27 Li-Cor, Inc. DNA sequencing and DNA terminators
US5151507A (en) * 1986-07-02 1992-09-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US5047519A (en) * 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US5242796A (en) * 1986-07-02 1993-09-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method, system and reagents for DNA sequencing
US6211158B1 (en) 1987-04-10 2001-04-03 Roche Diagnostics Gmbh Desazapurine-nucleotide derivatives, processes for the preparation thereof, pharmaceutical compositions containing them and the use thereof for nucleic acid sequencing and as antiviral agents
DE3739366A1 (de) * 1987-04-10 1988-10-27 Boehringer Mannheim Gmbh Desaza-purin-nucleosid-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung bei der nucleinsaeure-sequenzierung sowie als antivirale mittel
JP2828642B2 (ja) * 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
DE3807975C2 (de) * 1988-03-10 2002-03-07 Karl Otto Greulich Verfahren zur optischen Charakterisierung von Nukleinsäuren und Oligonukleotiden
JPH0217199A (ja) * 1988-07-05 1990-01-22 Japan Tobacco Inc ２’−デオキシ−β−アデノシンの製造方法
US5708154A (en) * 1989-02-24 1998-01-13 City Of Hope RNA-DNA hybrid molecules of nucleic acid
US5292873A (en) * 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5432272A (en) * 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
DE4102289A1 (de) * 1991-01-26 1992-07-30 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von (hetero)arylalk(en/in)-ylaminen und neue (hetero)arylkinylamine
US5221611A (en) * 1991-06-19 1993-06-22 Sigma Chemical Company Ddi immunoassays, derivatives, conjugates and antibodies
US5371241A (en) * 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5594121A (en) * 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
TW393513B (en) * 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5254687A (en) 1991-12-04 1993-10-19 The Trustees Of Princeton University Process for the preparation of pyrrolo[2,3-d]pyrimidines
US5658751A (en) * 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
AU6632094A (en) * 1993-04-19 1994-11-08 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5428149A (en) * 1993-06-14 1995-06-27 Washington State University Research Foundation Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products
US5719273A (en) * 1993-06-14 1998-02-17 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Palladium catalyzed nucleoside modifications methods using nucleophiles and carbon monoxide
US5580972A (en) * 1993-06-14 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Purine nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
DE4326466A1 (de) * 1993-08-06 1995-02-09 Boehringer Mannheim Gmbh Infrarot-Farbstoff-markierte Nucleotide und ihre Verwendung in der Nucleinsäure-Detektion
DE4438918A1 (de) * 1994-11-04 1996-05-09 Hoechst Ag Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
US6150510A (en) 1995-11-06 2000-11-21 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Modified oligonucleotides, their preparation and their use
US5808043A (en) * 1995-01-18 1998-09-15 Pharmacia Biotech Inc. Composition for stabilization of labelled nucleoside triphosphates and methods for using same
US5576197A (en) * 1995-04-07 1996-11-19 Molecular Bio-Products Polymerase chain reaction container and methods of using the same
US5798276A (en) 1995-06-07 1998-08-25 Molecular Probes, Inc. Reactive derivatives of sulforhodamine 101 with enhanced hydrolytic stability
US6004536A (en) * 1995-11-14 1999-12-21 Molecular Probes, Inc. Lipophilic cyanine dyes with enchanced aqueous solubilty
US5700921A (en) * 1995-11-27 1997-12-23 Vector Laboratories Labeling nucleic acids
US6027890A (en) 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US6613508B1 (en) 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
US6312893B1 (en) 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US5959100A (en) 1996-03-27 1999-09-28 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Pyrimidine nucleosides as therapeutic and diagnostic agents
US6020481A (en) * 1996-04-01 2000-02-01 The Perkin-Elmer Corporation Asymmetric benzoxanthene dyes
US6162931A (en) 1996-04-12 2000-12-19 Molecular Probes, Inc. Fluorinated xanthene derivatives
US5945527A (en) * 1996-05-30 1999-08-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Palladium catalyzed nucleoside modification methods using nucleophiles and carbon monoxide
US5846737A (en) * 1996-07-26 1998-12-08 Molecular Probes, Inc. Conjugates of sulforhodamine fluorophores with enhanced fluorescence
US5821356A (en) * 1996-08-12 1998-10-13 The Perkin Elmer Corporation Propargylethoxyamino nucleotides
US5696157A (en) * 1996-11-15 1997-12-09 Molecular Probes, Inc. Sulfonated derivatives of 7-aminocoumarin
US6027709A (en) * 1997-01-10 2000-02-22 Li-Cor Inc. Fluorescent cyanine dyes
EP1009802B1 (de) 1997-02-12 2004-08-11 Eugene Y. Chan Verfahren zur analyse von polymeren
EP0983364B1 (de) 1997-03-12 2002-06-12 PE Corporation (NY) Dna polymerasen, die verbesserte fähigkeiten zum einbau markierter nukleotide besitzen
EP0866070A1 (de) * 1997-03-20 1998-09-23 Amersham Pharmacia Biotech Inc Derivate von 7-Deaza-2'-Deoxy-Guanosin-5'-Triphosphate, Herstellung und Verwendung davon
US5770716A (en) * 1997-04-10 1998-06-23 The Perkin-Elmer Corporation Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same
GB9708611D0 (en) * 1997-04-28 1997-06-18 Univ Cardiff Chemical compounds
JP3489991B2 (ja) * 1997-07-07 2004-01-26 理化学研究所 ３’−デオキシリボヌクレオチド誘導体
US6130101A (en) * 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
US6653462B2 (en) 1998-05-29 2003-11-25 Applera Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US5948648A (en) * 1998-05-29 1999-09-07 Khan; Shaheer H. Nucleotide compounds including a rigid linker
US6096875A (en) * 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6117986A (en) * 1998-06-10 2000-09-12 Intergen Company, L.P. Pyrimidines linked to a quencher
US6110630A (en) * 1998-06-18 2000-08-29 Beckman Coulter, Inc. Efficient activated cyanine dyes
US6743605B1 (en) 1998-06-24 2004-06-01 Enzo Life Sciences, Inc. Linear amplification of specific nucleic acid sequences
US8445664B2 (en) * 1998-06-24 2013-05-21 Enzo Diagnostics, Inc. Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences
US6716394B2 (en) 1998-08-11 2004-04-06 Caliper Technologies Corp. DNA sequencing using multiple fluorescent labels being distinguishable by their decay times
US6447724B1 (en) 1998-08-11 2002-09-10 Caliper Technologies Corp. DNA sequencing using multiple fluorescent labels being distinguishable by their decay times
US6288221B1 (en) 1998-08-20 2001-09-11 Duke University Methods of synthesis of halogen base-modified oligonucleotides and subsequent labeling with a metal-catalyzed reaction
US6020483A (en) 1998-09-25 2000-02-01 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
US6232075B1 (en) 1998-12-14 2001-05-15 Li-Cor, Inc. Heterogeneous assay for pyrophosphate detection
US6515113B2 (en) * 1999-02-18 2003-02-04 The Regents Of The University Of California Phthalamide lanthanide complexes for use as luminescent markers
DE60001531T2 (de) 1999-04-23 2003-10-02 Molecular Probes, Inc. Xanthenfarbstoffe und ihre anwendung als lumineszenzlöschende verbindungen
US6664047B1 (en) 1999-04-30 2003-12-16 Molecular Probes, Inc. Aza-benzazolium containing cyanine dyes
US6750357B1 (en) 1999-06-25 2004-06-15 Syngen, Inc. Rhodamine-based fluorophores useful as labeling reagents
US6982146B1 (en) * 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
WO2001023411A2 (en) * 1999-09-30 2001-04-05 New England Biolabs, Inc. Incorporation of modified nucleotides by archaeon dna polymerases and related methods
US6221604B1 (en) 2000-02-07 2001-04-24 Pe Corporation Electron-deficient nitrogen heterocycle-substituted fluorescein dyes
US6686461B1 (en) * 2000-03-22 2004-02-03 Solulink Bioscience, Inc. Triphosphate oligonucleotide modification reagents and uses thereof
US7019129B1 (en) 2000-05-09 2006-03-28 Biosearch Technologies, Inc. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
US6936702B2 (en) 2000-06-07 2005-08-30 Li-Cor, Inc. Charge-switch nucleotides
JP2004516810A (ja) 2000-06-07 2004-06-10 リ−コール インコーポレーティッド 電荷スイッチヌクレオチド
US6869764B2 (en) 2000-06-07 2005-03-22 L--Cor, Inc. Nucleic acid sequencing using charge-switch nucleotides
US7169922B2 (en) * 2000-08-04 2007-01-30 Invitrogen Corporation Derivatives of 1,2-dihydro-7-hydroxyquinolines containing fused rings
AU7918501A (en) 2000-08-04 2002-02-18 Molecular Probes Inc Derivatives of 1,2-dihydro-7-hydroxyquinolines containing fused rings
CA2423806C (en) * 2000-09-29 2009-12-22 Molecular Probes, Inc. Modified carbocyanine dyes and their conjugates
EP1337541B1 (de) 2000-10-06 2007-03-07 The Trustees of Columbia University in the City of New York Massives Parallelverfahren zur Dekodierung von DNA und RNA
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
ATE431355T1 (de) * 2000-10-11 2009-05-15 Applera Corp Fluoreszierende nukleobasekonjugate mit anionische linker
WO2002044425A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US20020136772A1 (en) * 2001-03-26 2002-09-26 Tai-Nang Huang Polymer synthesis
US20040013573A1 (en) * 2001-03-26 2004-01-22 Tai-Nang Huang Polymer synthesis apparatus
CA2443894A1 (en) * 2001-04-11 2002-10-24 Charlie Xiang Modified random primers for probe labeling
US20030170675A1 (en) * 2001-04-11 2003-09-11 The Gov't Of The U.S Of America As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. Methods of manipulating nucleic acids
US7118907B2 (en) * 2001-06-06 2006-10-10 Li-Cor, Inc. Single molecule detection systems and methods
US20060234231A1 (en) * 2001-06-20 2006-10-19 Nuevolution A/S Microarrays displaying encoded molecules
WO2002102820A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
US9261460B2 (en) * 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
US20050032060A1 (en) * 2001-08-31 2005-02-10 Shishir Shah Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays
US20050042629A1 (en) 2002-09-13 2005-02-24 Applera Corporation Thermus scotoductus nucleic acid polymerases
AU2002367886B8 (en) 2001-10-12 2008-08-14 Perkinelmer Las, Inc. Compilations of nucleic acids and arrays and methods of using them
US7439346B2 (en) 2001-10-12 2008-10-21 Perkinelmer Las Inc. Nucleic acids arrays and methods of use therefor
AU2002346498A1 (en) 2001-11-30 2003-06-17 Applera Corporation Thermus brockianus nucleic acid polymerases
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
DE20200926U1 (de) * 2002-01-23 2002-04-18 Hegenscheidt-MFD GmbH & Co. KG, 41812 Erkelenz Festwalzgerät einer Festwalzmaschine für Kurbelwellen
US7166478B2 (en) * 2002-03-12 2007-01-23 Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses
US9353405B2 (en) 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
EP1487978B1 (de) * 2002-03-15 2008-11-19 Nuevolution A/S Eine verbesserte methode zur synthese von matritzenabhängigen molekülen
WO2003078626A2 (en) * 2002-03-15 2003-09-25 Nuevolution A/S A building block capable of transferring a functional entity
US6916621B2 (en) 2002-03-27 2005-07-12 Spectral Genomics, Inc. Methods for array-based comparitive binding assays
US7118871B2 (en) * 2002-04-22 2006-10-10 Lawler Joseph F Reagents for monitoring nucleic acid amplification and methods of using same
EP1539980B1 (de) * 2002-08-01 2016-02-17 Nuevolution A/S MEHRSTUFENSYNTHESE VON MIT MATRIZEN ASSOZIIERTE MOLEKüLEN
US11008359B2 (en) 2002-08-23 2021-05-18 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
SI3363809T1 (sl) 2002-08-23 2020-08-31 Illumina Cambridge Limited Modificirani nukleotidi za polinukleotidno sekvenciranje
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
AU2003270619A1 (en) * 2002-09-12 2004-04-30 Molecular Probes, Inc. Site-specific labeling of affinity tags in fusion proteins
US8791053B2 (en) * 2002-09-27 2014-07-29 Mpm-Holding Aps Spatially encoded polymer matrix
AU2003273792B2 (en) 2002-10-30 2011-07-07 Nuevolution A/S Method for the synthesis of a bifunctional complex
EP2175019A3 (de) 2002-12-19 2011-04-06 Nuevolution A/S Durch Quasizufallsstrukturen und Funktionen geführte Synthesemethoden
WO2004074429A2 (en) 2003-02-21 2004-09-02 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
WO2004092327A2 (en) * 2003-04-11 2004-10-28 Applera Corporation Method of generating size standard nucleic acids
US20070048761A1 (en) * 2005-05-20 2007-03-01 Applied Dna Sciences, Inc. System and method for authenticating multiple components associated with a particular product
US8372648B2 (en) 2003-04-16 2013-02-12 APDN (B.V.I.), Inc. Optical reporter compositions
US20100285985A1 (en) * 2003-04-15 2010-11-11 Applied Dna Sciences, Inc. Methods and Systems for the Generation of Plurality of Security Markers and the Detection Therof
US20090286250A1 (en) * 2006-05-19 2009-11-19 James Arthur Hayward Incorporating soluble security markers into cyanoacrylate solutions
US8415165B2 (en) * 2003-04-16 2013-04-09 APDN (B.V.I.), Inc. System and method for authenticating sports identification goods
US8124333B2 (en) * 2003-04-16 2012-02-28 APDN, Inc. Methods for covalent linking of optical reporters
US8420400B2 (en) * 2003-04-16 2013-04-16 APDN (B.V.I.), Inc. System and method for authenticating tablets
US8426216B2 (en) * 2003-04-16 2013-04-23 APDN (B.V.I.), Inc. Methods for authenticating articles with optical reporters
US8415164B2 (en) * 2003-04-16 2013-04-09 Apdn (B.V.I.) Inc. System and method for secure document printing and detection
US20050250214A1 (en) * 2004-05-05 2005-11-10 Gee Kyle R Zinc binding compounds and their method of use
CA2445420A1 (en) 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
US7727752B2 (en) 2003-07-29 2010-06-01 Life Technologies Corporation Kinase and phosphatase assays
US7619059B2 (en) 2003-07-29 2009-11-17 Life Technologies Corporation Bimolecular optical probes
WO2005012579A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-10 Molecular Probes, Inc. Homodimeric cyanine dye dimer comprising aromatic, heteroaromatic, cyclic or heterocyclic linker moiety in nucleic acid reporter molecules
US7271265B2 (en) * 2003-08-11 2007-09-18 Invitrogen Corporation Cyanine compounds and their application as quenching compounds
ITPZ20030002A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Giuseppe Caputo Composti del tipo cianina aventi un braccio di legame alchinilico
DE602004023960D1 (de) * 2003-09-18 2009-12-17 Nuevolution As Methode zur Gewinnung struktureller Informationen kodierter Moleküle und zur Selektion von Verbindungen
US20070212689A1 (en) * 2003-10-30 2007-09-13 Bianchi Diana W Prenatal Diagnosis Using Cell-Free Fetal DNA in Amniotic Fluid
WO2005042504A1 (en) * 2003-10-31 2005-05-12 Molecular Probes, Inc. Fluorinated resorufin compounds and their application in detecting hydrogen peroxide
US8637650B2 (en) 2003-11-05 2014-01-28 Genovoxx Gmbh Macromolecular nucleotide compounds and methods for using the same
US20050214807A1 (en) * 2003-11-19 2005-09-29 Iain Johnson Environmental sensitive fluorogenic compounds and their application for singlet oxygen and protein detection
US7776529B2 (en) 2003-12-05 2010-08-17 Life Technologies Corporation Methine-substituted cyanine dye compounds
WO2005056687A2 (en) 2003-12-05 2005-06-23 Molecular Probes, Inc. Methine-substituted cyanine dye compounds
EP1720944B1 (de) 2003-12-05 2013-07-17 Life Technologies Corporation Cyanin farbstoffverbindungen
US20050123935A1 (en) * 2003-12-09 2005-06-09 Richard Haugland Pyrenyloxysulfonic acid fluorescent agents
US8039642B2 (en) 2003-12-09 2011-10-18 Life Technologies Corporation Pyrenyloxysulfonic acid fluorescent agents
WO2006001835A2 (en) * 2003-12-30 2006-01-05 The Regents Of The University Of California Aromatic triamide-lanthanide complexes
US20050227309A1 (en) 2004-01-21 2005-10-13 Corry Schuyler B Optically-detectable enzyme substrates and their method of use
US20090239211A1 (en) * 2004-02-17 2009-09-24 Nuevolution A/S Method For Enrichment Involving Elimination By Mismatch Hybridisation
WO2006023231A2 (en) 2004-07-27 2006-03-02 Molecular Probes, Inc. Fluorescent metal ion indicators with large stokes shift
CA2581174A1 (en) 2004-09-16 2006-03-30 Applera Corporation Fluorescent dye compounds, conjugates and uses thereof
JP5306811B2 (ja) 2005-05-11 2013-10-02 ライフ テクノロジーズ コーポレーション ２本鎖ｄｎａへの高い選択性を有する蛍光化学物質及びそれらの使用
US7584947B2 (en) * 2005-05-20 2009-09-08 The Boeing Company Reconfigurable workpiece support fixture
US7737281B2 (en) * 2005-05-24 2010-06-15 Enzo Life Sciences, Inc. C/O Enzo Biochem, Inc. Purine based fluorescent dyes
US7569695B2 (en) * 2005-05-24 2009-08-04 Enzo Life Sciences, Inc. Dyes for the detection or quantification of desirable target molecules
US8357801B2 (en) 2005-05-24 2013-01-22 Enzo Life Sciences, Inc. Labeling of target molecules, identification of organelles and other applications, novel compositions, methods and kits
US9169510B2 (en) 2005-06-21 2015-10-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compositions
WO2007030521A1 (en) * 2005-09-06 2007-03-15 Invitrogen Corporation Control of chemical modification
EP1928822B1 (de) 2005-09-26 2013-02-27 Life Technologies Corporation Durch violette laser anregbare farbstoffe und verfahren zu ihrer anwendung
US7842823B2 (en) * 2005-10-27 2010-11-30 The Regents Of The University Of California Fluorogenic probes for reactive oxygen species
US7982029B2 (en) 2005-10-31 2011-07-19 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthesis of four color 3′O-allyl, modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods
WO2007053719A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chemically cleavable 3'-o-allyl-dntp-allyl-fluorophore fluorescent nucleotide analogues and related methods
WO2007062664A2 (en) 2005-12-01 2007-06-07 Nuevolution A/S Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries
WO2007070572A2 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Probe for nucleic acid sequencing and methods of use
US8703734B2 (en) 2005-12-12 2014-04-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nanoprobes for detection or modification of molecules
US20090233280A1 (en) * 2005-12-28 2009-09-17 Canon Kabushiki Kaisha Method of acquiring information regarding base sequence and information reading device for the same
US7521577B2 (en) * 2006-01-12 2009-04-21 Molecular Probes, Inc. Heavy metal binding compounds and their method of use
US8114636B2 (en) 2006-02-10 2012-02-14 Life Technologies Corporation Labeling and detection of nucleic acids
US20070249014A1 (en) * 2006-02-10 2007-10-25 Invitrogen Corporation Labeling and detection of post translationally modified proteins
US7482444B2 (en) 2006-03-13 2009-01-27 Wallac Oy Terminating substrates for DNA polymerases
FI20065162A0 (fi) * 2006-03-13 2006-03-13 Wallac Oy Terminoivia DNA polymeraasisubstraatteja
US9790538B2 (en) 2013-03-07 2017-10-17 Apdn (B.V.I.) Inc. Alkaline activation for immobilization of DNA taggants
US10741034B2 (en) 2006-05-19 2020-08-11 Apdn (B.V.I.) Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
US20140106357A1 (en) 2012-10-16 2014-04-17 Applied Dna Sciences, Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
US8329011B2 (en) 2006-06-20 2012-12-11 Canon Kabushiki Kaisha Polymerase-immobilized electrode
AU2007272604B2 (en) 2006-07-10 2013-08-01 The Regents Of The University Of California Luminescent 1-hydroxy-2-pyridinone chelates of lanthanides
CA2660800C (en) * 2006-08-15 2016-03-01 The Regents Of The University Of California Luminescent macrocyclic lanthanide complexes
EP2064290B1 (de) 2006-10-27 2013-10-09 Life Technologies Corporation Fluorgene ph-sensitive farbstoffe und ihre verwendung
WO2008069973A2 (en) 2006-12-01 2008-06-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Four-color dna sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US7947447B2 (en) 2007-01-16 2011-05-24 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
EP2114905B1 (de) 2007-01-25 2015-04-15 Lumiphore, Inc. Mehrfarbige zeitgesteuerte fluorophore auf basis makrozyklischer lanthanid-komplexe
US8586743B2 (en) * 2007-01-30 2013-11-19 Life Technologies Corporation Labeling reagents and methods of their use
US8404830B2 (en) * 2007-07-17 2013-03-26 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
EP2176277B1 (de) * 2007-07-19 2016-02-24 Georgia State University Research Foundation, Inc. Nukleotide und aptamere, die boronsäuregruppen mit bevorzugter bindung an glykosylierte proteine enthalten, und anwendungen davon
WO2009018112A2 (en) * 2007-07-27 2009-02-05 Invitrogen Corporation The use of novel coumarins as glutathione and thiol labels
CA2694030A1 (en) 2007-07-31 2008-12-18 Nitto Kasei Co., Ltd. Composition for measuring the binding affinity between nucleic acid and test substance, and use thereof
EP3431615A3 (de) 2007-10-19 2019-02-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna-sequenzierung mit nichtfluoreszierenden, reversiblen nukleotidterminatoren und spaltbaren, etikettmodifizierten nukleotidterminatoren
EP2223086B2 (de) * 2007-12-14 2016-06-01 Biotium Inc. Fluoreszenzverbindungen - markierungsfarbstoffe
US8772487B2 (en) 2008-01-24 2014-07-08 Life Technologies Corporation Fluorogenic hydrazine-substituted compounds
SI2757091T1 (en) * 2008-04-01 2018-01-31 Biosearch Technologies, Inc. Stabilized nucleic acid black gas-fluorofor probe
US8791258B2 (en) * 2008-06-10 2014-07-29 The Regents Of The University Of California Pro-fluorescent probes
US20100151591A1 (en) * 2008-10-31 2010-06-17 Butlin Nathaniel G Rapid homogeneous diagnostic testing platform based on lanthanide fluorescent resonance energy transfer
US8940485B2 (en) 2008-11-12 2015-01-27 Apdn (B.V.I.) Inc. Methods for genotyping mature cotton fibers and textiles
US8669079B2 (en) 2008-11-12 2014-03-11 Cara Therapeutics, Inc. Methods for genetic analysis of textiles made of Gossypium barbadense and Gossypium hirsutum cotton
US8431416B2 (en) 2009-04-01 2013-04-30 Becton, Dickinson And Company Reactive heterocycle-substituted 7-hydroxycoumarins and their conjugates
EP2816038B8 (de) 2009-08-24 2019-12-25 Lumiphore, Inc. Hopo-chelatoren
US8309059B2 (en) * 2009-08-31 2012-11-13 Promega Corporation Reactive cyanine compounds
WO2011050938A1 (de) 2009-10-26 2011-05-05 Genovoxx Gmbh Konjugate von nukleotiden und methoden zu deren anwendung
US8658434B2 (en) * 2009-10-28 2014-02-25 Biotium, Inc. Fluorescent pyrene compounds
US9579402B2 (en) * 2009-12-04 2017-02-28 Biotium, Inc. Heterocycle-substituted xanthene dyes
WO2011079291A1 (en) * 2009-12-24 2011-06-30 Lumiphore, Inc. Radiopharmaceutical complexes
JP6012591B2 (ja) 2010-04-12 2016-10-26 ソマロジック, インコーポレイテッドSomaLogic, Inc. β−ＮＧＦに対するアプタマー及びβ−ＮＧＦ介在疾患及び障害の治療におけるその使用
EP3540059A1 (de) 2010-04-16 2019-09-18 Nuevolution A/S Bifunktionelle komplexe und verfahren zur herstellung sowie verwendung derartiger komplexe
US9206216B2 (en) 2010-04-21 2015-12-08 Pierce Biotechnology, Inc. Modified nucleotides methods and kits
US8536323B2 (en) 2010-04-21 2013-09-17 Pierce Biotechnology, Inc. Modified nucleotides
US8623324B2 (en) 2010-07-21 2014-01-07 Aat Bioquest Inc. Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates
US9145361B2 (en) 2011-03-25 2015-09-29 Life Technologies Corporation SDP-containing heterobifunctional agents
DE102012008375A1 (de) 2011-04-27 2012-10-31 Genovoxx Gmbh Methoden und Komponenten zur Detektion von Nukleinsäureketten
US20150086981A1 (en) 2011-05-04 2015-03-26 Genovoxx Gmbh Nucleoside-triphosphate conjugate and methods for the use thereof
WO2012162429A2 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection
US9416153B2 (en) 2011-10-11 2016-08-16 Enzo Life Sciences, Inc. Fluorescent dyes
CN104640933A (zh) 2012-05-30 2015-05-20 生命科技公司 荧光pH敏感性染料和其使用方法
US9297032B2 (en) 2012-10-10 2016-03-29 Apdn (B.V.I.) Inc. Use of perturbants to facilitate incorporation and recovery of taggants from polymerized coatings
US9266370B2 (en) 2012-10-10 2016-02-23 Apdn (B.V.I) Inc. DNA marking of previously undistinguished items for traceability
US9963740B2 (en) 2013-03-07 2018-05-08 APDN (B.V.I.), Inc. Method and device for marking articles
WO2014144883A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
KR102230831B1 (ko) 2013-03-15 2021-03-22 일루미나 케임브리지 리미티드 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드
US11453652B2 (en) 2013-03-15 2022-09-27 Lumiphore, Inc. Di-macrocycles
US9904734B2 (en) 2013-10-07 2018-02-27 Apdn (B.V.I.) Inc. Multimode image and spectral reader
CN105658658B (zh) 2013-11-21 2019-11-05 私募蛋白质体公司 胞苷-5-甲酰胺修饰的核苷酸组合物及其相关方法
US9372194B2 (en) 2013-12-23 2016-06-21 Ramdas Pai Fluorescent dyes, labeled conjugates and analytical methods
US10745825B2 (en) 2014-03-18 2020-08-18 Apdn (B.V.I.) Inc. Encrypted optical markers for security applications
ES2978925T3 (es) 2014-03-18 2024-09-23 Apdn B V I Inc Marcadores ópticos cifrados para aplicaciones de seguridad
EP3143022B1 (de) 2014-05-16 2021-12-22 Life Technologies Corporation Als diagnostische hilfsmittel geeignete carbopyrononverbindungen
US20170044372A1 (en) 2014-05-16 2017-02-16 Life Technologiies Corporation Cell tracking reagents and their methods of use
WO2016090076A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Life Technologies Corporation Hydrazinyl and aminooxy compounds and their methods of use
US10760182B2 (en) 2014-12-16 2020-09-01 Apdn (B.V.I.) Inc. Method and device for marking fibrous materials
WO2016209753A1 (en) 2015-06-26 2016-12-29 Life Technologies Corporation Cell tracking reagents and their methods of use
KR20180136436A (ko) 2016-03-28 2018-12-24 에이에이티 바이오퀘스트, 인코포레이티드 폴리플루오레노[4,5-cde]옥세핀 접합체 및 피분석물 검출 방법에서의 이의 용도
US10519605B2 (en) 2016-04-11 2019-12-31 APDN (B.V.I.), Inc. Method of marking cellulosic products
WO2017223147A1 (en) 2016-06-23 2017-12-28 Life Technologies Corporation Methods and compositions for detecting or measuring caspases or apoptosis
US10995371B2 (en) 2016-10-13 2021-05-04 Apdn (B.V.I.) Inc. Composition and method of DNA marking elastomeric material
US10920274B2 (en) 2017-02-21 2021-02-16 Apdn (B.V.I.) Inc. Nucleic acid coated submicron particles for authentication
US20210324198A1 (en) 2018-08-10 2021-10-21 Life Technologies Corporation Silicon-substituted rhodamine dyes and dye conjugates
US11220628B2 (en) 2019-02-20 2022-01-11 Aat Bioquest, Inc. Condensed polycyclic conjugated polymers and their use for biological detection
WO2021154933A1 (en) 2020-01-30 2021-08-05 Aat Bioquest, Inc. Uv excitable polyfluorene based conjugates and their use in methods of analyte detection

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US57566A (en) * 1866-08-28 Improved car-coupling
AU596068B2 (en) * 1983-02-22 1990-04-26 Syngene, Inc. Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis
US5047519A (en) * 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
CA1340806C (en) * 1986-07-02 1999-11-02 James Merrill Prober Method, system and reagents for dna sequencing
JP2828642B2 (ja) * 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体

Also Published As

Publication number Publication date
ES2066760T3 (es) 1995-03-16
DK82093D0 (da) 1993-07-07
IE871756L (en) 1988-01-02
CA1340022C (en) 1998-09-01
NO872757D0 (no) 1987-07-01
EP0251786A3 (en) 1989-12-06
DK337587A (da) 1988-01-03
KR880000408A (ko) 1988-03-25
GR3015197T3 (en) 1995-05-31
PT85237A (en) 1987-08-01
NO171981C (no) 1993-05-26
DK337587D0 (da) 1987-07-01
KR960001528B1 (ko) 1996-02-01
IE68058B1 (en) 1996-05-15
EP0251786A2 (de) 1988-01-07
ATE114651T1 (de) 1994-12-15
JPS63152364A (ja) 1988-06-24
DK81993A (da) 1993-07-07
NO872757L (no) 1988-01-04
PT85237B (pt) 1990-03-30
DK82093A (da) 1993-07-07
NO171981B (no) 1993-02-15
DK81993D0 (da) 1993-07-07
US5047519A (en) 1991-09-10
JPH085908B2 (ja) 1996-01-24
EP0251786B1 (de) 1994-11-30
DE3750792D1 (de) 1995-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3750792T2 (de) Alkynylamino-nukleotide.
DE3750996T2 (de) Verfahren und Reagentien zur DNS-Sequenzierung.
US5151507A (en) Alkynylamino-nucleotides
US5625081A (en) Fluorescent dye intermediates
DE69503129T2 (de) Pteridin-nukleotidderivate als fluoreszierende sonden
DE60105258T2 (de) Mobilitaetsveraendernde cyaninfarbstoffe
DE3750080T2 (de) Deoxyribonucleosid-phosphoramidite und deren verwendung zur hertellung von oligonukleotiden.
DE3854176T2 (de) Verfahren zur Genkartierung.
DE69700303T2 (de) Asymmetrische benzoxanthenfarbstoffe
DE69930647T2 (de) Struktur-analoga von amin-basen und nucleosiden
EP0797580B1 (de) Nucleosid-derivate mit photolabilen schutzgruppen
Sasaki et al. Search for a simpler synthetic model system for intramolecular 1, 3-dipolar cycloaddition to the 5, 6-double bond of a pyrimidine nucleoside
DE3887273T2 (de) 2&#39;,3&#39;-Dideoxy-2&#39;-fluornucleoside.
KR20140067113A (ko) 핵산 시퀀싱을 위하여 5-메톡시, 3&#39;&#39;-oh 차단안된, 신속하게 광절단가능한 종료 뉴클레오티드 및 핵산 시퀀싱 방법
JPS6345289A (ja) プリンおよびピリミジン塩基のｎ−ホスホニルメトキシアルキル誘導体
DE19509038A1 (de) C-Nukleosid-Derivate und deren Verwendung in der Detektion von Nukleinsäuren
DE69723057T2 (de) Nukleosid analogen
DE68906890T2 (de) Nukleoside derivate, nützlich für die synthese von markierten oligonukleotiden, mit diesen derivaten hergestellte oligonukleotide und ihre synthese.
DE60123056T2 (de) Basenanaloge
DE1620292A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Nucleotidderivaten
DE1795075A1 (de) Arabinofuranosyl-Nucleoside und Zwischenprodukte
Goldman et al. Formation of 5-and 6-aminocytosine nucleosides and nucleotides from the corresponding 5-bromocytosine derivatives: synthesis and reaction mechanism
KR960005720B1 (ko) 알키닐 아미노 누클레오티드의 제조 방법
FUJII et al. Purines. IV. O→ N (9) Alkyl Migration in the Alkylation of 1-Alkoxyadenines
DD232492A1 (de) Verfahren zur herstellung von nucleosidanalogen 6-amino-substituierten thymin-derivaten

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: NEN LIFE SCIENCE PRODUCTS, INC.(N.D.GES.DES STAATE