JP6226318B2 - 光学分割用化合物、光学分割用試薬、光学分割する方法及び光学異性体 - Google Patents

光学分割用化合物、光学分割用試薬、光学分割する方法及び光学異性体 Download PDF

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Description

本発明は光学分割用化合物、光学分割用試薬、光学分割する方法及び光学異性体に関する。
従来、高等動物の生体中に存在するアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸のみであると考えられてきた。しかしながら、近年、分析技術の発展により、生体内にもＤ−アミノ酸が存在していることがわかった。
生体内のアミノ酸の生理的役割を解明する観点から、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を利用して、アミノ酸（例えば、非特許文献１−３参照）やＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸を精密に定量する分析手法（例えば、非特許文献４参照）の開発研究が進められている。
K．Shimbo etc．，Anal．Chem．，2009，81，5172−5179 K．Shimbo etc．，Rapid Commun．Mass Spectrom．，2009，23，1483−1492 S．A．Cohen etc．，Anal．Biochem．，1993，211，279−287 R．J．Reischl etc．，J．Chromatogra．A．，2012，1269，262−269
しかしながら、非特許文献１乃至非特許文献４に記載された光学分割方法では、光学分割能及び感度が低いという問題点を有していた。また、分析試料を作成するために、アミノ酸の光学異性体混合物と光学分割用化合物とを、熱を印加しながら比較的長い時間反応させる必要があった。
上記課題に対して、高感度で簡便にアミノ酸の光学異性体混合物を光学分割できる、光学分割用化合物を提供することを目的とする。
構造式（１）
Figure 0006226318
 又は
構造式（２）
Figure 0006226318
 である、光学分割用化合物が提供される。
本発明の一実施形態によれば、高感度で簡便にアミノ酸の光学異性体混合物を光学分割できる、光学分割用化合物を提供できる。
本実施形態に係る光学分割用化合物の合成スキームの一例である。 本実施形態に係る光学分割用化合物の合成スキームの他の例である。 本実施形態に係る光学分割用化合物を使用した、光学分割する方法の一例のフロー図である。 本実施形態に係る光学分割用化合物を使用した、ＨＰＬＣ−ＦＤ分析の結果の一例である。 本実施形態に係る光学分割用化合物を使用した、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果の一例である。 本実施形態に係る光学分割用化合物の効果の一例を説明するための概略図である。 本実施形態に係る光学分割用化合物の効果の他の例を説明するための概略図である。 本実施形態に係る光学分割用化合物の効果の他の例を説明するための概略図である。
以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書では主に、光学分割対象物として、アミノ酸を用いる実施形態について説明するが、本発明の光学分割用化合物は、アミン、アルコール、チオール、カルボン酸等の他の光学分割対象物であっても、高感度に光学分割することができる。
（光学分割用化合物）
本発明者らは、ＨＰＬＣ法によるアミノ酸等の光学分割技術において、下記構造式（１）又は構造式（２）で表される化合物を含む光学分割用試薬（又は光学分割用キット）を用いてアミノ酸の光学異性体混合物を誘導体化することにより、アミノ酸の光学分割能が著しく良好になることを見出した。
Figure 0006226318
Figure 0006226318
 構造式（１）又は構造式（２）の化合物を用いてアミノ酸を誘導体化することにより、ＨＰＬＣ法の光学分割能が向上する理由の詳細については調査中である。しかしながら、これらの化合物を用いて誘導体化することにより、得られるアミノ酸誘導体は、ＨＰＬＣ法により高感度で光学分割可能である。また、上述の構造式（１）又は構造式（２）の化合物は、短時間でアミノ酸を誘導体化可能であり、得られるアミノ酸誘導体は、優れた熱安定性及び光安定性を有することがわかった。
（構造式１の光学分割用化合物の合成例）
図１に、本実施形態に係る光学分割用化合物の合成スキームの一例を示す。下記に、図１を参照して、構造式（１）の光学分割用化合物の具体的な合成例について、説明する。
ｐ−アニシジン２．４５部に、エトキシメチレンマロン酸ジエチル４．３２部を加え、オイルバスを用いて窒素気流化、１１０℃で２時間加熱攪拌した。次に、ジフェニルエーテル２０ｍｌを加え、マントルヒータを用いて１時間還流した。室温まで放冷後、反応溶液にヘキサンを加えて析出物を濾取し、得られた生成物をアセトンで洗浄した。
この生成物に１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を１５ｍｌ加えて１時間還流した。反応溶液を塩酸水溶液で酸性にした後、析出物を濾取し、得られた生成物を水で洗浄した。
次に、この生成物にジフェニルエーテルを２０ｍｌ加え、マントルヒータを用いて窒素気流化で１．５時間還流した。室温まで放冷後、反応溶液にヘキサンを加えて析出物を濾取し、得られた生成物をアセトンで洗浄することにより、白色の粉末を得た（Ｓ１００）。得られた粉末は、１Ｈ ＮＭＲによって、６−メトキシキノリン４（１Ｈ）−オン（６−ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎ−４（１Ｈ）−ｏｎｅ）であると同定された。なお、本明細書において１Ｈ ＮＭＲは、４００メガヘルツ（ＭＨｚ）の電界強度で実施した。
なお、１Ｈ ＮＭＲの測定結果は、１Ｈ ＮＭＲ（dmso）：δ3．817(3H，s)，5．975(1H，d，J=7．6Hz)，7．270(1H，dd，J=3．2，9．2Hz)，7．477(1H，s)，7．492(1H，d，J=5．6Hz)，7．818(1H，s)，11．676(1H，s)であった。
得られた６−メトキシキノリン４（１Ｈ）−オン５２６部、水酸化カリウム１０７部及び炭酸エチレン７９８部を、Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５ｍｌに溶解させ、オイルバスを用いて窒素気流化、１３０℃で終夜加熱攪拌した。反応終了後、反応溶液中の溶媒を減圧除去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒； クロロホルム：メタノール＝２０：１→１０：１）で分取し、白色粉末を得た（Ｓ１１０）。得られた粉末は、１Ｈ ＮＭＲによって、１−（２−ヒドロキシエチル）−６−メトキシキノリン−４（１Ｈ）−オン（１−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−６−ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎ−４（１Ｈ）−ｏｎｅ）であると同定された。なお、１−（２−ヒドロキシエチル）−６−メトキシキノリン−４（１Ｈ）−オンの白色粉末は、純度を高めるために、クロロホルム又はエタノールを用いて再結晶化処理し、針状結晶として次工程に供することが好ましい。
なお、１Ｈ ＮＭＲの測定結果は、１Ｈ ＮＭＲ（dmso）：δ3．695(2H，q，J=5．6，5．2Hz)，3．835(3H，s)，4．270(2H，t，J=5．2Hz)，4．926(1H，t，J=5．2Hz)，5．981(1H，d，J=7．6Hz)，7．318(1H，dd，J=2．8，9．4Hz)，7．599(1H，d，J=3．6Hz)，7．708(1H，d，J=9．6Hz)，7．824(1H，d，J=7．6Hz)であった。
炭酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）１質量部をジクロロメタン１０ｍｌに溶解させ、ピリジンを２ｍｌ加えた。その後、予めジクロロメタンに溶解させた１−（２−ヒドロキシエチル）−６−メトキシキノリン−４（１Ｈ）−オンを、この溶液に１時間かけて滴下した後、終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を０．１Ｍの塩酸、飽和食塩水で洗浄し、有機層を硫酸マグネシウムにより乾燥させた。硫酸マグネシウムを濾別した後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒； クロロホルム：メタノール＝３０：１）で分取し、白色粉末を得た（Ｓ１２０）。得られた粉末は、１Ｈ ＮＭＲによって、２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２−（６−メトキシ−４−オキソキノリン−１（４Ｈ）−イル）エチル）炭酸塩（２，５−ｄｉｏｘｏｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎ−１−ｙｌ（２−（６−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｏｘｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−１（４Ｈ）−ｙｌ）ｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂｏｎａｔｅ）であると同定された。
なお、１Ｈ ＮＭＲの測定結果は、１Ｈ ＮＭＲ（CD3CN）：δ2．716(4H，s)，3．882(3H，s)，4．499(2H，t，J=5，5．2Hz)，4．644(2H，t，J=4．8，5Hz)，6．060(1H，d，J=7．6Hz)，7．324(1H，dd，J=3．2，9．2Hz)，7．562(1H，d，J=9．6Hz)，7．655(1H，d，J=7．6Hz)，7．707(1H，d，J=2．8Hz)であった。
（構造式２の光学分割用化合物の合成例）
図２に、本実施形態に係る光学分割用化合物の合成スキームの他の例を示す。下記に、図２を参照して、前述の構造式（２）の光学分割用化合物の具体的な合成例について、説明する。
６−メトキシキノリン−４（１Ｈ）−オン５００．５質量部、炭酸カリウム６１１．１質量部及びエチルブロモアセテート５００μＬを、ＤＭＦ５ｍｌに溶解させ、終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液にクロロホルムを加えて濾別し、得られた生成物を硫酸マグネシウムで乾燥した。
硫酸マグネシウムを濾別した後、有機溶媒を減圧除去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒； クロロホルム：メタノール＝１５：１→１０：１）で分取し、白色粉末を得た（Ｓ２００）。得られた粉末は、１Ｈ ＮＭＲによって、エチル２−（６−メトキシ−４−オキソキノリン−１（４Ｈ）−イル）アセテート（ｅｔｈｙｌ ２−（６−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｏｘｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−１（４Ｈ）−ｙｌ）ａｃｅｔａｔｅ）であると同定された。
なお、１Ｈ ＮＭＲの測定結果は、１Ｈ ＮＭＲ（dmso）：δ1．196(3H，t，J=7．6Hz)，3．836(3H，s)，4．159(2H，dd，J=7．2，14Hz)，5．178(2H，s)，6．039(1H，d，J=7．6Hz)，7．318(1H，dd，J=2．8，9．2Hz)，7．433(1H，d，J=9．2Hz)，7．587(1H，d，J=3．2Hz)，7．871(1H，d，J=7．6Hz)であった。
得られたエチル２−（６−メトキシ−４−オキソキノリン−１（４Ｈ）−ｙｌ）アセテート６５０質量部を、１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液５ｍＬに溶解させ、終夜攪拌した。反応終了後、反応溶液を３Ｍの塩酸を加えて析出物を濾取した後、水で洗浄して、白色粉末を得た（Ｓ２１０）。得られた粉末は、１Ｈ ＮＭＲによって、２−（６−メトキシ−４−オキソキノリン−１（４Ｈ）−イル）酢酸（２−（６−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｏｘｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−１（４Ｈ）−ｙｌ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）であると同定された。
なお、１Ｈ ＮＭＲの測定結果は、１Ｈ ＮＭＲ（dmso）：δ3．835(3H，s)，5．062(2H，s)，6．024(1H，d，J=7．6Hz)，7．324(1H，dd，J=3．2，9．4Hz)，7．439(1H，d，J=9．2Hz)，7．587(1H，d，J=2．8Hz)，7．873(1H，d，J=7．6Hz)，13．304(1H，s)であった。
得られた２−（６−メトキシ−４−オキソキノリン−１（４Ｈ）−イル）酢酸１０１質量部を、塩化チオニル７００μＬに溶解させ、０℃で２時間攪拌した。反応終了後、塩化チオニルを減圧除去した後、ヘキサンを加えて析出物を濾取し、黄色粉末を得た（Ｓ２２０）。得られた粉末は、１Ｈ ＮＭＲによって、２−（６−メトキシ−４−オキソキノリン−１（４Ｈ）−イル）酢酸塩化物（２−（６−ｍｅｔｈｏｘｙ−４−ｏｘｏｑｕｉｎｏｌｉｎ−１（４Ｈ）−ｙｌ）ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）であると同定された。
なお、１Ｈ ＮＭＲの測定結果は、１Ｈ ＮＭＲ（dmso）：δ3．893(3H，s)，5．338(2H，s)，6．611(1H，d，J=7．2Hz)，7．520(1H，dd，J=2．8，9．4Hz)，7．631(1H，d，J=3．2Hz)，7．720(1H，d，J=9．6Hz)，8．310(1H，d，J=7．2Hz)であった。
（光学分割する方法）
次に、本実施形態の光学分割用化合物を用いて、アミノ酸の光学異性体混合物を光学分割する方法について、説明する。
図３に、本実施形態に係る光学分割用化合物を使用した、光学分割する方法の一例のフロー図を示す。
本実施形態に係る光学分割する方法は、
光学分活用試薬と光学異性体混合物を混合して、光学異性体混合物の誘導体を得る、第１の工程（Ｓ３００）と、
前記誘導体を、カラムクロマトグラフィーを用いて各々の光学異性体に分離する、第２の工程（Ｓ３１０）と、
を含む。
Ｓ３００の第１の工程では、光学分活用試薬と光学異性体混合物を混合して、光学異性体混合物の誘導体を得る。
混合方法としては、特に制限はなく、例えば、室温で１分間程度混合して反応させることで、アミノ酸誘導体とすることができる。従来の光学分割用試薬を使用する場合、分析試料を作成するために、アミノ酸と光学分割用化合物とを、熱を印加しながら長時間反応させる必要があった。しかしながら、本実施形態の光学分割用化合物を使用する場合、室温で１分程度混合することでアミノ酸誘導体を得ることができ、簡便な方法であると言える。
次に、Ｓ３１０の第２の工程では、第１の工程で得られた光学異性体混合物を、カラムクロマトグラフィーを用いて、各々の光学異性体に分離する。
カラムクロマトグラフィーにおけるカラムとしては、従来の市販のカラムを使用することができる。
次に、具体的な実施形態を挙げて、本発明をより詳細に説明する。
（第１の実施形態）
第１の実施形態では、上述した構造式（１）の光学分割用化合物を用いたアミノ酸誘導体が、従来のカラムを用いたＨＰＬＣ分析によって、光学分割能良く光学分割可能であることを確認した実施形態について説明する。
本実施形態の光学分割用化合物は、測定対象のアミノ酸を含む溶液中に添加し、室温で１分間程度反応させることで、ＨＰＬＣ測定用のアミノ酸誘導体とすることができる。
具体的には、所定の濃度、例えば５０μＭ、１００μＭ又は１２５μＭ等の濃度のアミノ酸溶液１０μｌに対して、４０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８）を１０μＬ、上述の構造式（１）の光学分割用化合物の溶液５μｌ（濃度４０ｍＭ）を加えて、ボルテックスミキサで１分間混合することにより、アミノ酸を誘導体化することができる。
第１の実施形態では、１００μＭ又は１２５μＭ等の濃度のアミノ酸溶液１０μｌに対して、４０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８）を１０μＬ、上述の式（１）の光学分割用化合物の溶液５μｌ（濃度４０ｍＭ）を加えて、ボルテックスミキサで１分間混合して、アミノ酸を誘導体化した。得られたアミノ酸誘導体含有溶液に、０．５％のトリフルオロ酢酸水溶液を４７５μＬ添加して反応を停止させ、ＨＰＬＣ分析用の試料を作成した。得られた試料０．１μＬに対して、ＨＰＬＣ分析を施した。蛍光分析については励起波長２４３ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍとし、質量分析については例えばアラニンでは質量電荷比（Ｍ／Ｚ） ３３５のプリカーサイオンから生成するＭ／Ｚ １１４のプロダクトイオンを質量分析した。
ＨＰＬＣ分析の分析条件としては、
カラム：ＱＮ−１ＡＸ（１．５ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ）、
流速：２００μＬ／ｍｉｎ、
温度：２５℃、
移動相１（ＭＰ１）：０．０２％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相２（ＭＰ２）：０．０５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相３（ＭＰ３）：０．２％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相４（ＭＰ４）１０ｍＭギ酸アンモニウム メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相５（ＭＰ５）：０．５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
とした。
表１に、各アミノ酸と移動相の種類と、ＨＰＬＣ分析による溶出時間と、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の溶出順と、分離係数αとをまとめたものを示す。
Figure 0006226318
表１より明らかであるように、本実施形態の光学分割用化合物により誘導体化されたアミノ酸は、その種類（例えば、中性アミノ酸、酸性アミノ酸、疎水性アミノ酸、含硫アミノ酸、塩基性アミノ酸等）に関らず、分離係数αが１．０７以上であった。
また、本実施形態の光学分割用化合物を用いた光学分割する方法の検出限界は、注入量あたりフェムトモル（ｆｅｍｔ ｍｏｌ）オーダ〜アトモル（ａｔｔｏ ｍｏｌ）オーダであり、従来の方法と比較して、非常に高感度であった。
以上、本実施形態の光学分割用化合物を使用してアミノ酸誘導体を作成し、これをＨＰＬＣ分析することで、簡便な方法で、高い分離能かつ高い検出感度で、アミノ酸の光学異性体混合物を光学分割可能であることがわかった。
（第２の実施形態）
また、本実施形態の光学分割用化合物の効果が、カラムの種類に依存せず、他の従来のカラムでも適用可能であることを実証した実施形態について、説明する。
ＨＰＬＣ分析の分析条件を下記に変更し、アミノ酸の種類を一部変更した以外は、第１の実施形態と同様の方法により、所定のアミノ酸を光学分割した。
ＨＰＬＣ分析の分析条件としては、
カラム：ＱＤ−１ＡＸ（１．５ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ）、
流速：２００μＬ／ｍｉｎ、
温度：２５℃、
移動相１（ＭＰ１）：０．０２％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相２（ＭＰ２）：０．０５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相３（ＭＰ３）：０．２５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相４（ＭＰ４）：０．０３２％ギ酸を含む１０ｍＭ ギ酸アンモニウム メタノール／アセトニトリル＝２０／８０、
移動相５（ＭＰ５）：０．５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相６（ＭＰ６）：１％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
とした。
表２に、各アミノ酸と移動相の種類と、ＨＰＬＣ分析による溶出時間と、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の溶出順と、分離係数αとをまとめたものを示す。
Figure 0006226318
また、ＨＰＬＣ分析の分析条件を下記に変更し、アミノ酸の種類を一部変更した以外は、第１の実施形態と同様の方法により、所定のアミノ酸を光学分割した。
ＨＰＬＣ分析の分析条件としては、
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−３２００Ｓ（１．５ｍｍ ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）、
流速：２００μＬ／ｍｉｎ、
温度：２５℃、
移動相１（ＭＰ１）：０．０５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相２（ＭＰ２）：０．１％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相３（ＭＰ３）：０．０５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相４（ＭＰ４）：０．２５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
とした。
表３に、各アミノ酸と移動相の種類と、ＨＰＬＣ分析による溶出時間と、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の溶出順と、分離係数αとをまとめたものを示す。
Figure 0006226318
さらに、ＨＰＬＣ分析の分析条件を下記に変更し、アミノ酸の種類を一部変更した以外は、第１の実施形態と同様の方法により、所定のアミノ酸を光学分割した。
ＨＰＬＣ分析の分析条件としては、
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−４７００ＳＲ（１．５ｍｍ ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）、
流速：２００μＬ／ｍｉｎ、
温度：２５℃、
移動相１（ＭＰ１）：０．０２％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相２（ＭＰ２）：０．０５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
とした。
表４に、各アミノ酸と移動相の種類と、ＨＰＬＣ分析による溶出時間と、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の溶出順と、分離係数αとをまとめたものを示す。
Figure 0006226318
さらに、ＨＰＬＣ分析の分析条件を下記に変更し、アミノ酸の種類を一部変更した以外は、第１の実施形態と同様の方法により、所定のアミノ酸を光学分割した。
ＨＰＬＣ分析の分析条件としては、
カラム：ＫＳＡＡＣＳＰ−００１Ｓ（１．５ｍｍ ｉ．ｄ．×２５０ｍｍ）、
流速：２００μＬ／ｍｉｎ、
温度：２５℃、
移動相１（ＭＰ１）：０．０５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相２（ＭＰ２）：０．１％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
移動相３（ＭＰ３）：５ｍＭギ酸アンモニウムメタノール溶液（流速：１５０μＬ／ｍｉｎ）、
とした。
表５に、各アミノ酸と移動相の種類と、ＨＰＬＣ分析による溶出時間と、Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸の溶出順と、分離係数αとをまとめたものを示す。
Figure 0006226318
表１及び、表２乃至表５の結果から明らかであるように、本実施形態の光学分割用化合物により誘導体化されたアミノ酸は、カラムの種類やアミノ酸の種類に関らず、分離係数αが１以上であった。
以上、本実施形態の光学分割用化合物を使用してアミノ酸誘導体を作成し、これを従来のカラムを使用してＨＰＬＣ分析することで、簡便な方法で、高い分離能かつ高い検出感度で、アミノ酸の光学異性体混合物を光学分割可能であることがわかった。
（第３の実施形態）
第３の実施形態では、上述した構造式（２）の光学分割用化合物を用いたアミノ酸誘導体が、従来のカラムを用いたＨＰＬＣ分析によって、光学分割可能であることを確認した実施形態について説明する。
光学分割用化合物として、構造式（２）の化合物を使用した以外は、第１の実施形態と同様の方法により、アラニンを誘導体化した。
得られた試料０．１μＬに対して、ＨＰＬＣ分析を施した。蛍光分析については励起波長２４３ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍとし、質量分析については質量電荷比（Ｍ／Ｚ） ３０５のプリカーサイオンから生成するＭ／Ｚ ２５９のプロダクトイオンを質量分析した。
ＨＰＬＣ分析の分析条件としては、
カラム：ＱＮ−ＡＸ（１．５ｍｍ ｉ．ｄ．×１５０ｍｍ）、
流速：２００μＬ／ｍｉｎ、
温度：２５℃、
移動相：０．０５％ギ酸 メタノール／アセトニトリル＝５０／５０、
とした。
図４に、ＨＰＬＣ−ＦＬ分析の結果の一例を示し、図５に、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析の結果の一例を示す。図４の横軸は溶出時間を意味し、縦軸は蛍光強度を意味する。また、図５の縦軸は溶出時間を意味し、縦軸はイオン強度を意味する。また、図４及び図５においては、Ｌ体又はＤ体のみを同様の分析に供した場合の結果を併せて示した。
図４及び図５より明らかであるように、いずれの分析結果においても、本実施形態の光学分割用化合物を使用することにより、光学異性体混合物を完全分離可能であることがわかった。
また、本実施形態の光学分割用化合物を用いた光学分割する方法の検出限界は、注入量あたりフェムトモル（ｆｅｍｔ ｍｏｌ）オーダ〜アトモル（ａｔｔｏ ｍｏｌ）オーダであり、従来の方法と比較して、非常に高感度であった。
以上、本実施形態の光学分割用化合物を使用してアミノ酸誘導体を作成し、これをＨＰＬＣ分析することで、簡便な方法で、高い分離能かつ高い検出感度で、アミノ酸の光学異性体混合物を光学分割可能であることがわかった。
（第４の実施形態）
アミノ酸を誘導体化してＨＰＬＣ分析する技術分野において、アミノ酸を短時間で容易に誘導体化することは、非常に重要である。第４の実施形態では、本実施形態の光学分割用化合物が、アミノ酸を短時間で誘導体化可能であることを確認した実施形態について、説明する。
５０μＭの濃度のＬ−アラニン溶液１０μｌに対して、４０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８）を１０μＬ、上述の構造式（１）の光学分割用化合物の溶液５μｌ（濃度４０ｍＭ）を加えた。この溶液を、ボルテックスミキサで１、２、５又は１０分間混合して、アミノ酸を誘導体化した。得られたアミノ酸誘導体含有溶液に、０．５％のトリフルオロ酢酸水溶液を４７５μＬ添加して反応を停止させ、ＨＰＬＣ分析用の試料を作成した。また、比較の実施形態として、ボルテックスミキサによる混合を経由せずに、０．５％のトリフルオロ酢酸水溶液を４７５μＬ加えてＨＰＬＣ分析用の試料を作成した。
得られた試料０．１μＬに対して、第１の実施形態と同様にＨＰＬＣ分析を施した。蛍光分析については励起波長２４３ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍとし、質量分析については質量電荷比（Ｍ／Ｚ） ３３５のプリカーサイオンから生成するＭ／Ｚ １１４のプロダクトイオンを質量分析した。
図６に、本実施形態に係る光学分割用化合物の効果の一例を説明するための概略図を示す。図６の横軸は、光学分割用化合物とＬ−アラニンとの混合時間であり、縦軸は、Ｌ−アラニン誘導体由来のピーク高さ（μＶ）である。
図６に示されるように、混合時間が０分の試料と１分乃至１０分の試料との間では、ピーク高さの変化が見受けられたが、混合時間が１分乃至１０分の試料間では、ピーク高さの変化がほとんど見受けられなかった。このことから、本実施形態の光学分割用化合物は、アミノ酸と１分程度混合するだけで、アミノ酸を誘導体化することができることがわかった。
（第５の実施形態）
第５の実施形態では、本実施形態の光学分割用化合物とアミノ酸とを反応させて得られたアミノ酸誘導体が、優れた熱安定性を有することを確認した実施形態について、説明する。
５０μＭの濃度のＬ−アラニン溶液１０μｌに対して、４０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８）を１０μＬ、上述の構造式（１）の光学分割用化合物の溶液５μｌ（濃度４０ｍＭ）を加えた。この溶液を、ボルテックスミキサで１分間混合して、アミノ酸を誘導体化した。得られたアミノ酸誘導体含有溶液に、０．５％のトリフルオロ酢酸水溶液を４７５μＬ加えてＨＰＬＣ分析用の試料を作成した。
得られたＨＰＬＣ分析用の試料５０μｌを、予め５０℃に設定されたアルミヒータを用いて、５、１０、２０、３０又は６０分加熱した。加熱後の試料０．１μＬに対して、第１の実施形態と同様にＨＰＬＣ分析を施した。蛍光分析については励起波長２４３ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍとし、質量分析については質量電荷比（Ｍ／Ｚ） ３３５のプリカーサイオンから生成するＭ／Ｚ １１４のプロダクトイオンを質量分析した。
図７に、本実施形態に係る光学分割用化合物の効果の他の例を説明するための概略図を示す。図７の横軸は、Ｌ−アラニン誘導体の加熱時間であり、縦軸は、Ｌ−アラニン誘導体由来のピーク高さ（μＶ）である。
図７に示されるように、本実施形態の加熱時間の範囲では、Ｌ−アラニン誘導体の減少は確認されなかった。このことから、本実施形態の光学分割用化合物を使用して得られたアミノ酸誘導体は、優れた熱安定性を有することがわかった。
（第６の実施形態）
第６の実施形態では、本実施形態の光学分割用化合物とアミノ酸とを反応させて得られたアミノ酸誘導体が、優れた光安定性を有することを確認した実施形態について、説明する。
５０μＭの濃度のＬ−アラニン溶液１０μｌに対して、４０ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８）を１０μＬ、上述の構造式（１）の光学分割用化合物の溶液５μｌ（濃度４０ｍＭ）を加えた。この溶液を、ボルテックスミキサで１分間混合して、アミノ酸を誘導体化した。得られたアミノ酸誘導体含有溶液に、０．５％のトリフルオロ酢酸水溶液を４７５μＬ加えてＨＰＬＣ分析用の試料を作成した。
得られたＨＰＬＣ分析用の試料を、蛍光灯による光照射下で、０．５、１、２、３、５時間静置した。静置後の試料０．１μＬに対して、第１の実施形態と同様にＨＰＬＣ分析を施した。蛍光分析については励起波長２４３ｎｍ、蛍光波長３８０ｎｍとし、質量分析については質量電荷比（Ｍ／Ｚ） ３３５のプリカーサイオンから生成するＭ／Ｚ １１４のプロダクトイオンを質量分析した。
図８に、本実施形態に係る光学分割用化合物の効果の他の例を説明するための概略図を示す。図８の横軸は、Ｌ−アラニン誘導体の加熱時間であり、縦軸は、Ｌ−アラニン誘導体由来のピーク高さ（μＶ）である。
図８に示されるように、本実施形態の照射強度及び照射時間の範囲では、Ｌ−アラニン誘導体の減少は確認されなかった。このことから、本実施形態の光学分割用化合物を使用して得られたアミノ酸誘導体は、優れた光安定性を有することがわかった。
以上、本実施形態の光学分割用化合物は、アミノ酸の光学異性体混合物と混合することによりアミノ酸誘導体を作成でき、これをＨＰＬＣ分析することで光学異性体混合物を簡便な方法で、高い分離能かつ高い検出感度で、光学異性体混合物を光学分割可能であることがわかった。この際、アミノ酸の光学異性体混合物は、室温で１分程度の混合で誘導体化されることがわかった。また、得られるアミノ酸誘導体は、熱安定性及び光安定性に優れることがわかった。

Claims (7)

  1. 構造式（１）
    Figure 0006226318
     又は
    構造式（２）
    Figure 0006226318
     である、光学分割用化合物。
  2. 請求項１に記載の光学分割用化合物を含む、光学分割用試薬。
  3. 請求項２に記載の光学分割用試薬を用いた、アミノ酸の光学異性体混合物を光学分割する方法。
  4. 前記光学分割用試薬と前記光学異性体混合物を混合して、前記光学異性体混合物の誘導体を得る、第１の工程を含む、
    請求項３に記載の光学分割する方法。
  5. 前記第１の工程は、室温で１分間混合する工程を含む、
    請求項４に記載の光学分割する方法。
  6. 前記第１の工程の後に、前記誘導体を、カラムクロマトグラフィーを用いて各々の光学異性体に分離する、第２の工程を含む、
    請求項４又は５に記載の光学分割する方法。
  7. 請求項４乃至６のいずれか一項に記載の光学分割する方法によってアミノ酸の光学異性体を得る方法。
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