KR102230831B1 - 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 - Google Patents

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Abstract

본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 신규한 3'-하이드록시 보호기를 가진 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 분자에 관한 것이다. 상기 3'-하이드록시 보호기는 3'-탄소 원자에 공유 부착된 구조 -O-C(R)2N3를 형성하며, 여기서 R은 청구범위에 정의된 바와 같다. 또한 본 명세서에서는 이러한 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 분자를 제조하는 방법 및 이러한 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 분자를 이용하는 합성 과정에 의한 서열분석 방법이 제공된다.

Description

변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드{MODIFIED NUCLEOSIDES OR NUCLEOTIDES}
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 3'-하이드록시 보호기를 포함하는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드, 및 폴리뉴클레오타이드 서열분석 방법에서의 그들의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 3'-하이드록시 보호된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
분자의 연구에서의 진전은, 부분적으로는, 분자 또는 그들의 생물학적 반응을 특성 규명하는데 이용되는 기술에서의 개선에 의해 초래되었다. 특히, 핵산 DNA 및 RNA의 연구는 서열 분석 및 혼성화 이벤트의 연구를 위하여 이용되는 기술의 개발로부터 이익을 얻었다.
핵산의 연구를 개선시킨 기술의 일례는 고정된 핵산의 제작된 어레이(array)들의 개발이다. 이들 어레이는 전형적으로 고체 지지 재료 상에 고정된 폴리뉴클레오타이드의 고밀도 매트릭스로 구성된다. 이에 대해서는, 예컨대, 문헌[Fodor et al., Trends Biotech. 12: 19-26, 1994]을 참조하면 되며, 이 문헌은 적절하게 변형된 뉴클레오타이드 포스포라미다이트의 부착을 허용하도록 규정된 영역에 노출되지만 마스크에 의해 보호된 화학적으로 민감화된 유리 표면을 이용해서 핵산을 조립하는 방식을 기술하고 있다. 제작된 어레이는 또는 소정의 위치에서 고체 지지체 상에 "스포팅"(spotting) 공지된 폴리뉴클레오타이드의 수법에 의해 제작될 수 있다(예컨대, 문헌[Stimpson et al., Proc . Natl . Acad . Sci. 92: 6379-6383, 1995]).
어레이에 결합된 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 하나의 방식은 "합성에 의한 서열분석"(sequencing by synthesis) 또는 "SBS"라 불린다. DNA의 서열을 결정하는 이 수법은 이상적으로는 서열분석 중인 핵산 반대쪽에 올바른 상보적인 뉴클레오타이드의 제어된(즉, 한번에 하나) 혼입을 요구한다. 이것은 각 뉴클레오타이드 잔기가 한번에 하나씩 서열분석되므로 다수 사이클에서 뉴클레오타이드를 부가함으로써 정확한 서열분석을 허용하며, 이에 따라서 제어되지 않은 일련의 혼입이 일어나는 것을 방지한다. 혼입된 뉴클레오타이드는 표지 모이어티의 제거 및 그 후속 회의 서열분석 전에 이에 부착된 적절한 표지를 이용해서 판독된다.
단지 단일의 혼입이 일어나는 것을 확보하기 위하여, 구조적 수식("보호기")이 단지 하나의 뉴클레오타이드가 혼입되는 것을 확보하기 위하여 성장하는 사슬에 부가되는 각 표지된 뉴클레오타이드에 부가된다. 보호기를 가진 뉴클레오타이드가 부가된 후, 해당 보호기는 그 후 서열분석 중인 DNA의 완전성(integrity)을 간섭하지 않는 반응 조건 하에서 제거된다. 서열분석 사이클은 이어서 그 다음 보호된 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 계속할 수 있다.
DNA 서열분석에서 유용하기 위하여, 뉴클레오타이드, 및 더욱 통상적으로 뉴클레오타이드 트라이포스페이트는, 일반적으로 일단 뉴클레오타이드 상의 염기가 첨가되면 폴리뉴클레오타이드 사슬 내로의 혼입에 이용되는 중합효소가 복제를 계속하는 것을 방지하기 위하여 3'-하이드록시 보호기를 필요로 한다. 뉴클레오타이드 상에 첨가될 수 있고 여전히 적합한 기의 유형에 대해 많은 제한이 있다. 보호기는 폴리뉴클레오타이드 사슬에 대한 손상을 일으키는 일 없이 당 모이어티로부터 동시에 용이하게 제거 가능한 한편 추가의 뉴클레오타이드 분자가 폴리뉴클레오타이드 사슬에 부가되는 것을 방지해야 한다. 또한, 변형된 뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드 사슬 내로의 혼입에 이용되는 중합효소 또는 기타 적절한 효소에 의해 맞춤화되어야 할 필요가 있다. 따라서 이상적인 보호기는 장기 안정성을 발휘하고, 중합효소에 의해 효과적으로 혼입되며, 2차적인 혹은 추가의 뉴클레오타이드 혼입의 차단을 유발하고, 폴리뉴클레오타이드 구조에 대한 손상을 일으키지 않는 온화한 조건 하에서, 바람직하게는 수성 조건 하에서 제거되는 능력을 가진다.
가역적 보호기는 앞서 기술된 바 있다. 예를 들어, Metzker 등(Nucleic Acids Research, 22 (20): 4259-4267, 1994)은 8개의 3'-변형된 2-데옥시리보뉴클레오사이드 5'-트라이포스페이트(3'-변형된 dNTP)의 합성과 이용, 그리고 혼입 활성을 위한 2개의 DNA 주형 검정에서의 시험을 개시하고 있다. 제WO 2002/029003호는 중합효소 반응에서 DNA의 성장하는 가닥 상에 3'-OH기를 캐핑하기 위하여 알릴 보호기의 사용을 포함할 수 있는 서열분석 방법을 기술하고 있다.
또한, 본 발명자들은 국제 출원 공개 제WO 2004/018497호(그의 전문이 참고로 본 명세서에 편입됨)에서 많은 가역적 보호기의 개발 및 DAN 양립 가능한 조건 하에서 이들을 보호하는 방법을 이미 보고하였다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 신규한 3'-하이드록시 보호기를 가진 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 분자에 관한 것이다. 상기 3'-하이드록시 보호기는 3'-탄소 원자에 공유 부착된 구조 -O-C(R)2N3를 형성하며, 여기서 R은 청구범위에 정의된 바와 같다. 또한 본 명세서에서는 이러한 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 분자를 제조하는 방법 및 이러한 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 분자를 이용하는 합성 과정에 의한 서열분석 방법이 제공된다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 퓨린 또는 피리미딘 염기 및 3'-탄소 원자에 공유 부착된 구조 -O-C(R)2N3를 형성하는 제거 가능한 3'-하이드록시 보호기를 가진 리보스 또는 데옥시리보스 당 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자에 관한 것으로, 상기 구조에 있어서,
R은 수소, -C(R1)m(R2)n, -C(=O)OR3, -C(=O)NR4R5, -C(R6)2O(CH2)pNR7R8 및 -C(R9)2O-Ph-C(=O)NR10R11로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬 또는 할로겐으로부터 선택되며;
R3은 수소 또는 선택적으로 치환된 알킬로부터 선택되고;
각각의 R4 및 R5는 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 선택적으로 치환된 아르알킬로부터 선택되며;
각각의 R6 및 R9는 수소, 선택적으로 치환된 알킬 또는 할로겐으로부터 선택되고;
각각의 R7, R8, R10 및 R11은 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴 또는 선택적으로 치환된 아르알킬로부터 선택되며;
m은 0 내지 3의 정수이고;
n은 0 내지 3의 정수이되; 단, m + n의 합계는 3이며;
p는 0 내지 6의 정수이되; 단,
R1 및 R2는 둘 다 할로겐일 수 없고; 그리고
적어도 하나의 R은 수소가 아니다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 서열분석 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 대해서 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오타이드(growing polynucleotide)를 제조하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드 분자를 성장하는 상보적인 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키는 단계를 포함하되, 변형된 뉴클레오타이드의 혼입은 성장하는 상보적인 폴리뉴클레오타이드에 임의의 후속 뉴클레오타이드의 도입을 방지한다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법에 관한 것으로, 해당 방법은 상보적인 뉴클레오타이드들의 순차적인 혼입을 모니터링하는 단계(여기서 혼입되는 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드 분자임); 및 변형된 뉴클레오타이드 분자의 동일성을 검출하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드 분자의 혼입은 말단 전이효소, 말단 중합효소 또는 역전사효소에 의해 달성된다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 복수개의 본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자와, 이를 위한 패키징 재료를 포함하는 키트에 관한 것이다. 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드의 동일성은 염기에 연결된 검출 가능한 표지를 검출함으로써 결정된다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 3'-하이드록시 보호기와 검출 가능한 표지는 그 다음 상보적인 뉴클레오타이드를 도입하기 전에 제거된다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 3'-하이드록시 보호기와 검출 가능한 표지는 화학 반응의 단일 단계에서 제거된다.
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 신규한 3'-하이드록시 보호기를 가진 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 분자에 관한 것이다. 상기 3'-하이드록시 보호기는 3'-탄소 원자에 공유 부착된 구조 -O-C(R)2N3를 형성하며, 여기서 R은 청구범위에 정의된 바와 같다. 또한 본 명세서에서는 이러한 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 분자를 제조하는 방법 및 이러한 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오사이드 분자를 이용하는 합성 과정에 의한 서열분석 방법이 제공된다.
도 1a는 각종 3'-OH 보호기를 나타낸 도면;
도 1b는 다양한 3'-OH 보호기의 열 안정성을 나타낸 도면.
도 2A는 3개의 다른 3'-OH 보호기의 탈보호율 곡선을 나타낸 도면.
도 2B는 3개의 다른 3'-OH 보호기의 탈보호 반감 시간의 차트.
도 3은 표준 보호기와 비교하여 열적으로 안정한 3'-OH 보호기를 가진 다양한 변형된 뉴클레오타이드의 페이징(phasing)값 및 프레페이징(prephasing)값을 나타낸 도면.
도 4A는 혼입 믹스(incorporation mix: IMX)에서 모노-F ffNs-A-이성질체의 2×400bp 서열분석 데이터를 나타낸 도면.
도 4B는 혼입 믹스(IMX)에서 모노-F ffNs-B-이성질체의 2×400bp 서열분석 데이터를 나타낸 도면.
일 실시형태는 3'-OH 보호기를 포함하는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드이다. 일 실시형태에 있어서, 3'-OH 보호기는 모노플루오로메틸 치환된 아지도메틸 보호기이다. 다른 실시형태에 있어서, 3'-OH 보호기는 C-아미도 치환된 아지도메틸 보호기이다. 또 다른 실시형태는 다이플루오로메틸 치환된 아지도메틸 3'-OH 보호기를 가진 변형된 뉴클레오타이드에 관한 것이다.
정의
달리 규정되지 않는 한, 본 명세서에서 이용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자가 통상적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 지닌다. 용어 "포함하는(inluding)"뿐만 아니라 "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함된(included)" 등과 같은 기타 형태의 이용은 제한적이지 않다. 용어 "가지는(having)"뿐만 아니라, "가지다(have)", "가진(has)" 및 "가졌다(had)" 등과 같은 기타 형태의 이용은 제한적이지 않다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 과도적 어구에서든 또는 청구범위의 내용에서든, 용어 "포함하다(comprise(s))" 및 "포함하는(comprising)"은 제약을 두지 않는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 가지는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어로 해석되어야 한다. 예를 들어, 방법의 맥락에서 이용될 경우, 용어 "포함하는"은 그 방법이 적어도 언급된 단계들을 포함하지만, 추가의 단계들을 포함할 수도 있는 것을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치의 맥락에서 이용될 경우, 용어 "포함하는"은, 그 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 언급된 특성부들 또는 요소들을 포함하지만, 추가의 특성부들 또는 요소들을 포함할 수도 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 통상의 유기 화학 약어는 다음과 같이 정의된다:
Ac 아세틸
Ac2O 무수 아세트산
aq. 수성
Bn 벤질
Bz 벤조일
BOC 또는 Boc tert-뷰톡시카보닐
Bu n-뷰틸
cat. 촉매
Cbz 카보벤질옥시
℃ 섭씨온도
dATP 데옥시아데노신 트라이포스페이트
dCTP 데옥시시티딘 트라이포스페이트
dGTP 데옥시구아노신 트라이포스페이트
dTTP 데옥시티미딘 트라이포스페이트
ddNTP(s) 다이데옥시뉴클레오타이드(들)
DBU 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데크-7-엔
DCA 다이클로로아세트산
DCE 1,2-다이클로로에탄
DCM 염화메틸렌
DIEA 다이아이소프로필에틸아민
DMA 다이메틸아세트아마이드
DME 다이메톡시에탄
DMF N,N'-다이메틸폼아마이드
DMSO 다이메틸설폭사이드
DPPA 다이페닐포스포릴 아자이드
Et 에틸
EtOAc 아세트산에틸
ffN 완전 작용성 뉴클레오타이드
g 그램(들)
GPC 겔 침투 크로마토그래피
h 또는 hr 시간(들)
iPr 아이소프로필
KPi pH 7.0에서의 10mM 인산칼륨 완충액
KPS 과황산칼륨
IPA 아이소프로필 알코올
IMX 혼입 믹스
LCMS 액체 크로마토그래피-질량 분광법
LDA 리튬 다이아이소프로필아마이드
m 또는 min 분(들)
mCPBA 메타-클로로페옥시벤조산
MeOH 메탄올
MeCN 아세트나이트릴
모노-F -CH2F
모노-F ffN 아지도메틸 3'-OH 보호기의 메틸렌 위치 상에 치환된 -CH2F를 지닌 변형된 뉴클레오타이드
㎖ 밀리리터(들)
MTBE 메틸 3차-뷰틸 에터
NaN3 아자이드화나트륨
NHS N-하이드록시숙신이미드
PG 보호기
Ph 페닐
ppt 석출물
rt 실온
SBS 합성에 의한 서열분석
TEA 트라이에틸아민
TEMPO (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-1-일)옥실
TCDI 1,1'-티오카보닐 다이이미다졸
Tert, t 3차(또는 3급)
TFA 트라이플루오로아세트산
THF 테트라하이드로퓨란
TEMED 테트라메틸에틸렌다이아민
㎕ 마이크로리터(들)
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "어레이"는 상이한 프로브 분자가 상대적인 위치에 따라서 서로 구별될 수 있도록 하나 이상의 기재에 부착된 상이한 프로브 분자의 집단을 지칭한다. 어레이는 기재(substrate) 상의 상이한 접근 가능한 위치에서 각각 위치된 상이한 프로브 분자를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 어레이는 상이한 프로브 분자를 각각 보유하는 별개의 기재를 포함할 수 있고, 여기서 상이한 프로브 분자는 액체 중 기재의 위치에 따라서 또는 기재가 부착된 기재 상의 기재의 위치에 따라서 식별될 수 있다. 별개의 기재가 표면 상에 위치된 예시적인 어레이는, 제한 없이, 예를 들어, 미국 특허 제6,355,431 B1호, 제US 2002/0102578호 및 PCT 공개 제WO 00/63437호에 기재된 웰 내 비드를 포함하는 것들을 포함한다. 예를 들어, FACS(fluorescent activated cell sorter) 등과 같이, 미세유체 장치를 이용해서 액체 어레이 내 비드를 구별하기 위하여 본 발명에서 이용될 수 있는 예시적인 형태는, 예를 들어, 미국 특허 제6,524,793호에 기재되어 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 어레이의 추가의 예는, 제한 없이, 미국 특허 제5,429,807호; 제5,436,327호; 제5,561,071호; 제5,583,211호; 제5,658,734호; 제5,837,858호; 제5,874,219호; 제5,919,523호; 제6,136,269호; 제6,287,768호; 제6,287,776호; 제6,288,220호; 제6,297,006호; 제6,291,193호; 제6,346,413호; 제6,416,949호; 제6,482,591호; 제6,514,751호 및 제6,610,482호; 및 제WO 93/17126호; 제WO 95/11995호; 제WO 95/35505호; 제EP 742 287호; 및 제EP 799 897호에 기재된 것들을 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "공유 부착된" 또는 "공유 결합된"이란 원자들 간의 전자 쌍의 공유를 특징으로 하는 화학적 결합의 형성을 지칭한다. 예를 들어, 공유 부착된 중합체 코팅은, 기타 수단, 예를 들어, 접착 또는 정전기 상호작용을 통해서 표면에 부착된 것에 비해서, 기재의 작용화된 표면을 이용해서 화학 결합을 형성하는 중합체 코팅을 지칭한다. 표면에 공유 부착된 중합체가 공유 부착에 부가해서 수단을 통해서 또한 결합될 수 있는 것을 알 수 있을 것이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 임의의 "R"기(들), 예컨대, 제한 없이, R2, R3, R4, R5, R6 , R7 및 R8은 표시된 원자에 부착될 수 있는 치환기를 나타낸다. R기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 2개의 "R"기가 "함께 합해지는" 것으로 기재된다면, R기들과 이들에 부착되는 원자들은, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클을 형성할 수 있다. 예를 들어, 제한 없이, R2와 R3, 또는 R2, R3 또는 R4 및 이것이 부착되는 원자가 "함께 합해지거나" 또는 "함께 접합되는" 것으로 표시된다면, 이것은 이들이 서로 공유 결합되어 고리를 형성하는 것을 의미하며, 해당 고리의 예는 이하에 나타낸다:
Figure 112018062134087-pat00001
하나의 기가 "선택적으로 치환된"으로 기재될 때는 언제든지, 그 기는 비치환되거나 또는 표시된 치환기의 하나 이상과 치환될 수 있다. 마찬가지로, 하나의 기가 "비치환 또는 치환된" 것으로 기재된 경우, 치환된다면, 치환기는 하나 이상의 표시된 치환기로부터 선택될 수 있다. 치환기가 표시되지 않는다면, 그것은 "선택적으로 치환된" 또는 "치환된" 기가, 예컨대, 알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬, 헤테로아르알킬, (헤테로알리사이클릴)알킬, 하이드록시, 보호된 하이드록실, 알콕시, 아릴옥시, 아실, 머캅토, 알킬티오, 아릴티오, 사이아노, 할로겐, 티오카보닐, O-카바밀, N-카바밀, O-티오카바밀, N-티오카바밀, C-아미도, N-아미도, S-설폰아미도, N-설폰아미도, C-카복시, 보호된 C-카복시, O-카복시, 아이소사이아나토, 티오사이아나토, 아이소티오사이아나토, 나이트로, 실릴, 설페닐, 실피닐, 설포닐, 할로알킬, 할로알콕시, 트라이할로메탄설포닐, 트라이할로메탄설폰아미도, 아미노, 모노-치환된 아미노기, 다이-치환된 아미노기 및 그들의 보호된 유도체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 작용기의 군으로부터 개별적으로 그리고 독립적으로 선택된 하나 이상의 기로 개별적으로 그리고 독립적으로 치환될 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알킬"이란 완전 포화된(이중 혹은 삼중 결합이 없는) 탄화수소기를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬을 지칭한다. 몇몇 실시형태에 있어서, 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다(이것이 본 명세서에 출현할 때는 언제든지, "1 내지 20" 등과 같은 수치 범위는 종점을 포함하는 주어진 범위 내의 각 정수를 지칭하며; 예컨대, "1 내지 20개의 탄소 원자"는 알킬기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자, 등등, 20개까지를 포함하는 탄소 원자로 이루어질 수 있는 것을 의미하지만, 본 정의는 수치 범위가 지정되지 않은 용어 "알킬"의 경우도 커버한다). 알킬기는 약 7 내지 약 10개의 탄소 원자를 가진 중간 크기의 알킬일 수도 있다. 알킬기는 또한 1 내지 6개의 탄소 원자를 가진 저급 알킬일 수도 있다. 화합물의 알킬기는 "C1-C4 알킬" 또는 유사한 표시로서 지칭될 수 있다. 단지 예로서, "C1-C4 알킬"은 알킬 사슬 내에 1 내지 4개의 탄소 원자가 있는 것을 나타내며, 즉, 알킬 사슬은 메틸, 에틸, 프로필, 아이소-프로필, n-뷰틸, 아이소-뷰틸, sec-뷰틸 및 t-뷰틸로부터 선택된다. 전형적인 알킬기는, 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 뷰틸, 아이소뷰틸, 3차 뷰틸, 펜틸 및 헥실로부터 선택된다. 알킬기는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알켄일"은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬에 하나 이상의 이중 결합을 포함하는 알킬기를 지칭한다. 알켄일기는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알킨일"은 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소 사슬에 하나 이상의 삼중 결합을 포함하는 알킬기를 지칭한다. 알킨일기는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "사이클로알킬"이란 완전히 포화된(이중 혹은 삼중 결합이 없는) 단환식 또는 다환식 탄화수소 고리계를 지칭한다. 2개 이상의 고리로 구성된 경우, 그 고리들은 융합된(즉, 축합된) 형태로 함께 접합될 수 있다. 사이클로알킬기는 고리(들) 내에 3 내지 10개의 원자를 함유할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 사이클로알킬기는 고리(들) 내에 3 내지 8개의 원자를 함유할 수 있다. 사이클로알킬기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 전형적인 사이클로알킬기는, 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸을 포함하지만 이들로 결코 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "아릴"이란 고리들 중 적어도 하나를 통해서 완전히 탈국부화된 파이-전자계를 가지는 탄소환식(모두 탄소) 단환식 또는 다환식 방향족 고리계(예컨대, 축합된, 브리지된 또는 스피로 고리계를 포함함, 여기서 2개의 탄소환식 고리는 화학 결합을 공유하며, 예컨대, 하나 이상의 아릴 고리는 하나 이상의 아릴 또는 비아릴 고리를 지님)를 지칭한다. 아릴기 내의 탄소 원자의 수는 변할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 아릴기는 C6-C14 아릴기, C6-C10 아릴기 또는 C6 아릴기일 수 있다. 아릴기의 예는 벤젠, 나프탈렌 및 아줄렌을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 아릴기는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "헤테로사이클릴"은 적어도 하나의 헤테로원자(예컨대, O, N, S)를 포함하는 고리계를 지칭한다. 이러한 계는 불포화될 수 있거나, 일부 불포화를 포함할 수 있거나, 또는 일부 방향족 부분을 함유할 수 있거나 또는 모두 방향족일 수 있다. 헤테로사이클릴기는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "헤테로아릴"이란 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌, 탄소 이외의 원소와, 적어도 하나의 방향족 고리를 함유하는 단환식 또는 다환식 방향족 고리계(완전 탈국부화된 파이-전자계를 가진 적어도 하나의 고리를 지닌 고리계)를 지칭한다. 헤테로아릴기의 고리(들) 내의 원자의 수는 다양할 수 있다. 예를 들어, 몇몇 실시형태에 있어서, 헤테로아릴기는 고리(들) 내에 4 내지 14개의 원자, 고리(들) 내에 5 내지 10개의 원자 또는 고리(들) 내에 5 내지 6개의 원자를 함유할 수 있다. 또한, 용어 "헤테로아릴"은 축합된 고리계를 포함하되, 여기서 2개의 고리, 예컨대, 적어도 1개의 아릴 고리 및 적어도 1개의 헤테로아릴 고리, 또는 적어도 2개의 헤테로아릴 고리는 적어도 하나의 화학 결합을 공유한다. 헤테로아릴 고리의 예는 퓨란, 퓨라잔, 티오펜, 벤조티오펜, 프탈라진, 피롤, 옥사졸, 벤즈옥사졸, 1,2,3-옥사다이아졸, 1,2,4-옥사다이아졸, 티아졸, 1,2,3-티아다이아졸, 1,2,4-티아다이아졸, 벤조티아졸, 이미다졸, 벤즈이미다졸, 인돌, 인다졸, 피라졸, 벤조피라졸, 아이소옥사졸, 벤조아이소옥사졸, 아이소티아졸, 트라이아졸, 벤조트라이아졸, 티아다이아졸, 테트라졸, 피리딘, 피리다진, 피리미딘, 피라진, 퓨린, 프테리딘, 퀴놀린, 아이소퀴놀린, 퀴나졸린, 퀴녹살린, 신놀린 및 트라이아진을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 헤테로아릴기는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "헤테로알리사이클릭" 또는 "헤테로알리사이클릴"은 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 18-원까지의 단환식, 이환식 및 삼환식 고리계를 지칭하되, 여기서 탄소 원자는 1 내지 5개의 헤테로원자와 함께 상기 고리계를 구성한다. 헤테로사이클은 그러나 완전 탈국부화된 파이-전자계가 모든 고리를 통해서 일어나지 않는 방식으로 위치된 하나 이상의 불포화 결합을 선택적으로 함유할 수 있다. 헤테로원자는 독립적으로 산소, 황 및 질소로부터 선택된다. 헤테로사이클은 정의가 옥소계 및 티오계, 예컨대, 락탐, 락톤, 환식 이미드, 환식 티오이미드 및 환식 카바메이트를 포함하도록 하나 이상의 카보닐 또는 티오카보닐 작용기를 더 함유할 수 있다. 2개 이상의 고리로 구성된 경우, 고리는 축합 방식으로 함께 접합될 수 있다. 부가적으로, 헤테로알리사이클릭 내 임의의 질소는 4차화될 수 있다. 헤테로알리사이클릴 또는 헤테로알리사이클릭기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 이러한 "헤테로알리사이클릭" 또는 "헤테로알리사이클릴"기의 예는, 1,3-다이옥신, 1,3-다이옥산, 1,4-다이옥산, 1,2-다이옥솔란, 1,3-다이옥솔란, 1,4-다이옥솔란, 1,3-옥사티안, 1,4-옥사티인, 1,3-옥사티올란, 1,3-다이티올, 1,3-다이티올란, 1,4-옥사티안, 테트라하이드로-1,4-티아진, 2H-1,2-옥사진, 말레이미드, 숙신이미드, 바비투르산, 티오바비투르산, 다이옥소피페라진, 히단토인, 다이하이드로유라실, 트라이옥산, 헥사하이드로-1,3,5-트라이아진, 이미다졸린, 이미다졸리딘, 아이소옥사졸린, 아이소옥사졸리딘, 옥사졸린, 옥사졸리딘, 옥사졸리디논, 티아졸린, 티아졸리딘, 몰폴린, 옥시란, 피페리딘 N-옥사이드, 피페리딘, 피페라진, 피롤리딘, 피롤리돈, 피롤리디온, 4-피페리돈, 피라졸린, 피라졸리딘, 2-옥소피롤리딘, 테트라하이드로피란, 4H-피란, 테트라하이드로티오피란, 티아몰폴린, 티아몰폴린 설폭사이드, 티아몰폴린 설폰 및 그들의 벤조-축합된 유사체(예컨대, 벤즈이미다졸리디논, 테트라하이드로퀴놀린, 3,4-메틸렌다이옥시페닐)를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "아르알킬" 및 "아릴(알킬)"은 저급 알킬렌기를 통해서 치환기로서 연결된 아릴기를 지칭한다. 저급 알킬렌 및 아르알킬의 아릴기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 그 예는 벤질, 2-페닐알킬, 3-페닐알킬 및 나프틸알킬을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "헤테로아르알킬" 및 "헤테로아릴(알킬)"은 저급 알킬렌기를 통해서 치환기로서 연결된 헤테로아릴기를 지칭한다. 저급 알킬렌 및 헤테로아르알킬의 헤테로아릴기는 치환되거나 비치환될 수 있다. 그 예는 2-티엔일알킬, 3-티엔일알킬, 퓨릴알킬, 티엔일알킬, 피롤릴알킬, 피리딜알킬, 아이소옥사졸릴알킬 및 이미다졸릴알킬, 및 그들의 벤조-축합된 유사체를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "알콕시"는 식 -OR을 지칭하며, 여기서 R은 위에서 정의된 바와 같은 알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일 또는 사이클로알킨일이다. 알콕시의 비제한적인 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 1-메틸에톡시(아이소프로폭시), n-뷰톡시, 아이소-뷰톡시, sec-뷰톡시 및 tert-뷰톡시이다. 알콕시 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "C-아미도"기는 "-C(=O)N(RaRb)"기를 지칭하되, 여기서 Ra 및 Rb는 독립적으로 수소, 알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬일 수 있다. C-아미도는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "N-아미도"기는 "RC(=O)N(Ra)-"기를 지칭하되, 여기서 R 및 Ra는 독립적으로 수소, 알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬일 수 있다. N-아미도는 치환되거나 비치환될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "할로겐 원자", "할로겐" 또는 "할로"는 원소의 주기율표의 제7족의 방사능-안정한 원자, 예컨대, 플루오르, 염소, 브로민 및 요오드 중 임의의 하나를 의미한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "아민"은 -NH2기를 지칭하되, 여기서 하나 이상의 수소는 R기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. R은 독립적으로 수소, 알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬일 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "알데하이드"는 -Rc-C(O)H기를 지칭하되, 여기서 Rc는 존재하지 않을 수 있거나, 또는 독립적으로 알킬렌, 알켄일렌, 알킨일렌, 사이클로알킬렌, 사이클로알켄일렌, 사이클로알킨일렌, 아릴렌, 헤테로아릴렌, 헤테로알리사이클릴렌, 아르알킬렌 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬렌으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "아미노"는 -NH2기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "하이드록시"는 -OH기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "사이아노"기는 "-CN"기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "아지도"는 -N3기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "티올"은 -SH기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "카복실산"은 -C(O)OH를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "티오사이아네이트"는 -S-C≡N기를 지칭한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "옥소-아민"은 -O-NH2기를 지칭하되, 여기서 -NH2의 하나 이상의 수소는 R기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. R은 독립적으로 수소, 알킬, 알켄일, 알킨일, 사이클로알킬, 사이클로알켄일, 사이클로알킨일, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로알리사이클릴, 아르알킬 또는 (헤테로알리사이클릴)알킬이다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "뉴클레오타이드"는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당 및 하나 이상의 포스페이트기를 포함한다. 이들은 핵산 서열의 단량체 유닛이다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉, 리보스에 존재하는 하이드록실기를 결여하는 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 그들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 사이토신(C), 티민(T) 및 유라실(U), 및 그들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "뉴클레오사이드"는 뉴클레오타이드와 구조적으로 유사하지만, 포스페이트 모이어티를 결여한다. 뉴클레오사이드 유사체의 예는 표지가 염기에 연결되고 당 분자에 부착된 포스페이트기가 없는 것일 것이다. 용어 "뉴클레오사이드"는, 당업자가 알고 있는 그의 통상의 의미로 본 명세서에서 이용된다. 그 예는 리보스 모이어티를 포함하는 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보스 모이어티를 포함하는 데옥시리보뉴클레오사이드를 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다. 변형된 5탄당 모이어티는, 산소 원자가 탄소로 교체되고/되거나 탄소가 황 또는 산소 원자로 교체된 5탄단 모이어티이다. "뉴클레오사이드"는 치환된 염기 및/또는 당 모이어티를 가질 수 있는 단량체이다. 또한, 뉴클레오사이드는 보다 큰 DNA 및/또는 RNA 중합체 및 올리고머 내로 혼입될 수 있다.
용어 "퓨린 염기"는 본 명세서에서 당업자가 이해하는 바와 같은 통상의 의미로 이용되며, 그의 호변이성질체를 포함한다. 마찬가지로, 용어 "피리미딘 염기"는 당업자가 이해하는 바와 같은 그의 통상의 의미로 본 명세서에서 이용되며 그의 호변이성질체를 포함한다. 선택적으로 치환된 퓨린염기의 비제한적인 예는 퓨린, 아데닌, 구아닌, 하이포잔틴, 잔틴, 알로잔틴, 7-알킬구아닌(예컨대 7-메틸구아닌), 테오브로민, 카페인, 요산 및 아이소구아닌을 포함한다. 피리미딘 염기의 예는, 사이토신, 티민, 유라실, 5,6-다이하이드로유라실 및 5-알킬사이토신(예컨대, 5-메틸사이토신)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, "유도체" 또는 "유사체"는 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 가진 합성 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 유도체를 의미한다. 이러한 유도체 및 유사체는, 예컨대, 문헌[Scheit, Nucleotide Analogs (John Wiley & Son, 1980) 및 Uhlman et al., Chemical Reviews 90:543-584, 1990]에서 논의되어 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 알킬-포스포네이트, 포르포르아닐리데이트 및 포스포라미데이트 연쇄를 비롯한 변형된 포스포다이에스터 연쇄를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "유도체", "유사체" 및 "변형된"은, 호환가능하게 이용될 수 있고, 본 명세서에 정의된 "뉴클레오타이드" 및 "뉴클레오사이드"란 용어에 의해 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "포스페이트"는 당업자가 이해하는 바와 같은 그의 통상의 의미로 이용되며, 그의 양자화된 형태(예를 들어,
Figure 112018062134087-pat00002
및
Figure 112018062134087-pat00003
)를 포함한다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "모노포스페이트", "다이포스페이트" 및 "트라이포스페이트"는 당업자가 이해하는 바와 같은 그들의 통상의 의미로 이용되며, 양자화된 형태를 포함한다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "보호기" 및 "보호기들"은 분자 내에 존재하는 기들이 원치 않는 화학 반응을 겪는 것을 방지하기 위하여 분자에 첨가되는 임의의 원자 또는 원자들의 그룹을 지칭한다. 때때로, "보호기" 및 "차단기"는 호환 가능하게 이용될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 접두사 "광"(photo) 또는 "광-"은 광 또는 전자기 방사선에 관련된 것을 의미한다. 이 용어는 스펙트럼의 방사선, 마이크로파, 적외선, 가시광, 자외선, X선 또는 감마선 부분으로서 통상 공지된 범위의 하나 이상을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아닌 전자기 스펙트럼의 전부 혹은 일부를 포함할 수 있다. 이 스펙트럼의 일부는 본 명세서에 기재된 금속 등과 같은 표면의 금속 영역에 의해 차단되는 것일 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 스펙트럼의 일부는 본 명세서에 기재된 유리, 플라스틱, 실리카 또는 기타 물질로 이루어진 영역 등과 같은 표면의 간질 영역(interstitial region)을 통과하는 것일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 금속을 통과할 수 있는 방사선이 이용될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 본 명세서에 기재된 유리, 플라스틱, 실리카 또는 기타 물질에 의해 마스킹된 방사선이 이용될 수 있다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같이, 용어 "페이징"이란, 주어진 서열분석 사이클에서 중합효소에 의해 클러스터 내의 DNA 가닥의 일부의 혼입을 완성시키는데 대한 실패 및 3' 종결자 및 형광단의 불완전한 제거로 인해 초래되는 SBS에서의 현상을 지칭한다. 프레-페이징은 유효한 3' 종결자가 없는 뉴클레오타이드의 혼입 및 1사이클이 전행되는 혼입 이벤트에 의해 초래된다. 페이징 및 프레-페이징은 선행하는 사이클 및 후속하는 사이클로부터의 잡음뿐만 아니라 현재 사이클의 신호로 구성되도록 특정 사이클을 위한 추출된 강도를 유발한다. 사이클 수가 증가함에 따라서, 페이징에 의해 영향을 미치는 클러스터 당 서열의 분획이 증가하여 정확한 염기의 식별화를 방해한다. 프레-페이징은 합성에 의한 서열분석(SBS) 동안 보호되지 않은 혹은 차단되지 않은 3'-OH 뉴클레오타이드의 흔적량의 존재에 의해 유발될 수 있다. 보호되지 않은 3'-OH 뉴클레오타이드는 제조 과정 동안 또는 가능하게는 보관 및 시약 취급 과정 동안 발생될 수도 있었다. 따라서, 프레-페이징의 발생을 감소시키는 뉴클레오타이드 유사체의 발견은 경이로운 것이며, 기존의 뉴클레오타이드 유사체에 비해서 SBS 적용에 커다란 이점을 제공한다. 예를 들어, 제공된 뉴클레오타이드 유사체는 SBS 사이클 타임의 더욱 신속화, 페이징 및 프레-페이징값의 저하 및 더욱 연장된 서열분석 판독 길이로 귀결될 수 있다.
3'-OH 보호기 -C(R) 2 N 3
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 제거 가능한 3'-하이드록시 보호기 -C(R)2N3를 가진 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자에 관한 것으로, 여기서 R은 수소, -C(R1)m(R2)n, -C(=O)OR3, -C(=O)NR4R5, -C(R6)2O(CH2)pNR7R8 및 -C(R9)2O-Ph-C(=O)NR10R11로 이루어진 군으로부터 선택되되, 이때 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, m, n 및 p는 위에서 정의되어 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, R 중 하나는 수소이고 다른 하나의 R은 -C(R1)m(R2)n이다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, -C(R1)m(R2)n은 -CHF2, -CH2F, -CHCl2 또는 -CH2Cl로부터 선택된다. 일 실시형태에 있어서, -C(R1)m(R2)n은 -CHF2이다. 다른 실시형태에 있어서, -C(R1)m(R2)n은 -CH2F이다.
몇몇 실시형태에 있어서, R 중 하나는 수소이고 다른 하나의 R은 -C(=O)OR3이다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, R3은 수소이다.
몇몇 실시형태에 있어서, R 중 하나는 수소이고 다른 하나의 R은 -C(=O)NR4R5이다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, R4와 R5는 둘 다 수소이다. 몇몇 다른 이러한 실시형태에 있어서, R4는 수소이고, R5는 C1-6 알킬이다. 또 다른 몇몇 실시형태에 있어서, R4와 R5는 둘 다 C1-6 알킬이다. 일 실시형태에 있어서, R5는 n-뷰틸이다. 다른 실시형태에 있어서, R4와 R5는 둘 다 메틸이다.
몇몇 실시형태에 있어서, R 중 하나는 수소이고 다른 하나의 R은 -C(R6)2O(CH2)pNR7R8이다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 두 R6은 수소이다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, R7과 R8은 둘 다 수소이다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, p는 0이다. 몇몇 다른 이러한 실시형태에 있어서, p는 6이다.
몇몇 실시형태에 있어서, R 중 하나는 수소이고 다른 하나의 R은 -C(R9)2O-Ph-C(=O)NR10R11이다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 두 R9는 수소이다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, R10과 R11은 둘 다 수소이다. 몇몇 다른 이러한 실시형태에 있어서, R10은 수소이고, R11은 치환된 알킬이다. 일 실시형태에 있어서, R11은 아미노 치환된 알킬이다.
3'-OH 보호기의 탈보호
몇몇 실시형태에 있어서, 3'-OH 보호기는 포스핀과의 탈보호 반응에서 제거된다. -C(R)2N3 중 아지도기는 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자를 포스핀과 접촉시킴으로써 아미노기로 전환될 수 있다. 대안적으로, -C(R)2N3 중 아지도기는 이러한 분자를 티올, 특히, 수용성 티올, 예컨대, 다이티오트레이톨(DTT)과 접촉시킴으로써 아미노기로 전환될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 포스핀은 트리스(하이드록시메틸)포스핀(THP)이다. 달리 표시되지 않는 한, 뉴클레오타이드란 언급은 또한 뉴클레오사이드에 적용 가능하도록 의도되어 있다.
검출 가능한 표지
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태는 통상의 검출 가능한 표지의 이용에 관한 것이다. 검출은 형광 분광법을 비롯한 임의의 적절한 방법에 의해 또는 기타 광학적 수단에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 표지는 형광단이며, 이것은 에너지의 흡수 후, 규정된 파장에서 방사선을 방출한다. 많은 적절한 형광 표지가 공지되어 있다. 예를 들어, Welch 등(Chem . Eur . J. 5(3):951-960, 1999)은 본 발명에서 이용될 수 있는 단일-작용화된 형광 모이어티를 개시하고 있다. Zhu 등(Cytometry 28:206-211, 1997)은 본 발명에서 또한 이용될 수 있는 형광 표지 Cy3 및 Cy5의 사용을 기술하고 있다. 이용하는데 적합한 표지는 또한 Prober 등(Science 238:336-341, 1987); Connell 등(BioTechniques 5(4):342-384, 1987), Ansorge 등(Nucl . Acids Res. 15(11):4593-4602, 1987) 및 Smith 등(Nature 321:674, 1986)에 개시되어 있다. 기타 상업적으로 입수 가능한 형광 표지는, 플루오레세인(fluorescein), 로다민(TMR, 텍사스 레드(texas red) 및 Rox를 포함함), 알렉사(alexa), 보디피(bodipy), 아크리딘(acridine), 쿠마린(coumarin), 피렌(pyrene), 벤잔트라센(benzanthracene) 및 사이아닌(cyanins)을 포함하지만 이들로 제한되는 것은 아니다.
다수의 표지, 예를 들어, 바이-형광단 FRET 카세트(Tet . Let. 46:8867-8871, 2000)가 또한 본 출원에서 이용될 수 있다. 멀티-플루오르 수지상 시스템(Multi-fluor dendrimeric systems)(J. Am. Chem . Soc. 123:8101-8108, 2001)이 또한 이용될 수 있다. 형광 표지가 바람직하지만, 기타 형태의 검출 가능한 표지가 당업자에게 유용한 것은 명백할 것이다. 예를 들어, 양자점(Empodocles et al., Nature 399:126-130, 1999), 금 나노입자(Reichert et al., Anal. Chem. 72:6025-6029, 2000) 및 마이크로비드(Lacoste et al., Proc . Natl . Acad . Sci USA 97(17):9461-9466, 2000)를 비롯하여 마이크로입자가 모두 이용될 수 있다.
다성분 표지가 또한 본 출원에서 이용될 수 있다. 다성분 표지는 검출용의 추가의 화합물과의 상호작용에 좌우되는 것이다. 생물학에서 이용되는 가장 흔한 다성분 표지는 바이오틴-스트렙타비딘 시스템이다. 바이오틴은 뉴클레오타이드 염기에 부착된 표지로서 이용된다. 스트렙타비딘은 이어서 검출이 발생할 수 있도록 별도로 첨가된다. 기타 다성분 시스템이 입수 가능하다. 예를 들어, 다이나이트로페놀은 검출에 이용될 수 있는 상업적으로 입수 가능한 형광성 항체이다.
달리 표시되지 않는 한, 뉴클레오타이드란 언급은 또한 뉴클레오사이드에 적용 가능하도록 의도된다. 본 출원은 또한 DNA를 참고하여 더욱 기재될 것이지만, 그 설명은, 달리 표시되지 않는 한, RNA, PNA, 및 기타 핵산에도 또한 적용 가능할 것이다.
링커
본 명세서에 기재된 몇몇 실시형태에 있어서, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 분자의 퓨린 또는 피리미딘 염기는 위에서 기재된 바와 같은 검출 가능한 표지에 연결될 수 있다. 몇몇 이러한 실시형태에 있어서, 이용되는 링커는 절단 가능하다. 절단성 링커의 이용은, 필요한 경우, 표지가 검출 후에 제거될 수 있어 순차로 혼입된 임의의 표지된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드와의 어떠한 신호 간섭도 회피하는 것을 확실하게 한다.
몇몇 다른 실시형태에 있어서, 이용되는 링커는 비-절단성(non-cleavable)이다. 본 발명의 표지된 뉴클레오타이드가 혼입된 각 경우에, 뉴클레오타이드가 순차로 혼입될 필요는 없고, 따라서 표지는 뉴클레오타이드로부터 제거될 필요가 없다.
당업자라면 특정 유형의 뉴클레오타이드에서 랜덤화된 사슬-종결에 의존하는 소위 생거 서열분석법(Sanger sequencing method), 및 관련된 프로토콜(생거식(Sanger-type))에서 다이데옥시뉴클레오사이드 트라이포스페이트의 유용성을 알고 있을 것이다. 생거식 서열분석 프로토콜의 일례는 Metzker에 의해 기재된 BASS 방법이다.
생거 및 생거식 방법은 일반적으로 서로 상이하게 표지되는 8가지 유형의 뉴클레오타이드가 제공되되 그 중 4가지가 3'-OH기를 함유하고; 4가지가 OH기를 생략하고 있는 실험에서 수행함으로써 작동된다. 3'-OH기-다이데옥시 뉴클레오타이드(ddNTP)를 생략하고 있는 뉴클레오타이드가 이용되었다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, ddNTP들이 혼입되는 말단 뉴클레오타이드의 위치를 결정하고 이 정보를 조합함으로써 상이하게 표지되므로, 표적 올리고뉴클레오타이드의 서열이 결정될 수 있다.
본 출원의 뉴클레오타이드는, ddNTP들을 이용해서 달성된 동일한 효과가 본 명세서에 기재된 3'-OH 보호기를 사용함으로써 달성될 수 있으므로 생거 방법 및 관련된 프로토콜에서 유용성이 있을 수 있다는 것이 인지될 것이다: 둘 다 후속의 뉴클레오타이드의 혼입을 방지한다.
게다가, 3'-OH 보호된 뉴클레오타이드의 혼입의 모니터링은 부착된 포스페이트기 내에 방사능 32P의 이용에 의해 결정될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 이들은 ddNTP 자체에 또는 연장을 위하여 이용되는 프라이머에 존재할 수 있다.
절단성 링커는 당업계에 공지되어 있고, 통상의 화학은 뉴클레오타이드 염기 및 표지에 링커를 부착시키기 위하여 적용될 수 있다. 링커는 산, 염기, 친핵체, 친전자체, 라디칼, 금속, 환원 혹은 산화제, 광, 온도, 효소 등에의 노출을 비롯한 임의의 적절한 방법에 의해 절단될 수 있다. 본 명세서에서 논의된 링커는 또한 3'-O-보호기 결합을 절단하는데 이용된 동일한 촉매로 절단될 수 있다. 적절한 링커는, 문헌[Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons]에 개시된 바와 같이, 표준 화학 보호기로부터 개조될 수 있다. 고상 합성에서 이용되는 더욱 적합한 절단성 링커는 문헌[Guillier et al. (Chem . Rev. 100:2092-2157, 2000)]에 개시되어 있다.
용어 "절단성 링커"의 이용은, 전체 링커가 예컨대 뉴클레오타이드 염기로부터 제거되도록 요구되는 것을 의미하는 것은 아니다. 검출 가능한 표지가 염기에 부착된 경우, 뉴클레오사이드 절단 부위는 절단 후에 뉴클레오타이드 염기에 부착된 링커의 일부가 남아 있는 것을 확실하게 하는 링커 상의 위치에 위치될 수 있다.
검출 가능한 표지가 염기에 부착된 경우, 링커는 왓슨-크릭 염기 짝짖기가 여전히 수행될 수 있다는 조건 하에 뉴클레오타이드 염기 상의 임의의 위치에 부착될 수 있다. 퓨린 염기의 맥락에서, 링커가 퓨린 또는 바람직한 데아자퓨린 유사체의 7-위치를 통해서, 8-변형된 퓨린을 통해서, N-6 변형된 아데노신 또는 N-2 변형된 구아닌을 통해서 부착된다면 바람직하다. 피리미딘을 위하여, 사이토신, 티미딘 또는 유라실 상의 5-위치 및 사이토신 상의 N-4 위치를 통한 부착이 바람직하다.
A. 친전자성 절단된 링커
친전자성 절단된 링커는 양성자에 의해 전형적으로 절단되고, 산에 민감한 절단을 포함한다. 적절한 링커는 트리틸, p-알콕시벤질 에스터 및 p-알콕시벤질 아마이드 등과 같은 변형된 벤질계를 포함한다. 기타 적절한 링커는 tert-뷰틸옥시카보닐(Boc)기 및 아세탈계를 포함한다.
티오아세탈 또는 기타 황-함유 보호기의 절단에서 황친화성 금속, 예컨대, 니켈, 은 또는 수은의 사용은 또한 적절한 링커 분자의 제조를 위하여 고려될 수 있다.
B. 친핵성 절단된 링커
친핵성 절단은 또한 링커 분자의 제조에서 잘 인지된 방법이다. 물에서 불안정한(즉, 염기성 pH에서 단순히 절단될 수 있는) 에스터 등과 같은 기 및 비수계 친핵체에 불안정한 기가 이용될 수 있다. 플루오르 이온은 트라이아이소프로필 실란(TIPS) 또는 t-뷰틸다이메틸 실란(TBDMS) 등과 같은 기에 규소-산소 결합을 절단하는데 이용될 수 있다.
C. 광절단성 링커
광절단성 링커는 탄수화물 화학에서 광범위하게 이용되어 왔다. 절단을 활성화하기 위하여 요구되는 광은 변형된 뉴클레오타이드의 다른 성분에 영향을 미치지 않는 것이 바람직하다. 예를 들어, 형광단이 표지로서 이용된다면, 이것이 링커 분자를 절단하는데 요구되는 것과는 다른 파장의 광을 흡수한다면 바람직하다. 적절한 링커는 O-나이트로벤질 화합물 및 나이트로베라트릴 화합물에 기초한 것들을 포함한다. 벤조인 화학에 기초한 링커가 또한 이용될 수 있다(Lee et al., J. Org . Chem. 64:3454-3460, 1999).
D. 환원 조건 하의 절단
환원성 절단을 받기 쉬운 공지된 많은 링커가 있다. 팔라듐-기반 촉매를 이용하는 촉매적 수소화는 벤질 및 벤질옥시카보닐기를 절단하기 위하여 이용되어 왔다. 다이설파이드 결합 환원 또한 당업계에 공지되어 있다.
E. 산화 조건 하의 절단
산화-기반 접근법들은 당업계에 잘 알려져 있다. 이들은 p-알콕시벤질기의 산화와 황 및 셀렌 링커의 산화를 포함한다. 다이설파이드 및 기타 황 또는 셀렌-기반 링커를 절단하기 위하여 수성 요오드의 사용은 또한 본 발명의 범위 내이다.
F. 세이프티-캐치(safety-catch) 링커
세이프티-캐치 링커는 2 단계로 절단되는 것들이다. 바람직한 시스템에서, 제1 단계는 반응성 친핵성 중심의 생성이고, 이어서 절단을 유발하는 분자내 고리화를 수반하는 제2 단계를 수반한다. 예를 들어, 레불린산 연쇄는 하이드라진 또는 광화학으로 처리되어 활성 아민을 유리시킬 수 있고, 이것은 이어서 분자 내의 어딘가 다른 곳에서 에스터를 절단하도록 고리화될 수 있다(Burgess et al., J. Org. Chem. 62:5165-5168, 1997).
G. 제거 기전에 의한 절단
제거 반응이 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, Fmoc 및 사이아노에틸 등과 같은 기의 염기-촉매적 제거와, 알릴계의 팔라듐-촉매적 환원 제거가 이용될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 링커는 스페이서 유닛을 포함할 수 있다. 링커의 길이는 중요하지 않지만, 단, 뉴클레오타이드와 효소 간의 어떠한 상호작용도 간섭하지 않도록 표지가 뉴클레오타이드로부터 충분한 거리를 유지해야 한다.
몇몇 실시형태에 있어서, 링커는 3'-OH 보호기로서 유사한 작용기로 구성될 수 있다. 이것은, 단지 단일 처리가 표지와 보호기 둘 다를 제거하는데 필요로 될 것이므로, 탈보호 및 탈보호 과정을 더욱 효과적으로 만들 것이다. 특히 바람직한 링커는 포스핀-절단 가능한 아자이드 함유 링커이다.
서열분석 방법
본 명세서에 기재된 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 각종 서열분석 수법과 함께 이용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 방법은 자동화 과정일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 뉴클레오타이드 유사체는 서열분석 절차, 예컨대, 합성에 의한 서열분석(SBS) 수법에서 이용될 수 있다. 간략히 말하면, SBS는 표적 핵산을 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 중합효소 등과 접촉시킴으로써 개시될 수 있다. 프라이머가 표적 핵산을 주형으로서 이용해서 연장되는 이들 특성부는 검출될 수 있는 표지된 뉴클레오타이드를 혼입할 것이다. 선택적으로, 표지된 뉴클레오타이드는 일단 뉴클레오타이드가 프라이머에 부가되면 추가의 프라이머 연장을 종결시키는 가역적 종결 특성을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 가진 뉴클레오타이드 유사체는 프라이머에 부가될 수 있으므로, 후속의 연장은 탈블로킹제(deblocking agent)가 모이어티를 제거하도록 전달될 때까지 일어나지 않을 수 있다. 따라서, 가역적 종결을 이용하는 실시형태에 대해서, 탈블로킹 시약은 (검출이 일어나기 전 혹은 후에) 유동 세포에 전달될 수 있다. 세척은 각종 전달 단계들 사이에 일어날 수 있다. 이어서 사이클은 n개의 뉴클레오타이드만큼 프라이머를 연장시키기 위하여 n회 반복될 수 있고, 이에 따라서 서열 길이 n을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성되는 어레이와 함께 이용하기에 용이하게 적합할 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유체 시스템 및 검출 플랫폼은, 예를 들어, 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), 제WO 04/018497호; 제WO 91/06678호; 제WO 07/123744호; 미국 특허 제7,057,026호; 제7,329,492호; 제7,211,414호; 제7,315,019호 또는 제7,405,281호 및 미국 특허 출원 공개 제2008/0108082 A1호(이들 각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)]에 기재되어 있다.
환식 반응을 이용하는 기타 서열분석 절차, 예컨대, 파이로서열분석(pyrosequencing)이 이용될 수 있다. 파이로서열분석은 특정 뉴클레오타이드가 초기 핵산 가닥 내로 혼입됨에 따라서 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998); 미국 특허 제6,210,891호; 제6,258,568호; 및 제6,274,320호(이들 각각은 참고로 본 명세서에 편입된다). 파이로서열분석에서, 방출된 PPi는 ATP 설푸릴라제에 의해 아데노신 트라이포스페이트(ATP)로 전환됨으로써 검출될 수 있고, 얻어진 ATP는 루시페라제-생성 양성자를 통해서 검출될 수 있다. 이와 같이 해서, 서열분석 반응은 발광 검출 시스템을 통해서 모니터링될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템에 이용되는 여기 방사선 공급원은 파이로서열분석 절차를 위하여 필요하지 않다. 본 발명의 어레이에 파이로서열분석의 적용을 위하여 이용될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 절차는, 예를 들어, 국제 특허 출원 제PCT/US11/57111호, 미국 특허 공개 제2005/0191698 A1호, 미국 특허 제7,595,883호 및 미국 특허 제7,244,559호(이들 각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재되어 있다.
예를 들어, 문헌[Shendure et al. Science 309:1728-1732 (2005); 미국 특허 제5,599,675호; 및 미국 특허 제5,750,341호(이들 각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)]에 기재된 것들을 비롯한 결찰 반응에 의한 서열분석이 또한 유용하다. 몇몇 실시형태는, 예를 들어, 문헌[Bains et al., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor et al., Science 251(4995), 767-773 (1995); 및 제WO 1989/10977호(이들 각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)]에 기재된 바와 같은 혼성화에 의한 서열분석 절차를 포함할 수 있다. 결찰에 의한 서열분석 및 혼성화에 의한 서열분석 절차 둘 다에서, 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특성부)에 존재하는 핵산에는 올리고뉴클레오타이드 전달 및 검출의 반복 사이클이 시행된다. 본 명세서에서 또는 본 명세서에 인용된 문헌에서 기재된 바와 같은 SBS 방법을 위한 유체 시스템은, 결찰에 의한 서열분석 또는 혼성화에 의한 서열분석 절차를 위한 시약 전달을 위하여 용이하게 적합화될 수 있다. 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는 형광 표지되고, 본 명세서에서 SBS 절차에 관하여 그리고 본 명세서에 인용된 문헌에서 기재된 것들과 유사한 형광 검출기를 이용해서 검출될 수 있다.
몇몇 실시형태는 DNA 중합효소 활성을 실시간 모니터링하는 것을 포함하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 혼입은 형광단-보유 중합효소와 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드 간의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 상호작용을 통해서 또는 제로모드 도광체(zeromode waveguide)를 이용해서 검출될 수 있다. FRET-기반 서열분석을 위한 수법 및 시약은, 예를 들어, 문헌[Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett . 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc. Natl . Acad . Sci . USA 105, 1176-1181 (2008)]에 기재되어 있으며, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입된다.
몇몇 SBS 실시형태는 연장 산물 내로 뉴클레오타이드의 혼입 시 방출된 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 서열분석은 이온 토렌트사(Ion Torrent)(코네티컷주의 길퍼드시에 소재, 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)의 자회사)로부터 상업적으로 입수 가능한 전기 검출기 및 관련된 수법, 또는 미국 특허 출원 공개 제2009/0026082 A1호; 제2009/0127589 A1호; 제2010/0137143 A1호; 또는 제2010/0282617 A1호(이들 각각은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 서열분석 방법 및 시스템을 이용할 수 있다.
실시예
추가의 실시형태는 이하의 실시예에서 더욱 상세히 개시되며, 이는 결코 청구범위의 범주를 제한하도록 의도된 것은 아니다. 보호된 3'-하이드록시기를 가진 다양한 변형된 뉴클레오타이드의 합성이 실시예 1 내지 3에서 입증된다.
실시예 1
3'-OH 보호기를 가진 뉴클레오타이드의 합성
Figure 112018062134087-pat00004
반응식 1.
반응식 1은 3'-OH 보호기로서 모노플루오로메틸 치환된 아지도메틸을 가진 변형된 뉴클레오타이드의 제조에 대한 합성 경로를 예시한다. 화합물 1a 내지 1f는 변형된 티민(T-PA)을 염기로서 이용한다. 이용될 수 있는 염기의 다른 비제한적인 예는 Cbz-PA, ADMF-PA 및 GPac-PA를 포함하며, 이들 구조는 반응식 1에서 위에서 도시되어 있다.
실험 절차
무수 CH3CN(25㎖) 중 출발 뉴클레오사이드 1a(1.54g, 2.5 m㏖)의 용액에 2,6-루티딘(0.87㎖, 7.5m㏖), (2-플루오로에틸)(4-메톡시페닐)설페인(MPSF)(3.26g, 17.5m㏖) 및 이어서 Bz2O2(50% 순도, 8.47g, 17.5m㏖)를 4℃에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온까지 서서히 가온시켰다. 이 혼합물을 더욱 6시간에 걸쳐서 교반하였다. TLC(EtOAc:DCM=2:8 v/v)는 출발 뉴클레오사이드의 완전한 소비를 보기 위하여 모니터링하였다. 반응물은 이어서 감압 하에 유성 잔사로 농축시켰다. 이 혼합물에, 석유 에터(500㎖)를 첨가하고, 10분 동안 격렬하게 교반하였다. 석유 에터층을 따라내고, 잔사를 석유 에터(×2)로 반복해서 처리하였다. 유성 잔사를 DCM/NaHCO3(1:1)(300㎖) 간에 분배시켰다. 유기 층을 분액시키고, 수성 층을 DCM(2×150㎖)에 더욱 추출하였다. 유기 층을 합하여 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 휘발물을 감압 하에 증발시켰다. 조질의 생성물 1c를 석유 에터 내지 석유 에터:EtOAc 1:1(v/v)의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(Biotag silica gel column)(50g)에 의해 정제시켜 1.63g의 뉴클레오사이드 1b를 담황색 발포물로서 얻었다(부분입체이성질체, 수율 82%). 1H NMR (d6 DMSO, 400 MHz): δ, 0.95 (s, 9H, tBu), 2.16-2.28 (m, 2H, H-2'), 3.67 (s, OMe), 3.65 -3.85 (m, 2H, HH-5'), 3.77 (dd, J = 11.1, 4.5　Hz, 1H, HH-5'), 3.95-3.98 (m, 1H, H-4'), 4.04 (m, 2H, CH2F), 4.63-4.64 (m, 1H, H-3'), 5.01-5.32 (s, 1H, CH), 6.00 (m, 1H, H-1'), 6.72-6.87 (m, 3H, Ar), 7.35-7.44 (m, 7H, Ar), 7.55-7.60 (m, 4H, Ar), 7.88 (s, 1H, H-6), 9.95 (brt, 1H, NH), 11.70 (s, 1H, NH).
N2 하에 분자체(4Å)를 구비하는 무수 CH2Cl2(14㎖) 중 출발 뉴클레오사이드 1b(1.14g, 1.4m㏖)의 용액에 사이클로헥센(1.44㎖, 14m㏖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 드라이아이스/아세톤욕으로 -78℃로 냉각시켰다. DCM(14㎖) 중 염화설퍼릴(580㎕, 7.2m㏖)의 용액을 N2 하에 90분에 걸쳐서 서서히 첨가하였다. 20분 후에 그 온도에서 TLC(EtOAc:석유 에터=1:1 v/v)는 출발 뉴클레오사이드의 완전한 소비를 나타내었다. 휘발물을 감압(25℃의 실온) 하에 증발시키고, 유성 잔사를 발포될 때까지 더욱 10분 동안 고진공으로 신속하게 만들었다. 조질의 생성물을 N2로 퍼지시키고 나서 무수 DMF(5㎖)에 용해시키고, NaN3(470㎎, 7m㏖)를 한번에 첨가하였다. 얻어진 현탁액을 실온에서 2시간 동안 또는 TLC가 반응 완료와 1c의 두 이성질체(a 및 b)로서의 형성을 나타낼 때까지 교반하였다. 이 반응 혼합물을 EtOAc:NaHCO3(1:1)(200㎖) 간에 분배시켰다. 유기 층을 분액시키고, 수성 층을 EtOAc(2×100㎖)에 더욱 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 휘발물을 감압 하에 증발시켰다. 1c의 두 부분입체이성질체(A 및 B)를 석유 에터 내지 석유 에터:EtOAc 1:1(v/v)의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(25g)에 의해 담황색 발포물로서 분리시켰다.
이성질체 A (370㎎, 수율: 38%). 1H NMR (d6 DMSO, 400 MHz): δ 1.02 (s, 9H, tBu), 2.35　- 2.43 (m, 2H, H-2'), 3.76-3.80 (m, 1H, H-5'), 3.88 - 3.92 (m, 1H, H-5'), 4.10 - 4.12 (m, 1H, H-4'), 4.14 (d, J = 4.1　Hz 2H, NHCH2), 4.46-4.60 (m, 3H, H-3', CH2F), 5.05-5.09 (m,　1H, CHN3), 6.11 (t, J = 6.1　Hz, 1H, H-1'), 7.47 - 7.51 (m, 6H, Ar), 7.64 - 7.68 (m, 4H, Ar), 7.97 (s, 1H, H-6), 10.03 (bt, 1H, J = 10.0　Hz, NH), 11.76 (s, 1H, NH). 19F NMR: -74.3 (CF3), -230.2 (CH2F).
이성질체 B (253㎎, 수율: 26%). 1H NMR (d6 DMSO, 400 MHz): δ 1.01 (s, 9H, tBu), 2.38-2.42 (m, 2H, H-2'), 3.74-3.78 (m, 1H, H-5'), 3.86-3.90 (m, 1H, H-5'), 4.00-4.05 (m, 1H, H-4'), 4.12 (d, J = 4.1　Hz 2H, NHCH2), 4.45-4.60 (m, 3H, H-3', CH2F), 5.00-5.14 (m,　1H, CHN3), 6.09 (t, J = 6.1　Hz, 1H, H-1'), 7.41 - 7.50 (m, 6H, Ar), 7.63-7.66 (m, 4H, Ar), 7.95 (s, 1H, H-6), 10.01 (bs, 1H, NH), 11.74 (s, 1H, NH). 19F NMR: -74.5 (CF3), -230.4 (CH2F).
출발 물질 1c(이성질체 A)(500㎎, 0.71m㏖)를 THF(3㎖)에 용해시키고, 빙욕에서 4℃로 냉각시켰다. 이어서, TBAF(THF 중 1.0M, 5 중량%의 물, 1.07㎖, 1.07m㏖)를 5분의 기간에 걸쳐서 서서히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온까지 서서히 가온시켰다. 반응 과정은 TLC(석유 에터:EtOAc 3:7(v/v))에 의해 모니터링하였다. 반응은 TLC에 의해 출발 물질이 더 이상 보이지 않을 때인 1시간 후에 정지시켰다. 반응 용액을 EtOAc(50㎖)에 용해시키고, NaHCO3(60㎖)에 첨가하였다. 두 층을 분액시키고, 수성 층을 추가의 DCM(50㎖×2)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여, 건조시키고(MgSO4), 여과시키고 증발시켜 황색 오일을 얻었다. 조질의 생성물 1d(이성질체 A)를 석유 에터:EtOAc 8:2(v/v) 내지 EtOAc의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(10g)에 의해 백색 고체(183㎎, 수율: 56%)로서 정제시켰다.
이성질체 A: 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): d 2.24-2.35 (m, 2H, H-2'), 3.56-3.66 (m, 2H, H-5'), 3.96-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.23 (s, 2H, CH 2NH), 4.33-4.37 (m, 1H, H-3'), 4.43-4.51 (m, CH2F), 5.12 (br.s, 1H, CHN3), 5.23 (br.s, 1H, 5'-OH), 6.07 (t, J=6.7 Hz, 1H, H-1'), 8.26 (s, 1H, H-6), 10.11 (br s, 1H, NH), 11.72 (br s, 1H, NH). 19F NMR: -74.3 (CF3), -230.5 (CH2F)
동일한 반응을 360㎎ 규모에서 1c(이성질체 B)에 대해서 수행하여 대응하는 생성물 1d(이성질체 B, 150㎎, 63%)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): d 2.24-2.37 (m, 2H, H-2'), 3.57-3.70 (m, 2H, H-5'), 3.97-4.01 (m, 1H, H-4'), 4.23 (br.s, 2H, CH 2NH), 4.33-4.37 (m, 1H, H-3'), 4.44-4.53 (m, CH2F), 5.11-5.21 (br.s, 1H, CHN3), 5.23 (br.s, 1H, 5'-OH), 6.07 (t, J=6.6 Hz, 1H, H-1'), 8.23 (s, 1H, H-6), 10.09 (br s, 1H, NH), 11.70 (br s, 1H, NH). 19F NMR: -74.1 (CF3), -230.1 (CH2F).
대응하는 트라이포스페이트 1e의 제조 및 완전 작용성 뉴클레오타이드 트라이포스페이트(ffN) 1f를 제공하기 위하여 핵염기에의 염기의 추가의 부착은 제WO 2004/018497호에 보고되어 있고, 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
실시예 2
3'-OH 보호기를 가진 뉴클레오타이드의 합성
Figure 112018062134087-pat00005
반응식 2.
반응식 2는 3'-OH 보호기로서 C-아미도 치환된 아지도메틸을 가진 변형된 뉴클레오타이드의 제조를 위한 합성 경로를 예시한다. 화합물 2a 내지 2i는 변형된 티민(T-PA)을 염기로서 이용하였다. 이용될 수 있는 염기의 다른 비제한적인 예는 Cbz-PA, ADMF-PA 및 GPac-PA를 포함하며, 이들 구조는 반응식 1에서 위에서 도시되어 있다. 실험 절차에서, N,N-다이메틸-C(=O)- 치환된 아지도메틸 보호기(R = NMe2)를 가진 화합물 2f 및 후속의 반응이 보고되었다. 다른 C-아미도기를 가진 화합물, 예컨대, N-에틸-C(=O)-(R = NHEt)도 제조되었다.
실험 절차
무수 CH3CN(50㎖) 중 출발 뉴클레오사이드 2a(4.27g, 6.9m㏖)의 용액에 2,6-루티딘(2.4㎖, 20.7m㏖), S(CH2CH2OAc)2(12.2g, 69m㏖) 및 이어서 Bz2O2(50% 순도, 33.4g, 69m㏖)를 4℃에서 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온에서 서서히 가온시켰다. 이 혼합물을 더욱 12시간 동안 교반하였다. TLC(EtOAc:DCM = 4:6 v/v)는 출발 뉴클레오사이드의 완전한 소비를 보기 위하여 모니터링하였다. 반응물은 이어서 감압 하에 유성 잔사로 농축시켰다. 이 혼합물에, 석유 에터(800㎖)를 첨가하고 10분 동안 격렬하게 교반하였다. 석유 에터층을 따라내고 잔사를 석유 에터(x2)로 반복해서 처리하였다. 유성 잔사를 이어서 DCM/NaHCO3(1:1)(1000㎖) 간에 분배시켰다. 유기 층을 분액시키고, 수성 층을 DCM(2x500㎖)으로 더욱 추출하였다. 유기 층을 합하여 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 휘발물을 감압 하에 증발시켰다. 조질의 생성물 2b를 석유 에터 내지 석유 에터:EtOAc 2:8(v/v)의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(100g)에 의해 담황색 발포물(4.17g, 수율: 74%, 부분입체이성질체)로서 정제시켰다.
N2 하에 분자체(4Å)를 구비하는 무수 CH2Cl2(56㎖) 중 출발 뉴클레오사이드 2b(4.54g, 5.56m㏖)의 용액에 사이클로헥센(5.62㎖, 56m㏖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 빙욕을 이용해서 4℃로 냉각시켰다. DCM(25㎖) 중 염화설퍼릴(1.13㎖, 13.9m㏖)의 용액을 N2 하에 90분에 걸쳐서 서서히 첨가하였다. 30분 후에 그 온도에서 TLC(EtOAc:DCM = 4:6 v/v)는 출발 뉴클레오사이드 2b의 10%가 남아 있는 것을 나타내었다. 이 반응 혼합물에 추가의 염화설퍼릴(0.1㎖)을 첨가하였다. TLC는 2b의 완전한 전환을 나타내었다. 휘발물을 감압(그리고 25℃의 실온) 하에 증발시키고, 유성 잔사를 발포될 때까지 더욱 10분 동안 고진공으로 신속하게 만들었다. 이어서 조질의 생성물을 N2로 퍼지시키고 무수 DMF(5㎖)에 용해시키고 나서 NaN3(1.8g, 27.8m㏖)를 한번에 첨가하였다. 얻어진 현탁액을, 실온에서 2시간 동안 또는 TLC가 반응의 완료 및 두 이성질체(A 및 B)로서의 2c의 형성을 나타낼 때까지 교반하였다. 이 반응 혼합물을 EtOAc:NaHCO3(1:1)(1000㎖) 간에 분배시켰다. 유기 층을 분액시키고, 수성 층을 EtOAc(2×300㎖)로 더욱 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 휘발물을 감압 하에 증발시켰다. 두 부분입체이성질체 2c(이성질체 A 및 B)를 석유 에터 내지 석유 에터:EtOAc 1:1(v/v)의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(100g)에 의해 담황색 발포물로서 분리시켰다. 이성질체 A: 1.68g, 수율: 40.7%. 이성질체 B: 1.79g, 수율: 43.2%.
MeOH/THF(1:1)(20㎖) 중 출발 뉴클레오사이드 2c(이성질체 A)(1.63g, 2.2m㏖)의 용액에 NaOH(물 중 1M)(2.2㎖, 2.2m㏖)를 서서히 첨가하고 4℃에서 교반하였다. 반응 진행은 TLC(EtOAc:DCM = 4:6 v/v)에 의해 모니터링하였다. 반응은 TLC에 의해 출발 물질이 더 이상 보이지 않을 때인 1시간 후에 정지시켰다. 이 반응 혼합물을 DCM:NaHCO3(1:1)(150㎖) 간에 분배시켰다. 유기 층을 분액시키고, 수성 층을 DCM(2×70㎖)으로 더욱 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 휘발물을 감압 하에 증발시켰다. 조질의 생성물 2d를 석유 에터:EtOAc(8:2)(v/v) 내지 EtOAc의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(10g)에 의해 담황색 발포물(1.1g, 수율: 71%)로서 정제시켰다.
동일한 반응을 2c(이성질체 B, 1.57g)에 대해서 반복하여 대응하는 생성물 2d(이성질체 B, 1.01g, 수율 69%)를 얻었다.
CH3CN(10㎖) 중 출발 뉴클레오사이드 2d(이성질체 A)(700㎎, 1m㏖)의 용액에 실온에서 TEMPO(63㎎, 0.4m㏖) 및 BAIB(644㎎, 2m㏖)로 처리하였다. 반응 진행은 TLC(EtOAc:DCM = 7:3 v/v)에 의해 모니터링하였다. 반응은 TLC에 의해 출발 물질이 더 이상 보이지 않을 때인 2시간 후에 정지시켰다. 이 반응 혼합물을 DCM:Na2S2O3(1:1)(100㎖) 간에 분배시켰다. 유기 층을 분액시키고, 수성 층을 DCM(2×70㎖)으로 더욱 추출하였다. 이어서 유기 추출물을 합하여 NaCl(포화)로 세척하였다. 생성물이 석출되는 것을 방지하기 위하여 MgSO4 상에서 건조시키는 일 없이 유기 층을 감압 하에 증발시켰다. 조질의 생성물 2e를 석유 에터:EtOAc(1:1)(v/v) 내지 EtOAc 내지 MeOH:EtOAc(1:9)의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(10g)에 의해 담황색 발포물(이성질체 A, 482㎎, 수율 68%)로서 정제시켰다.
동일한 반응을 2d(이성질체 B, 700㎎)에 대해서 수행하여 대응하는 생성물 2e(이성질체 B, 488㎎, 수율 69%)를 얻었다.
CH3CN(10㎖) 중 출발 뉴클레오사이드 2e(이성질체 A)(233㎎, 0.33m㏖)의 용액에 실온에서 후니그의 염기(Hunig's base)(173㎕, 1m㏖) 및 BOP(165㎎, 0.39m㏖)를 첨가하였다. 5분 동안 교반 후, 이 용액을 Me2NH(THF 중 2M)(0.41㎖, 0.82m㏖)로 처리하였다. 반응 진행은 TLC(MeOH:DCM = 1:9 v/v)에 의해 모니터링하였다. 반응은 TLC에 의해 출발 물질이 더 이상 보이지 않을 때인 2시간 후에 정지시켰다. 이 반응 혼합물을 DCM:NaHCO3(1:1)(50㎖) 간에 분배시켰다. 유기 층을 분액시키고, 수성 층을 DCM(2×30㎖)으로 더욱 추출하였다. 유기 추출물을 합하여 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과 후 휘발물을 감압 하에 증발시켰다. 조질의 생성물 2f(R = NMe2)를 DCM:EtOAc(8:2)(v/v) 내지 EtOAc의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(10g)에 의해 담황색 발포물(이성질체 A, 220㎎, 수율 90%)로서 정제시켰다.
동일한 반응을 2e(이성질체 B, 249㎎)에 대해서 수행하여 대응하는 생성물 2f(이성질체 B, 240㎎, 수율 92%)를 얻었다.
출발 물질 2f(이성질체 A와 B의 혼합물)(455㎎, 0.61m㏖)를 THF(2㎖)에 용해시키고 빙욕을 이용해서 4℃로 냉각시켰다. 이어서, TBAF(THF 중 1.0M, 5 중량%의 물, 1.0㎖, 1.0m㏖)를 5분의 기간에 걸쳐서 서서히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온까지 서서히 가온시켰다. 반응 진행은 TLC(EtOAc)에 의해 모니터링하였다. 반응은 TLC에 의해 출발 물질이 더 이상 보이지 않을 때인 1시간 후에 정지시켰다. 반응 용액을 DCM(30㎖)에 용해시키고 NaHCO3(30㎖)에 첨가하였다. 두 층을 분액시키고, 수성 층을 추가의 DCM(30㎖×2)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여, 건조시키고(MgSO4), 여과시키고 증발시켜 황색 오일을 얻었다. 조질의 생성물 2g를 DCM:EtOAc 8:2(v/v) 내지 EtOAc 내지 MeOH:EtOAc(2:8)의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(10g)에 의해 백색 고체(수율 52%, 160㎎)로서 정제시켰다.
대응하는 트라이포스페이트 2h의 제조 및 완전 작용성 뉴클레오타이드 트라이포스페이트(ffN) 2i를 제공하기 위하여 핵염기에의 염기의 추가의 부착은 제WO 2004/018497호에 보고되어 있고, 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
실시예 3
3'-OH 보호기를 가진 뉴클레오타이드의 합성
Figure 112018062134087-pat00006
반응식 3.
반응식 3은 다이플루오로메틸 치환된 아지도메틸 3'-OH 보호기를 가진 변형된 뉴클레오타이드의 제조를 위한 합성 경로를 예시한다. 화합물 3a 내지 3i는 변형된 티민(T-PA)을 염기로서 이용한다. 이용될 수 있는 염기의 기타 비제한적인 예는 Cbz-PA, ADMF-PA 및 GPac-PA를 포함하고, 이 구조는 반응식 1에서 위에서 표시되어 있다. 3b, 3c 및 3d의 합성을 위한 절차는 실시예 2에 기재되어 있었다.
실험 절차
무수 DCM(5㎖) 중 출발 뉴클레오사이드 3d(이성질체 A)(490㎎, 0.7m㏖) 및 DBU(209㎕, 1.4m㏖)의 용액에 -78℃에서 무수 DCM(2㎖) 중 N-tert-뷰틸 벤젠 설핀이미도일 클로라이드(181㎎, 0.84m㏖)의 용액을 서서히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 -78℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 진행은 TLC(EtOAc:DCM 4:6 v/v)에 의해 모니터링하였다. 반응은 과반응을 방지하기 위하여 TLC에 의해 여전히 10% 출발 물질이 남아 있었을 때인 2시간 후에 정지시켰다. 이 반응 혼합물을 DCM:NaHCO3(1:1)(50㎖) 간에 분배시켰다. 수성 층을 DCM(2×30㎖)에서 더욱 추출하였다. 유기 추출물을 합하여, 건조시키고(MgSO4), 여과 후 증발시켜 황색 오일을 얻었다. 조질의 생성물 3e를 석유 에터:EtOAc(8:2)(v/v) 내지 석유 에터:EtOAc(2:8)(v/v)의 구배를 이용해서 바이오태그 실리카겔 칼럼(10g)에 의해 정제시켜 담황색 발포물로서 얻었다(이성질체 A, 250㎎, 수율 51%).
동일한 반응을 3d(이성질체 B, 480㎎)에 대해서 수행하여 대응하는 생성물 3e(이성질체 B, 240㎎, 수율 50%)를 얻었다.
DCM(2.5㎖) 중 출발 뉴클레오사이드 3e(이성질체 A)(342㎎, 0.49m㏖), EtOH(15㎕, 0.25m㏖)의 용액에 4℃(빙욕)에서 DCM(2.5㎖) 중 DAST(181㎎, 0.84m㏖)을 서서히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 4℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 진행은 TLC(EtOAc:석유 에터 = 3:7 v/v)에 의해 모니터링하였다. 반응은 1시간 후에 정지시켰다. 이 반응 혼합물을 DCM:NaHCO3(1:1)(50㎖) 간에 분배시켰다. 수성 층을 DCM(2×30㎖)에서 더욱 추출하였다. 유기 추출물을 합하여, 건조시키고(MgSO4), 여과 후 증발시켜 황색 오일을 얻었다. 조질의 생성물 3f를 석유 에터:EtOAc(9:1)(v/v) 내지 석유 에터:EtOAc(2:8)(v/v)의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(10g)에 의해 정제시켜 담황색 발포물로서 얻었다(이성질체 A, 100㎎, 28%).
동일한 반응을 3e(이성질체 B, 480㎎)에 대해서 수행하여 대응하는 생성물 3f(이성질체 B, 240㎎, 수율 50%)를 얻었다.
출발 물질 3f(이성질체 A)(124㎎, 0.17m㏖)를 THF(2㎖)에 용해시키고, 빙욕을 이용해서 4℃까지 냉각시켰다. 이어서, TBAF(THF 중 1.0M, 5 중량%의 물, 255㎕, 10.255m㏖)를 5분의 기간에 걸쳐서 서서히 첨가하였다. 이 반응 혼합물을 실온까지 서서히 가온시켰다. 반응 진행을 TLC(EtOAc)에 의해 모니터링하였다. 반응은 TLC에 의해 더 이상 출발 물질이 보이지 않을 때인 1시간 후에 정지시켰다. 반응 용액을 DCM(30㎖)에 용해시키고 NaHCO3(30㎖)에 첨가하였다. 두 층을 분액시키고 수성 층을 추가의 DCM(30㎖×2)으로 추출하였다. 유기 추출물을 합하여, 건조시키고(MgSO4), 여과 후 증발시켜 황색 오일을 얻었다. 조질의 생성물 3g을 DCM:EtOAc 8:2(v/v) 내지 EtOAc 내지 MeOH:EtOAc(2:8)의 구배를 이용하는 바이오태그 실리카겔 칼럼(4g)에 의해 정제시켜 담황색 발포물로서 얻었다(이성질체 A, 수율 54%, 44㎎).
이성질체 A: 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 2.24-2.35 (m, 2H, H-2'), 3.56-3.66 (m, 2H, H-5'), 3.96-4.00 (m, 1H, H-4'), 4.23 (s, 2H, CH 2NH), 4.33-4.37 (m, 1H, H-3'), 4.85 (s, 2H, OCH2N3), 5.23 (t, J=5.1 Hz, 1H, 5'-OH), 6.07 (t, J=6.7 Hz, 1H, H-1'), 8.19 (s, 1H, H-6), 10.09 (br s, 1H, NH), 11.70 (br s, 1H, NH). 19F NMR: -74.4 (CF3), -131.6 (CH2F).
동일한 반응을 3f(이성질체 B, 133㎎)에 대해서 수행하여 대응하는 생성물 3g(이성질체 B, 48㎎, 수율 54%)를 얻었다. 1H NMR (400 MHz, d6-DMSO): δ 2.27-2.44 (m, 2H, H-2'), 3.58-3.67 (m, 2H, H-5'), 4.00-4.02 (m, 1H, H-4'), 4.24 (d, J=4.1 Hz, 2H, CH 2NH), 4.57-4.58 (m, 1H, H-3'), 5.24-5.29 (m, 2H, 5'-OH, OCHN3), 6.07-6.34 (m, 2H, H-1', CHF2), 8.19 (s, 1H, H-6), 10.09 (br s, 1H, NH), 11.70 (br s, 1H, NH). 19F NMR: -74.2 (CF3), -131.4 (CH2F).
대응하는 트라이포스페이트 3h의 제조 및 완전 작용성 뉴클레오타이드(ffN) 3i를 제공하기 위하여 핵염기에의 염기의 추가의 부착은 제WO 2004/018497호에 보고되어 있고, 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
실시예 4
3'-OH 보호기의 열 안정성 시험
각종 3'-OH 보호기는 그들의 열 안정성에 관하여 조사되었다(도 1A). 열 안정성은 60℃에서 pH = 9 완충액(tris-HCl 50mM, NaCl 50mM, 트윈(tween) 0.05%, Mg2SO4 6mM) 중에서 0.1mM의 각각의 3'-OH 보호된 뉴클레오타이드를 가열함으로써 평가하였다. 각종 시점을 취하여 HPLC를 이용해서 비-차단된 재료의 형성을 분석하였다. -CH2F 및 -C(O)NHBu의 안정성은 표준 아지도메틸(-CH2N3) 보호기보다 약 2배 큰 것으로 확인되었다. -CF2H기의 안정성은 표준보다 약 10배인 것으로 확인되었다(도 1B).
실시예 5
3'-OH 보호기의 탈보호
수 개의 3'-OH 보호기의 탈보호 반응 속도가 또한 연구되었다. 표준 아지도메틸 보호기의 탈보호 속도는 -CH2F 치환된 아지도메틸 및 -C(O)NHBu 치환된 아지도메틸과 비교되었다. 더욱 열적으로 안정한 3'-OH 차단기들의 둘 모두가 탈보호제로서 포스핀(1mM THP)을 이용하는 표준 아지도메틸 보호기보다 더 빠르게 제거된 것이 관찰되었다. 이에 대해서는 도 2A를 참조하면 된다. 예를 들어, -CH2F 및 -C(O)NHBu의 반감기는, 아지도메틸의 20.4분의 반감기와 비교해서, 각각 8.9분 및 2.9분이었다(도 2B).
실시예 6
서열분석 시험
-CH2F(모노-F) 치환된 아지도메틸 3'-OH 보호기를 가진 변형된 뉴클레오타이드를 제조하고, 그들의 서열분석 성능은 Miseq 플랫폿 상에서 평가하였다. 3'-OH 보호기의 증가된 열 안정성은 덜 오염된 3'-비차단된 뉴클레오타이드를 이용하는 서열분석 화학에 대해서 보다 고품질의 뉴클레오타이드를 초래하는 것이 상정되었다. 따라서, SBS-서열분석 키트에서 3'-비차단된 뉴클레오타이드의 존재는 프레-페이징 이벤트에서 일어날 것이고, 이는 프레-페이징값으로서 수치화되었다.
짧은 12-사이클 서열분석 실험은 우선 페이징값과 프레-페이징값을 발생하는데 이용되었다. 모노-F 치환된 아지도메틸 보호된 ffN은 이하의 농도에 따라서 이용되었다: ffA-염료 1(2μM); ffT-염료 2(10μM), ffC-염료 3(2μM) 및 ffG-염료 4(5μM). 모노-F 치환된 아지도메틸기는 이성질체 A 및 B 둘 다를 포함한다. 두 염료 - 표준 Miseq 키트에서와 같은 염료 2 및 염료 5가 표지 ffT에 이용되었다. 표 1은 페이징 및 프레-페이징 영양에 관하여 평가된 모노-F 치환된 아지도메틸의 A 및 B 이성질체와의 각종 뉴클레오타이드 조합을 나타낸다. 모든 경우에, 프레-페이징값은 표준 V2 Miseq 키트 뉴클레오타이드가 이용된 대조군보다 실질적으로 낮았다(도 3).
샘플 3'-OH 보호기 페이징( % ) 프레 -페이징( % )
1 표준 Miseq V2 IMX 대조군 0.119 0.177
2 모노-F-A-이성질체 0.11 0.085
3 모노-F-A 이성질체 (ffT-염료 5) 0.076 0.032
4 모노-F-A 이성질체(A, C 및 G) + 모노-F-B-ffT-염료 5 0.095 0.083
5 모노-F-A(G, ffT-염료 5) 및 모노-F-B(A,C) 0.104 0.05
6 모노-F-A(G, T) 및 모노-F-B(A,C) 0.098 0.095
7 표준 Miseq V2 IMX 대조군 0.145 0.167
서열분석 품질 시험2×400bp 서열분석은 서열분석 품질 개선을 위한 이들 뉴클레오타이드의 잠재성을 평가하기 위하여 Miseq 상에서 수행하였다. 서열분석 시행은 제조사의 지시(일루미나사(Illumina Inc.), 캘리포니아주의 샌디에이고시에 소재)에 따라서 수행하였다. 표준 혼입 완충액은 모든 모노-F 차단된 FFN을 함유하는 혼입 완충액으로 교체하였으며, 각각은 별개의 염료 표지: ffA-염료 1(2μM), ffT-염료 2(1μM), ffC-염료 3(2μM) 및 ffG-염료 4(5μM)를 지녔다. 이용된 DNA 라이브러리는 바실러스 세레우스(B cereus) 게놈 DNA로부터 표준 TruSeq HT 프로토콜에 따라서 제작되었다.
두 서열분석 실험(모노-F 블록 A 및 B 이성질체를 이용)에 있어서, 매우 낮은 프레-페이징값이 관찰되었다. 낮은 페이징값과 결합하여, 이들 신규한 뉴클레오타이드의 응용분야는 두 사례에 있어서 Q30보다 80%를 초과하는 염기를 가진 우수한 2×400bp 서열분석 데이터를 생성하였다(이성질체 A의 Q 스코어에 대해서는 도 4A 그리고 이성질체 B의 Q 스코어에 대해서는 도 4B 참조). 이들 결과는 Miseq v2 키트에 비해서 커다란 개선을 입증하고 있다(2×250bp, 전형적인 R&D 서열분석 실험에서 80% 염기 > Q30, 또는 개시된 사양으로서 70% 염기 > Q30). 이하에 나타낸 바와 같이, 표 2는 IMX에서 모든 모노-F ffNs-A-이성질체를 이용한 경우의 서열분석 데이터를 요약하고 있다. 표 3은 IMX에서 모든 모노-F ffNs-B-이성질체를 이용한 서열분석 데이터를 요약하고 있다.
레인 타일 밀도
(K/㎟) 		클러스터 PF ( % ) 페이징/
프레페이징 (%) 		판독치 (M) 판독치PF (M) % 부정합률 ( PF ) % >= Q30 총 수득량 (G)
R1 28 690 +/- 14 93.1 +/- 0.7 0.075 / 0.051 13.35 12.43 0.58 ±0.11 89.7 5
R2 28 690 +/- 14 93.1 +/- 0.7 0.092 / 0.078 13.35 12.43 1.31±0.25 81.9 5
총합 　 　 　 　 　 　 　 85.8 9.9
레인 타일 밀도
(K/ ㎟ ) 		클러스터 PF ( % ) 페이징/
프레페이징 (%) 		판독치 (M) 판독치 PF (M) % 부정합률 ( PF ) % >= Q30 총 수득량 (G)
R1 28 816 +/- 9 92.7 +/- 0.6 0.073 / 0.033 15.79 14.64 0.44±0.11 91.2 5.9
R2 28 816 +/- 9 92.7 +/- 0.6 0.078 / 0.059 15.79 14.64 1.03±0.19 83.4 5.9
총합 　 　 　 　 　 　 　 87.3 11.7

Claims (23)

  1. 핵염기 및 3'-탄소 원자에 공유 부착된 구조 -O-CH(R)N3를 형성하는 제거 가능한 3'-하이드록시 보호기를 가진 리보스 또는 데옥시리보스 당 모이어티를 포함하는 변형된 뉴클레오타이드 분자:
    상기 구조에 있어서,
    R은 -C(R1)m(R2)n 또는 -C(=O)NR4R5이고;
    R1은 독립적으로 수소 또는 C1-6 알킬이고;
    R2는 할로겐이고;
    각각의 R4 및 R5는 독립적으로 수소 또는 C1-6 알킬이고;
    m은 1 또는 2의 정수이고;
    n은 1 또는 2의 정수이되; 단, m + n의 합계는 3이다.
  2. 제1항에 있어서, 데옥시리보스 당 모이어티를 포함하는 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵염기는 데아자퓨린인 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R은 -CHF2 또는 -CH2F인 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R은 -C(=O)NR4R5이고, 상기 R4는 수소이고, 상기 R5는 C1- 6알킬인 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵염기는 절단성 링커를 통해서 검출 가능한 표지에 연결되는 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 절단성 링커는 산 불안정성, 광불안정성이거나 또는 다이설파이드 모이어티를 포함하는 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  8. 제7항에 있어서, 상기 절단성 링커는 다이설파이드 모이어티를 포함하는 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  9. 제6항에 있어서, 상기 절단성 링커는 상기 3'-하이드록시 보호기와 유사한 모이어티를 포함하는 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  10. 제6항에 있어서, 상기 절단성 링커는 상기 3'-하이드록시 보호기와 동일한 조건에서 절단되는 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  11. 제6항에 있어서, 상기 검출 가능한 표지는 형광단인 것인, 변형된 뉴클레오타이드 분자.
  12. 뉴클레오타이드 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오타이드로서,
    상기 뉴클레오타이드 잔기는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 것인, 올리고뉴클레오타이드.
  13. 제12항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 고체 지지체에 부착된 것인, 올리고뉴클레오타이드.
  14. 서열분석 반응에서 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 대해서 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오타이드(growing polynucleotide)를 제조하는 방법으로서,
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변형된 뉴클레오타이드 분자를 상기 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키는 것을 포함하되, 상기 변형된 뉴클레오타이드의 혼입은 상기 상보적인 성장하는 폴리뉴클레오타이드에 임의의 후속 뉴클레오타이드의 도입을 방지하는, 성장하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드 분자의 혼입은 말단 전이효소, 말단 중합효소 또는 역전사효소에 의해 달성되는 것인, 성장하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드 분자의 혼입은 말단 중합효소에 의해 달성되는 것인, 성장하는 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법.
  17. 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
    상보적인 뉴클레오타이드들의 순차적인 혼입을 모니터링하는 것으로서, 혼입되는 적어도 하나의 상보적인 뉴클레오타이드가 제6항의 변형된 뉴클레오타이드 분자인, 상기 모니터링하는 것; 및
    상기 변형된 뉴클레오타이드 분자의 동일성을 검출하는 것을 포함하는, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드의 동일성은 검출 가능한 표지를 검출함으로써 결정되는 것인, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 3'-하이드록시 보호기와 상기 검출 가능한 표지는 그 다음 상보적인 뉴클레오타이드를 도입하기 전에 제거되는 것인, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 3'-하이드록시 보호기와 상기 검출 가능한 표지는 화학 반응의 단일 단계에서 제거되는 것인, 표적 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 방법.
  21. 복수 개의 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 변형된 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 키트로서,
    상기 변형된 뉴클레오타이드 분자 각각은 서로 다른 검출 가능한 표지를 포함하는 것인, 키트.
  22. 제21항에 있어서, 4개의 변형된 뉴클레오타이드 분자를 포함하고, 상기 변형된 뉴클레오타이드 분자 각각은 데옥시리보스 당 모이어티를 포함하는 것인, 키트.
  23. 제21항에 있어서, 효소 및 상기 효소의 작용에 적합한 완충액을 추가로 포함하는 것인, 키트.
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