CN101258220A - 荧光染料化合物，共轭物及其应用 - Google Patents

荧光染料化合物，共轭物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN101258220A
CN101258220A CNA2005800310384A CN200580031038A CN101258220A CN 101258220 A CN101258220 A CN 101258220A CN A2005800310384 A CNA2005800310384 A CN A2005800310384A CN 200580031038 A CN200580031038 A CN 200580031038A CN 101258220 A CN101258220 A CN 101258220A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compound
described compound
nhr
polynucleotide
substituted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2005800310384A
Other languages
English (en)
Inventor
R·格雷厄
R·邹
K·G·尤帕德亚
S·C·本森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Applied Biosystems Inc
Original Assignee
Applera Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Applera Corp filed Critical Applera Corp
Publication of CN101258220A publication Critical patent/CN101258220A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D219/00—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems
    • C07D219/04—Heterocyclic compounds containing acridine or hydrogenated acridine ring systems with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to carbon atoms of the ring system
    • C07D219/06—Oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B15/00—Acridine dyes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1011—Condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Other In-Based Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明一般涉及荧光染料，可连接形式的荧光染料，能量转移染料，用荧光染料标记的试剂，以及它们的应用。

Description

荧光染料化合物，共轭物及其应用
本发明一般涉及荧光染料、荧光染料的可连接形式、能量转移染料和用荧光染料标记的试剂，以及它们的应用。
使用荧光标记物对生物分析物的非放射性检测是现代分子生物学中重要的技术。通过消除对放射性标记物的需要，提高了安全性，减小了由于废弃试剂对环境的影响和成本。这些使用此类非放射性荧光检测的方法的例子包括4-色自动化DNA测序、寡核苷酸杂交方法，以及聚合酶-链-反应产物的检测、免疫测定等。
在许多应用中，为了实现多个空间重叠的分析物的独立检测，例如单管多重DNA探针试验和4-色自动化DNA测序方法，最好使用多个可光谱识别的荧光标记物。在多重DNA探针试验中，通过使用可光谱识别的荧光标记物，可以减少反应管的数目，从而简化实验步骤，便于生产特定的试剂组。在4-色自动化DNA测序中，采用多色荧光标记，可以实现在单通道中分析多个碱，从而使产量比单色法高，并且减少了由于通道间电泳迁移的不同而导致的不确定因素。
目前可获得的适用于4-色自动化DNA测序应用的多重染料组需要蓝色或蓝绿色激光，以充分地激发所有构成染料组的染料的荧光发射，例如，氩离子激光器。在商购自动化DNA测序系统中使用蓝色或蓝绿色激光器通常是不利的，因为这类激光器具有高成本和有限的使用寿命。
因此，需要满足上述要求同时能被波长约大于600纳米的光激发的荧光染料化合物。
目前已经发现基于结构式(1)的红色荧光发射染料的化学稳定性和光活化稳定性非常高，并且能够被波长较长的光激发。
在某些实施方式中，本发明提供包括选自以下的结构的新荧光染料：
和
Figure A20058003103800201
其中，
R1-R3和R6-R16各自独立地是-H、卤素、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基，其中R可以是C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基；和
R4和R5可以独立地是C1-C6烷基、C1-C6取代烷基，R4和R5可以一起形成C3-C7环烷基、C4-C7不饱和环烷基、C3-C7取代环烷基或C4-C7取代不饱和环烷基；
前提是，如果化合物包括结构(I)，则R1-R3或R8中的至少一个不是-H。任选地，R1-R3和R6-R16中的至少一个可以是-SO3H。
在一些实施方式中，本发明提供包含与受体染料共价连接的给体染料的能量转移染料化合物，其中给体染料能够吸收第一波长的光，作为响应发射出激发能，受体染料能够吸收给体染料发出的激发能，作为响应产生第二波长的荧光。在一些实施方式中，给体染料能够通过键、非核苷酸连接(non-nucleotidic linker)或核苷连接(即，多核苷酸、核糖核酸等)与受体染料共价连接。在一些实施方式中，上述连接可促进能量在给体染料和受体染料之间有效地转移。在一些实施方式中，给体染料和受体染料中的至少一种是本发明所述的染料。
在一些实施方式中，本发明提供了包括以下结构的标记核苷和/或核苷酸：
NUC-L-D
其中，NUC包括核苷、核苷酸、改性核苷或改性核苷酸，L包括键或连接部分，D包括本发明的染料化合物。在一些实施方式中，NUC和D可以通过连接部分L共价连接，其中L可以通过R1-R3和R6-R16中的一个与D连接。在一些实施方式中，如果NUC包括嘌呤碱，连接部分可以与嘌呤的8-位连接，如果NUC包括7-脱氮嘌呤碱，连接部分可以与7-脱氮嘌呤(deazapurine)的7-位连接，如果NUC包括嘧啶碱，则连接部分可以与嘧啶的5-位连接。
在一些实施方式中，本发明提供寡核苷酸分析方法，其包括以下步骤：形成一组用上述结构的染料标记的寡核苷酸片段；对标记的寡核苷酸片段进行根据尺寸的分离的步骤，例如电泳；在分离步骤后，检测标记的寡核苷酸片段。
参考以下说明、附图和所附权利要求书可以更好地理解本发明所述的这些和其它特征和优点。
图1显示合成本发明的包括结构(I)的染料化合物的一般合成路径。
图2显示合成本发明的包括结构(II)的染料化合物的一般合成路径。
图3显示合成本发明的包括结构(III)的染料化合物的一般合成路径。
图4显示合成本发明的包括结构(IV)的染料化合物的一般合成路径。
图5显示合成本发明的包括结构(I)的染料化合物的可能合成路径。
图6显示合成可用于制备本发明所述化合物的叔醇(例如，2-(4’-羟基萘(hydroxynathalen)-2-基)-2-丙醇)中间体的示例性合成路径。
图7显示制备本发明的包括结构(II)的化合物的可能合成方案。
图8显示制备本发明的包括结构(II)的化合物的可能合成方案。
图9显示DDAO和本发明的几种代表性化合物的吸收光谱。
图10显示DDAO和本发明的几种代表性化合物的发射光谱。
下面将详细描述本发明的可选实施方式，其例子示于附图。虽然，将结合这些可选实施方式描述本发明，但是应理解，这些实施方式不旨在将本发明限制于此。相反，本发明旨在覆盖所有属于所附权利要求限定的本发明的范围内的替换、修改和等同内容。
在此申请中，除非另有说明，使用的单数包括复数。在此申请中，除非另有说明，使用的“或”表示“和/或”。此外，使用的术语“包括”以及其它形式如“包含”和“含有”应理解为是包括的，因为术语“包括”为开放式表示，还可能包括其它成分。
应理解，用于定义本发明的化合物的化学结构是各给定的结构可以表示的可能共振结构中的任何一种的表示。此外，应理解通过定义，共振结构仅仅是本领域技术人员使用的表示电子离域情况的图示，本发明不以任何方式使一种给定结构受限于一种具体共振结构。
一般来说，本发明包括可用作荧光标记物的荧光染料化合物，用作能量转移染料的部分，用于核苷、核苷酸和多核苷酸的共轭物，用于生物分析领域中使用此类染料和试剂的方法。本发明的化合物可特别应用于荧光核酸分析领域(例如，自动DNA测序和片段分析)、在杂交测试中检测探针杂交和检测核酸扩增产物等。
在一些实施方式中，本发明提供包括选自以下的结构的新荧光染料：
Figure A20058003103800221
Figure A20058003103800231
和
Figure A20058003103800232
其中，
R1-R3和R6-R16独立地是-H、卤素、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基，其中R可以是C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基；和
R4和R5可独立地是C1-C6烷基、C1-C6取代烷基，R4和R5可一起形成C3-C7环烷基、C4-C7不饱和环烷基、C3-C7取代环烷基或C4-C7取代不饱和环烷基；
前提是，如果该化合物包括结构(I)，则R1-R3或R8中的至少一个不是-H。任选地，R1-R3和R6-R16中的至少一个可以是-SO3H。应理解，文中所述任何化合物可包括苯酚氧(phenol oxygen)去质子化形式以及可能的共振结构。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800241
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800242
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800243
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800251
在一些实施方式中，R6和R7可以独立地是卤素、氟、氯或溴。在一些实施方式中，R6和R7可以是氟。在一些实施方式中，R6和R7可以是氯。在一些实施方式中，R6和R7可以是溴。
在一些实施方式中，R6可以是-H，R7可以是-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2和-CH2NHR，其中R如上所定义。在一些实施方式中，X1可以是-H，X2可以是-H、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2NH2和-CH2NHR，其中R如上所定义。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物包括结构(I)，其中R1-R3和R8可以各自独立地是-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，其中R如上所定义，前提是，如果该化合物包括结构(I)，则R1-R3或R8中的至少一个不是-H。在一些实施方式中，R1-R3和R8可以各自独立地是-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，其中R如上所定义。在一些实施方式中，R1-R3和R8可以各自独立地是-SO3H或-SO3R，其中R如上所定义。在一些实施方式中，R1-R3和R8可以各自独立地是-CH2NH2或-CH2NHR，其中R如上所定义。
在一些实施方式，本发明的染料化合物包括结构(I)，其中R6和R7可以各自独立地是卤、氟、氯或溴，R1-R3和R8可以各自独立地是-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基，其中R如上所定义，前提是，如果化合物包括结构(I)，则R1-R3或R8中的至少一个不是-H。在一些实施方式中，R6和R7可以各自独立地是卤素、氟、氯或溴，R1-R3和R8可以各自独立地是-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，其中R如上所定义。在一些实施方式中，R6和R7是氟，R1-R3和R8可以各自独立地是-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，其中R如上所定义。在一些实施方式中，R6和R7是氯，R1-R3和R8可以各自独立地是-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，其中R如上所定义。在一些实施方式中，R6和R7是溴，R1-R3和R8可以各自独立地是-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，其中R如上所定义。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物包括结构(I)，其中R6可以是-H，R7可以是-H、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2NH2或-CH2NHR，其中R如上所定义，R1-R3和R8可以各自独立地是-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，其中R如上所定义。在一些实施方式中，R6可以是-H，R7可以是-H、-SO3H或-SO3R，R1-R3和R8可以各自独立地是-CH2NH2或-CH2NHR，其中R如上所定义。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800261
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800262
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800263
在一些实施方式中，R可以是取代苯甲酰基。在一些实施方式中，R可以是连接基。在一些实施方式中，R可以是三氟乙酰基。在一些实施方式中，R可以包括以下结构：
Figure A20058003103800271
在一些实施方式中，R可以包括以下结构：
Figure A20058003103800272
X可以是丁二酰亚胺。
在一些实施方式中，R可以是
Figure A20058003103800273
在一些实施方式中，R4和R5可以是甲基。在一些实施方式中，R2和R3中的至少一个可以是-NO2，R4和R5可以是甲基。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括结构(II)，其中R6和R7可以各自独立地是卤素、氟、氯或溴，R可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括结构(II)，其中R6和R7可以各自独立地是卤素、氟、氯或溴，R3、R8和R9-R12中的任何一个可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基，其中R如上所定义。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括结构(II)，其中R6和R7可以各自独立地是卤素、氟、氯或溴，R9可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R10-R12可以是-H，其中R如上所定义。在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括结构(II)，其中R6和R7可以各自独立地是卤素、氟、氯或溴，R10可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R9和R11-R12可以是-H，其中R如上所定义。在一些实施方式中，本发明的染料化合物可以包括结构(II)，其中R6和R7可以各自独立地是卤素、氟、氯或溴，R11可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R9-R10和R12可以是-H，其中R如上所定义。在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括结构(II)，其中R6和R7可以各自独立地是卤素、氟、氯或溴，R12可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R9-R11可以是-H，其中R如上所定义。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括结构(II)，其中R6可以是-H，R7可以是-H、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2NH2或-CH2NHR，其中R如上所定义，R9可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R10-R12可以是-H，其中R如上所定义。在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括结构(II)，其中R6可以是-H，R7可以是-H、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2NH2或-CH2NHR，其中R如上所定义，R10可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R9和R11-R12可以是-H，其中R如上所定义。在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括结构(II)，其中R6可以是-H，R7可以是-H、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2NH2或-CH2NHR，其中R如上所定义，R11可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R9-R10和R12可以是-H，其中R如上所定义。在一些实施方式中，本发明的染料化合物包括结构(II)，其中R6可以是-H，R7可以是-H、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2NH2或-CH2NHR，其中R如上所定义，R12可以是-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R9-R11可以是-H，其中R如上所定义。
在一些实施方式中，R9-R12中的任何一个可以是-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，其中R如上所定义。在一些实施方式中，R9-R12中的任一个可以是-SO3H或-SO3R，其中R如上所定义。在一些实施方式中，R9-R12中的任一个可以是-CH2NH2或-CH2NHR，其中R如上所定义。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
其中R6和R7可以是氢、氟、氯或溴。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
其中R6和R7可以是氢、氟、氯或溴。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800301
其中R6和R7可以是氢、氟、氯或溴。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800302
其中R6和R7可以是氢、氟、氯或溴。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800303
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800304
其中R如上所定义。
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800311
在一些实施方式中，本发明的染料化合物可包括以下结构：
Figure A20058003103800312
其中R如上所定义。
在一些实施方式中，R可以是取代苯甲酰基。在一些实施方式中，R可以是连接基。在一些实施方式中，R可以是三氟乙酰基。在一些实施方式中，R可包括以下结构：
Figure A20058003103800313
在一些实施方式中，R可包括以下结构：
Figure A20058003103800314
X可以是丁二酰亚胺。
在一些实施方式中，R可以是
Figure A20058003103800315
在一些实施方式中，本发明的化合物包括结构(III)。在一些实施方式中，R1和R3可以是-H。在一些实施方式中，R6可以是-H。在一些实施方式中，R13、R15和R16可以是-H。在一些实施方式中，R2可以是-SO3H。在一些实施方式中，R2可以是-H。在一些实施方式中，R14可以是-CH2NH2。在一些实施方式中，R14可以是-CH2NHR。在一些实施方式中，R可以是
Figure A20058003103800321
在一些实施方式中，R可包括以下结构：
Figure A20058003103800322
X可以是丁二酰亚胺。
在一些实施方式中，R可以是
在一些实施方式中，R可以是连接基。在一些实施方式中，R14可以是-H。在一些实施方式中，R14可以是-SO3H。在一些实施方式中，R14可以是-H。在一些实施方式中，R2可以是-CH2NH2。在一些实施方式中，R2可以是-CH2NHR。在一些实施方式中，R可以是
Figure A20058003103800324
在一些实施方式中，R可以包括以下结构：
Figure A20058003103800331
X可以是丁二酰亚胺。
在一些实施方式中，R可以是
Figure A20058003103800332
在一些实施方式中，R可以是连接基。在一些实施方式中，R2可以是-H。在一些实施方式中，R4和R5可以是甲基。
在一些实施方式中，本发明的化合物包括结构(IV)。在一些实施方式中，R10可以是-SO3H。在一些实施方式中，R10可以是-H。在一些实施方式中，R14可以是-CH2NH2。在一些实施方式中，R14可以是-CH2NHR。在一些实施方式中，R可以是
Figure A20058003103800333
在一些实施方式中，R可以包括以下结构：
Figure A20058003103800334
X可以是丁二酰亚胺。
在一些实施方式中，R可以是
Figure A20058003103800335
在一些实施方式中，R是连接基。在一些实施方式中，R14可以是-H。在一些实施方式中，R3、R6、R9、R11、R12、R13、R15和R16可以是-H。在一些实施方式中，R14可以是-SO3H。在一些实施方式中，R14可以是-H。在一些实施方式中，R10可以是-CH2NH2。在一些实施方式中，R10可以是-CH2NHR。在一些实施方式中，R可以是
Figure A20058003103800341
在一些实施方式中，R可以包括以下结构：
Figure A20058003103800342
X可以是丁二酰亚胺。
在一些实施方式中，R可以是
Figure A20058003103800343
在一些实施方式中，R可以是连接基。在一些实施方式中，R14可以是-H。在一些实施方式中，R3、R6、R9、R11、R12、R13、R15和R16可以是-H。
在一些实施方式中，R4和R5可以是甲基。
文中所用的“取代”指分子中一个或多个氢原子被一个或多个非氢原子、官能团或部分取代。例如，未取代的胺是-NH2，而取代胺可以是-NHCH3。示例性的取代基包括但不限于：卤素、氟、氯、溴、C1-C6烷基、C1-C6环烷基、C1-C6支链烷基、C1-C6烯基、C1-C6环烯基、C1-C6支链烯基、C1-C6炔基、C1-C6支链炔基、硫酸基、磺酸基、砜、氨基、铵、酰氨基、腈、C1-C6烷氧基、苯氧基，芳族取代苯氧基、苯基、芳族多环基团、富电子杂环和连接基。
文中所用的“连接基”指能够与连接在能量转移染料对的试剂或成员上的“互补官能团(complementary functionality)”反应的部分，该反应形成使染料与能量转移染料对的试剂或成员连接的“连接部分”。当互补官能团是胺时，合适的连接基包括但不限于：异硫氰酸酯、磺酰氯、4，6-二氯三嗪基、丁二酰亚胺酯或其它活性羧酸酯。当互补官能团是硫氢基时，合适的连接基包括但不限于：马来酰亚胺、卤代乙酰基、碘代乙酰基、卤代乙酰胺或碘代乙酰胺。参见，例如，R.Haugland，Molecular Probes Handbook ofFluorescent Probes and Research Chemicals，Molecular probes，Inc.(1992)。
此外，应理解，适用于使本发明的染料分子与各种分子或底物(即核苷酸、核苷、寡核苷酸、肽或其它染料分子、连接部分等)共价结合的各种互补连接基/互补官能团对在本领域是众所周知的。适合在许多应用中作为连接基/互补官能团对的互补亲电试剂和亲核试剂列于表1中，所列的亲电物质和亲核物质的反应生成指示的共价键。形成共价键的条件是众所周知的。
表1
形成可用的共价连接的一些路径的例子
Figure A20058003103800351
Figure A20058003103800361
*活性酯，如本领域中所理解的，一般通式为-COX，其中X是良好的离去基团，例如氧基丁二酰亚氨基(-ONC4H4O2)、氧基磺基丁二酰亚氨基(-ONC4H3O2-SO3H)、1-氧基苯并三唑基(-OC6H4N3)；通式为-OR″的芳氧基，其中R″是芳基或被一个或多个相同或不同的拉电子取代基(例如，-NO2、-F、-Cl、-CN或-CF3)取代的芳基，用于形成通式-OCORa或-OCNRaNHRb的酸酐或混合酸酐(其中Ra和Rb可相同或不同)，是(C1-C6)烷基、(C1-C6)全氟烷基或(C1-C6)烷氧基；或环己基、3-二甲基氨基丙基或N-吗啉代乙基。
**酰基叠氮可以重排为异氰酸酯。
用于使本发明染料与给定分子或底物共价结合的亲核试剂或亲电试剂的选择取决于分子或底物上与染料分子结合的互补官能团的性质。待结合的分子或物质上可存在的互补官能团的类型包括，但不限于，胺、硫醇、醇、酚、醛、酮、磷酸酯、咪唑、阱、羟胺、一取代和二取代的胺、卤化物、环氧化物、磺酸酯、羧酸或羧酸酯。
在一些实施方式中，可用于本发明的合适的亲核试剂包括胺、酚、苯胺、硫醇或醇、或它们的组合。在一些实施方式中，亲核试剂包括胺。在一些实施方式中，亲核试剂包括伯胺。在一些实施方式中，亲核试剂包括仲胺。
在一些实施方式中，亲电试剂包括丙烯酰胺、羧酸的活性酯、酰基叠氮、酰基腈、酰卤、醛、烷基卤、酸酐、芳基卤、叠氮、氮丙啶、硼酸盐、羧酸或羧酸盐、重氮烷、卤代乙酰胺、卤代三嗪、阱、亚氨酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、亚磷酰胺、迈克尔受体(即α，β-不饱和酯、α，β-不饱和醛等)或磺酰卤。
在一些实施方式中，亲电试剂包括羧酸的活性酯或羧酸盐、丁二酰亚胺酯、卤代乙酰胺、酰卤、烷基卤、磺酰卤、异硫氰酸酯、马来酰亚胺或叠氮基全氟苯酰氨基。在一些实施方式中，连接基是N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯，互补官能团是胺。为了形成NHS酯，本发明的包括羧酸部分作为连接基的染料与例如二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基丁二酰亚胺反应。或者，为形成NHS酯，将要与本发明的包括羧酸部分作为连接基的染料分子结合的分子或底物与例如二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基丁二酰亚胺反应。
用于制备本发明的包括结构(I)的化合物的示例性合成方案示于图1中。例如，使用Corey，P.F.在美国专利第4,810,636号中描述的合成步骤作为指导，本领域技术人员可以使类型(2)的4-羟基苯胺化合物与叔醇(4)，(例如，2-(4’-羟基苯基)-2-丙醇)在碱存在下反应，形成化合物(5)。或者，使4-羟基苯胺化合物(2)氧化，形成类型(3)的N-氯亚胺化合物，该化合物可与叔醇(4)(例如，2-(4’-羟基苯基)-2-丙醇)在碱存在下反应，形成化合物(5)。化合物(5)可与还原剂(例如，连二亚硫酸钠)反应，形成仲胺化合物(6)。可以用酸(例如，2N HCl)处理，然后用例如高碘酸钠进行氧化，从而通过环化反应使化合物(6)转化为化合物(7)。在一些实施方式中，根据存在的取代型式，化合物(7)可以任选地进一步衍生化。例如化合物(7)可以任选地通过与例如氯磺酸反应而磺化。
或者，化合物(7)可以通过与氨基甲基化试剂(例如，N-(羟基甲基)三氟乙酰胺)在酸(例如，浓硫酸)存在下或类似的条件下进行反应而氨基甲基化。
用于制备本发明的包括结构(II)的化合物的示例性合成方案示于图2中。根据与Corey描述的类似的方案，类型(2)的4-羟基苯胺化合物可以与叔醇(8)(例如，2-(4’-羟基萘-2-基)-2-丙醇)在碱存在下反应，形成化合物(9)。或者，可以使用已知条件，将4-羟基苯胺化合物(2)氧化，形成类型(3)的N-氯亚胺化合物，该化合物可与叔醇(8)在碱存在下反应，形成化合物(9)。化合物(9)随后可与还原剂(例如，连二亚硫酸钠)反应，形成仲胺化合物(10)。然后可用酸(例如，2N HCl)处理，接着用例如高碘酸钠进行氧化，从而通过环化反应使化合物(10)转化为化合物(11)。在一些实施方式中，根据存在的取代型式，化合物(11)可以任选的进一步衍生化。例如化合物(11)可以任选地通过与例如氯磺酸反应而磺化。
用于制备本发明的包括结构(III)的化合物的示例性合成方案示于图3中。根据与Corey描述的类似的方案，类型(12)的化合物可以与叔醇(4)在碱存在下反应，形成化合物(14)。或者，使用已知的条件将化合物(12)氧化，形成类型(13)的N-氯亚胺化合物，该化合物可与叔醇(4)在碱存在下反应，形成化合物(14)。化合物(14)随后可与还原剂(例如连二亚硫酸钠)反应，形成仲胺化合物(15)。然后可用酸(例如，2N HCl)处理，接着用例如高碘酸钠进行氧化，从而通过环化反应使化合物(15)转化为化合物(16)。在一些实施方式中，根据存在的取代型式，化合物(16)可以任选地进一步衍生化。例如化合物(16)可以任选地通过与例如氯磺酸反应而磺化。
用于制备本发明的包括结构(IV)的化合物的示例性合成方案示于图4中。根据与Corey描述的类似的方案，类型(12)的化合物可以与叔醇(8)在碱存在下反应，形成化合物(17)。或者，可使用已知的条件将化合物(12)氧化，形成类型(13)的N-氯亚胺化合物，该化合物可与叔醇(8)在碱存在下反应，形成化合物(17)。化合物(17)随后可与还原剂(例如连二亚硫酸钠)反应，形成仲胺化合物(18)。然后可用酸(例如，2N HCl)处理，接着用例如高碘酸钠进行氧化，从而通过环化反应使化合物(18)转化为化合物(19)。在一些实施方式中，根据存在的取代型式，化合物(19)可以任选的进一步衍生化。例如化合物(19)可以任选地通过与例如氯磺酸反应而磺化。
用于制备本发明的示例性化合物的合成方案示于图5中。根据与Corey描述的类似的方案，类型(20)的氯亚胺化合物可以与叔醇(21)在碱存在下反应，形成化合物(22)。化合物(22)随后可与还原剂(例如连二亚硫酸钠)反应，形成仲胺化合物(23)。然后可用酸(例如，2N HCl)处理，接着用例如高碘酸钠进行氧化，从而通过环化反应使化合物(23)转化为化合物(24)。此外，化合物(24)可以通过与例如氯磺酸反应而磺化，提供本发明的染料(25)。或者，化合物(24)可以通过与氨基甲基化试剂(例如，N-(羟基甲基)三氟乙酰胺)在酸(例如，浓硫酸)存在下或类似的条件下反应而氨基甲基化，形成化合物(26)。可以根据文献步骤(Corey，P.F.，美国专利4,810,636，1989年3月7日；Corey等.Angew Chem Int.Ed.Engl 30(1991))，用例如阮内镍/H2进行还原，然后与氧化剂(例如，高碘酸钠)反应进行氧化，而使染料(26)脱卤化，形成本发明的染料(27)。染料(27)可通过例如与氯磺酸反应而磺化，提供本发明的染料(28)。
如果本领域技术人员使用2-(4’-羟基萘-2-基)-2-丙醇作为叔醇，则可以根据图6所示的文献步骤(Haworth等.J.Chem Soc，Abstracts，第10-13页(1943))来制备该试剂。具体地，可以将丁二酸苄酯(29)(可从美国威斯康星州，密尔沃基的Sigma-Aldrich Chemical Company商购)悬浮在冷乙酰氯中，得到双酸酐丁二酸苄酯衍生物。该酸酐衍生物可以在AlCl3作用下，在硝基苯中环化为四氢萘酮中间体。该四氢萘酮中间体可以经两步通过溴化和碱催化除溴处理而芳香化，得到4-羟基-2-萘甲酸(napthoic acid)(30)。4-羟基-2-萘甲酸化合物(30)可以通过Fisher酯化反应在乙醇和HCl中转化为乙酯。最后，使用已有的文献步骤(J.Am.Chem.Soc.，v.108，4119(1986))，4-羟基-2-萘甲酸乙酯可以与甲基氯化镁(3.3当量)反应，得到叔醇2-(4’-羟基萘-2-基)-2-丙醇(31)。
用于制备本发明的示例性化合物的合成方案示于图7中。根据与Corey描述的类似的方案，类型(20)的氯亚胺化合物可以与叔醇(31)在碱存在下反应，形成化合物(32)。化合物(32)随后可与还原剂(例如连二亚硫酸钠)反应，形成仲胺化合物(33)。然后可用酸(例如，2N HCl)处理，接着用例如高碘酸钠进行氧化，从而通过环化反应使化合物(33)转化为化合物(34)。
示例性化合物(34)转化为其它本发明的化合物的合成方案示于图8中。在一些实施方式中，染料(34)可通过与例如氯磺酸反应而磺化，提供本发明的染料(35)。可以根据文献步骤(Corey，P.F.，美国专利4,810,636，1989年3月7日；Corey等.Angew Chem Int.Ed.Engl 30(1991))，用例如阮内镍/H2进行还原，然后与氧化剂(例如，高碘酸钠)反应进行氧化，而使染料(35)脱卤化，形成本发明的染料(36)。可以通过用N-(羟基甲基)三氟乙酰胺在酸(例如，浓硫酸)存在下或类似的条件下对染料(36)进行处理而使其氨基甲基化，形成本发明的化合物(37)。或者，可以通过用N-(羟基甲基)三氟乙酰胺在酸(例如，浓硫酸)存在下或类似的条件下对染料(34)进行处理而使其氨基甲基化，形成化合物(38)。如上所述，可以根据文献步骤使化合物(38)脱卤化，接着氧化，得到化合物(39)。最后，化合物(39)可以通过与氯磺酸反应而磺化，提供本发明的染料(40)。此外，本领域技术人员将意识到，可以使用已有的步骤，使化合物(37)或(40)的胺官能团任选地被脱保护，和任选地转化为取代胺，和/或化合物(37)或(40)可以任选地被卤化，以改变荧光性质(即发射波长)。
例如，图1&2中所示的适用于本发明的类型(3)的N-氯亚胺化合物可作为商品得到，和/或由各种4-羟基苯胺化合物制得，而4-羟基苯胺化合物可商购或使用本领域中已有的步骤制备。合适的4-羟基苯胺化合物的例子包括但不限于以下所列：
Figure A20058003103800411
本领域技术人员应理解，任何上述4-羟基苯胺化合物可以直接或在任选地用可行的不稳定官能团保护后转化为N-氯亚胺。本领域中已知的适合作为4-羟基苯胺化合物的其它例子可通过结构检索在目前可获得的如Chemical Abstracts Service(CAS)，SciFinder之类的数据库中找到。
例如，图3中所示的适用于本发明的类型(12)的N-氯亚胺化合物可作为商品得到，和/或由各种4-羟基-氨基萘化合物制得，而4--羟基-氨基萘化合物可商购或使用本领域中已有的步骤制备。合适的4-羟基-氨基萘化合物例子包括但不限于以下所列：
Figure A20058003103800422
本领域技术人员应理解，任何上述4-羟基-氨基萘化合物可以直接或在任选地用可行的不稳定官能团保护后转化为N-氯亚胺。本领域中已知的适合作为4-羟基-氨基萘化合物的其它例子可通过结构检索在目前可获得的如Chemical Abstracts Service(CAS)，SciFinder之类的数据库中找到。
例如，可按照与6中描述的类似的方法，由合适的4-羟基-2-萘甲酸化合物制备图2中所示的合适的类型(8)的叔醇化合物。本领域中已知的合适的4-羟基-2-萘甲酸化合物的例子包括但不限于以下所列：
本领域技术人员应理解，任何上述4-羟基-2-萘甲酸化合物可直接或者在任选地用可行的不稳定官能团保护后，用于合成本发明的化合物，本领域中已知的适合作为4-羟基-2-萘甲酸化合物的其它例子可通过结构检索在目前可获得的如Chemical Abstracts Service(CAS)，SciFinder之类的数据库中找到。
在一些实施方式中，本发明包括结合了通式I-IV的染料化合物的能量转移染料化合物。一般来说，本发明的能量转移染料包括给体染料和受体染料，两者共价连接，给体染料能够吸收第一波长的光，并作为响应发射激发能，受体染料能够吸收由给体染料发出的激发能，并作为响应产生第二波长的荧光。在一些实施方式中，给体染料与受体染料可通过连接部分共价连接。在一些实施方式中，连接部分可以有效地促进给体染料和受体染料之间的有效能量转移。在一些实施方式中，连接部分是非核苷酸形式的。在一些实施方式中，连接部分可以是核苷酸连接部分，诸如多核苷酸。关于这类能量转移染料的结构、合成和应用的深入讨论参见(例如)Mathies等的美国专利第5,728,528号、Lee等的美国专利第5,863,727号、Glazer等的美国专利第5,853,992号、Waggoner等的美国专利第6,008,373号、Nampalli等的美国专利申请2004/0126763 A1、Kumar等的PCT公开WO00/13026A1和PCT公开WO 01/19841A1，这些文献中关于能量转移染料的结构、能量转移染料的合成、能量转移染料的连接、可选的给体染料、可选的受体染料和能量转移染料的光谱性质方面的所有内容通过参考结合于此。
在一些实施方式中，适用于本发明的连接部分可包括以下结构：
Figure A20058003103800451
其中，羰基可以与给体染料或受体染料共价连接，R11可以是与羰基碳原子连接的包括以下的部分：未取代烯、取代烯、未取代二烯、取代二烯、未取代三烯、取代三烯、未取代炔、取代炔、具有至少一个不饱和键的未取代五元或六元环、具有至少一个不饱和键的取代五元或六元环、或者未取代或取代的稠合环，R12是包括能够使连接部分与给体染料或受体染料连接的官能团的部分，这样给体染料和受体染料都得到表示。
可用作连接部分中R11的合适的五元环或六元环的例子包括，但不限于：环戊烯、环己烯、环戊二烯、环己二烯、呋喃、噻吩、吡咯、吡唑、异咪唑、吡喃、吡喃酮、苯、吡啶、哒嗪、嘧啶、三嗪、吡嗪和噁嗪。稠环结构的例子包括，但不限于，茚、苯并呋喃、硫萘、吲哚和萘。在一些实施方式中，连接部分具有以下结构：
Figure A20058003103800461
在一些实施方式中，连接部分在X1-X2、R1-R3或R7-R10之一的位置与本发明的染料连接。在一些实施方式中，连接部分可以是键。其它合适的连接部分包括多核苷酸、核糖核酸等。
在一些实施方式中，给体或受体染料中的一种是依据本发明的染料，而另一种染料可以是花青、酞菁、方菁(squaraine)、氟硼二吡咯(bodipy)、荧光素、若丹明、延伸若丹明(extended rhodamine)或二苯并若丹明(dibenzorhodamine)染料。
可与本发明的能量转移染料一起使用的合适的染料的例子包括，但不限于，5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、若丹明绿(R110)、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、N，N’-二乙基-2’，7’-二甲基-5-羧基-若丹明(5-R6G)、N，N’-二乙基-2’，7’-二甲基-6-羧基若丹明(6-R6G)、N，N，N’，N’-四甲基-5-羧基若丹明(5-TAMRA)、N，N，N’，N’-四甲基-5-羧基若丹明(6-TAMRA)、5-羧基-X-若丹明(5-ROX)、6-羧基-X-若丹明(6-ROX)、5-羧基-2’，4’，5’，7’，-4，7-六氯荧光素、6-羧基-2’，4’，5’，7’，4，7-六氯-荧光素、5-羧基-2’，7’-二羧基-4’，5’-二氯荧光素、6-羧基-2’，7’-二羧基-4’，5’-二氯-荧光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、1’，2’-苯并-4’-氟代-7’，4，7-三氯-5-羧基荧光素、1’，2’-苯并-4’-氟代-7’，4，7-三氯-6-羧基-荧光素、1’，2’，7’，8’-二苯并-4，7-二氯-5-羧基荧光素，以及表2中所示的其它可商购染料。
荧光染料   吸收(nm)   发射(nm) 消光系数
  5-荧光素   495   520   73000
  5-羧基荧光素(5-FAM)   495   520   83000
  6-羧基荧光素(6-FAM)   495   520   83000
  6-羧基六氯荧光素(6-HEX)   535   556   73000
  6-羧基四氯荧光素(6-TET)   521   536   73000
  JOE   520   548   73000
  LightCycler Red 640   625   640
  LightCycler Red 705   685   705
  Oregon Green 488   496   516   76000
  Oregon Green 500   499   519   84000
  Oregon Green 514   506   526   85000
  BODIPY FL-X   504   510   70000
  BODIPY FL   504   510   70000
  BODIPY-TMR-X   544   570   56000
  BODIPY R6G   528   547   70000
  BODIPY 650/665   650   665   101000
  BODIPY 564/570   563   569   142000
  BODIPY 581/591   581   591   136000
  BODIPY TR-X   588   616   68000
  BODIPY 630/650   625   640   101000
  BODIPY 493/503   500   509   79000
  5-羧基若丹明6G   524   557   102000
  5(6)-羧基四甲基若丹明(TAMRA)   546   576   90000
  6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)   544   576   90000
  5(6)-羧基-X-若丹明(ROX)   576   601   82000
  6-羧基-X-若丹明(ROX)   575   602   82000
  AMCA-X(Coumarin)   353   442   19000
  Texas Red-X   583   603   116000
  若丹明红-X   560   580   129000
  Marina Blue   362   459   19000
  Pacific Blue   416   451   37000
  若丹明绿-X   503   528   74000
  7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸   432   472   56000
  7-甲氧基香豆素-3-羧酸   358   410   26000
  Cy3   552   570   150000
  Cy3B   558   573   130000
  Cy5   643   667   250000
  Cy5.5   675   694   250000
  DY-505   505   530   85000
  DY-550   553   578   122000
  DY-555   555   580   100000
  DY-610   606   636   140000
  DY-630   630   655   120000
  DY-633   630   659   120000
  DY-636   645   671   120000
  DY-650   653   674   77000
  DY-675   674   699   110000
  DY-676   674   699   84000
  DY-681   691   708   125000
  DY-700   702   723   96000
  DY-701   706   731   115000
  DY-730   734   750   113000
  DY-750   747   776   45700
  DY-751   751   779   220000
  DY-782   782   800   102000
  Cy3.5   581   596   150000
  EDANS   336   490   5700
  WellRED D2-PA   750   770   170000
  WellRED D3-PA   685   706   224000
  WellRED D4-PA   650   670   203000
  芘(Pyrene)   341   377   43000
  Cascade Blue   399   423   30000
  Cascade Yellow   409   558   24000
  PyMPO   415   570   26000
  Lucifer Yellow   428   532   11000
  NBD-X   466   535   22000
  羧基萘并荧光素   598   668   42000
  Alexa Fluor 350   346   442   19000
  Alexa Fluor 405   401   421   35000
  Alexa Fluor 430   434   541   16000
  Alexa Fluor 488   495   519   71000
  Alexa Fluor 532   532   554   81000
  Alexa Fluor 546   556   573   104000
  Alexa Fluor 555   555   565   150000
  Alexa Fluor 568   578   603   91300
  Alexa Fluor 594   590   617   73000
  Alexa Fluor 633   632   647   100000
  Alexa Fluor 647   650   665   239000
  Alexa Fluor 660   663   690   132000
  Alexa Fluor 680   679   702   184000
  Alexa Fluor 700   702   723   192000
  Alexa Fluor 750   749   775   240000
  Oyster 556   556   570   155000
  Oyster 645   645   666   250000
  Oyster 656   656   674   220000
  5(6)-羧基曙红   521   544   95000
  赤藓红   529   544   90000
表2
在一些方式中，本发明提供包括以下结构的标记核苷和/或核苷酸：
NUC-L-D
其中，NUC包括核苷、核苷酸、改性核苷或改性核苷酸，L包括键或连接部分，D包括本发明的染料化合物。在一些实施方式中，NUC和D可以通过连接部分L连接，其中L可以通过X1-X2、R1-R3或R7-R10中的任何一个与D连接。在一些实施方式中，如果NUC包括嘌呤碱，连接部分可以与嘌呤的8-位连接，如果NUC包括7-脱氮嘌呤碱，连接部分可以与7-脱氮嘌呤的7-位连接，如果NUC包括嘧啶碱，则连接部分可以与嘧啶的5-位连接。这类核苷和核苷酸试剂可特别用于标记通过酶合成所形成的多核苷酸，例如使用在PCR增扩、桑格型多核苷酸测序和切口平移反应中的核苷酸三磷酸。
应理解，可通过已知的标记技术中的任何一种，使用已知的连接部分、连接基和相关的互补官能团来实现核苷的标记。一般来说，连接部分应该具有以下特点：(i)不干扰寡核苷酸靶向杂交，(ii)与相关酶(例如聚合酶、连接酶等)相容和(iii)对染料的荧光性质没有不利影响。适用于本发明的示例性碱标记方法参见，例如：Gibson等，Nucleic Acids Research，15：6455-6467(1987)；Gebeyehu等，Nucleic Acids Research，15：4513-4535(1987)；Haralambidis等，Nucleic Acids Research，15：4856-4876(1987)；Nelson等，Nucleosides and Nucleotides，5(3)：233-241(1986)；Bergstrom等，JACS，111：374-375(1989)和美国专利4,855,225、5,231,191和5,449,767。
在一些实施方式中，合适的连接部分可以是炔类酰氨基或烯类酰氨基，其中染料和核苷或核苷酸碱之间的结合可以通过例如染料的活性N-羟基丁二酰亚胺(NHS)酯与核苷或核苷酸的炔氨基或烯氨基衍生的碱反应而形成。
在一些实施方式中，标记的核苷或核苷酸可以包括以下结构：
Figure A20058003103800501
在一些实施方式中，标记的核苷或核苷酸可以包括以下结构：
其中，X可以是
Figure A20058003103800503
n是1-5；
Figure A20058003103800504
n是1-5；
Figure A20058003103800505
和
Figure A20058003103800506
其中R1可以是-H或低级烷基；R2可以是-H，低级烷基或保护基团。参见，例如，于1997年4月10日提交的Khan等的美国专利申请序列号08/833,854。
例如，Hobbs等在欧洲专利0 251 786 B1中，以及Hobbs等在J.Org.Chem.，54：3420(1989)中描述了炔氨基衍生的核苷的合成。简而言之，炔氨基衍生的核苷酸可通过以下步骤形成：将合适的卤代二脱氧核苷(通常如Hobbs等描述的5-碘嘧啶和7-碘-7-脱氮嘌呤二脱氧核苷(如上所述))和Cu(I)放入到烧瓶中，用氩气吹扫，以除去空气，加入干燥DMF，然后加入炔基胺、三乙胺和Pd(0)。将反应混合物搅拌几小时，或者搅拌到薄层色谱显示卤代二脱氧核苷消耗完毕。当使用未保护的炔基胺时，可通过浓缩反应混合物，并采用硅胶色谱通过含有氢氧化铵的洗脱溶剂进行纯化，而将炔氨基-核苷分离，洗脱溶剂中含有氢氧化铵，以中和偶联反应中形成的氢卤化物。当使用经过保护的炔基胺时，可以向反应混合物中加入甲醇/二氯甲烷，然后加入碳酸氢盐形式的强碱性阴离子交换树脂。将该浆料搅拌约45分钟，过滤，用另外的甲醇/二氯甲烷冲洗树脂。合并的滤液可以浓缩，并通过快速色谱在硅胶上使用甲醇-二氯甲烷梯度进行梯度纯化。可通过标准技术得到三磷酸。
在一些实施方式中，本发明的核苷和/或核苷酸可包括天然糖(即-核糖、2’-脱氧核糖等)或糖的类似物。文中所用的术语“糖的类似物”指核糖的类似物。示例性的核糖类似物包括，但不限于，具有多于或少于5个环原子的取代或未取代呋喃糖(例如赤藓糖和己糖)和取代或未取代的3-6碳非环糖。典型的取代呋喃糖和非环糖是其中一个或多个碳原子被一个或多个相同或不同的以下基团取代的糖：-R、-OR、-NRR或卤素，其中各R独立地是-H、(C1-C6)烷基或(C1-C14)芳基。具有5个环原子的取代呋喃糖的例子包括，但不限于：2′-脱氧核糖、2′-(C1-C6)烷基核糖、2′-(C1-C6)烷氧基核糖、2′-(C5-C14)芳氧基核糖、2′，3′-二脱氧核糖、2′，3′-二脱氢核糖、2′-脱氧-3′-卤代核糖、2′-脱氧-3′-氟代核糖、2′-脱氧-3′-氯核糖、2′-脱氧-3′-氨基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷基核糖、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷氧基核糖、2′-脱氧-3′-(C5-C14)芳氧基核糖、3′-(C1-C6)烷基核糖-5′-三磷酸、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷基核糖-5′-三磷酸、2′-脱氧-3′-(C1-C6)烷氧基核糖-5’-三磷酸、2′-脱氧-3′-(C5-C14)芳氧基核糖-5′-三磷酸、2′-脱氧-3′-卤代核糖-5′-三磷酸、2′-脱氧-3′-氨基核糖-5′-三磷酸、2′，3′-二脱氧核糖-5′-三磷酸或2′，3′-二脱氢核糖-5′-三磷酸。其它糖类似物还包括具有以下结构的锁定核酸(LNA)：
Figure A20058003103800521
以及Wengel等在WO 99/14226中描述的糖类似物，该专利文献通过参考结合于此。
在一些实施方式中，本发明的核苷和/或核苷酸可以具有以下结构：
Figure A20058003103800522
其中B包括核苷或核苷酸碱，诸如尿嘧啶，胞嘧啶，脱氮腺嘌呤或脱氮鸟苷；W1和W2可以独立地是-OH或能够阻断聚合酶介导的模板指导聚合反应的基团，例如-H、氟等；W3可以是OH，或一磷酸、二磷酸或三磷酸，或磷酸类似物；D是本发明的染料化合物。在一些实施方式中，本发明的核苷酸可以是具有以下结构的二脱氧核苷酸三磷酸：
Figure A20058003103800523
如果存在缔合的抗衡离子，则还包括该这些抗衡离子。
标记的二脱氧核苷酸，例如上述的那些，可特别用作利用荧光检测的桑格型DNA测序方法中的链终止剂。
在一些实施方式中，本发明的核苷酸可以是具有以下结构的脱氧核苷酸三磷酸：
Figure A20058003103800531
如果存在缔合的抗衡离子，则还包括这些抗衡离子。
标记的二脱氧核苷酸，例如上述的那些，可特别用作例如聚合酶链式反应或切口平移中标记聚合酶延伸产物的试剂。
在一些实施方式中，本发明提供用至少一种本发明的染料标记的多核苷酸。这类标记的多核苷酸可用于许多重要应用中，包括作为DNA测序引物、PCR引物、寡核苷酸杂交探针、寡核苷酸连接探针等。
在一些实施方式中，本发明的标记的多核苷酸可包括设置的多种染料，这样在给体染料和受体染料之间就可以发生荧光能量转移。这类多染料能量转移多核苷可用作光谱可调节测序引物，参见例如Ju等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4347-4351(1995)，或作为探针，参见例如Lee等，Nucleic AcidsResearch，21：3761-3766(1993)。
标记的多核苷酸可通过酶合成，例如使用DNA聚合酶或连接酶(参见，例如Stryer，Biochemistry，第24章，W.H.Freeman and Company(1981))，或通过化学合成，例如通过亚磷酰胺法、亚磷酸三酯法等方法来合成(参见，例如，Gait，Oligonucleotide Synthesis，IRL Press(1990))。标记物可以在酶合成的过程中通过上述经过标记的核苷酸三磷酸单体引入，或者在化学合成中通过上述经过标记的非核苷酸或核苷酸亚磷酰胺引入，或者在合成后引入。
一般来说，如果使用酶合成来制备标记的多核苷酸，则可以使用以下步骤。模板DNA变性，寡核苷酸引物与模板DNA退火。将脱氧核苷酸三磷酸的混合物加入到包括dGTP、dATP、dCTP和dTTP的混合物中，至少一部分的脱氧核苷酸用上述本发明的染料化合物进行标记。然后，在聚合酶呈活性的条件下加入聚合酶。通过在聚合酶介导的链合成过程中结合经过标记的脱氧核苷酸来形成标记的多核苷酸。在另一个酶合成方法中，使用两种引物来替代一种引物，这两种引物中一种与靶标的(+)链互补，另一种与靶标的(-)链互补，聚合酶是热稳定的聚合酶，反应温度在变性温度和延伸温度之间循环，从而通过PCR指数合成靶序列的标记互补物，参见，例如PCR Protocols，Innis等编辑，Academic Press(1990)。
可使用亚磷酰胺法化学合成标记的多核苷酸。用于通过亚磷酰胺法形成多核苷酸的化学方法的详细说参明见以下文献：例如Caruthers等，美国专利4,458,066和4,415,732；Caruthers等，Genetic Engineering，4：1-17(1982)；Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers，第6-1至6-22页，Applied Biosystems，Part No.901237(1991)。
在一些实施方式中，合成多核苷酸的亚磷酰胺法是有利的，因为该方法是有效且快速的偶联反应，并且原料稳定。用附着在固体载体上的生长多核苷酸链进行上述合成，这样液相的过量试剂容易通过过滤除去，从而不需要在两次合成循环之间进行纯化步骤。
以下简单描述通过亚磷酰胺方法进行的典型多核苷酸合成循环的步骤。首先，用酸(例如三氟乙酸)处理包括保护的核苷酸单体的固体载体，以除去5’-羟基保护基团，使羟基游离出来用于之后的偶联反应。然后通过向反应中同时加入保护的亚磷酰胺核苷单体和弱酸(例如，四唑)形成活性中间体。弱酸使亚磷酰胺的氮质子化，形成活性中间体。在30秒内完成核苷加成。然后，进行加帽步骤，终止任何未进行核苷加成的多核苷酸链。可用乙酸酐和1-甲基咪唑完成加帽步骤。然后使用碘作为优选的氧化剂、水作氧给体通过氧化反应将核苷酸间连键从亚磷酸转化为更稳定的磷酸三酯。在氧化反应后，用质子酸(例如三氟乙酸或二氟乙酸)除去羟基保护基团，重复上述循环，直至链延长完成。在合成后，使用碱(例如，氢氧化铵或叔丁胺)将多核苷酸链从载体上分裂。分裂反应也除去任何磷酸保护基团，诸如氰乙基。最后，通过用多核苷酸的碱溶液在较高的温度(例如，55℃)进行处理来除去碱的环外胺上的保护基团和染料上的羟基保护基团。本领域技术人员将意识到许多试剂可用于进行上述合成，在一些情况中，一些试剂在单次反应中可用于不止一个步骤。
任何亚磷酰胺核苷单体可以是上述染料标记的亚磷酰胺。如果核苷酸的5’-端位被标记，则本发明的标记非核苷酸亚磷酰胺可用在最后的缩合步骤中。如果寡核苷酸的内位被标记，则本发明的标记核苷酸亚磷酰胺可使用在任何缩合步骤中。
在合成后，可以在许多位置标记多核苷酸，包括：5’-端位，参见例如Oligonucleotides and Analogs，Eckstein编辑，第8章，IRL Press(1991)、Orgel等，Nucleic Acids Research 11(18)：6513(1983)和美国专利5,118,800；磷酸二酯主链，参见例如Oligonucleotides and Analogs，Eckstein编辑，第9章，IRLPress(1991)；或3’-端位，参见例如Nelson，Nucleic Acids Research 20(23)：6253-6259、美国专利5,401,837和5,141,813。关于寡核苷酸标记方法的全面综述参见R.Haugland，Excited States of Biopolymers，Steiner编辑，PlenumPress，NY(1983)。
在一种合成后的化学标记方法中，可以按照以下步骤标记寡核苷酸。通过约1当量的1，3-二环己基碳二亚胺与约3当量的N-羟基丁二酰亚胺在干燥乙酸乙酯中在室温下反应3小时，而使包括羧基连接基的染料转化为N-羟基丁二酰亚胺酯。用5％HCl洗涤该反应混合物，用硫酸镁干燥，过滤，浓缩至固体，将该固体重新悬浮在DMSO中。然后如美国专利4,757,141中所描述的，将过量(10-20x)的DMSO染料加入到在pH9.4的0.25M碳酸氢盐/碳酸盐缓冲液中的氨己基衍生的寡核苷酸中，反应6小时。通过使反应物通过尺寸排阻色谱柱，用缓冲液(例如，0.1摩尔乙酸三乙胺(TEAA))洗脱，将染料标记的寡核苷酸与未反应的染料分离。用反相HPLC通过梯度洗脱对含有粗制的标记寡核苷酸的部分进一步纯化。
应理解，以下实施例仅仅是说明性的，不旨在以任何方式限制本发明。尽管上述足以指导本领域技术人员如何实施本发明，但是给出以下实施例进一步指导本领域技术人员。
在一些实施方式中，本发明提供一种混合物，该混合物包含至少一种文中所述任何形式的本发明化合物和至少一种包括荧光染料的其它组分。例如，本发明提供多核苷酸的混合物，混合物中至少一种多核苷酸包含本发明的化合物，至少一种其它多核苷酸包含荧光染料。包含本发明荧光染料的混合物组分可以通过文中所述的任何方法制备。在一些实施方式中，本发明提供包含至少一种为文中所述任何形式的本发明化合物的试剂盒。
实施例
材料和方法
除非另有指示，所有试剂来自Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)，并以收到货品的形式使用。按照Corey，P.F.在美国专利4,810,636中的描述制备DDAO(1)。使用Bruker 400MHz Avance-NMR Spectrometer(分光计)得到NMR光谱。使用Applied Biosystems API 1500 Mass Spectrometer(质谱仪)得到质谱数据。使用Perkin Elmer LS-50B LuminescenceSpectrophotometer(发光分光光度计)得到荧光数据。使用Hewlett Packard8451A Diode Array Spectrophotometer(二极管阵列分光光度计)得到UV/Vis数据。
实施例1：6-硫代-DDAO(42)的合成
向冷却到0℃的50毫克DDAO(41)溶解在5毫升二氯甲烷(DCM)中的搅拌中的溶液中加入0.5毫升氯磺酸。将该反应在60℃搅拌过夜，然后倒入冰水中。用乙酸乙酯(EtOAc)萃取未反应的原料，然后用正丁醇萃取产物。在真空下除去溶剂，得到45毫克黑色的光亮晶体6-硫代-DDAO(42)。1HNMR(CD3OD)：δ7.9(s，1H)，7.75(s，1H)，7.2(s，1H)，1.78(s，6H).MS：M+H＝388。
实施例2：N-(4-羧基苯甲酰基)-氨基甲基DDAO(45)的合成
Figure A20058003103800571
在室温下，向搅拌中的450毫克DDAO(1.466毫摩尔)在10毫升浓硫酸(H2SO4)中的溶液中加入419毫克N-(羟基甲基)三氟乙酰胺(2.929毫摩尔)。将所得混合物在室温下搅拌2小时。将反应物倒入100毫升冰水中，用4×100毫升10％甲醇/二氯甲烷(MeOH/DCM)进行萃取。有机层用硫酸钠(Na2SO4)进行干燥，过滤，在减压下蒸发到干燥。通过硅胶色谱使用2∶20∶78至8∶20∶72的MeOH/乙酸乙酯(EtOAc)/DCM的梯度纯化剩余物，得到456毫克红色固态的化合物43。1H NMR(DMSO-d6)：δ11.4(br s，1H，OH)，9.95(t，1H，NH)，7.82(s，1H)，7.34(s，1H)，7.03(s，1H)，4.35(d，2H)，1.78(s，6H).MS：(ESI)M-H＝431.2。
将64毫克化合物43(0.148毫摩尔)在30毫升NH3/MeOH中的溶液在室温下搅拌20小时。通过蒸发和与MeOH共蒸发将反应物浓缩至干燥。用MeOH/DCM将固体重结晶，得到化合物44。
在室温下，在搅拌条件下向化合物44在6毫升二甲基甲酰胺(DMF)/DCM(1∶1)中的溶液中加入118毫克4-羧乙基对苯二甲酰氯(0.594毫摩尔)和0.2毫升二异丙基乙基胺。将所得混合物在室温下搅拌3小时。然后加入10毫升饱和碳酸氢钠水溶液(NaHCO3)和0.5毫升甲醇钠/MeOH(25％)溶液猝灭反应。然后用20毫升H2O稀释反应混合物，用1×50毫升EtOAc进行萃取。有机层用Na2SO4干燥，过滤，在减压下蒸发。然后用氢氧化锂(LiOH)/MeOH/H2O(177毫克/20毫升/5毫升)的溶液在80℃对剩余物处理45分钟。然后使反应冷却到室温，在减压下蒸发，再溶解到30毫升H2O中，用1.5毫升10％的HCl酸化，用100毫升EtOAc萃取。有机层用Na2SO4进行干燥，过滤，在减压下蒸发到干燥。用硅胶色谱纯化剩余物(使用1∶9至8∶2MeOH/DCM的梯度)，得到52毫克固体化合物45。1H NMR(DMSO-d6)：δ 8.84(t，1H，NH)，8.00(d，2H)，7.34(m，3H)，6.97(s，1H)，6.52(s，1H)，4.24(d，2H)，1.70(s，6H).MS：(ESI)M+H＝485.0。
实施例3：6，8-二硝基-DDAO(46)的合成
将50毫克DDAO溶解在2毫升1∶1的H2SO4/HNO3溶液中形成的溶液在室温下搅拌过夜。用EtOAc萃取反应物。在真空下除去溶剂，用EtOH重结晶粗制产物，得到41毫克二硝基-DDAO(46)。
实施例4：N-(4-羧基-2-硫代苯甲酰基)-氨基甲基DDAO(47)的合成
Figure A20058003103800582
按照与实施例2相同的方法制备化合物43。将43.3毫克化合物43(0.1毫摩尔)在20毫升NH3/MeOH中的溶液在室温下搅拌20小时。通过蒸发和与DCM共蒸发将反应物浓缩到干燥，得到化合物44。
将剩余物(44)溶解在5毫升DMF中，用200微升二异丙基乙基胺(Hunig碱)和74毫克酸酐48(0.324毫摩尔)在室温下进行处理。将反应在室温下搅拌3小时，用1mL 10％HCl猝灭。在真空下除去溶剂，将剩余物再溶解于50毫升H2O中，用3×50mL 10％MeOH/EtOAc萃取。有机层用Na2SO4干燥，过滤，蒸发至干燥。
用20毫升LiOH·H2O/MeOH/H2O(0.85克/100毫升/20毫升)溶液在室温下对剩余物处理10分钟。用1毫升10％HCl酸化混合物，用50毫升NaCl饱和水溶液稀释。用2×100毫升10％MeOH/EtOAc萃取混合物，然后用0.5毫升三乙胺处理有机层，蒸发至干燥，最后与MeOH共蒸发。将粗产物溶解于50毫升20％MeOH/DCM中，通过硅胶色谱纯化(2×17.5厘米，洗脱剂梯度：20％，30％，50％，60％，70％和80％MeOH/DCM(每个洗脱步骤各100毫升，收集20毫升馏分))，得到60毫克化合物47。1H NMR(在MeOD中)：δ8.52(d，1H)，8.01(dd，1H)，7.71(d，1H)，7.51(s，1H)，7.24(s，1H)，6.69(s，1H)，4.45(s，2H，CH2)，1.82(s，6H，2 x CH3).MS(ESI)m/e 563.2(计算值为M-H＝563.0)。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1. 一种化合物，其包括选自以下的结构：
其中，
R1-R3和R6-R16各自独立地选自-H、卤素、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基，其中R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基；和
R4和R5独立地选自C1-C6烷基或C1-C6取代烷基，R4和R5一起形成选自以下的基团：C3-C7环烷基、C4-C7不饱和环烷基、C3-C7取代环烷基或C4-C7取代不饱和环烷基；
前提是，如果该化合物包括结构(I)，则R1、R2、R3或R8中的至少一个不是-H。
2. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R6和R7各自独立地选自卤素、氟、氯或溴。
3. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R6和R7是氟。
4. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R6和R7是氯。
5. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R6和R7是溴。
6. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R6是-H，R7选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2或-CH2NHR。
7. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R6是-H，R7选自-H、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2NH2或-CH2NHR。
8. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R6和R7各自独立地选自卤素、氟、氯或溴，R2选自-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
9. 如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R2 选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
10. 如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R2选自-SO3H或-SO3R。
11. 如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R2选自-CH2NH2或-CH2NHR。
12. 如权利要求8至10中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-SO3H。
13. 如权利要求8至10中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-SO3R。
14. 如权利要求8、9或11中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2NH2。
15. 如权利要求8、9或11中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2NHR。
16. 如权利要求9-11、13或15中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800721
17. 如权利要求9-11、13或15中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
18. 如权利要求1、6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R7是-SO3H，R2是-CH2NH2。
19. 如权利要求1、6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R7是-SO3H，R2是-CH2NHR。
20. 如权利要求19所述的化合物，其特征在于，R是取代的苯甲酰基。
21. 如权利要求19或20所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800731
22. 如权利要求19所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
23. 如权利要求所述的化合物，其特征在于，R1-R3和R6-R16中的至少一个是SO3H。
24. 如权利要求1至23中任一项所述的化合物，其特征在于，R4和R5是甲基。
25. 如权利要求1至24中任一项所述的化合物，其特征在于，R1和R3是-H。
26. 如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R9选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3和R8-R10是-H。
27. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
28. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9选自-SO3H或-SO3R。
29. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9选自-CH2NH2或-CH2NHR。
30. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9是-SO3H。
31. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9是-SO3R。
32. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9是-CH2NH2。
33. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9是-CH2NHR。
34. 如权利要求26-29、31或33中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800741
35. 如权利要求26-29、31或33中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
36. 如权利要求6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R9选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3和R10-R12是-H。
37. 如权利要求36所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R9是-CH2NH2。
38. 如权利要求36所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R9是-CH2NHR。
39. 如权利要求36所述的化合物，其特征在于，R是
40. 如权利要求36所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
41. 如权利要求1至7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R10选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3、R9和R11-R12是-H。
42. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
43. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10选自-SO3H或-SO3R。
44. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10选自-CH2NH2或-CH2NHR。
45. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10是-SO3H。
46. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10是-SO3R。
47. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10是-CH2NH2。
48. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10是-CH2NHR。
49. 如权利要求41-44、46或48中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800751
50. 如权利要求41-44、46或48中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
51. 如权利要求6或7所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R10选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3、R9和R11-R12是-H。
52. 如权利要求51所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R10是-CH2NH2。
53. 如权利要求51所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R10是-CH2NHR。
54. 如权利要求53所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800761
55. 如权利要求53所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
56. 如权利要求1至7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R11选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3、R9-R10和R12是-H。
57. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
58. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11选自-SO3H或-SO3R。
59. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11选自-CH2NH2或-CH2NHR。
60. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11是-SO3H。
61. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11是-SO3R。
62. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11是-CH2NH2。
63. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11是-CH2NHR。
64. 如权利要求56-59、61或63中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800762
65. 如权利要求56-59、61或63中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
66. 如权利要求6或7所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R11选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3、R9-R10和R12是-H。
67. 如权利要求66所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R11是-CH2NH2。
68. 如权利要求66所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R11是-CH2NHR。
69. 如权利要求68所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800771
70. 如权利要求68所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
71. 如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R12选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3和R9-R10是-H。
72. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
73. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12选自-SO3H或-SO3R。
74. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12选自-CH2NH2或-CH2NHR。
75. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12是-SO3H。
76. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12是-SO3R。
77. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12是-CH2NH2。
78. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12是-CH2NHR。
79. 如权利要求71-74、76或78中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800781
80. 如权利要求71-74、76或78中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
81. 如权利要求6或7所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R12选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3和R9-R11是-H。
82. 如权利要求81所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R12是-CH2NH2。
83. 如权利要求81所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R12是-CH2NHR。
84. 如权利要求83所述的化合物，其特征在于，R是
85. 如权利要求83所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
86. 如权利要求26至85中任一项所述的化合物，其特征在于，R9-R12是H。
87. 如权利要求26至86中任一项所述的化合物，其特征在于，R4和R5是甲基。
88. 如权利要求1-5或8中任一项所述的化合物，其特征在于，R2和R3是-NO2，R4和R5是甲基。
89. 如权利要求1、6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(III)，R1和R3是-H。
90. 如权利要求89所述的化合物，其特征在于，R6是-H。
91. 如权利要求89或90所述的化合物，其特征在于，R13、R15和R16是-H。
92. 如权利要求91所述的化合物，其特征在于，R2是-SO3H。
93. 如权利要求91所述的化合物，其特征在于，R2是-H。
94. 如权利要求91至93中任一项所述的化合物，其特征在于，R14是-CH2NH2。
95. 如权利要求91至93中任一项所述的化合物，其特征在于，R14是-CH2NHR。
96. 如权利要求95所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800791
97. 如权利要求95所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
98. 如权利要求92或93所述的化合物，其特征在于，R14是-H。
99. 如权利要求91所述的化合物，其特征在于，R14是-SO3H。
100. 如权利要求91所述的化合物，其特征在于，R14是-H。
101. 如权利要求91或99-100中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2NH2。
102. 如权利要求91或99-100中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2NHR。
103. 如权利要求102所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800801
104. 如权利要求102所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
105. 如权利要求99所述的化合物，其特征在于，R2是-H。
106. 如权利要求89至105中任一项所述的化合物，其特征在于，R4和R5是甲基。
107. 如权利要求1、6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(IV)。
108. 如权利要求107所述的化合物，其特征在于，R10是-SO3H。
109. 如权利要求107所述的化合物，其特征在于，R10是-H。
110. 如权利要求107至109中任一项所述的化合物，其特征在于，R14是-CH2NH2。
111. 如权利要求107至109中任一项所述的化合物，其特征在于，R14是-CH2NHR。
112. 如权利要求111所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A20058003103800802
113.如权利要求111所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
114.如权利要求107所述的化合物，其特征在于，R14是-SO3H。
115.如权利要求107所述的化合物，其特征在于，R14是-H。
116. 如权利要求114或115所述的化合物，其特征在于，R10是-CH2NH2。
117. 如权利要求114或115所述的化合物，其特征在于，R10是-CH2NHR。
118. 如权利要求117所述的化合物，其特征在于，R是
119. 如权利要求117所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
120. 如权利要求107或114所述的化合物，其特征在于，R14是-H。
121. 如权利要求114至120中任一项所述的化合物，其特征在于，R3、R6、R9、R11、R12、R13、R15和R16是-H。
122. 如权利要求114至121中任一项所述的化合物，其特征在于，R4和R5是甲基。
123. 一种能量转移染料，其包括与受体染料共价连接的给体染料，其中所述给体染料能够吸收第一波长的光，并作为响应发射激发能量，所述受体染料能吸收所述给体染料发射的激发能量，并作为响应产生第二波长的荧光，给体染料或受体染料中的一种是如权利要求1至122中任一项所述的化合物。
124. 如权利要求123所述的能量转移染料，其特征在于，所述给体染料与所述受体染料通过连接部分共价连接。
125. 如权利要求124所述的能量转移染料，其特征在于，所述连接部分是非核苷酸型。
126. 如权利要求124所述的能量转移染料，其特征在于，所述连接部分是核苷酸型。
127. 如权利要求123至126中任一项所述的能量转移染料，其特征在于，所述受体染料是包括选自以下的结构的化合物：
Figure A20058003103800821
其中，
R1-R3和R6-R16各自独立地选自-H、卤素、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基，其中R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基；和
R4和R5独立地选自C1-C6烷基或C1-C6取代烷基，R4和R5一起形成选自以下的基团：C3-C7环烷基、C4-C7不饱和环烷基、C3-C7取代环烷基或C4-C7取代不饱和环烷基。
128. 如权利要求127所述的能量转移染料，其特征在于，所述给体染料选自5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、若丹明绿(R110)、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、N，N’-二乙基-2’，7’-二甲基-5-羧基-若丹明(5-R6G)、N，N’-二乙基-2’，7’-二甲基-6-羧基若丹明(6-R6G)、N，N，N’，N’-四甲基-5-羧基若丹明(5-TAMRA)、Cy3、N，N，N’，N’-四甲基-5-羧基若丹明(6-TAMRA)、5-羧基-X-若丹明(5-ROX)、6-羧基-X-若丹明(6-ROX)、5-羧基-2’，4’，5’，7’，-4，7-六氯荧光素、6-羧基-2’，4’，5’，7’，4，7-六氯荧光素、5-羧基-2’，7’-二羧基-4’，5’-二氯-荧光素、6-羧基-2’，7’-二羧基-4’，5’-二氯荧光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、1’，2’-苯并-4’-氟代-7’，4，7-三氯-5-羧基荧光素、1’，2’-苯并-4’-氟代-7’，4，7-三氯-6-羧基荧光素或1’，2’，7’，8’-二苯并-4，7-二氯-5-羧基荧光素。
129. 一种标记的核苷或核苷酸化合物，其包括以下结构：
NUC-L-D
其中NUC包括核苷、核苷酸、改性核苷或改性核苷酸，L包括共价连接NUC和D的键或连接部分，D包括如权利要求1至128中任一项所述的化合物。
130. 如权利要求129所述的标记的核苷或核苷酸化合物，其特征在于，L在选自以下的D上的位置与D连接：X2、R1、R3、R7、R8、R9或R10。
131. 如权利要求129或130所述的标记的核苷或核苷酸化合物，其特征在于，如果NUC包括嘌呤碱基，则连接部分与嘌呤的8-位连接，如果NUC包括7-脱氮嘌呤碱基，则连接部分与7-脱氮嘌呤的7-位连接，如果NUC包括嘧啶碱基，则连接部分与嘧啶的5-位连接。
132. 如权利要求129至131中任一项所述的标记的核苷或核苷酸，其特征在于，NUC包括选自下组的碱：尿嘧啶、胞嘧啶、脱氮腺嘌呤或脱氮鸟苷。
133. 如权利要求129至132中任一项所述的标记的核苷或核苷酸，其特征在于，其包括以下结构：
Figure A20058003103800841
134. 一种多核苷酸测序的方法，该方法包括以下步骤：
i)形成第一类、第二类、第三类和第四类多核苷酸的混合物，使得：
第一类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧腺苷，并用第一染料标记；
第二类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧胞苷，并用第二染料标记；
第三类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧鸟苷，并用第三染料标记；
第四类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧胸苷，并用第四染料标记；
其中所述第一、第二、第三和第四染料中的至少一种是如权利要求1-128中任一项所述的染料化合物；
所述第一、第二、第三和第四染料中的其余染料可通过光谱方法与所述一种或多种染料相区别，并且彼此之间可通过光谱方法相区别；
ii)电泳分离多核苷酸，从而形成类似大小的多核苷酸带；
iii)用能够导致染料发射荧光的照射光束照射所述带；
iv)通过染料的荧光光谱识别所述带中多核苷酸的类别。
135. 如权利要求134所述的方法，其特征在于，所述方法还包括作为内标的第五染料。
136. 一种多核苷酸测序的方法，该方法包括以下步骤：
i)形成包括第一类、第二类、第三类和第四类多核苷酸的混合物，使得：
第一类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧腺苷，并用第一染料标记；
第二类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧胞苷，并用第二染料标记；
第三类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧鸟苷，并用第三染料标记；
第四类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧胸苷，并用第四染料标记；
还包含作为内标的第五染料；
其中第五染料是如权利要求1-128中任一项所述的染料化合物；
所述第一、第二、第三、第四和第五染料中的其余染料可通过光谱方法与所述一种或多种染料相区别，并且彼此之间可通过光谱方法相区别；
ii)电泳分离多核苷酸，从而形成类似大小的多核苷酸带；
iii)用能够导致染料发射荧光的照射光束照射所述带；
iv)通过染料的荧光光谱识别带中多核苷酸的类别。
137. 一种片段分析的方法，该方法包括以下步骤：
i)形成标记的多核苷酸片段，所述片段用如权利要求1-87中任一项的染料化合物标记；
ii)对标记的多核苷酸片段进行根据大小的分离；
iii)在所述分离步骤后，检测标记的多核苷酸片段。
138. 一种标记的多核苷酸，其包括以下结构：
NUC-L-D
其中NUC包括多核苷酸，L包括共价连接NUC和D的键或连接部分，D包括如权利要求1至128中任一项所述的化合物。

Claims (140)

1. 一种化合物，其包括选自以下的结构：
Figure A2005800310380002C1
其中，
R1-R3和R6-R16各自独立地选自-H、卤素、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基，其中R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基；和
R4和R5独立地选自C1-C6烷基或C1-C6取代烷基，R4和R5一起形成选自以下的基团：C3-C7环烷基、C4-C7不饱和环烷基、C3-C7取代环烷基或C4-C7取代不饱和环烷基；
前提是，如果该化合物包括结构(I)，则R1、R2、R3或R8中的至少一个不是-H。
2. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R6和R7各自独立地选自卤素、氟、氯或溴。
3. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R6和R7是氟。
4. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R6和R7是氯。
5. 如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，R6和R7是溴。
6. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R6是-H，R7选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2或-CH2NHR。
7. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R6是-H，R7选自-H、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2NH2或-CH2NHR。
8. 如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R6和R7各自独立地选自卤素、氟、氯或溴，R2选自-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
9. 如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R2选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
10. 如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R2选自-SO3H或-SO3R。
11. 如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R2选自-CH2NH2或-CH2NHR。
12. 如权利要求8至10中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-SO3H。
13. 如权利要求8至10中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-SO3R。
14. 如权利要求8、9或11中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2NH2。
15. 如权利要求8、9或11中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2NHR。
16. 如权利要求9-11、13或15中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380004C1
17. 如权利要求9-11、13或15中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
18. 如权利要求1、6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R7是-SO3H，R2是-CH2NH2。
19. 如权利要求1、6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(I)，R7是-SO3H，R2是-CH2NHR。
20. 如权利要求19所述的化合物，其特征在于，R是取代的苯甲酰基。
21. 如权利要求19或20所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380005C1
22. 如权利要求19所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
23. 如权利要求所述的化合物，其特征在于，R1-R3和R6-R16中的至少一个是SO3H。
24. 如权利要求1至23中任一项所述的化合物，其特征在于，R4和R5是甲基。
25. 如权利要求1至24中任一项所述的化合物，其特征在于，R1和R3是-H。
26. 如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R9选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3和R8-R10是-H。
27. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
28. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9选自-SO3H或-SO3R。
29. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9选自-CH2NH2或-CH2NHR。
30. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9是-SO3H。
31. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9是-SO3R。
32. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9是-CH2NH2。
33. 如权利要求26所述的化合物，其特征在于，R9是-CH2NHR。
34. 如权利要求26-29、31或33中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380006C1
35. 如权利要求26-29、31或33中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
36. 如权利要求6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R9选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3和R10-R12是-H。
37. 如权利要求36所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R9是-CH2NH2。
38. 如权利要求36所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R9是-CH2NHR。
39. 如权利要求36所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380006C2
40. 如权利要求36所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
41. 如权利要求1至7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R10选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3、R9和R11-R12是-H。
42. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
43. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10选自-SO3H或-SO3R。
44. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10选自-CH2NH2或-CH2NHR。
45. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10是-SO3H。
46. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10是-SO3R。
47. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10是-CH2NH2。
48. 如权利要求41所述的化合物，其特征在于，R10是-CH2NHR。
49. 如权利要求41-44、46或48中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380007C1
50. 如权利要求41-44、46或48中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
51. 如权利要求6或7所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R10选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3、R9和R11-R12是-H。
52. 如权利要求51所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R10是-CH2NH2。
53. 如权利要求51所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R10是-CH2NHR。
54. 如权利要求53所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380008C1
55. 如权利要求53所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
56. 如权利要求1至7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R11选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3、R9-R10和R12是-H。
57. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
58. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11选自-SO3H或-SO3R。
59. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11选自-CH2NH2或-CH2NHR。
60. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11是-SO3H。
61. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11是-SO3R。
62. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11是-CH2NH2。
63. 如权利要求56所述的化合物，其特征在于，R11是-CH2NHR。
64. 如权利要求56-59、61或63中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380008C2
65. 如权利要求56-59、61或63中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
66. 如权利要求6或7所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R11选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3、R9-R10和R12是-H。
67. 如权利要求66所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R11是-CH2NH2。
68. 如权利要求66所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R11是-CH2NHR。
69. 如权利要求68所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380009C1
70. 如权利要求68所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
71. 如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R12选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3和R9-R10是-H。
72. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12选自-SO3H、-SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2。
73. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12选自-SO3H或-SO3R。
74. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12选自-CH2NH2或-CH2NHR。
75. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12是-SO3H。
76. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12是-SO3R。
77. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12是-CH2NH2。
78. 如权利要求71所述的化合物，其特征在于，R12是-CH2NHR。
79. 如权利要求71-74、76或78中任一项所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380010C1
80. 如权利要求71-74、76或78中任一项所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
81. 如权利要求6或7所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(II)，R12选自-H、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR或-NO2，R3和R9-R11是-H。
82. 如权利要求81所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R12是-CH2NH2。
83. 如权利要求81所述的化合物，其特征在于，R7是-SO3H，R12是-CH2NHR。
84. 如权利要求83所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380010C2
85. 如权利要求83所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
86. 如权利要求26至85中任一项所述的化合物，其特征在于，R9-R12是H。
87. 如权利要求26至86中任一项所述的化合物，其特征在于，R4和R5是甲基。
88. 如权利要求1-5或8中任一项所述的化合物，其特征在于，R2和R3是-NO2，R4和R5是甲基。
89. 如权利要求1、6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(III)，R1和R3是-H。
90. 如权利要求89所述的化合物，其特征在于，R6是-H。
91. 如权利要求89或90所述的化合物，其特征在于，R13、R15和R16是-H。
92. 如权利要求91所述的化合物，其特征在于，R2是-SO3H。
93. 如权利要求91所述的化合物，其特征在于，R2是-H。
94. 如权利要求91至93中任一项所述的化合物，其特征在于，R14是-CH2NH2。
95. 如权利要求91至93中任一项所述的化合物，其特征在于，R14是-CH2NHR。
96. 如权利要求95所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380011C1
97. 如权利要求95所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
98. 如权利要求92或93所述的化合物，其特征在于，R14是-H。
99. 如权利要求91所述的化合物，其特征在于，R14是-SO3H。
100. 如权利要求91所述的化合物，其特征在于，R14是-H。
101. 如权利要求91或99-100中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2NH2。
102. 如权利要求91或99-100中任一项所述的化合物，其特征在于，R2是-CH2NHR。
103. 如权利要求102所述的化合物，其特征在于，R是
104. 如权利要求102所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
105. 如权利要求99所述的化合物，其特征在于，R2是-H。
106. 如权利要求89至105中任一项所述的化合物，其特征在于，R4和R5是甲基。
107. 如权利要求1、6或7中任一项所述的化合物，其特征在于，所述化合物包括结构(IV)。
108. 如权利要求107所述的化合物，其特征在于，R10是-SO3H。
109. 如权利要求107所述的化合物，其特征在于，R10是-H。
110. 如权利要求107至109中任一项所述的化合物，其特征在于，R14是-CH2NH2。
111. 如权利要求107至109中任一项所述的化合物，其特征在于，R14是-CH2NHR。
112. 如权利要求111所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380012C2
113. 如权利要求111所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
114. 如权利要求107至109中任一项所述的化合物，其特征在于，R14是-H。
115. 如权利要求107至114中任一项所述的化合物，其特征在于，R3、R6、R9、R11、R12、R13、R15和R16是-H。
114. 如权利要求107所述的化合物，其特征在于，R14是-SO3H。
115. 如权利要求107所述的化合物，其特征在于，R14是-H。
116. 如权利要求114或115所述的化合物，其特征在于，R10是-CH2NH2。
117. 如权利要求114或115所述的化合物，其特征在于，R10是-CH2NHR。
118. 如权利要求117所述的化合物，其特征在于，R是
Figure A2005800310380013C1
119. 如权利要求117所述的化合物，其特征在于，R是连接基。
120. 如权利要求107或114所述的化合物，其特征在于，R14是-H。
121. 如权利要求114至120中任一项所述的化合物，其特征在于，R3、R6、R9、R11、R12、R13、R15和R16是-H。
122. 如权利要求114至121中任一项所述的化合物，其特征在于，R4和R5是甲基。
123. 一种能量转移染料，其包括与受体染料共价连接的给体染料，其中所述给体染料能够吸收第一波长的光，并作为响应发射激发能量，所述受体染料能吸收所述给体染料发射的激发能量，并作为响应产生第二波长的荧光，给体染料或受体染料中的一种是如权利要求1至122中任一项所述的化合物。
124. 如权利要求123所述的能量转移染料，其特征在于，所述给体染料与所述受体染料通过连接部分共价连接。
125. 如权利要求124所述的能量转移染料，其特征在于，所述连接部分是非核苷酸型。
126. 如权利要求124所述的能量转移染料，其特征在于，所述连接部分是核苷酸型。
127. 如权利要求123至126中任一项所述的能量转移染料，其特征在于，所述受体染料是包括选自以下的结构的化合物：
Figure A2005800310380014C1
其中，
R1-R3和R6-R16各自独立地选自-H、卤素、氟、氯、溴、芳基、取代芳基、杂芳基、-CO2H、-CO2R、-SO3H、-SO3R、-CH2CO2H、-CH2CO2R、-CH2SO3H、-CH2SO3R、-CH2NH2、-CH2NHR、-NO2、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基，其中R选自C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、取代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧基芳基、取代的C1-C6烷氧基芳基、苯基、取代苯基、联苯基、取代联苯基、苄基、取代苄基、苯甲酰基、取代苯甲酰基、键或连接基；和
R4和R5独立地选自C1-C6烷基或C1-C6取代烷基，R4和R5一起形成选自以下的基团：C3-C7环烷基、C4-C7不饱和环烷基、C3-C7取代环烷基或C4-C7取代不饱和环烷基。
128. 如权利要求127所述的能量转移染料，其特征在于，所述给体染料选自5-羧基荧光素(5-FAM)、6-羧基荧光素(6-FAM)、若丹明绿(R110)、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、N，N’-二乙基-2’，7’-二甲基-5-羧基-若丹明(5-R6G)、N，N’-二乙基-2’，7’-二甲基-6-羧基若丹明(6-R6G)、N，N，N’，N’-四甲基-5-羧基若丹明(5-TAMRA)、Cy3、N，N，N’，N’-四甲基-5-羧基若丹明(6-TAMRA)、5-羧基-X-若丹明(5-ROX)、6-羧基-X-若丹明(6-ROX)、5-羧基-2’，4’，5’，7’，-4，7-六氯荧光素、6-羧基-2’，4’，5’，7’，4，7-六氯荧光素、5-羧基-2’，7’-二羧基-4’，5’-二氯-荧光素、6-羧基-2’，7’-二羧基-4’，5’-二氯荧光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、1’，2’-苯并-4’-氟代-7’，4，7-三氯-5-羧基荧光素、1’，2’-苯并-4’-氟代-7’，4，7-三氯-6-羧基荧光素或1’，2’，7’，8’-二苯并-4，7-二氯-5-羧基荧光素。
129. 一种标记的核苷或核苷酸化合物，其包括以下结构：
NUC-L-D
其中NUC包括核苷、核苷酸、改性核苷或改性核苷酸，L包括共价连接NUC和D的键或连接部分，D包括如权利要求1至128中任一项所述的化合物。
130. 如权利要求129所述的标记的核苷或核苷酸化合物，其特征在于，L在选自以下的D上的位置与D连接：X2、R1、R3、R7、R8、R9或R10。
131. 如权利要求129或130所述的标记的核苷或核苷酸化合物，其特征在于，如果NUC包括嘌呤碱基，则连接部分与嘌呤的8-位连接，如果NUC包括7-脱氮嘌呤碱基，则连接部分与7-脱氮嘌呤的7-位连接，如果NUC包括嘧啶碱基，则连接部分与嘧啶的5-位连接。
132. 如权利要求129至131中任一项所述的标记的核苷或核苷酸，其特征在于，NUC包括选自下组的碱：尿嘧啶、胞嘧啶、脱氮腺嘌呤或脱氮鸟苷。
133. 如权利要求129至132中任一项所述的标记的核苷或核苷酸，其特征在于，其包括以下结构：
134. 一种多核苷酸测序的方法，该方法包括以下步骤：
i)形成第一类、第二类、第三类和第四类多核苷酸的混合物，使得：
第一类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧腺苷，并用第一染料标记；
第二类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧胞苷，并用第二染料标记；
第三类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧鸟苷，并用第三染料标记；
第四类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧胸苷，并用第四染料标记；
其中所述第一、第二、第三和第四染料中的至少一种是如权利要求1-128中任一项所述的染料化合物；
所述第一、第二、第三和第四染料中的其余染料可通过光谱方法与所述一种或多种染料相区别，并且彼此之间可通过光谱方法相区别；
ii)电泳分离多核苷酸，从而形成类似大小的多核苷酸带；
iii)用能够导致染料发射荧光的照射光束照射所述带；
iv)通过染料的荧光光谱识别所述带中多核苷酸的类别。
135. 如权利要求134所述的方法，其特征在于，所述方法还包括作为内标的第五染料。
136. 一种多核苷酸测序的方法，该方法包括以下步骤：
i)形成包括第一类、第二类、第三类和第四类多核苷酸的混合物，使得：
第一类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧腺苷，并用第一染料标记；
第二类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧胞苷，并用第二染料标记；
第三类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧鸟苷，并用第三染料标记；
第四类中的各多核苷酸包括3’-端位二脱氧胸苷，并用第四染料标记；
还包含作为内标的第五染料；
其中第五染料是如权利要求1-128中任一项所述的染料化合物；
所述第一、第二、第三、第四和第五染料中的其余染料可通过光谱方法与所述一种或多种染料相区别，并且彼此之间可通过光谱方法相区别；
ii)电泳分离多核苷酸，从而形成类似大小的多核苷酸带；
iii)用能够导致染料发射荧光的照射光束照射所述带；
iv)通过染料的荧光光谱识别带中多核苷酸的类别。
137. 一种片段分析的方法，该方法包括以下步骤：
i)形成标记的多核苷酸片段，所述片段用如权利要求1-87中任一项的染料化合物标记；
ii)对标记的多核苷酸片段进行根据大小的分离；
iii)在所述分离步骤后，检测标记的多核苷酸片段。
138. 一种标记的多核苷酸，其包括以下结构：
NUC-L-D
其中NUC包括多核苷酸，L包括共价连接NUC和D的键或连接部分，D包括如权利要求1至128中任一项所述的化合物。
CNA2005800310384A 2004-09-16 2005-09-16 荧光染料化合物，共轭物及其应用 Pending CN101258220A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61111904P 2004-09-16 2004-09-16
US60/611,119 2004-09-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101258220A true CN101258220A (zh) 2008-09-03

Family

ID=35455743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2005800310384A Pending CN101258220A (zh) 2004-09-16 2005-09-16 荧光染料化合物，共轭物及其应用

Country Status (8)

Country Link
US (4) US7256292B2 (zh)
EP (2) EP1802727B1 (zh)
JP (2) JP2008513579A (zh)
CN (1) CN101258220A (zh)
AU (1) AU2005287078A1 (zh)
CA (1) CA2581174A1 (zh)
SG (1) SG155923A1 (zh)
WO (1) WO2006034036A1 (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7570443B2 (en) 2003-09-19 2009-08-04 Applied Biosystems, Llc Optical camera alignment
EP1802727B1 (en) * 2004-09-16 2018-04-04 Life Technologies Corporation Fluorescent dye compounds, conjugates and uses thereof
US20080066549A1 (en) * 2006-09-18 2008-03-20 Oldham Mark F Methods, systems and apparatus for light concentrating mechanisms
US20080293127A1 (en) * 2007-05-22 2008-11-27 Applera Corporation Method to Render Pressure Sensitive Adhesive Compatible with Polymerase Chain Reaction Systems
US8652442B2 (en) 2008-11-03 2014-02-18 Washington University Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo, methods, compositions and apparatuses therefor
WO2010063732A1 (en) * 2008-12-01 2010-06-10 Biotype Ag Novel combination of fluorescent dyes for the detection of nucleic acids
GB201012417D0 (en) * 2010-07-23 2010-09-08 Cambridge Entpr Ltd Capilary electrophoresis of carbohydrates
WO2012092403A1 (en) * 2010-12-29 2012-07-05 Life Technologies Corporation Ddao compounds as fluorescent reference standards
TWI485145B (zh) 2012-10-26 2015-05-21 Ind Tech Res Inst Ｐ型有機半導體材料與光電元件
EP3802526A1 (en) 2018-05-29 2021-04-14 ELITechGroup, Inc. Carborhodamine compounds and methods of preparation thereof
US20220002716A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Life Technologies Corporation Trinucleotide cap analogs, preparation and uses thereof

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4711955A (en) 1981-04-17 1987-12-08 Yale University Modified nucleotides and methods of preparing and using same
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US4757141A (en) 1985-08-26 1988-07-12 Applied Biosystems, Incorporated Amino-derivatized phosphite and phosphate linking agents, phosphoramidite precursors, and useful conjugates thereof
US4855225A (en) 1986-02-07 1989-08-08 Applied Biosystems, Inc. Method of detecting electrophoretically separated oligonucleotides
US5047519A (en) 1986-07-02 1991-09-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Alkynylamino-nucleotides
EP0459536B1 (en) 1986-12-09 1996-09-04 Bayer Corporation Chromogenic acridinone enzyme substrates
US4810636A (en) 1986-12-09 1989-03-07 Miles Inc. Chromogenic acridinone enzyme substrates
US5231191A (en) 1987-12-24 1993-07-27 Applied Biosystems, Inc. Rhodamine phosphoramidite compounds
DE3912046B4 (de) * 1988-09-02 2004-03-25 Carnegie Mellon University Verfahren zum Markieren einer Komponente einer wäßrigen Flüssigkeit und lumineszenzphotostabiles Reaktionsprodukt
US5141813A (en) 1989-08-28 1992-08-25 Clontech Laboratories, Inc. Multifunctional controlled pore glass reagent for solid phase oligonucleotide synthesis
US5393615A (en) * 1994-02-03 1995-02-28 Miles Inc. Mediators suitable for the electrochemical regeneration of NADH, NADPH or analogs thereof
DE69519783T2 (de) 1994-04-29 2001-06-07 Perkin Elmer Corp Verfahren und vorrichtung zur echtzeiterfassung der produkte von nukleinsäureamplifikation
US6008373A (en) 1995-06-07 1999-12-28 Carnegie Mellon University Fluorescent labeling complexes with large stokes shift formed by coupling together cyanine and other fluorochromes capable of resonance energy transfer
US5728528A (en) 1995-09-20 1998-03-17 The Regents Of The University Of California Universal spacer/energy transfer dyes
US5863727A (en) 1996-05-03 1999-01-26 The Perkin-Elmer Corporation Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
US5853992A (en) 1996-10-04 1998-12-29 The Regents Of The University Of California Cyanine dyes with high-absorbance cross section as donor chromophores in energy transfer labels
JP4236812B2 (ja) 1997-09-12 2009-03-11 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチド類似体
US6583168B1 (en) * 1997-11-25 2003-06-24 Applera Corporation Sulfonated diarylrhodamine dyes
GB2341189B (en) 1998-08-31 2001-06-13 Amersham Pharm Biotech Inc Energy transfer dyes
ES2199605T3 (es) * 1998-12-14 2004-02-16 Vertex Pharmaceuticals (San Diego) Llc Indicadores moleculares opticos de actividad del citocromo p450.
CA2382063A1 (en) 1999-09-17 2001-03-22 Shiv Kumar Charge-modified nucleic acid terminators
US6465644B1 (en) * 2000-05-02 2002-10-15 Applera Corporation Sulfonated [8,9] benzophenoxazine dyes and the use of their labelled conjugates
JP2003064083A (ja) * 2001-08-23 2003-03-05 Fuji Photo Film Co Ltd ２，３，３−トリメチル−３Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−５−スルホン酸およびその誘導体
US7223541B2 (en) 2001-08-29 2007-05-29 Ge Healthcare Bio-Sciences Corp. Terminal-phosphate-labeled nucleotides and methods of use
US7052839B2 (en) * 2001-08-29 2006-05-30 Amersham Biosciences Corp Terminal-phosphate-labeled nucleotides and methods of use
CA2457513C (en) * 2001-08-29 2013-07-23 Amersham Biosciences Corp Labeled nucleoside polyphosphates
US7033762B2 (en) * 2001-08-29 2006-04-25 Amersham Biosciences Corp Single nucleotide amplification and detection by polymerase
WO2003020603A1 (en) * 2001-09-06 2003-03-13 Robert John Galway Collapsible packing boxes
EP1654372A4 (en) * 2001-09-19 2010-11-10 Life Technologies Corp TRANSPARENT FLUORESCENT SUBSTRATES VIA A MEMBRANE
CA2433473A1 (en) 2002-07-23 2004-01-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Fluorescent hybridization probes with reduced background
AU2003268322B2 (en) * 2002-08-29 2009-07-16 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Allele specific primer extension
EP1546354B1 (en) * 2002-08-29 2010-05-05 Amersham Biosciences Corp. Analyte detection
US6855503B2 (en) 2002-12-20 2005-02-15 Amersham Biosciences Corp Heterocyclic FRETdye cassettes for labeling biological molecules and their use in DNA sequencing
JP2006513705A (ja) * 2003-02-05 2006-04-27 アマシャム・バイオサイエンス・コーポレイション 核酸増殖
EP1802727B1 (en) * 2004-09-16 2018-04-04 Life Technologies Corporation Fluorescent dye compounds, conjugates and uses thereof
US20100227327A1 (en) 2008-08-08 2010-09-09 Xiaoliang Sunney Xie Methods and compositions for continuous single-molecule nucleic acid sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides
CN102648415A (zh) 2009-08-25 2012-08-22 生命技术公司 定量荧光蛋白标准品
WO2012092403A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Life Technologies Corporation Ddao compounds as fluorescent reference standards

Also Published As

Publication number Publication date
EP2371927B1 (en) 2020-03-11
EP1802727A1 (en) 2007-07-04
JP2008513579A (ja) 2008-05-01
SG155923A1 (en) 2009-10-29
EP1802727B1 (en) 2018-04-04
US20090093062A1 (en) 2009-04-09
US9745336B2 (en) 2017-08-29
EP2371927A1 (en) 2011-10-05
US20140303003A1 (en) 2014-10-09
US8729267B2 (en) 2014-05-20
CA2581174A1 (en) 2006-03-30
US7985602B2 (en) 2011-07-26
US20110250699A1 (en) 2011-10-13
US20060167257A1 (en) 2006-07-27
US7256292B2 (en) 2007-08-14
AU2005287078A1 (en) 2006-03-30
JP2009041027A (ja) 2009-02-26
WO2006034036A1 (en) 2006-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1212457B1 (en) Uv excitable fluorescent energy transfer dyes
CN101258220A (zh) 荧光染料化合物，共轭物及其应用
US6713622B1 (en) 4,7-dichlororhodamine dye labeled polynucleotides
EP0915935B1 (en) 4,7-dichlororhodamine dyes
EP0805190A2 (en) Energy transfer dyes with enhanced fluorescence
CA2426121A1 (en) Atropisomers of asymmetric xanthene fluorescent dyes and methods of dna sequencing and fragment analysis
CA2429816A1 (en) Sulfonated diarylrhodamine dyes as fluorescent labels
US20090093623A1 (en) 4,7-dichlororhodamine dyes
US6218124B1 (en) Method for detecting oligonucleotides using UV light source

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20080903