NO171981B - Alkynylaminonukleotider, fremgangsmaate for fremstilling derav, 7-jodnukleotider, merkede alkynyl-aminonukleotider samt fremgangsmaate for fremstilling av 7-(3-amino-1-propynyl)-2',3'-dideoxyguanosin-5'-trifosfat - Google Patents

Alkynylaminonukleotider, fremgangsmaate for fremstilling derav, 7-jodnukleotider, merkede alkynyl-aminonukleotider samt fremgangsmaate for fremstilling av 7-(3-amino-1-propynyl)-2',3'-dideoxyguanosin-5'-trifosfat Download PDF

Info

Publication number
NO171981B
NO171981B NO872757A NO872757A NO171981B NO 171981 B NO171981 B NO 171981B NO 872757 A NO872757 A NO 872757A NO 872757 A NO872757 A NO 872757A NO 171981 B NO171981 B NO 171981B
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
formula
added
preparation
nmr
solution
Prior art date
Application number
NO872757A
Other languages
English (en)
Other versions
NO171981C (no
NO872757D0 (no
NO872757L (no
Inventor
James Merrill Prober
Rudy Johan Dam
Jr Charles William Robertson
Jr Frank Worden Hobbs
George Leonard Trainor
Anthony Joseph Cocuzza
Original Assignee
Du Pont
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26736630&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO171981(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Du Pont filed Critical Du Pont
Publication of NO872757D0 publication Critical patent/NO872757D0/no
Publication of NO872757L publication Critical patent/NO872757L/no
Publication of NO171981B publication Critical patent/NO171981B/no
Publication of NO171981C publication Critical patent/NO171981C/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/645—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having two nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6509—Six-membered rings
    • C07F9/6512—Six-membered rings having the nitrogen atoms in positions 1 and 3
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6558—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system
    • C07F9/65586—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing at least two different or differently substituted hetero rings neither condensed among themselves nor condensed with a common carbocyclic ring or ring system at least one of the hetero rings does not contain nitrogen as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6561—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom containing systems of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring or ring system, with or without other non-condensed hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means
    • G01N27/44726—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means using specific dyes, markers or binding molecules

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

Oppfinnelsen vedrører alkynylaminonukleotider, merkede alkynylaminonukleotider, fremgangsmåte for fremstilling av 7-(3-amino-l-propynyl)-2<1>,3'-dideoxyguanosin-5<1->trifosfat, fremgangsmåte for fremstilling av alkynylaminonukleotidene, samt 7-jodnukleotider.
Sekvensbestemmelse av DNA er en av de analytiske hjørnestensteknikker innen moderne molekylærbiologi. Ut-viklingen av pålitelige fremgangsmåter for sekvensbestemmelse har ført til store fremskritt innen forståelsen av organiseringen av genetisk informasjon, og har muliggjort manipuleringen av genetisk materiale (dvs. genetisk ingeniørkunst).
For tiden er det to generelle fremgangsmåter for sekvensbestemmelse av DNA: den kjemiske nedbrytningsmetode til Maxam-Gilbert [A. Maxam et al., Meth. in Enzym., vol.
65, 499-559 (1980)] og dideoxykjedetermineringsmetoden til Sanger [F. Sanger et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, vol.
74, 5463-5467 (1977)]. Et fellestrekk ved disse to teknikkene er genereringen av et sett DNA-fragmenter som analyseres ved hjelp av elektroforese. Teknikkene er forskjellige når det gjelder metodene som brukes til å fremstille disse fragmentene.
Ved Maxam-Gilbert-teknikken fremstilles DNA-fragmenter gjennom basespesifikk kjemisk spaltning av det DNA-stykke som skal sekvensbestemmes. DNA-stykket som skal sekvensbestemmes, merkes først i 5'-enden med <32>P og oppdeles deretter i fire deler. Hver del utsettes for et forskjellig sett kjemiske behandlinger utformet for å spalte DNA i posi-sjoner som ligger ved siden av en bestemt base (eller baser). Resultatet er at alle merkede fragmenter vil ha den samme 5'-ende som det opprinnelige stykke DNA og vil ha 3'-ender definert ved posisjonene til spaltningen. Denne behandlingen utføres under betingelser som genererer DNA-fragmenter som har passende lengder for separasjon ved gelelektroforese.
Med Sangers teknikk fremstilles DNA-fragmenter gjennom delvis enzymatisk kopiering (dvs. syntese) av det DNA-stykke som skal sekvensbestemmes. Ved den mest vanlige versjon innføres det stykke av DNA som skal sekvensbestemmes ved a bruke standardteknikker i en "sekvenserende vektor", et stort ringformet, en-kjedet stykke DNA, slik som bakterio-fagen M13. Denne blir templatet for kopieringsprosessen. Et kort stykke DNA med en sekvens som er komplementær til et område av templatet like oppstrøms fra innskuddet, hektes til templatet for å tjene som en primer for syntesen. I nærvær av de fire naturlig forekommende deoxyribonukleosid-trifosfater (dNTP-er) vil en DNA-polymerase forlenge primeren fra 3'-enden, hvorved det fremstilles en komplementær kopi av templatet i området til innskuddet. For å fremstille et komplett sett sekvenseringsfragmenter, kjøres det fire reaksjoner parallelt som hver inneholder de fire dNTP-er sammen med en enkelt dideoxyribonukleosid-trifosfat-terminator (ddNTP), en for hver base. (<32>P-merket dNTP tilsettes for å gi merkede fragmenter.) Dersom et dNTP inkorporeres ved hjelp av polymerasen, kan kjedeforlengelse fortsette. Dersom det tilsvarende ddNTP velges, avsluttes kjeden. Forholdet mellom ddNTP og dNTP-er reguleres slik at det genereres DNA-fragmenter med passende lengder. Hver av de fire reaksjonsblandingene vil således inneholde en fordeling av fragmenter med den samme dideoxynukleosidresten i 31 - enden og en primerdefinert 5'-ende.
Uttrykkene "terminator", "kjedeterminator" og "kjedeterminerende substrat" brukes om hverandre for å betegne et substrat som kan inkorporeres i 3'-enden til en DNA- eller RNA-kjede ved hjelp av et enzym som replikerer nukleinsyrer på en templatrettet måte, men som, når det først er inkorpo-rert, forhindrer ytterligere kjedeforlengelse. I motsetning til dette kan de naturlige deoxynukleotidsubstrater anses for å være "kjedeforlengende substrater".
Uttrykket "nukleosid" brukes for å betegne en enhet av heterosyklisk base og sukker som er sammensatt av et pyri-midin- eller purinmolekyl (eller derivater derav) og et ribosesukkermolekyl (eller derivater eller funksjonelle ekvivalenter derav). Uttrykket "nukleotid" brukes for å betegne enten et nukleosid eller dets fosforylerte derivat. I både metoden til Sanger og til Maxam-Gilbert er basesekvensinformasjon som vanligvis ikke kan bestemmes direkte ved hjelp av fysiske metoder, blitt omdannet til kjedelengdeinformasjon som kan bestemmes. Denne bestemmelse kan utføres gjennom elektroforetisk separasjon. Under denaturerende betingelser (høy temperatur, ureaprosent etc.) migrerer korte DNA-fragmenter som om de var stive staver. Dersom en gelmatriks anvendes til elektroforesen, vil DNA-fragmentene sorteres etter størrelse. Den en-baseoppløsning som er påkrevet for sekvensbestemmelse, kan vanligvis oppnås for DNA-fragmenter som inneholder opptil flere hundre baser.
For å bestemme en full sekvens, utsettes de fire
settene med fragmenter, fremstilt ved hjelp av enten Maxam-Gilbert- eller Sanger-metodikken for elektroforese i fire parallelle felter. Dette resulterer i fragmenter som opp-løses romlig langs lengden av gelen. Mønsteret til de merkede fragmenter overføres vanligvis til lysfølsom film ved hjelp av autoradiografi (dvs. en eksponering frembringes ved å legge gelen og filmen oppå hverandre i et tidsrom). Den fremkalte film viser et sammenhengende hele av bånd fordelt i de fire feltene, ofte referert til som en sekvensbestemmende stige. Stigen avleses ved visuelt å se over filmen (idet man starter med fragmenter som beveger seg hurtigere) og bestemme feltet hvor det neste bånd opptrer for hvert trinn på stigen. Ettersom hvert felt er forbundet med en bestemt base (eller kombinasjon av baser i Maxam-Gilbert-tilfellet), oversettes den lineære utvikling av feltangivelsene direkte til basesekvens.
Fremgangsmåtene til Sanger og Maxam-Gilbert for sekvensbestemmelse av DNA er som ideer elegante og effek-tive, men de er operasjonelt vanskelige og tidkrevende. Analyser av disse teknikkene viser at mange av problemene stammer fra bruken av en enkelt radioisotoprapportør. [En rapportør kan defineres som en kjemisk gruppe som har et fysisk eller kjemisk kjennetegn som lett kan måles eller påvises ved hjelp av passende fysiske eller kjemiske detek-torsystemer eller -fremgangsmåter. Lett påvisbarhet kan tilveiebringes ved hjelp av slike kjennetegn som farge-endring, luminescens, fluorescens eller radioaktivitet; eller den kan tilveiebringes ved hjelp av rapportørens evne til å tjene som et ligandgjenkjennende sete slik at det dannes spesifikke ligand-ligandkomplekser som inneholder grupper som er påvisbare ved hjelp av konvensjonelle (f.eks. kolorimetriske, spektrofotometriske, fluorometriske eller radioaktive) påvisningsfremgangsmåter. Ligand-ligandkomplek-sene kan være i form av protein-ligand-, enzym-substrat-, antistoff-antigen-, carbohydrat-lectin-, protein-kofaktor-, protein-effektor-, nukleinsyre-nukleinsyre- eller nukleinsyre -ligandkomplekser] .
Anvendelsen av radioisotoper med kort halveringstid, slik som <32>P ved høy spesifikk aktivitet, er problematisk både ut fra et forsyningsmessig og et helse- og sikkerhets-messig synspunkt. Den korte halveringstiden til <32>P nød-vendiggjør klargjøring av reagensbehov flere dager på for-hånd og umiddelbar bruk av reagenset. Så snart det er blitt generert•<32>P-merkede DNA-sekvenserende fragmenter, er de tilbøyelige til selvødeleggelse og må øyeblikkelig gjøres til gjenstand for elektroforetisk analyse. De store elektro-foresegeler som er påkrevet for å oppnå en-baseseparasjon, fører til store volumer med forurenset buffer som gir problemer med avfallshåndtering. Den autoradiografi som er påkrevet for etterfølgende visualisering av de merkede DNA-fragmenter i gelen, er en sen prosess (eksponeringer over natten er vanlig) og gir et betydelig tidstillegg til den totale operasjon. Endelig er det mulige helserisikoer forbundet med bruken av slike sterke radioisotoper.
Bruken av bare en enkelt rapportør for å analysere posisjonen til fire baser, gir den samlede prosess betydelig operasjonell kompleksitet. De kjemisk/enzymatiske trinn må utføres i separate holdere og elektroforetisk analyse må utføres i fire parallelle felter. Varmeinduserte forstyrrelser i mobilitet resulterer i forskjøvne bilder av merkede DNA-fragmenter (f.eks. "smil"-virkningen) som igjen fører til vanskeligheter ved sammenligning av de fire felter. Disse forstyrrelser begrenser ofte antallet baser som kan avleses på en enkelt gel.
De lange tidsrom som er påkrevet for autoradiografisk bildedannelse sammen med nødvendigheten av å bruke fire parallelle felter, tvinger frem en "snapshot"-måte for visualisering. Ettersom samtidig romlig oppløsning av et stort antall bånd er påkrevet, må det brukes svært store geler. Dette resulterer i ytterligere problemer: Store geler er vanskelige å håndtere og er sene å kjøre, noe som tilfører ytterligere tid til den totale prosess.
Endelig er det et problem med manuell fortolkning. Omdannelse av en sekvensbestemmende stige til en basesekvens er en tidkrevende, feilbeheftet fremgangsmåte som påkaller den fulle oppmerksomhet hos en svært erfaren forsker. Det har vært gjort mange forsøk på å automatisere avlesningen, og noen mekaniske hjelpemidler foreligger, men fremgangsmåten for fortolkning av en sekvensgel er fortsatt omhygge-lig og sen.
For å overvinne disse problemene, har det vært vurdert å erstatte <32>P/autoradiografi med et alternativt rapportør/- påvisningssystem uten radioisotoper. Et slikt påvisnings-system må være svært følsomt for å gi en følsomhet som er sammenlignbar med <32>P; hvert bånd på en sekvensbestemmelses-gel inneholder i størrelsesorden 10"^ mol DNA. En fremgangsmåte for påvisning som er i stand til å nå dette nivå av følsomhet, er fluorescens. DNA-fragmenter kunne merkes med en eller flere fluorescensmarkører (fluorescerende fargestoffer)r Eksitasjon med en passende lyskilde ville resultere i en karakteristisk emisjon fra markøren og derved identifisere båndet.
Bruken av fluorescerende markører, i motsetning til radioisotopmarkører, ville muliggjøre lettere merking av påvisningssystemet for denne bestemte anvendelse. For eksempel ville bruken av fire forskjellige fluorescerende markører som lar seg skjelne fra hverandre på grunnlag av et eller annet emisjonskjennetegn (f.eks. spektralfordeling, halveringstid, polarisering) gjøre det mulig å binde en bestemt markør enhetlig til de sekvenserende fragmenter som er forbundet med en bestemt base. Med denne binding eta-blert ville fragmentene kombineres og oppløses i ett enkelt felt, og basebestemmelsen ville kunne gjøres direkte på
grunnlag av det utvalgte emisjonskjennetegn.
Hittil er det blitt beskrevet to forsøk på å utvikle et fluorescensbasert system for sekvensbestemmelse av DNA. Det første systemet, utviklet ved California Institute of Technology, er blitt beskrevet i DE patentsøknad nr. 3 446 635 Al, DE patentsøknad nr. 3 501 306 Al, L.M. Smith et al., Nucleic Acids Research, vol. 13, 2399-2412 (1985) og L.M. Smith et al., Nature, vol. 321, 674-679 (1986). Dette systemet retter seg mot problemene beskrevet i avsnittet ovenfor, men de nærmere detaljer ved utførelsen gjør fremgangsmåten bare delvis vellykket. For eksempel gjør det brede bølgelengdeområde for emisjonstoppene til de fluorescensmerkede fragmenter for sekvensbestemmelse av DNA som brukes i dette sysemet, det vanskelig å fremkalle alle fire fargestoffene effektivt med en enkelt monokromatisk kilde. Viktigere er det at de betydelige differensialforskyvninger i elektroforetisk mobilitet som oppstår ved fargestoffer med forskjellige nettoladninger, gjør det vanskelig eller umulig å utføre en-feltssekvensering med det settet med fargestoffer som brukes i dette systemet. Disse vanskelighetene er eksplisitt påpekt i litteraturhenvisningene ovenfor.
Den metodikk som brukes for å fremstille de fluorescensmerkede fragmenter for sekvensbestemmelse, skaper vanskeligheter. For sekvensbestemmelse etter Maxam-Gilbert ligeres 5'-merkede oligonukleotider til dobbeltkjedede fragmenter av DNA fremstilt gjennom restriksjonsspaltning, som har "klebrige ender". Dette medfører begrensning til fragmenter for sekvensbestemmelse fremstilt på denne måte. For sekvensbestemmelse etter Sanger brukes 5<1->merkede oligonukleotider som primere. Fire spesielle primere er påkrevet. For å bruke et nytt vektorsystem, må man gå gjennom den komplekse prosessen med syntetisering og rensing av fire nye fargestoffmerkede primere. Det samme gjelder bestandig når det trengs en bestemt primer.
Bruken av merkede primere er bedre også i andre sammenhenger. Polymeriseringsreaksjonene må fortsatt utføres i separate beholdere. Som ved Maxam-Gilbert- og Sanger-sekvenseringssystemene vil i praksis alle fragmenter avledet fra den merkede primer være fluorescensmerket. Det resulterende sekvensbestemmende mønster vil således bibeholde mesteparten av de felles artefakter (f.eks. falske eller skyggebånd, kollisjoner) som oppstår når enzymatisk kjedeforlengelse avbrytes av andre prosesser enn inkorporering av en kjedeterminator.
Ved en annen fremgangsmåte har W. Ansorge et al., J. Biochem. Biophys. Methods, vol. 13, 315-323 (1986) beskrevet en teknikk for sekvensbestemmelse av DNA uten radioisotoper hvor en enkelt 5'-tetramethylrhodamin-fluorescensmarkør er kovalent bundet til 5'-enden av en 17-basers oligonukleotid-primer. Denne primeren forlenges enzymatisk i fire beholdere gjennom standardmetoder for dideoxynukleotidsekvensering, hvorved man får en serie enzymatisk kopierte DNA-fragmenter med varierende lengde. Hver av de fire beholderne inneholder en dideoxynukleotidkjedeterminator som svarer til en av de fire DNA-basene som muliggjør terminal basebestemmelse ut fra konvensjonell elektroforetisk separasjon i fire gel-felter. 5'-tetramethylrhodamin-fluorescensmarkøren frem-kalles ved hjelp av en argonionlaserstråle som passerer gjennom bredden av hele gelen. Selv om dette systemet har den fordel at en fluorescerende rapportør brukes i stedet for en radioaktiv rapportør, gjenstår fortsatt alle ulempene som er forbundet med konvensjonell sekvensbestemmelse og med fremstilling av merkede primere.
Hittil har ingen skapt et system for sekvensbestemmelse av DNA som kombinerer fordelene ved fluorescenspåvisning med terminatormerking. Dersom man kunne komme frem til passende fluorescensmerkede kjedeterminatorer, ville merkede fragmenter for sekvensbestemmelse bare bli fremstilt når en merket kjedeterminator inkorporeres enzymatisk i et sekvenserende fragment, noe som ville eliminere mange av artefaktene som er forbundet med andre merkings-metoder. Dersom hver av de fire kjedeterminatorene som trengs for å sekvensbestemme DNA ble bundet kovalent til en annen fluorescensrapportør som lar seg skjelne, burde det være mulig i prinsippet å inkorporere alle fire termi-natorene under en enkelt primerforlengelsesreaksjon og deretter analysere de resulterende sekvensbestemmelsesfragmenter i ett enkelt gelfelt. Dersom man kunne komme frem til slike fluorescensmerkede kjedeterminatorer, ville disse forbindelsene sannsynligvis også være anvendbare for andre typer enzymatisk merking av nukleinsyrer. Særlig kunne det utformes analoger av fluorescensmerkede kjedeterminatorer for å bruke andre ikke-fluorescerende rapportører, eller for å tjene som kjedeforlengende substrater for enzymer som replikerer nukleinsyrer på en templatrettet måte (f.eks. reverstranskriptase, RNA-polymerase eller DNA-polymerase). Innføring av en rapportør i DNA på en måte som kan brukes for sekvensbestemmelse, er et av de vanskeligste problemer ved merking av nukleinsyrer. Forbindelser og/eller fremgangsmåter utviklet for sekvensbestemmelse av DNA vil sannsynligvis også være anvendbare ved mange andre merkings-problemer.
For å være anvendbart som et kjedeterminerende substrat for fluorescensbasert DNA-sekvensbestemmelse, må et substrat inneholde en fluorescensmarkør, og det må aksep-teres av et enzym som kan brukes til sekvensbestemmelse av DNA. Egnede substratkandidater forventes å være derivater eller analoger av de naturlig forekommende nukleotider. På grunn av forventningen om at en fluorescerende markør og et nukleotid ikke samtidig vil passe inn i det aktive sete til et replikasjonsenzym, må et godt utformet substrat ha den fluorescerende markør atskilt fra nukleotidet ved en sammenbindende gruppe med tilstrekkelig lengde og passende geometri til å plassere den fluorescerende markør bort fra det aktive sete til enzymet. Egenskapene til den sammenbindende gruppe kan variere med både markøren og enzymet som brukes. For å lette syntese og tilpasningsdyktighet til variasjoner i markør- og/eller enzymbehov, er det imidlertid mest passende å betrakte den sammenbindende gruppe som bestående av en kobler som er bundet til nukleotidet og til den fluorescerende markør.
Ved utformingen av fluorescensmerkede kjedeterminatorer for sekvensbestemmelse av DNA må kobleren tilfredsstille flere krav:
1) man må være i stand til å kunne binde den samme eller en funksjonelt ekvivalent kobler til alle fire basene som finnes i DNA; 2) kobleren må ikke forhindre at det merkede nukleotid utnyttes effektivt som et kjedeterminerende substrat for et enzym som kan anvendes til sekvensbestemmelse av DNA; 3) kobleren (pluss eventuelt mellomstykke og markør) må forstyrre elektroforesen av oligonukleotider som den er bundet til, på en måte som er uavhengig av basen som den er bundet til; 4) bindingen av kobleren til basen og mellomstykket eller markøren må være stereoselektiv og regioselektiv for å gi ett enkelt veldefinert nukleotidsubstrat; og 5) kobleren bør fortrinnsvis inneholde et primært eller sekundært amin for kobling til markøren.
Selv om fem forskjellige typer aminkoblere er blitt beskrevet for binding av markører til nukleotider og oligonukleotider (se nedenunder), imøtekommer ingen av disse koblerne alle fem kravene som er angitt ovenfor for bruk i et kjedeterminerende substrat som kan anvendes ved sekvensbestemmelse av DNA.
Bergstrøm et al., J. Am. Chem. Soc, vol. 98, 1587
(1976) beskriver en fremgangsmåte for binding av alken-amino- og akrylatsidekjeder til nukleotider ved hjelp av Pd(II)-katalysert kobling av 5-kvikksølv-uridiner til de-finer. I PCT/US84/00279 beskrives bruken av de ovenfor nevnte sidekjeder som koblere for binding av rapportører til ikke-enzymatiske syntetiserte oligonukleotider. Langer et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, vol. 78, 6633 (1981) beskriver bruken av allylaminokoblere for binding av rappor-tører til nukleotider. Ulempene ved disse koblerne omfatter vanskeligheten med å fremstille regioselektivt de passende kvikksølvholdige nukleotidforløpere, vanskeligheten med å separere blandingen av produkter frembrakt ved hjelp av noen av disse nukleotid-/olefinkoblingsreaksjoner, og den eventuelle labilitet hos vinylsubstituerte nukleosider. I WO 86/02929 beskrives en fremgangsmåte for binding av koblere til N4-stillingen i cytidin og N6-stillingen i adenosin. Ulempene ved denne fremgangsmåte er at det ikke finnes analogt sete i uridin og guanosin for binding av en kobler.
En annen mulig kobler som kan tilfredsstille de fem kravene angitt ovenfor, er en alkynylaminokobler hvor en ende i trippelbindingen er bundet til nukleosidet, og den andre enden i trippelbindingen er bundet til en gruppe som inneholder et primært eller sekundært amin. For å sikre kjemisk stabilitet, bør aminet ikke være direkte bundet til trippelbindingen. Noen fremgangsmåter for binding av alkyn-grupper til nukleosider er blitt beskrevet (se nedenunder).
I Barr et al., J. Chem. Soc, Perkins Trans. 1, 1263-1267 (1978) beskrives syntesene av 5-ethynyluridin, 2'-deoxy-5-ethynyluridin, 5-ethynylcytosin, 5-ethynylcytidin, 2•-deoxy-5-ethynylcytidin og a-anomerene av 2'-deoxyribo-nukleosider. 2'-deoxyribonukleosidene ble fremstilt ved å bygge opp de heterosykliske forbindelsene, koble med et funksjonalisert 2-deoxysukker, separere de anomere blandinger og fjerne beskyttelsesgruppene på sukrene.
I Bergstrøm et al., J. Am. Chem. Soc, vol. 100, 8106
(1978) beskrives den palladiumkatalyserte kobling av alkener til 5-kvikksølv- eller 5-jodderivater av uracilnukleosider. Denne fremgangsmåten ble rapportert å slå feil ved analoge reaksjoner av alkyner med uracilnukleosidderivater.
I Vincent et al., Tetrahedron Letters, vol. 22, 945-947 (1981) beskrives syntesen av 5-alkynyl-2'-deoxyuridiner ved omsetning av 0-3',5'-bis-(trimethylsilyl)-deoxyuridin og alkynylzinkreagenser i nærvær av palladium- eller nikkel-katalysatorer [diklor-bis-(trifenylfosfin)-palladium(II), diklor-bis-(benzonitril)-palladium(II) eller diklor-(ethylen)-(bis-(difenylfosfin))nikkel(II)].
I Robins et al., J. Org. Chem., vol. 48, 1854-1862
(1983) beskrives en fremgangsmåte for kobling av terminale alkyner, HC=CR (R = H, alkyl, fenyl, trialkylsilyl, hydroxyalkyl eller beskyttet hydroxyalkyl) til 5-jod-l-methyluracil og 5-joduracil-nukleosider (beskyttet som p-toluylestrene derav) i nærvær av bis-(trifenylfosfin)-palladium(II)-klorid og kobber(I)-jodid i varm triethylamin. Når 3',5'-di-O-acetyl-5-jod-2'-deoxyuridin ble omsatt med hexyn, 4-(p-toluyl-oxy)-butyn, 4-(tetrahydropyranyloxy) eller 4-(trityloxy)-butyn, ble hovedproduktene de sykliserte furano[2,3-d]pyri-midin-2-oner og ikke de ønskede alkynyluridiner.
Ingen av de ovenfor angitte litteratursteder beskriver en fremgangsmåte for binding av en alkynylaminokobler til nukleosider. Metoden til Bergstrøm slår feil, og metoden til Barr er ikke direkte anvendbar. Katalysatorene som brukes av Robins et al. og Vincent et al., har evne til å fremme en rekke uønskede bireaksjoner (f.eks. syklisering eller intermolekylær nukleofil addisjon av aminet til et alkyn) når alkynet inneholder en aminogruppe. Koblingsreaksjoner er blitt rapportert bare med jodnukleosider som inneholder en elektronfattig uracilbase. Ettersom Pd-kata-lyserte koblingsreaksjoner generelt virker best med elek-tronf attige aryljodider, kan det forventes problemer med kobling av alkyner til alle de øvrige tre basene (som alle er mer elektronrike enn uracil).
Det gjenstår et behov for alkynylaminonukleotider og for fremgangsmåter som muliggjør deres fremstilling.
Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er alkynylaminonukleotider som er kjennetegnet ved at de har formelen
hvor
Rx er en alkylenrest med 1-20 atomer,
R2 og R3 er H eller C^-C^-alkyl, eller trifluoracetyl som en beskyttelsesgruppe, og
Nuc er R4-Het med formelen
Z er H eller NH,,, og
R4 er
hvor
R5 er H, P03H2, P206H3, P309H4 eller salter derav, og (i) når R7 = R8 = H, så er R6 = H eller OH, eller (ii) når R, = H og R, = OH, så er R6 = H eller OH, eller
(iii) når R7 = OH og R8 = H, så er R6 = OH.
De merkede alkynylaminonukleotider ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at de har den samme formel I, men hvor R^ er en rapportørgruppe.
Strategien som brukes for å inkorporere rappor-tører i fragmentene for sekvensbestemmelse av DNA på en basespesifikk måte, er et avgjørende trekk ved ethvert system for sekvensbestemmelse av DNA. Bruken av alkynylaminonukleotidene ifølge oppfinnelsen muliggjør modifikasjon av metoden til Sanger på en svært fordelaktig måte ved å binde en rapportør (markør) til en alkynylamino-nukleotid-kjedeterminator. Selv om rapportøren kan velges blant en lang rekke lett påvisbare grupper (markører), er for lett-vinthets skyld den foretrukne fremgangsmåte hvor det brukes fluorescerende rapportører, illustrert nedenunder.
Denne fremgangsmåte byr på en rekke praktiske fordeler. Aller viktigst er det at terminatormerking binder den tilknyttede rapportør på en fast måte til den basespesi-fikke terminering. Bare DNA-sekvenserende fragmenter som skriver seg fra virkelige termineringer vil bære en rappor-tør. Dette eliminerer mange av de artefakter som iakttas ved konvensjonell sekvensering. Denne fremgangsmåte gir også fullstendig fleksibilitet i valget av sekvenserings-vektor, ettersom ingen spesiell primer er involvert. Auto-matisering lettes ved det faktum at rapportøren bæres av fire reagenser med lav molekylvekt som selektivt kan inn-føres i en enkelt reaksjon.
Det er ingen medfølgende praktiske ulemper; problemene med denne fremgangsmåte møter man i utformingstrinnet. Vanligvis er de enzymene som brukes for sekvensbestemmelse av DNA, svært substratselektive, og det er ingen grunn ut fra erfaring å forvente at man skal være i stand til å lage et nukleosidtrifosfat med en kovalent bundet rapportør som er et effektivt kjedeterminerende substrat for et sekvens-bestemmelsesenzym. Det ville kunne tenkes at binding av en rapportør til et substrat ville forårsake tilstrekkelige store endringer i den steriske og elektroniske karakter til substratet til å gjøre det uakseptabelt for enzymet, eller selv om det skulle bli akseptert, ville det ikke bli inkor-porert i DNA-kjeden. Det er imidlertid funnet at den lille størrelsen til alkynylaminokobleren ifølge oppfinnelsen og evnen til å binde alkynylaminokobleren til 5-stillingen i pyrimidinnukleotidene og 7-stillingen i purinnukleotidene, gir merkede kjedeterminerende substrater som ikke i over-dreven grad virker inn på graden av eller nøyaktigheten i substratinkorporeringen.
Alkynylaminonukleotidene ifølge oppfinnelsen vil bli illustrert gjennon beskrivelsen av fluorescensmerkede alkynylaminonukleotidkjedeterminatorer. For å skissere det strukturelle omfang og begrunnelsen for de fluorescensmerkede alkynylaminonukleotider ifølge oppfinnelsen, er det nyttig å bryte opp den merkede struktur (I) i fem deler: trifosfat-sukker-Het—C=CR1-NR2-markør (fluorescerende)
(i) (ii) (iii) (iv) (v)
(i) en trifosfatrest, R5
(ii) et "sukker", R4
(iii) en heterosyklisk base (Het)
(iv) en kobler (-CsCR^N!^-) og
(v) en fluorescerende markør, R3.
(i) Trifosfatrest (R5)
Trifosfatresten eller en nær analog (f.eks. a-thiotri-fosfat) er en obligatorisk gruppe for ethvert enzymsubstrat, enten det er kjedeterminerende eller ikke. Denne gruppen forsyner substratet med mye av dets bindingsenergi og er det faktiske sete for enzymsubstratreaksjonen.
(ii) Sukker (R4)
"Sukker"-delen tilsvarer 2'-deoxyribofuranosefrag-mentet i de naturlige enzymsubstrater. Denne delen av molekylet bidrar til enzymgjenkjennelse og er vesentlig for opprettholdelse av det korrekte romlige forhold mellom trifosfatresten og den heterosykliske base. For å være anvendbar for DNA-sekvensbestemmelse, når "sukkeret" er en ribo-furanose, må 3<1->a-stillingen ikke ha en hydroxylgruppe som er i stand til å bli brukt av enzymet etterpå. Hydroxylgruppen må enten være fraværende, erstattet med en annen gruppe eller på annen måte gjort ubrukbar. Slike sukkere vil bli henvist til som kjedeterminerende sukkere. Det er kjent at en del modifiserte furanosefragmenter kan oppfylle dette krav, deriblant: 2',3'-dideoxy-p-D-ribofuranosyl [(a) F. Sanger et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, vol. 74, 5463-5467 (1977)],
B-D-arabinofuranosyl [(b) F. Sanger et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, vol. 74, 5463-5467 (1977)],
3'-dideoxy-8-D-ribofuranosyl [(c) Klement et al., Gene Analysis Technology, vol. 3, 59-66 (1986)],
3' -amino-2' ,3'-dideoxy-B-D-ribofuranosyl [(d) Z.G. Chidgeavadze et al., Nuc. Acids Res., vol. 12, 1671-1686
(1984)],
2',3<1->dideoxy-3<1->fluor-p-D-ribofuranosyl [(e) Z.G.
Chidgeavadze et al., FEBS Lett., vol. 183, 275-278 (1985)] og
2',3'-dideoxy-2',3'-didehydro-B-D-ribofuranosyl [(f) Atkinson et al., Biochem., vol. 8, 4897-4904 (1969)].
Acyklonukleosidtrifosfater (AcyNTP-er), hvor det så-kalte sukker er en asyklisk gruppe [f.eks. 2-oxyethoxymethyl (g)], kan også brukes som kjedeterminatorer ved sekvensbestemmelse av DNA etter Sanger-metoden. Bruken av AcyNTP-er som kjedeterminerende substrater har vært demonstrert ved utførelse av konvensjonell Sanger-sekvensering (<32>P-rappor-tør), idet AcyNTP-ene erstattet ddNTP-ene. De sekvenserende stiger fremstilt med AcyNTP-er var praktisk talt identiske med de som ble fremstilt med ddNTP-er, bortsett fra at det var påkrevet med en høyere konsentrasjon av AcyNTP (omtrent 10 x) for å oppnå en lignende fordeling av DNA-fragmenter. AcyNTP-ene virker både med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og AMV-reverstranskriptase. Alkynylaminoderivatene av AcyNTP-er er derfor også forventet som kjedeterminerende substrater.
AcyNTP-ene har fordelen ved å la seg syntetisere lettere enn ddNTP-ene. Mens syntesen av ddNTP-er ikke er et hovedproblem i konvensjonell sekvensering, er det betydelig når strukturelt komplekse, fluorescensmerkede kjedeterminatorer fremstilles. Bruken av 2-oxyethoxymethylgruppen som et sukker forenkler reagenssyntesen svært mye, men samtidig som det opprettholdes et akseptabelt utseende.
Medisinsk forskning har identifisert andre sukkermodi-fikasjoner som kan være anvendbare for DNA-sekvensering. For eksempel er 3<1->azido-2',3'-dideoxythymidin [AZT: Mitsuya et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, vol. 82, 7096-7100 (1985)] og 9-[2<1->hydroxy-1'-(hydroxymethyl)-ethoxymethyl]-guanin [DHPG: Aston et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., vol. 108, 1716-1721 (1982)] to antivirale midler som antas å virke ved å bli omdannet til trifosfater som forårsaker kjedetermi-nering av DNA-replikasjon. Nukleosidtrifosfater med slike sukkerenheter kan også brukes til sekvensbestemmelse av DNA.
(iii) Heterosyklisk base (Het)
Den heterosykliske base virker som det avgjørende gjenkjenningselement i nukleinsyrer, idet den virker som en hydrogenbindende akseptor og donor i en bestemt romlig orientering. Delene fra de heterosykliske baser er vesent-lige for inkorporering med den store grad av nøyaktighet som er nødvendig for nøyaktig sekvensbestemmelse. Denne strukturelle del er også sete for binding av kobleren.
De heterosykliske baser omfatter: uracil (h),
cytosin (i), 7-deazaadenin (j), 7-deazaguanin (k) og 7-deazahypoxanthin (1). De ikke-naturlig forekommende 7-deazapuriner kan anvendes for å binde kobleren uten å tilføre en nettoladning til basedelen og derved destabilisere glykosid-bindingen. (For å forenkle nomenklaturen, er de heterosykliske baser angitt og nummerert som 7-deazapuriner.)
(iv) Kobler
Kobleren er en alkynylaminogruppe hvor en ende i trippelbindingen er bundet til et amin gjennom en alkylenrest, R^, med 1-20 atomer; den andre enden av trippelbindingen er kovalent bundet til den heterosykliske base i 5-stillingen for pyrimidiner eller i 7-stillingen (purin-nummerering) for 7-deazapurinene. Aminnitrogenet i alkynyl-aminogruppen er bundet til en reaktiv funksjonell gruppe (f.eks. carbonyl) på den fluorescerende markør. Kobleren må ikke reagere i noen betydelig grad ved binding til eller inkorporering av DNA-polymerasen. Fortrinnsvis er alkylenresten rettkjedet alkylen, ci~^ io' helst er alkylenresten
-CH2-.
(v) Fluorescerende markør (R3)
Den fluorescerende markør tilveiebringer påvisbar, emittert stråling etterfulgt av eksitasjon ved absorpsjon av energi fra en passende kilde, slik som en argonionlaser. Det er ønskelig å ha unike fluorescerende rapportører som lar seg skille fra hverandre, for hver DNA-base som man støter på i anvendelser for sekvensbestemmelse.
En familie av rapportører som kan brukes for fluor-escensmerking i en fremgangsmåte for sekvensbestemmelse av DNA basert på merkede kjedeterminatorer, kan avledes fra det kjente fargestoff 9-carboxyethyl-6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen [S. Biggs et al., J. Chem. Soc, vol. 123, 2934-2943
(1923)]. Denne xanthenfamilien har den generelle struktur-formel 1
hvor
R9 og R^g omfatter H, laverealkyl, laverealkoxy, halogen og cyano.
Et foretrukket sett fargestoff egnet for DNA-sekvensbestemmelse er forbindelse 1, a) Rg = R^q = H, abs. 487 nm, emis. 505 nm; b) Rg = H, R^q = CH3, abs. 494 nm, emis. 512 nm; c) Rg = CH3, Rio = H, abs. 501 nm, emis. 519 nm og d) Rg = R^o = CH3/ abs. 508 nm, emis. 526 nm. Instrumentene beskrevet av L.M. Smith, L.E. Hood et al., L.M. Smith et al. og W. Ansorge et al. er i stand til å påvise sekvensbestemmende fragmenter merket med hvilket som helst av disse fargestoffene ved konsentrasjoner som er egnet for DNA-sekvensbestemmelse. Men disse instrumentene er ikke i stand til å skjelne mellom det ovenfor nevnte sett med fire fargestoffer. En fremgangsmåte for å skjelne mellom fargestoffene og bruke denne informasjon for å bestemme DNA-sekvenser, er beskrevet i norsk patentsøknad nr. 872758.
Denne søknad beskriver et system for sekvensbestemmelse av DNA som omfatter midler for å påvise tilstedeværelsen av strålingsenergi fra nært beslektede, men skjelnbare rapportører som er kovalent bundet til forbindelser som virker som kjedeterminerende nukleotider i en modifisert Sanger-metode for DNA-kjedeforlengelse. En fluorescerende rapportør som lar seg skjelne, er bundet til hver av fire dideoxynukleotidbaser representert i Sanger-DNA-sekvens-bestemmelsesreaksjoner, dvs. dideoxynukleotider av adenin, guanin, cytosin og thymin. Disse rapportørmerkede kjedeterminerende reagenser erstatter umerkede kjedeterminatorer i den tradisjonelle Sanger-metode og bindes i reaksjoner til' de tilsvarende deoxynukleotider, en passende primer, templat og polymerase. Den resulterende blanding inneholder DNA-fragmenter med varierende lengde som atskiller seg fra hverandre med en base som avslutter 3'-enden med unikt merkede kjedeterminatorer som svarer til hver av de fire DNA-basene. Denne nye merkemetode muliggjør eliminering av den vanlige radioaktive markør som finnes i en av deoxynukleotidene i den tradisjonelle Sanger-metode.
Påvisning av disse rapportørmarkørene kan utføres med to stasjonære lysforsterkningsrør (PMT-er) som mottar nære fluorescensemisjoner fra laserstimulerte rapportører bundet til kjedeterminatorer på DNA-fragmenter. Disse fragmentene kan separeres elektroforetisk i rom og/eller tid ved be-vegelse langs en akse vinkelrett på PMT-enes følerflate. Fluorescensemisjonene passerer først gjennom et tofargefil-ter med både en transmisjons- og refleksjonsegenskap, plassert slik at en av egenskapene (transmisjon) rettes mot ett PMT, og den andre egenskap (refleksjon) rettes mot det andre PMT. På denne måte dannes det forskjellige tallsignaler i hvert PMT, hvorfra det kan beregnes et forholdstall slik at det fås et tredje signal som er unikt for en bestemt fluor-escensrapportør, selv om en serie fluorescensrapportører har emisjoner som ligger tett opp til hverandre. Dette systemet er i stand til å påvise rapportører som alle eksiteres effektivt av en enkelt laserlinje, slik som 488 nm, og med emisjoner like opptil hverandre med maksimalverdier som vanligvis er forskjellige fra hverandre bare med 5-7-nm. Derfor kan bestemmelsene av baserekkefølgen i en DNA-kjede av interesse gjøres på grunnlag av det unike forhold avledet fra hver av de fire rapportørmerkede kjedeterminatorer som tilsvarer hver av de fire basene i DNA.
Ettersom disse xanthenfargestoffer inneholder reaktive funksjonelle grupper, beskriver den ovenfor nevnte norske patentsøknad også utformingen og fremstillingen av reagenser som er nyttige for binding av disse fargestoffene til aminogruppen i en alkynylaminokobler. N-hydroxysuccinimidestere 2 (hvor Rg og R^q er s°ro definert i formel 1) er foretrukne eksempler på slike reagenser. Under fremstillingen av 2 adderes en sarcosingruppe til det grunnleggende fargestoff-molekyl for å minimalisere bireaksjoner. I den ovenfor nevnte norske patentsøknad henvises denne eventuelle sarcosingruppe til som et "mellomledd". Ettersom bare de foretrukne reagenser brukes her, anses den fluorescerende del av en merket alkynylaminokjedeterminator for å omfatte et sarcosinmellomledd. Etter at den uttredende N-hydroxy-succinimidgruppe er blitt erstattet av aminogruppen i kobleren, frigjøres det fluorescerende fargestoff (delstruk-tur 1) ved behandling med konsentrert ammoniumhydroxyd. N-hydroxysuccinimidestere er acyleringsmidler som reagerer selektivt med svært nukleofile aminogrupper, slik som de som er til stede i alkynylaminokoblerne beskrevet ovenfor. Kontrollforsøk har påvist at N-hydroxysuccinimidestrene svarende til 2 reagerer mye saktere med aminogruppene i den heterosykliske base enn med kobleraminogruppen. Dersom reaksjon oppstår i en liten utstrekning med de heterosykliske aminogrupper, er det blitt oppdaget at de resulterende amider hydrolyseres ved ammoniumhydroxydbehandlingen som frigjør fargestoffet. Det er derfor mulig å bruke estere, slik som 2, for å binde selektivt hvilken som helst rappor-tør, slik som et fluorescerende fargestoff, til aminogruppen i kobleren uten å modifisere nukleotidet på en uønsket måte.
Fluorescensmerkede alkynylaminonukleotid-kjedeterminatorer ifølge oppfinnelsen virker like godt ved DNA-sekvensbestemmelse med AMV-reverstranskriptase som de tilsvarende substrater som inneholder allylaminokoblere som er beskrevet i den ovenfor nevnte norske patentsøknad. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er imidlertid lettere å syntetisere enn de tilsvarende substrater som inneholder allylaminokoblere, ettersom alkynylaminokoblerne er lettere å binde til en forhåndsvalgt stilling på de forskjellige basene som trengs for sekvensbestemmelse av DNA. I tillegg kan alkynylaminokoblerne bindes til nukleotidene i høyere utbytte. Endelig forventes nukleotider som inneholder en alkynrest sammen med en heterosyklisk ring, å være mer stabile enn tilsvarende nukleotider som inneholder en alken-rest. Egnede fluorescensmerkede kjedeterminatorer avledet fra alkynylaminonukleotider er vist ved formel 3, hvor Nuc, R1~R4 °9 R6~R8 er som definert ovenfor, R5 = HC>9P3~3 og forutsatt at når Rg er H eller OH, må R6 være OH.
Skjema 1 viser fremgangsmåter for fremstilling av alkynylaminonukleotider ifølge oppfinnelsen hvor sukkeret er en 2,3-dideoxyribofuranosylgruppe. Disse fremgangsmåtene er forenlige med alle sukrene ifølge oppfinnelsen. Når de kombineres med kjente fremgangsmåter for modifisering av sukrene av nukleotider,> kan disse fremgangsmåtene brukes til å fremstille alkynylaminonukleotider hvor 2,3-dideoxyribo-furanosylgruppen er erstattet med de øvrige sukrene ifølge oppfinnelsen.
Det kan brukes forskjellige måter til å fremstille de første nøkkeIme1lomprodukter, jodnukleosidene (4).
5-jod-2',3'-dideoxyuridin kan fremstilles ved å behandle 2<1>,3'-dideoxyuridin [Pfitzer et al., J. Org. Chem., vol. 29, 1508 (1964)] med ICI [Robins et al., Can. J. Chem., vol. 60, 554-557 (1982)].
5-jod-2',3'-dideoxycytidin kan fremstilles ved å om-danne 2',3'-dideoxycytidin (Rayco Co.) til det tilsvarende 5-kvikksølvnukleosid [Bergstrøm et al., J. Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides, vol. 4, 257-269 (1977)] og deretter behandle med jod.
Selv om fremgangsmåter for fremstilling av 7-deazaguanosin og 2'-deoxy-7-deazaguanosin er kjent, er det blitt vist [Seela et al., Chem. Ber., vol. Ili, 2925-2930 (1978)] at elektrofilt angrep på 7-deazaguaniner oppstår både i 7-og 8-stillingen. Det er imidlertid funnet at de ønskede 7-jod-7-deazapuriner kan oppnås ved behandling av 6-methoxy-2-thiomethyl-7-deazapuriner med N-jodsuccinimid, etterfulgt av utbytting av 2-thiomethyl- og 6-methoxysubstituentene som vist i skjema 2 og beskrevet i eksempel 3. Bruken av N-jodsuccinimid for regioselektiv jodering av et 7-deazapurin-ringsystem er ikke tidligere beskrevet.
Fremgangsmåten for fremstilling av 7-(3-amino-l-propynyl)-2',3'-dideoxyguanosin-5'-trifosfat ifølge oppfinnelsen er således kjennetegnet ved at
(A) 6-methoxy-2-methylthio-7-deazapurin bringes i kontakt med l-klor-2-deoxy-3,5-di-0-p-toluoyl-a-D-ribofuranosi
i nærvær av natriumhydrid,
(B) esterproduktet fra trinn (A) med formel 9
hydrolyseres under basiske betingelser til diolen me
formel 10
(C) 5-OH-stillingen i diol 10 beskyttes med en tritylgruppe, (D) 3-OH-gruppen fjernes ved å redusere et mellom-produktthionocarbonat med et tinnhydrid som reduksjonsmiddel, (E) dideoxydeazapurinet med formel 12 som fås i trinn (D) behandles med N-jodsuccinimid slik at 7-jodderivatet med formel 13 dannes (F) forbindelse med formel 13 bringes i kontakt med natriumthiocresolat i hexamethylfosforamid, hvorved 7-deazapurin-6-onet med formel 14 fås (G) forbindelsen med formel 14 behandles suksessivt med metaklorperoxybenzosyre og ammoniakk, hvorved 7-deaza-guanosinet med formel 15 fås (H) N-propargyltrifluoracetamid kobles til den av- beskyttede 7-jodforbindelse med formel 16 hvorved 7-(3-trifluoracetamido-l-propynyl)-2',3'-dideoxy-7-deazaguanosin fås, og (I) produktet fra trinn (H) omdannes til 5'-trifos-fatet, etterfulgt av fjerning av beskyttelsesgrupper. 7-jodnukleotidene ifølge oppfinnelsen er kjenne tegnet ved at de har formelen
hvor
R5 er H, P03H2, P206H3, P309H4 eller salter derav, og (i) når R7 = R8 = H, så er R6 = H eller OH, eller (ii) når R7 = H og R8 = OH, så er R6 = H eller OH, eller (iii) når R7 = OH og R8 = H, så er R6 = OH. 7-jod-2'-3'-dideoxy-7-deazaadenosin kan fremstilles ved deoksygenering av tubercidin, etterfulgt av kvikksølv-behandling/jodering (skjema 3). Deoksygeneringsreaksjonene ble tilpasset fra fremgangsmåter beskrevet av Moffatt et al., [J. Am. Chem. Soc, vol. 95, 4016-4030 (1972)] og Robins et al. [Tetrahedron Lett., vol. 25, 367-340 (1984)], hvorved man fikk en forbedret syntese av 2',3'-dideoxy-7-deazaadenosin som vist i skjema 3 og beskrevet i eksempel 4.
7-jod-7-deazaadenosin kan fremstilles ved regioselektiv kvikksølvbehandling/jodering av tubercidin (7-deazaadenosin), som rapportert av Bergstrøm et al., J. Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides, vol. 5, 285-296
(1978) og Bergstrøm et al., J. Org. Chem., vol. 46, 1424
(1981).
Alternative veier til 7-jod-2',3'-dideoxy-7-deazaadenosin kan brukes, hvor det ikke brukes tubercidin som er et kostbart fermenteringsprodukt, som utgangsmateriale. Disse veiene er vist i skjemaene 4 og 5 og er beskrevet i eksemplene 5 og 6. Ved en av disse reaksjonsveiene ble problemet med regioselektiv innføring av et jodatom i 7-stillingen løst ved hjelp av en annen jodering som tidligere ikke er beskrevet. I dette tilfelle gav behandling av 6-klor-7-deazapurin 32 med jodmonoklorid bare 7-jodregioiso-meren 33.
Selv om en fremgangsmåte for kobling av terminale alkynrester til beskyttede 5-joduracilnukleosider under anvendelse av en Pd(II)/Cu(I)-katalysator er blitt rapportert av Robins et al. [Tetrahedron Lett., vol. 22, 421-424
(1981)3, gir ikke denne fremgangsmåte den ønskede kobling mellom alkynylaminer (f.eks. propargylamin) og de ubeskyttede 5-jodpyrimidin- eller 7-jodpurinnukleosider. Mulig-heten for å bruke alkynylaminer i direkte kobling var svært ønskelig for å gi direkte forbindelser med en amingruppe for etterfølgende binding av fluorescensmarkøren. Likeledes ble det lett etter en fremgangsmåte for å bruke ubeskyttede nukleosider for en mer direkte reaksjonsvei til de ønskede forbindelser ved eliminering av ellers unødvendige serier med beskyttelses-/avbeskyttelsesreaksjoner. Under de betingelser som er beskrevet nedenunder, ble alkynylaminer med hell koblet til flere forskjellige halo-gennukleosider i utmerkede utbytter under anvendelse av en Pd(0)/Cu(I)-katalysator. Denne koblingsreaksjon var også vellykket når alkynylaminnitrogenet var beskyttet av en acylgruppe, slik som acetyl og trifluoracetyl, alkoxy-carbonylgruppe, slik som 9-fluorenylmethyloxycarbonylgruppe og en sulfonylgruppe, slik som p-toluensulfonylgruppe. Antallet carbonatomer mellom aminogruppen og trippelbindingen ble uventet funnet ikke å være av avgjørende betydning ved fremgangsmåten beskrevet nedenunder: 3-amino-l-propyn (propargylamin), 5-amino-l-pentyn, N-(2-propynyl)-trifluoracetamid, N-(4-pentynyl)-trifluoracetamid og N-(II-dodecynyl)-trifluoracetamid ble alle med hell brukt i koblingsreaksjonen. På bakgrunn av teknikkens stand er det vellykkede resultat med denne Pd(0)/Cu(I)-katalyserte koblingsreaksjon uventet. For eksempel er det i Bergstrøm et al. [J. Am. Chem. Soc, vol. 100, 8106 (1978)] angitt at alkynrester ikke kobles til 5-kvikksølv- eller 5-jodderivater av uracilnukleosider ved bruk av Pd-katalysatorer. Videre er det i Robins et al. [J. Org. Chem., vol. 48, 1854-1862 (1983)] angitt at Pd(II)/Cu(I)-katalyserte reaksjoner med 3',5'-di-O-acetyl-5-jod-2'-deoxyuridin ofte gav ringformede produkter. Når fremgangsmåten beskrevert nedenunder brukes, fortsetter koblingen selv med alkynylaminer (slik som 5-amino-l-pentyn), som lett ville kunne danne ring.
Ifølge oppfinnelsen er det således også tilveiebrakt en fremgangsmåte for fremstilling av alkynylaminonukleotidene
med formel I ifølge oppfinnelsen, ved kobling av tilsvarende jodnukleotider med et jodatom bundet til et carbonatom i den heterosykliske base, til tilsvarende terminale alkynylaminer under anvendelse av palladium(0)/kobber(I)- eller palladium (II) /kobber (I) -katalyse, som er kjennetegnet ved at det anvendes en tetrakis-(trifenylfosfin)-palladium(O)/kobber(I)-j odid-katalysator.
Vanligvis kan alkynylaminonukleosidene frem-
stilles ved å plassere halogennukleosidet og Cu(I) i en kolbe, gjennomblåse med Ar for å fjerne luft,
tilsette tørt dimethylformamid etterfulgt av tilsetning av alkynylaminet, triethylaminet og Pd(O). Reaksjonsblandingen kan omrøres i flere timer, eller inntil tynnsjiktskromato-grafi (TLC) indikerer at halogennukleosidet er oppbrukt. Når et ubeskyttet alkynylamin brukes, kan alkynylaminonukleo-sidet isoleres ved oppkonsentrering av reaksjonsblandingen og kromatografering på silicagel, under anvendelse av et elueringsmiddel som inneholder ammoniumhydroxyd, for å nøy-tralisere hydrogenhalogenidet generert i koblingsreaksjonen. Når det brukes et beskyttet alkynylamin, kan methanol/- methylenklorid tilsettes til reaksjonsblandingen, etterfulgt av bicarbonatformen av en sterkt basisk anionebytterharpiks. Oppslemmingen kan deretter omrøres i ca. 45 min., filtreres og harpiksen fylles med ytterligere methanol/methylenklorid. De kombinerte filtrater kan oppkonsentreres og renses med en gang med hurtig kromatografering på silicagel under anvendelse av en methanol-/methylenkloridgradient.
Alkynylaminonukleotidene ifølge oppfinnelsen fremstilles fortrinnsvis fra 5-jodpyrimidin- eller 7-jod-7-deazapurinnuk-leosider. (Den Pd(0)/Cu(I)-katalyserte koblingsreaksjon kan også brukes for å innføre alkynylamingrupper i andre stil-linger på den aromatiske eller heteroaromatiske ring, forutsatt at bare det korrekte halogennukleotid er tilgjengelig).
Som alkynylaminer for den Pd(0)/Cu(I)-katalyserte koblingsreaksjon anvendes terminale alkyner hvor trippelbindingen er bundet til et amin ved hjelp av en alkylenrest med 1-20 atomer. Alkylenresten kan være rettkjedet alkylen (C^-C^, f.eks. -C3H6-). Fortrinnsvis er alkylenresten et rettkjedet alkylen ( C^ C^) ; aller helst er alkylenresten -CH2-. Substi-tuenter på aminet er lavere alkyl (C^-C^) og beskyttelsesgrupper slik som trifluoracetyl. Generelt kan aminet i alkynylaminet være primært, sekundært eller tertiært. For bruk av en kobler er imidlertid alkynylaminet et primært amin. Aminet i alkynylaminet er vanligvis beskyttet ettersom aminbeskyttelse er påkrevet i det neste trinn. Det koblede produkt renses også lettere når dette aminet er innført i beskyttet form. En tri-fluoracetylbeskyttelsesgruppe er foretrukket ettersom den fjernes lett etter at koblingsproduktet omdannes til det tilsvarende 5'-trifosfat. Generelt kan det brukes et 1,5-3,0 ganger overskudd av alkynylamin (i forhold til jodnukleosid) for å sikre fullstendig omdannelse av jodnukleosidet til et alkynylaminonukleosid.
Egnede oppløsningsmidler for koblingsreaksjonen omfatter polare oppløsningsmidler som oppløser jod-
nukleosidet og ikke dekomponerer Pd(0)/Cu(I)-katalysator-systemet. N,N-dimethylformamid (DMF), acetonitril, THF, dimethylsulfoxyd (DMSO), hexamethylfosforamid (HMPA) og alkoholer kan alle brukes; oppløsningsmidler som inneholder små mengder vann er også akseptable. Fortrinnsvis er opp-løsningsmidlet DMF. Konsentrasjonen av halogennukleosidet er fortrinnsvis 0,02-1,0 M, helst 0,2-0,5 M.
Mengden av Pd-katalysator som brukes, er vanligvis 1-25 mol% (basert på jodnukleosid), fortrinnsvis 5-15 mol%. De største katalysatormengdene brukes for å utføre reaksjonen i en svært liten skala, eller for å redusere reaksjonstiden for kobling.
Molforholdet mellom Cu(I)-kokatalysator og Pd(0)-katalysator er mer enn 1,0, men mindre enn 20. Når det brukes et beskyttet alkynylamin, er det foretrukne molforhold Cu/Pd = 2. Når alkynylaminet er beskyttet, nedsetter det ubeskyttede basiske nitrogenatom den katalytiske aktivitet til kobber. I dette tilfelle er det foretrukket med et Cu/Pd-forhold på 5. I begge tilfeller iakttas det ingen reaksjon ved værelsetemperatur når Cu/Pd = 1. Reaksjonshastigheten økes vanligvis med økende Cu/Pd-forhold. Med beskyttede alkynylaminer og Cu/Pd-forhold på mer enn 2, ledsages imidlertid denne økning av økte mengder biprodukter, slik-som indikert ved TLC.
Triethylamin tjener sannsynligvis som en syrefjerner i denne reaksjonen; andre sterke basiske aminer kan også brukes. Et overskudd av det ubeskyttede alkynylamin kan også tjene som syrefjerner, men fortrinnsvis tilsettes også triethylamin.
Beskyttede alkynylaminonukleosider kan omdannes til de tilsvarende 5'-trifosfater ved behandling med fosforoxyklorid og deretter tri-n-butylammoniumpyrofosfat [Ruth et al., Mol. Pharmacol., 415 (1981)]. Det resulterende urene trifosfat kan renses på dette trinn ved ionebytterkromatografi ved eluering med en flyktig buffer, slik som triethylammoniumbicarbonat. Det ønskede nukleosidtrifosfat separeres godt fra biproduktene, men lyofilisering gir en viss fjerning av beskyttelsesgruppen på koblernitrogenet når denne beskyttelsesgruppe er en trifluoracetylgruppe. Fjerning av beskyttelsesgrupper kan fullføres ved behandling med 14 % vandig ammoniakk, og produktet kan på nytt renses ved ionebytterkromatografi. Ettersom egenskapene til kobleren og dens beskyttelsesgruppe ikke synes å blokkere omdannelse til et trifosfat, kan denne metoden brukes til å fremstille en lang rekke nukleosid-mono-, -di-, og -trifosfater med beskyttede eller ubeskyttede alkynylaminokoblere.
Etter fremstillingen av alkynylaminonukleotidene ifølge oppfinnelsen er det klart for fremstilling av hvilket som helst ønsket rapportørmerket alkynylaminonukleotid ifølge oppfinnelsen.
Det foretrukne sett av fire fluorescensmerkede alkynylaminonukleotid-kjedeterminatorer (34-37) som er vist nedenunder, avledes fra alkynylaminonukleotider ifølge oppfinnelsen. Dette settet av merkede forbindelser fremstilles som beskrevet i eksempel 19 ved kobling av N-hydroxysuccinimidestere 2 med alkynylaminonukleosidtrifosfat 6, etterfulgt av fjerning av ammoniakk.
Disse fire fluorescensmerkede kjedeterminatorer ble brukt i stedet for de vanlige dideoxynukleotid-kjedeterminatorene når DNA ble sekvensbestemt under anvendelse av AMV-reverstranskriptase ifølge fremgangsmåten til Zagursky et al., Gene Analysis Technigues, vol. 2, 89-94 (1985). De resulterende fluorescensmerkede sekvensbestemmelsesstiger kan analyseres ved hjelp av et instrument som er utformet for å påvise fluorescerende molekyler etter hvert som de forflytter seg gjennom gelelektroforese, fortrinnsvis ved hjelp av instrumentet beskrevet i U.S. patentsøknad (IP-678). Et system av denne type hvor det brukes to filtre, er beskrevet i den nevnte søknad. Som beskrevet i den nevnte patentsøknad, plasseres et par moduler over og under et plan hvor den rapportøreksiterende lysstråle avsøker flere felter på en elektroforesegel. Hver kanal inneholder rapportør-merkede DNA-fragmenter. Hver påvisningsmodul omfatter et lysforsterkerrør med et hvitt innfallsareal og et separat bølgelengdeselektivt filter plassert mellom dets PMT og den fluorescerende art i gelen. Disse filtrene er interferens-filtre med komplementære transmisjonsbåndkarakteristika som simulerer tofargefiltervirkningen. Filtrene gjør det mulig for PMT-ene å generere signaler som varierer i styrke på flere måter som en funksjon av egenskapene til artene. Ett filter slipper i grove trekk igjennom de kortere emisjons-bølgelengder og avviser de høyere emisjonsbølgelengder, mens det andre filtret gjør nøyaktig det motsatte. Transmisjons-filtre kan brukes sammen med hvert interferensfilter for å avvise lys fra vinkler som ligger utenfor aksen og som er større enn forhåndsbestemt vinkel. Bølgelengdefiltrene har stort sett komplementær transmisjon i forhold til bølge-lengdeegenskapene i emisjonsområdet til de fire fargestoffene, idet de bølgelengdene som slipper igjennom opptrer nær sentrum av artenes strålingsenergispektra.
Påvisning av fragmentene kan også utføres ved hjelp av fremgangsmåtene beskrevet av Smith et al., Hood et al. og Ansorge et al. Samtidig analyse av fire baser i ett enkelt felt, under anvendelse av den informasjon som er tilveiebrakt ved hjelp av dette spesielle sett med fire fluorescerende fargestoffer, kan imidlertid bare gjøres ved hjelp av de signaldannende systemer beskrevet i den ovenfor nevnte patentsøknad.
For å sammenligne resultatene som fås ved hjelp av fluorescenspåvisning med de som fås ved hjelp av standard-sekvensbestemmelsesteknikker, er dette settet med fire merkede kjedeterminatorer også blitt brukt til å generere fluorescensmerkede sekvensbestemmelsesfragmenter som også inneholder en 32P-rap<p>ortør. (<32>P-rapportøren kan inkorporeres enzymatisk under primerforlengelse ved å addere merket dNTP eller ved 5'-merking av primeren med en kinase.) De resulterende dobbeltmerkede sekvensbestemmelsesstiger kan analyseres både ved autoradiografi og ved hjelp av en fluor-escensgelavleser. Disse fluorescensmerkede sekvensbestemmelsesstiger er svært like og funksjonelt ekvivalente med stigene fremstilt ved hjelp av standard-dideoxynukleotid-kjedeterminatorene, bortsett fra at alle bånd fås omtrent to baser senere. Den relative styrke til forskjellige bånd i disse sekvensbestemmelsesstiger modifiseres ved tilsetning av en kobler eller et fargestoff, men den modifiserte kjedeterminator synes ikke å forårsake at noen bånd går tapt. Under passende gelelektroforesebetingelser forårsaker ikke kobleren og fargestoffet på disse kjedeterminatorene at noen av båndene forflytter seg uregelmessig: et bånd som forflytter seg hurtigere inneholder færre baser enn et bånd som forflytter seg saktere. Mellomrommet mellom tilgrensende bånd med forskjellige fargestoffer varierer litt, avhengig av hvilke fargestoffer som er ved siden av hverandre. Når det brukes enten fluorescens- eller radioaktiv påvisning under optimale betingelser, virker disse mindre variasjoner i relativ båndstyrke og -posisjon ikke på bruken av disse kjedeterminatorene ved sekvensbestemmelse av DNA.
Anvendeligheten av alkynylaminonukleotider for fremstilling av merkede kjedeterminerende substrater for sekvensbestemmelse av DNA er ikke begrenset til syntese av bare det ovenfor viste sett av fire forbindelser (34-37). Andre kombinasjoner av sukkere, baser og fargestoffer er blitt satt sammen ved hjelp av en alkynylaminokobler og disse forbindelsene er også anvendbare for sekvensbestemmelse av DNA.
I tillegg til nytten ved fremstilling av fluorescensmerkede kjedeterminatorer er alkynylaminonukleotidene ifølge oppfinnelsen generelt anvendbare for binding av en rekke rapportører til nukleotider eller oligonukleotider. Ettersom det mest nukleofile sete i disse molekylene er aminogruppen innført med kobleren, kan en rapportør som inneholder en aktivert carboxylsyre (f.eks. N-hydroxysuccinimidester), et isocyanat, et isothiocyanat, et aktivert aryl-halogenid (f.eks. 1-fluor-2,4-dinitrobenzen) eller andre elektrofile funksjonelle grupper med passende reaktivitet, selektivt bindes til dette nitrogenatornet. De resulterende merkede addukter kan så brukes i andre anvendelser som vil bli beskrevet nedenunder.
Ettersom underenheten av nukleotider som består av heterosyklisk base brukes i den genetiske kode, bestemmes funksjonen til mange nukleotider ofte gjennom egenskapene til sukkerunderenheten. Likeledes avhenger anvendbarheten av alkynylaminonukleotider spesifikt av hvilken type sukker-underenhet som er til stede. Denne anvendbarhet vil redu-seres dersom alkynylaminokobleren og/eller rapportøren virker inn på en nødvendig funksjon av nukleotidet. De alkynylaminokoblerholdige nukleotider ifølge oppfinnelsen har klare fordeler, slik som: den lille steriske masse av alkynylaminokobleren minimaliserer forstyrrelse av nukleotidet: plassering av kobleren i 5-stillingen til pyrimidinnukleotider og 7-stillingen til 7-deazapurinnukleotider plasserer etter hvert kobleren og rapportøren i hovedfordyp-ningen når nukleotidet inkorporeres i dobbeltkjedet DNA (dette vil tjene til å minimalisere innvirkning på hybridi-sering og andre prosesser, noe som krever at en dobbeltkjedet konformasjon er mulig); og alkynylaminonukleotider med en rapportør bundet er utmerkede substrater for AMV-reverstranskriptase. Ettersom funksjonelt beslektede enzymer er tilbøyelige til å virke inn på substratene sine på lignende måter, er det sannsynlig at disse nukleotidene også vil være substrater for andre anvendbare enzymer (slik som andre reverstranskriptaser, DNA-polymeraser og RNA-polymeraser) som utfører templatstyrt nukleotidpolymerisering.
Alkynylaminonukleotidene ifølge oppfinnelsen byr på et attraktivt alternativ til den kjemiske (ikke-enzymatiske) syntese av merkede 2'-deoxyoligonukleotider. I den internasjonale patentsøknad PCT/US84/00279 beskrives en fremgangsmåte for inkorporering av en rapportørgruppe i et en-kj edet oligonukleotid med definert sekvens. Fremgangsmåten omfatter fremstilling av passende beskyttede og aktiverte monomere nukleotider som har en kobler med en beskyttet aminogruppe, bruk av disse monomere nukleotider til å syntetisere oligonukleotider kjemisk, etterfulgt av den selektive binding av en rapportør til kobleraminogruppen. Den lille størrelsen til alkynylaminokoblerne og deres lokalisering i 5-stillingen til pyrimidinnukleotider og 7-stillingen til 7-deazapurinnukleotider forventes å forbedre virkningen av oligonukleotider som inneholder dem. En passende beskyttet og aktivert monoraer (38), som er lik med en beskrevet i den ovenfor nevnte internasjonale patent-søknad, vil kunne fremstilles fra kommersielt tilgjengelig 5-jod-2'-deoxyuridin ved hjelp av den Pd(0)/Cu(I)-kata-lyserte binding av en alkynylaminokobler etterfulgt av selektiv dimethoxytritylering av 5'-alkoholen og til slutt omdannelse til et 3'-fosforamiditt med klor-(diisopropyl-amino)-methoxyfosfin. Denne monomeren og andre lignende alkynylaminoholdige monomerer forventes å være anvendbare i oligonukleotidsynteser og rapportørbinding ifølge fremgangsmåtene beskrevet i den nevnte internasjonale patentsøknad.
(Trifluoracetyl-beskyttelsesgruppen på koblernitrogenet fjernes ved hjelp av de basiske og/eller nukleofile reagenser som vanligvis brukes for fjerning av beskyttelsesgrupper ved slutten av den kjemiske syntese av oligonukleotider.) Dersom rapportøren er upåvirket av reaksjonene som brukes i oligonukleotidsynteser, ville den også kunne bindes til alkynylaminokobleren på et tidligere stadium.
Selv om kjemisk syntese av oligoribonukleotider for tiden ikke er like effektiv eller anvendbar som syntese av 2'-deoxyoligonukleotider, ville en passende monomer, [(39), -O-tetrahydropyranyl (OTHP)] kunne fremstilles og brukes til å lage merket RNA.
Ved nok en annen anvendelse kan den enzymatiske merking av dobbeltkjedede nukleinsyrer lettes gjennom bruken av alkynylaminokoblerne. Langer et al., Proe. Nat. Acad. Sei., USA, 78, 6633 (1981) beskrev en fremgangsmåte med "nick"-translasjon for merking av dobbeltkjedet DNA med bio-tinrapportører. En allylaminokobler ble brukt til å binde biotin til 5-stillingen i 2'-deoxyuridintrifosfat og uridin-trifosfat. De resulterende biotinylerte nukleotider er substrater for DNA- og RNA-polymeraser. Alternativt kunne det brukes en alkynylaminokobler for biotintilknytning eller generelt for tilknytning av andre rapportører, slik som fluorescerende fargestoffer. Adenosintrifosfatanaloger (40) og (41) med alkynylaminokoblere kunne fremstilles lettere enn adenosinanaloger med en allylaminokobler. Analogene til nukleotidtrifosfater (40) og (41) kunne brukes til "nick"-translasjonsmerking av DNA eller RNA ved de enzymatiske fremgangsmåter til Langer et al.
Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.
Alle temperaturer er angitt i °C. (25° refererer til omgivelses- eller værelsetemperatur.) Alle deler og prosentdeler som ikke er angitt på annen måte, er basert på vekt, bortsett fra blandinger av væsker som er basert på volum. Følgende forkortelser er anvendt: DMF - dimethylformamid, DMSO - dimethylsulfoxyd, NHTFA - trifluoracet amidogruppe, TEAB - triethylammoniumbicarbonat, tris - tris-(hydroxymethyl)-aminomethan, SF - succinylfluorescein, NMR - kjernemagnetisk resonansspektrum, IR - infrarødt spektrum, UV - ultrafiolett spektrum eller påvisning, TLC - tynn-sjiktskromatografi på silicagel, HPLC - høytrykksvæske-kromatografi, GC - gasskromatografi, sm.p. - smeltepunkt, sm.p. d - smeltepunkt med dekomponering, kp. - kokepunkt. Ved angivelse av NMR-data er kjemiske skift angitt i ppm, og koblingskonstanter (J) er angitt i Hertz. Alle smelte-punkter er ukorrigerte. Ionebytterharpikser ble vasket med passende vandige og organiske oppløsningsmidler før bruk. Identiteten til alle forbindelser som her er beskrevet, ble fastslått ved passende spektroskopiske og analytiske tek-nikker. Med mindre annet er angitt, ble det utført rensing ved hjelp av kromatografi på silicagel slik som beskrevet av Still et al., J. Org. Chem., 43, 2923-2926 (1978).
Eksempel 1
Fremstilling av 5-( 3- amino- l- propynyl)- 2', 3'- dideoxycytidin-5'- trifosfat ( 42)
[Forbindelse 42 er et eksempel på struktur 6 hvor Het er cytosin (i), og R^ er -CH2-. Den er den umiddelbare for-løper for merket kjedeterminator 35.]
A. Fremstilling av N- propargyltrifluoracetamid ( 43)
24,79 g, 0,450 mol propargylamin (Aldrich, 99 %) ble tilsatt dråpevis i løpet av en time til 69,19 g, 0,540 mol, 1,2 ekv. methyltrifluoracetat (Aldrich) ved 0°C. Etter omrøring i ytterligere en time ved 0°C gav destillasjon gjennom en 15 cm Vigreux-kolonne 62,12 g (91 %) trifluoracetamid som en fargeløs væske (kp. 68,5-69,5°C ved 11 torr). Dette materiale var homogent ved NMR og GC og ble brukt vekselvis med spektroskopisk identiske materialer fremstilt ved å acylere propargylamin med trifluoreddiksyre-anhydrid.
3-H-NMR (CDCI3): 6,85 (bred s, 1H, NHTFA), 4,17 (dd, J = 5,6 og 2,5, 2H, CH2), 2,35 (t, J = 2,5, 1H, CH). IR (ublandet; cm-<1>): 3300 (N-H), 3095 og 2935 (C-H), 2130
(acetylen), 1720 (C=0), 1550 (N-H), 1430, 1365, 1160, 1040, 998, 918, 857, 829, 772 og 725.
B. Fremstilling av 5- jod- 2', 3'- dideoxycytidin ( 44)
En oppløsning av 2,11 g, 10 mmol 2',3'-dideoxycytidin (Raylo) og 3,35 g, 10,5 mmol kvikksølvacetat (Fisher) i 50 ml methanol ble kokt under tilbakeløp i 19 timer. Den resulterende hvite suspensjon ble fortynnet med 50 ml methanol og 100 ml diklormethan. 3,05 g, 12 mmol jod ble tilsatt, og suspensjonen ble omrørt ved 25°C inntil det forelå en klar fiolett oppløsning. Etter 4 timer ble 20 ml, 38 mekv. av den frie baseformen av AG3 X4A harpiks (Bio-Rad, en svakt basisk polystyrenharpiks) tilsatt og hydrogensulfid ble boblet inn i reaksjonsblandingen i 15 min. Fullstendig utfelling av kviksølv(II) ble bekreftet ved hjelp av TLC. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom filterhjelp, og filterhjelpen ble vasket med 1:1 methanol:diklormethan. Filtratet ble inndampet på silicagel (10 g), og den ladede silicagel ble plassert på toppen av en 150 g silicagelkolonne. Eluering med 5 %, 10 % og 20 % methanol i diklormethan gav 2,79 g (83 %) jodid 44 som et fargeløst, krystallinsk stoff. To rekrystalliseringer fra kokende vann gav etter vakuumtørking ved 50°C store, analytisk rene prismer (sm.p. d 178°C).
<1->H-NMR (DMSO-d6): 8,50 (s, 1H, H6), 7,73 (bred s, 1H, -NH2a), 6,53 (bred s, 1H, -NH2b), 5,86 (dd, J = 6,5 og 2,1, 1H, Hl'), 5,19 (t, 1H, 5'OH), 4,04 (m, 1H, H4'), 3,75 (ddd, J = 12,1, 5,2 og 2,9, 1H, H5'a), 3,53 (dt, J = 12,1 og 3,8, 1H, H5'b) og 2,3-1,7 (m, 4H, H2' og H3'). Beregnet, for C9<H>12N3°3I: c 32,07 %, H 3,59 %, N 12,46 %. Funnet: C 32,05 %, H 3,80 %, N 12,46 %.
C. Generell fremgangsmåte for kobling av aminoalkyner til jodnukleosider. Fremstilling av 5-(3-trifluoracetamido-1-propynyl)- 2', 3'- dideoxycytidin ( 45)
I en 50 ml 3-halset kolbe ble det fylt 770 mg,
2,00 mmol jodcytidin 44 og 76,2 mg, 0,400 mmol, 0,20 ekv. kobberjodid (Aldrich, Gold Label). Etter gjennomblåsning av
kolben med argon ble 10 ml tørr dimethylformamid (Aldrich) tilsatt, hvorved man fikk en 0,2 M-oppløsning av jodcytidin som inneholdt oppslemmet kobberjodid. 0,70 ml, 6,00 mmol, 3,0 ekv. N-propargyltrifluoracetamid og 0,56 ml, 4,00 mmol, 2,0 ekv. triethylamin (lagret over molekylsikter) ble tilsatt via en sprøyte. 231 mg, 0,20 mmol, 0,10 ekv. tetrakis-(trifenylfosfin)-palladium(O) ble veid inn i en ampulle i en tørr beholder og tilsatt til reaksjonsblandingen. Kobber-jodiden oppløstes og gav en gul oppløsning som gradvis mørknet i løpet av flere timer. Reaksjonen fikk fortsette inntil TLC indikerte at utgangsmaterialet var fullstendig oppbrukt. Etter 4 timer ble reaksjonsblandingen fortynnet med 20 ml 1:1 methanol-diklormethan og 2,0 g, ca. 6 ekv. av bicarbonatformen av AG1 X8 harpiks (Bio-Rad, en sterkt basisk anionebytter, polystyrenharpiks) ble tilsatt. Etter omrøring i ca. 15 min. opphørte gassutviklingen. Etter 30 min. ble reaksjonsblandingen filtrert og harpiksen ble vasket med 1:1 diklormethan:methanol. De kombinerte filtrater ble hurtig oppkonsentrert med en rotasjonsinndamper. (Fjerning av dimethylformamid krevde ca. 10 min. ved 45°C og 2 torr). Resten ble øyeblikkelig renset med kromatografi på 100 g silicagel under anvendelse av 10 %, 15 % og 20 % methanol i diklormethan. Fjerning av oppløs-ningsmiddel fra de passende fraksjoner gav 651 mg (90 %) alkynylaminnukleosid 45 som et lysegult, krystallinsk skum som var homogent ifølge TLC og NMR. Produktet fra et lignende preparat ble fastslått å være et hemihydrat ved hjelp av elementæranalyse.
<3->H-NMR (DMSO-d6): 9,96 (bred s, 1H, NHTFA) , 8,32 (s 1H, H6), 7,76 (bred s, 1H, NH2a), 6,78 (bred s, 1H, NH2b), 5,88 (dd, J = 6,5 og 2,5, 1H, Hl')/ 5,13 (t, J = 5,1, 1H,
5'OH), 4,28 (d, J = 5,0, 2H, -CH2-), 4,04 (m, 1H, H4'), 3,73 (ddd, J = 12,0, 5,0 og 3,1, 1H, H5'a), 3,53 (dt, J = 12,1 og 4,0, 1H, H5'b), 2,3-1,7 (m, 4H, H2' og H3'). <19>F-NMR (DMSO-d6): -74,0 (s). UV (MeOH): maksima ved 238,5 (17.100) og
295,5 (9.300). Beregnet for C14H15N404F3•1/2 H20: C 45,53, H 4,37, N 15,17. Funnet: C 45,56, H 4,52, N 15,26."
D. Fremstilling av tris-( tri- n- butylammonium)- pyrofosfat
4,46 g, 10 mmol tetranatrium-pyrofosfat-decahydrat ble oppløst i den minimale mengde vann (ca. 50 ml) og sendt gjennom en kolonne med AG50W X8 harpiks (100-200 mesh, 4 x 10 cm lag; en sterkt sur kationebytter, polystyrenharpiks) som er helt opp i vann. Kolonnen ble eluert med vann, og eluenten ble samlet opp i en isavkjølt kolbe inntil pH i eluenten nådde nøytralitet. 7,1 ml, 30 mmol tri-n-butylamin (Aldrich, Gold Label) ble tilsatt til eluenten, og de to fasene ble omrørt kraftig inntil alt amin var oppløst. Den resulterende oppløsning ble lyofilisert. Resten ble koinndampet to ganger med tørr pyridin og én gang med tørr
dimethylformamid. Resten ble oppløst i 10 ml dimethylformamid, og den resulterende 1,0 M-oppløsning ble lagret (for så lang tid som en måned) ved 0°C under argon inntil den skulle brukes.
E. Generell fremgangsmåte for omdannelse av beskyttede alkynylaminonukleosider til de tilsvarende 5'-trifosfater og fjerning av trifluoracetylbeskyttelsesgruppen. Fremstilling av 5-(3-amino-l-propynyl)-2',3'-dideoxycytidin-5'-trifosfat ( 42)
361 mg, 1,00 mmol alkynylaminonukleosid 45 ble oppløst i 2,0 ml trimethylfosfat (Aldrich, Gold Label) under om-røring under argon i en ovnstørket kolbe. Oppløsningen ble avkjølt til -s-10°C, og 0,093 ml, 1,00 mmol f osf oroxyklorid (Aldrich, Gold Label) ble tilsatt ved hjelp av en sprøyte. Etter omrøring av reaksjonsblandingen ved -5-10°C i 30 min. ble en andre aliguot med 0,093 ml, 1,00 mmol fosforoxyklorid tilsatt, og oppløsningen fikk varmes sakte opp til 25°C under omrøring. Reaksjonen i aliguoter av reaksjonsblandingen ble stanset med 1 N vandig hydroxyd og analysert ved hjelp av HPLC. Når omdannelse til det tilsvarende nukleo-tidmonofosfat var ved et maksimum (i dette tilfelle 100 min. etter den andre tilsetning av fosforoxyklorid), ble reaksjonsblandingen tilsatt dråpevis til en forhåndsavkjølt (■5-10°C) oppløsning av tris-( tri-n-butylammonium-pyrof osf at
(6,0 ml av den ovenfor 1,0 M-oppløsning i tørr dimethyl-formamdid). Oppløsningen fikk varmes opp sakte til 25°C under omrøring under argon. Etter 100 min. ble reaksjons-oppløsningen sakte tilsatt til en forhåndsavkjølt (0°C) oppløsning av 1,4 ml triethylamin i 20 ml vann. Oppløs-ningen ble omrørt ved isavkjøling i 15 min., og deretter fikk den stå over natten ved ca. 2°C.
De flyktige stoffene ble fjernet ved vakuuminndamping ved 25°C og 0,5 torr. Resten ble på nytt oppløst i 75 ml vann og tilført en kolonne med DEAE-SEPHADEX ionebytter (A-25-120, 2,6 x 65 cm lag) som var blitt ekvilibrert med: 1) ph 7,6, 1,0 M vandig TEAB (300 ml), 2) 1,0 M vandig kalium-bicarbonat (300 ml) og 3) pH 7,6, 0,1 M vandig TEAB
(300 ml). Kolonnen ble eluert med en lineær gradient av pH 7,6 vandig TEAB fra 0,1 M (1 1) til 1,0 M (1 1). Kolonnen ble kjørt ved 100 ml/time under oppsamling av fraksjoner hvert 12. min. Elueringen ble overvåket ved absorbans ved 270 nm (40 AUFS). Det ønskede materiale eluerte som et godt separert hovedbånd nær enden av gradienten (fraksjonene 73-80). De produktholdige fraksjoner ble slått sammen, oppkonsentrert (ved under 30°C) og koinndampet to ganger med absolutt ethanol. Resten ble tatt opp i 20,4 ml vann og lyofilisert.
Mellomproduktet ble tatt opp i 12,5 ml vann og 12,5 ml konsentrert ammoniumhydroxyd ble tilsatt. Etter omrøring i 3,5 timer ble oppløsningen omrørt under avsugningsvakuum i 2 timer for å fjerne overskuddet med ammoniakkgass, og deretter lyofilisert. Resten ble tatt opp i 10 ml pH 7,6 0,1 M vandig TEAB og tilført en kolonne med DEAE-SEPHADEX ionebytterharpiks (A-25-120, 1,6 x 55 cm lag) som var blitt preparert som beskrevet ovenfor. Kolonnen ble eluert mens 6 ml fraksjoner ble samlet opp med en lineær gradient av TEAB fra 0,1 M (280 ml) til 1,0 M (280 ml). Produktet eluerte som en enkelt hovedtopp. Fraksjonene som ble beregnet å inneholde rent produkt (nr. 39-45) ble slått sammen, oppkonsentrert (ved under 30°C), koinndampet med absolutt ethanol (2 x) og tatt opp i 9,8 ml vann. Oppløsningen ble analysert ved hjelp av UV-absorpsjon og HPLC og deretter
lyofilisert.
En fortynnet oppløsning av produktet utviste absorp-sjonsmaksima ved 240 og 293,5 nm i pH 8,2 50 mM vandig tris-buffer. Hvis man går ut fra at absorpsjonskoeffisienten til produktet er lik med absorpsjonskoeffisienten til utgangsmaterialet (9.300), var utbyttet av produkt basert på absorpsjonen ved 293,5 nm, 0,32 mmol (32 %). HPLC (Zorbax SAX, 0,2 M, pH 6,5 vandig kaliumfosfat, avsøkning ved 270 nm) av sluttproduktet gav hovedsakelig en enkelt topp (> 99 %).
<1->H-NMR (D20): 8,57 (s, 1H, H6), 6,03 (dd, J = 6,4 og 1,6, 1H, Hl<1>)/ 4,42 (m, 2H, H4' og H5'a), 4,18 (ddd, J = 12, 5.5 og 3, 1H, H5'b), 4,036 (s, 2H, -CH2-), 2,5-1,9 (m, 4H, H2'og H3 ' ), pluss mot-ion-(triethylammonium)-topper. 3^P-NMR (D20): -9,02 (d, J = 20, 1P), -9,74 (d, J = 20, 1P), -21,37 (t, J = 20, 1P). UV (pH 8,2 vandig tris): maksima ved 240 og 293,5 nm.
Eksempel 2
Fremstilling av 5-( 3- amino- l- propynyl)- 2', 3'- dideoxyuridin-5'- trifosfat ( 46)
(Forbindelse 46 er et eksempel på struktur 6 hvor Het er uracil (h) og R^ er -CH2-. Den er den umiddelbare for-løper for merket kjedeterminator 34).
A. Fremstilling av 5- jod- 2', 3'- dideoxyuridin ( 47)
2,122 g, 10,0 mmol didideoxyuridin ble oppløst i 30 ml lunken methanol, og etter avkjøling til 25°C ble det tilsatt 4.06 g, 25 mmol, 2,5 ekv. jodmonoklorid (Fisher) i 20 ml methanol i løpet av 5 min. Den mørkt fiolette reaksjonsblanding ble varmet opp i et bad ved 50°C under nitrogen i 20 min. og deretter øyeblikkelig avkjølt i et is-/vannbad. Etter henstand uten omrøring i 165 min. ble den resulterende utfelling samlet opp ved filtrering og vasket med 2 x 10 ml kald methanol. Vakuumtørking over natten gav 2,232 g (66 %) jod 47 som gråhvite mikrokrystaller. Dette materiale ble brukt uten ytterligere rensing i den neste reaksjon, men andre utfellinger ble renset ved kromatografi eller rekrys-
tallisering fra 30 ml/g kokende methanol, hvorved man fikk hvite nåler (sm.p. d 160-164°C). NMR indikerte at den urene utfelling var homogen, men også at 5'-hydroxylprotonet var svært bredt på grunn av utbytting katalysert ved sporuren-heter. Kromatograferte eller rekrystalliserte materialer gav spektra hvor dette protonet som vanlig var en skarp triplett.
■'-H-NMR (DMSO-d6): 11,60 (bred s, 1H, H3), 8,57 (s, 1H, H6), 5,90 (dd, J = 2,0 og 6,6, 1H, Hl'), 5,2 (bred s, 1H, 5'OH), 4,06 (m, 1H, H4'), 3,75 og 3,53 (m, 2H, H5'), 2,26, 2,02 og 1,84 (m, 4H, H2' og H3').
B. Fremstilling av 5-( 3- trifluoracetamido- l- propynyl)-2', 31- dideoxyuridin ( 48)
Joduridin 47 ble koblet i 3 timer til N-propargyltrifluoracetamid etterfulgt av den generelle fremgangsmåte gjengitt i eksempel 1C. Kromatografi med en 0-5 % methanol i diklormethangradient gav materiale som var homogent ved TLC, men som var vanskelig å tørke. Etter koinndamping av det kromatograferte produkt flere ganger med kloroform og vakuumtørking ble det erholdt 536,5 mg alkynylaminonukleosid 48 som et hvitt skum. Dette materiale var homogent ved TLC og var rent ved NMR, bortsett fra en liten mengde (39 mol%; korrigert utbytte 66 %) kloroform.
1-H-NMR (DMSO-d6): 11,61 (s, 1H, H3) , 10,07 (fortegnet t, 1H, NHTFA), 8,35 (s, 1H, H6), 7,26 (s, 0,39H, CHCl3), 5,89 (dd, J = 6,6 og 3,2, 1H, Hl'), 5,15 (t, J = 5,2, 1H, 5'OH), 4,22 (bred d, 2H, -CH2N-), 4,04 (tilsynelatende hept, J = 3,5, 1H, H4'), 3,73 og 3,53 (m, 2H, H5'), 2,26, 2,03 og 1,84 (m, 4H, H2' og H3'). TLC (95:5 diklormethan-methanol, to elueringer, UV): utgangsjodid 47, Rf = 0,37; produkt 48, 0,28; katalysator, 0,95 og 0,80 pluss svak strekdannelse.
C. Fremstilling av 5-( 3- amino- l- propynyl)- 23'- dideoxyuridin- 5'- trifosfat ( 46)
0,30 mmol alkynylaminonukleosid 48 ble omdannet til det tilsvarende trifosfat, og dets trifluoracetylgruppe ble fjernet, etterfulgt av den generelle fremgangsmåte gjengitt
i eksempel 1E. Etter tilsetning av den andre aliquot med fosforoxyklorid fikk fosforylering fortsette i til sammen 210 min. Hvis man forutsetter en absorpsjonskoeffisient for produktet som er lik med absorpsjonskoeffisienten til utgangsmaterialet (13.000), var utbyttet av trifosfat 46 basert på dets UV-absorpsjon ved 291,5 nm, 18.
Eksempel 3
Fremstilling av 7-( 3- amino- l- propynyl)- 2', 3'- dideoxyguano-sin- 5'- trifosfat ( 49)
(Forbindelse 49 er et eksempel på struktur 6 hvor Het er 7-deazaguanin (k) og R^ er -CH2-. Den er den umiddelbare forløper for merket kjedeterminator 37).
A. Fremstilling av 6- methoxv- 2- methylthio- 9-( 3, 5- di- O- p-toluoyl- 2- deoxy- B- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 9)
6-methoxy-2-methylthio-7-deazapurin [8, fremstilt etter fremgangsmåten til F. Seela et al., Chem. Ber., vol. 111, 2925 (1978)3 ble tørket azeotropisk ved oppløsning i 150 ml tørr pyridin og inndamping til tørrhet ved 30-35°C. Dette materiale ble oppslemmet i 450 ml tørr acetonitril ved værelsetemperatur ved nitrogen, og 2,16 g av en 60 % suspensjon av natriumhydrid i olje ble tilsatt under omrøring. Etter 45. min. ble 18,6 g l-klor-2-deoxy-3,5-di-O-p-toluoyl-a-D-ribofuranose [fremstilt etter fremgangsmåten til M. Hoffer, Chem. Ber., vol. 93, 2777 (1960)] tilsatt i tre like store porsjoner i løpet av 20 min. Etter omrøring av reaksjonsblandingen i ytterligere 45 min. ved værelsetemperatur ble 1 ml eddiksyre og 300 ml diklormethan tilsatt. Blandingen ble sugefiltrert gjennom en pute av filterhjelp, og filtratet ble inndampet til tørrhet. Resten ble oppløst i benzen, og denne oppløsningen ble vasket to ganger med vann og én gang med saltvann. Etter tørking av det organiske sjikt over natriumsulfat og inndamping ble resten oppløst i 400 ml methanol og fikk utkrystallisere, hvorved man fikk 19,24 g (73,8 %) ribosylert produkt 9 som fargeløse krystaller (sm.p. 106-107°C).
<3->H-NMR (CDCI3): 2,42 (s, 3H, toluoyl CH3), 2,44 (s,
3H, toluoyl CH3), 2,64 (s, 3H, SCH3), 2,70 og 2,89 (m, 2H, H2'), 4,08 (s, 3H, OCH3), 4,56 (m, 1H, H3'), 4,65 (m, 2H, H5'), 5,74 (m, 1H, H4'), 6,44 (d, J = 4, 1H, H7), 6,77 (dd, J = 8 og 6, 1H, Hl'), 7,05 (d, J = 4, 1H, H8) og 7,25 og 7,95 (m, 8H, toluoyl H).
Rekrystallisering av en prøve av det ovenfor nevnte materiale fra methanol som inneholdt en liten mengde diklormethan, gav krystaller med sm.p. 109-110°C.
B. Fremstilling av 6- methoxy- 2- methylthio- 9-( 2- deoxy- 3- D-ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 10) 19 g av en suspensjon av ester 9 og 38 g av hydroxyd-formen av REXYN 201 harpiks (en sterkt basisk anionebytter-polystyrenharpiks) i 600 ml methanol ble kokt under tilbake-løp i 1,5 time under nitrogen. Den varme suspensjon ble sugefiltrert for å fjerne harpiksen, og filtratet ble inndampet til tørrhet. Den faste rest ble oppløst i 450 ml ether, og etter 10 min. ble oppløsningen filtrert gjennom en pute av filterhjelp for å fjerne en liten mengde av en farget urenhet. Oppløsningen ble sådd med krystaller av det ønskede produkt erholdt fra en tidligere reaksjon og fikk stå over natten ved 25°C. Krystallinsk diol 10 ble samlet opp ved filtrering, og modervæsken ble oppkonsentrert slik at man fikk en andre mengde. Hver mengde ble vasket grundig med ether og tørket, hvorved man fikk i alt 8,43 g (78,0 %) diol 10 som fargeløse krystaller (sm.p. 129-130°C).
■<1->H-NMR (DMSO-d6): 2,21 og 2,55 (m, 2H, H2' ), 2,56 (s, 3H, SCH3), 3,53 (m, 2H, H5'), 3,82 (m, 1H, H3'), 4,02 (s, 3H, OCH3), 4,36 (m, 1H, H4'), 4,90 (t, J = 5,5, 1H, 5'OH), 5,30 (d, J = 5,5, 1H, 3'OH), 6,48 (d, J = 4, 1H, H7), 6,55 (dd, J = 8 og 6, 1H, Hl'), 7,48 (d, J = 4, 1H, H8).
Rekrystallisering av en prøve av dette materiale fra diklormethan som inneholdt en liten mengde methanol, gav krystaller med sm.p. 130-131°C.
C. Fremstilling av 6- methoxy- 2- methylthio- 9-( 5- 0- trifenylmethyl- 2- deoxy- 3- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 11)
7,2 g diol 10 ble tørket azeotropisk ved oppløsning i tørr pyridin og inndamping av oppløsningen til tørrhet ved 35°C. Resten ble oppløst i 100 ml tørr pyridin og 8,0 g trifenylmethylklorid, 4,0 ml triethylamin, og 300 mg 4-(di-methylamino)-pyridin ble tilsatt. Etter oppvarming av reaksjonsblandingen ved 65°C under nitrogen i 30 min. ble det gjort en andre tilsetning av 1,0 g trifenylmethylklorid, og oppvarmingen ble fortsatt i 16,5 timer. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen oppkonsentrert, og resten ble fordelt mellom diklormethan og vann. Det vandige sjikt ble ekstrahert med diklormethan, og de kombinerte organiske sjikt ble vasket med 0,3 N saltsyre, vandig natriumbicarbonat og saltvann. Etter tørking av natriumsulfat og oppkonsentrering gav rensing av råproduktet ved kromatografi på silicagel med 0%, 1%, 1,5% og 2% methanol i diklormethan 12,1 g (94,5 %) monotritylether 11 som et fargeløst glass.
<1>H-NMR (CDC13): 2,58 (s, 3H, SCH3), 2,42 og 2,62 (m, 2H, H2'), 3,37 (m, 2H, H5'), 4,04 (m, 1H, H3'), 4,08 (s, 3H, OCH3), 4,60 (m, 1H, H4')/ 6,40 (d, J = 4, 1H, H7), 6,68 (tilsynelatende t, J = 7, 1H, Hl'), 7,00 (d, J = 4, 1H, 8H), 7,27 og 7,43 (m, 15H, trityl H).
Disse data ble erholdt fra en annen sats av 11 fremstilt som beskrevet ovenfor.
D. Fremstilling av 6- methoxy- 2- methylthio- 9-( 5- O- trifenylmethyl- 2, 3- dideoxy- 3- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 12)
En oppløsning av 12,1 g tritylether 11, 9,2 g 4-di-methylaminopyridin og 7,5 ml fenylklorthionocarbonat (Aldrich) i 220 ml tørr diklormethan ble omrørt ved 25°C i 2 timer under nitrogen. Ettersom TLC-analyse indikerte at reaksjonen var ufullstendig, ble 4,0 ml fenylklorthionocarbonat tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere en time. Oppløsningen ble fortynnet med 280 ml diklormethan og ble vasket i rekkefølge med 500 ml 0,5 N saltsyre, 500 ml 0,5 N natriumhydroxyd og saltvann. Det organiske sjikt ble tørket over natriumsulfat og inndampet
til tørrhet.
Det resulterende urene thionocarbonat ble oppløst i
350 ml tørr toluen og 350 g azoisobisbutyronitril, og 10 ml tri-n-butyltinnhydrid ble tilsatt. Den resulterende oppløs-ning ble varmet opp ved 100-105°C i 10 min. Etter avkjøling ble oppløsningen fortynnet med litt ether og ble ristet med 350 ml 10 % kaliumfluorid. De to sjiktene ble filtrert gjennom en pute av filterhjelp (for å fjerne en mørk oppslemming) og separert. De organiske sjikt ble vasket med 0,75 N kaliumhydroxyd og saltvann, tørket over natriumsulfat og oppkonsentrert. Kromatografi av den resulterende olje på silicagel med 1:1 diklormethan:ether og deretter med diklormethan gav 9,93 g (84,5 %) dideoxynukleosid 12 som et farge-løst fast stoff (sm.p. 122-124°C).
■^H-NMR (CDC13): 2,10, 2,33 og 2,43 (m, 4H, H2' og H3'), 2,60 (s, 3H, SCH3), 3,30 (m, 2H, H5'), 4,08 (s, 3H, OCH3), 4,29 (m, 1H, H4'), 6,36 (d, J = 3,7, 1H, H7), 6,53
(dd, J = 7 og 4, 1H, Hl'), 7,09 (d, 1H, J = 3,7, H8), 7,25
og 7,45 (m, 15H, trityl H).
E. Fremstilling av 7- jod- 6- methoxy- 2- methylthio- 9-( 5- O- trifenylmethyl- 2, 3- dideoxy- 3- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 13)
10,0 g N-jodsuccinimid ble tilsatt til en oppløsning
av 9,9 g deazapurin 12 i 550 ml tørr dimethylformamid.
Etter omrøring i mørke under nitrogen i 16 timer ble 2,5 ml 10 % vandig natriumbicarbonat tilsatt, og reaksjonsblandingen ble oppkonsentrert under vakuum ved 50°C til et volum på 100 ml. Denne oppløsningen ble fordelt mellom vann og ethylacetat. Det organiske sjikt ble vasket med 5 % vandig natriumhydrosulfitt og saltvann, tørket over natriumsulfat og oppkonsentrert. Kromatografi av det svakt urene produkt på silicagel med diklormethan gav 11,68 g (95,6 %) jodid 13 som et fargeløst glassaktig, fast stoff.
<3->H-NMR (CDCI3): 2,06, 2,24 og 2,41 (m, 4H, H2' og H3'), 2,58 (s, 3H, SCH3), 3,30 (m, 2H, H5'), 4,10 (s, 3H, OCH3), 4,29 (m, 1H, H4'), 6,47 (dd, J = 6 og 4, 1H, Hl'), 7,19 (s, 1H, H8), 7,30 og 7,46 (m, 15H, trityl H).
Disse data ble erholdt fra en annen sats av 13 frem-
stilt som beskrevet ovenfor.
F. Fremstilling av 7- jod- 2- methylthio- 9-( 5- 0- trifenylmethyl- 2, 3- dideoxy- 3- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin- 4- on ( 14)
Natriumthiocresolat ble fremstilt ved å tilsette 1 ekv. natriummethoxyd til en oppløsning av thiocresol i methanol og deretter inndampe til tørrhet. En blanding av 4,0 g methylether 13, 4,0 g natriumthiocresolat og 10 ml hexamethylfosforamid i 150 ml tørr toluen ble kokt under tilbakeløp under nitrogen i 4,5 timer. Etter avkjøling ble blandingen fordelt mellom ethylacetat og vann. Det organiske sjikt ble vasket med vann og saltoppløsning, tørket over natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Kromatografi av det resulterende urene produkt på silicagel med 0 % og 2 % methanol i diklormethan gav 3,80 g (97,0 %) deazapurinon 14 som et fargeløst glassaktig, fast stoff.
■^-H-NMR (CDC13): 2,05, 2,25 og 2,42 (m, 4H, H2' og H3<1>), 2,60 (s, 3H, SCH3), 3,30 (m, 2H, H5<1>), 4,28 (m, 1H, H4"), 6,40 (dd, J = 7 og 4, 1H, Hl<1>), 7,05 (s, 1H, H8), 7,30 og 7,46 (m, 15H, trityl H), 10,00 (bred s, 1H, Hl).
G. Fremstilling av 7- jod- 5'- O- trifenylmethyl- 2', 3'- dideoxy-7- deazaguanosin ( 15)
1,23 g, 85 % metha-klorperoxybenzosyre (Aldrich) ble tilsatt til en omrørt oppløsning av 3,6 g methylthioether 14 i 150 ml tørr diklormethan ved 0°C under nitrogen. Etter 15 min. ble avkjølingsbadet fjernet, og omrøring ble fortsatt ved 25°C i 40 min. Denne oppløsningen ble vasket med vandig natriumbicarbonat og saltoppløsning og tørket over
natriumsulfat. 2 volumprosent methanol ble tilsatt, og den resulterende oppløsning ble sendt gjennom en kort silicagel-plugg for å fjerne polare urenheter. Det resulterende urene sulfoxyd (3,07 g) ble oppløst i 40 ml dioxan og plassert i en glassforet bombe. 10,0 g ammoniakk ble tilsatt, og blandingen ble varmet opp ved 100°C i 2 timer i en autoklav. Den resulterende oppløsning ble inndampet til tørrhet. Resten ble oppløst i 20 ml diklormethan og filtrert gjennom en pute av filterhjelp. 40 ml methanol ble tilsatt til opp-
løsningen, og etter avkjøling utkrystalliserte 1,57 g av et fargeløst produkt. Modervæsken ble inndampet og renset ved væskekromatografi ved middels trykk på silicagel med 5 % methanol i diklormethan, hvorved man fikk ytterligere 328 mg av produktet som fargeløse krystaller. Det totale utbytte av deazaguanosin 15 var 1,90 g (55,4 %).
<1->H-NMR (CDC13): 2,05, 2,23 og 2,35 (m, 4H, H2' og H3'), 3,29 (m, 2H, H5'), 4,26 (m, 1H, H4'), 5,90 (bred s, 2H, NH2), 6,24 (dd, J = 7 og 4, 1H, Hl')/ 6,90 (s, 1H, H8), 7,30 og 7,46 (m, 15H, trityl H), 10,90 (bred s, 1H, Hl).
Rekrystallisering av en prøve av dette materiale fra methanol/diklormethan gav krystaller med sm.p. 201-203°C.
H. Fremstilling av 2', 3'- dideoxy- 7- jod- 7- deazaguanosin ( 16)
En oppløsning av 1,7 g tritylether 15 i 12 ml maursyre ble omrørt ved værelsetemperatur i 10 min. Den resulterende gule suspensjon ble deretter inndampet til tørrhet under vakuum ved 30°C. Kromatografi av resten på silicagel med 5 %, 7 % og 10 % methanol i diklormethan gav 940 mg av et fargeløst fast stoff. Triturering av dette faste stoff med ether som inneholdt litt diklormethan gav 838 mg (81,0 %) nukleosid 16 som fargeløse krystaller.
<3->H-NMR (DMSO-d6): 1,95, 2,09 og 2,26 (m, 4H, H2' og H3'), 3,48 og 3,54 (m, 2H, H5'), 3,98 (m, 1H, H4'), 4,90 (bred t, J = 5, 1H, 5'OH), 6,08 (m, 1H, Hl'), 6,32 (bred s, 2H, NH2), 7,12 (s, 1H, H8), 10,46 (bred s, 1H, Hl).
I. Fremstilling av 7-( 3- trifluoracetamido- l- propynyl)-2', 3'- dideoxy- 7- deazaguanosin ( 50)
376 mg, 1,00 mmol jodid 16 ble koblet i 2,25 timer til N-propargyltrifluoracetamid ved hjelp av den generelle fremgangsmåte gjengitt i eksempel 1C. Produkt og utgangsmateriale lot seg ikke skjelne fra hverandre ved hjelp av TLC, så reaksjonen ble overvåket ved hjelp av reversfase HPLC (10 cm ODS, 1 ml/min., gradient fra 100 % vann til 100 % methanol over 5 min., deretter 100 % methanol, med UV-påvisning ved 280 nm: utgangsjodid 16, 5,49 min.; produkt 50, 5,75 min.; mellomprodukt, 6,58 min.). Det urene produkt var lite opp-
løselig i diklormethan, så det ble oppkonsentrert fra en diklormethan-/methanoloppløsning på 5 g silicagel før det ble fylt på kromatografikolonnen. Eluering med 2 %, 5 %, 7 % og 10 % methanol i diklormethan gav 300 mg (78 %) alkynylaminonukleosid 50 som et gult fast stoff.
■^•H-NMR (DMSO-d6): 1,96, 2,08 og 2,28 (m, 4H, H2' og H3<1>), 3,47 og 3,55 (m, 2H, H5'), 3,99 (m, 1H, H4'), 4,22 (bred s, 2H, -CH2-), 4,90 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 6,09 (dd, J = 6 og 4, 1H, Hl'), 6,33 (bred s, 2H, NH2), 7,30 (s, 1H, H8), 10,05 (bred s, 1H, NHTFA), 10,50 (bred s, 1H, Hl). <1>H-avkoblet <13>C-NMR (DMSO-d6): 155,5 (g, J = 36,5, trifluor-acetylcarbonyl), 157,8, 153,1 og 149,9 (C2, C4 og C6), 122,6 (C8), 115,9 (g, J = 288, CF3), 99,4 og 97,5 (C7 og C5), 84,2 og 77,4 (acetylenisk), 83,2 og 81,0 (Cl' og C4'), 62,9 (C5'), 29,7 (propargylisk), 31,8 og 25,8 (C2<*>og C3').
Disse <13>C-NMR-data ble erholdt fra en annen sats av 50 fremstilt som beskrevet ovenfor.
J. Fremstilling av 7-( 3- amino- l- propynyl)- 2', 3'- dideoxy- 7-deazaguanosin- 5'- trifosfat ( 49)
0,90 mmol alkynylaminonukleosid 50 ble omdannet til det tilsvarende 5'-trifosfat, og trifluoracetylbeskyttelsesgruppen ble deretter fjernet ved å følge den generelle fremgangsmåte gjengitt i eksempel 1E. Etter den andre tilsetning av fosforoxyklorid ble reaksjonsblandingen omrørt i ytterligere 165 min. Hvis man forutsetter en absorpsjonskoeffisient for produktet som er lik med absorpsjonskoeffisienten til utgangsmaterialet (11.900), var utbyttet av 5'-trifosfat 49 basert på dets absorpsjon ved 275,5 nm, 18 %.
Eksempel 4
Fremstilling av 7-( 3- amino- l- propynyl)- 2', 3'- dideoxy- 7-deazaadenosin- 5'- trifosfat ( 51)
(Forbindelse 51 er et eksempel på struktur 6 hvor Het er 7-deazaadenin (j) og R^ er -CH2-. Den er den umiddelbare forløper for merket kjedeterminator 36).
A. Fremstilling av 2'- acetoxy- 3'- brom- 51 -( 2- acetoxyiso-butyryl)- adenosin ( 18)
19,5 ml, 150 mmol, 5 ekv. 2-acetoxyisobutyrylbromid [fremstilt ifølge fremgangsmåten til Russel et al., J. Am. Chem. Soc, 95, 4016-4030 (1973)] ble tilsatt i løpet av
15 min. til en suspensjon av 6,66 g, 25,0 mmol tubercidin (17, 7-deazaadenosin, Sigma) i 250 ml tørr acetonitril
(Aldrich). Det oppslemmede faste stoff oppløstes i løpet av ca. 5 min., og reaksjonsblandingen ble omrørt under nitrogen i 22 timer ved 25°C. Reaksjonsblandingen ble tilsatt til en oppløsning av 43,55 g, 300 mmol, 6 ekv. dikaliumhydrogen-fosfat i 400 ml vann. Etter omrøring i 30 min. ble oppløs-ningen ekstrahert med 1 x 400 ml og 2 x 200 ml ethylacetat. De kombinerte organiske sjikt ble tørket over magnesiumsulfat og inndampet til tørrhet, hvorved man fikk 14,73 g (118 %) av et hvitt skum. Dette materiale var mer enn 95 % en svakt utbredt flekk ved TLC (med UV-påvisning), men NMR viste at ett hovedprodukt og minst ett produkt i mindre mengde var til stede. NMR-spekteret var i overensstemmelse med bromacetat 18 som hovedprodukt.
<3->H-NMR (DMSO-d6) for hovedbestanddelen 18: 8,08 (s, 1H, H2), 7,34 (d, J = 3,7, 1H, H8), 7,12 (bred s, 2H, NH2), 6,70 (d, J = 3,7, 1H, H7), 6,32 (d, J = 3,8, 1H, Hl'), 5,61 (dd, J = 2,4 og 3,8, 1H, H2'), 4,89 (dd, J = 2,4 og 4,5, 1H, H3'), 4,43 (m, 1H, H4'), 4,35 (dd, J = 12 og 4, 1H, H5'a), 4,29 (dd, J = 12 og 7, 1H, H5'b), 2,08 (s, 3H, OAc), 2,00 (s, 3H, OAc) og 1,49 (s, 6H, 2CH3).
B. Fremstilling av 2', 3'- dideoxy- 2', 3'- didehydro- 7- deazaadenosin ( 19)
Sink-kobberforbindelse ble nyfremstilt ved hurtig (totalt forløpt tid ca. 10 min.) vasking av 20 g sinkstøv (Mallinkrodt) med 3 x 50 ml 1 N saltsyre, 2 x 50 ml vann, 2 x 50 ml 2 % kobbersulfat, 4 x 50 ml vann, 3 x 50 ml ethanol og 2 x 50 ml ether. Under hver vasking ble sinkstøvet omrørt i en frittetrakt inntil det var oppslemmet, og det vaskede materiale ble fjernet ved avsugning mens eksponeringen av sinken mot luft ble gjort så liten som mulig. Forbindelsen ble vakuumtørket i 30 min. Det ovenfor nevnte urene bromacetat (14,63 g) ble oppløst i 150 ml tørr dimethylformamid (Aldrich), og omtrent 25 ml oppløsningsmiddel ble fjernet med en rotasjonsinndamper (45°C ved 2 torr). Nyfremstilt sink-kobberforbindelse (14,63 g, ca. 9 ekv.) ble tilsatt, og den resulterende suspensjon ble omrørt under nitrogen ved 25°C. Avhengig av kvaliteten på sink-kobberforbindelsen kan denne reaksjon utvise en induksjonsperiode og/eller variabel hastighet, slik at reaksjonen fikk fortsette inntil TLC (90:9:1 diklormethan:methanol:konsentrert ammoniumhydroxyd, utgangsmateriale Rf = 0,45 og produkter Rf = 0,39 og 0,36) indikerte at utgangsmaterialet var blitt fullstendig oppbrukt. I dette tilfelle var reaksjonen fullstendig i løpet av mindre enn 15 min. Etter 100 min. ble 75 ml mettet vandig natriumbicarbonat tilsatt forsiktig i løpet av 10 min. til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom en filterhjelp, og filterhjelpen ble vasket med 2 x 50 ml methanol. De kombinerte filtrater ble inndampet til tørrhet, og resten ble fordelt mellom 150 ml vann og 150 ml ethylacetat. Vannsjiktet ble ekstrahert med 2 x 100 ml ethylacetat, og de kombinerte organiske ekstrakter ble tørket over magnesiumsulfat, oppkonsentrert og vakuumtørket i en time.
Det resulterende mørkt orange halvfaste stoff ble opp-løst i 100 ml methanol og deretter i 25 ml vann, og 29 g, 4,3 mekv./g, 5 ekv. REXYN 201 harpiks (hydroxydform) ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble kokt under tilbakeløp i til sammen 210 min. Overvåkning ved TLC (85:13:2 diklormethan: methanol: konsentrert ammoniumhydroxyd: mellomprodukt Rf = 0,49, sluttprodukt 19, 0,24) indikerte at reaksjonen hurtig hadde stanset ved ca. 70 % omdannelse, så etter 165 min. ble ytterligere 29 g harpiks tilsatt. Uten av-kjøling ble harpiksen fjernet ved filtrering og vasket med 1:1 diklormethan:methanol (2 x 75 ml). De kombinerte filtrater ble inndampet til tørrhet, og det resulterende fiolette faste stoff ble rekrystallisert fra 150 ml kokende isopropanol, hvorved man fikk 3,778 g olefin 19 som gråhvite nåler (sm.p. 205-206°C). En andre mengde med 0,631 g produkt
(lysfiolette nåler, sm.p. 202-203°C) ble erholdt ved oppkonsentrering av modervæskene til 25 ml. Begge mengdene (i alt 4,409 g, 76 %) var homogene ved TLC og rene ved NMR, bortsett fra et spor av isopropanol.
1-H-NMR (DMSO-d6): 8,07 (s, 1H, H2), 7,15 (d, J = 3,6, 1H, H8), 7,12 (bred s, 1H, Hl'), 7,01 (bred s, 2H, NH2), 6,57 (d, J = 3,6, 1H, H7), 6,43 og 6,02 (bred d, J = 6,0, 1H hver, H2' og H3'), 4,95 (t, J = 6,5, 1H, 5'OH), 4,79 (m, 1H, H4' ) og 3,52 (m, 2H, H5').
C. Fremstilling av 2', 3'- dideoxy- 7- deazaadenosin ( 20)
I en 450 ml Parr-flaske ble det fylt 3,80 g olefin 19, 76 ml ethanol, 380 mg 10 % palladium-på-carbon (Aldrich) og 2,8 kg/cm<2> hydrogen. Etter risting i 4,67 timer ved 25°C var 1,0 kg/cm<2> hydrogen blitt absorbert, og hydrogenopptak hadde stanset. TLC (to elueringer med 85:13:2 diklormethan: methanol: konsentrert ammoniumhydroxyd, utgangsmateriale 19, 0,45, produkt 20, 0,48) viste fullstendig omdannelse til ett enkelt UV-aktivt nytt produkt. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering gjennom filterhjelp og vasket med ethanol. Fjerning av oppløsningsmiddel fra filtratet og vakuumtørking over natten gav 3,98 g (104 %) dideoxynukleosid 20 som et hvitt skum. NMR indikerte at produktet var homogent, bortsett fra tilstedeværelse av 8 vekt% ethanol (96 % korrigert utbytte). Lignende satser av dette materiale motstod krystallisering og ble ekstremt hygroskopiske etter azeotrop tørking med vannfrie oppløsningsmidler. Dette materiale ble derfor lagret under vakuum i ca. en uke og brukt når NMR indikerte at materialet inneholdt 5 vekt% ethanol. Mangel på krystallinitet og spektralkarakteristika som ble iakttatt for dette produkt, var i overensstemmelse med dem som ble rapportert tidligere av Robins et al., Can. J. Chem., vol. 55, 1259 (1977).
^■H-NMR (DMSO-d6): 8,04 (s, 1H, H2) , 7,33 (d, J = 3,6, 1H, H8), 6,97 (bred s, 2H, NH2), 6,56 (d, J = 3,6, 1H, H7), 6,34 (dd, J = 5,2 og 6,4, 1H, Hl'), 4,96 (t, J = 5,6, 1H, 5'OH), 4,33 (t, J = 5,1, 0,43H, ethanol OH), 4,04 (m, 1H, H4'), 3,4-3,6 (m, 2,86H, H5' og ethanol CH2), 2,33, 2,21 og
2,02 (m, 4H, H2'og H3') og 1,06 (t, J = 7,0, 1,3H, ethanol CH3).
D. Fremstilling av 7- jod- 2', 3'- dideoxy- 7- deazaadenosin ( 21)
En mekanisk omrørt oppløsning av 2,95 g, 11,96 mmol
95 % ren dideoxynukleosid 20, 4,13 g, 50,3 mmol, 4 ekv. vannfritt natriumacetat og 3,81 g, 11,95 mmol, 1,00 ekv. kvikksølvacetat (Fisher, 99,9 %) i 190 ml vann ble varmet opp under nitrogen ved 65°C i 2 timer. Etter avkjøling av den resulterende hvite suspensjon av kvikksølvholdig materiale til 25°C ble 4,79 g, 18,9 mmol, 1,6 ekv. jod og 190 ml ethylacetat tilsatt. Etter en time var det oppslemmede kvikksølvholdige materiale oppbrukt, og en klar fiolett oppløsning gjenstod. Etter 2 timer ble 6,35 g natriumsulfitt tilsatt, og den fiolette farge forsvant. Etter omrøring i 30 min. ble hydrogensulfidgass forsiktig boblet inn i reaksjonsblandingen i 15 min. Kvikksølvsulfid (et svart kolloid) og jodid 21 (et hvitt pulver) ble utfelt fra reaksjonsblandingen. Fullstendig utfelling av kvikksølv(II) ble fastslått ved hjelp av TLC ved overvåkning av forsvinningen til en av de to hoved-UV-aktive flekker. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom filterhjelp og separert i to sjikt. Filterhjelpen ble vasket med kokende ethylacetat (9 x 100 ml) inntil TLC indikerte at det ikke ble ekstrahert noe ytterligere produkt. Hvert ethylacetatekstrakt ble vasket med det vandige sjikt. De kombinerte ethylacetatsjikt ble tørket over magnesiumsulfat og inndampet til tørrhet. Det resulterende urene faste stoff slo over til rødt etter eksponering mot luft. Dette materiale ble oppløst i 100 ml 3:1 diklormethan:methanol, og 5,0 g av den frie baseform av AG3 X4A anionebytterharpiks (Bio-Rad, 2,9 mekv./g tørt) ble tilsatt. Hydrogensulfid ble boblet inn i den røde oppløsning i 10 min., og den røde farge ble fjernet. En svak uklarhet ble fjernet ved kort oppvarming, og oppløsningen ble hurtig filtrert gjennom en 2 cm plugg (15 g) silicagel. Silicagelen ble eluert med ytterligere 3:1 diklormethan:methanol (100 ml). 50 g silicagel ble tilsatt til filtratet, og hydrogensulfid ble boblet inn i 10 min. Oppløsningsmidlet ble fjernet fra denne blanding med en rotasjonsinndamper, og silicagelen ble "tørket" ved koinndamping med 200 ml kloroform. Denne silicagel ble hurtig fylt på en silicagelkolonne (500 g) som var blitt avgasset med en strøm av nitrogen. Eluering under nitrogen med 5% (6 1) og 10% (4 1) kokende methanol i diklormethan gav 2,92 g (64 %) jodid 21 som et hvitt pulver og 456 mg (7,5 %) mindre polar 7,8-dijod-2',3'-dideoxy-7-deazaadenosin. Rekrystallisering av hovedproduk-tet fra 200 ml kokende ethylacetat gav 2,626 g hvite nåler (sm.p. 158-160°C). Oppkonsentrering av modervæskene til 10 ml gav en andre mengde på 0,391 g med lyserøde nåler (sm.p. 156-158°C). Begge mengdene var homogene ifølge NMR og TLC og utgjorde til sammen et 64 % totalt utbytte av jodnukleosid 21 fra olefin 19.
<1->H-NMR (DMSO-d6): 8,09 (s, 1H, H2), 7,67 (s, 1H, H8), 6,65 (bred s, 2H, NH2), 6,34 (dd, J = 4,4 og 6,8, 1H, Hl<1>), 4,95 (t, J = 5,5, 1H, 5'OH), 4,04 (tilsynelatende hept, J = 3,5, 1H, H4'), 3,59 og 3,49 (m, 2H, H5'), 2,30, 2,28 og 2,00 (m, 4H, H2' og H3').
E. Fremstilling av 7-( 3- trifluoracetamido- l- propynyl)-2', 3'- dideoxy- 7- deazaadenosin ( 52)
720,3 mg, 2,00 mmol jodid 21 ble koblet i 90 min. med N-propargyltrifluoracetamid, etterfulgt av standardfrem-gangsmåten gjengitt i eksempel 1C. Kromatografi med 7 % methanol i diklormethan gav 705,8 mg (92 %) av koblings-produkt 52 som et gråhvitt pulver som var homogent ifølge NMR og TLC. Rekrystallisering fra 10 ml kokende ethylacetat gav 372 mg hvite mikrokrystaller (sm.p. 169-171°C).
<X>H-NMR (DMSO-d6): 10,1 (fortegnet t, 1H, NHTFA), 8,10 (s, 1H, H2), 7,78 (s, 1H, H8), 6,7-7,5 (svært bred s, 2H, NH2), 6,34 (dd, J = 4,5 og 7,0, 1H, Hl')/ 4,98 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 4,31 (svakt utbredd s, 2H, -CH2N-), 4,10 (tilsynelatende hept, J = 3,5, 1H, H4'), 3,60 og 3,40 (m, 2H, H5'), 2,37, 2,18 og 2,00 (m, 4H, H2' og H3'). TLC (90:9:1 diklormethan:methanol:konsentrert ammoniumhydroxyd; UV): utgangsjodid 21, Rf = 0,36; produkt 52, 0,26).
F. Fremstilling av 7-( 3- amino- l- propynyl- 2', 3'- dideoxy- 7-deazaadenosin- 5'- trifosfat ( 51)
1,00 mmol alkynylaminonukleosid 52 ble omdannet til det tilsvarende 5'-trifosfat, og trifluoracetylgruppen ble fjernet ved å følge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1E. Etter tilsetning av den andre aliquot med fosforoxyklorid ble oppløsningen omrørt i 120 min. Hvis man forutsetter en absorpsjonskoeffisient for produktet som er lik med absorp-sjonskoef f isienten til utgangsmaterialet (12.700), var utbyttet av trifosfat 51 basert på absorpsjonen ved 279,5 nm, 40 %.
^-H-NMR (D20): 7,97 (s, 1H, H2), 7,80 (s, 1H, H8), 6,33 (m, 1H, Hl'), 4,44 (m, 1H, H4<1>), 4,27 (m, 1H, H5<»>a), 4,14 (m, 1H, H5'b), 4,11 (bred, s, 2H, -CH2-), 2,6-2,0 (m, 4H, H2' og H3') pluss mot-ion-(triethylammonium)-topper. 3^ ?-NMR (D20): -8,59 (bred d, J = 20, 1P), -9,56 (d, J = 20, 1P) og -21,38 (m, 1P). UV (pH 8,2 vandig tris): maksima ved 238 og 279,5 nm.
Eksempel 5
En andre fremstilling av 7- jod- 2', 3'- dideoxy- 7- deazaadenosin
( 21)
(Forbindelse 21 er et mellomprodukt som ble fremstilt og brukt ifølge eksempel 4).
A. Fremstilling av 6- klor- 2- methylthio- 9-( 2- deoxy- p- D-ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 23)
210 ml methanol og 210 ml konsentrert ammoniumhydroxyd ble tilsatt til en oppløsning av 26,8 g 6-klor-2-methylthio-9-(3,5-di-0-p-toluoyl-2-deoxy-B-D-ribofuranosyl)-7-deazapurin (22, fremstilt som beskrevet av KaziJtiierczuk et al., J. Am. Chem. Soc, vol. 106, 6379 (1984) i 210 ml diklormethan. Den resulterende blanding ble omrørt ved værelsetemperatur i fem dager og deretter inndampet til tørrhet. Resten ble tørket ved koinndamping med ethanol. Det urene produkt ble oppløst i diklormethan, og fargeløse krystaller falt ut etter henstand. Utfellingen ble samlet opp og vasket grundig med ether, hvorved man fikk 14,5 g (79,1 %)
diol 23 (sm.p. d 190-192°C).
^■H-NMR (DMSO-d6): 2,26 og 2,55 (m, 2H, H2'), 2,57 (s, 3H, SCH3), 3,54 (m, 2H, H5'), 3,84 (m, 1H, H3'), 4,37 (m, 1H, H4'), 4,95 (m, 1H, OH), 5,34 (m, 1H, OH), 6,57 (m, 1H, Hl'), 6,63 (m, 1H, H7), 7,80 (m, 1H, H8).
Disse data ble erholdt fra en annen sats av diol 23 fremstilt som beskrevet ovenfor.
B. Fremstilling av 6- klor- 2- methylthio- 9-( 5- O- trifenylmethyl- 2- deoxy- 3- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 24)
14,5 g diol 23 ble tørket ved koinndamping med tørr pyridin. 16 g trifenylmethylklorid, 600 mg 4-(dimethyl-amino)-pyridin og 8,0 ml triethylamin ble tilsatt til en oppløsning av den tørre diol i 200 ml tørr pyridin. Etter omrøring av reaksjonsblandingen ved 65°C under nitrogen i
6 timer ble ytterligere 2,0 g trifenylmethylklorid og 1,0 ml triethylamin tilsatt, og oppvarming ble fortsatt i 17 timer. Etter avkjøling ble 3 ml methanol tilsatt, og reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet. Resten ble fordelt mellom diklormethan og 0,3 N saltsyre. Det organiske sjikt ble
vasket med vandig natriumbicarbonat og saltoppløsning, tørket over natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Kromatografi av det resulterende urene produkt på silicagel med 1 % og 1,5 % methanol i diklormethan gav 22,7 g (88,6 %) av monotritylether 24 som et glassaktig fast stoff.
^■H-NMR (CDC13): 2,48, og 2,60 (m, 2H, H2' ) , 2,59 (s, 3H, SCH3), 3,40 (m, 2H, H5'), 4,08 (m, 1H, H3'), 4,61 (m, 1H, H4'), 6,43 (m, 1H, H7), 6,68 (m, 1H, Hl'), 7,2-7,5 (m, 16H, trityl H og H8).
Disse data ble erholdt fra en annen sats av 24 fremstilt som beskrevet ovenfor.
C. Fremstilling av 6- klor- 2- methylthio- 9-( 5- O- trifenyl-methyl— 2, 3- dideoxy- 3- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 25)
16,5 g 4-(dimethylamino)-pyridin og 13,5 ml fenylklorthionocarbonat ble tilsatt til en oppløsning av tritylether 24 i 300 ml tørr diklormethan. Etter omrøring av reaksjonsblandingen ved værelsetemperatur under nitrogen i 2,25 timer
ble 200 ml diklormethan tilsatt. Oppløsningen ble vasket med 700 ml 0,5 N saltsyre, 700 ml 0,5 N natriumhydroxyd og saltoppløsning. Det organiske sjikt ble tørket over natriumsulfat og inndampet til tørrhet.
Det resulterende urene thiocarbonat ble oppløst i
450 ml tørr toluen, og oppløsningen ble varmet opp til en forsiktig koking med tilbakeløp. 600 mg azobisbutyronitril og 17,7 ml tri-n-butyltinnhydrid ble tilsatt. Etter om-røring ved koking med tilbakeløp under nitrogen i 15 min. ble ytterligere 2,0 ml tri-n-butyltinnhydrid tilsatt, og reaksjonsblandingen ble kokt under tilbakeløp i ytterligere 15 min. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen fortynnet med 200 ml ether og vasket med 500 ml 10 % vandig kaliumfluorid, 500 ml 0,75 N kaliumhydroxyd og saltoppløsning. Etter tørking over natriumsulfat og oppkonsentrering gav kromatografi av det resulterende urene produkt på silicagel med 2:1 diklormethan:ether og diklormethan 10,1 g dideoxynukleosid 25. De urene fraksjoner ble slått sammen og på nytt kromatografert, hvorved man fikk ytterligere 3,76 g av rent produkt. Disse produktene ble slått sammen, hvorved man fikk 13,9 g (63,0 %) av 25 som et fargeløst fast stoff (sm.p. 140-142,5 °C).
<1->H-NMR (CDC13): 2,11, 2,36 og 2,46 (m, 4H, H2' og H3<1>), 2,60 (s, 3H, SCH3), 3,33 (tilsynelatende d, J = 4, 2H, H5'), 4,32 (m, 1H, H4'), 6,39 (d, J = 3,7, 1H, H7), 6,52 (dd, J = 6,7 og 3,7, 1H, Hl'), 7,25 og 7,45 (m, 15H, trityl H), 7,32 (d, 1H, J = 3,7, H8).
Disse data ble erholdt fra en annen sats av 25 fremstilt som beskrevet ovenfor.
D. Fremstilling av 6- klor- 2- methylthio- 9-( 2', 3'- dideoxy- B-D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 26)
10 ml trifluoreddiksyre ble tilsatt til en oppløsning av 7,58 g tritylether 25 i 1:1 methanol:diklormethan (100 ml), og oppløsningen ble omrørt ved 25°C under nitrogen i 17 timer. Reaksjonsblandingen ble fordelt mellom 500 ml diklormethan og vandig natriumbicarbonat, og vannsjiktet ble på nytt ekstrahert med diklormethan. De kombinerte organiske sjikt ble tørket over natriumsulfat og inndampet til tørr-het. Kromatografi av resten på silicagel med 0 % og 5 % methanol i diklormethan gav 4,07 g (97,1 %) nukleosid 26 som et tykt fargeløst glass.
<1->H-NMR (CDC13): 2,16, 2,26 og 2,50 (m, 4H, H2'og H3<1>), 2,63 (s, 3H, SCH3), 2,76 (bred s, 1H, OH), 3,67 og 3,93 (m, 2H, H5'), 4,27 (m, 1H, H4'), 6,38 (dd, J = 6,7 og 5,2 Hz, 1H, Hl')/ 6,51 (d, J = 3,7 Hz, 1H, H7), 7,26 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H8).
Disse data ble erholdt fra en annen sats av 26 fremstilt som beskrevet ovenfor.
E. Fremstilling av 2', 3'- dideoxy- 2- methylthio- 7- deazaadenosin ( 27) 10 g ammoniakk ble destillert inn i en oppløsning av klorid 26 (1,83 g) i 50 ml methanol i en glassforet bombe. Oppløsningen ble varmet opp i en autoklav ved 100°C i 15 timer. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen inndampet til tørrhet. Rensing av det resulterende urene produkt på silicagel med 0 %, 3 % og 5 % methanol i diklormethan gav 1,27 g (80,4 %) deazaadenosin 27 som et fargeløst fast stoff (sm.p. 184-185°C).
<1->H-NMR (DMSO-d6): 2,01, 2,21 og 2,39 (m, 4H, H2<1> og H3'), 2,45 (s, 3H, SCH3), 3,50 (m, 2H, H5'), 4,02 (m, 1H, H4'), 4,83 (t, J = 5,5, 1H, 5'OH), 6,32 (dd, J = 7 og 4,5, 1H, Hl'), 6,50 (d, J = 3,7, 1H, H7), 7,07 (bred s, 2H, NH2)/ 7,20 (d, 1H, J = 3,7, H8).
F. Fremstilling av 2', 3'- dideoxy- 7- deazaadenosin ( 20)
En blanding av 600 mg 27 og overskudd Raney-nikkel (Aldrich, forvasket med vann og methanol) ble kokt under tilbakeløp under nitrogen inntil TLC indikerte forsvinningen av utgangsmaterialet (6 timer). Den varme oppløsning ble filtrert gjennom filterhjelp, og det oppsamlede Raney-nikkel ble vasket godt med methanol. De kombinerte filtrater ble inndampet, hvorved man fikk 424 g (84,9 %) av 20 som et fargeløst, glassaktig fast stoff som er identisk med materialet fremstilt i eksempel 4C.
G. Fremstilling av 7- jod- 21, 3'- dideoxy- 7- deazaadenosin ( 21)
Dideoxy-7-deazaadenosin 20 ble jodert, etterfulgt av fremgangsmåten gjengitt i eksempel 4D.
Eksempel 6
En tredje fremstilling av 7- jod- 2', 31- dideoxy- 7- deazaadenosin ( 21)
(Forbindelse 21 er et mellomprodukt fremstilt og brukt i eksempel 4).
A. Fremstilling av 6- klor- 9-( 2- deoxy- B- D- ribofuranosyl)- 7-deazapurin ( 29)
En oppløsning av 100 ml konsentrert ammoniumhydroxyd i 175 ml methanol ble tilsatt til en oppløsning av 10 g 6-klor-9-(3,5-di-0-p-toluoyl-2-deoxy-B-D-ribofuranosyl)-7-deazapurin [28, fremstilt som beskrevet av Kazimierczuk et al., J. Am. Chem. Soc, vol. 106, 6379 (1984)] i 100 ml diklormethan. Etter omrøring av den resulterende blanding ved 25°C i 24 timer ble det tilsatt ytterligere 50 ml konsentrert ammoniumhydroxyd. Etter omrøring i til sammen fem dager ble reaksjonsblandingen inndampet til tørrhet og det urene produkt koinndampet med ethanol. Resten ble opp-løst i diklormethan, og det ønskede produkt utkrystallisert. Filtrering og tørking gav 4,90 g (92 %) av nukleosid 29 som fargeløse krystaller (sm.p. 155,5-158,5°C).
^-H-NMR (DMSO-d6): 2,30 og 2,55 (m, 2H, H2' ) , 3,58 (m, 2H, H5'), 3,85 (m, 1H, H3'), 4,40 (m, 1H, H4'), 4,97 (m, 1H, OH), 5,35 (m, 1H, OH), 6,65 (m, 1H, Hl'), 6,75 (d, 1H, H7), 8,00 (m, 1H, H8), 8,65 (s, 1H, H2).
Disse data ble erholdt fra en annen sats av 29 fremstilt som beskrevet ovenfor.
B. Fremstilling av 6- klor- 9-( 5- O- trifenylmethyl- 2- deoxy- B-D- ribof uranosyl) - 7- deazapurin ( 30)
2,5 g nukleosid 29 ble tørket ved koinndamping med tørr pyridin. Resten ble på nytt oppløst i 40 ml tørr pyridin og 2,5 g trifenylmethylklorid, 120 mg 4-(dimethylamino)-pyridin og 1,6 ml triethylamin ble tilsatt. Reaksjonsblan-
dingen ble omrørt ved 65°C i 4 timer under nitrogen. Ytterligere 1,0 g trifenylmethylklorid og 0,6 ml triethylamin ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt ved 75°C i 18 timer. Etter avkjøling ble 2 ml methanol tilsatt, og reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet. Resten ble fordelt mellom diklormethan og 0,5 N saltsyre. Det organiske sjikt ble vasket med vandig natriumbicarbonat og saltoppløs-ning, tørket over natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Kromatografi på silicagel med 0%, 1,5% og 3% methanol i diklormethan gav 2,26 g (48 %) tritylether 30 som et glassaktig fast stoff.
<1->H-NMR (CDC13): 2,46 og 2,65 (m, 2H, H2'), 3,40 (m, 2H, H5'), 4,10 (m, 1H, H3'), 4,65 (m, 1H, H4'), 6,55 (d, 1H, H7), 6,72 (m, 1H, Hl'), 7,2-7,5 (m, 16H, trityl H og H8) og 8,60 (s, 1H, H2).
C. Fremstilling av 6- klor- 9-( 5- O- trifenylmethyl- 2- deoxy- 3-thionocarbofenoxy- p- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 30a)
1,35 g 4-(dimethylamino)-pyridin og 1,20 ml fenylklorthionocarbonat ble tilsatt til en oppløsning av tritylether 30 i 30 ml tørr diklormethan. Etter omrøring av reaksjonsblandingen under nitrogen i 2 timer ved 25°C ble ytterligere 20 ml diklormethan tilsatt, og oppløsningen ble vasket med 0,5 N saltsyre, 0,5 N natriumhydroxyd og saltoppløsning. Det organiske sjikt ble tørket over natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Triturering av resten med diklormethan-ether gav 1,53 g (76 %) thiocarbonat 30a som fargeløse krystaller (sm.p. 186,5-188,5°C).
1-H-NMR (CDCI3): 2,85 og 3,00 (m, 2H, H2' ), 3,55 (m, 2H, H5'), 4,50 (m, 1H, H4'), 6,00 (m, 1H, H3'), 6,60 (d/ 1H, H7), 6,85 (m, 1H, Hl'), 7,1-7,5 (m, 20H, trityl og fenyl H), 7,50 (d, 1H, H8) og 8,60 (s, 1H, H2).
D. Fremstilling av 6- klor- 9-( 5- O- trifenylmethyl- 2, 3- dideoxy- 3- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 31)
En oppløsning av 1,2 g thiocarbonat 30a, 50 mg azoisobisbutyronitril og 0,60 ml tri-n-butyltinnhydrid i 50 ml tørr toluen ble varmet opp ved 110°C under nitrogen i 15 min. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen fortynnet med 50 ml ether og vasket med 50 ml 10 % vandig kaliumfluorid og saltoppløsning. Det organiske sjikt ble tørket over natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Kromatografi av det resulterende urene produkt på silicagel med 0 % og 1,5 % methanol i diklormethan gav 0,84 g (92 %) dideoxynukleosid 31 som et fargeløst fast stoff (sm.p. 60-63,5°C).
ifi-NMR (CDC13): 2,11, 2,36 og 2,50 (m, 4H, H2' og H3'), 3,37 (m, 2H, H5'), 4,35 (m, 1H, H4'), 6,50 (d, J = 3,7, 1H, H7), 6,58 (dd, 1H, Hl'), 7,25 og 7,45 (m, 15H, trityl H), 7,55 (d, 1H, J = 3,7, H8) og 8,60 (s, 1H, H2).
E. Fremstilling av 6- klor- 9-( 2, 3- dideoxy- 3- D- ribofuranosyl) - 7- deazapurin ( 31a)
1,5 ml trifluoreddiksyre ble tilsatt til en oppløsning av 700 mg tritylether 31 i 1:1 methanol:diklormethan (20 ml). Etter omrøring under nitrogen ved 25°C i 17 timer ble 1,5 g natriumbicarbonat tilsatt, og blandingen ble omrørt i 30 min. Reaksjonsblandingen ble filtrert og inndampet til tørrhet. Kromatografi av det resulterende produkt på silicagel med
0 % og 2 % methanol i diklormethan gav 300 mg (84 %) alkohol 31a som et fargeløst glass.
^H-NMR (CDCI3): 2,20, 2,40 og 2,65 (m, 4H, H2' og H3'), 3,65 og 4,00 (m, 2H, H5'), 3,95 (bred s, 1H, OH), 4,35 (m, 1H, H4'), 6,28 (dd, 1H, Hl'), 6,62 (d, J = 4, 1H, H7), 7,40 (d, 1H, J = 4, H8) og 8,65 (s, 1H, H2).
F. Fremstilling av 6- klor- 9-( 5- acetoxy- 2, 3- dideoxy- B- D-ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 32)
2,0 mmol eddiksyreanhydrid ble tilsatt til en oppløs-ning av 284 mg alkohol 31a i 10 ml tørr pyridin. Etter omrøring av oppløsningen i 1,25 time ved 25°C ble 10 ml methanol tilsatt. Etter omrøring i ytterligere 30 min. ble reaksjonsblandingen inndampet til tørrhet. Resten ble opp-løst i diklormethan, og denne oppløsning ble vasket med 1 N saltsyre (2 x) og saltoppløsning (lx). Det organiske sjikt ble tørket over natriumsulfat og inndampet til tørrhet, hvorved man fikk 295 mg (89 %) av råacetat 32 som et farge-
løst glass.
<1>H-NMR (CDCI3): 2,07 (s, 3H, acetyl), 2,20, 2,45 og 2,55 (m, 4H, H2' og H3<*>), 4,25 og 4,35 (m, 2H, H5'), 4,40 (m, 1H, H4'), 6,55 (dd, 1H, Hl'), 6,65 (d, 1H, H7), 7,50 (d, 1H, H8) og 8,60 (s, 1H, H2).
G. Fremstilling av 6- klor- 7- jod- 9-( 5- 0- acetyl- 2, 3- dideoxy-3- D- ribofuranosyl)- 7- deazapurin ( 33)
En oppløsning av 340 mg jodmonoklorid i ca. 1 ml diklormethan ble tilsatt til en oppløsning av 200 mg acetat 32 i 20 ml tørr diklormethan. Etter omrøring ved 25°C i 3 timer ble reaksjonsblandingen fordelt mellom diklormethan og vandig natirumhydrosulfitt. Det organiske sjikt ble vasket med vandig natriumbicarbonat og saltoppløsning, tørket over natriumsulfat og inndampet til tørrhet. Resten ble triturert med diklormethan-ether, hvorved man fikk 135 mg (47 %) fargeløse krystaller (sm.p. 132,5-134°C).
<1>H-NMR (CDCI3): 2,10, 2,40 og 2,55 (m, 4H, H2'og H3'), 2,17 (s, 3H, COCH3), 4,27 og 4,37 (m, 2H, H5'), 4,40 (m, 1H, H4'), 6,55 (dd, 1H, Hl'), 7,72 (s, 1H, H8) og 8,60 (s, 1H, H2).
H. Fremstilling av 7- jod- 2', 3'- dideoxy- 7- deazaadenosin ( 21) 4 g ammoniakk ble tilsatt til en oppløsning av 125 mg klorid 33 i 20 ml methanol i en glassforet bombe. Bomben ble varmet opp i en autoklav ved 100°C i 3 timers Etter avkjøl-ing ble reaksjonsblandingen inndampet til tørrhet. Resten ble oppløst i varm ethylacetat, og den varme oppløsning ble filtrert gjennom en pute av filterhjelp. Etter inndamping av filtratet til tørrhet ble resten triturert med ether, hvorved man fikk 85 mg svakt urent produkt 21 som fargeløse krystaller. Ytterligere rensing av dette materiale ved preparativ TLC på en silicagel med 5 % methanol i diklormethan gav 67 mg (63 %) jodid 21 som et fargeløst fast stoff. Dette materiale var identisk med det som ble fremstilt i eksempel 4D.
Eksempel 7
Fremstilling av 7- jod- 2', 3'- dideoxy- 7- deazainosin ( 53)
[Forbindelse 53 er et eksempel på struktur 4 hvor Het er 7-deazahypoxanthin (1)]. 18 ml vann ble tilsatt dråpevis til en suspensjon av 720,3 mg, 2,00 mmol deazaadenosin 21 i iseddik (2,0 ml) under argon, hvorved man fikk en klar oppløsning. 1,38 g, 20,0 mmol, 10 ekv. fast natriumnitritt ble tilsatt under en strøm av argon i små porsjoner i løpet av 10 min. Den resulterende uklare reaksjonsblanding ble omrørt mekanisk under argon, og en gummiaktig utfelling ble gradvis dannet. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen filtrert, og utfellingen ble vasket grundig med 100 ml ethylacetat og ca. 10 ml vann. De kombinerte filtrater ble fordelt, og vannsjiktet ble ekstrahert med 2 x 50 ml ethylacetat. De kombinerte organiske sjikt ble tørket over magnesiumsulfat og inndampet til tørrhet. Ifølge TLC bestod både utfellingen og ethylacetat-ekstraktene av produkt 53 og forurenset med mindre enn 5 % ikke-omsatt 21. Begge satsene av produkt ble oppløst i 1:1 methanol:diklormethan, slått sammen og inndampet på 7 g silicagel. Silicagelen ble koinndampet med 50 ml kloroform og plassert på en silicagelkolonne (50 g). Eluering med 8 % methanol i diklormethan gav 558,3 mg (78 %) deazainosin 53 som et lysegult fast stoff. Det ble erholdt to mengder med hvite krystaller ved rekrystallisering av dette materiale fra kokende isopropanol. Disse nålene hadde et smeltepunkt med dekomponering som varierte mellom 200 og 210°C. De kromatograferte og rekrystalliserte produkter var homogene ved TLC og NMR, bortsett fra tilstedeværelse av isopropanol (5 mol%).
^■H-NMR (DMSO-d6): 12,04 (bred s, 1H, Hl), 7,93 (s, 1H, H2), 7,56 (s, 1H, H8), 6,29 (dd, J = 4,0 og 6,8, 1H, Hl'), 4,94 (t, J = 5,0, 1H, 5'OH), 4,04 (tilsynelatende hept, J = 3,5, 1H, H4'), 2,36, 2,18 og 1,99 (m, 4H, H2' og H3' ).
Eksempel 8
Fremstilling av 5-( 3- amino- l- propynyl)- 2'- deoxycytidin- 5'-trifosfat ( 54)
[Forbindelse 54 er et eksempel på et alkynylaminonukleotid (I) hvor R]_ er -CH2-, Het er cytosin (i), R2, R3/ R7 og Rg er H, Rg er OH, og R5 er P3O9H<3>"].
A. Fremstilling av 5- jod- 2'- deoxycytidin ( 55)
En oppløsning av 1,226 g, 5,00 mmol 2'-deoxycytidin-monohydrat (Aldrich) og 1,753 g, 5,5 mmol, 1,1 ekv. kvikk-sølvacetat (Fisher) i 20 ml methanol ble kokt under tilbake-løp i 14,5 timer. Den resulterende hvite suspensjon ble fortynnet med 30 ml methanol og 50 ml diklormethan, og deretter ble 1,522 g, 6,00 mmol, 1,2 ekv. jod tilsatt. Etter omrøring i 60 min. hadde den resulterende fiolette oppløs-ning mistet fargen, og ikke-omsatt kvikksølvholdig materiale var fortsatt synlig som en hvit suspensjon. Etter 100 min. og 240 min. ble det gjort tilsetninger av hhv. 0,381 g,
1,5 mmol, 0,3 ekv. og 0,122 g, 0,50 mmol, 0,1 ekv. jod. Etter i alt 5 timer var reaksjonsblandingen krystallklar og fiolett. 5,17 g, 2,9 mekv./g, 3 ekv. AG3 X4A harpiks i fri baseform (Bio-Rad) ble tilsatt, og deretter ble hydrogensulfid boblet inn i reaksjonsblandingen i 5 min. Fullstendig utfelling av kvikksølv(II) ble bekreftet ved hjelp av TLC. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom filterhjelp, og filterhjelpen ble vasket med 1:1 methanol:diklormethan. 5 g silicagel ble tilsatt til de kombinerte filtrater, og reaksjonsblandingen ble inndampet til tørrhet. Silicagelen ble koinndampet med 50 ml kloroform og plassert på en kolonne med 50 g silicagel. Eluering med 15 %, 20 % og 30 % methanol i diklormethan gav 1,378 g (78 %) jodcytidin 55 som et hvitt pulver. Rekrystallisering fra 35 ml kokende methanol gav etter vakuumtørking over natten 0,953 g hvite nåler (sm.p. 179-180°C). Oppkonsentrering av modervæskene til 10 ml gav en andre mengde med 0,140 g lysegule nåler (sm.p. 172-174°C). Med unntak av et spor av methanol var begge mengdene (totalt utbytte 62 %) homogene ifølge TLC og NMR.
1-H-NMR (DMSO-d6): 8 , 28 ( s, 1H, H6) , 7 , 8 og 6,6 (bred
S, 2H, NH2), 6,08 (t, J = 6,3, 1H, Hl')/ 5,20 (d, J = 4, 1H, 3'OH), 4,90 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 4,20 (ra, 1H, H4'), 3,77 (fortegnet q, 1H, H3'), 3,60 og 3,54 (m, 1H, H5'), 2,12 og 1,98 (m, 1H, H2'). TLC (75:20:5 diklormethan-.methanol konsentrert ammoniumhydroxyd; UV): utgangsmateriale, Rf = 0,15; produkt 55, 0,33; kvikksølv(II), 0,54.
B. Fremstilling av 5-( 3- trifluoracetamido- l- propynyl)- 2'-deoxycytidin ( 56)
353,1 mg, 1,00 mmol jodid 55 ble koblet i 4 timer til N-propargyltrifluoracetamid, etterfulgt av den generelle fremgangsmåte gjengitt i eksempel 1C. Kromatografering av det urene produkt med en 0-20 % methanol-i-diklormethangradient gav 3,84 g (102 %) hvitt pulver etter vakuumtørking over natten. Dette materiale var homogent ved TLC, men holdt fast på oppløsningsmiddel. Rekrystallisering av dette pulver fra 10 ml kokende isopropanol og avkjøling til -s-20°C gav 299,6 mg (74 %) alkynylaminonukleosid 56 som hvite nåler (sm.p. 168-170°C). NMR viste at det rekrystalliserte produkt var homogent og at krystallene inneholdt 0,5 molekyler isopropanol per molekylprodukt 56.
■^■H-NMR (DMSO-d6): 9,96 (bred s, 1H, NHTFA), 8,15 (s, 1H, H6), 7,83 og 6,86 (bred s, 2H, NH2), 6,10 (t, J = 6,5, 1H, Hl'), 5,21 (d, J = 4,5, 1H, 3'OH), 5,06 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 4,35 (d, J = 4, 0,5H, isopropanol OH), 4,28 (bred s, 2H, -CH2N-), 4,20 (tilsynelatende heks, J = 3,5, 1H, H4'), 3,79 (m, 1,5H, H3' og isopropanol CH), 3,56, (m, 2H, H5'), 2,13 og 1,97 (m, 1H, H2') og 1,04 (d, J = 6, 3H, isopropanol CH3). TLC (85:13:2 diklormethan:methanol:konsentrert ammoniumhydroxyd; to elueringer, UV): utgangsjodid 55, Rf = 0,31; produkt 56, 0,27.
C. Fremstilling av 5-( 3- amino- l- propynyl)- 2'- deoxycytidin-5'- trifosfat ( 54)
0,275 mmol alkynylaminonukleosid 56 ble omdannet til det tilsvarende 5'-trifosfat, og trifluoracetylgruppen ble fjernet ved å følge den generelle fremgangsmåte gjengitt i eksempel 1E. Etter tilsetning av den andre aliguot av
fosforoxyklorid fikk fosforylering skje i 3,5 timer. Hvis man antar at absorpsjonskoeffisienten til produktet er lik med absorpsjonskoeffisienten til utgangsmaterialet (8.780), var utbyttet av trifosfat 54 basert på dets UV-absorpsjon ved 293 nm, 17 %.
Eksempel 9
Fremstilling av 5-( 3- trifluoracetamido- l- propynyl)- 2'- deoxy-uridin ( 57)
[Forbindelse 57 er et eksempel på et alkynylaminonukleotid (I) hvor R^ er -CH2-, R2 er COCF3, Het er uracil (h), R3, <R>5, R7 og Rg er H, og R6 er OH].
7,08 g, 20,0 mmol 5-jod-2'-deoxyuridin (Aldrich) ble koblet i 4 timer til N-trifluoracetylpropargylamin ved å følge den generelle fremgangsmåte som er gjengitt i eksempel 1C, bortsett fra at reaksjonen ble tørr 2,5 ganger mer konsentrert enn vanlig. Kromatografi av det urene produkt på 500 g silicagel med 10-20 % methanol i diklormethan gav 3,50 mg (46 %) av alkynylaminonukleosid 57 som et gulbrunt fast stoff. Ifølge NMR og TLC var dette materiale mer enn 95 % rent, bortsett fra tilstedeværelse av methanol (ca.
50 mol%) som ikke ble fjernet ved vakuumtørking.
^■H-NMR (DMSO-d6): 11,63 (s, 1H, H3), 10,06 (fortegnet t, 1H, NHTFA), 8,19 (s, 1H, H6), 6,10 (tilsynelatende t, 1H, Hl'), 5,23 (d, J = 4, 1H, 3'OH), 5,07 (t, J = 5, 1H, 5'OH), 4,23 (m, 3H, -CH2- og H4'), 3,8 (tilsynelatende q, J = 4, 1H, H3'), 3,58 (m, 2H, H5') og 2,12 (m, 2H, H2').
Eksempel 10
Fremstilling av 5-( 5- trifluoracetamido- l- pentynyl)- 2', 3'-dideoxyuridin ( 58)
[Forbindelse 58 er et eksempel på struktur 5 hvor Het er uracil (h), og R3, er -(CH2)3-].
A. Fremstilling av 5- trifluoracetamido- l- pentyn ( 59)
Natriumhydrid (60 % dispersjon i olje, alfa) ble gjort oljefri ved grundig og hurtig vasking med pentan og deretter vakuumtørking. 4,40 g, 0,110 mol, 1,1 ekv. oljefritt natriumhydrid ble tilsatt i ca. 20 porsjoner i løpet av 25 min. til en oppløsning av 10,6 ml, 0,100 mol, 1,0 ekv. 5-klorpentyn, 14,13 g, 0,125 mol, 1,25 ekv. trifluoracetamid og 14,99 g, 0,100 mol, 1,0 ekv. natriumjodid i 250 ml tørr dimethylformamid (Aldrich). Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 25°C i 4,5 timer og ved 60°C i 21 timer. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen tilsatt til en oppløsning av 43,5 g, 0,250 mol, 2,0 ekv. kaliumdihydrogenfosfat i 500 ml vann. Denne oppløsning ble ekstrahert med 2 x 500 ml pentan og 3 x 500 ml ether. De kombinerte organiske sjikt ble vasket med 1 x 100 ml vann, tørket over magnesiumsulfat og oppkonsentrert med en rotasjonsinndamper. Fraksjonell destillasjon to ganger gjennom en 20 cm Vigreux-kolonne gav 8,09 g (45 %) 5-trifluoracetamid-1-pentyn (58) som en fargeløs, mobil væske (kp. 68-69°C ved 13 torr).
<1->H-NMR (CDC13): 6,77 (bred s, 1H, NHTFA) , 3,53 (g, J = 6,7 og 2,7, 2H, CH2NHTFA), 2,31 (td, J = 6,7 og 2,7, 2H, HCCCH2-), 2,04 (t, J = 2,7, 1H, HCCCH2-) og 1,83 (kvintett, J = 6,7, 2H, -CH2CH2CH2-).
B. Fremstilling av 5-( 5- trifluoracetamido- l- pentynyl)-21, 3'- dideoxyuridin ( 58)
5-trifluoracetamido-1-pentyn (59) ble koblet i
4 timer til 5-jod-2',3'-dideoxyuridin (47, fremstilt som beskrevet i eksempel 2A) ifølge den generelle fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 1C. Kromatografi på 100 g silicagel med en 0-5 % methanol-i-diklormethangradient gav 647,7 mg alkynylaminonukleosid 58 som et lyst gulbrunt skum. Dette materiale var homogent ved TLC og NMR, bortsett fra tilstedeværelse av ca. 16 mol% dimethylformamid. Etter korreksjon for tilstedeværelsen av dimethylformamid var utbyttet av ønsket produkt 80 %. ■^■H-NMR (DMSO-d6): 11,52 (s, 1H, H3), 9,47 (fortegnet t, 1H, NHTFA), 5,90 (q, 1H, Hl'), 5,12 (t, 1H, 5'OH), 4,04 (m, 1H, H4'), 3,71 og 3,52 (m, 2H, 5'H), 3,30 (m, 2H, -CH2CH2CH2NHTFA), 2,40 (t, 2H, -CH2CH2CH2NHTFA), 2,23, 2,01 og 1,85 (m, 4H, H2' og H3') og 1,73 (kvintett, 2H,
-CH2 CH2CH2NHTFA).
Eksempel 11
Fremstilling av 5-( 12- trifluoracetamido- l- dodecynyl)- 2' , 3'-dideoxyuridin ( 60)
[Forbindelse 60 er et eksempel på struktur 5 hvor Het er uracil (h), og R^. er -(CH2)io~]«
A. Fremstilling av 11- dodecyn- l- ol ( 61)
64,26 g, 0,200 mol l-brom-10-tetrahydropyranyloxydecan (Lancaster, "97 + %") ble dråpevis tilsatt i løpet av 140 min. til en foravkjølt suspensjon av 23,94 g, 0,260 mol, 1,3 ekv. lithiumacetylidethylendiaminkompleks (Aldrich, 90 %) i 100 ml tørr dimethylsulfoxyd, slik at den indre temperatur forble ved 5-10°C. Etter at tilsetningen var fullført, ble avkjølingsbadet fjernet, og reaksjonsblandingen ble omrørt i 4,5 timer. 20 ml vann ble dråpevis tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter omrøring i 10 min. ble reaksjonsblandingen helt over i 300 ml vann. Denne oppløsning ble ekstrahert sekvensvis med 2 x 300 ml pentan og 2 x 300 ml ether. Hvert organisk sjikt ble vasket hver for seg med vann (ca. 20 ml), og de vandige vaskevann ble kombinert med hovedvannsjiktet for ny ekstraksjon. De kombinerte organiske sjikt ble tørket over magnesiumsulfat og inndampet til tørrhet, hvorved man fikk 51,38 g (96 %) uren 12-(tetrahydropyranyloxy)-1-dodecyn som en olje.
En sterkt sur ionebytterharpiks (AG-50W-X8, 50 g,
5,1 mekv./g, Bio-Rad) ble tilsatt til en oppløsning av det ovenfor nevnte urene produkt (49,96 g) i en blanding av 260 ml kloroform og 260 ml methanol. Suspensjonen ble varmet opp ved koking under tilbakeløp i 4,5 timer og deretter avkjølt. Reaksjonsblandingen ble filtrert, og filtratet ble oppkonsentrert. Kromatografi av resten på 500 g silicagel med 10%, 20% og 30% ethylacetat i hexaner gav 31 g av en olje som var mer enn 95 % en flekk ved TLC, med påvisning ved hjelp av fosfomolybdensyre. Destillasjon av dette materiale gjennom en 20 cm Vigreux-kolonne gav etter et 0,78 g forforsøk 17,91 g 11-dodecyn-l-ol (61) som en tykk fargeløs olje (kp. 104-108°C ved 1,4 torr) som størknet til et hvitt fast stoff ved henstand. Dette materiale var 98 %
en topp ved GC.
^H-NMR (CDCI3) av det kromatograferte produkt før destillasjon: 3,64 (t, 2H, -CH2OH), 3,37 og 3,33 (m, ca. 0,2H, urenhet), 2,17 (td, 2H, HCCCH2-), 1,92 (t, 1H, HCCCH2-) og 1,2-1,6 (m, 17H, (CH2)8 og OH). IR (tynn film av smelte): 3392 (0-H), 3311, 2930 og 2854 (C-H), 2160 (acetylen), 1466, 1432, 1394, 1371, 1352, 1328, 1303, 1103 og 1001.
B. Fremstilling av 12- jod- l- dodecyn ( 62)
43,16 g, 170 mmol, 2,0 ekv. jod ble tilsatt til en suspensjon av 15,50 g, 85 mmol destillert alkohol 61,
17,36 g, 255 mmol, 3,0 ekv. imidazol og 66,90 g, 255 mmol, 3.0 ekv. trifenylfosfin i 425 ml tørr toluen lagret over molekylsikter. Reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved koking under tilbakeløp med kraftig omrøring i 25 min., hvorved det ble dannet en gul oppløsning med en oljeaktig svart utfelling. Etter avkjøling til 25°C ble det tilsatt 200 ml mettet vandig natriumbicarbonat og 23,73 g, 93,5 mmol,
1.1 ekv. jod, og reaksjonsblandingen ble kraftig omrørt i en time. 40 ml mettet vandig natriumsulfitt ble tilsatt, hvilket fjernet den fiolette farge. Reaksjonsblandingen fikk separere i to sjikt, og det organiske sjikt ble vasket med saltoppløsning. Det organiske sjikt ble tørket over magnesiumsulfat og oppkonsentrert. Resten ble oppløst i 50 ml diklormethan, og 200 ml ether ble tilsatt. Etter henstand i 30 min. ble den resulterende utfelling (trifenylfos-finoxyd) fjernet ved filtrering og vasket med 100 ml ether. Etter ytterligere henstand avsatte den kombinerte modervæske og ethervask en andre mengde krystaller som ble fjernet som tidligere. De kombinerte modervæsker og ethervaskeoppløs-ninger ble oppkonsentrert og oppløst i 200 ml lunken toluen. Denne oppløsningen ble plassert på en kolonne av 500 g silicagel og eluert med 3 1 toluen, hvorved man fikk 13,55 g (55 %) jodid 62 som en lysegul mobil væske. Dette materiale var 96 % en topp ved GC.
^H-NMR (CDCI3): 3,20 (t, 2H, -CH2I), 2,17 (td, 2H, HCCCH2-), 1,94 (t, 1H, HCCCH2-), 1,82, 1,51 og 1,20-1,42 (m, 16H, (CH2)8).
C. Fremstilling av 12- trifluoracetamido- l- dodecyn ( 63)
Natriumhydrid (60 % dispersjon i olje, alfa) ble gjort oljefri ved hurtig og grundig vasking med pentan og vakuum-tørking. 22,61 g, 200 mol, 5 ekv. trifluoracetamid ble tilsatt i ca. 10 porsjoner i løpet av 50 min. til en suspensjon av 3,84 g, 160 mmol, 4 ekv. natriumhydrid i 90 ml tørr dimethylformamid (Aldrich). Da det ble oppdaget tidlig under denne tilsetning at reaksjonsblandingen ble oppvarmet, ble det tilsatt et is-/vannbad, og resten av tilsetningen ble utført ved en indre temperatur på ca. 10°C. Is-/vannbadet ble fjernet, og reaksjonsblandingen ble omrørt inntil hydro-genutvikling stanset. Etter omrøring i ytterligere 15 min. ble en oppløsning av 11,69 g, 40,0 mmol jodid 63 i 10 ml tørr dimethylformamid tilsatt dråpevis i løpet av 10 min. til reaksjonsblandingen. Etter omrøring i 4 timer ved 25°C ble reaksjonsblandingen hurtig helt over i en omrørt blanding av 200 ml mettet vandig ammoniumklorid, 200 ml vann og 200 ml pentan. Reaksjonsbeholderen ble skylt med en blanding av 50 ml vann, 50 ml mettet vandig ammoniumklorid og 200 ml pentan. De kombinerte oppløsninger fikk separere i to sjikt, og vannsjiktet ble ekstrahert med 2 x 200 ml pentan. De kombinerte organiske sjikt ble tørket over magnesiumsulfat og inndampet til tørrhet, hvorved man fikk 10,42 g (94 %) trifluoracetamid 63 som en olje som størknet til et voksaktig fast stoff ved henstand.
Rekrystallisering av dette materiale fra 100 ml kokende hexan med sakte avkjøling til -s-20°C gav 8,145 g (73 %) trifluoracetamid 63 som lysegule nåler (sm.p. 46-47°C).
<i>H-NMR (CDC13): 6,27 (bred s, 1H, NHTFA), 3,34 (tilsynelatende q, 2H, -CH2NHTFA), 2,18 (td, 2H, HCCCH2-), 1,94 (t, 1H, HCCCH2-), 1,20-1,65 (m, 16H, (CH2)8). IR (tynn film av smelte): 3312, 3298, 2932 og 2857 (C-H og N-H), 2117 (acetylen), 1706 (C=0), 1675, 1563, 1460, 1448, 1208, 1182, 1166, 722 og 634.
D. Fremstilling av 5-( 12- trifluoracetamido- l- dodecynyl)-23'- dideoxyuridin ( 60)
Beskyttet alkynylamin 63 ble koblet i 24 timer til 676,2 mg, 2,00 mmol 5-jod-2',3<1->dideoxyuridin (47, fremstilt som beskrevet i eksempel 2A) ved å følge den generelle fremgangsmåte beskrevet i eksempel 1C. Kromatografi på 100 g silicagel og eluering med en 0-5 % methanol-i-diklormethangradient gav et mørkerødt skum. Den røde urenhet ble fjernet ved kromatografi på en reversfasekolonne (100 g, octadecyl-silan på 40 mikrometer silicagel, Baker) med 40 % vann i methanol. De passende fraksjoner ble slått sammen, oppkonsentrert og koinndampet to ganger med absolutt ethanol, hvorved man fikk 731 mg alkynylaminonukleosid 60 som en klar olje. Dette materiale var homogent ved TLC og NMR, bortsett fra tilstedeværelse av restethanol (25 mol%, korrigert utbytte 73 %).
<3->H-NMR (DMSO-d6): 11,49 (bred s, 1H, -H3), 9,38 (fortegnet t, 1H, NHTFA), 8,15 (s, 1H, H6), 5,90 (dd, 1H, Hl'), 5,12 (fortegnet t, 1H, 5'OH), 4,35 (t, 0,25H, CH2CH2OH), 4,03 (m, 1H, H4'), 3,72 og 3,52 (m, 2H, H5'), 3,43 (m, 0,5H, CH3CH2OH), 3,16 (kvintett, 2H, -CH2NHTFA), 2,34 (t, 2H, propargylisk H), 2,16, 2,01 og 1,86 (m, 4H, H2' og H3'), 1,65-1,15 (m, 16H, (C<H>2)8) og 1,06 (t, 0,75H, CH3CH2OH).
Eksempel 12
Fremstilling av 5-( 5- amino- l- pentynyl)- 2', 3'- dideoxyuridin
( 64)
[Forbindelse 64 er et eksempel på et alkynylaminonukleotid (I) hvor Het er uracil (h), R^ er (CH2)3, og R2, R3, R5, <R>6, R7 og R8 er H].
A. Fremstilling av 5- amino- l- pentyn ( 65)
340 g, 20 mol ammoniakk ble destillert inn i en bombe som inneholdt 20,51 g, 0,200 mol 5-klorpentyn og 7,49 g, 0,050 mol, 0,25 ekv. natriumjodid. Bomben ble lukket og varmet opp i en autoklav ved 100°C i 12 timer. Ammoniakken fikk avdampe, og resten ble omrørt med en tofaseblanding bestående av 40 g, 1,0 mol, 5 ekv. natriumhydroxyd, 100 ml
vann og 100 ml ether. Den resulterende blanding ble filtrert og fikk separere i to sjikt. Det organiske sjikt ble tørket over magnesiumsulfat og destillert gjennom en 20 cm Vigreux-kolonne. Fire fraksjoner (12,46 g, kp. 95-127°C, atmosfære-trykk) ble funnet ved GC å inneholde betydelige mengder av
produkt. Disse fraksjonene ble slått sammen og forsiktig destillert gjennom en kolonne med roterende bånd, hvorved man fikk 6,55 g (39 %) 5-amino-1-pentyn (65) som en fargeløs mobil væske (kp. 125,5-126°C). Dette materiale var mer enn 99 % en topp ved GC.
ifJ-NMR (CDC13): 2,81 (t, J = 7,5, 2H, -CH2NH2), 2,27 (td, J = 7,5 og 2,5, 2H, HCCCH2-), 1,96 (t, J = 2,5, 1H, HCCCH2-), 1,66 (kvintett, J = 7,5, 2H, -CH2CH2CH2-) og 1,07 (bred s, 2H, NH2).
B. Generell fremgangsmåte for kobling av ubeskyttede alkynylaminer til jodnukleosider. Fremstilling av 5-(5-amino- 1- pentyn)- 21, 31- dideoxyuridin ( 64)
En tørr, 35 ml rundbunnet kolbe ble fylt med 676,2 mg, 2,00 mmol 5-jod-2',3'-dideoxyuridin (47, fremstilt som beskrevet i eksempel 2A) og deretter gjennomblåst med argon. 10 ml tørr dimethylformamid (Aldrich), 0,56 ml, 4,0 mmol, 2,0 ekv. tørr triethylamin lagret over sikter, 0,59 ml,
6,03 mmol, 3,0 ekv. 5-amino-l-pentyn og 231 mg, 0,200 mmol, 0,1 ekv. tetrakis-(trifenylfosfin)-palladium(O) som var veid inn i en ampulle i en tørr boks, ble tilsatt. Den resulterende suspensjon ble omrørt i 45 min., men palladiumkata-lysatoren forble i det minste delvis uoppløst. 190,4 mg, 1,00 mmol, 0,5 ekv. kobberjodid (Aldrich, Gold Label) ble tilsatt. Etter omrøring i 15 min. hadde det dannet seg en homogen blå oppløsning, og etter ca. 150 min. ble oppløs-ningen uklar. Etter 200 min. viste TLC at alt utgangsjodid 47 var blitt forbrukt. Etter 4 timer ble reaksjonsblandingen oppkonsentrert med en rotasjonsinndamper i ca. 10 min. ved 45°C og 2 torr. Resten ble øyeblikkelig absorbert på en kolonne med 100 g silicagel og eluert med en blanding av diklormethan, methanol og konsentrert ammoniumhydroxyd (400 ml hver av 90:9:1, 85:13:2, 75:20:5, 65:30:5 og 50:45:5).
Fraksjonene som inneholdt det polare hovedprodukt ifølge TLC, ble slått sammen, koinndampet to ganger med ethanol og vakuumtørket over natten, hvorved man fikk 395,9 g (67 %) alkynylaminonukleosid 64 som et gult fast stoff. Dette materiale var homogent ved TLC og NMR, bortsett fra tilstedeværelsen av 33 mol% ethanol som ikke ble fjernet ved vakuumtørking. Utbyttet av 64 korrigert for tilstedeværelsen av ethanol var 64 %.
<1>H-NMR (DMSO-d6): 8,33 (s, 1H, H6), 5,90 (dd, J = 6,6 og 3,0, 1H, Hl'), 4,05 (m, 1H, H4'), 3,73 (dd, J = 6,6 og 3,0, 1H, Hl<1>), 4,05 (m, 1H, H4'), 3,73 (dd, J = 12,1 og 2,8, 1H, H5'a), 3,53 (dd, J = 12,1 og 3,1, 1H, H5'b), 2,80 (bred s, 2H, -CH2H2), 2,45 (t, J = 7,0, 2H, propargylisk H), 2,28, 2,02 og 1,86 (m, 4H, H2<1> og H3') og 1,70 (kvintett, J = 7,0 Hz, 2H, -CH2CH2CH2-).
Disse NMR-data fikk man fra en annen sats av 64 fremstilt på en måte som var lik med den som er beskrevet ovenfor. Signalene for utbyttbare hydrogenatomer (H3, 5'OH og -NH2) i NMR-prøvene fra begge materialene ble slått sammen i ett enkelt bredt (> 2 ppm bredt) signal som knapt var opp-løst fra grunnlinjen.
Eksempel 13
Fremstilling av 5-( 3- amino- l- propynyl)- 2', 3'- dideoxyuridin
( 66)
[Forbindelse 66 er et eksempel på et alkynylaminonukleotid (I) hvor Het er uracil (h), R^ er CH2, og R2, R3, R5, <R>6, R7 og R8 er H].
2,00 mmol 5-jod-2',3'-dideoxyuridin (47) ble koblet i 3 timer til 6,00 mmol propargylamin (Aldrich) ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 12B, bortsett fra at propargylamin ble brukt i stedet for 5-amino-l-pentyn. Kromatografi som beskrevet ovenfor gav tilbake 794,5 mg uren alkynylaminonukleosid 66 som et gult fast stoff som gav en enkelt flekk når det ble analysert ved hjelp av TLC. NMR og massebalansen for reaksjonen indikerte at dette materiale var forurenset av ethanol og muligens uorganiske urenheter.
■^H-NMR (DMSO-d6): 11,70 (bred s, 1H, H3), 8,40 (s,
1H, H6), 8,25 (bred s, 2H, NH2), 5,89 (dd, J = 6,6 og 3,0, 1H, Hl'), 5,13 (t, J = 5,0, 1H, 5'OH), 4,07 (m, 1H, H4'), 3,96 (s, 2H, -CH2NH2), 3,71 og 3,56 (m, 2H, H5'), 2,30, 2,04 og 1,85 (m, 4H, H2' og H3') og signaler for ethanol og en ukjent urenhet.
NMR-datåene ovenfor ble tatt fra forskjellige frem-stillinger av 66 utført som ovenfor, bortsett fra at 0,2 ekv. kobberjodid ble brukt, og at reaksjonen ikke ble fullført.
Eksempel 14
Fremstilling av l-( 2- hydroxyethoxymethyl)- 5-( 3- amino- l-propynyl) - cytosin- trif osf at ( 67)
[Forbindelse 67 er et eksempel på et alkynylaminonukleotid (I) hvor R^ er -CH2-, R2 og R3 er H, Het er cytosin (i), R4 er (g), og R5 er P3O9H<3>"].
A. Fremstilling av 1-( 2- hydroxyethoxymethyl)- 5- jodcytosin
( 68)
En blanding av 1,85 g, 10,0 mmol 1-(2-hydroxyethoxy-methyl) -cytosin og 3,35 g, 10,5 mmol kvikksølvacetat ble kokt under tilbakeløp i methanol (50 ml) og diklormethan (100 ml). 3,05 g, 12,0 mmol jod ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble omrørt i en time. Den frie baseform av AG3-X4-harpiks (38 mekv.) ble tilsatt og oppløsningen gjennomboblet med hydrogensulfid i 15 min. De faste stoffene ble fjernet ved filtrering og filtratet strippet ned på 10 g silicagel. Silicaen ble fylt på en silicagelkolonne (4 x 25 cm) og eluert med 5 %, 10 % og 20 % methanol i diklormethan. Inndamping etterfulgt av vakuumtørking gav et fargeløst fast stoff (1,73 g, 56 %).
Rekrystallisering fra 95 % ethanol gav analytisk rent materiale (sm.p. 172°C). Beregnet for C2HinN3C>3l: C
27,03 %, H 3,24 %, N 13,51 %. Funnet: C 27,08 %, H 3,41 %, N 13,51 %. UV (methanol): maksimum ved 292,5 (5.300). <1>H-NMR (DMSO-d6): 3,481 (m, 4H), 4,659 (t, J = 5, 1H), 5,070 (s, 2H), 6,665 (bred s, 1H), 7,869 (bred s, 1H) og 8,107 (s, 1H).
B. Fremstilling av 1-( 2- hydroxyethoxymethyl)- 5-( 3- trifluoracetamido- l- propynyl)- cytosin ( 69)
311 mg, 1,00 mmol jodid 68 ble koblet til N-propargyltrifluoracetamid (43) ifølge den generelle fremgangsmåte beskrevet i eksempel 1C. Hurtig kromatografi på 3 x 20 cm silicagel med 5 %, 10 % og 20 % methanol i diklormethan gav alkynylaminonukleosid 69 som et lysegult skum (77,4 mg, 23 %).
NMR (DMSO-d6): 3,472 (bred s), 4,276 (d, J = 5,0, 2H), 4,653 (bred t, J = 4,5, 1H), 5,091 (s, 2H), 6,925 (bred s, 1H), 8,037 (s, 1H) og 9,964 (bred s, 1H).
C. Fremstilling av 1-( 2- hydroxyethoxymethyl)- 5-( 3- amino- l-propynyl )- cytosin ( 67)
Hydroxylgruppen i sukkerdelen av alkynylaminonukleosid 69 (0,167 mmol) ble omdannet til et trifosfat, og trifluoracetylgruppen ble fjernet ved å følge den generelle fremgangsmåte som er gjengitt i eksempel 1E. Etter tilsetning av den andre aliguot av fosforoxyklorid fikk fosforylering fortsette i 75 min. Hvis man antar at absorpsjonskoeffisienten for produktet er lik med absorpsjonskoeffisienten for utgangsmaterialet (7.790), var utbyttet av trifosfat 67 basert på dets UV-absorpsjon ved 291 nm, 21 %.
Eksempel 15
Fremstilling av N- hydroxysuccinimidester 2a
(Et foretrukket reagens for festing av et 505 nm fluorescerende fargestoff til et alkynylaminonukleotid hvor R9 og R10 er H).
A. Fremstilling av 9-( carboxyethyliden)- 3, 6- dihydroxy- 9H-xanthen ( SF- 505)
33,0 g, 0,300 mol resorcinol og 30,0 g, 0,300 mol ravsyreanhydrid ble plassert i en rundbunnet kolbe og renset med nitrogen. 150 ml methansulfonsyre ble tilsatt, og opp-løsningen ble omrørt ved 65°C i 2 timer under en atmosfære av nitrogen. Reaksjonsblandingen ble tilsatt dråpevis til hurtig omrørt, isavkjølt vann (1 1) med samtidig tilsetning
av 50 % vandig natriumhydroxyd for å holde pH på 2,5 +/* 0,5. Produktet som fremkom som en granulær utfelling, ble samlet opp ved filtrering og skylt med 3 x 100 ml vann og deretter 3 x 100 ml aceton. Produktet ble lufttørket og deretter vakuumtørket (vakuumovn) ved 110°C i 18 timer, hvorved man fikk et mørkerødt pulver (37,7 g, 88 %).
En analytisk prøve ble fremstilt ved å oppløse 1,0 g av produktet i 25 ml varm 0,3 N HC1. Utfellingen som ble dannet etter avkjøling, ble fjernet ved filtrering og kastet. Fortynnet vandig natriumhydroxyd ble tilsatt for å øke pH til 1,25. Den resulterende utfelling ble samlet opp ved filtrering, skylt med vann, lufttørket og deretter vakuumtørket over P2O5 ved 140°C i 36 timer.
Analyse: beregnet [C(16)H(12)0(5)] C 67,60, H 4,26. Funnet: C 67,37, H 4,34, 0,52 % vann (K-F). NMR (DMSO-d6): (for det meste spirolaktonform) 6 2,690 (t, J = 8,6 hz, 2H), 3,070 (t, J = 8,6 hz, 2H), 6,530 (d, J = 1,8 hz, 2H), 6,676 (dd, J = 8,7, 1,8 hz, 2H), 7,432 (d, J = 8,7, 1,8 hz, 2H), 7,432 (d, J = 8,7 hz, 2H) og 9,964 (s, 2H). Vis. abs. (pH 8,2; 50 mM vandig tris/HCl): maks. 486 nm (72.600).
B. Fremstilling av 9-( 2- carboxyethyl)- 3, 6- diacetoxy- 9-ethoxy- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 505)
29,3 g, 103 mmol SF-505 ble tilsatt til iskald eddiksyreanhydrid (500 ml), etterfulgt av 100 ml pyridin. Blandingen ble omrørt i is i 20 min. og deretter tilsatt i løpet av 20 min. til hurtig omrørt, iskaldt vann (7 1). Etter omrøring i ytterligere 30 min. ble mellomproduktet filtrert og resuspendert i vann (4 1) og omrørt i ytterligere 30 min. Det faste stoff ble samlet opp ved filtrering, oppløst ill absolutt ethanol og kokt under tilbakeløp i 45 min. Oppløs-ningen ble oppkonsentrert på en rotasjonsinndamper til
200 ml, noe som resulterte i krystallisering. Produktet ble samlet opp ved filtrering, lufttørket og deretter vakuum-tørket, hvorved man fikk lyse orange mikrokrystaller (21,9 g, 51 %).
Rekrystallisering fra methylenklorid/cyklohexan gav fargeløse mikrokrystaller, sm.p.: 142-143°C. Analyse: beregnet [C(22)H(22)0(8)] C 63,76, H 5,35. Funnet: C 63,58, H 5,39. NMR (DMSO-d6): 5 1,035 (t, J = 6,9 hz, 3H), 1,667 (m, 2H), 2,232 (m, 2H), 2,294 (s, 6H), 2,888 (g, J = 6,9 hz, 2H), 7,0-7,1 (m, 4H) og 7,575 (d, J = 9,1 hz, 2H).
C. Fremstilling av 9-( 2-( N- succinimidyloxycarbonyl))-ethy1)- 3, 6- diacetoxy- 9- ethoxy- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 5 0 5- NHS)
10,4 g, 25,1 mmol Ac2EtSF-505 ble blandet med 300 ml methylenklorid og 9,70 g, 50,6 mmol 1-(3-dimethylamino-propyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid og 4,32 g, 37,5 mmol N-hydroxysuccinimid ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i en time og deretter vasket med 5 x 50 ml vann. De kombinerte vannsjikt ble tilbakeekstrahert med 50 ml methylenklorid, og de sammenslåtte organiske sjikt ble tørket over natrium-sulf at og strippet ned. Triturering med 75 ml ethanol etterfulgt av filtrering og lufttørking gav det urene produkt som et lysegult fast stoff (c. 10 g). Dette materiale ble oppløst i 50 ml methylenklorid, og 50 ml cyklohexan ble tilsatt. En teskje trekull ble tilsatt, blandingen ble filtrert, og produktet ble brakt ned med en ytterligere porsjon med 100 ml cyklohexan. Oppsamling ved filtrering, luft-tørking og vakuumtørking gav fargeløse krystaller (6,94 g, 54 %).
En andre utkrystallisering fra ethanol gav en analytisk prøve. Sm.p.: 162-3°C. Analyse: beregnet [C(26)H-(25)N(l)O(10)] C 61,05, H 4,93, N 2,74. Funnet: C 60,78, H 5,01, N 2,65. NMR (DMSO-d6): 6 1,056 (t, J = 7,0 hz, 3H), 2,4-2,1 (m, 4H), 2,293 (s, 6H), 2,757 (s, 4H), 2,922 (g, J = 7,0 hz, 2H), 7,069 (m, 4H) og 7,617 (p d, J = 9,1 hz, 2H).
D. Fremstilling av 9-( 2-( N- methyl- N-( benzyloxycarbonyl-methyl)- carboxamido)- ethyl)- 3, 6- diacetoxy- 9- ethoxy- 9H-xanthen ( Ac2EtSF- 505- Sar- OBn)
Til en oppløsning av 1,13 g, 6,31 mmol sarcosinbenzylester<*> i 50 ml methylenklorid ble det tilsatt 2,58 g,
5,05 mmol Ac2EtSF-505-NHS og 5 % vandig natriumbicarbonat-oppløsning (30 ml). Tofaseblandingen ble omrørt hurtig i 20 timer. Sjiktene ble separert og det organiske sjikt
vasket med 3 x 15 ml vann, tørket over natriumsulfat og oppkonsentrert til 25 ml. Oppløsningen ble fortynnet til 150 ml med cyklohexan, trekullbehandlet og redusert til 75 ml under en strøm av nitrogen som gav utfelling av produktet. Supernatanten ble dekantert bort og resten koinndampet med
methylenklorid, hvorved man fikk et fargeløst skum (1,70 g, 58 %).
Kraftig vakuumtørking gav en analytisk prøve. Analyse: beregnet [C(32)H(33)N(1)0(9)] C 66,77, H 5,78, N 2,43. Funnet: C 66,66, H 5,89, N 2,25. NMR (DMSO-d6): (viser 5:2-blanding av amidbundne rotamerer). 6 (stor og liten) 1,040 og 1,018 (t, J = 6,7 hz, 3H), 1,789 og 1,670 (m, 2H), 2,211 (m, 2H), 2,290 og 2,276 (s, 6H), 2,713 og 2,695 (s, 3H), 2,893 (g, J = 6,7 hz, 2H), 3,963 (s, 2H), 5,075 og 5,039 (s, 2H), 7,044 (m, 4H), 7,324 (m, 5H) og 7,573 og 7,516 (p d, J =9,2 hz, 2H).
<*> p-tosylatsalt av sarcosinbenzylester (Adams Chemical Co.) ble tatt opp i methylenklorid og vasket gjentatte ganger med 5 % vandig natriumbicarbonat, deretter vasket med vann, tørket over natriumsulfat og strippet ned.
E. Fremstilling av 9-(2-(N-methyl-N-(N'-succinimidyloxy-carbonylmethyl)-carboxamido)-ethyl-3,6-diacetoxy-9-ethoxy-9H- xanthen ( Ac2EtSF- 505- Sar- NHS, struktur 2a)
Til en oppløsning av 1,55 g, 2,69 mmol Ac2EtSF-505-Sar-OBn i 60 ml absolutt ethanol ble det tilsatt 10 % palladium-på-carbon (0,15 g). Blandingen ble omrørt under ballongtrykk av hydrogen i 30 min. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og ethanolen strippet av, hvorved man fikk en sirupaktig rest.
Denne resten ble oppløst i 85 ml methylenklorid og 0,495 g, 4,30 mmol N-hydroxysuccinimid, og 1,12 g, 5,84 mmol 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid ble tilsatt (4 x 25 ml). Oppløsningen ble oppkonsentrert til 25 ml, fortynnet til 175 ml med cyklohexan, trekullbehandlet og redusert i volum til 75 ml under en strøm av nitrogen. Det faste produkt ble samlet opp ved filtrering, lufttørket og vakuumtørket, hvorved man fikk et fargeløst pulver
(0,97 g, 62 %).
Koinndamping med methylenklorid etterfulgt av grundig vakuumtørking ved 40°C fjernet spor av cyklohexan og gav en analytisk prøve som et amorft fast stoff.
Analyse: beregnet [C(29)H(30)N(2)0(11)] C 59,79, H 5,19, N 4,81. Funnet: C 59,37, H 4,62, N 4,62, 0,93 % vann (K-F). NMR (DMSO-dg): (viser en 4:l-blanding av amidbundne rotamerer). 6 (stor og liten) 1,034 (t, J = 6,9 hz, 3H), 1,827 og 1,935 (m, 2H), 2,223 (m, 2H) , 2,289 (s, 6H), 2,758 (s, 4H), 2,779 og 2,824 (s, 3H), 2,888 (q, J = 6,8 hz, 2H), 4,333 og 4,473 (s, 2H), 7,043 (m, 4H) og 7,587 (per d, J = 9,1 hz, 2H).
Eksempel 16
Fremstilling av N- hydroxysuccinimidester 2b
(Et foretrukket reagens for festing av et 512 nm fluorescerende fargestoff til et alkynylaminonukleotid hvor Rg er H og R^q er CH3).
A. Fremstilling av 4- methylresorcinol
33,97 g, 0,246 mol 2,4-dihydroxybenzaldehyd (rekrystallisert fra toluen) ble oppløst i 3 1 2-propanol av spektroskopisk kvalitet i en rundbunnet kolbe utstyrt med et gassinnløp og et bobleutløp. 10 % palladium-på-carbon (1,35 g) ble tilsatt, etterfulgt av 3 ml fosforsyre, og blandingen ble gjennomblåst med nitrogen. Nitrogenstrømmen ble skiftet over til hydrogen, og blandingen ble hurtig omrørt med isavkjøling. Etter 3 timer var hydrogenopptaket fullstendig, og katalysatoren ble fjernet ved filtrering.
Filtratet ble strippet ned til 200 ml, og 200 ml ethylacetat ble tilsatt. Oppløsningen ble vasket med 4 x 200 ml vann og de kombinerte vannekstrakter tilbakeekstrahert med ethylacetat. Disse organiske ekstrakter ble vasket med vann og de kombinerte organiske sjikt tørket over natriumsulfat og strippet ned, hvorved man fikk produktet som et fargeløst, krystallinsk fast stoff (29,95 g, 98 %). Sm.p.: 106°C.
(Lit. 106-107°C [J.C. Bell, W. Bridge og A. Robertson, J. Chem. Soc, 1542-45 (1937)]).
NMR (DMSO-d6): 6 1,961 (s, Me), 6,076 (dd, H-6, J[5,6] = 8 hz, J[2,6] = 2 hz), 6,231 (d, H-2), 6,760 (d, H-5), 8,867 (s, OH) og 9,008 (s, OH) .
B. Fremstilling av 9- carboxyethyliden- 3, 6- dihydroxy- 2, 7-dimethyl- 9H- xanthen ( SF- 512)
25,8 g, 0,208 mol 4-methylresorcinol og 20,8 g, 0,208 mol ravsyreanhydrid ble plassert i en rundbunnet kolbe, og kolben ble renset med nitrogen. 150 ml methansulfonsyre ble tilsatt og oppløsningen varmet opp under nitrogen til 65°C i 2 timer. Oppløsningen ble tilsatt dråpevis til 1 1 hurtig omrørt, isavkjølt vann med samtidig tilsetning av 50 % vandig natriumhydroxyd for å opprettholde pH på 2,25 +/■*-0,25. Produktet ble samlet opp ved sentrifugering og vasket med vann (3 x) og acetaon (2 x). Det faste stoff ble luft-tørket og deretter vakuumtørket ved 110°c, hvorved man fikk et murstensrødt pulver (24,1 g, 74 %).
Rensing ble utført ved å la ethylacetat sakte diffun-dere inn i en oppløsning av produktet i dimethylsulfoxyd. Utfellingen ble samlet opp ved filtrering, lufttørket og deretter vakuumtørket.
NMR (DMSO-dg): (viser dårlig deltaform sammen med ett mol hver av vann og dimethylsulfoxyd). 6 2,124 (s, 6H), 3,421 (d, J = 7,2 hz, 2H), 5,769 (t, J = 7,2 hz, 1H), 6,512 (s, 1H), 6,573 (s, 1H), 7,295 (s, 2H), 9,681 (s, 1H), 9,825 (s, 1H) og 12,346 (bs, 1H). Vis. abs. (pH 8,2 vandig tris): maks 493,5 nm.
C. Fremstilling av 9- carboxyethyl- 3, 6- diacetoxy- 2, 7- di-methyl- 9- ethoxy- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 512)
En prøve av 20,0 g, 64,0 mmol SF-512 ble tilsatt til 350 ml eddiksyreanhydrid, etterfulgt av 80 ml pyridin. Dette ble omrørt i en time og deretter filtrert for å fjerne spor av ikke-omsatt fargestoff. Filtratet ble helt over i 3,5 1 hurtig omrørt vann. Det faste mellomprodukt ble samlet opp ved filtrering, oppslemmet på nytt i 2 1 kaldt vann, omrørt i 15 min. og deretter på nytt samlet opp og lufttørket, hvorved man fikk spirolaktonmellomproduktet
(20,8 g). Dette ble oppløst i 600 ml absolutt ethanol og kokt under tilbakeløp i 45 min. Oppløsningen ble trekullbehandlet og oppkonsentrert til 300 ml. Produktet ble samlet opp ved filtrering, skylt med kald ethanol (2 x 50 ml), lufttørket og deretter vakuumtørket, hvorved man fikk fargeløse mikrokrystaller (14,9 g, 53 %). Sm.p.: 143°C.
Analyse: beregnet [C(24)H(26)0(8)] C 65,15, H 5,92. Funnet: C 65,31, H 5,97. NMR (DMSO-d6): 6 1,027 (t, J = 6,9 Hz, 3H), 1,628 (m, 2H), 2,136 (s, 6H) , 2,207 (m, 2H), 2,303 (s, 6H), 2,884 (q, 6,9 hz, 2H), 6,939 (s, 2H) og 7,417 (s, 2H).
D. Fremstilling av 9-( 2- N- succinimidyloxycarbonyl)- ethyl)-3, 6- diacetoxy- 2, 7- dimethyl- 9- ethoxy- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 512-NHS)
Til en oppløsning av 9,42 g, 21,3 mmol Ac2EtSF-512 i 175 ml methylenklorid ble det tilsatt 3,62 g, 31,5 mmol N-hydroxysuccinimid, etterfulgt øyeblikkelig av 8,05 g,
42,0 mmol 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid. Oppløsningen ble omrørt ved værelsetemperatur i 2 timer. Blandingen ble vasket med 4 x 100 ml vann og de vandige vaskinger tilbakeekstrahert med 2 x 50 ml methylenklorid. De kombinerte organiske sjikt ble tørket over natriumsulfat og strippet ned til en olje. Absolutt ethanol ble tilsatt, og krystallisering ble igangsatt ved skraping. Produktet ble samlet opp ved filtrering, lufttørket og deretter vakuumtørket, hvorved man fikk lyse orange mikrokrystaller (9,80 g, 85 %).
En analytisk prøve ble fremstilt ved å oppløse 1 g i 10 ml methylenklorid og tilsette 40 ml cyklohexan. Trekullbehandling etterfulgt av avkjøling og skrapeindusert krystallisering gav et fargeløst, krystallinsk fast stoff. Sm.p.: 159°C.
Analyse: beregnet [C(28)H(29)N(l)O(10)] C 62,33, H 5,42, N 2,60. Funnet: C 62,06, H 5,71, N 2,39. NMR (DMSO-d6): 6 1,053 (t, J = 6,9 hz, 3H), 2,149 (s, 6H), 2,304 (s, 6H), 2,1-2,4 (m, 4H), 2,747 (s, 4H), 2,920 (q, J = 6,9 hz, 2H), 6,975 (s, 2H) og 7,464 (s, 2H).
E. Fremstilling av 9-(2-(N-methyl-N-(benzyloxycarbonyl-methyl)-carboxamido)-ethyl)-3,6-diacetoxy-2,7-dimethyl-9-ethoxy- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 512- Sar- OBn
Til en oppløsning av 0,72 g, 4,02 mmol sarcosinbenzylester i 25 ml methylenklorid ble det tilsatt 1,73 g, 3,21 mmol Ac2EtSF-512-NHS og 20 ml 5 % vandig natriumbicarbonat-oppløsning. Tofaseblandingen ble omrørt hurtig i 20 timer. Sjiktene ble separert og det organiske sjikt vasket med 3 x 15 ml vann, tørket over natriumsulfat og oppkonsentrert til 10 ml. Oppløsningen ble fortynnet til 60 ml med cyklohexan, trekullbehandlet og redusert til 25 ml under en strøm av nitrogen, noe som resulterte i utfelling av produktet. Supernatanten ble fradekantert, og det fargeløse faste stoff vakuumtørket (1,44 g, 74 %).
Rekrystallisering fra methylenklorid/cyklohexan med trekullbehandling gav en analytisk prøve. Sm.p.: 150-2°C.
Analyse: beregnet [C(34)H(37)N(1)0(9)] C 67,65, H 6,18, N 2,32. Funnet: C 67,42, H 6,08, N 2,33. NMR (DMSO-dg): (viser 5:2-blanding av amidbundne rotamerer). 6 (stor og liten) 1,049 og 1,008 (t, J = 6,8 hz, 3H), 1,747 og 1,66 (m, 2H), 2,144 og 2,115 (s, 6H), 2,18 (m, 2H), 2,314 og 2,303 (s, 6H), 2,694 (s, 3H), 2,907 og 2,884 (g, J = 6,8 hz, 2H), 3,961 (s, 2H), 5,075 og 5,016 (s, 2H), 6,960 og 6,917 (s, 2H), 7,430 og 7,396 (s, 2H) og 7,30 (m, 5H).
F. Fremstilling av 9-( 2-( N- methyl- N-( N'- succinimidyloxy-carbonylmethyl)- carboxamido)- ethyl)- 3, 6- diacetoxy- 9- ethoxy-2, 4, 5, 7- tetramethyl- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 512- Sar- NHS, struktur 2b)
Til en suspensjon av 0,45 g, 0,745 mol Ac2EtSF-512-Sar-OBn i 20 ml absolutt ethanol ble det tilsatt 10 % palladium-på-carbon (0,05 g). Blandingen ble omrørt under ballongtrykk av hydrogen i 30 min. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og ethanolen strippet bort, hvorved man fikk en sirupaktig rest.
Denne resten ble oppløst i 25 ml methylenklorid, og 0,129 g, 1,12 mmol N-hydroxysuccinimid og 0,292 g, 1,52 mmol 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 30 min. og deretter vasket med 3 x 15 ml vann. Oppløsningen ble tørket over natrium-sulf at, oppkonsentrert til 10 ml, fortynnet til 40 ml med cyklohexan, trekullbehandlet og redusert i volum til 20 ml under en strøm av nitrogen. Supernatanten ble fradekantert og resten utsatt for en andre utfelling fra methylenklorid, hvorved man fikk et fargeløst pulver (0,27 g, 59 %).
Analyse: beregnet [C(31)H(34)N(2)0(11)] C 60,98, H 5,61, N 4,59. Funnet: C 60,28, H 5,71, N 4,40, 1,08 % vann (K-F). NMR (DMSO-dg): (viser en 5:l-blanding av rotamerer rundt amidbindingen). 6 (stor og liten) 1,043 (t, J = 7,0 hz, 3H), 1,793 og 1,933 (m, 2H), 2,145 og 2,133 (s, 6H), 2,198 (m, 2H), 2,314 (s, 6H), 2,740 (s, 4H), 2,778 og 2,821 (s, 3H), 2,900 (q, J = 7,0 hz, 2H), 4,334 og 4,469 (s, 2H), 6,960 og 6,925 (s, 2HO) og 7,441 (s, 2H) .
Eksempel 17
Fremstilling av N- hydroxysuccinimidester 2c
(Et foretrukket reagens for festing av et 519 nm fluorescerende fargestoff til et alkynylaminonukleotid hvor Rg er CH3 og R10 er H)•
A. Fremstilling av 9-( 2- carboxyethyliden)- 3, 6- dihydroxy-4, 5- dimethyl- 9H- xanthen ( SF- 519)
37,2 g, 0,300 mol 2-methylresorcinol og 30,0 g,
0,300 mol ravsyreanhydrid ble plassert i en rundbunnet kolbe og renset med nitrogen. 150 ml methansulfonsyre ble tilsatt, og oppløsningen ble omrørt ved 65°C i 4 timer under en atmosfære av nitrogen. Reaksjonsblandingen ble dråpevis tilsatt til hurtig omrørt, isavkjølt vann (1 1) med samtidig tilsetning av 50 % vandig natriumhydroxyd for å holde pH på 6,0 +/-s- 0,5. Det fint oppdelte faste stoff ble samlet opp ved sentrifugering og skylt med vann (4 x 250 ml), hver gang på nytt oppslemmet, spunnet ned og supernatanten kastet. Det urene produkt ble oppslemmet ill vann, og tilstrekkelig vandig natriumhydroxyd (50 %) ble tilsatt for å øke pH
til 10,2. Oppløsningen ble filtrert og filtratet brakt til pH 1,2 med konsentrert HCl. Produktet ble samlet opp ved sentrifugering og skylt med vann (3 x 350 ml) og aceton (3 x 250 ml) som beskrevet ovenfor. Det resulterende faste stoff ble azeotropbehandlet med toluen, samlet opp ved filtrering og vakuumtørket ved 110°C, hvorved man fikk et murstensrødt pulver (24,6 g, 53 %).
Analyse: beregnet [C(18)H(16)0(5)] C 69,22, H 5,16. Funnet: C 68,95, H 5,30, 0,80 % vann (K-F). NMR (DMSO-d6): (for det meste deltaform): 6 2,164 (s, 3H), 2,177 (s, 3H), 3,376 (d, J = 7,1 hz, 2H), 5,749 (t, J = 7,2 hz, 1H), 6,642 (d, J = 8,8 hz, 1H), 6,672 (d, J = 8,8 hz, 1H), 7,216 (d, J = 8,5 hz, 1H), 7,227 (d, J = 8,5 hz, 1H), 9,602 (bs, 1H) og 9,758 (bs, 1H). Vis. abs. (pH 8,2; 50 mM vandig tris/HCl) maks. 500 nm (69.800)
B. Fremstilling av 9-( 2- carboxyethyl)- 3, 6- diacetoxy- 4, 5-dimethyl- 9- ethoxy- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 519)
15,0 g, 48,0 mmol SF-519 ble tilsatt til 250 ml eddiksyreanhydrid, og det faste stoff ble pulverisert. (Lydbølge-behandling kan brukes til å dispergere sterkt uoppløselig SF-519). Suspensjonen ble isavkjølt, 50 ml pyridin ble tilsatt og blandingen omrørt i 20 min. Oppløsningen ble filtrert og tilsatt i en sakte, men jevn strøm til hurtig omrørt iskaldt vann (4 1). Etter omrøring i ytterligere 20 min. ble mellomproduktet frafiltrert, på nytt oppslemmet i vann (3 1) og omrørt i ytterligere 25 min. Det faste stoff ble samlet opp ved filtrering og lufttørket. Det tørkede mellomprodukt ble oppløst i 600 ml absolutt ethanol og kokt under tilbakeløp i en time. Oppløsningen ble oppkonsentrert på en rotasjonsinndamper til 200 ml, noe som gav krystallisasjon. Produktet ble samlet opp ved filtrering, lufttørket og deretter vakuumtørket, hvorved man fikk farge-løse krystaller (12,13 g, 57 %).
En analytisk prøve ble fremstilt ved utfelling fra methylenkloridoppløsning med cyklohexan. NMR (DMSO-dg): 6 1,033 (t, J = 6,9 hz, 3H), 1,674 (m, 2H), 2,189 (s, 6H), 2,19 (m, 2H), 2,348 (s, 6H), 2,878 (g, J = 6,9 hz, 2H), 7,006 (d, J = 8,6 hz, 2H) og 7,399 (d, J = 8,6 hz, 2H).
C. Fremstilling av 9-( 2-( N- succinimidyloxycarbonyl)- ethyl-3, 6- diacetoxy- 4, 5- dimethyl- 9- ethoxy- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 519-NHS)
7,80 g, 17,6 mmol Ac2EtSF-519 ble blandet med 175 ml methylenklorid, og 2,75 g, 23,9 mmol N-hydroxysuccinimid og 7,00 g, 36,5 mmol 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbo-diimid-hydroklorid ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 90 min. og deretter vasket med vann (5 x 100 ml). De kombinerte vandige sjikt ble tilbakeekstrahert med 2 x 50 ml methylenklorid, og de sammenslåtte organiske sjikt ble tørket over natriumsulfat og strippet ned. Triturering med 100 ml ethanol, etterfulgt av filtrering og lufttørking gav produktet som et lysegult fast stoff (7,45 g, 78 %).
To rekrystalliseringer fra cyklohexan/methylenklorid med trekullbehandling gav en analytisk prøve. Sm.p.: 164-5°C.
Analyse: beregnet [C(28)H(29)N(1)0(10)] C 62,33, H 5,42, N 2,60. Funnet: C 62,17, H 5,47, N 2,48. NMR (DMSO-d6): 6 1,051 (t, J = 7,0 hz, 3H), 2,4-2,1 (m, 4H), 2,191 (s, 6H), 2,337 (s, 6H), 2,715 (s, 4H), 2,912 (g, J = 7,0 hz, 2H), 7,015 (d, J = 8,6 hz, 2H) og 7,429 (d, J = 8,6 hz, 2H).
D. Fremstilling av 9-(2-(N-methyl-N-(benzyloxycarbonyl-methyl)-carboxamido)-ethyl)-3,6-diacetoxy-4,5-dimethyl-9-ethoxy- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 519- Sar- OBn)
Til en oppløsning av 0,557 g, 3,11 mmol sarcosinbenzylester i 19 ml methylenklorid ble det tilsatt 1,30 g, 2,41 mmol Ac2EtSF-519-NHS og 15 ml 5 % vandig natrium-bicarbonatoppløsning. Tofaseblandingen ble omrørt hurtig i 18 timer. Sjiktene ble separert og det organiske sjikt vasket med 3 x 10 ml vann, tørket over natriumsulfat og oppkonsentrert til 10 ml. Oppløsningen ble fortynnet til 40 ml med cyklohexan, trekullbehandlet og redusert til 20 ml under en strøm av nitrogen, noe som resulterte i utfelling av produktet som et klebrig fast stoff. Supernatanten ble fradekantert og resten koinndampet med methylenklorid, hvorved
man fikk et fargeløst skum (0,97 g, 67 %).
Grundig vakuumtørking gav en analytisk prøve. Analyse: beregnet [C(34)H(37)N(1)0(9)] C 67,65, H 6,18, N 2,32. Funnet: C 67,43, H 6,37, N 2,32. NMR (DMSO-d6): (viser 5:2-blanding av amidbundne rotamerer): 6 (stor og liten) 1,044 og 1,020 (t, J = 7,0 hz, 3H), 1,824 og 1,714 (m, 2H), 2,17 (m, 2H), 2,195 og 2,169 (s, 6H) , 2,346 og 2,337 (s, 6H), 2,720 og 2,691 (s, 3H), 2,889 (g, J = 7,0 hz, 2H), 3,959 og 3,988 (s, 2H), 5,073 og 5,048 (s, 2H), 7,000 og 6,954 (d, J = 8,6 hz, 2H) og 7,45-7,25 (m, 7H).
E. Fremstilling av 9-(2-(N-methyl-N-(N'-succinimidyloxy-carbonylmethyl) -carboxamido )-ethyl-3,6-diacetoxy-4,5-di-methyl-9-ethoxy-9H-xanthen (Ac2EtSF-519-Sar-NHS, struktur 2c)
Til en oppløsning av 1,35 g, 2,24 mmol Ac2EtSF-519-Sar-OBn i 50 ml absolutt ethanol ble det tilsatt 10 % palladium-på-carbon (0,13 g). Blandingen ble omrørt under ballongtrykk av hydrogen i 20 min. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og ethanolen strippet bort, hvorved man fikk en sirupaktig rest.
Denne resten ble oppløst i 50 ml methylenklorid, og 0,39 g, 3,39 mmol N-hydroxysuccinimid og 1,57 g, 8,19 mmol 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 75 min. og deretter vasket med 4 x 15 ml vann. Oppløsningen ble tørket over natrium-sulf at, oppkonsentrert til 25 ml, fortynnet til 125 ml med cyklohexan, trekullbehandlet og redusert i volum til 50 ml under en strøm av nitrogen. Supernatanten ble fradekantert og den gjenværende olje tatt opp i 5 ml methylenklorid og tilsatt dråpevis til hurtig omrørt cyklohexan (75 ml), hvorved man fikk et fargeløst pulver (0,587 g, 43 %).
For å tilveiebringe en analytisk prøve, ble en porsjon av produktet tatt opp i methylenklorid, tørket over molekylsikter, inndampet under en nitrogenstrøm og til slutt tørket i en tørkepistol ved 48°C over fosforpentoxyd i 20 timer.
Analyse: beregnet [C(31)H(34)N(2)0(11)] C 60,98, H 5,61, N 4,59. Funnet: C 60,15, H 5,71, N 4,51, vann (K-F) 1,51 %. NMR (DMSO-dg): (viser en 4:l-blanding av amidbundne rotamerer): 5 (stor og liten) 1,039 (t, J = 6,9 hz, 3H), 1,841 og 1,945 (m, 2H), 2,19 (m, 2H), 2,194 (s, 6H), 2,345 (s, 6H), 2,767 og 2,744 (s, 4H), 2,778 og 2,825 (s, 3H), 2,888 (g, J = 6,9 hz, 2H), 4,328 og 4,461 (s, 2H), 7,000 (d, J = 8,6 hz, 2H) og 7,410 (d, J = 8,6 hz, 2H).
Eksempel 18
Fremstilling av N- hydroxysuccinimidester 2d
(Et foretrukket reagens for festing av et 526 nm fluorescerende fargestoff til et alkynylaminonukleotid hvor Rg og R]_q er CH3).
A. Fremstilling av 2, 4- dihydroxy- 3- methylbenzaldehyd
80 ml, 0,86 mol fosforoxyklorid ble tilsatt til en omrørt blanding av 102 ml, 0,82 mol N-methylformanilid i 250 ml ether. Blandingen ble omrørt i en time ved værelsetemperatur og deretter avkjølt på is. 100 g, 0,81 mol 2-methylresorcinol (Aldrich) ble tilsatt, og blandingen fikk varmes opp til værelsetemperatur under omrøring over natten. Det utfelte mellomprodukt ble samlet opp ved filtrering og skylt med ether (3 x). Mellomproduktet ble hydrolysert ved oppløsning i en blanding av 250 ml aceton og 250 ml vann og omrøring i 30 min. 2 1 vann ble tilsatt, blandingen ble brakt til koking, og deretter fikk den avkjøles og avsette' krystallinsk produkt. Dette ble rekrystallisert en andre gang fra 4 1 vann, hvorved man fikk rent produkt (70 g, 57 %). Sm.p. 150°C (Lit. 152-3°C [W. Baker et al., J. Chem. Soc, 2834-5 (1949) 3 ).
NMR (DMSO-d6): 6 1,973 (s, 3H), 6,551 (d, J = 8,5 hz, 1H), 7,428 (d, J = 8,5 hz, 1H), 9,703 (s, 1H), 10,745 (s, 1H) og 11,592 (s, 1H).
B. Fremstilling av 2, 4- dimethylresorcinol
En oppløsning av 30,0 g, 197 mmol 2,4-dihydroxy-3-methylbenzaldehyd i 3 1 isopropanol ble isavkjølt i en 5 1 3-halset kolbe forsynt med en magnetisk rører. 4 ml fosforsyre og 10 % palladium-på-carbon ble tilsatt, og oppløs-ningen ble gjennomboblet med nitrogen og deretter hydrogen. Etter at opptaket var bedømt til å være fullstendig (c.
1,5 time), ble oppløsningen på nytt gjennomboblet med nitrogen og deretter filtrert gjennom Celite®. Oppløsningsmidlet ble strippet av, resten tatt opp i ethylacetat og den resulterende oppløsning vasket med 4 x 100 ml vann. Vaskevannene ble tilbakeekstrahert med ethylacetat og de kombinerte
organiske sjikt tørket over natriumsulfat og strippet ned. Sublimering (95°C, 0,05 torr) gav et fargeløst fast stoff (19,6 g, 72 %). Sm.p.: 107-8°C (Lit. 108-9°C [W. Baker et al., J. Chem. Soc, 2834-5 (1949)]).
NMR (DMSO-d6): 6 1,969 (s, 3H), 2,037 (s, 3H), 6,220 (d, J = 8,1 hz, 1H), 6,637 (d, J = 8,1 hz, 1H), 7,929 (s, 1H) og 8,785 (s, 1H).
C. Fremstilling av 9-( 2- carboxyethyliden)- 3, 6- dihydroxy-2, 4, 5, 7- tetramethyl- 9H- xanthen ( SF- 526)
28,4 g, 0,205 mol 2,4-dimethylresorcinol og 20,0 g, 0,200 mol ravsyreanhydrid ble plassert i en rundbunnet kolbe og renset med nitrogen. 231 ml methansulfonsyre ble tilsatt, og oppløsningen ble omrørt ved 70°C i 20 timer under en nitrogenatmosfære. Reaksjonsblandingen ble tilsatt dråpevis til en hurtig omrørt blanding av vandig natriumhydroxyd (95 g i 150 mi vann) og 3 1 is. Tilstrekkelig methansulfonsyre ble tilsatt til å bringe slutt-pH fra 4,7 til 1,5. Det resulterende faste stoff ble samlet opp ved sentrifugering og vasket ved oppslemming, spunnet ned og dekantert fra vann (5 x 1,2 1). Sluttsuspensjonen ble samlet opp ved filtrering, lufttørket og deretter ovnstørket ved 110°C i 6 timer, hvorved man fikk et murstensrødt fast stoff (30,6 g, 44 %).
En andre utfelling fra alkalisk oppløsning etterfulgt av sentrifugering og vannvaskinger gav en analytisk prøve.
Analyse: beregnet [C(16)H(12)0(5)] C 70,57, H 5,92. Funnet: C 70,39, H 6,00, 0,21 % vann (K-F). NMR (DMSO-d6): (for det meste spirolaktonform): 6 2,172 (s, 12H), 2,508 (m, 2H), 3,342 (m, 2H) og 7,604 (s, 2H). Vis. abs. (pH 8,2;
50 mM vandig tris/HCl): 509 nm (71.300).
D. Fremstilling av 9-( 2- carboxyethyl)- 3, 6- diacetoxy- 9-ethoxy- 2, 4, 5, 7- tetramethyl- 9H- xanthen ( Ac2EtSF- 526)
25,2 g, 74 mmol SF-526 ble tilsatt til iskald eddiksyreanhydrid (450 ml), etterfulgt av 100 ml pyridin, og
blandingen ble omrørt med isavkjøling i 150 min. Reaksjonsblandingen ble filtrert og deretter tilsatt i en sakte, jevn strøm til hurtig omrørt, isavkjølt vann (7 1). Etter omrør-ing i ytterligere 30 min. ble mellomproduktet frafiltrert,
vasket med vann, på nytt oppslemmet i 4 1 vann og omrørt i ytterligere 30 min. Det faste stoff ble samlet opp ved filtrering og lufttørket, hvorved man fikk spirolaktonmellomproduktet (28,9 g). En porsjon av dette mellomprodukt (18,6 g) ble oppløst ill absolutt ethanol og kokt under tilbakeløp i 90 min. Oppløsningen ble oppkonsentrert på en rotasjonsinndamper til 300 ml, hvilket gav utkrystallisering. Produktet ble samlet opp ved filtrering, skylt med ethanol, lufttørket og deretter vakuumtørket, hvorved man fikk fargeløse mikrokrystaller (11,6 g, 52 %, basert på anvendt mengde mellomprodukt).
Rekrystallisering fra methylenklorid/cyklohexan med trekullbehandling gav fargeløse mikrokrystaller. Sm.p.: 154-155°C. To inndampinger fra methylenklorid fjernet spor av cyklohexan for analyse.
Analyse: beregnet [C(20)H(20)O(5)] C 70,57, H 5,92. Funnet: C 70,39, H 6,00, 0,21 % vann (K-F). NMR (DMSO-d6): (for det meste spirolaktonform): 6 2,172 (s, 12H), 2,508 (m, 2H), 3,342 (m, 2H) og 7,604 (s, 2H). Vis. abs. (pH 8,2;
50 mM vandig tris/HCl): 509 nm (71.300).
E. Fremstilling av 9-(2-(N-succinimidyloxycarbonyl)-ethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy-2,4,5,7-tetramethyl-9H-xanthen
( Ac2EtSF- 526- NHS)
4,70 g, 9,99 mmol Ac2EtSF-526 ble blandet med 75 ml methylenklorid, og 3,10 g, 16,2 mmol 1-(3-dimethylamino-propyl) -3-ethylcarbodiimid-hydroklorid og 1,50 g, 13,0 mmol N-hydroxysuccinimid ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i
90 min. og deretter vasket med 4 x 50 ml vann. De kombinerte vannsjikt ble tilbakeekstrahert med 50 ml methylenklorid, og de sammenslåtte organiske sjikt ble tørket over natriumsulfat og strippet ned. Triturering med 75 ml ethanol, etterfulgt av filtrering og lufttørking gav det urene produkt som et lysegult fast stoff (c. 4,7 g). Dette materiale ble oppløst i 50 ml methylenklorid, og 50 ml cyklohexan ble tilsatt. En teskje trekull ble tilsatt, blandingen ble filtrert, og produktet ble brakt ned med ytterligere 25 ml cyklohexan. Oppsamling ved filtrering, lufttørking og vakuumtørking gav fargeløse krystaller (3,14 g, 55 %).
En andre utfelling fra methylenklorid med cyklohexan gav en analytisk prøve.
Analyse: beregnet [C(30)H(33)N(1)0(10)] C 63,48, H 5,86, N 2,47. Funnet: C 63,08, H 6,00, N 2,37. NMR (DMSO-d6): 5 1,058 (t, J = 6,9 hz, 3H), 2,136 (s, 6H), 2,155 (s, 6H), 2,228 (m, 4H), 2,371 (s, 6H) , 2,748 (s, 4H), 2,918 (g, J = 6,9 hz, 2H) og 7,300 (s, 2H) .
F. Fremstilling av 9-(2-(N-methyl-N-(benzyloxycarbonyl-methyl)-carboxamido)-ethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy-9H-xanthen ( Ac2EtSF- 505- Sar- OBn)
Til en oppløsning av 0,72 g, 4,02 mmol sarcosinbenzylester i 40 ml methylenklorid ble det tilsatt 1,82 g, 3,21 mmol Ac2EtSF-526-NHS og 30 ml 5 % vandig natriumbicarbonat-oppløsning. Tofaseblandingen ble omrørt hurtig i 20 timer. Sjiktene ble separert og det organiske sjikt vasket med 4 x 15 ml vann, tørket over natriumsulfat og oppkonsentrert til 15 ml. Oppløsningen ble fortynnet til 110 ml med cyklohexan, trekullbehandlet og redusert til 50 ml under en nitrogenstrøm, hvilket gav utfelling av produktet. Filtrering etterfulgt av lutfttørking gav et fargeløst fast stoff (0,96 g, 47 %).
Koinndamping med methylenklorid etterfulgt av grundig vakuumtørking gav en analytisk prøve.
Analyse: beregnet [C(36)H(41)N(1)0(9)] C 68,45, H 6,54, N 2,22. Funnet: C 68,29, H 6,70, N 2,07. NMR (DMSO-dg): (viser 5:2-blanding av amidbundne rotamerer): 6 (stor og liten) 1,049 og 1,027 (t, J = 6,8 hz, 3H), 1,783 og 1,700 (m, 2H), 2,129 og 2,099 (s, 6H) , 2,159 og 2,129 (s, 6H), 2,14 (m, 2H), 2,379 og 2,371 (s, 6H), 2,699 og 2,690 (s, 3H), 2,873 (q, J = 6,8 hz, 2H), 3,958 og 3,976 (s, 2H), 5,075 og 5,019 (s, 2H), 7,266 og 7,233 (s, 2H) og 7,25-7,40 (m, 5H).
G. Fremstilling av 9-(2-(N-methyl-N-(N'-succinimidyloxy-carbonylmethyl)-carboxamido)-ethyl)-3,6-diacetoxy-9-ethoxy-2,4,5,7-tetramethyl-9H-xanthen (Ac2EtSF-526-Sar-NHS, struktur 2d)
Til en oppløsning av 0,96 g, 1,52 mmol Ac2EtSF-526-Sar-OBn i 40 ml absolutt ethanol ble det tilsatt 0,10 g 10 % palladium-på-carbon. Blandingen ble omrørt under ballongtrykk av hydrogen i 30 min. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og ethanolen strippet av, hvorved man fikk en sirupaktig rest.
Denne rest ble oppløst i 40 ml methylenklorid, og 0,26 g, 2,26 mmol N-hydroxysuccinimid og 0,59 g, 3,08 mmol 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-hydroklorid ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 30 min. og deretter vasket med 4 x 15 ml vann. Oppløsningen ble tørket over natrium-sulf at, oppkonsentrert til 15 ml, fortynnet til 100 ml med cyklohexan, trekullbehandlet og redusert i volum til 50 ml under en nitrogenstrøm. Produktet ble samlet opp ved filtrering, lufttørket og vakuumtørket, hvorved man fikk fargeløse mikrokrystaller (0,573 g, 59 %).
Koinndamping med methylenklorid etterfulgt av grundig vakuumtørking ved 40°C fjernet spor av cyklohexan og gav en analytisk prøve som et amorft fast stoff.
NMR (DMSO-d6): 6 1,043 (t, J = 6,7 hz, 3H), 1,82 (m, 2H), 2,130 (s, 6H), 2,157 (s, 6H), 2,15 (m, 2H), 2,378 (s, 6H), 2,748 (s, 4H), 2,778 (s, 3H), 2,891 (g, J = 6,7 hz, 2H), 4,327 (s, 2H) og 7,275 (s, 2H).
Eksempel 19
Generell fremgangsmåte for kobling av alkynylaminonukleotider til N-hydroxysuccinimidestere 2. Fremstilling av fluorescensmerkede kjedeterminerende alkynylaminonukleotider 5 34- 37 10 mikromol alkynylaminonukleotidtrifosfat 49 (fra eksempel 3J) ble tatt opp i 0,050 ml vann og fortynnet med 0,100 ml dimethylformamid. En oppløsning av 12,3 mg, 21 mikromol, 2,1 ekv. N-hydroxysuccinimidester 2a (fra eksempel 15E) i 0,100 ml dimethylformamid ble tilsatt, og blandingen ble omrørt ved 50°C i 4 timer. 0,25 ml konsentrert ammoniumhydroxyd ble tilsatt, reaksjonsbeholderen ble tett lukket, og oppvarming ved,50°C ble fortsatt i 25 min. Den resulterende røde oppløsning ble fortynnet til 10 ml med vann og tilført en kolonne av DEAE-Sephadex A-25-120 (1 x 19 cm lag) som var blitt ekvilibrert med 1,0 M pH 7,6 vandig TEAB
(50 ml) og deretter 0,2 M pH 7,6 vandig TEAB (50 ml). Kolonnen ble eluert med en lineær gradient av pH 7,6 vandig TEAB fra 0,4 M (150 ml) til 0,7 M (150 ml). Kolonnen ble kjørt ved 100 ml/time, og det ble samlet opp fraksjoner hvert 3. minutt. Eluenten ble overvåket ved hjelp av absorbans ved 498 nm (40 AUFS). To mindre biproduktbånd eluerte først, etterfulgt av det sterkeste produktbånd med grunn-linjeoppløsning. De fraksjoner som ble beregnet å inneholde rent produkt, ble slått sammen, strippet ned (T < 30°C), koinndampet tre ganger med absolutt ethanol og tatt opp i 0,74 ml vann. Oppløsningen ble analysert ved hjelp av synlig absorpsjon (pH 8,2 50 mM vandig tris-buffer) og lyofilisert. En fortynnet oppløsning av produktet gav et absorpsjonsmaksimum ved 487,5 nm. Hvis man forutsetter en absorpsjonskoeffisient for produktet som er lik med absorp-sjonskoef f isienten for det frie fargestoff (72.600), var utbyttet av merket alkynylaminonukleotid 37 4,2 mikromol (42 %).
Fremgangsmåten ovenfor gav fluorescensmerket kjedeterminator 37 hvor Het er en 7-deazaguanin (k). Merkede kjedeterminatorer 34 [Het er uracil (H)], 35, [cytosin (i)] og 36 [7-deazaadenosin (j)] ble fremstilt ved å følge lignende fremgangsmåter ved å koble alkynylaminonukleotid-trifosfater 46, 42 og 51 til N-hydroxysuccinimider hhv. 2d, 2c og 2b. Andre fluorescensmerkede nukleotidtrifosfater ble også fremstilt ved hjelp av de samme fremgangsmåter.

Claims (8)

1. Alkynylaminonukleotid, karakterisert ved at det har formelen hvor Rx er en alkylenrest med 1-20 atomer, R2 og R3 er H eller q-C^-alkyl, eller trifluoracetyl som en beskyttelsesgruppe, og Nuc er R4-Het med formelen Z er H eller NH2, og R4 er hvor R5 er H, P03H2, P206H3, P309H4 eller salter derav, og (i) når R7 = R8 = H, så er R6 = H eller OH, eller (ii) når R, -- H og R, = OH, så er R6 = H eller OH, eller (iii) når R7 = OH og Re = H, så er R6 = OH.
2. Alkynylaminonukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at Rj er rettkjedet C^ C^-alkylenrest.
3. Alkynylaminonukleotid ifølge krav 1, karakterisert ved at Rx er -CH2-.
4. Merket alkynylaminonukleotid, karakterisert ved at det har formelen hvor Rx er en alkylenrest med 1-20 atomer, R2 er H eller C^-C^-alkyl, eller trifluoracetyl som en beskyttelsesgruppe, og Nuc er R4-Het med formel Z er H eller NH2, og R4 er hvor R5 er H, P03H2, P205H3, P309H4 eller salter derav, og (i) når R7 = Re = H, så er R6= H eller OH, eller (ii) når R7 = H og R8 = OH, så er R6 = H eller OH, eller (iii) når R7 = OH og R8 = H, så er R6 = OH, og R3 er en rapportørgruppe.
5. Merket alkynylaminonukleotid ifølge krav 4, karakterisert ved at R3 er en fluorescerende gruppe med formel 1 eller 2 hvor R9 og R10 er H, laverealkyl, laverealkoxy, halogen eller cyano.
6. Fremgangsmåte for fremstilling av 7-(3-amino-l-propynyl )-2',3'-dideoxyguanosin-5'-trifosfat, karakterisert ved at: (A) 6-methoxy-2-methylthio-7-deazapurin bringes i kontakt med l-klor-2-deoxy-3,5-di-O-p-toluoyl-a-D-ribofuranose i nærvær av natriumhydrid, (B) esterproduktet fra trinn (A) med formel 9 hydrolyseres under basiske betingelser til diolen med formel 10 (C) 5-OH-stillingen i diol 10 beskyttes med en tritylgruppe, (D) 3-OH-gruppen fjernes ved å redusere et mellom-produktthionocarbonat med et tinnhydrid som reduksjonsmiddel, (E) dideoxydeazapurinet med formel 12 som fås i trinn (D) behandles med N-jodsuccinimid slik at 7-jodderivatet med formel 13 dannes (F) forbindelse med formel 13 bringes i kontakt med natriumthiocresolat i hexamethylfosforamid, hvorved 7-deazapurin-6-onet med formel 14 fås (G) forbindelsen med formel 14 behandles suksessivt med metaklorperoxybenzosyre og ammoniakk, hvorved 7-deaza-guanosinet med formel 15 fås (H) N-propargyltrifluoracetamid kobles til den av- beskyttede 7-jodforbindelse med formel 16 hvorved 7-(3-trifluoracetamido-l-propynyl)-2',3'-dideoxy-7-deazaguanosin fås, og (I) produktet fra trinn (H) omdannes til 5'-trifos-fatet, etterfulgt av fjerning av beskyttelsesgrupper.
7. Fremgangsmåte for fremstilling av alkynylaminonukleotider med formel hvor Rx er en alkylenrest med 1-20 atomer, R2 og R3 er H eller C^-C^-alkyl, eller trifluoracetyl som en beskyttelsesgruppe, og Nuc er R4-Het med formelen Z er H eller NH2, og R4 er hvor R5 er H, P03H2, P206H3, P3OgH4 eller salter derav, og (i) når R7 = R8 = H, så er R6 = H eller OH, eller (ii) når R7 = H og R8 = OH, så er R6 = H eller OH, eller (iii) når R7 = OH og R8= H, så er R6 = OH, ved kobling av tilsvarende jodnukleotider med et jodatom bundet til et carbonatom i den heterosykliske base, til tilsvarende terminale alkynylaminer under anvendelse av palladium(O)/kobber(I)- eller palladium(II)/kobber(I)-katalyse, karakterisert ved at det anvendes en tetra kis-(trifenylfosfin)-palladium(0)/kobber(I)jodid-katalysator
8. 7-jodnukleotider, karakterisert ved at de har formelen Z er H eller NH2, og R4 er hvor R5 er H, P03H2, P206H3, P309H4 eller salter derav, og (i) når R7 = R8 = H, så er R6 = H eller OH, eller (ii) når R7 = H og R8 = OH, så er R6 = H eller OH, eller (iii) når R7 = OH og R8 = H, så er R6 = OH.
NO872757A 1986-07-02 1987-07-01 Alkynylaminonukleotider, fremgangsmaate for fremstilling derav, 7-jodnukleotider, merkede alkynyl-aminonukleotider samt fremgangsmaate for fremstilling av 7-(3-amino-1-propynyl)-2',3'-dideoxyguanosin-5'-trifosfat NO171981C (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US88137286A 1986-07-02 1986-07-02
US07/057,565 US5047519A (en) 1986-07-02 1987-06-12 Alkynylamino-nucleotides

Publications (4)

Publication Number Publication Date
NO872757D0 NO872757D0 (no) 1987-07-01
NO872757L NO872757L (no) 1988-01-04
NO171981B true NO171981B (no) 1993-02-15
NO171981C NO171981C (no) 1993-05-26

Family

ID=26736630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO872757A NO171981C (no) 1986-07-02 1987-07-01 Alkynylaminonukleotider, fremgangsmaate for fremstilling derav, 7-jodnukleotider, merkede alkynyl-aminonukleotider samt fremgangsmaate for fremstilling av 7-(3-amino-1-propynyl)-2',3'-dideoxyguanosin-5'-trifosfat

Country Status (13)

Country Link
US (1) US5047519A (no)
EP (1) EP0251786B1 (no)
JP (1) JPH085908B2 (no)
KR (1) KR960001528B1 (no)
AT (1) ATE114651T1 (no)
CA (1) CA1340022C (no)
DE (1) DE3750792T2 (no)
DK (3) DK337587A (no)
ES (1) ES2066760T3 (no)
GR (1) GR3015197T3 (no)
IE (1) IE68058B1 (no)
NO (1) NO171981C (no)
PT (1) PT85237B (no)

Families Citing this family (237)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2990920A (en) * 1958-01-21 1961-07-04 Republic Steel Corp Structural building elements
US3003600A (en) * 1958-04-10 1961-10-10 James A Mackenzie Constructional element
US3355848A (en) * 1964-12-30 1967-12-05 Logan Co Adjustable partitions
US6004446A (en) * 1984-03-29 1999-12-21 Li-Cor, Inc. DNA Sequencing
US5863403A (en) * 1984-03-29 1999-01-26 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Digital DNA typing
US6207421B1 (en) 1984-03-29 2001-03-27 Li-Cor, Inc. DNA sequencing and DNA terminators
US5360523A (en) * 1984-03-29 1994-11-01 Li-Cor, Inc. DNA sequencing
US5571388A (en) * 1984-03-29 1996-11-05 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescense labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels thereof
US4729947A (en) * 1984-03-29 1988-03-08 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska DNA sequencing
US6086737A (en) * 1984-03-29 2000-07-11 Li-Cor, Inc. Sequencing near infrared and infrared fluorescence labeled DNA for detecting using laser diodes and suitable labels therefor
US5047519A (en) * 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US5242796A (en) * 1986-07-02 1993-09-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method, system and reagents for DNA sequencing
US5151507A (en) * 1986-07-02 1992-09-29 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
US6211158B1 (en) 1987-04-10 2001-04-03 Roche Diagnostics Gmbh Desazapurine-nucleotide derivatives, processes for the preparation thereof, pharmaceutical compositions containing them and the use thereof for nucleic acid sequencing and as antiviral agents
DE3739366A1 (de) * 1987-04-10 1988-10-27 Boehringer Mannheim Gmbh Desaza-purin-nucleosid-derivate, verfahren zu deren herstellung sowie deren verwendung bei der nucleinsaeure-sequenzierung sowie als antivirale mittel
ATE113059T1 (de) * 1987-06-24 1994-11-15 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.
DE3807975C2 (de) * 1988-03-10 2002-03-07 Karl Otto Greulich Verfahren zur optischen Charakterisierung von Nukleinsäuren und Oligonukleotiden
JPH0217199A (ja) * 1988-07-05 1990-01-22 Japan Tobacco Inc ２’−デオキシ−β−アデノシンの製造方法
US5708154A (en) * 1989-02-24 1998-01-13 City Of Hope RNA-DNA hybrid molecules of nucleic acid
US5292873A (en) * 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5432272A (en) * 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
DE4102289A1 (de) * 1991-01-26 1992-07-30 Bayer Ag Verfahren zur herstellung von (hetero)arylalk(en/in)-ylaminen und neue (hetero)arylkinylamine
US5221611A (en) * 1991-06-19 1993-06-22 Sigma Chemical Company Ddi immunoassays, derivatives, conjugates and antibodies
US5371241A (en) * 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5594121A (en) * 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
TW393513B (en) * 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5254687A (en) 1991-12-04 1993-10-19 The Trustees Of Princeton University Process for the preparation of pyrrolo[2,3-d]pyrimidines
US5658751A (en) * 1993-04-13 1997-08-19 Molecular Probes, Inc. Substituted unsymmetrical cyanine dyes with selected permeability
EP0695306A1 (en) * 1993-04-19 1996-02-07 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5428149A (en) * 1993-06-14 1995-06-27 Washington State University Research Foundation Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products
US5580972A (en) * 1993-06-14 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Purine nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
US5719273A (en) * 1993-06-14 1998-02-17 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Palladium catalyzed nucleoside modifications methods using nucleophiles and carbon monoxide
DE4326466A1 (de) * 1993-08-06 1995-02-09 Boehringer Mannheim Gmbh Infrarot-Farbstoff-markierte Nucleotide und ihre Verwendung in der Nucleinsäure-Detektion
US6150510A (en) 1995-11-06 2000-11-21 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Modified oligonucleotides, their preparation and their use
DE4438918A1 (de) 1994-11-04 1996-05-09 Hoechst Ag Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
US5808043A (en) * 1995-01-18 1998-09-15 Pharmacia Biotech Inc. Composition for stabilization of labelled nucleoside triphosphates and methods for using same
US5576197A (en) * 1995-04-07 1996-11-19 Molecular Bio-Products Polymerase chain reaction container and methods of using the same
US5798276A (en) * 1995-06-07 1998-08-25 Molecular Probes, Inc. Reactive derivatives of sulforhodamine 101 with enhanced hydrolytic stability
US6004536A (en) * 1995-11-14 1999-12-21 Molecular Probes, Inc. Lipophilic cyanine dyes with enchanced aqueous solubilty
US5700921A (en) * 1995-11-27 1997-12-23 Vector Laboratories Labeling nucleic acids
US6027890A (en) * 1996-01-23 2000-02-22 Rapigene, Inc. Methods and compositions for enhancing sensitivity in the analysis of biological-based assays
US6613508B1 (en) 1996-01-23 2003-09-02 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid molecules utilizing sizing techniques
US6312893B1 (en) 1996-01-23 2001-11-06 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
US5959100A (en) 1996-03-27 1999-09-28 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Pyrimidine nucleosides as therapeutic and diagnostic agents
US6020481A (en) * 1996-04-01 2000-02-01 The Perkin-Elmer Corporation Asymmetric benzoxanthene dyes
US6162931A (en) * 1996-04-12 2000-12-19 Molecular Probes, Inc. Fluorinated xanthene derivatives
US5945527A (en) * 1996-05-30 1999-08-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Palladium catalyzed nucleoside modification methods using nucleophiles and carbon monoxide
US5846737A (en) * 1996-07-26 1998-12-08 Molecular Probes, Inc. Conjugates of sulforhodamine fluorophores with enhanced fluorescence
US5821356A (en) * 1996-08-12 1998-10-13 The Perkin Elmer Corporation Propargylethoxyamino nucleotides
US5696157A (en) * 1996-11-15 1997-12-09 Molecular Probes, Inc. Sulfonated derivatives of 7-aminocoumarin
US6027709A (en) * 1997-01-10 2000-02-22 Li-Cor Inc. Fluorescent cyanine dyes
CA2281205A1 (en) 1997-02-12 1998-08-13 Eugene Y. Chan Methods and products for analyzing polymers
JP3435416B2 (ja) 1997-03-12 2003-08-11 ピーイー コーポレイション（エヌワイ） 改善された標識ヌクレオチド取込み特性を有するｄｎａポリメラーゼ
GB2323357B (en) * 1997-03-20 1999-09-29 Amersham Pharm Biotech Inc Derivatives of 7-deaza-2-deoxy-guanosine-5'-triphosphate, preparation and use thereof
US5770716A (en) * 1997-04-10 1998-06-23 The Perkin-Elmer Corporation Substituted propargylethoxyamido nucleosides, oligonucleotides and methods for using same
GB9708611D0 (en) * 1997-04-28 1997-06-18 Univ Cardiff Chemical compounds
JP3489991B2 (ja) * 1997-07-07 2004-01-26 理化学研究所 ３’−デオキシリボヌクレオチド誘導体
US6130101A (en) * 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
US5948648A (en) * 1998-05-29 1999-09-07 Khan; Shaheer H. Nucleotide compounds including a rigid linker
US6096875A (en) 1998-05-29 2000-08-01 The Perlein-Elmer Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6653462B2 (en) 1998-05-29 2003-11-25 Applera Corporation Nucleotide compounds including a rigid linker
US6117986A (en) * 1998-06-10 2000-09-12 Intergen Company, L.P. Pyrimidines linked to a quencher
US6110630A (en) * 1998-06-18 2000-08-29 Beckman Coulter, Inc. Efficient activated cyanine dyes
US6743605B1 (en) * 1998-06-24 2004-06-01 Enzo Life Sciences, Inc. Linear amplification of specific nucleic acid sequences
US8445664B2 (en) * 1998-06-24 2013-05-21 Enzo Diagnostics, Inc. Kits for amplifying and detecting nucleic acid sequences
US6716394B2 (en) 1998-08-11 2004-04-06 Caliper Technologies Corp. DNA sequencing using multiple fluorescent labels being distinguishable by their decay times
US6447724B1 (en) 1998-08-11 2002-09-10 Caliper Technologies Corp. DNA sequencing using multiple fluorescent labels being distinguishable by their decay times
US6288221B1 (en) 1998-08-20 2001-09-11 Duke University Methods of synthesis of halogen base-modified oligonucleotides and subsequent labeling with a metal-catalyzed reaction
US6020483A (en) 1998-09-25 2000-02-01 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleoside modifications by palladium catalyzed methods
JP4638043B2 (ja) 1998-12-14 2011-02-23 パシフィック バイオサイエンシーズ オブ カリフォルニア， インコーポレイテッド ポリメラーゼ合成による、単一分子の核酸の配列決定のためのシステムおよび方法
AU768957B2 (en) * 1999-02-18 2004-01-08 Regents Of The University Of California, The Phthalamide-lanthanide complexes for use as luminescent markers
EP1090073B1 (en) 1999-04-23 2003-03-05 Molecular Probes Inc. Xanthene dyes and their application as luminescence quenching compounds
US6664047B1 (en) 1999-04-30 2003-12-16 Molecular Probes, Inc. Aza-benzazolium containing cyanine dyes
US6750357B1 (en) 1999-06-25 2004-06-15 Syngen, Inc. Rhodamine-based fluorophores useful as labeling reagents
US6982146B1 (en) * 1999-08-30 2006-01-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services High speed parallel molecular nucleic acid sequencing
WO2001023411A2 (en) * 1999-09-30 2001-04-05 New England Biolabs, Inc. Incorporation of modified nucleotides by archaeon dna polymerases and related methods
US6221604B1 (en) 2000-02-07 2001-04-24 Pe Corporation Electron-deficient nitrogen heterocycle-substituted fluorescein dyes
US6686461B1 (en) * 2000-03-22 2004-02-03 Solulink Bioscience, Inc. Triphosphate oligonucleotide modification reagents and uses thereof
US7019129B1 (en) 2000-05-09 2006-03-28 Biosearch Technologies, Inc. Dark quenchers for donor-acceptor energy transfer
US6936702B2 (en) 2000-06-07 2005-08-30 Li-Cor, Inc. Charge-switch nucleotides
EP2226330B1 (en) 2000-06-07 2013-09-18 Pacific Biosciences of California, Inc. Charge-switch nucleotides
US6869764B2 (en) 2000-06-07 2005-03-22 L--Cor, Inc. Nucleic acid sequencing using charge-switch nucleotides
AU7918501A (en) 2000-08-04 2002-02-18 Molecular Probes Inc Derivatives of 1,2-dihydro-7-hydroxyquinolines containing fused rings
US7169922B2 (en) * 2000-08-04 2007-01-30 Invitrogen Corporation Derivatives of 1,2-dihydro-7-hydroxyquinolines containing fused rings
WO2002026891A1 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Molecular Probes, Inc. Modified carbocyanine dyes and their conjugates
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
US6664079B2 (en) 2000-10-06 2003-12-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
WO2002030944A2 (en) * 2000-10-11 2002-04-18 Applera Corporation Fluorescent nucleobase conjugates having anionic linkers
AU2002227156A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Visigen Biotechnologies, Inc. Enzymatic nucleic acid synthesis: compositions and methods for altering monomer incorporation fidelity
US20020136772A1 (en) * 2001-03-26 2002-09-26 Tai-Nang Huang Polymer synthesis
US20040013573A1 (en) * 2001-03-26 2004-01-22 Tai-Nang Huang Polymer synthesis apparatus
EP1377683A4 (en) * 2001-04-11 2004-09-08 Us Gov Health & Human Serv MODIFIED RANDOM SPRAYERS FOR PROBE MARKING
US20030170675A1 (en) * 2001-04-11 2003-09-11 The Gov't Of The U.S Of America As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Serv. Methods of manipulating nucleic acids
US7118907B2 (en) * 2001-06-06 2006-10-10 Li-Cor, Inc. Single molecule detection systems and methods
WO2002102820A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
US20060234231A1 (en) * 2001-06-20 2006-10-19 Nuevolution A/S Microarrays displaying encoded molecules
US9261460B2 (en) * 2002-03-12 2016-02-16 Enzo Life Sciences, Inc. Real-time nucleic acid detection processes and compositions
US20050032060A1 (en) * 2001-08-31 2005-02-10 Shishir Shah Arrays comprising pre-labeled biological molecules and methods for making and using these arrays
US20050042629A1 (en) 2002-09-13 2005-02-24 Applera Corporation Thermus scotoductus nucleic acid polymerases
WO2003091426A1 (en) 2001-10-12 2003-11-06 Spectral Genomics, Inc. Compilations of nucleic acids and arrays and methods of using them
US7439346B2 (en) 2001-10-12 2008-10-21 Perkinelmer Las Inc. Nucleic acids arrays and methods of use therefor
AU2002346498A1 (en) 2001-11-30 2003-06-17 Applera Corporation Thermus brockianus nucleic acid polymerases
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
DE20200926U1 (de) * 2002-01-23 2002-04-18 Hegenscheidt-MFD GmbH & Co. KG, 41812 Erkelenz Festwalzgerät einer Festwalzmaschine für Kurbelwellen
US9353405B2 (en) 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
US7166478B2 (en) * 2002-03-12 2007-01-23 Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses
ATE414769T1 (de) 2002-03-15 2008-12-15 Nuevolution As Eine verbesserte methode zur synthese von matritzenabhängigen molekülen
EP1487849A2 (en) * 2002-03-15 2004-12-22 Nuevolution A/S A building block capable of transferring a functional entity
US6916621B2 (en) 2002-03-27 2005-07-12 Spectral Genomics, Inc. Methods for array-based comparitive binding assays
AU2003230832A1 (en) * 2002-04-22 2003-11-03 Joseph F. Lawler Jr. Reagents for monitoring nuclei acid amplification and methods of using same
AU2003247266A1 (en) * 2002-08-01 2004-02-23 Nuevolution A/S Multi-step synthesis of templated molecules
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
US11008359B2 (en) 2002-08-23 2021-05-18 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
DK3363809T3 (da) 2002-08-23 2020-05-04 Illumina Cambridge Ltd Modificerede nukleotider til polynukleotidsekvensering
WO2004025259A2 (en) 2002-09-12 2004-03-25 Molecular Probes, Inc. Site-specific labeling of affinity tags in fusion proteins
AU2003266932B2 (en) * 2002-09-27 2009-04-09 Mpm-Holding Aps Spatially encoded polymer matrix
ES2640279T3 (es) 2002-10-30 2017-11-02 Nuevolution A/S Procedimiento para la síntesis de un complejo bifuncional
EP1756277B1 (en) 2002-12-19 2009-12-02 Nuevolution A/S Quasirandom structure and function guided synthesis methods
US20070026397A1 (en) 2003-02-21 2007-02-01 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
WO2004092327A2 (en) * 2003-04-11 2004-10-28 Applera Corporation Method of generating size standard nucleic acids
US20070048761A1 (en) * 2005-05-20 2007-03-01 Applied Dna Sciences, Inc. System and method for authenticating multiple components associated with a particular product
US20100285985A1 (en) * 2003-04-15 2010-11-11 Applied Dna Sciences, Inc. Methods and Systems for the Generation of Plurality of Security Markers and the Detection Therof
US8372648B2 (en) 2003-04-16 2013-02-12 APDN (B.V.I.), Inc. Optical reporter compositions
US20090286250A1 (en) * 2006-05-19 2009-11-19 James Arthur Hayward Incorporating soluble security markers into cyanoacrylate solutions
US8415165B2 (en) * 2003-04-16 2013-04-09 APDN (B.V.I.), Inc. System and method for authenticating sports identification goods
US8420400B2 (en) * 2003-04-16 2013-04-16 APDN (B.V.I.), Inc. System and method for authenticating tablets
US8124333B2 (en) * 2003-04-16 2012-02-28 APDN, Inc. Methods for covalent linking of optical reporters
US8426216B2 (en) * 2003-04-16 2013-04-23 APDN (B.V.I.), Inc. Methods for authenticating articles with optical reporters
US8415164B2 (en) * 2003-04-16 2013-04-09 Apdn (B.V.I.) Inc. System and method for secure document printing and detection
US20050250214A1 (en) * 2004-05-05 2005-11-10 Gee Kyle R Zinc binding compounds and their method of use
US7619059B2 (en) 2003-07-29 2009-11-17 Life Technologies Corporation Bimolecular optical probes
US7727752B2 (en) 2003-07-29 2010-06-01 Life Technologies Corporation Kinase and phosphatase assays
CA2445420A1 (en) 2003-07-29 2005-01-29 Invitrogen Corporation Kinase and phosphatase assays
US20050074796A1 (en) * 2003-07-31 2005-04-07 Stephen Yue Unsymmetrical cyanine dimer compounds and their application
US7271265B2 (en) 2003-08-11 2007-09-18 Invitrogen Corporation Cyanine compounds and their application as quenching compounds
ITPZ20030002A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Giuseppe Caputo Composti del tipo cianina aventi un braccio di legame alchinilico
EP1670939B1 (en) * 2003-09-18 2009-11-04 Nuevolution A/S A method for obtaining structural information concerning an encoded molecule and method for selecting compounds
US20070212689A1 (en) * 2003-10-30 2007-09-13 Bianchi Diana W Prenatal Diagnosis Using Cell-Free Fetal DNA in Amniotic Fluid
US7432372B2 (en) * 2003-10-31 2008-10-07 Invitrogen Corporation Fluorinated resorufin compounds and their application
WO2005044836A2 (de) 2003-11-05 2005-05-19 Genovoxx Gmbh Makromolekulare nukleotidverbindungen und methoden zu deren anwendung
US20050214807A1 (en) * 2003-11-19 2005-09-29 Iain Johnson Environmental sensitive fluorogenic compounds and their application for singlet oxygen and protein detection
US7776529B2 (en) 2003-12-05 2010-08-17 Life Technologies Corporation Methine-substituted cyanine dye compounds
EP2610315B1 (en) 2003-12-05 2016-08-31 Life Technologies Corporation Methine-substituted cyanine dye compounds
EP1720944B1 (en) * 2003-12-05 2013-07-17 Life Technologies Corporation Cyanine dye compounds
WO2005064336A1 (en) * 2003-12-09 2005-07-14 Molecular Probes, Inc. Pyrenyloxysulfonic acid fluorescent agents
US8039642B2 (en) 2003-12-09 2011-10-18 Life Technologies Corporation Pyrenyloxysulfonic acid fluorescent agents
EP1706452B1 (en) * 2003-12-30 2008-09-03 The Regents of the University of California, Office of the President Aromatic triamide-lanthanide complexes
US20050227309A1 (en) 2004-01-21 2005-10-13 Corry Schuyler B Optically-detectable enzyme substrates and their method of use
EP1723255B1 (en) * 2004-02-17 2010-12-29 Nuevolution A/S Method for enrichment involving elimination by mismatch hybridisation
WO2006023231A2 (en) 2004-07-27 2006-03-02 Molecular Probes, Inc. Fluorescent metal ion indicators with large stokes shift
CN101258220A (zh) 2004-09-16 2008-09-03 阿普里拉股份有限公司 荧光染料化合物，共轭物及其应用
US7598390B2 (en) 2005-05-11 2009-10-06 Life Technologies Corporation Fluorescent chemical compounds having high selectivity for double stranded DNA, and methods for their use
US7584947B2 (en) * 2005-05-20 2009-09-08 The Boeing Company Reconfigurable workpiece support fixture
US7569695B2 (en) * 2005-05-24 2009-08-04 Enzo Life Sciences, Inc. Dyes for the detection or quantification of desirable target molecules
US7737281B2 (en) * 2005-05-24 2010-06-15 Enzo Life Sciences, Inc. C/O Enzo Biochem, Inc. Purine based fluorescent dyes
US8357801B2 (en) 2005-05-24 2013-01-22 Enzo Life Sciences, Inc. Labeling of target molecules, identification of organelles and other applications, novel compositions, methods and kits
WO2007002204A2 (en) 2005-06-21 2007-01-04 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Pyrosequencing methods and related compostions
US20070134685A1 (en) * 2005-09-06 2007-06-14 Invitrogen Corporation Control of chemical modification
JP2009510198A (ja) 2005-09-26 2009-03-12 インヴィトロジェン コーポレーション 紫色レーザー励起性色素及びその使用方法
US7842823B2 (en) * 2005-10-27 2010-11-30 The Regents Of The University Of California Fluorogenic probes for reactive oxygen species
WO2007053719A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chemically cleavable 3'-o-allyl-dntp-allyl-fluorophore fluorescent nucleotide analogues and related methods
WO2007053702A2 (en) 2005-10-31 2007-05-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthesis of four color 3'-o-allyl modified photocleavable fluorescent nucleotides and related methods
EP1957644B1 (en) 2005-12-01 2010-12-01 Nuevolution A/S Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries
US7871777B2 (en) * 2005-12-12 2011-01-18 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Probe for nucleic acid sequencing and methods of use
US8703734B2 (en) 2005-12-12 2014-04-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nanoprobes for detection or modification of molecules
US20090233280A1 (en) * 2005-12-28 2009-09-17 Canon Kabushiki Kaisha Method of acquiring information regarding base sequence and information reading device for the same
US7521577B2 (en) 2006-01-12 2009-04-21 Molecular Probes, Inc. Heavy metal binding compounds and their method of use
DK1991273T4 (da) 2006-02-10 2022-02-07 Life Technologies Corp Mærkning og påvisning af post-translationelt modificerede proteiner
US8114636B2 (en) 2006-02-10 2012-02-14 Life Technologies Corporation Labeling and detection of nucleic acids
US7482444B2 (en) 2006-03-13 2009-01-27 Wallac Oy Terminating substrates for DNA polymerases
FI20065162A0 (fi) * 2006-03-13 2006-03-13 Wallac Oy Terminoivia DNA polymeraasisubstraatteja
US9790538B2 (en) 2013-03-07 2017-10-17 Apdn (B.V.I.) Inc. Alkaline activation for immobilization of DNA taggants
US20140106357A1 (en) 2012-10-16 2014-04-17 Applied Dna Sciences, Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
US10741034B2 (en) 2006-05-19 2020-08-11 Apdn (B.V.I.) Inc. Security system and method of marking an inventory item and/or person in the vicinity
WO2007148809A1 (en) 2006-06-20 2007-12-27 Canon Kabushiki Kaisha Polymerase-immobilized electrode
EP2511266B1 (en) 2006-07-10 2019-09-04 The Regents of The University of California Luminescent 1-hydroxy-2-pyridinone chelates of lanthanides
WO2008063721A2 (en) 2006-08-15 2008-05-29 The Regents Of The University Of California Luminescent macrocyclic lanthanide complexes
JP5636189B2 (ja) 2006-10-27 2014-12-03 ライフ テクノロジーズ コーポレーション 蛍光発生性ｐＨ感受性色素およびその使用方法
WO2008069973A2 (en) 2006-12-01 2008-06-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Four-color dna sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US7947447B2 (en) 2007-01-16 2011-05-24 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
WO2008092120A1 (en) * 2007-01-25 2008-07-31 Lumiphore, Inc. Multi-color time resolved fluorophores based on macrocyclic lanthanide complexes
US8586743B2 (en) 2007-01-30 2013-11-19 Life Technologies Corporation Labeling reagents and methods of their use
US8404830B2 (en) * 2007-07-17 2013-03-26 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US9096856B2 (en) * 2007-07-19 2015-08-04 Georgia State University Research Foundation, Inc. Nucleotides and aptamers containing boronic acid groups having biased binding to glycosylated proteins, and uses thereof
WO2009018112A2 (en) * 2007-07-27 2009-02-05 Invitrogen Corporation The use of novel coumarins as glutathione and thiol labels
JP4533981B2 (ja) 2007-07-31 2010-09-01 国立大学法人大阪大学 核酸と被験物質との結合親和性を測定するための組成物及びその利用
DK2725107T3 (da) 2007-10-19 2019-01-02 Univ Columbia DNA-sekventering med ikke-fluorescerende nukleotidreversible terminatorer og ddNTP'er modificeret med spaltbart mærke og nukleinsyre omfattende inosin med reversible terminatorer
US9097667B2 (en) 2007-12-14 2015-08-04 Biotium, Inc. Fluorescent compounds
WO2009094536A1 (en) * 2008-01-24 2009-07-30 Life Technologies Corporation Fluorogenic hydrazine-substituted compounds
CN102037144B (zh) 2008-04-01 2013-09-25 生物检索技术股份有限公司 稳定化的核酸暗猝灭剂-荧光团探针
WO2009152102A2 (en) * 2008-06-10 2009-12-17 The Regents Of The University Of California Pro-fluorescent probes
US20100151591A1 (en) * 2008-10-31 2010-06-17 Butlin Nathaniel G Rapid homogeneous diagnostic testing platform based on lanthanide fluorescent resonance energy transfer
US8940485B2 (en) 2008-11-12 2015-01-27 Apdn (B.V.I.) Inc. Methods for genotyping mature cotton fibers and textiles
US8669079B2 (en) 2008-11-12 2014-03-11 Cara Therapeutics, Inc. Methods for genetic analysis of textiles made of Gossypium barbadense and Gossypium hirsutum cotton
US8431416B2 (en) 2009-04-01 2013-04-30 Becton, Dickinson And Company Reactive heterocycle-substituted 7-hydroxycoumarins and their conjugates
EP2816038B8 (en) 2009-08-24 2019-12-25 Lumiphore, Inc. Hopo chelators
US8309059B2 (en) * 2009-08-31 2012-11-13 Promega Corporation Reactive cyanine compounds
DE102010049607A1 (de) 2009-10-26 2011-06-30 Becker, Claus, Prof., 76470 Konjugate von Nukleotiden und Methoden zu deren Anwendung
US8658434B2 (en) * 2009-10-28 2014-02-25 Biotium, Inc. Fluorescent pyrene compounds
WO2011068569A1 (en) 2009-12-04 2011-06-09 Biotium, Inc. Heterocycle-substituted xanthene dyes
AU2010336403B2 (en) * 2009-12-24 2016-04-21 Lumiphore, Inc. Radiopharmaceutical complexes
JP5901610B2 (ja) 2010-04-12 2016-04-13 ソマロジック・インコーポレーテッド ５位修飾ピリミジンとその使用
WO2011127933A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Nuevolution A/S Bi-functional complexes and methods for making and using such complexes
US9206216B2 (en) 2010-04-21 2015-12-08 Pierce Biotechnology, Inc. Modified nucleotides methods and kits
US8536323B2 (en) 2010-04-21 2013-09-17 Pierce Biotechnology, Inc. Modified nucleotides
US8623324B2 (en) 2010-07-21 2014-01-07 Aat Bioquest Inc. Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates
US9145361B2 (en) 2011-03-25 2015-09-29 Life Technologies Corporation SDP-containing heterobifunctional agents
US9994894B2 (en) 2011-04-27 2018-06-12 Agct Gmbh Method and components for detecting nucleic acid chains
US20150086981A1 (en) 2011-05-04 2015-03-26 Genovoxx Gmbh Nucleoside-triphosphate conjugate and methods for the use thereof
WO2012162429A2 (en) 2011-05-23 2012-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by synthesis using raman and infrared spectroscopy detection
US9416153B2 (en) 2011-10-11 2016-08-16 Enzo Life Sciences, Inc. Fluorescent dyes
WO2013180811A1 (en) 2012-05-30 2013-12-05 Life Technologies Corporation FLUOROGENIC pH-SENSITIVE DYES AND THEIR METHODS OF USE
US9297032B2 (en) 2012-10-10 2016-03-29 Apdn (B.V.I.) Inc. Use of perturbants to facilitate incorporation and recovery of taggants from polymerized coatings
US9266370B2 (en) 2012-10-10 2016-02-23 Apdn (B.V.I) Inc. DNA marking of previously undistinguished items for traceability
US9963740B2 (en) 2013-03-07 2018-05-08 APDN (B.V.I.), Inc. Method and device for marking articles
US11453652B2 (en) 2013-03-15 2022-09-27 Lumiphore, Inc. Di-macrocycles
WO2014144883A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
KR102230831B1 (ko) 2013-03-15 2021-03-22 일루미나 케임브리지 리미티드 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드
EP3058339B1 (en) 2013-10-07 2019-05-22 APDN (B.V.I.) Inc. Multimode image and spectral reader
US9938314B2 (en) 2013-11-21 2018-04-10 Somalogic, Inc. Cytidine-5-carboxamide modified nucleotide compositions and methods related thereto
US9372194B2 (en) 2013-12-23 2016-06-21 Ramdas Pai Fluorescent dyes, labeled conjugates and analytical methods
CA2940655C (en) 2014-03-18 2020-07-07 Apdn (B.V.I.) Inc. Encrypted optical markers for security applications
US10745825B2 (en) 2014-03-18 2020-08-18 Apdn (B.V.I.) Inc. Encrypted optical markers for security applications
EP3143022B1 (en) 2014-05-16 2021-12-22 Life Technologies Corporation Carbopyronone compounds useful as diagnostic adjuvants
WO2015175873A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Life Technologies Corporation Cell tracking reagents and their methods of use
WO2016090076A2 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Life Technologies Corporation Hydrazinyl and aminooxy compounds and their methods of use
US10760182B2 (en) 2014-12-16 2020-09-01 Apdn (B.V.I.) Inc. Method and device for marking fibrous materials
US20180196033A1 (en) 2015-06-26 2018-07-12 Life Technologies Corporation Cell tracking reagents and their methods of use
WO2017172608A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 Aat Bioquest, Inc. Polyfluoreno[4,5-cde]oxepine conjugates and their use in methods of analyte detection
US10519605B2 (en) 2016-04-11 2019-12-31 APDN (B.V.I.), Inc. Method of marking cellulosic products
WO2017223147A1 (en) 2016-06-23 2017-12-28 Life Technologies Corporation Methods and compositions for detecting or measuring caspases or apoptosis
US10995371B2 (en) 2016-10-13 2021-05-04 Apdn (B.V.I.) Inc. Composition and method of DNA marking elastomeric material
US10920274B2 (en) 2017-02-21 2021-02-16 Apdn (B.V.I.) Inc. Nucleic acid coated submicron particles for authentication
EP3833715A2 (en) 2018-08-10 2021-06-16 Life Technologies Corporation Silicon-substituted rhodamine dyes and dye conjugates
US11220628B2 (en) 2019-02-20 2022-01-11 Aat Bioquest, Inc. Condensed polycyclic conjugated polymers and their use for biological detection
CN115280147A (zh) 2020-01-30 2022-11-01 阿特生物探索公司 可紫外激发的基于聚芴的缀合物及其在分析物检测方法中的用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US57566A (en) * 1866-08-28 Improved car-coupling
EP0135587B2 (en) * 1983-02-22 2002-12-18 Syngene, Inc. Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis
CA1340806C (en) * 1986-07-02 1999-11-02 James Merrill Prober Method, system and reagents for dna sequencing
US5047519A (en) * 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
ATE113059T1 (de) * 1987-06-24 1994-11-15 Florey Howard Inst Nukleosid-derivate.

Also Published As

Publication number Publication date
DK81993A (da) 1993-07-07
ATE114651T1 (de) 1994-12-15
US5047519A (en) 1991-09-10
NO171981C (no) 1993-05-26
EP0251786B1 (en) 1994-11-30
DK337587A (da) 1988-01-03
JPH085908B2 (ja) 1996-01-24
PT85237A (en) 1987-08-01
NO872757D0 (no) 1987-07-01
GR3015197T3 (en) 1995-05-31
DK81993D0 (da) 1993-07-07
EP0251786A2 (en) 1988-01-07
NO872757L (no) 1988-01-04
DK337587D0 (da) 1987-07-01
DE3750792T2 (de) 1995-05-04
EP0251786A3 (en) 1989-12-06
PT85237B (pt) 1990-03-30
KR960001528B1 (ko) 1996-02-01
DK82093D0 (da) 1993-07-07
DK82093A (da) 1993-07-07
JPS63152364A (ja) 1988-06-24
IE871756L (en) 1988-01-02
DE3750792D1 (de) 1995-01-12
CA1340022C (en) 1998-09-01
ES2066760T3 (es) 1995-03-16
KR880000408A (ko) 1988-03-25
IE68058B1 (en) 1996-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO171981B (no) Alkynylaminonukleotider, fremgangsmaate for fremstilling derav, 7-jodnukleotider, merkede alkynyl-aminonukleotider samt fremgangsmaate for fremstilling av 7-(3-amino-1-propynyl)-2&#39;,3&#39;-dideoxyguanosin-5&#39;-trifosfat
US5151507A (en) Alkynylamino-nucleotides
CA1340806C (en) Method, system and reagents for dna sequencing
US5625081A (en) Fluorescent dye intermediates
KR102048274B1 (ko) 핵산 시퀀싱을 위하여 5-메톡시, 3&#39;-oh 차단안된, 신속하게 광절단가능한 종료 뉴클레오티드 및 핵산 시퀀싱 방법
CA2145405C (en) Nucleotides labelled with an infrared dye and their use in nucleic acid detection
JP2000504009A (ja) ヌクレオシド類似体
CA2568907A1 (en) 8-carbyl substituted cyclic adenosine-3&#39;,5&#39;-monophosphorothiolate compounds as camp modulators
US5795756A (en) Method and compounds for the inhibition of adenylyl cyclase
CA2265727A1 (en) Heterocyclic compounds and their use for isolating nucleic acids
Goldman et al. Formation of 5-and 6-aminocytosine nucleosides and nucleotides from the corresponding 5-bromocytosine derivatives: synthesis and reaction mechanism
KR960005720B1 (ko) 알키닐 아미노 누클레오티드의 제조 방법
Janeba et al. Synthesis of 8-amino-and N-substituted 8-aminoadenine derivatives of acyclic nucleoside and nucleotide analogs
CA2145682C (en) 2-substituted adenosines with a-2 receptor affinity
FUJII et al. Purines. IV. O→ N (9) Alkyl Migration in the Alkylation of 1-Alkoxyadenines
Cook et al. Fluorinated pyrimidine nucleosides. 2. Reaction of 2, 2'-anhydro-1-. beta.-D-arabinofuranosyl-5-fluorocytosine hydrochloride with nitrogen and sulfur nucleophiles
Ceulemans et al. Synthesis of an Uncharged cAMP-Analogue
Predescu Synthesis of nucleoside analogues and fluorescent labels for DNA sequencing and other applications in biotechnology
NZ622268B2 (en) 5-methoxy, 3&#39;-oh unblocked, fast photocleavable terminating nucleotides and methods for nucleic acid sequencing

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired