DE69007968T2 - Derivate von polyhydroxylierten molekülen, welche die einführung von mindestens einer verzweigung in ein oligonukleotid erlauben. - Google Patents
Derivate von polyhydroxylierten molekülen, welche die einführung von mindestens einer verzweigung in ein oligonukleotid erlauben.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Derivate von polyhydroxylierten Molekülen, zum Beispiel Nukleosiden oder Polyolen, die in der Oligonucleotidsynthese verwendbar sind, um Oligonucleotide zu bilden, welche mindestens eine Verzweigung umfassen, die zum Beispiel als Markierung von Oligonucleotiden dienen kann.
- Die markierten Oligonucleotide, zum Beispiel die Nucleinsäuresonden, bilden in verschiedenen Bereichen, wie den genetischen Krankheiten, den Infektionskrankheiten, Krebs und der Zelltypisierung, ein sehr interessantes Diagnoseinstrument.
- In den Diagnosetechniken verwendet man eine Oligonucleotidsonde, welche eine Sequenz aufweist, die zu der des Ziels, das heißt der zu bestimmenden biologischen Probe, komplementär ist. Diese Diagnosetechniken basieren auf der Verwendung der Hybridation, das heißt, der Verbindung durch Wasserstoffbindungen von zwei komplementären Nukleinsäuresträngen (DNS oder RNS), von denen eine die Sonde und die andere das Ziel ist. Diese Reaktion kann somit zwei DNS- Ketten ins Spiel bringen, eine DNS-Kette und eine RNS-Kette, oder auch noch zwei RNS-Ketten. Um die Detektion der Sonde zu ermöglichen umfaßt diese ein passendes Markerelement, das geeignet ist, durch Methoden wie den radioaktiven, immunoenzymatischen, kolorimetrischen, fluorimetrischen oder lumineszenten Methoden detektiert zu werden.
- Die synthetischen oligonucleotidischen Sonden werden hergestellt, indem man zwischen ihnen durch chemische Methoden Nucleoside verbindet, durch Zwischenschalten einer Phosphatgruppe, um eine DNS- (oder RNS-)Kette zu bilden. Dies grenzt an die Bildung eines synthetischen Polymers in welchem die internucleotidischen Phosphate immer die sekundäre Alkoholfunktion in der Position 3' eines Nucleosidderivats mit der primären Alkoholfunktion in Position 5' eines anderen Nucleosidderivats verbinden. Während der Oligonucleotidsynthese sind daher nur diese beiden Funktionen beansprucht, die anderen Funktionen werden geschützt. Dies wird also an die Bildung eines Oligonucleotids grenzen.
- Die markierten Oligonucleotide werden gemäß dem selben Prinzip hergestellt, der Marker wird im allgemeinen an die heterozyklische Basis eines Nucleosidderivats gebunden.
- Die Einführung dieses Nucleosidderivats in die oligonucleotidische Kette erfolgt immer indem man eine internucleotidische Verbindung 3'-5' erzeugt.
- Die Marker können in verschiedener Weise eingeführt werden, sowohl am 5'-Ende als auch am 3'-Ende, als auch im Inneren eines Oligonucleotids. Aber in allen Fällen wird die erhaltene Kette linear sein.
- Wenn man nicht radioaktive Markerelemente verwendet, kann man direkt die markierten Nucleotidsonden herstellen, und zwar vor ihrer Verwendung durch biochemische oder chemische Verfahren.
- Im Gegenteil, wenn das Markerelement radioaktiv ist, muß die Einführung dieses Elements in die Sonde auf ein Mal durchgeführt werden.
- Unter den biochemischen Verfahren zur Herstellung von markierten Oligonucleotiden kannte man ein Verfahren der Beimengung von biotinylierten Nucleotide, welches die End-Desoxynucleotidyltransferase verwendet, wie es durch WU in Methods in Enzymology, Vol. 65, 1980, S. 43-62 beschrieben ist. Diese Methode ist interessant, weil sie es statistisch ermöglicht, mehrere Biotine (im Allgemeinen 3 bis 5) auf einer kurzen Oligonucleotidsonde einzubauen. Die Markierung hingegen benötigt einen zusätzlichen Schritt nach der Oligonucleotidsynthese. Doch ist es schwierig, eine Sonde herzustellen, welche eine definierte Anzahl von Markern umfaßt, weil man eine komplexe Mischung von Produkten verschiedener Länge erhält, die man trennen muß, um eine Sonde mit wohldefiniertem Schmelzpunkt zu haben.
- Unter den chemischen Methoden kannte man eine Methode, gemäß welcher man das Markerelement auf den Oligonucleotidbasen bindet, nach Synthese und Entfernung des Schutzes von dieser, wie es von Roduit et al in Nucleosides & Nucleotides, 6 (1&2), 349-352 (1987) beschrieben ist. In diesem Fall kann man mehrere Markerelemente binden, aber die mit diesen markierten Oligonucleotiden erhaltene Empfindlichkeit ist noch ungenügend, weil man nur eine beschränkte Anzahl markierender Gruppen einführen kann. Jeder Marker wird in nicht quantitativer Weise eingeführt, was das Erhalten einer Mischung von Produkten impliziert, in welcher die gesamt markierte Sonde in der Minderzahl ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft genau neue Derivate von polyhydroxylierten Molekülen, die zur Oligonucleotidsynthese verwendbar sind, welche es ermöglichen, am Ende des Oligonucleotids eine hohe Anzahl von Molekülen, zum Beispiel von Markermolekülen einzuführen, um somit die Empfindlichkeit zu erhöhen.
- Gemäß der Erfindung ist dieses neue Derivat des polyhydroxylierten Moleküls ein Nucleosidderivat, das der Formel:
- entspricht, in welcher
- - R¹ ein Schutzradikal einer OH-Gruppe ist, die zur Oligonucleotidsynthese beiträgt,
- - R² ein an die Oligonucleotidsynthese angepaßtes Phosphorradikal ist, nicht sübstituiert oder durch OR¹ sübstituiert,
- - R³ ein Wasserstoffatom, ein Hydroxylradikal, ein geschütztes Hydroxylradikal oder das Radikal R&sup4;OR¹ darstellt, wobei R¹ die oben gegeben Bedeutung hat und R&sup4; ein bivalentes, lineares oder verzweigtes, substituiertes oder nicht substituiertes Kohlenwasserstoffradikal darstellt, welches eventuell in seiner Kette eine oder mehrere Gruppen enthält, die unter O, S, NH, NHCO, NHSO&sub2;, SO&sub2;, CO, -C C-, CH=CH,
- gewählt wird, wobei t und u ganze Zahlen von 1 bis 2 sind und , und
- - B ein Radikalderivat einer Purin- oder Pyrimidinbase darstellt, das den folgenden Formeln entspricht:
- in welchen R&sup5; H, CH&sub3;, R&sup4;OR¹ oder R&sup8;Z darstellt, R&sup6; eine Gruppe zum Schutz einer in der Nucleotidsynthese verwendbaren Amingruppe, das Radikal R&sup4;OR¹ oder R&sup8;Z darstellt, R&sup7; ein Wasserstoffatom, das Radikal R&sup4;OR¹ oder R&sup8;Z darstellt, unter der Bedingung, daß mindestens eines der R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; R&sup4;OR¹ darstellt, wenn R³ nicht R&sup4;OR¹ darstellt und daß R² keinen Sübstituenten R&sup4;OR¹ umfaßt, wobei die R¹ und R&sup4; identisch oder verschieden sein können,
- - R&sup4; ein lineares oder verzweigtes, sübstituiertes oder nicht sübstituiertes, bivalentes Kohlenwasserstoffradikal darstellt, das eventuell in seiner Kette eine oder mehrere Gruppen umfaßt, welche unter O, S, NH, NHCO, NHSO&sub2;, SO&sub2;, CO, C C, CH=CH,
- gewählt werden, wobei t und u ganze Zahlen zwischen 1 und 2 und sind,
- - R&sup8; eine einfache Verbindung oder ein lineares oder verzweigtes, substituiertes oder nicht substituiertes, bivalentes Kohlenwasserstoffradikal ist, das eventuell in seiner Kette und/oder seinen Verzweigungen ein oder mehrere Gruppen umfaßt, die unter O, S, NH, NHCO, NHSO&sub2;, SO&sub2;, CO, C C, CH=CH,
- gewählt werden, wobei t und u ganze Zahlen zwischen 1 und 2 und sind, und
- - Z ein Radikalderivat eines Moleküls zur Markierung eines Vorläufermoleküls zur Markierung oder eines Moleküls ist, das fähig ist, sich mit anderen Molekülen zu verbinden, unter der Bedingung, daß, wenn B das Radikal der Formel II darstellt, wobei R&sup6; R&sup4;OR¹ darstellt, R&sup4; nicht (CH&sub2;)n darstellt, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 6 ist.
- Man gibt genauer an, daß in der oben gegebenen Formel, wenn das Nucleosidderivat der Erfindung mehrere R&sup4; umfaßt, diese identisch oder verschieden sein können.
- Wie man vorher gesehen hat, sind die Radikale R&sup4; sübstituierte oder nicht sübstituierte Kohlenwasserstoffradikale, die außerdem mehrere Gruppen umfassen können.
- Die verwendeten Substituenten können besonders Aryl-, Zykloalkyl-, Cyano-, Halo-, Nitro- und Acylradikale sein.
- Im allgemeinen umfaßt R&sup4; 1 bis 20 Kohlenstoffatome, vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatome.
- Als Beispiele solcher Radikale kann man die Radikale der Formel:
- -(CH&sub2;)n--
- -(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -NH(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -O(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -S(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -NHCO(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -NHSO&sub2;(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -CO(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -SO&sub2;(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- anführen, in denen n eine ganze Zahl zwischen 1 und 6 ist, p eine ganze Zahl zwischen 1 und 6 ist, und X eine einfache Verbindung ist oder CH&sub2;, NHCO, O, S, NH, N(CH)rCH&sub3;, C C, -CO-, -HC=CH-, CH(CH&sub2;)rOR¹, C=CH(CH&sub2;)OR¹, N-(CH&sub2;)rOR¹, CH-O(Ch&sub2;)rOR¹, oder CH-S-(CH&sub2;)rOR¹ darstellt, wobei r gleich 0 ist oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 6 ist und R¹ die oben gegebene Bedeutung hat.
- Gemäß der Erfindung kann R&sup8; auch ein Kohlenwasserstoffradikal darstellen, das verschiedene Substituenten und verschiedene Gruppen umfaßt. Die verwendeten Sübstituenten können von demselben Typ sein wie die oben beschriebenen.
- Außerdem umfaßt R&sup8; im allgemeinen 1 bis 20, vorzugsweise 3 bis 10 Kohlenstoffatome.
- Als Beispiele solcher Radikale kann man die Radikal der Formel:
- -(CH&sub2;)n--
- -NH(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q--
- -NH(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q-NH--
- -O(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q--
- -O(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q-NH--
- -S(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q--
- -S(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q-NH--
- -NHCO(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q--
- -NHCO(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q-NH--
- -NHSO&sub2;(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q--
- -NHSO&sub2;(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q-NH--
- -(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q--
- -(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q-NH--
- -CO(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q--
- -CO(CH&sub2;)n-Y-(CH&sub2;)q-NH--
- anführen, in welchen n eine ganze Zahl zwischen 1 und 6 ist, q gleich 0 ist oder eine ganze Zahl zwischen 1 und 6 ist, Y CH&sub2;, O, S, NH, CO, NHCO, -HC=CH-, C=CH(CH&sub2;)rZ, C=CH(CH&sub2;)rNHZ, N(CH&sub2;)rZ, N(CH&sub2;)rNHZ, CH-O(CH&sub2;)rZ, CH-O-(CH&sub2;)rNHZ, HCS(CH&sub2;)rZ, CHS(CH&sub2;)rNHZ darstellt, wobei r=1 bis 6 ist und Z ein Radikalderivat eines Markierungmoleküls oder eines Vorläufermoleküls zur Markierung ist.
- Wenn in den Nucleosidderivaten der Formel (Ia) R³ ein geschütztes Hydroxylradikal darstellt, verwendet man als Schutzgruppe dieses Hydroxyls die gewöhnlich in der Synthese der Ribonucleide verwendeten Gruppen.
- Im allgemeinen stellt R³ ein Wasserstoffatom dar.
- Vorzugsweise ist in den Nucleosidderivaten Ia der Erfindung die Funktion R&sup4;OR¹ am Teil B des Nucleosidderivats angeordnet, das heißt am Radikalderivat der Purin- oder Pyrimidinbase. Wenn die Base ein exozyklische NH&sub2;-Gruppe umfaßt, kann man besonders diese exozyklische NH&sub2;-Gruppe durch R&sup4;OR¹ ersetzen.
- Zum Beispiel kann B darstellen:
- In diesem Fall kann das Radikal R&sup4; unter den Radikalen der Formeln:
- -(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -O(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -S(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- -CO(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- SO&sub2;(CH&sub2;)n-X-(CH&sub2;)p--
- gewählt werden, in welchen n, p und X die oben gegebene Bedeutung haben.
- Zum Beispiel kann R&sup4; -(CH&sub2;)n-NH-(CH&sub2;)p darstellen, wobei n und p zum Beispiel gleich 2 sind.
- In dem Nucleosidderivat der Formel (Ia) der Erfindung ist B ein Radikalderivat einer Purin- oder Pyrimidinbase, wie Uracil, Thymin, Cytosin, Adenin und Guanin. Dieses Radikal B kann verschiedene Substituenten umfassen, die sowohl das Radikal R&sup4;OR¹ sind und dazu dienen, eine Verzweigung auszuführen, als auch ein Schutzradikal der exozyklischen NH&sub2;-Gruppen dieser Basen sowie ein Radikal R&sup8;Z, welches ein Markierungsmolekül oder ein Vorläufermolekül zur Markierung umfaßt.
- Für die Oligonucleotidsynthese können die Schutzgruppen der exozyklischen NH&sub2;-Gruppen verschiedener Art sein und sind in der Technik wohl bekannt. Zum Beispiel kann man Benzol- oder Anisolgruppen in dem Fall verwenden, da B ein Guaninderivat ist sowie die in der Europäischen Patentanmeldung EP-A- 0 241 363 beschriebenen Schutzgruppen.
- Vorzugsweise verwendet man eine Phenylpropionyl-, Isobutyryl- oder Benzolgruppe für das Radikal der Formel (II), eine Phenoxyacetyl- oder Benzolgruppe für das Radikal der Formel (IV) und eine Phenoxy-, Acetyl- oder Isobutyryl-Gruppe für das Radikal der Formel (V).
- In dem Fall da B eine R&sup8;Z-Gruppe umfaßt, wobei Z ein Markierungsmolekül oder ein Vorläufermolekül zur Markierung umfaßt, kann man ein direkt detektierbares Markierungsmolekül verwenden, zum Beispiel Moleküle, die fähig sind, sich mit Avidin oder Streptavidin zu verbinden, Moleküle die einer Reaktion des Typs Antigen-Antikörper Anlaß geben oder Moleküle, die fluoreszierende oder lumineszierende Eigenschaften haben.
- Man kann auch Markierungsmoleküle verwenden, die fähig sind, ein radioaktives Element genau im Moment vor dessen Verwendung aufzunehmen. Wenn man radioaktive Atome verwendet, ist es in der Tat schwierig, diese Elemente gut vor der Verwendung einzuführen aufgrund ihrer Halbwertszeit und der Radiolysereaktionen, die sie hervorrufen.
- Auch verwendet man gemäß der Erfindung in diesem Fall ein Markierungsmolekül, das geeignet ist, dann durch ein radioaktives Elemente markiert zu werden, zum Beispiel durch radioaktives Jod.
- Man kann natürlich in den Nucleosidderivaten der Erfindung andere Markierungsmoleküle verwenden, besonders die gewöhnlich für die Detektion von Antigenen, Antikörpern oder Haptenen in der Immunologie verwendeten.
- In dem Fall, da Z ein Molekül darstellt, das fähig ist, sich mit anderen Molekülen zu verbinden, kann es sich um ein Molekül handeln, das fähig ist, sich mit einem anderen Molekül zu verbinden, das zum Beispiel auf einem festen Träger befestigt ist, um das Anhaften dieses Oligonucleotids auf diesem Träger zu ermöglichen. Als Beispiel von Systemen dieses Typs kann man die Systeme Biotin-Avidin, Dintrophenyl-Antikörper anführen.
- Es kann sich auch um Moleküle handeln, die fähig sind, sich mit einem anderen Molekül zu verbinden, das eine therapeutische Wirkung hat, um dem Oligonucleotid eine therapeutische Wirkung zu verleihen.
- Die Nucleosidderivate der Erfindung können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden, solche wie in Organic Chemistry of Nucleic Acids, Teil B, .N.K. Kochetkov and E.I.Budovski, 1972 (Plenum New York) beschrieben. Im allgemeinen teilt man die Nucleosidderivate die der Formel:
- entsprechen, in welcher R¹ und R² Wasserstoff darstellen, R³ H oder OH darstellt und B ein Radikal entsprechend den oben gegebenen Formeln II, III, IV oder V ist, wobei R&sup6; und R&sup7; ein Wasserstoffatom darstellen und R&sup5; ein Wasserstoffatom oder ein Methylradikal darstellt. Man bindet dann an diesen Derivaten die gewünschten Radikale durch herkömmliche Methoden.
- Wenn das Radikal B des herzustellenden Nucleosidderivats ein Radikal der Formel (II) ist, kann man auch diese Derivat herstellen, indem man von 4-Thiothymidin oder von 4-Thiodesoxyuridin, geschützt oder nicht, ausgeht, durch Reaktion mit einem Diamin, einem Aminoalkohol, einem monosubstituierten Diamin oder Aminoalkohol, wie H&sub2;N-R&sup9;Z oder H&sub2;NR&sup4;OR', Z kann ein Markierungsmolekül sein in dem Fall, da dieses mit einer primären Aminfunktion gekoppelt werden kann. Dies entspricht dem folgenden Reaktionsschema:
- in welchem R&sup5; im allgemeinen H oder CH&sub3; darstellt und R¹³ und/oder R¹&sup4;, die identisch oder verschieden sein können, H oder ein Schutzradikal darstellen.
- Nach dieser Reaktion kann man das Nucleosidderivat behandeln um es zur Nucleosidsynthese zu befähigen und ihm eine oder mehrere R&sup4;OR¹-Funktionen zufügen sowie eventuell Markierungsmoleküle des Typs R&sup8;Z.
- Gemäß einer Variante der Erfindung ist das Derivat des Polyhydroxyl-Moleküls ein Polyol-Derivat, entsprechend der Formel:
- in welcher
- -R¹ ein Schutzradikal einer OH-Gruppe ist, passend zur Oligonucleotidsynthese,
- -R² ein an die Oligonucleotidsynthese angepaßtes Phosphorradikal ist, nicht substituiert oder substituiert durch OR¹,
- -R&sup4; ein bivalentes, lineares oder verzweigtes, substituiertes oder nicht substituiertes Kohlenwasserstoffradikal darstellt, das eventuell in seiner Kette ein oder mehrere Gruppen umfaßt, die unter O, S, NH, NHCO, NHSO&sub2;, SO&sub2;, CO, C C, CH=CH,
- ausgewählt werden, wobei t und u ganze Zahlen zwischen 1 und 2 und sind.
- Man präzisiert ebenso, daß in der oben gegebenen Formel (Ib) die beiden R&sup4; identisch oder verschieden sein können und dieselben Radikale darstellen können wie die bezüglich der Formel (Ia) beschriebenen.
- Zum Beispiel kann R&sup4; -(CH&sub2;)n- darstellen, wobei n eine ganze zahl zwischen 1 und 6, zum Beispiel 3, ist.
- Die Polyolderivate der Formel Ib können durch Reduktion des Diester einer, vorzugsweise symmetrischen, Ketodicarboxyl-Säure hergestellt werden. Dieses Symmetriekriterium ist nicht absolut, aber es vermeidet die Bildung von Diastereo-Isomeren und erleichtert somit die Reinigung und die Analyse durch NMR der funktionalisierten Derivate der Formel Ib hinsichtlich ihrer Verwendung für die Nucleotidsynthese.
- Die Ausgangsverbindung ist zum Beispiel γ-Oxopimel-Säure.
- In den Derivaten der Formeln Ia und Ib der Erfindung ist R¹ ein Schutzradikal einer OH-Gruppe, passend zur Nucleotidsynthese.
- Als Beispiele der zur Verwendung geeigneten R¹-Radikale kann man besonders die Phenyl-9-Xanthenyl-Radikale und die Tritylradikal der Formel:
- anführen, in denen R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹, die identisch oder verschieden sein können, ein Wasserstoffatom, ein Alkyl-, Alcoxy- oder Aminoradikal darstellen. Man kann auch für R¹ das t-butyl-Dimethyl-Silyl-Radikal verwenden.
- Vorzugsweise ist R¹ das Methoxy- oder Dimethoxy-Trityl- Radikal, als auch das Radikal entsprechend der vorher angeführten Formel VII, in welcher R&sup9; oder R&sup9; und R¹&sup0; Methoxy-Gruppen darstellen, R¹¹ und eventuell R¹&sup0; ein Wasserstoffatom darstellen.
- Gemäß der Erfindung ist das Radikal R² ein zur Nucleotidsynthese fähiges funktionelles Radikal, zum Beispiel ein Phosphorradikal, welches eventuell einen Substituenten der Formel R¹&sup0; umfaßt.
- Als Beispiele zur Verwendung geeigneter Phosphorradikale kann man die Radikale der Formeln:
- anführen, in welchen R¹ die oben gegebene Bedeutung hat, R&sup4; ein bivalentes, lineares oder verzweigtes Kohlenwasserstoffradikal, substituiert oder nicht, darstellt, das eventuell in seiner Kette ein oder mehrere Gruppen O, S, NH, NHCO, NHSO&sub2;, SO&sub2;, CO, C C, CH=CH,
- umfaßt, wobei t und u ganze Zahlen zwischen 1 und 2, sind, und R' und R'' getrennt jeweils ein Alkyl-, Aralkyl- oder Zykloalkylradikal darstellen, das bis zu 10 Kohlenstoffatomen enthält, oder R' und R'' zusammen eine Alkylenkette bilden, die bis zu 5 Kohlenstoffatome in der Hauptkette und insgesamt bis zu 10 Kohlenstoffatome enthält, oder zusammen mit dem stickstoffatom einen gesättigten Heterozyklus bilden, der ein oder mehrere Heteroatome enthalten kann, gewählt unter N, O und S.
- Wenn R' und R'' getrennt genommen werden, stellen sie vorzugsweise kleinere Alkylgruppen dar, wie die Isopropyl-, t-Butyl-, Isobutyl-, sec-Butyl-, Neopentyl-, tert-Pentyl-, Isopentyl-, sec-Pentylradikale.
- Wenn R' und R'' zusammen mit dem Stickstoffatom einen Heterozyklus bilden, ist dieser Heterozyklus vorzugsweise Pyrrolidin, Morpholin oder Piperidin.
- Zum Beispiel stellt R² das Radikal der Formel:
- dar.
- Die Derivate polyhydroxylierter Moleküle der Formeln Ia und Ib der Erfindung sind sehr interessant bei der Verwendung in einer Oligonucleotidsynthese, weil sie es ermöglichen, an der gewünschten Stelle der Oligonucleotide Verzweigungen zu erzeugen, die von einem oder mehreren Molekülen sehr verschiedener Arten erzeugt werden können.
- Wen man diese Derivate polyhydroxylierter Moleküle in der Oligonucleotidsynthese verwendet, ermöglicht es die Anwesenheit der Funktion OR² in der Tat, das Derivat auf einem schon gebildeten Oligonucleotid zu binden und die Anwesenheit von 2 bis 4 Funktionen OR¹ ermöglicht es, die Synthese fortzusetzen, indem Verzweigungen ausgeführt werden, das heißt, indem man dann auf diesen Derivaten 2 bis 4 Moleküle bindet, die fähig sind, mit den durch Durchtrennung der OR¹-Bindungen erhaltenen OH-Funktionen zu reagieren.
- Die gebundenen Moleküle können verschiedener Art sein.
- Als Beispiele solcher Moleküle kann man anführen die Nucleoside, die markierten Nucleoside, die Moleküle, die als Abstandhalter dienen, die Markierungsmoleküle, die Moleküle, die fähig sind markiert zu werden, und die Moleküle, die fähig sind, sich mit anderen Molekülen zu verbinden, um dem Oligonucleotid bestimmte Eigenschaften zu verleihen, zum Beispiel sein Anhaften auf einem festen Träger auszuführen oder es therapeutisch wirksam zu machen. Man kann, gemäß der Erfindung, auch Derivate polyhydroxylierter Moleküle verwenden um andere Verzweigungen auszuführen.
- Indem man in passender Weise die verwendeten Moleküle auswählt, kann man auch die Synthese fortsetzen, indem Verzweigungen ausgeführt werden, jede gebildet als eine Nachfolge der identischen oder verschiedenen Moleküle, um dem Oligonucleotid interessante Eigenschaften, zum Beispiel für seine Detektion, zu verleihen.
- Die Derivate der polyhydroxylierten Moleküle der Erfindung weisen also einen großen Nutzen in der Oligonucleotidsynthese auf.
- Auch betrifft die Erfindung ebenso ein Verfahren, um mindestens eine Verzweigung auf einem Oligonucleotid zu bilden, das nacheinander die folgenden Abschnitte umfaßt:
- a) auf dem Oligonucleotid Bindung eines Derivats polyhydroxylierter Moleküle der Formel:
- in welchen R¹, R², R³, R&sup4; und B die oben gegebene Bedeutung haben,
- b) Reaktion der OH-Funktionen des gebundenen Derivats mit Molekülen, die fähig sind mit den durch durchtrennen der OR¹-Bindungen erhaltenen OH-Funktionen zu reagieren.
- Gemäß einer Ausführungsvariante dieses Verfahrens bindet man zuerst ein als Abstandhalter dienendes Molekül auf dem Oligonucleotid, dann bindet man auf diesem als Abstandhalter dienenden Molekül das Derivat der Erfindung und bindet dann an diesem Derivat die Moleküle, die fähig sind, mit den durch Antrennen der OR¹ erzeugten OH-Funktionen zu reagieren.
- Die auf dem Derivat der Erfindung gebundenen Moleküle können verschiedener Art sein, da sie nun eine Funktion besitzen, die fähig ist, mit den durch Abtrennen der OR¹ von dem Derivat der Erfindung erhaltenen OH-Funktionen zu reagieren.
- Zum Beispiel können diese Moleküle Nucleoside, markierte Nucleoside, Moleküle, die als Anstandhalter dienen können (Moleküle, die nicht nur eine Funktion umfassen die fähig ist, mit der durch Antrennen erhaltenen OR1-Funktion zu reagieren, sondern auch eine Funktion haben, welche die Bindung auf einem anderen Molekül, zum Beispiel einem Nucleosid, ermöglicht), Markierungsmoleküle, Moleküle, die markiert werden können, Moleküle, die fähig sind, sich mit anderen Molekülen oder anderen Derivaten der polyhydroxylierten Moleküle gemäß der Erfindung zu verbinden, sein.
- Die Verwendung von Derivaten der Erfindung in der Oligonucleotidsynthese ermöglicht es also, sehr verschiedene Strukturen und Konfigurationen auszuführen.
- Als nicht beschränkende Beispiele kann man die folgenden Strukturen ausführen, in denen:
- - N das Derivat der Erfindung darstellt,
- - N' ein als Abstandhalter dienendes Molekül darstellt,
- - M ein Molekül darstellt, das markiert ist oder markiert werden kann, oder auch ein Molekül, das fähig ist, sich mit anderen Molekülen zu verbinden. lineares Oligonucleotid
- In diesen Strukturen können die Moleküle N', die als Abstandhalter dienen, Kohlenwasserstoffketten sein, die an ihren Enden Funktionen umfassen, welche geeignet sind, es ihnen zu ermöglichen, zwischen Moleküle N, N' und/oder M eingeschoben zu werden.
- Die als Abstandhalter dienenden Moleküle N' können auch durch Nucleosidderivate, zum Beispiel Desoxythymidin, gebildet werden.
- Die Einführung dieser Nucleosidderivate N', die einzig als Abstandhalter dienen, ermöglicht es, die Löslichkeit in Wasser und das biologische Milieu der erhaltenen Oligonucleotide zu verbessern, die Marker von der Hybridisierungssequenz zu beseitigen (lineare Oligonucleotide), und somit eine bessere Zugänglichkeit der eventuell zu Beginn der Verzweigungen gebundenen Marker zu sichern.
- Die Moleküle M der Markierung können auch verschiedener Art sein.
- Daher kann man ein direkt detektierbares Markierungsmolekül verwenden, zum Beispiel fluoreszierende oder phosphoreszierende Marker, Antigenmoleküle oder Derivate, welche eine starke Affinität für andere Moleküle haben.
- Zum Beispiel können die direkt detektierbaren Markierungsmoleküle Moleküle sein, die fähig sind, sich mit Avidin oder Streptavidin zu verbinden, Moleküle, welche eine Reaktion des Typs Antigen- Antikörper veranlassen können, oder Moleküle, welche fluoreszierende oder lumineszente Eigenschaften haben.
- Man kann auch Markierungsmoleküle verwenden, die fähig sind, ein radioaktives Element genau im Moment seine Verwendung aufzunehmen. Wenn man radioaktive Atome verwendet, ist es tatsächlich schwierig, diese Elemente lang vor der Verwendung einzuführen, aufgrund ihrer Halbwertszeit und der Radiolysereaktionen, die sie verursachen. Auch verwendet man gemaß der Erfindung in diesem Fall ein Markierungsmolekül, das fähig ist, dann durch ein radioaktives Element, zum Beispiel durch radioaktives Jod, markiert zu werden.
- Diese Markierungsmoleküle können direkt eingeführt werden oder durch Zwischenschaltung eines Nucleosidderivats, das sie umfaßt, zum Beispiel eines Nucleosidderivats der Formel (Ia), das ein Radikal R&sup8;Z und eine oder mehrere Funktionen OR¹ umfaßt.
- Als Molekül M, das geeignet ist, markiert zu werden, kann man auch ein natürliches Nucleosidderivat verwenden, das man dann durch ein radioaktives Elemente wie ³²P markiert, indem man zum Beispiel die Hydroxylfunktion dieses Nucleosidderivats mit radioaktivem Phosphat reagieren läßt, zum Beispiel durch Einwirkung von γ ³²P ATP und der Polynucleotidkinase.
- Daher ist es mit den gemaß der Erfindung erhaltenen Oligonucleotidstrukturen möglich, eine hohe Moleküldichte der Marker am Ende des Oligonucleotids zu haben und ein für die Markierung mit Phosphor 32 sehr empfindliches Signal zu erhalten.
- Entsprechend den verwendeten Molekülen kann man daher Oligonucleotide erhalten, welche die gewünschten Eigenschaften haben, zum Beispiel markierte Oligonucleotide, die eine erhöhte Empfindlichkeit haben.
- Das Molekül M kann auch noch ein Molekül sein, das fähig ist, sich mit anderen Molekülen zu verbinden, zum Beispiel um das Anhaften des Oligonucleotids auf einem festen Träger auszuführen oder es therapeutisch wirksam zu machen, wie man vorher gesehen hat.
- Die Verwendung von Derivaten der Erfindung in der Oligonculseotidsynthese stellt keine Probleme, weil sie direkt als Synthone in den automatischen Apparaten der Oligonucleotidsynthese verwendet werden können, und sie ohne Änderung allen Vorgängen der Oligonucleotidsynthe unterzogen werden können. Außerdem haben sie Reaktionsvermögen ähnlich denen der momentan verwendeten kommerziellen Synthone.
- Für die Oligonucleotidsynthese kann man die Synthesemethode des Phosphortriesters verwenden, wenn R² das Radikal der Formel (VIII) oder (IX) ist, die Synthesemethode des Phosphoramidit in dem Fall, da R² das Radikal der Formel X, XI oder XII ist, oder die Synthesemethode des Phosphonats in dem Fall, da R² das Radikal der Formel (XIII) ist.
- Die Synthese kann sowohl durch Methoden in Lösung als auch durch Synthesemethoden auf Trägern ausgeführt werden. Man verwendet vorzugsweise die Synthesemethoden auf Trägern, die momentan die besten Ergebnisse bringen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft auch Oligonucleotide, die durch das oben beschriebene Verfahren erhalten werden.
- Diese Olignculeotide entsprechen der Formel:
- An1N'aNC
- in welcher:
- - n1 eine ganze Zähl größer 1 ist,
- - die A gleiche oder verschiedene Nucleotide sind,
- - N' ein als Abstandhalter dienendes Molekül ist,
- - a gleich 0 ist oder eine ganze Zähl ist,
- - N ein Derivat des polyhydroxylierten Moleküls gemaß der Erfindung ist, und
- - C das Ende des Oligonucleotids darstellt, welches mindestens zwei gleiche oder verschiedene Verzweigungen umfaßt, die jeweils von einem oder mehreren identischen oder verschiedenen Molekülen gebildet werden, gewählt unter N', N, M und A gewählt werden, wobei M ein markiertes Nucleotid, ein Markierungsmolekül, ein Vorläufermolekül eines Markers oder ein Molekül, das fähig ist, sich mit anderen Molekülen zu verbinden, darstellt.
- Andere Kennzeichen und Vorteile der Erfindung treten besser bei der Lektüre der folgenden Beispiel hervor, die natürlich beschreibend und nicht beschränkend gegeben werden. Beispiel 1: Herstellung der Verbindung Nr. 1 der Formel: (Verbindung Nr. 1)
- Diese Verbindung Nr. 1 ist ein Nucleosidderivat der Formel (Ia), in welcher R¹ das Dimehtoxytritylderivat (dmt) darstellt, R² und R³ ein Wasserstoffatom darstellen, B das Radikal der Formel (II) darstellt, wobei R&sup5; CH&sub3; darstellt, R&sup7; ein Wasserstoffatom darstellt und R&sup6; das Radikal R&sup4;OR¹ darstellt, wobei R&sup4; (CH&sub2;)&sub2;NH(CH&sub2;)&sub2; darstellt und R¹ H darstellt.
- Man löst 840 mg (1,5 mol) 5'-Dimethoxytrityl, 4-Thiothymidin in 10 ml Isopropanol und 610um (4mmol) N-(2-Hydroxyethyl)-Ethylendiamin und man erhitzt während 16h in einer Stöpselflasche auf 60ºC. Nach Verdampfen bis zur Trockne löst man die Mischung durch 25 ml Chloroform wieder auf und man wäscht 3 mal mit 50 ml 5%igem Natriumbicarbonat und 50 ml destilliertem Wasser. Nach Verdampfen des organischen Lösungsmittels, wird das Produkt in Toluol kristallisiert und mit einem Wirkungsgrad von 71% erhalten. Beispiel 2: Herstellung der Verbindung Nr. 2 der Formel: (Verbindung Nr. 2)
- Man trocknet 296mg (0,5mmol) der Verbindung Nr. 1 durch Mitverdampfen in anhydriertem Pyridin. Man fügt 1,2 eq Dimethoxytrityl-Chlorid hinzu und läßt die Reaktionsmischung während 16h bei 0ºC. Nach dem Stoppen der Reaktion durch 1ml Methanol, fügt man 50ml einer 5%-igen Natriumbicarbonatlösung und 50 ml Chloroform hinzu.
- Nach den Dekantieren wäscht man die organische Phase zwei mal durch 50ml Bicarbonat, dann ein mal durch 50ml destilliertes Wasser. Man gegenextrahiert die wäßrigen Phasen durch 50 ml Chloroform. Man vereinigt die organischen Phasen wieder und man verdampft sie bis zur Trockne. Man trennt das Produkt auf einer Siliziumsäule, indem man durch einen Gradienten von Ethanol in Chloroform (0 bis 20%) eluiert. Man erhält somit die Verbindung Nr. 2 mit einem Wirkungsgrad von 73%. Beispiel 3: Herstellung der Verbindung Nr. 3 der Formel: (Verbindung Nr. 3)
- Man trocknet durch Coevaporation in einer Mischung von Dichlormethan und anhydriertem Acetonitril 472mg (0,5 mmol) der Verbindung Nr. 2, dann löst man sie wieder in 5ml anhydriertem Dichlormethan auf. Man fügt 0,25mmol Diisopropylammonium-Tetrazolat und 0,6 mmol Bis-Diisopropylaminocyanoethoxyphophin hinzu. Man läßt die Reaktion sich während 2h bei Umgebungstemperatur fortsetzen. Man verdünnt die Reaktionsmischung auf 25ml, dann wäscht man 3 mal mit 25 ml NaHCO&sub3; in gesättigter wässeriger Lösung. Man verdampft im Vakuum die organische Phase, dann löst man den Rückstand durch 5 ml einer Chloroformlösung und man fällt in 100ml auf -80ºC abgekühlten Hexan. Man erhält somit die Verbindung Nr. 3 mit einem Wirkungsgrad von 94%. Beispiel 4: Herstellung der Verbindung Nr. 4 der Formel: (Verbindung Nr. 4) a) Herstellung der Verbindung Nr. 5 der Formel: (Verbindung Nr. 5)
- Man löst 1mmol 4-Thiothymidin in 5ml reinem Ethanol und man fügt dazu 5mmol 1,6-Diaminohexan und man hält dies während 16h bei 60ºC. Man verdampft bis zur Trockne, dann löst man wieder durch 10ml Wasser und 0,2ml Triethylamin und verdampft. Man zerkleinert den Rückstand durch 4 mal 10 ml Ethylether. Man adsorbiert den Rückstand auf 1g Celit 545 und man schlägt ihn auf einer Celitsäule ab, die mit der unteren Phase der Mischung Ethylazetat-Methoxyethanol-Wasser 4:1:2 hergestellt ist, und man eluiert die Säule durch die obere Phase dieser Mischung, dann eluiert man das gesuchte Produkt durch die obere Phase der Mischung Ethylazetat-n-Butanol-Wasser 1:1:1. Durch Verdampfen der geeigneten Fraktionen und Lyophilisation erhält man somit die Verbindung Nr. 5. b) Herstellung der Verbindung Nr. 6. (Verbindung Nr. 6)
- Man löst 681 mg (2mmol) der Verbindung Nr. 5 in 15 ml Dimethylformamid und man fügt 0,4 ml (4mmol) Triethylamin und 700 mg (2mmol) N-Hydroxysuccinimidobiotin hinzu. Nach 3h unter Rühren bei 20ºC verdampft man unter Vakuum die Reaktionsmischung, dann coevaporiert man 2 mal 15 ml destilliertes Wasser, dann mit 2 mal 20ml reinem Ethanol. Man löst den Rückstand wieder durch Methanol, man fügt 8g Siliziumgel (0,2 bis 0,5mm) hinzu und man trocknet die Suspension unter Vakuum. Man schlägt dann auf einer Siliziumgelsäule (Gel 60 von Merck) die vorher auf Silizium adsorbierte Mischung nieder, und man eluiert dann die Säule durch einen Gradienten von Methanol in Chloroform (5 bis 20%).
- Man erhält somit 715 mg der Verbindung Nr. 6, was einem Wirkungsgrad von 63% entspricht. c) Herstellung der Verbindung Nr. 7 der Formel: (Verbindung Nr. 7)
- Man stellt diese Verbindung ausgehend von Verbindung Nr. 6 in der folgenden Weise her.
- Man löst im Warmen 1,14g (2mmol) der Verbindung Nr. 6 in anhydriertem Pyridin, man kühlt die Lösung wieder ab und man verdampft unter Vakuum. Man löst den Rückstand wieder durch 5ml anhydriertem Dimethylformamid und man löst durch 20ml anhydriertem Pyridin, dann kühlt man die Mischung wieder auf 0ºC unter Rühren ab. Man fügt danach 744 mg des Dimethoxy-4,4'-Trityl-Chlorids hinzu. Man hält die Mischung während 16h unter Rühren. Man fügt dann 2ml Methanol hinzu, nach 15min gießt man dann die Reaktionsmischung auf 35ml einer gesättigten wässerigen Lösung von Natriumbicarbonat.
- Man extrahiert die Mischung mit zwei mal 50ml Chloroform, dann verdampft man die organische Phase und man coevaporiert mit zwei mal 20 ml Toluol.
- Man löst den Rückstand wieder mit Dichlormethan und man reinigt durch Chromatographie auf Siliziumgel (Gel 60 von Merck), indem man für die Elution einen Gradienten von Methanol in Dichlormethan verwendet.
- Man erhält somit 1,44g der Verbindung Nr. 7, was einem Wirkungsgrad von 83% entspricht.
- Man anhydriert 870mg (1mmol) der Verbindung Nr. 7 durch Coevaporation in reinem Pyridin, dann löst man wieder in 10ml anhydriertem Dichlormethan. Man fügt 85mg (0,5mmol) Diisopropylammonium- Tetrazolat hinzu sowie 340ul Bis(Diisopropylamino)cyanoethoxyphosphin. Man rührt das Reaktionsmilieu während 2h bei Umgebungstemperatur, dann fügt man 50 ml Dichlormethan hinzu. Man wäscht die organische Lösung durch drei mal 50ml Natriumbicarbonat in gesättigter wässeriger Lösung, dann durch 50ml einer gesättigten Lösung Natriumchlorid.
- Man verdampft unter Vakuum die organische Phase, dann löst man den Rückstand wieder durch 5ml Dichlormethan und man fällt in 100ml Hexan, das auf -78ºC abgekühlt ist. Man sammelt den Niederschlag und man trocknet unter Vakuum.
- Man erhält somit 930mg der Verbindung Nr. 4, was einem Wirkungsgrad von 87% entspricht.
- Dieses Beispiel erläutert die Herstellung eines verzweigten Oligonucleotids, das mit Biotin markiert ist, indem die Verbindungen Nr. 3 und 4 verwendet werden.
- Das Oligonucleotid hat die folgende Sequenz:
- In dieser Sequenz stellt A das durch Adenin gebildete Nucleotid dar, C stellt das durch Cytosin gebildete Nucleotid dar, G stellt das durch Guanin gebildete Nucleotid dar, T stellt das durch Thymin gebildete Nucleotid dar, N stellt das ausgehend von Verbindung Nr. 3 gebildete Nucleotid gemäß der Erfindung dar, und M stellt das ausgehend von Verbindung Nr. 4 gebildete Nucleotid dar.
- Um diese Synthese auszuführen, verwendet man die Verbindung Nr. 3 als Synthon entsprechend zu N und die Verbindung Nr. 4 als Synthon entsprechend zu M. Die anderen verwendeten Synthone sind Synthone entsprechend zu Adenin, zu Cytosin, zu Guanin und zu Thymin, welche ausgehend von entsprechenden Nucleosiden erhalten werden, indem die Hydroxylfunktion in 5' durch das Radikal dmt geschützt wird und indem die Hydroxylfunktion in 3' funktionalisiert wird durch das Radikal der Formel:
- Für die Nucleotide entsprechend zu Adenin und zu Cytosin, wird die exozyklische Aminierte Funktion durch eine Benzolgruppe geschützt. Für die Nucleotide entsprechend zu Guanin wird sie durch die Isobutyril-Gruppe geschützt.
- Die Synthese wird mithilfe eines automatischen Synthesators von Oligonucleotiden Applied Biosystems 381 A ausgeführt, unter Verwendung für die Synthese des linearen Oligonucleotids:
- - 0,2umol Nucleotid, das auf einen Träger "Controlled Pore Glass" implantiert ist, der einen räumlichen Arm umfaßt, gebildet durch eine aminierte Kette, wobei die Verbindung zwischen diesem Nucleotid und dem Amin durch ein Succinylradikal ausgeführt wird.
- -10mg (40eq) pro Kondensationszyklus von Synthonen von Desoxy-2'-Adenosin, Desoxy-2'-Cytidin, Desoxy-2'-Guanosin und Thymidin, also ungefähr 40 Äquivalente bezüglich des Trägers.
- - 7mg pro Kondensationszyklus eines Aktivierungsmittels, gebildet durch Tetrazol, also ungefähr 10 Äquivalente bezüglich des Nucleotids.
- Der Kondensationszyklus ist der Standardzyklus "0,2umol Cyanoethylphosphoramidit" des Apparats Applied Biosystems 381 A, der einen vorhergehenden Abschnitt der Detritylierung umfaßt, das heißt der Trennung der Verbindungen OR¹ um sie in OH umzuwandeln.
- Am Ende des Kondensationszyklus erhält man lineare geschützte Oligonucleotide, die in kovalenter Weise mit dem Träger durch Zwischenschaltung von räumlichen Succinylarmen verbunden sind.
- Man bindet dann auf dem linearen Oligonucleotid das Nucleotid entsprechend dem durch die Verbindung Nr. 3 gebildeten Synthon, indem man ebenso 10mg der Verbindung Nr. 3, also 40eq, verwendet, dann verfährt man im ersten Zyklus der Verzweigung, indem man 20mg, also 80eq, der Verbindung Nr. 3 verwendet, dann im zweiten Zyklus der Verzweigung, indem man 40mg, also 160eq der Verbindung Nr. 3 verwendet.
- Man führt dann zehn Kondensationszyklen durch, um am Beginn jeder Verzweigung 10 Nucleotide entsprechend der Verbindung Nr. 4 zu binden.
- Um die Kondensationszyklen auf die Verbindung Nr. 3 einwirken zu lassen, sowie um die 10 Kondensationszyklen auf die Verbindung Nr. 4 einwirken zu lassen, verwendet man den Standardzyklus "1umol".
- Das verwendete Kondensationsmittel ist Tetrazol. Die Reaktionszeit ist 3min um die Kopplungen auf die Verbindung Nr. 3 und die Verbindung Nr. 4 einwirken zu lassen.
- Am Ende des Vorgangs wird das Oligonucleotid durch eine Behandlung mit 28%igem Ammoniak während 2h vom Träger geschnitten, dann wird die erhaltene ammoniakhaltige Lösung 5 bis 16h auf 60ºC erhitzt, um die Schutzgruppen zu entfernen. Der Ammoniak wird verdampft, der Rückstand wird durch 500ul destilliertes Wasser wieder aufgelöst und auf einer Sephadex-Säule G25 (Durchmesser 1cm, Höhe 7cm) filtriert, die dem ersten Peak entsprechenden Fraktionen sind lyophilisiert. Das Produkt wird durch Elektrophorese auf Agarosgel getrennt.
- Man stellt in derselben Weise wie in Beispiel 5 ein Nucleotid her, dessen Sequenz die folgende ist:
- indem man dieselben Synthone verwendet. Man erhält somit ein Nucleotid, welches am Beginn der Kette 20 an ihrem 5'-Ende biotynilierte Nucleotide umfaßt.
- Man stellt in derselben Weise wie in Beispiel 5 ein Oligonucleotid her, dessen Sequenz die folgende ist:
- Man erhält also ein Oligonucleotid, das 40 Oligonucleotide umfaßt, die an ihrem Ende der Sequenz markiert sind.
- Man stellt in derselben Weise wie in Beispiel 5 ein Oligonucleotid her, dessen Sequenz die folgende ist:
- in welchem T Thymidin darstellt, und drei Thymidine in die Verzweigung zwischen zwei Nucleosidderivaten der Erfindung eingebaut sind, um als Abstandhalter zu dienen.
- Man erhält somit ein Oligonucleotid, das 80 Nucleosidderivate umfaßt, die an ihrem 5'-Ende mit Biotin markiert sind. Beispiel 9: Herstellung von Polyol entsprechend der Formel (Ib) mit R&sup4;=(CH&sub2;)n, wobei n=3 und R¹=R²=H. (Verbindung Nr. 8)
- Man fügt 250mg doppelt hydriertes Lithiumaluminium mit Ethylen-3-Cethopimelat, wie durch Rabjohn, N, Org. Synth, col. Vol. 4 (1963) 302 (500mg, 2,2 mmol) beschrieben, zu auf 0ºC abgekühltem, anhydriertem Tetrahydrofuran (40ml). Nach 15min hält man bei Rückfluß während 15 bis 20min, dann läßt man fortschreitend abkühlen. Man kühlt auf 0ºC ab und man fügt ungefähr 5ml einer Lösung von 10% Wasser in Tetrahydrofuran hinzu.
- Man läßt 30min unter Rühren, man filtert den Aluminatniederschlag und man wäscht ihn durch 3x10ml Tetrahydrofuran. Man verdampft das Filtrat und man unterzieht den Rückstand der Chromatographie auf kurzer Säule (Silizium G Merck), indem man eine Chloroform- Methanol Mischung 95:5 dann 85:15 verwendet.
- Man erhält 300mg einer viskosen Flüssigkeit. Beispiel 10: Herstellung von teilweise geschütztem Polyol entsprechend der Formel (Ib) mit R&sup4;=(CH&sub2;)n wobei n=3, R¹=dmt und R²=H. (Verbindung Nr. 9)
- Man fügt 20ml Pyridin und 1,2 Äquivalente Trityl- Dimehtoxy-Chlorid zu 300mg (2,2mmol) der coevaporierten Verbindung Nr. 8 in Anwesenheit von anhydriertem Pyridin. Man läßt die Mischung unter Rühren während 3h bei 0ºC. Man fügt dann 10ml einer wässerigen 5%igen Lösung von Natriumbicarbonat hinzu und nach 30min führt man eine Trennung von Chloroform und Wasser durch. Die organische Phase wird eingedampft und der Rückstand wird auf einer Siliziumsäule G (Merck) chromatographiert, indem man durch einen Gradienten (30 bis 100%) Dichlormethan in Hexan eluiert, dann durch 2% Azeton in Dichlormethan.
- Man erhält 1,08g (72%) der Verbindung Nr. 9. Beispiel 11: Herstellung der Verbindung Nr. 10 entsprechend der Formel (Ib), mit R&sup4;=(CH&sub2;)n wobei n=3, R¹=dmt und R²=das Radikal der Formel (XI): (Verbindung Nr. 10)
- Die Verbindung Nr. 9 wird durch Bis- Diisopropylaminocyanoethoxyphosphin behandelt gemäß der in Beispiel 3 beschriebenen Methode.
- Nach der Behandlung reinigt man das Produkt durch Chromatographie auf einer kurzen Säule mit einem Gradienten von Dichlormethan in Hexan, gefolgt von einem Niederschlag in Hexan bei -78ºC.
- Man erhält somit die Verbindung Nr. 10. Beispiel 12: Herstellung der Verbindung Nr. 11 der Formel: (Verbindung Nr. 11)
- Diese Verbindung Nr. 11 ist ein Nucleosidderivat der Formel (Ia), in welcher R¹, R² und R³ ein Wasserstoffatom darstellen, B das Radikal der Formel (III) darstellt, wobei R&sup5; R&sup4;OR¹ darstellt, in dem R&sup4; (CH&sub2;)&sub6; darstellt und R¹ ein Wasserstoffatom darstellt und R&sup7; ein Wasserstoffatom darstellt.
- Das Ausgangsprodukt, 5-Chloromercuri-2'-Desoxyuridin, wird gemäß Bergstrom et al. (J. Carbohydr., Nucleoside Nucleotides 1977, 4, 257-269) hergestellt.
- Eine Lösung (0,1M) von Lithium-Tetrachloropalladat (11ml) in Methanol wird zu einer Suspension von 0,5g 5-Chloromercuri-2'-Desoxyuridin in Methanol (10mi) gefügt. Man fügt 0,33ml Hexen-5-ol-1 hinzu und man hält bei Rückfluß während 16h. Die Reaktionsmischung wird abgekühlt, dann mit H&sub2;S gesättigt und auf Celit gefiltert. Das Filtrat wird eingedampft und auf Silicagel (0,2-0,5mm) durch Coevaporation mit einer Mischung Chloroform-Methanol adsorbiert. Das Silicagel wird auf einer kurzen Säule von Siliziumgel G (Merck) abgeschieden. Das Produkt wird mit einem Gradienten von Methanol in Chloroform (0 bis 20%) eluiert.
- Durch Eindampfen erhält man 0,3g der Verbindung Nr. 12, die einer katalytischen Hydrierung unterzogen wird. (Verbindung Nr. 12)
- Die obige Verbindung wird in 20ml Methanol gelöst und in Anwesenheit von 30mg Palladium auf Kohlenstoff bei 10% hydriert. Nach 6h Hydrierung (30 PSI, also 2 Atm.), wird der Katalysator filtriert und das Lösungsmittel verdampft. Man erhält 0,25g (80%) der Verbindung Nr. 11. Beispiel 13: Herstellung der Verbindung Nr. 13 der Formel: (Verbindung Nr. 13)
- Die Verbindung Nr. 11 (0,25g, 0,8mmol) wird durch 0,6g Dimethoxytrityl-Chlorid in 15ml Pyridin behandelt, indem man dem Protokoll folgt, das für die Verbindung Nr. 2 in Beispiel 2 beschrieben ist. Man erhält 0,31 g der Verbindung Nr. 13. Beispiel 14: Herstellung der Verbindung Nr. 14 der Formel: (Verbindung Nr. 14)
- Die Verbindung Nr. 13 wird phosphatiert, indem man das in Beispiel 3 beschriebene Verfahren für die Herstellung der Verbindung Nr. 3 verwendet.
- Nach Fällen in Hexan erhält man die Verbindung Nr. 14. Beispiel 15: Herstellung der Verbindung Nr. 15 der Formel: (Verbindung Nr. 15)
- Diese Verbindung Nr. 15 ist ein Nucleosidderivat der Formel (Ia) in welcher R¹, R² und R³ Wasserstoffatome darstellen, B das Radikal der Formel (IV) darstellt, wobei R&sup7; ein Wasserstoffatom darstellt, R&sup6; das Radikal R&sup4;OR¹ darstellt, in dem R&sup4; (CH&sub2;)&sub6; darstellt und R¹ ein Wasserstoffatom darstellt.
- Das Ausgangsprodukt, 6-Chloro-9-(2'-Desoxyribofuranosyl)-Purin, wird gemäß Z. Kazimierczuk et al., J. Am. Chem. Soc., 106, 6379 (1984) hergestellt.
- Das 6-Chloronucleosid (500mg) wird durch Amino-6-Hexanol-1 (300mg, 2,5eq) behandelt. Man hält 3h bei Rückfluß, dann dampft man bis zur Trockne ein und man löst durch 15ml Wasser wieder auf. Die wässerige Phase wird durch 5x20ml Chloroform extrahiert, dann durch 20ml Ether, dann bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit 2ml Wasser aufgelöst, der erhaltene Niederschlag wird durch Filtration wieder gesammelt. Man erhält somit 370mg der Verbindung Nr. 15 (Wirkungsgrad 72%). Beispiel Nr. 16: Herstellung der Verbindung Nr. 16 der Formel: (Verbindung Nr. 16)
- Diese Verbindung wird ausgehend von Verbindung Nr. 15 hergestellt, indem man dem für die Herstellung von Verbindungen Nr. 2 und 13 in den Beispielen 2 und 13 beschriebenen Protokoll folgt. Das Produkt wird durch Säulenchromatographie durch das in Beispiel Nr. 2 beschriebene Verfahren gereinigt. Beispiel 17: Herstellung der Verbindung Nr. 17 der Formel: (Verbindung Nr. 17)
- Diese Verbindung wird ausgehend von Verbindung Nr. 16 hergestellt, indem man das für die Verbindungen 3 und 14 beschriebene Verfahren zur Phosphatisierung verwendet.
- In diesem Beispiel verwendet man dasselbe Verfahren wie in Beispiel Nr. 5 um ein verzweigtes Oligonucleotid entsprechend der folgenden Formel herzustellen:
- in welcher A das durch Adenin gebildete Nucleotid darstellt, C das durch Cytosin gebildete Nucleotid darstellt, G das durch Guanin gebildete Nucleotid darstellt, T das durch Thymin gebildete Nucleotid darstellt, und B die ausgehend von der Verbindung Nr. 10, beschrieben in Beispiel Nr. 11, gebildete Verzweigung darstellt.
- Für diese Synthese löst man die Verbindung Nr. 10 in Acetonitril (bei einer Konzentration von 0,15 bis 0,2mol/l) und man verwendet diese Lösung in dem Standardzyklus: "0,2umol Cyanoethylphophramidin" des Apparats Applied Biosystems, der in Beispiel Nr. 5 verwendet wird.
- Der geschätzte Wirkungsgrad der Kopplung durch Messung des Kations Dimethoxytrityl beträgt 94% für die Einführung der Verbindung Nr. 10.
- Man stellt in derselben Weise wie in Beispiel Nr. 18 ein Oligonucleotid komplementär zu einer Sequenz der Phage M13 her, deren Sequenz die folgende ist:
- indem man dieselben Synthone verwendet und die Verbindung Nr. 10 aus Beispiel Nr. 11 in Lösung in Acetonitril (0,2mol/l) auf einem Synthetisator Applied Biosystem, indem man das in Beispiel 5 angeführte Verfahren verwendet. Bis zur 17. Base wird der Standardzyklus "0,2umol" verwendet. Um die folgenden Kopplungen entsprechend mit 3 durch B oben bestimmten Verzweigungen sowie für die Einführung des Thymidins, verwendet man den Standardzyklus "1umol".
- In diesem Beispiel verwendet man ein verzweigte und mit einer Dinitrophenylgruppe (DNP) markiertes Oligonucleotid.
- Man stellt in derselben Weise wie in Beispiel 5 ein Oligonucleotid her, dessen Sequenz die folgende ist:
- Für diese Herstellung verwendet man für A und G die entsprechend durch Adenin und Guanin gebildeten, auf ihrer exozyklischen NH&sub2;-Gruppe durch Phenoxyacetylgruppen geschützten Nucleotide und für C das Nucleotid, gebildet ausgehend von Cytosin, dessen exozyklische NH&sub2;-Gruppe durch die Isobutyrylgrupe geschützt ist, wie es von Schulhof et al in Nucleic Acids Res. 1987, 15, S. 397-416 beschrieben ist.
- Für B verwendet man die Verbindung Nr. 10 in Lösung in Acetonitril bei 0,2mol/l.
- Man führt die Synthese aus, indem man den Standardzyklus "0,2umol" verwendet, nach dem Verzweigungspunkt, erhalten mit der Verbindung Nr. 10, eingeführt in Position 21, und man ein Cytosin- Residuum einbaut, das als Abstandhalter dient, dann ein markiertes Nucleotid, in dem man als Synthon das Phophoramidit-Derivat von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-4-N-(6-N(2,4-Dinitrophenyl)-Aminohexyl)-5 -Methyl-2'-Desoxycitidin verwendet, beschrieben in dem Dokument WO 89/12642. Man konserviert das Oligonucleotid in seiner tritylierten Form, dann unterzieht man es einem Abschnitt zur Schutzentfernung in Ammoniak (28%) während 16h bei 20ºC.
- Das Oligonucleotid wird in seiner tritylierten Form erhalten und durch Hochdruck-Flüssigchromatographie in inverser Phase (RT=48,9 min auf einer Säule C-18, Gradient 20 bis 60% CH&sub3;CN in TEAAC 0,05M in 60 min, 1ml/min) gereinigt.
- Das Oligonucleotid bindet sich in wirksamer Weise an Anti- Antikörpern DNP und zeigt ein Absorptionssverhältnis A&sub2;&sub6;&sub0;/A&sub3;&sub6;&sub0; in der Größenordnung von 8,7, was mit der Anwesenheit von zwei DNP-Gruppen in dem Molekül vergleichbar ist.
Claims (21)
1. Derivat eines polyhydroxylierten Moleküls
entsprechend der Formel
worin
- R¹ eine zur Oligonucleotidsynthese geeignete
Schutzgruppe für die OH-Gruppe ist,
- R² ein der Oligonucleotidsynthese angepaßter,
phosphorhaltiger, unsubstituierter oder mit OR¹ substituierter Rest
ist,
- R³ ein Wasserstoffatom, die Hydroxylgruppe, eine
geschützte Hydroxylgruppe oder den Rest R&sup4;OR¹ bedeutet, wobei R¹
die oben gegebene Bedeutung hat und R&sup4; einen zweiwertigen,
linearen oder verzweigten, substituierten oder
unsubstituierten Kohlenwasserstoffrest bedeutet, der gegebenenfalls in
seiner Kette eine oder mehrere Gruppierungen aufweist, die unter
O, S, NH, NHCO, NHSO&sub2;, SO&sub2;, CO, -C C-, CH=CH,
wobei t und u ganze Zahlen von 1 bis 2 sind, und
ausgewählt sind, und
- B einen von einer Purin- oder Pyrimidinbase
abgeleiteten Rest entsprechend den folgenden Formeln bedeutet:
worin R&sup5; für H, CH&sub3;, R&sup4;OR¹ oder R&sup8;Z steht, R&sup6; eine bei der
Nucleotidsynthese verwendbare schutzgruppe oder den Rest R&sup4;OR¹
oder R&sup8;Z bedeutet, R&sup7; ein Wasserstoffatom oder den Rest R&sup4;OR¹
oder R&sup8;Z bedeutet, unter der Bedingung, daß wenigstens einer
der Reste R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; für R&sup4;OR¹ steht, wenn R³ nicht für
R&sup4;OR¹ steht, und daß R² nicht den Substituenten R&sup4;OR¹ enthält,
während die Reste R¹ und R&sup4; gleich oder verschieden sein
können,
- R&sup4; einen zweiwertigen, linearen oder verzweigten,
substituierten oder unsubstituierten Kohlenwasserstoffrest
bedeutet, der gegebenenfalls in seiner Kette eine oder mehrere
Gruppierungen aufweist, die unter O, S, NH, NHCO, NHSO&sub2;, SO&sub2;,
CO, -C C-, CH=CH,
wobei t und u ganze Zahlen von 1 bis 2 sind, und
ausgewählt sind,
- R&sup8; eine einfache Bindung oder ein linearer oder
verzweigter, substituierter oder unsubstituierter
Kohlenwasserstoffrest ist, der gegebenenfalls in seiner Kette und/oder in
seinen Verzweigungen eine oder mehrere Gruppierungen aufweist,
die unter O, S, NH, NHCO, NHSO&sub2;, SO&sub2;, CO, -C C-, CH=CH,
wobei t und u ganze Zahlen von 1 bis 2 sind, und
ausgewählt sind, und
- Z ein von einem Markierungsmolekül, von einem Marker-
Vorläufermolekül oder von einem Molekül, das imstande ist,
sich mit anderen Molekülen zu assoziieren, abgeleiteter Rest
ist, unter der Bedingung, daß, wenn B den Rest der Formel (II)
bedeutet, worin R&sup4;OR¹ bedeutet, R&sup4; nicht (CH&sub2;)n bedeutet,
worin n eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist.
2. Derivat eines polyhydroxylierten Moleküls
entsprechend der Formel
worin
- R¹ eine für die Oligonucleotidsynthese geeignete
schutzgruppe für die OH-Gruppe ist,
- R² ein der Oligonucleotidsynthese angepaßter,
phosphorhaltiger, unsubstituierter oder mit OR¹ substituierter Rest
ist,
- R&sup4; einen zweiwertigen, linearen oder verzweigten,
substituierten oder unsubstituierten Kohlenwasserstoffrest
bedeutet, der gegebenenfalls in seiner Kette eine oder mehrere
Gruppierungen aufweist, die unter O, S, NH, NHCO, NHSO&sub2;, SO&sub2;,
CO, -C C-, CH=CH,
wobei t und u ganze Zahlen von 1 bis 2 sind, und
ausgewählt sind.
3. Derivat nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch
gekennzeichnet, daß R¹ einen Tritylrest der Formel
bedeutet, worin R&sup9;, R¹&sup0; und R¹¹, die gleich oder verschieden
sein können, ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl-, Alkoxy-
oder Aminogruppe bedeuten.
4. Derivat nach einem der Ansprüche 1 und 2, dadurch
gekennzeichnet, daß R² ein phosphorhaltiger Rest ist, der
unter den Resten der Formeln
ausgewählt ist, worin R¹ und R&sup4; die in Anspruch 1 gegebene
Bedeutung haben, R' und R'', für sich genommen, jeweils einen
Alkyl-, Aralkyl- oder Cycloalkylrest bedeuten, der bis zu 10
Kohlenstoffatome enthält, oder R' und R'' zusammen eine
Alkylenkette bilden, die in der Hauptkette bis zu 5
Kohlenstoffatome und insgesamt bis zu 10 Kohlenstoffatome enthält, oder
R' und R'' zusammen mit dem Stickstoffatom einen gesättigten
Heterocyclus bilden, der ein oder mehrere unter N, O und S
ausgewählte Heteroatome enthalten kann.
5. Derivat nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
R² den Rest der Formel
bedeutet.
6. Derivat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß
R¹ der Dimethoxytritylrest ist.
7. Nucleosidderivat der Formel (Ia) nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß B
bedeutet.
8. Nucleosidderivat nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß R&sup4; für -(CH&sub2;)n-NH-(CH&sub2;)p steht, worin n und p
ganze Zahlen von 1 bis 6 sind.
9. Derivat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß
n und p gleich 2 sind.
10. Derivat nach einem der Ansprüche 1, 7, 8 und 9,
dadurch gekennzeichnet, daß R³ ein Wasserstoffatom bedeutet.
11. Derivat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
R&sup4; für -(CH&sub2;)n- steht, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 6
ist.
12. Derivat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß n gleich 3 ist.
13. Verfahren zur Bildung wenigstens einer Verzweigung
in einem Oligonucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es
nacheinander die folgenden Schritte umfaßt:
a) Fixieren eines Derivats des polyhydroxylierten
Moleküls der Formel
worin R¹, R², R³ und B die in Anspruch 1 gegebene Bedeutung
haben, an diesem Oligonucleotid, und
b) Reaktion der OH-Gruppen des fixierten Derivats mit
Molekülen, die imstande sind, mit den durch Trennen der
OR¹-Bindungen erhaltenen OH-Gruppen zu reagieren.
14. Verfahren zur Bildung wenigstens einer Verzweigung
in einem Oligonucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß es
nacheinander die folgenden Schritte umfaßt:
a) Fixieren eines Derivats des polyhydroxylierten
Moleküls der Formel
worin R¹, R² und R&sup4; die in Anspruch 2 gegebene Bedeutung
haben, an diesem Oligonucleotid, und
b) Reaktion der OH-Gruppen des fixierten Derivats mit
Molekülen, die imstande sind, mit den durch Trennen der
OR¹-Bindungen erhaltenen OH-Gruppen zu reagieren.
15. Verfahren zur Bildung wenigstens einer Verzweigung
in einem linearen Oligonucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß
es nacheinander die folgenden Schritte umfaßt:
a) Fixieren eines als Abstandshalter dienenden Moleküls
an diesem Oligonucleotid,
b> Fixieren eines Derivats des polyhydroxylierten
Moleküls der Formel
worin R¹, R², R³ und B die in Anspruch 1 gegebene Bedeutung
haben, an diesem als Abstandshalter dienenden Molekül,
c) Reaktion der OH-Gruppen des fixierten Derivats mit
Molekülen, die imstande sind, mit den durch Trennen der
OR¹-Bindungen erhaltenen OH-Gruppen zu reagieren.
16. Verfahren zur Bildung wenigstens einer Verzweigung
in einem linearen Oligonucleotid, dadurch gekennzeichnet, daß
es nacheinander die folgenden Schritte umfaßt:
a) Fixieren eines als Abstandshalter dienenden Moleküls
an diesem linearen Oligonucleotid,
b) Fixieren eines Derivats eines polyhydroxylierten
Moleküls der Formel
worin R¹, R² und R&sup4; die in Anspruch 2 gegebene Bedeutung
haben, an diesem als Abstandshalter dienenden Molekül, und
c) Reaktion der OH-Gruppen des fixierten Derivats mit
Molekülen, die imstande sind, mit den durch Trennen der
OR¹-Bindungen erhaltenen OH-Gruppen zu reagieren.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16,
dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle, die imstande sind,
mit den durch Trennen der OR¹ erhaltenen OH-Gruppen zu
reagieren, unter den Nucleosiden, den markierten Nucleosiden, den
Molekülen, die als Abstandshalter dienen können, den
Markierungsmolekülen,
den Molekülen, die markiert werden können, den
Derivaten der polyhydroxylierten Moleküle der Formel (Ia) oder
(Ib) und den Molekülen, die sich mit anderen Moleküle
assoziieren können, ausgewählt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß das Molekül, das markiert werden kann, ein
Nucleosidderivat ist, das man dann mit Phosphor-32 markiert.
19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß das Markierungsmolekül ein Molekül ist, das sich mit
Avidin oder Streptavidin assoziieren kann.
20. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß das Markierungsmolekül ein Molekül ist, das Fluoreszenz-
oder Lumineszenzeigenschaften besitzt.
21. Oligonucleotid entsprechend der Formel
An1-N'a-N-C ,
worin
- n1 eine ganze Zahl größer als 1 ist,
- die A gleiche oder verschiedene Nucleotide sind,
- N' ein als Abstandshalter dienendes Molekül ist,
- a gleich 0 oder eine ganze Zahl ist,
- N ein Derivat eines polyhydroxylierten Moleküls nach
Anspruch 1 oder 2 ist und
- C das Ende des Oligonucleotids ist, das wenigstens zwei
gleiche oder verschiedene Verzweigungen umfaßt, die jeweils
aus einem oder mehreren, gleichen oder verschiedenen Molekülen
gebildet sind, die unter N', N, M und A ausgewählt sind, wobei
M ein markiertes Nucleotid, ein Markierungsmolekül oder ein
Marker-Vorläufermolekül oder ein Molekül, das sich mit anderen
Molekülen assoziieren kann, bedeutet.
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