发明内容
本发明提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒,能够进一步评估可逆性阻断dNTP的纯度。
根据本发明的第一方面,本发明提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法,包括:
(a)获取至少一装载有核酸的芯片和至少一已知序列,该已知序列与上述核酸上的部分序列互补;形成互补后,上述核酸在沿上述已知序列的延伸方向上紧接有两个特异的待测碱基,第一个碱基与待检测的可逆性阻断dNTP互补,第二个碱基与带荧光的dNTP互补;
(b)在DNA聚合酶的作用下,首先至少加入上述待检测的可逆性阻断dNTP,使上述已知序列以上述核酸为模板延伸一个碱基;然后加入上述带荧光的dNTP,使延伸一个碱基后的序列中的至少部分序列继续延伸一个碱基;
(c)采集反应后的产物的荧光信号,并根据上述荧光信号的强度推算出上述待检测的可逆性阻断dNTP中非阻断杂质的含量。
进一步地,上述两个特异的待测碱基是不同的碱基。
进一步地,上述推算依据标准曲线进行,上述标准曲线包括自然dNTP的浓度与上述浓度对应的荧光信号强度的函数关系,其中上述自然dNTP与上述第一个碱基互补。
进一步地,上述标准曲线的R2≥0.95。
进一步地,上述方法还包括制作上述标准曲线的步骤:
(d)在DNA聚合酶的作用下,首先加入不同浓度的上述自然dNTP,使上述已知序列以上述核酸为模板延伸一个碱基;然后加入上述带荧光的dNTP,使延伸一个碱基后的序列中至少部分序列继续延伸一个碱基;
(e)采集反应后的产物的荧光信号,并根据上述自然dNTP的浓度与上述荧光信号的强度关系制作上述标准曲线。
进一步地,上述步骤(d)与上述步骤(b)同步进行;上述步骤(e)与上述步骤(c)同步进行。
进一步地,上述步骤(b)和上述步骤(c)至少重复三次,上述非阻断杂质的含量是所有重复结果的平均值。
进一步地,上述步骤(b)还包括加入已知浓度的自然dNTP,上述自然dNTP与上述第一个碱基互补。
根据本发明的第二方面,本发明提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的试剂盒,包括:
至少一装载有核酸的芯片,至少一已知序列,带荧光的dNTP,DNA聚合酶;
其中,上述已知序列与上述核酸上的部分序列互补;形成互补后,上述核酸在沿上述已知序列的延伸方向上紧接有两个特异的待测碱基,第一个碱基与待检测的可逆性阻断dNTP互补,第二个碱基与上述带荧光的dNTP互补;
上述已知序列用于在上述DNA聚合酶的作用下,以上述核酸为模板、利用上述待检测的可逆性阻断dNTP延伸一个碱基;
上述带荧光的dNTP用于使延伸一个碱基后的序列中至少部分序列继续延伸一个碱基,以便采集反应后的荧光信号并推算出上述待检测的可逆性阻断dNTP中非阻断杂质的含量。
进一步地,上述试剂盒还包括:自然dNTP,其与上述第一个碱基互补,用于在DNA聚合酶的作用下,使上述已知序列以上述核酸为模板延伸一个碱基,以便上述带荧光的dNTP使延伸一个碱基后的序列中至少部分序列继续延伸一个碱基,进而采集反应后的荧光信号并制作上述荧光信号与上述自然dNTP浓度的标准曲线。
本发明的检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法,以装载有核酸的芯片为载体,使用与核酸上的部分序列互补的已知序列作为延伸引物,利用有效的可逆性阻断dNTP加入已知序列后阻止后续带荧光的dNTP加入的特性,以及非阻断杂质或自然dNTP加入已知序列后不能阻止后续带荧光的dNTP加入的特性,建立起非阻断杂质或自然dNTP含量与荧光信号强度的线性关系,从而根据荧光信号强度推算出非阻断杂质含量。能够进一步评估可逆性阻断dNTP的纯度,并且精确度更高。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
可逆性阻断dNTP是指脱氧核糖的3’端被阻断基团阻断的dNTP。本发明实施例中,阻断基团可以是任何本领域中用于阻断dNTP的3′羟基的基团,典型单非限定性的包括叠氮亚甲基。其它的可用阻断基团还包括例如国际申请WO2014139596A1中公开的那些阻断基团。本发明对阻断基团的种类没有特别限定,根据本发明的原理,任何本领域中用于阻断dNTP的3′羟基的基团都可以作为本发明中的阻断基团。这些阻断基团都能够可逆地从dNTP上脱落下来,因此会存在非阻断杂质(正常的dNTP),这些非阻断杂质会导致测序过程中,每个循环本应合成一个碱基,却合成二个或更多的碱基,即所谓预定相现象。
因此,本发明的目的在于,提供一种检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法,以精确定量可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量,进而评估预定相的严重程度。
请参考图1,本发明实施例以检测可逆性阻断dATP中非阻断杂质(正常的dATP)含量为例,来说明本发明的原理、方法和效果。可逆性阻断dCTP、dTTP、dGTP中非阻断杂质的含量检测方法类似。
本发明实施例的方法包括:(a)提供至少一装载有核酸的芯片和至少一已知序列,该已知序列与核酸上的部分序列互补;形成互补后,核酸在沿已知序列的延伸方向(图1中从左至右的方向)上紧接有两个特异的待测碱基(图1中的T、G),第一个碱基(图1中的T)与待检测的可逆性阻断dATP互补,第二个碱基(图1中的G)与带荧光的dCTP互补;(b)在DNA聚合酶的作用下,首先至少加入待检测的可逆性阻断dATP,使已知序列以核酸为模板延伸一个碱基(图1中的A);然后加入带荧光的dCTP,使延伸一个碱基(图1中的A)后的序列中的至少部分序列继续延伸一个碱基(图1中的C);(c)采集反应后的产物的荧光信号,并根据荧光信号的强度推算出待检测的可逆性阻断dATP中非阻断杂质(正常的dATP)的含量。
本发明实施例中的核酸可以是任意固定在芯片上的可以作为扩增模板的序列,尤其可以是DNA纳米球(DNB),其是测序技术领域,尤其是Complete Genomics(简称CG)基因测序平台中的技术。基因组DNA首先经过片段化处理,再加上接头序列,并环化形成单链环状DNA,随后使用滚环扩增技术可将单链环状DNA扩增2-3个数量级,所产生的扩增产物称为DNA纳米球,最终DNA纳米球经过DNB装载技术固定在阵列化的硅芯片上。
本发明实施例的已知序列实际上就是一段引物序列,其与核酸(如DNA纳米球)上的部分序列互补,以核酸为模板引导DNA聚合反应。已知序列的延伸方向也就是5’至3’的方向,相当于核酸上的3’至5’的方向。
所谓“紧接有两个特异的待测碱基”,是指在核酸上,紧挨着与已知序列的3’端最后一个碱基配对的那个碱基的两个特异的待测碱基。其中,从核酸上3’至5’的方向上看,这两个特异的待测碱基依次被称为第一个碱基和第二个碱基。从检测精确度的角度出发,第一个碱基和第二个碱基采用不同的碱基能够避免干扰,精确度更高。
本发明实施例的方法,利用了有效的可逆性阻断dNTP加入已知序列后阻止后续带荧光的dNTP加入的特性,以及非阻断杂质或自然dNTP加入已知序列后不能阻止后续带荧光的dNTP加入的特性,建立起非阻断杂质或自然dNTP含量与荧光信号强度的线性关系,从而根据荧光信号强度推算出非阻断杂质含量。
本发明实施例还包括制作自然dNTP的浓度与浓度对应的荧光信号强度的函数关系的标准曲线。以图1所示的原理和流程图为例,具体可以包括:(d)在DNA聚合酶的作用下,首先加入不同浓度的自然dATP(图1中普通的dATP),使已知序列以核酸为模板延伸一个碱基(图1中的A);然后加入带荧光的dCTP,使延伸一个碱基后的序列中至少部分序列继续延伸一个碱基(图1中的C);(e)采集反应后的产物的荧光信号,并根据自然dNTP的浓度与荧光信号的强度关系制作标准曲线。其中,不同浓度的自然dATP可以是梯度浓度的自然dATP,例如图1中第1-5号中的15nm、0nm、5nm、10nm、20nm的普通的dATP。
标准曲线示出了自然dNTP的浓度与荧光信号强度的线性函数关系,从而只要测得待检测的可逆性阻断dNTP作为反应物所采集的荧光信号,即可计算出其中所含的非阻断杂质(自然/普通的dNTP)的含量。
需要说明的是,本发明实施例中,自然dNTP或普通的dNTP都是指没有任何阻断基团阻断的dNTP。
在实际应用中,用于制作标准曲线的反应,即步骤(d)和步骤(e),与检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的反应,即步骤(b)和步骤(c),可以同步进行。也就是说,步骤(d)与步骤(b)同步进行;步骤(e)与步骤(c)同步进行。
在实际应用中,为了提高检测结果的精确性,可以设置至少三次重复反应,也就是步骤(b)和步骤(c)至少重复三次,每一次都得到一个非阻断杂质的含量结果,最终非阻断杂质的含量是所有重复结果的平均值。
上述重复反应可以是完全相同的平行重复,即试剂用量完全相同。也可以是试剂用量有差别的重复反应,例如不同重复中可逆性阻断dNTP的体积用量不同。还可以是,在可逆性阻断dNTP中加入已知浓度的自然dNTP,该自然dNTP与第一个碱基互补。在此情况下,总的荧光信号来源于自然dNTP加入已知序列之后再进一步与带荧光的dNTP反应的结果,也来源于非阻断杂质加入已知序列之后再进一步与带荧光的dNTP反应的结果。根据总的荧光信号计算出自然dNTP和非阻断杂质的总浓度,之后扣除前者即得到非阻断杂质的含量。这样做的好处在于,单纯非阻断杂质参与反应引起的荧光信号的强度可能偏小,从而使得误差偏大,加入已知浓度的自然dNTP后,荧光信号的强度能够有效提高,降低了检测误差。
考虑到可逆性阻断dNTP中的非阻断杂质的含量一般很低,例如1%以下,甚至0.1%以下,因此所加入的自然dNTP的浓度与可逆性阻断dNTP的浓度应该有2-3个数量级的差别。如图1所示,在第6-8号所示的三个重复反应中,可逆性阻断dNTP的浓度是5微摩尔,而自然dNTP的浓度分别是0、5、15纳摩尔。
在本发明实施例中,标准曲线中自然dNTP的浓度与荧光信号强度具有良好的线性关系,标准曲线的R2≥0.95。这保证了本发明方法的精确度。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案和效果,应当理解,实施例并不是限制性的,不能理解为对本发明保护范围的限制。
1.器材:Bgiseq1000测序仪(BGI),测序芯片(BGI),VWR加热板;PCR仪;PCR 8连管。
2.试剂:如下表1所示。
表1
3.试剂制备:
3.1构建ssDNA文库和制备DNB,此DNB上包含一段已知的接头序列,且能与设计的引物互补。
3.2设计并稀释以下引物至5μM,序列(英俊公司合成)如下表2,其中括号中的碱基表示待合成的碱基,不是引物的组成部分。
表2
3.3分别配置100nM、60nM、30nM的自然dATP、dTTP、dGTP、dCTP,按以下表3的顺序依次配置,每一步都需充分混匀。
表3
3.4分别准备10μM待测可逆性阻断的dATP、dTTP、dGTP、dCTP(共4管),按以下表4配方配制并震荡混匀。
表4
3.5分别准备预混液pre mix-1(4种的dNTP),按以下表5-表8配方配制至8连管中。
表5 pre QC-A mix-1
表6 preQC-T mix-1
表7 pre QC-C mix-1
表8 pre QC-G mix-1
3.6准备混合液mix-1:
按以下表9配方配制,混匀后分别加入3.5的八连管中,每管10μL,加入后震荡混匀并离心待用,并分别命名QC-A mix-1、QC-T mix-1、QC-C mix-1、QC-G mix-1。
表9
3.7准备混合液mix-2:
按以下表10-13配方配制,震荡混匀后分装至8连管中,每管30μL,待用。
表10 QC-A mix-2
表11 QC-T mix-2
表12 QC-C mix-2
表13 QC-G mix-2
3.8准备1×Standard Taq buffer:
按以下表14配方配制,震荡混匀后分装至两个8连管中,每管150μL待用。
表14
3.9实验步骤如下:
4种待测可逆性阻断dNTP,需要4张芯片,其中试剂对应关系如下表15。
表15
3.9.1芯片预处理:在28℃下用50μL/管用读取缓冲液(Read Buffer,BGI)洗芯片两次,并赶气泡,保证芯片内充满读取缓冲液;
3.9.2在28℃下用50μL/管杂交缓冲液(Pre-Anchor Wash Buffer,BGI)洗芯片一次,保证芯片内充满杂交缓冲液并孵育5分钟;
3.9.3向芯片中加入30μL/管的5μM对应的QC-anchor室温下孵育30分钟以上;
3.9.4在28℃下用50μL/管读取缓冲液洗芯片5次,保证芯片内充满读取缓冲液,用无尘纸擦拭芯片表面至干净;
3.9.5将芯片放置在68℃的加热板上,预热1分钟;
3.9.6将1×标准Taq缓冲液分装至8连管中,120μL/管,放置在68℃的PCR仪上预热2分钟;
3.9.7向芯片中加入50μL预热的1×标准Taq缓冲液,并重复一次,保证芯片中充满1×标准Taq缓冲液;
3.9.8将预热的对应的QC mix-1对应的加入芯片的每管中,保证芯片中无气泡,68℃孵育3分钟;
3.9.9向芯片中加入50μL预热的1×标准Taq缓冲液,并重复一次,保证芯片中充满1×标准Taq缓冲液;
3.9.10将预热的对应的QC mix-2加入芯片的每管中,保证芯片中无气泡,68℃孵育3分钟;
3.9.11将芯片从加热板上取下,向芯片中加入25μL的3XSSC,保证芯片中无气泡,重复两次;
3.9.12向芯片中加入25μL的终止缓冲液(Stop buffer,BGI),保证芯片中无气泡,重复一次;
3.9.13向芯片中加入25μL的柠檬酸盐洗脱液(Citrate Wash Buffer,BGI),保证芯片中无气泡,重复一次;
3.9.14向芯片中加入50μL的读取缓冲液,保证芯片中无气泡,重复4次,用无尘纸将芯片表面擦拭干净;
3.9.15在BGI seq1000测序仪上收集信号。
4.0结果分析:
均一化每管的信号值;根据均一化后的信号值作散点图,以管1至管5的浓度为横坐标,均一化后的管1至管5的信号值为纵坐标,显示R2及E,R2≥0.95为合格;根据E计算相应的均一化后管6至管8的待测dNTP浓度为X1、X2、X3。待测dNTP的含量X为:
X={(X1/5000*100%)+[(X2-5)/5000*100%]+[(X3-15)/5000*100%]}/3。
结果如表16-19所示。
表16
表17
表18
表19
图2至图5分别示出了实施例中dATP、dCTP、dTTP和dGTP的浓度与均一化荧光信号的标准曲线图。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大基因研究院
<120> 检测可逆性阻断dNTP中非阻断杂质含量的方法和试剂盒
<130> 16I23597
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 1
ggccaagcgg tcttaggaag acaagctcga gctcgagcga 40
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 2
tcttaggaag acaagctcga gctcgagcga tcgggcttcg 40
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 3
ttaggaagac aagctcgagc tcgagcgatc gggcttcga 39
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 引物序列
<400> 4
aggccaagcg gtcttaggaa gacaagctcg agctcgagc 39