DE69815370T2

DE69815370T2 - Fluoreszend-konjugaten von nukleosiden und von nukleotiden, ihrer verfahren zur herstellung und ihrer verwendungen

Info

Publication number: DE69815370T2
Application number: DE69815370T
Authority: DE
Inventors: Herve Bazin; Gerard Mathis
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-02
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2018-10-03
Also published as: FR2769315A1; WO1999018114A1; JP2001519354A; US6340747B1; EP1025115B1; ATE242261T1; AU751147B2; KR20010030885A; CA2305811A1; DE69815370D1; ES2201533T3; EP1025115A1; FR2769315B1; AU9355698A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue fluoreszierende Nucleosid- oder Nucleotid-Konjugate, die insbesondere zum Nachweis, zur Lokalisierung und/oder zur Isolierung von Nucleinsäuren oder biologisch oder klinisch interessanten Molekülen, die Nucleosidstruktur haben oder mit Nucleinsäuren wechselwirken können, verwendet werden können.

Nachstehend werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

RNA	Ribonucleinsäure
DNA	Desoxyribonucleinsäure
A	Adenosin
C	Cytidin
G	Guanosin
T	Thymidin
U	Uridin
I	Inosin
Suffix MP	Monophosphat
Suffix DP	Diphosphat
Suffix TP	Triphosphat
Präfix d	Desoxy.

Bei einer Reaktion zur enzymatischen Synthese von DNA verwendet man ein RNA- oder DNA-Templat, einen Oligonucleotidprimer mit einer zu einem Segment des Templats komplementären Sequenz, ein geeignetes Enzym und die vier Desoxynucleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP (oder dUTP). Es sind verschiedene Enzyme bekannt, wie E.-coli-DNA-Polymerase, T7-DNA-Polymerase, das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase und eine inverse Transkriptase, die mit terminaler Nucleotidyltransferase versetzt werden können, welche die Besonderheit aufweist, daß sie kein Templat benötigt. Die Synthese von RNA wird auf ähnliche Art und Weise durchgeführt, wobei man jedoch andere Primer und Template sowie Ribonucleotide (ATP, CTP, GTP und UTP) in Gegenwart von RNA-Polymerasen verwendet.
Die Nucleotide oder Polynucleotide könne radioaktiv markiert sein (³H, ³²P, ¹⁴C, ³⁵S oder ¹²⁵I).
Die Verwendung von markierten Molekülen ist mit den üblicherweise mit radioaktiven Isotopen assoziierten Nachteilen behaftet, nämlich den mit Radioaktivität verbundenen Risiken sowie aufgrund von radioaktivem Zerfall und Radiolysephänomenen begrenzter Lagerung und Verfügbarkeit.
Diese Nachteile können durch die in der Literatur beschriebene chemische Markierung von Nucleotiden und Polynucleotiden vermieden werden. Insbesondere wurde die Biotinmarkierung von Nucleotiden, die sich von dUTP oder UTP ableiten, beschrieben (Langer P. R., Waldrop A. A., Ward D. C., 1981; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6633–37). Hierbei handelt es sich um Derivate, in denen das Biotin über einen Alkylamin-Arm an die C-S-Stellung des Pyrimidinrings gebunden ist. Diese markierten Nucleotide werden durch Einwirkung von DNA- oder RNA-Polymerasen in vitro in Polynucleotide eingebaut ( EP 0 063 879 ) und ermöglichen einen kolorimetrische Nachweis von Nucleinsäuren durch eine Dot-Blot-Reaktion (Leary J. J., Brigati D. J. und Ward D. D.; 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4045–49).
Andere Analoge von biotinmarkierten Nucleotiden auf Basis von N-4-Aminoalkyldesoxycytidin- und N-6-Aminoalkyldesoxyadenosin-Derivaten werden in der Patentschrift US 4,828,979 und in Gebeyehu G. G. et al., Nucleic. Acids Res.; 1987, 15, 4513–4534, beschrieben.
Es wurde auch schon über Derivate von dUTP und dATP mit Biotinsubstituition in C-8-Stellung sowie die Möglichkeit der C-7-Substitution eines 7-Desazapurins berichtet ( EP 0 063 879 ).
Das Derivat Bio-15-dGTP ist auch schon beschrieben worden (Gilliam I. C. und Tener G. M.; 1989; Nucleoside & Nucleotide; 8, 1453–62). Fluoreszierende Derivate, wie Fluorescein oder Rhodamin, können mit Hilfe eines markierten Nucleosidtriphosphats (dATP, dUTP, dCTP) in eine Nucleinsäure eingebaut werden (WO 93 19206). Eine Diskussion über das Substitutionsmuster bei Purinen und Pyrimidinen sowie die Beschaffenheit der zur Markierung von Didesoxynucleotiden mit Fluorescein-Derivaten verwendbaren Spacer, die allerdings Kettenterminatoren für die Sequenzierung gewidmet ist, gibt einen Überblick über die Chemie markierter Nucleotide (Confalone P. T., 1990, J. Heterocyclic Chem., 27, 31– 46).
Die kombinierte Verwendung von mit verschiedenen Tracern markierten Nucleosidtriphosphaten (Biotin-11-dUTP, dig-11-dUTP und FITC-11-dUTP, ermöglicht eine gleichzeitige Visualisierung von verschiedenen Sequenzen bei einer Hybridisierung (RIED T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89, 1388–1392).
Der Einbau von fluoresceinmarkierten Desoxynucleotiden, wie F1-dUTP oder F1-dCTP, erfolgt ebenfalls durch nur teilweisen Ersatz des natürlichen Nucleotids durch die markierte Verbindung, dCTP/FldCTP ≈ 2 : 1 (WO 93/19206). In derselben Patentschrift wird auch angegeben, daß man durch die Wahl des Enzyms und der Versuchsbedingungen das gesamte Nucleotid durch ein markiertes Nucleotid ersetzen kann.
Die Literaturangaben zeigen, daß die Effizienz des Einbaus eines Triphosphatkonjugats durch die Kupplung mit einem Molekül wie Biotin und in geringerem Maße durch die Gegenwart des die Kupplung ermöglichenden Arms verändert wird.
So wurden beispielsweise bei einer "Nick-Translationsreaktion" in Gegenwart einer DNA-Polymerase die Einbaugrade verschiedener Triphosphat-Analoga mit dem natürlichen Nucleosid als Referenz (100 Einbau) für die gleiche Reaktionszeit (90 min) verglichen (Gebeyehu G. et al., Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4525).
Die mit Nucleosidtriphosphaten konjugierten Moleküle (Goodchild, J., Bioconjugate Chem., 1990, p. 171; Kricka J., Non isotopic Blotting, and Sequencing, 1995, Academic Press, p. 47; Zhu Z. et al., Nucleic Acids Res., 1994, 3418–3422) sind verhältnismäßig klein (< 800 Da), entweder neutral oder negativ geladen und weitgehend planar, so daß ihre sterische Hinderung verringert ist, aber den enzymatischen Einbau des Nucleosidtriphosphats noch stört.
Seltenerdmetallkryptate, die als Marker zum Nachweis von biologischen Substanzen verwendet werden können, werden in der Patentanmeldung EP 0 321 353 beschrieben.
In der Patentanmeldung WO 92/14841 werden Konjugate aus einem Seltenerdmetallchelat mit n Triazin-Einheiten, die kovalent an ein Oligonucleotid mit mindestens 4 + n Desoxy- oder Ribonucleotiden gebunden sind, beschrieben.
Es wurden nun neue Nucleosid- und Nucleotid-Konjugate gefunden, die:

– ein natives oder chemisch modifiziertes oder mit einem oder mehreren Markermolekülen konjugiertes Ribo- oder Desoxyribonucleosid oder -nucleotid, worin mindestens ein Kohlenstoffatom des Rings, ein exocyclisches Stickstoffatom des Purin- oder Pyrimidinrings oder ein Kohlenstoffatom des Pentofuranoserings mit einem Fluoreszenzmarker eine Bindung eingehen kann, und
– mindestens einen an das Atom bzw. die Atome gebundenen Fluoreszenzmarker, der aus einem Seltenerdmetallkryptat besteht, enthalten.

Nach einer bevorzugten Ausgestaltung enthalten die Konjugate:

– ein natives oder chemisch modifiziertes oder mit einem oder mehreren Markermolekülen konjugiertes Ribo- oder Desoxyribonucleosid oder -nucleotid, worin mindestens ein Kohlenstoffatom des Rings oder ein exocyclisches Stickstoffatom des Purin- oder Pyrimidinrings mit einem Fluoreszenzmarker eine Bindung eingehen kann, und
– mindestens einen an das Atom bzw. die Atome gebundenen Fluoreszenzmarker, der aus einem Seltenerdmetallkryptat besteht,

Die Konjugate können ohne größere Nachteile bei allen Anwendungen markierter Nucleoside oder Nucleotide verwendet werden und können insbesondere gut in einzelsträngige oder doppelsträngige DNA eingebaut werden.
Diese Eigenschaften sind um so überraschender, als es sich bei Seltenerdmetallkryptaten um Moleküle mit hoher Molmasse (über 1400 Da), dreidimensionaler Struktur, die eine größere sterische Hinderung als ein insgesamt planares Molekül aufweist, und ionischem Charakter, da das komplexierte Ion ihnen eine positive Ladung verleiht, handelt.
Aufgrund dieser strukturellen Eigenschaften könnte man erwarten, daß die positiven Ladungen eines Seltenerdmetallkryptats mit den negativen Ladungen der Triphosphatgruppe stark wechselwirken und deren Reaktivität sowie die Fluoreszenzqualitäten des Kryptats verändern.
Da die Aktivität von Enzymen wie Polymerasen gegenüber der Gegenwart und Konzentration bestimmter komplexierender Ionen oder Agentien im Reaktionsmedium empfindlich ist, könnte man außerdem erwarten, daß die erfindungsgemäßen Konjugate eine starke Verringerung des Einbaus der Nucleosidtriphosphate und somit eine geringe Ausbeute, insbesondere bei einer Polynucleotidsynthese, mit sich bringen.
Überraschenderweise geht aus den unter Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate erhaltenen Ergebnissen hervor, daß die Seltenerdmetallkryptate nicht nur bei Anwendungen mit enzymatischen Reaktionen keinen ungünstigen Einfluß haben, sondern auch ihre intrinsischen Fluoreszenzeigenschaften behalten.
Vorteilhafterweise wurde außerdem gefunden, daß die erfindungsgemäßen Konjugate neue Fluoreszenzcharakteristika aufweisen und insbesondere die Emissionslebensdauer des komplexierten Seltenerdmetallions wesentlich erhöht wird.
Die Konjugate können daher bei allen Anwendungen, bei denen ein quantitativer oder qualitativer Nachweis durch Messung der direkten oder indirekten Fluoreszenz durchgeführt wird, als Fluoreszenzmarker verwendet werden.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung betrifft die Erfindung Nucleotid-Konjugate, die ein unter AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2Me-AMP, 2Me-ADP, 2Me-ATP, 1Me-GMP, 1Me-GDP, 1Me-GTP, 5Me-CMP, 5Me-CDP, 5Me-CTP, 5MeO-CMP, 5MeO-CDP, 5MeO-CTP, 7-Desaza-ATP oder 7-Desaza-GTP ausgewähltes Ribonucleotid oder ein unter den diesen Ribonucleotiden entsprechenden Desoxy- oder Didesoxyribonucleotiden ausgewähltes Desoxyribonucleotid und insbesondere

– in 5-Stellung der Base funktionalisierte Derivate von 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat oder Uridin-5'-triphosphat (hauptsächlich Aminoallyl- oder Aminopropingrüst),
– in 4- oder 5-Stellung der Base funktionalisierte Derivate von 2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat oder Cytidin-5'-triphosphat (für die 5-Stellung hauptsächlich Aminoallyl- oder Aminopropingrüst),
– in 6- oder 8-Stellung der Base funktionalisierte Derivate von 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat oder Adenosin-5'-triphosphat,
– in 6- oder 8-Stellung der Base funktionalisierte Derivate von 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat oder Guanosin-5'-triphosphat,
– in 7-Stellung der Base funktionalisierte Derivate von 2'-Desoxy-7-desazaadenosin-5'-triphosphat oder 7-Desazaadenosin-5'-triphosphat und
– in 7-Stellung der Base funktionalisierte Derivate von 2'-Desoxy-7-desazaguanosin-5'-triphosphat oder 7-Desazaguanosin-5'-triphosphat

Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendbaren Nucleotide können auch im Triphsophatteil chemisch modifizierte Nucleotide enthalten, insbesondere α-Thiotriphosphate.
Gemäß einer anderen Ausgestaltung betrifft die Erfindung fluoreszierende Nucleosid-Konjugate, bei denen das Ribo- oder Desoxyribonucleosid unter A, G, C, U, T, den entsprechenden Desoxy- oder Didesoxynucleosiden und chemisch modifizierten Analogen davon und insbesondere 3'-Azido-3'-desoxythymidin und Derivaten davon und den 2',3'-Didesoxyanalogen von A, T, C, G, U und I ausgewählt ist.
Der Fluoreszenzmarker besteht aus einem Seltenerdmetallkryptat, das vorzugsweise unter Kryptaten des Terbiums, Europiums, Samariums oder Dysprosiums ausgewählt ist.
Nachstehend richten sich der Begriff "Kryptat" und die Nomenklatur der verwendbaren Makrocyclen und Polycyclen nach den Definitionen von J. M. Lehn in Struct. Bonding (Berlin), 16, 1, 1973, und in Acc. Chem. Res. 11, 49 (1978).
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung besteht das Seltenerdmetallkryptat aus mindestens einem durch eine makropolycyclische Verbindung der Formel
worin Z für ein drei- oder vierbindiges Atom steht, R nicht vorhanden ist oder für Wasserstoff, Hydroxyl, eine Aminogruppe oder einen Kohlenwasserstoffrest steht, die zweiwertigen Reste
unabhängig voneinander für Kohlenwasserstoffketten, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthalten und gegebenenfalls durch einen Heteromakrocyclus unterbrochen sind, stehen, wobei mindestens einer der Reste
außerdem mindestens eine Molekülgruppierung enthält oder im wesentlichen aus einer Molekülgruppierung besteht, deren Triplettenergie über der Triplettenergie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions liegt, komplexierten Seltenerdmetallsalz.
Vorzugsweise handelt es sich um ein Kryptat, das aus mindestens einem durch eine makropolycyclische Verbindung der obigen Formel (I) komplexierten Seltenerdmetallsalz besteht, bei dem die Molekülgruppierung unter Phenanthrolin, Anthracen, Benzol, Naphthalin, Bi- und Terphenyl, Azobenzol, Azopyridin, Pyridin, Bipyridinen, Bischinolinen und Verbindungen der nachstehenden Formeln ausgewählt ist: -C₂H₄-X₁-C₆H₄-X₂-C₂H₄- -C₂H₄-X₁-CH₂-C₆H₄-CH₂-X₂-C₂H₄-, wobei X₁ und X₂ gleich oder verschieden sein können und für Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel stehen,
wobei X für Sauerstoff oder Wasserstoff steht.
Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung handelt es sich bei dem Fluoreszenzmarker um ein Seltenerdmetallkryptat, das aus einem durch eine der nachstehenden makrocyclischen Verbindungen komplexierten Terbium- oder Europiumion besteht:
(22)Phenanthrolin, (22)Phenanthrolinamid, (22)Anthracen, (22)Anthracenamid, (22)Bi-isochinolin, (22)Biphenyl-bis-pyridin, (22)Bipyridin, (22)Bi-pyridinamid und Tris-bipyridin-, Tris-phenanthrolin-, Phenanthrolin-bis-bipyridin-, Bi-isochinolin-bis--bipyridin- und Bis-bipyridin-diphenylbipyridin-Makropolycyclen.
Ein besonders vorteilhafter Marker ist das Europiumkryptat Eu-trisbipyridin.
Derartige Verbindungen werden beispielsweise in der EP 180 492 beschrieben.
In Betracht kommen auch die Seltenerdmetallionen komplexierende makropolycyclische Kryptatverbindungen, bei denen die Molekülgruppierung unter Bipyrazinen, Bipyrimidinen und Stickstoffheterocyclen mit N-Oxid-Gruppen ausgewählt ist.
Makropolycyclische Verbindungen mit Bipyrazin-Einheiten werden in F. Bodar-Houillon et al., New J. Chem., 1996, 20, 1041–1045, beschrieben.
Makropolycyclische Verbindungen mit Bipyrimidin-Einheiten werden in J. M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1992, 75, 1221, beschrieben.
Makropolycyclische Verbindungen mit Stickstoffheterocyclen mit N-Oxid-Gruppen werden in J. M. Lehn et al., Helv. Chim. Acta, 1991, 74, 572, beschrieben.
Das als Fluoreszenzmarker verwendete Seltenerdmetallkyptat kann auch aus mindestens einem durch eine makropolycyclische Verbindung einer der nachstehenden Formeln II oder III komplexierten Seltenerdmetallsalz bestehen:
worin:

– es sich bei dem Ring der Formel
um einen der folgenden Ringe handelt:
– Y für eine Gruppe oder einen Spacer steht, der aus einem zweiwertigen organischen Rest besteht, der unter linearen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylengruppen, die gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen und/oder gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, oder eine oder mehrere Carbamoyl- oder Carbonsäureamidgruppen enthalten können; C₅- bis C₈-Cycloalkylengruppen oder C₆- bis C₁₉-Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls durch Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind, ausgewählt ist;
– Z für eine funktionelle Gruppe, die mit einer biologischen Substanz eine kovalente Bindung eingehen kann, steht;
– R für eine Methylgruppe oder die Gruppe -Y-Z steht;
– R' für Wasserstoff oder eine -COOR''-Gruppe, worin R'' eine C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe und vorzugsweise Methyl, Ethyl oder tert.-Butyl bedeutet, oder eine -CO-NH-Y-Z-Gruppe steht.

Derartige Verbindungen werden beispielsweise in der EP 321 353 beschrieben.
In den erfindungsgemäßen Konjugaten kann der Fluoreszenzmarker direkt oder über einen Spacer an das Ribo- oder Desoxyribonucleosid oder -nucleotid gebunden sein.
Unter "direkter Bindung" versteht man die Bindung des Fluoreszenzmarkers an eine an einem oder mehreren Atomen der Base oder der Pentafuranoseeinheit des Ribo- oder Desoxyribonucleosids oder -nucleotids vorher eingeführte oder gebildete funktionelle Gruppe.
Als funktionelle Gruppe wird im Rahmen der vorliegenden Beschreibung jede am Nucleosid- oder Nucleotidteil vorliegende oder nach einem beliebigen, dem Fachmann bekannten Verfahren an diesem Teil eingeführte Funktion bezeichnet, die direkt oder nach Aktivierung mit einer am Kryptat oder dem Spacer des Kryptats vorhandenen Funktion eine kovalente Bindung eingehen kann. Derartige funktionelle Gruppen sind insbesondere die Funktionen NH₂, COOH, CHO, OH oder SH sowie Funktionen, die durch Substitution (Halogenide, Sulfonate, Epoxid) oder durch Addition (Doppelbindungen vom Maleinimid-Typ) kovalente Bindungen ergeben können. Diese Funktionen befinden sich im allgemeinen an einer Kohlenwasserstoffkette, die selbst an den Nucleosid- oder Nucleotidteil gebunden ist.
Verfahren zur Einführung dieser funktionellen Gruppen werden insbesodere in C. Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing, 2. Auflage, L. J. Kricka (1995), Hrsg. Academic Press Ltd., London, S. 66–72, beschrieben.
Der Spacer besteht beispielsweise aus einem zweiwertigen organischen Rest, der unter linearen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylengruppen, die gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen oder Dreifachbindungen und/oder gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, oder eine oder mehrere Carbamoyl- oder Carbonsäureamidgruppen enthalten können; C₅-C₈-Cycloalkylengruppen und C₆-C₁₄- Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls durch Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind, ausgewählt ist.
Insbesondere kann er unter den Gruppen:
ausgewählt sein.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung enthält das erfindungsgemäße Konjugat ein Desoxyribonucleotid, bei dem es sich um Desoxyuridin handelt, einen Fluoreszenzmarker, bei dem es sich um das Europiumkryptat Eu-trisbipyridin handelt, und einen Spacer, bei dem es sich um eine 3-Aminoallylgruppe handelt.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltung betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Konjugate.
Das Herstellungsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man ein natives oder chemisch modifiziertes oder mit einem oder mehreren Markermolekülen konjugiertes Ribo- oder Desoxyribonucleosid oder -nucleotid, worin mindestens ein Kohlenstoffatom des Rings, ein exocyclisches Stickstoffatom des Purin- oder Pyrimidinrings oder ein Kohlenstoffatom der Pentofuranoseeinheit mit dem Fluoreszenzmarker eine Bindung eingehen kann, mit mindestens einem an das Atom bzw. die Atome gebundenen Fluoreszenzmarker, der aus einem Seltenerdmetallkryptat besteht, umsetzt und das so erhaltene Konjugat isoliert.
Bei diesem Herstellungsverfahren können Ribo- oder Desoxyribonucleoside oder -nucleotide und Fluoreszenzmarker eingesetzt werden, wie sie oben beschrieben sind.
Die erfindungsgemäßen Konjugate, die ein Ribo- oder Desoxyribonucleotid enthalten, eignen sich insbesondere für alle Anwendungen, bei denen eine qualitative oder quantitative Bestimmung bei der Synthese oder Verwendung von Polynucleotiden erforderlich ist.
Gemäß einer Ausgestaltung betrifft die Erfindung auch die Polynucleotide, die mindestens ein fluoreszierendes Ribo- oder Desoxyribonucleotid-Konjugat gemäß obiger Beschreibung als Nucleotidbaustein enthalten.
Vorteilhafterweise können die durch Einbau erfindungsgemäßer Konjugate erhaltenen Polynucleotide mehr als ein Konjugat und somit mehr als einen Fluoreszenzmarker enthalten.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Konjugate kann man somit die Mehrfachmarkierung von Polynucleotiden auf enzymatischem Wege vornehmen. Mit dieser Technik sind markierte Polynucleotide leichter erhältlich, wobei eine bessere Reproduzierbarkeit als bei herkömmlichen Techniken zur Fluoreszenzmarkierung auf chemischem Wege gewährleistet ist. Insbesondere entfallen hierbei die zur Entfernung der nicht umgesetzten Polynucleotide und/oder funktionalisierten Fluoreszenzmarker aus dem Medium notwendigen Trennschritte.
Es sei darauf hingewiesen, daß bei Verwendung von bifunktionalisierten Kryptaten die Konjugation nur an einem Arm erfolgt, was immer den Einbau des Konjugats im Rahmen einer Polynucleotidsynthese ermöglicht.
Die erfindungsgemäßen Konjugate, die ein Ribo- oder Desoxyribonucleotid enthalten, können zum Nachweis und/oder zur Lokalisierung von Verbindungen mit mindestens einer Nucleinsäuresequenz verwendet werden.
Unter diesen Verwendungen seien beispielhaft aufgeführt:

– Nachweis und/oder Lokalisierung von spezifischen DNA-Sequenzen, beispielsweise zur Kartierung von Chromosomen oder zum Nachweis einer Mutation;
– Synthese von Sonden, die in der biomedizinischen Forschung oder zur Ausarbeitung einer klinischen Diagnose verwendet werden können.

Man kann sie auch bei einem Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität eines an einer Nucleinsäure-Synthesereaktion beteiligten Enzyms, beispielsweise der Aktivität einer DNA- oder RNA-Polymerase, inversen Transkriptase, Transferase oder Ligase, verwenden, bei dem man die von dem Konjugat direkt oder indirekt emittierte Fluoreszenz mißt, wobei die Fluoreszenzemission mit dem Einbaugrad des Konjugats in das synthetisierte Nucleinsäure-Polynucleotid korreliert wird.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können auch zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität eines Enzyms mit einer Nucleinsäure als Substrat, beispielsweise der Aktivität einer Phosphodiesterase, DNAse oder RNAse, verwendet werden, wobei die von dem Konjugat direkt oder indirekt emittierte Fluoreszenz entweder mit der Aktivität oder der Inhibierung der Aktivität korreliert wird.
Man kann sie auch zur Bestimmung einer enzymatischen Aktivität, bei der die Struktur einer Nucleinsäure verändert wird, wie z. B. der Aktivität einer Helicase oder Integrase, oder einer Aktivität, bei der die Topologie einer Nucleinsäure verändert wird, wie der Aktivität einer Topoisomerase, verwenden.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können auch als Marker verwendet werden, beispielsweise zur Herstellung einer Verbindung, die eine Nucleinsäure enthält, in die das Konjugat zwecks Nachweis eingebaut ist.
Die von den erfindungsgemäßen Konjugaten emittierte Fluoreszenz kann entweder "direkt", wobei das Leuchtsignal von dem Konjugat nach Anregung bei einer gegebenen Wellenlänge emittiert wird, oder "indirekt", wobei die Emission des Leuchtsignals durch strahlungslosen Energietransfer zwischen dem Konjugat nach Anregung, der "Donorverbindung", und einem anderen fluoreszierenden Molekül, der "Akzeptorverbindung", induziert wird, sein.
In diesem speziellen Fall sind die folgenden Bedingungen erfüllt:

– zum einen besitzt die fluoreszierende Akzeptorverbindung ein Absorptionsspektrum, das sich zumindest teilweise mit dem Emissionsspektrum des Donors deckt und in dieser Deckungszone einen großen molaren Absorptionskoeffizienten aufweist, und ein Emissionsspektrum in einem Wellenlängenbereich, in dem der Donor eine geringe intrinische Emission aufweist;
– zum anderen befinden sich der Akzeptor und der Donor nahe zueinander, wobei ihre Übergangsdipole ungefähr parallel orientiert sind.

Das Prinzip der Technik des strahlungslosen Energietransfers wird insbesondere in G. Mathis et al., Clin. Chem., 1993, 39, 1953–1959, beschrieben.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, in denen bestimmte Konzentrationen in Absorptionseinheiten (AU) bei einer gegebenen Wellenlänge (in nm) pro Volumeneinheit (in ml) angegeben und durch die gleiche Zahl wie die optische Dichte der betreffenden Lösung ausgedrückt sind.
BEISPIEL 1: Synthese von mit Europium-trisbipyridin-Kryptat markiertem Desoxyuridin (Konjugat K-11-dUTP)
In diesem Konjugat gibt die Zahl 11 die Gesamtzahl der Spaceratome und der die Kryptatstruktur mit dem Nucleotid verbindenden funktionellen Gruppe (hier erfolgt die Bindung in 5-Stellung des Pyrimidins) an.
Als Nucleosidtriphosphat verwendet man 5-[N-(6-Aminocaproyl)-3-aminoallyl]-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (AH-dUTP), das durch Umsetzung von Trifluoracetamidocapronsäure-N-hydroxysuccinimidylester (M. S. Urdea et al., Nucleic Acids Res., 1988, 4937) mit nach einem Literaturverfahren (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 78, 6633–6637) hergestelltem 5-(3-Aminoallyl)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat und anschließende Entschützung mit Ammoniak (3%iges wäßriges NH₄OH, 45 min bei 60°C) erhalten wird. Die Verbindung wird an DEAE-Sepharose® (Pharmacia) mit einem linearen Triethylammoniumhydrogencarbonat-Gradienten (0,1 M bis 0,3 M) gereinigt.
1) Methode A
Man verdünnt 68 μl einer AH-dUTP-Lösung mit einer Konzentration von 6 μmol/ml (d. h. 0,4 μmol) mit 250 μl 0,1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB), pH 7,8, und versetzt mit 320 μl einer Lösung des N-Hydroxysuccinimid-Kryptats (4 mg/ml in Acetonitril), die folgendermaßen hergestellt wurde. Das in Beispiel 4, Teil A, der Patentanmeldung EP 0 321 353 beschriebene Europium-[(bis-bpy)-(bpy-diester)]-Kryptat wird mit NaOH hydrolysiert, wonach das erhaltene Disäure-Kryptat an einer RP-18-HPLC-Säule (Gradient von Acetonitril in 1%iger wäßriger Trifluoressigsäure) gereinigt wird. Das so erhaltene Europium-[(bis-bpy)-(bpy-disäure)]-Kryptat (4 mg) wird in 0,5 ml wasserfreiem Acetonitril gelöst und mit 1 mg N-Hydroxysuccinimid und danach mit einer Lösung von 1,9 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Acetonitril versetzt. Nach 16 h Reaktionszeit wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und die Lösung des N-Hydroxysuccinimid-Kryptats direkt für die Kupplung verwendet.
Nach 45 min Rühren versetzt man mit 15 μl 1 M TEAB, pH 8,5, und gibt die Mischung auf eine Superdex-30®-HR-10/30-Säule (Pharmacia), die mit 0,05 M TEAB, pH 7, mit 10% Acetonitril eluiert wird (Durchflußrate 1 ml/min).
Die Verbindung mit Rt ≈ 16,4 min wird gesammelt, wonach diese als Fraktion 1 bezeichnete Fraktion unter Vakuum (Speed-Vac) auf ein Volumen von 350 μl eingeengt wird und 8 AU₃₀₄ nm enthält. Mit einem geschätzten ε₃₀₄ 35.000 wird die K-dUTP-Konzentration auf ungefähr 0,72 mM geschätzt.
Ein Aliquot (90 μl) dieser Fraktion 1 wird auf die gleiche Säule aufgegeben und mit 25 mM Triethylammoniumacetatpuffer, pH 7, mit 5% Acetonitril eluiert. Die dem einzigen Peak im Chromatogramm entsprechende Fraktion wird gesammelt (16 min < Rt < 19 min) und unter Vakuum (Speed-Vac) auf konzentriert. Man erhält 150 μl einer Lösung von K-dUTP, die als Fraktion 2 bezeichnet wird und 1,95 AU₃₀₄ nm enthält.
Die Verbindung wird massenspektrometrisch analysiert (Elektrospray, Positivmodus):
(M-2H)⁺ = 1431
(M-2H+CH₃COOH)⁺ = 1491.
Das UV-Spektrum in Wasser weist ein Maximum bei 241 nm, das für den Nucleosidteil des Moleküls charakteristisch ist (λmax = 289 nm, ε = 7100, λmax = 240 nm, ε = 10.700), und ein Maximum bei 304 nm, das in der Nähe des für das Europium-Kryptat charakteristischen λmax-Werts von 305 nm (ε = 30.000) liegt, auf. Man findet ein A₃₀₄/A₂₄₁-Verhältnis von ungefähr 0,83, das mit der vorgeschlagenen Struktur vereinbar ist.
2) Methode B
Man löst 0,08 μmmol einer Lösung von AH-dUTP in 80 μl 0,1 M Boratpuffer, pH 8,6, und versetzt mit 90 μl einer wie oben bei Methode A hergestellten Lösung von N-Hydroxysuccinimid-Kryptat (4 mg/ml).
Nach 60 min bei 20°C versetzt man mit 5 μl 1 M TEAB, pH 8,5, und 45 μl H₂O. Dann gibt man die gesamte Reaktionsmischung auf eine Superdex-Peptide-HR-10/30-Säule (Pharmacia) und eluiert mit 0,05 M TEAB, pH 7, mit 10% Acetonitril (Durchflußrate 1 ml/min).
Der Peak mit Rt ≈ 16,1 min mit einem Maximum bei 304 nm und einem A₃₀₄/A₂₄₁-Verhältnis von ungefähr 0, 79 wird gesammelt. Man erhält ungefähr 0,03 μmol der Verbindung K-11-dUTP.
Die Formel des Konjugats K-11-dUTP ist in 2 angegeben.
BEISPIEL 2: Reinigung des Konjugats K-11-dUTP durch Ionenaustausch
Man verwendet eine C10/20-Säule (Pharmacia Biotech., Uppsala, S) mit DERE-Sepharose® Fast Flow (Pharmacia), die mit einem 10 mM TEAB-Puffer mit 10% Methanol äquilibriert worden ist. Man gibt eine Lösung von K-11-dUTP, die auch nicht konjugiertes funktionalisiertes Europium-trisbipyridin-Kryptat enthält, auf und eluiert die Säule (8 ml/min) mit 40 ml Puffer A (10 mM TEAB mit 10% Methanol). Man sammelt 4-ml-Fraktionen und mißt die Fluoreszenz der eluierten Fraktionen (λAnregung = 337 nm, λEmission = 620 nm). Das nicht konjugierte Kryptat wird in den Fraktionen 4 und 5 eluiert, d. h. kurz nach dem Totvolumen der Säule.
Dann eluiert man weiter (8 ml/min) mit einem linearen Gradienten von 10 mM TEAB/10% Methanol (100 ml) bis 200 mM TEAB/10% Methanol (100 ml) und sammelt 5-ml-Fraktionen. Man findet, daß die Fluorezenz (620 nm) in den Röhrchen 43 bis 44 konzentriert ist, woraus hervorgeht, daß das K-11-dUTP bei einer Konzentration von ungefähr 0,16 mM TEAB eluiert wird. Die das K-11-dUTP enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und auf konzentriert.
BEISPIEL 3: Einbau des Konjugats K-11-dUTP beim Kopieren einer einzelsträngigen DNA mit einer Polymerase (Analyse mittels PAGE und Autoradiographie)
Das DNA-Templat wird durch PCR-Amplifizierung (PCR = Polymerase Chain Reaction) eines Fragments des k-ras-Gens (Exon I), das durch die folgenden Primer begrenzt wird, erhalten:
Primer k-ras EX1 Sense S ^5'd(GGC CTG CTG AAA ATG ACT GAA TAT)₃
Stammlösung mit 3 AU₂₆₀/ml, d. h. ungefähr 1,2·10^–5 M
Primer k-ras EX1 Antisense AS ^5'(TGT TGG ATC ATA TTC GTC CAC AAA ATG)_3'
Stammlösung mit 3 AU₂₆₀/ml, d. h. ungefähr 1,2·10^–5 M.

Der hier für die nachstehende PCR verwendete AS-Primer ist an seinem 5'-Ende biotinyliert. Nach folgender Vorschrift wird mittels PCR eine biotinylierte doppelsträngige DNA synthetisiert:

PCR-Medium

25 μl BUAM (CIS Bio International) 10X 8 μl Antisense-bio-Primer 8 μl Sense-Primer 10 μl Taq-Polymerase (1,25 U/ml) 10 μl dNTP (vier natürliche dNTPs, jeweils 5 mM) 100 μl Humanplacenta-DNA (Sigma), 0,01 μg/μl 89 μm Milli-Q-Wasser.

Das PCR-Medium wird auf 5 Mikroröhrchen (5 × 50 μl) verteilt, wonach die Röhrchen in einen Thermocycler eingebracht und analog Beispiel 5 31 PCR-Zyklen unterworfen werden.
Die doppelsträngige DNA aus der PCR (äquivalent zu 25 pmol Biotin-Primer) wird in Gegenwart von 300 μg Dynabeads-Streptavidin M-280 (Dynal, N) inkubiert.
Nach Waschen wird die einzelsträngige DNA (SS DNA) mit 0,1 Natronlauge eluiert, wonach der Überstand abdekantiert, mit verdünnter HCl neutralisiert und dann auf ein Restvolumen von 60 μl eingeengt wird.
Für die restlichen Arbeitsgänge verwendet man einen AS-Primer (nicht biotinyliert) gemäß obiger Definition, der mit ³²P markiert ist, wie in J. Sambrook et al., Molecular cloning a laboratory manual, 1989, beschrieben.
Zur Herstellung der Medien für die Kopierreaktion werden die folgenden Bestandteile verwendet:

– K-11-dUTP-Fraktion 1 (Rt = 16,4 min) aus Beispiel 1, verdünnt auf 0,25 mM
– dTTP, 0,25 mM
– Mischung von 3 Desoxynucleotidtriphosphaten (dATP, dCTP und dGTP), jeweils 0,625 mM
– Taq-DNA-Polymerase, 1,25 U/μl
– Taq-Puffer (BUAM) 10X (Cis Bio International)
– AS-Primer (3 AU₂₆₀/ml) und mit ³²P markierter AS-Primer (0,06 AU₂₆₀/ml).

Parallel dazu führt man eine Vergleichsreaktion durch, bei der man das K-11-dUTP durch 0,6 μl dTTP (0,25 mM) ersetzt, so daß die dTTP-Konzentration in dem Medium so groß ist wie für die drei anderen Triphosphate.
Durch Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) wird bestätigt, daß die Reaktion in Gegenwart des Konjugats K-11-dUTP eine Bande ergibt, die einer Kopie der DNA über ihre gesamte Länge entspricht und eine Mobilität aufweist, die in der Nähe der für die Vergleichsreaktion, bei der nur die vier natürlichen Nucleotide eingebaut werden, erhaltenen Bande liegt. Zum anderen zeigt das Elektrophoreseprofil in beiden Fällen keine Ablesungsunterbrechungen.
Analog wurde unter Verwendung von variablen dTTP/K-11-dUTP-Verhältnissen, u. a. mit 0,3 μl K-11-dUTP und 0,9 μl dTTP (dTTP/K-11-dUTP = 3) verfahren.
Die Kopierraktion wurde auch in Gegenwart von DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment, durchgeführt (37°C, 45 min) und lieferte weitgehend die gleichen Ergebnisse.
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß das Konjugat aus dUTP und Europium-trisbipyridin-Kryptat durch eine Polymerase (Taq-Polymerase oder Klenow-Fragment) beim Kopieren von einzelsträngiger DNA gut eingebaut wird.
BEISPIEL 4: Einbau des Konjugats K-11-dUTP beim Kopieren einer einzelsträngigen DNA mit einer Polymerase (Nachweis durch strahlungslosen Energietransfer und zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung)
Man verwendet die einzelsträngige DNA gemäß Beispiel 3.
Man bereitet ein Mikroröhrchen vor, in dem die Kopierreaktion (50 μl) durchgeführt wird und das folgendes enthält:

– K-11-dUTP: 0,25 mM Fraktion 1 (Rt = 16,4 min) aus Beispiel 1
– dTTP: 0,25 mM
– Mischung von 3 Desoxynucleotidtriphosphaten: dATP, dCTP und dGTP, jeweils 0,625 mM
– Biotinylierter AS-Primer (siehe Beispiel 3): 3 AU₂₆₀/ml
– Taq-DNA-Polymerase: 1,25 U/μl
– Taq-Puffer: BUAM 10X

Die Röhren werden 2 min auf 90°C erhitzt (Denaturierung) und dann in einem Thermocycler bei 70°C inkubiert. Nach 0, 5, 10, 15 und 20 min werden Proben (9 μl) genommen. Die Aliquots werden in Röhrchen mit 2 μl 0,5 M EDTA-Lösung, pH 8, gegeben.
Man erhält das Äquivalent von 12,5 pmol biotinylierten Primern pro 50 μl Ansatz, d. h. 2,5 pmol pro 10 μl. Außerem liegen 150 pmol K-11-dUTP pro 10 μl vor.
Die Proben werden in einer Menge von 8 μl in 200 μl Puffer L (0,1 M Phosphat, pH 7, 0,15 M NaCl, 0,4 M KF und 0,1% BSA) verdünnt und dann mit dem gleichen Puffer auf 1/10 verdünnt.
20 μl (äquivalent zu 2·10⁴ mol Biotin) der (wie oben verdünnten) Proben werden in die Testvertiefungen einer Mikroplatte (schwarze Flachboden-Fluoreszenzmikroplatte HTRF-96 von Packard) pipettiert. Dann gibt man 30 μl Konjugat SA-XL₆₆₅ (Konjugat von Streptavidin und chemisch modifiziertem Allophycocyanin, Cis Bio International), die mit Puffer L bis zu einer Endkonzentration von 2·10^–8 M verdünnt worden sind, in jede der Testvertiefungen (6,5·10¹³ mol SA, d. h. 30 Äquivalente, bezogen auf Biotin) und versetzt dann mit 250 μl Puffer L.
Man pipettiert 20 μl der verdünnten Proben in die Blindvertiefungen und gibt 280 μl Puffer L zu.
Nach Inkubation (15 min bei 37°C) liest man sofort die Fluoreszenz bei 620 nm und bei 665 nm auf einem Discovery-Gerät (HTRF-Mikroplatten-Analysegerät von Packard) ab.
Man berechnet für jeden Versuch die Verhältnisse der Fluoreszenzintensitäten Re = E665/E620 und für jede Blindprobe Ro = B665/B620 und dann den Wert DF = (Re – Ro)/Ro in Prozent. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 aufgeführt.
In der Tabelle sind wie in den übrigen Beispielen die Fluoreszenzmessungen bei 620 nm und 665 nm in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten ausgedrückt, die von dem zur Messung verwendeten Gerät abhängen.
Tabelle 1
Durch Auftragung des DF-Werts als Funktion der Reaktionszeit erhält man das typische Profil einer Kinetik des Nucleotideinbaus beim enzymatischen Kopieren (1).
BEISPIEL 5: Einbau des Konjugats K-11-dUTP bei einer PCR-Reaktion (Nachweis durch strahlungslosen Energietransfer und zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung)
1) PCR:
Man amplifiziert einen Bereich des Exons 1 des k-ras-Gens, der durch die S- und AS-Primer gemäß Beispiel 3 begrenzt wird.
So erhält man ein Amplifikationsprodukt mit einer Länge von 117 bp und der Sequenz (Sense-Strang)
Man wählt aus dem mittleren Bereich der amplifizierten Sequenz eine Sonde (56% G + C) aus (oben unterstrichen). Am 5'-Ende wird über einen N-4-Aminohexyl-dC-Arm ein Biotin eingeführt (A. Roget et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 7643–7651): CP-Sonde: Biotin-dC.GCC TTG ACG ATA CAG C
Stammlösung mit 0,3 AU₂₆₀/ml, d. h. etwa 1,7·10^–6 M.
Man verwendet 48 μl der in einem TEAAc-Puffer (siehe Beispiel 1, Methode A) gereinigten K-11-dUTP-Fraktion (13 AU₃₀₄/ml) und verdünnt mit 32 μl Milli-Q-Wasser, d. h. eine K-11-dUTP-Endkonzentration von etwa 0,2 mM.
Man verwendet eine Mischung von 4 natürlichen Desoxynucleotidtriphosphaten: 5 mM dATP, 5 mM dCTP, 5 mM dGTP und 3,5 mM dTTP.
Die folgende PCR-Stamm-Mischung wird hergestellt:

– 25 μl BUAM-Puffer (Cis Bio International) 10X
– 10 μl dNTP
– 8 μl S-Primer
– 8 μl AS-Primer
– 10 μl Taq-DNA-Polymerase (d. h. 12,5 U)
– 9 μl Milli-Q-Wasser.

In PCR-Mikroröhrchen werden gemäß der folgenden Tabelle unter Verwendung von Humanplacenta-DNA (Sigma) in einer Konzentration von 0,01 μg/μl PCR-Medien hergestellt.
Die PCR-Reaktion wird nach folgender Vorschrift durchgeführt:

1. 5 min/95°C
2.1 1 min/94°C (Denaturierung)
2.2 1 min/60°C (Zirkularisierung)
2.3 1 min/70°C (Elongation) (31 Zyklen)
3.1 8 min/70°C (Endelongation)

Die Reaktionen werden mittels Agarosegelelektrophorese untersucht. Nur die Röhrchen mit DNA (T+, K1+ und K2+) ergeben eine Bande der erwarteten Länge (durch Vergleich mit der 124-bp-Bande des Markers VIII von Boehringer).
2) Zeitaufgelöste Messung des Energietransfers
Das Meßprinzip besteht in der Hybridisierung der biotinylierten CP-Sonde des amplifizierten DNA-Fragments und anschließendem Zusammengeben des Hybrids mit Konjugat SA-XL665 (in Beispiel 4 definiert). Der Einbau von mit Europium-Kryptat (Donor) markierten Basen führt bei Anregung des Donors bei etwa 337 nm zu einem strahlungslosen Energietransfer auf XL665 (Akzeptor).
In diesem Fall emittiert der Akzeptor Fluoreszenz bei 665 nm mit langer Lebensdauer, so daß dieses Signal von der inhärenten Fluoreszenz des Akzeptors, die eine kurze Lebensdauer hat, unterschieden werden kann.
Man führt zeitaufgelöste Messungen der Fluoreszenz bei 620 nm und 665 nm in Gegenwart des Akzeptors (E620 und E665 "Test") und in Abwesenheit des Akzeptors (B620 und B665 "Blindprobe") durch und berechnet dann das Verhältnis Re = E665/E620 und Ro = B665/B620. Danach berechnet man den Wert DF = (Re – Ro)/Rp in Prozent. Eine Zunahme des DF-Werts belegt das Vorliegen eines Energietransfers und somit den Einbau des Kryptats in die amplifizierte DNA.
Man verwendet die Medien K1–, K1+, K2– und K2+ aus den PCR-Reaktionen. In die Mikroröhrchen gibt man 2 μl jedes PCR-Mediums und versetzt mit 10 μl CP-Sonde (0,03 AU₂₆₀/ml) und 13 μl BUAM-Puffer (2X), wonach man die verschlossenen Röhrchen 10 min mit Hilfe eines Thermocyclers auf 94°C und dann 20 min auf 50°C erhitzt. Man verdünnt 5 μl des Hybridisierungsmediums in 200 μl Puffer L und pipettiert 40 μl dieser Lösung in die Testvertiefungen einer Mikrotiterplatte und 40 μl in die Blindvertiefungen (Flachboden-Mikroplatte HTRF mit 96 Vertiefungen, Packard).
Man gibt 40 μl 3·10^–8 M SA-XL665 (Cis Bio International) und 200 μl Puffer L in die Testvertiefungen. In die Blindvertiefungen gibt man 240 μl Puffer L.
Nach 15 min Inkubationbei bei 37°C führt man sofort die Fluoreszenzmessung auf einem Discovery-Gerät (Packard) durch.
Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
Die Ergebnisse zeigen, daß das Konjugat K-11-dUTP bei einer PCR-Reaktion eingebaut wird. Darüber hinaus kann die Gegenwart von an die amplifizierte DNA gebundenen Kryptatmolekülen durch Hybridisierung mit einer für diese amplifizierte DNA spezifischen Sonde gezeigt und durch einen strahlungslosen Energietransfer zwischen dem Kryptat und einem an die hybridisierte Sonde gebundenen Akzeptor nachgewiesen werden.
BEISPIEL 6: Synthese von mit dem Kryptat Europiumtrisbipyridin markiertem Desoxyuridin (K-4-dUTP).
In dieser Verbindung gibt die Zahl 4 die Gesamtzahl der Atome des Arms, der die Kryptatstruktur mit dem Nucleotid verbindet (hier erfolgt die Bindung in 5-Stellung des Pyrimidins), an.
Als Nucleosidtriphosphat verwendet man 5-(3-Aminoallyl)-2'-desoxyuridin-5'-triphosphat (AA-dUTP), das nach einem Literaturverfahren (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 78, 6633–6637) hergestellt wird. Die Verbindung wird an DEAE-Sepharose® (Pharmacia) mit einem Triethylammoniumhydrogencarbonat-Gradienten (10 mM bis 300 mM) gereinigt.
Man verdünnt 60 μl einer AA-dUTP-Lösung mit einer Konzentration von 5,4 μmol/ml (d. h. 0,3 μmol) mit 240 μl 0,1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB), pH 7,8, und versetzt mit 300 μl einer Lösung des aktivierten Kryptats [TBP-(Eu3+)] (4 mg/ml in Acetonitril, d. h. 0,85 μmol; ungefähr 3 Äquivalente). Das aktivierte Kryptat wird analog Beispiel 1, Methode A, vor Gebrauch frisch hergestellt.
Nach 35 min Rühren versetzt man mit 15 μl 1 M TEAB, pH 8,5, engt auf die Hälfte ein und gibt die Mischung dann auf eine Superdex-30®-HR-10/30-Säule (Pharmacia), die mit 25 mM TEAB, pH 9, mit 10% Acetonitril eluiert wird (Durchflußrate 1 ml/min).
Die Verbindung mit Rt ≈ 16,3 min wird gesammelt, wonach diese als Fraktion 1 bezeichnete Fraktion unter Vakuum (Speed-Vac) auf ein Volumen von 200 μl eingeengt wird und auf die gleiche Säule aufgegeben und mit 25 mM Triethylammoniumacetatpuffer, pH 7, mit 5% Acetonitril eluiert wird. Die dem einzigen Peak im Chromatogramm entsprechende Fraktion wird gesammelt (16 min < Rt < 19 min) und unter Vakuum (Speed-Vac) auf konzentriert. Man erhält 260 μl einer Lösung von K-4-dUTP, die als Fraktion 2 bezeichnet wird und 6,0 AU₃₀₃ nm enthält. Mit einem geschätzten ε₃₀₃ ≈ 35.000 wird die K-4-dUTP-Konzentration auf ungefähr 0,65 mM geschätzt.
Die Verbindung wird massenspektrometrisch analysiert (Elektrospray, Negativmodus):
(M-4H)^– = 1315,5 (C₅₀H₄₈EuN₁₁O₁₇P₃; berechnet: 1319)
Das UV-Spektrum in Wasser weist ein Maximum bei 243 nm, das für den Nucleosidteil des Moleküls charakteristisch ist (λmax = 289 nm, ε = 7100, λmax = 240 nm, ε = 10.700), und ein Maximum bei 303 nm, das in der Nähe des für das Europium-Kryptat charakteristischen λmax-Werts von 305 nm (ε = 27.000) liegt, auf. Man findet ein A₃₀₃/A₂₄₀-Verhältnis von ungefähr 0, 82, das mit der vorgeschlagenen Struktur vereinbar ist.
Die Formel des Konjugats K-4-dUTP ist in 2 angegeben.
BEISPIEL 7: Synthese von mit Europium-trisbipyridin-Kryptat markiertem Uridin (K-11-UTP)
In dieser Verbindung gibt die Zahl 11 die Gesamtzahl der Atome des Spacers, der die Kryptatstruktur mit dem Nucleotid verbindet (hier erfolgt die Bindung in 5-Stellung des Pyrimidins), an.
Als Nucleosidtriphosphat verwendet man 6-Aminocaproyl-[5-(3-aminoallyl)-uridin-5'-triphosphat] (AH-UTP), das analog Beispiel 1 hergestellt wird. Die Verbindung wird an DEAE-Sepharose® (Pharmacia) mit einem linearen Triethylammoniumhydrogencarbonat-Gradienten (25 mM bis 300 mM) gereinigt.
Man verwendet 400 μl einer AH-dUTP-Lösung mit einer Konzentration von 1,1 μmol/ml (d. h. 0,44 μmol) in 0,1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB), pH 7,8, und versetzt mit 360 μl einer Lösung des aktivierten Kryptats [TBP-(Eu3+)] (3 mg/ml in Acetonitril). Das aktivierte Kryptat [TBP-(EU3+)] wird analog Beispiel 1, Methode A, vor Gebrauch frisch hergestellt.
Nach 45 min Rühren versetzt man mit 40 μl 1 M TEAB, pH 8,5, und gibt die Mischung auf eine Superdex-Peptid-30®-HR-10/30-Säule (Pharmacia), die mit 50 mM TEAB, pH 7, mit 10% Acetonitril eluiert wird (Durchflußrate 1 ml/min).
Die Verbindung mit Rt ≈ 15,4 min wird gesammelt, wonach diese als Fraktion 1 bezeichnete Fraktion unter Vakuum (Speed-Vac) auf ein Volumen von 200 μl eingeengt wird und ungefähr 10 AU₃₀₄ nm enthält. Mit einem geschätzten ε₃₀₄ ≈ 35.000 wird die K-11-UTP-Konzentration auf ungefähr 0,3 mM geschätzt.
Diese Fraktion 1 wird auf die gleiche Säule aufgegeben und mit 25 mM Triethylammoniumacetatpuffer, pH 7, mit 5% Acetonitril eluiert. Die dem einzigen Peak im Chromatogramm entsprechende Fraktion wird gesammelt (Rt 16,5 min) und unter Vakuum (Speed-Vac) auf konzentriert. Man erhält 202 μl einer Lösung von K-11-UTP, die als Fraktion 2 bezeichnet wird und 7,5 AU₃₀₄ nm enthält.
Die Verbindung wird massenspektrometrisch analysiert (Elektrospray, Negativmodus):
(M-4H)^– = 1444,3 (C₅₆H₅₈EuN₁₂O₁₉P₃; berechnet: 1448,0).
Das UV-Spektrum in Wasser weist ein Maximum bei 241 nm, das für den Nucleosidteil des Moleküls charakteristisch ist (λmax = 289 nm, ε = 7100, λmax = 240 nm, ε = 10.700), und ein Maximum bei 303 nm, das in der Nähe des für das Europium-Kryptat charakteristischen λmax-Werts von 305 nm (ε = 27.000) liegt, auf. Man findet ein A₃₀₄/A₂₄₁-Verhältnis von ungefähr 0,80, das mit der vorgeschlagenen Struktur vereinbar ist.
Die Verbindung wird mittels FPLC (Mono-Q-Säule, Pharmacia) analysiert. Puffer A: 20 mM Natriumacetat, pH 5,2, mit 10% Acetonitril. Puffer B: 20 mM Natriumacetat, pH 5,0, und 1 M LiCl mit 10% Acetonitril. Linearer Gradient von 0 bis 30% B in 25 min. Durchflußrate 1 ml/min. Das K-11-UTP hat einen Rt-Wert von 10,7 min.
Die Formel des Konjugats K-11-UTP ist in 3 angegeben.
BEISPIEL 8: Vergleichende Messungen der Lebensdauern der Konjugate von dUTP und UTP mit dem Kryptat Europium-trisbipyridin und des Kryptats allein
Als Referenzkryptat verwendet man das Kryptat Europium[(bis-bpy)(bpy-di(amidoethylenamin)] gemäß Beispiel 4 der Patentanmeldung 0 321 353 (das im folgenden als KNH₂ bezeichnet wird).
Man stellt eine Stammlösung von KNH₂ in Wasser her und bestimmt ihre Konzentration durch Messung der optischen Dichte bei 306 nm unter der Annahme eines Werts von ungefähr 30.000 für ε₃₀₆. Die Stammlösung (6,7 × 10^–4 M) wird mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 9 auf 1/100 verdünnt; 100 μl dieser Zwischenlösung werden dann mit 600 μl des gleichen Puffers verdünnt. Parallel dazu stellt man eine Stammlösung von K-11-dUTP, K-4-dUTP und K-11-UTP (hergestellt gemäß Beispiel 1, Methode A, Beispiel 6 bzw. Beispiel 7) in Wasser her, deren Konzentration durch Messung der optischen Dichte bei 304 nm (ε₃₀₄ ≈ 35.000) zu 3 × 10⁵ M bestimmt wird. Jede Stammlösung wird in einer Menge von 50 μl mit 1 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,4, oder mit 0,1 M Tris-HCl-Puffer, pH 9, verdünnt.
Die Werte für die Lebensdauer der Emission des Europiums (τ in ms) werden auf einem zeitaufgelösten Spektralfluorimeter Typ LS50 (Perkin-Elmer) und 5 mm × 5 mm großen Helma-Küvetten gemessen.
Die Eregbnisse sind nachstehend in Tabelle 3 aufgeführt:
Tabelle 3
Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß die Kupplung des Nucleotids mit dem Kryptatmolekül zu einer Verbesserung der Lebensdauer des Europiums und neuer Fluoreszenzeigenschaften für das Kryptat-Nucleotid-Konjugat im Vergleich zu dem Referenzkryptat führt.
BEISPIEL 9: Einbau von K-11-dUTP bei der Elongation eines Oligonucleotids mit Terminal Nucleotidyl Transferase (Nachweis durch strahlungslosen Energietransfer und zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung)
Man bereitet ein Mikroröhrchen vor, in dem die Elongationsreaktion durchgeführt wird, wobei man folgende Bestandteile verwendet:

– 25 μl 0,2 M Tris-Acetat-Puffer, pH 7,2
– 4 μl 25 mM wäßrige Cobaltchloridlösung
– 5 μl einer 2,4 μM Lösung eines Oligonucleotids (Zusammensetzung A₂C₃G₇T₃; 5'-biotinyliert) in Wasser
– 2 μl K-11-dUTP (Fraktion 2, hergestellt gemäß Beispiel 7) mit einer Konzentration von 0,04 mM
– 8 μl dTTP: 0,04 mM
– 5 μl Wasser
– 1 μl Terminal Deoxyucleotidyl Transferase (TnT, EC 2.7.7.31) (Sigma, 35 U/μl).

Man entnimmt 2 μl der Reaktionmischung und versetzt mit 4 μl 60 mM EDTA (zur Herstellung eines Vergleichs bei t₀ = 0 min). Der Rest wird zur Durchführung einer kinetischen Studie bei 37°C inkubiert. Nach 5, 10, 20, 40, 60 und 80 min Reaktion bei 37°C werden jeweils 2 μl der Reaktionsmischung entnommen und zur Beendigung der Reaktion mit 4 μl 60 mM EDTA versetzt. So erhält man die Fraktionen t₅, t₁₀ usw. Diese Fraktionen t₀, t₅, t₁₀ werden mit 250 ml Puffer (0,1 M Phosphat, pH 7, 0,15 M NaCl, 0,4 M KF und 0,1% BSA) verdünnt.
Man pipettiert 50 μl (äquivalent zu 2,3·10^–12 mol Biotin) der wie oben beschrieben verdünnten Proben in Testvertiefungen (mit der Bezeichnung E₀, E₅, E₁₀ usw.) einer Mikroplatte (schwarze Flachboden-Fluoreszenzmikroplatte HTRF-96 mit 96 Vertiefungen von Packard) pipettiert. Dann gibt man 50 μl Konjugat SA-XL₆₆₅ (Cis Bio International), die mit Puffer L auf 1,5·10^–8 M verdünnt worden sind, in jede der Testvertiefungen und versetzt dann mit 150 μl Puffer L.
Zur Herstellung einer Blindprobe aus dem oben beschriebenen Reaktionsgemisch unter Ersatz des Enzyms durch 1 μl Wasser entnimmt man 2 μl dieses Gemischs und führt die oben beschriebenen Verdünnungen durch. 50 μl dieser verdünnten Probe werden in Blindvertiefungen pipettiert und mit 50 μl Konjugat SA-XL₆₆₅ und 150 μl Puffer L versetzt.
Nach Inkubation (15 min bei 37°C) liest man sofort die Fluoreszenz bei 620 nm und bei 665 nm auf einem Discovery-Gerät (HTRF-Mikroplatten-Analysegerät von Packard) ab.
Man berechnet für jeden Versuch die Verhältnisse der Fluoreszenzintensitäten Re = E665/E620 und für jede Blindprobe Ro = B665/B620 und dann den Wert DF = (Re – Ro)/Ro in Prozent. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 4 aufgeführt.
Tabelle 4
Die Blindprobe weist ein B₆₆₅/B₆₂₀-Verhältnis von 0,064 auf. Für t₀ findet man ein E₆₆₅/E₆₂₀-Verhältnis von 0,063, wobei der Transfer DF = 100 × (Re – R₀)/R₀ = 100 (0,063– 0,064)/0,064, also praktisch gleich Null ist. Durch Berechnung des DF-Werts für jede Zeit findet man, daß der durch den Wert DF ausgedrückte Energietransfer im Laufe der Zeit zunimmt, was zeigt, daß das K-11-dUTP durch Terminal Deoxynucleotidyl Transferase in die Oligonucleotidkette eingebaut wird.
BEISPIEL 10: Photophysikalische Eigenschaften eines Oligonucleotids mit eingebauten Kryptatmolekülen
Man führt eine K-11-dUTP-Einbaureaktion mit TnT analog Beispiel 9 durch, wobei man alle Mengen mit 3 multipliziert. Durch Messung des DF-Werts als Funktion der Zeit wird verifiziert, daß der Einbau von K-11-dUTP nach der gleichen Kinetik verläuft. Nach 80 min Reaktionszeit wird die Reaktion durch Zugabe von 12 μl 400 mM EDTA-Lösung beendet. 105 μl des Reaktionsgemischs werden entnommen und auf eine mit 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, äquilibrierte NAP5-Säule (Pharmacia) aufgegeben.
Das Oligonucleotid wird mit 600 μl Puffer eluiert. Diese, als Fraktion 1 bezeichnete Fraktion (Ausschlußvolumen) wird folgendermaßen analysiert: in Vertiefungen einer Mirkoplatte gibt man 50 μl Fraktion 1 und versetzt mit 200 μl Puffer L, was das "Blindkryptat" ergibt. In die übrigen Vertiefungen gibt man 50 μl Fraktion 1 und 50 μl Konjugat SA-XL₆₆₅ (Cis Bio International) (1,5·10^–8 M in Puffer L) und 150 μl Puffer L, was die Testvertiefungen ergibt. Man mißt die Fluoreszenz bei 620 nm und bei 665 nm auf einem Discovery-Gerät (HTRF-Mikroplatten-Analysegerät von Packard).
Man berechnet DF = 100 × (Re – R₀)/R₀ = 100 (1,14 – 0,0347) /0,0347 = 3180%. Diese Fraktion enthält somit mit Kryptat markiertes Oligonucleotid.
Man findet, daß die bei Fortsetzung der Elution erhaltenen Fraktionen (Fraktionen 2, 3 usw.) im Vergleich zu F1 einen kleinen DF-Wert und eine hohe Rohfluoreszenz bei 620 nm aufweisen: sie enthalten somit einen Überschuß an nicht eingebautem K-11-dUTP.
Durch Vergleich der Fluoreszenz in der Fraktion 1 (die den in die Oligonucleotidkette eingebauten Kryptatmolekülen entspricht) mit der Fluoreszenz von Kalibrierlösungen mit bekannter Kryptatkonzentration kann man abschätzen, daß die Fraktion F1 ungefähr 5·10^–11 mol Kryptat enthält. Mit einer abgeschätzten Oligonucleotidmenge in der Fraktion F1 von 2·10^–11 findet man eine Zahl n = 5·10^–11/2·10^–11 des kryptatmarkierten Nucleotids pro Oligonucleotidkette.
Es sei darauf hingewiesen, daß der Einbau von K-dUTP und dTTP gleichzeitig und auf statistische Art und Weise stattfindet.
Somit sind am 3'-Ende jeder Oligonucleotidkette eine variable Zahl von Nucleotiden T und durchschittlich mindestens 2 K-dU-Nulceotide eingebaut.
Die Lebensdauer τ wird aus der Steigung der durch Auftragung von Log E₆₂₀ = f(t) erhaltenen Geraden berechnet.
Man mißt die Lebensdauer der Emission bei 620 nm für das markierte Oligonucleotid in Fraktion 1 (10 mM Phosphatpuffer, pH 7,4) unter Verwendung eines zeitaufgelösten Fluorimeters KRYPTOR (Cis Bio International) mit einer Anregung von 337 nm. Dabei erhält man eine Lebensdauer τ von 886 μs. Diese Lebensdauer ist größer als die gleichzeitig unter den gleichen Bedingungen gemessene Lebensdauer des Konjugats K-11-dUTP (τ = 681 ms).
Daher findet man eine Erhöhung der Lebensdauer des in eine Oligonucleotidkette eingebauten Kryptats.
BEISPIEL 11: Synthese von mit dem Kryptat Europiumtrisbipyridin markiertem Adenosin (Konjugat K-8-ATP).
In dieser Verbindung gibt die Zahl 8 die Gesamtzahl der Atome des Spacers, der die Kryptatstruktur mit dem Nucleotid verbindet (hier erfolgt die Bindung in 8-Stellung des Purins), an.
Als Nucleosidtriphosphat verwendet man [8-(6-Aminohexyl)-adenosin-5'-triphosphat] (AH-ATP, Sigma). Man verwendet eine 0,1 μmol AH-ATP-Lösung in 100 μl 0,1 M Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB), pH 8, und versetzt mit 100 μl einer Lösung des aktivierten Kryptats [TBP-(Eu3+)] (4 mg/ml in Acetonitril). Das aktivierte Kryptat [TBP-(Eu3+)] (NHS/DCC in Acetonitril) wird analog Beispiel 1, Methode A, vor Gebrauch frisch hergestellt.
Nach 35 min Rühren versetzt man mit 5 μl 1 M TEAB, engt auf die Hälfte ein und gibt die Mischung dann auf eine Superdex-30®-HR-10/30-Säule (Pharmacia), die mit 50 mM TEAB, pH 8, mit 10% Acetonitril eluiert wird (Durchflußrate 1 ml/min).
Die Verbindung mit Rt ≈ 16,7 min wird gesammelt, wonach diese als Fraktion 1 bezeichnete Fraktion unter Vakuum (Speed-Vac) auf ein Volumen von 200 μl eingeengt wird und auf die gleiche Säule aufgegeben und mit 25 mM Triethylammoniumacetatpuffer, pH 7, mit 5% Acetonitril eluiert wird. Die dem einzigen Peak im Chromatogramm entsprechende Fraktion wird gesammelt (Rt ≈ 17,2 min) und unter Vakuum (Speed-Vac) aufkonzentriert.
Das UV-Spektrum in Wasser weist ein Maximum bei 245 nm, ein Maximum bei 283 nm, das in der Nähe des für den Nucleosidteil des Moleküls charakteristischen λmax-Werts (λmax = 279 nm, ε = 21.000) liegt, und ein Maximum bei 303 nm (ε = 27.000), das in der Nähe für das Europium-Kryptat charakteristischen λmax-Werts von 305 nm (ε 27,000) liegt, auf. Man findet ein A₃₀₅/A₂₈₀-Verhältnis von ungefähr 1, das mit der vorgeschlagenen Struktur vereinbar ist.
Die Formel des Konjugats K-8-ATP ist in 3 angegeben.
BEISPIEL 12: Einbau eines Konjugats von UTP mit dem Kryptat Europium-trisbipyridin (K-11-UTP) bei einer in-vitro-Transkriptionsreaktion (Nachweis durch strahlungslosen Energietransfer und zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung)
Hier werden K-11-UTP und Bio-14-CTP (CTP-Biotin-Konjugat) durch in-vitro-Transkription gleichzeitig in dasselbe RNA-Molekül eingebaut.
1) Transkription
Die Transkription einer doppelsträngigen DNA mit einem Promotor (Plasmid-DNA pSTP18 und pSTP19, die den Promotor 7 enthalten und durch Eco R1 linearisiert sind) auf RNA wird mit Hilfe eines Trankriptionskits SP6/T7 (Boehringer-Mannheim) durchgeführt. Das erhaltene Transkript hat eine Länge von 1035 Basen.
Das Transkriptionsmedium enthält neben den Ribonucleotiden in einer Endkonzentration von 0,5 mM 0,2% K-11-UTP und 30% Bio-14CTP, die entlang der Kette statistisch eingebaut werden.
Man verwendet die K-11-UTP-Fraktion 2 gemäß Beispiel 7, die mit Wasser auf eine Konzentration von 20 μM verdünnt wird.
Die Bio-14-CTP-Lösung wird durch Verdünnung einer handelsüblichen 10 mM Lösung von Biotin-l4-CTP (Gibco-BRL/Life Technologies) mit Wasser hergestellt.
Das Transkriptionsmedium wird in PCR-Mikroröhrchen (0,5 ml) gemäß der nachstehenden Tabelle hergestellt:
Nach Zusatz des Enzyms entnimmt man 2 μl des Reaktionsmediums und verdünnt sofort mit 38 μl einer 50 mM EDTA-Lösung, pH 8, wonach man 19 μl dieser Lösung entnimmt und mit 144 μl Puffer L verdünnt. Diese Lösung dient als Hintergrundkontrolle bei t₀ = 0 min.
Das Reaktionsgemsich wird bei 37°C in einen Thermocycler eingebracht. Nach bestimmten Reaktions zeiten (60 min, 90 min und 120 min) werden 2 μl des Reaktionsgemischs entnommen und wie oben mit 38 μl 50 mM EDTA, pH 8, verdünnt. Dann werden jeweils 19 μl dieser Lösungen mit 114 μl Puffer L verdünnt.
50 μl jeder verdünnten Lösung entsprechend den Zeiten 0 min, 60 min, 90 min und 120 min werden in die Vertiefungen einer schwarzen Mikroplatte (Flachboden-Mirkoplatte HTRF mit 96 Vertiefungen, Packard) gegeben.
Man gibt 50 μl einer 6,25·10^–7 M Lösung von SA-XL665 (Cis Bio International) in Puffer L und danach 100 μl Puffer L zu.
2) Zeitaufgelöste Messung des Energietransfers
Nach Inkubation (15 min bei Umgebungstemperatur) mißt man die Fluoreszenz bei 620 nm und 665 nm auf einem DISCOVERY-Gerät (Packard).
Für jede betrachtete Reaktionszeit wird der Energietransfer durch Berechnung des Verhältnisses Re = F665/F620 ermittelt. Mit dem Verhältnis Ro = F665/F620 für die Zeit t₀ kann man das Hintergrundniveau ermitteln. Die gleiche Messung an einer Verdünnung von 2 μl eines Transkriptionsreaktionsgemischs, in dem das Enzym durch ein äquivalentes Volumen Wasser ersetzt worden ist, ergibt das gleiche Hintergrundniveau.
Der Energietransfer wird für jede Zeit mit der Formel DF = (Re – Ro)/Ro berechnet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5
Man findet eine Zunahme des DF-Werts, was eine Zunahme des Energietransfers aufgrund des Einbaus von K-11-UTP und Bio-CTP in die transkribierte RNA bedeutet.
Die oben beschriebene Transkriptionsreaktion wird durch Elektrophorese an Agarosegel (3%) untersucht.
Man erhält eine große Bande, die die Integrität des produzierten RNA-Fragments belegt. Diese Bande ist durch eine Migration gekennzeichnet, die mit derjenigen einer durch Transkription unter Verwendung von ausschließlich natürlichen rNTPs produzierten Bande identisch ist.
Die in 4 wiedergegebene Kurve für die DF-Werte als Funktion der Reaktionszeit zeigt das typische Profil einer Kinetik des Nucleotideinbaus bei einer enzymatischen Transkription. Aus diesen Ergebnissen geht hervor, daß das Konjugat K-11-UTP durch eine RNA-Polymerase effizient eingebaut wird.
BEISPIEL 13: Einbau eines K-11-dUTP-Konjugats bei einer in-vitro-Transkriptionsreaktion (Nachweis durch strahlungslosen Energietransfer und zeitaufgelöste Fluoreszenzmessung nach Hybridisierung mit einer Akzeptorsonde)
Die Transkriptionsreaktion einer doppelsträngigen DNA auf RNA wird mit Hilfe eines Trankriptionskits (Gibco BRL) durchgeführt. Die doppelsträngige DNA mit dem Promotor T7 wird ihrerseits durch PCR mit einem Primerpaar hergestellt, wobei einer der Primer die Sequenz des Promotors der T7-RNA-Polymerase enthält (EC 2.7.7.6).
Das erhaltene Transkript hat eine theoretische Länge von 115 Basen.
Das generelle Prinzip der Transkription durch eine RNA-Polymerase wird auf S. 5.58 und 5.59 von "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2. Auflage, J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, CSH Press 1989, beschrieben.
Man kann auch eine andere RNA-Polymerase verwenden, wie SP6- oder T3-RNA-Polymerase; in diesem Fall wird die Sequenz des betreffenden PCR-Primers so verändert, daß sie den spezifischen Promotor der betrachteten RNA-Polymerase enthält.
Der Einbau eines Promotors wird in § 13.5 und § 23.2 in "PCR: Clinical Diagnostics and Research", A. Rolfs et al., Springer-Verlag (1992), sowie in D. Y. Kwoth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989), 86, 1173–1177, beschrieben.
1) Herstellung der doppelsträngigen DNA mit dem Promotor der RNA-Polymerase
Man verwendet eine analoge Vorschrift wie in Beispiel 5, wobei man aber ausschließlich Desoxynucleotide verwendet, um ein primäres PCR-Produkt mit 117 bp herzustellen.
Unter Verwendung von 2 μl einer 1/100-Verdünnung des Produkts der primären PCR als Target-DNA (DNA) wird eine zweite PCR (sekundäre PCR) durchgeführt. Hierfür ersetzt man den k-ras-EX1-Antisense-Primer durch den folgenden Primer mit der Bezeichnung T7-AS und der Sequenz
Der kursiv geschriebene Teil dieser Sequenz entspricht der Sequenz des Promotors der T7-RNA-Polymerase.
Der k-ras-EX1-Sense-Primer hat die folgende Sequenz:
^5'd(CTG.CTG.AAA.ATG.ACT.GAA.TAT)_3'.
Nach dieser sekundären PCR erhält man eine doppelsträngige DNA mit einer theoretichen Länge von 132 bp und der folgenden Sequenz (Sense-Strang):
Der kursiv geschriebene Teil gibt die T7-Sequenz (Sense-Strang) wieder und der unterstrichene Teil gibt die der Sonde bei der Hybridisierung entsprechende Sequenz wieder.
Die Transkription ergibt die folgende RNA-Sequenz (zum Antisense-Strang des transkribierten DNA-Fragments homologe Sequenz), in der der unterstrichene Teil der Sequenz, die von der biotinylierten Sonde erkannt wird, entspricht:
Die verwendete RAS12N-Sonde ist 5'-biotinyliert und hat die folgende Sequenz:
Biotin-^5'd(GTT.GGA.GCT.GGT.GGC.GTA.GG)_3'.
2) Transkription:
Das Transkriptionsmedium enthält neben den natürlichen Ribonucleotiden in einer Endkonzentration von 0,5 mM, 2% K-11-UTP, das entlang der RNA-Kette statistisch eingebaut werden wird.
Man verwendet die K-11-UTP-Fraktion 2 gemäß Beispiel 7, die mit Wasser auf eine Konzentration von 100 μM verdünnt wird.
Das Transkriptionsmedium wird in PCR-Mikroröhrchen (0,5 ml) gemäß der nachstehenden Tabelle hergestellt:
Das Reaktionsgemsich wird bei 40°C über einen Zeitraum von 120 min in einen Thermocycler gestellt, wonach die Reaktion mit 4 μl 0,2 M EDTA, pH 8, gestoppt wird.
In einem PCR-Mikroröhrchen werden 2 μl des Reaktionsmediums mit 10 μl RAS12N-Sonde (0,03 AU₂₆₀/ml in H₂O) verdünnt und dann mit 13 μl Hybridisierungspuffer (100 mM Phosphatpuffer, pH 7,4/0,1% BSA, 1 M NaCl). Man erhitzt 10 min auf 70°C und hybridisiert dann 20 min bei 45°C in einem Thermocycler.
5,5 μl des obigen Hybridisierungsmediums werden mit Puffer L auf 200 μl verdünnt, was das verdünnte Hybridisierungsmedium HT_pos ergibt.
Man stellt eine Blindprobe her, indem man eine Transkription nach der obigen Vorschrift durchführt, dabei aber die Positiv-PCR-DNA durch ein äquivalentes Volumen von PCR-Medium aus einer negativen PCR-Reaktion ohne Target-DNA ersetzt.
Das negative Transkriptionsmedium (2 μl) wird gestoppt, wonach man wie oben beschrieben eine Hybridisierung durchfführt und mit Puffer L verdünnt. So erhält man das verdünnte Hybridisierungsmedium HT_neg.
3) Zeitaufgelöste Messung des Energietransfers
Der Einbau des Kryptats in die RNA-Kette wird durch Hybridisierung mit einer zu der RNA-Sequenz komplementären Sonde nachgewiesen, wobei diese Sonde mit dem Konjugat SA-XL665 (Cis Bio International) über das Paar Streptavidin-Biotin markiert ist.
In die Vertiefungen einer schwarzen Mikroplatte (Flachboden-Mikroplatte HTRF mit 96 Vertiefungen, Packard) gibt man 50 μl HT_pos-Medium und 50 μl in Puffer L auf 1,5·10^–10 M verdünntes Konjugat SA-XL-665 (Cis Bio International) und gibt dann 100 μl Puffer L zu. Diese Vertiefungen erlauben die Messung des Energietransfers durch die Berechnung Re = E665/E620 gemäß Beispiel 5.
In die benachbarten Vertiefungen gibt man 50 μl HT_neg-Medium und 50 μl Konjugat SA-XL-665 und 100 μl Puffer L wie oben beschrieben. Diese Vertiefungen bilden eine Referenz zur Ermittlung des Hintergrunds durch Berechnung von Ro.
Man mißt die Fluoreszenz bei 620 nm und 665 nm auf einem DISCOVERY-Gerät (Packard).
Der Energietransfer wird für jede Zeit mit der Formel DF = (Re – Ro)/Ro berechnet. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6
Im Fall der Durchführung der Transkription in Gegenwart von Target-DNA findet man einen Transfer von 178%.

Claims

Fluoreszierendes Nucleosid- oder Nucleotid-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß es: – ein natives oder chemisch modifiziertes oder mit einem oder mehreren Markermolekülen konjugiertes Ribo- oder Desoxyribonucleosid oder -nucleotid, worin mindestens ein Kohlenstoffatom des Rings, ein exocyclisches Stickstoffatom des Purin- oder Pyrimidinrings oder ein Kohlenstoffatom der Pentofuranoseeinheit mit dem Fluoreszenzmarker eine Bindung eingehen kann, und – mindestens einen an das Atom bzw. die Atome gebundenen Fluoreszenzmarker, der aus einem Seltenerdmetallkryptat besteht, enthält.
Fluoreszierendes Nucleosid- oder Nucleotid-Konjugat, dadurch gekennzeichnet, daß es: – ein natives oder chemisch modifiziertes oder mit einem oder mehreren Markermolekülen konjugiertes Ribo- oder Desoxyribonucleosid oder -nucleotid, worin mindestens ein Kohlenstoffatom des Rings oder ein exocyclisches Stickstoffatom des Purin- oder Pyrimidinrings mit dem Fluoreszenzmarker eine Bindung eingehen kann, und – mindestens einen an das Atom bzw. die Atome gebundenen Fluoreszenzmarker, der aus einem Seltenerdmetallkryptat besteht, enthält.
Konjugat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein fluoreszierendes Nucleotid-Konjugat handelt, das ein unter AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, GTP, CMP, CDP, CTP, UMP, UDP, UTP, TMP, TDP, TTP, 2Me-AMP, 2Me- ADP, 2Me-ATP, 1Me-GMP, 1Me-GDP, 1Me-GTP, 5Me-CMP, 5Me-CDP, 5Me-CTP, 5MeO-CMP, 5MeO-CDP, 5MeO-CTP, 7-Desaza-ATP oder 7-Desaza-GTP ausgewähltes Ribonucleotid oder ein unter den diesen Ribonucleotiden entsprechenden Desoxy- oder Didesoxyribonucleotiden ausgewähltes Desoxyribonucleotid enthält.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Ribo- oder Desoxyribonucleotid unter: – in 5-Stellung der Base funktionalisierten Derivaten von 2'-Desoxyuridin-5'-triphosphat oder Uridin-5'-triphosphat, – in 4- oder 5-Stellung der Base funktionalisierten Derivaten von 2'-Desoxycytidin-5'-triphosphat oder Cytidin-5'-triphosphat, – in 6- oder 8-Stellung der Base funktionalisierten Derivaten von 2'-Desoxyadenosin-5'-triphosphat oder Adenosin-5'-triphosphat, – in 6- oder 8-Stellung der Base funktionalisierten Derivaten von 2'-Desoxyguanosin-5'-triphosphat oder Guanosin-5'-triphosphat, – in 7-Stellung der Base funktionalisierten Derivaten von 2'-Desoxy-7-desazaadenosin-5'-triphosphat oder 7-Desazaadenosin-5'-triphosphat und – in 7-Stellung der Base funktionalisierten Derivaten von 2'-Desoxy-7-desazaguanosin-5'-triphosphat oder 7-Desazaguanosin-5'-triphosphat ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein fluoreszierendes Nucleosid-Konjugat handelt, bei dem das Ribo- oder Desoxy ribonucleosid unter A, G, C, U, T, den entsprechenden Desoxy- oder Didesoxynucleosiden und chemisch modifizierten Analogen davon ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Desoxyribonucleosid unter 3'-Azido-3'-desoxythymidin und Derivaten davon und den 2',3'-Didesoxyanalogen von A, T, C, G, U und I ausgewählt ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker entweder direkt oder über einen Spacer an eine an der Base oder der Pentofuranoseeinheit des Ribo- oder Desoxyribonucleosids oder -nucleotids eingeführte oder gebildete funktionelle Gruppe gebunden ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fluoreszenzmarker um ein Kryptat des Terbiums, Europiums, Samariums oder Dysprosiums handelt.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fluoreszenzmarker um ein Seltenerdmetallkryptat handelt, das aus mindestens einem durch eine makropolycyclische Verbindung der Formel
worin Z für ein drei- oder vierbindiges Atom steht, R nicht vorhanden ist oder für Wasserstoff, Hydroxyl, eine Aminogruppe oder einen Kohlenwasserstoffrest steht, die zweiwertigen Reste
unabhängig voneinander für Kohlenwasserstoffketten, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthalten und gegebenenfalls durch einen Heteromakrocyclus unterbrochen sind, stehen, wobei mindestens einer der Reste
außerdem mindestens eine Molekülgruppierung enthält oder im wesentlichen aus einer Molekülgruppierung besteht, deren Triplettenergie über der Triplettenergie des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdmetallions liegt, komplexierten Seltenerdmetallsalz besteht.
Konjugat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fluoreszenzmarker um ein Seltenerdmetallkryptat handelt, das aus mindestens einem durch eine makropolycyclische Verbindung der Formel (I) gemäß Anspruch 9 komplexierten Seltenerdmetallsalz besteht, bei dem die Molekülgruppierung unter Phenanthrolin, Anthracen, Benzol, Naphthalin, Bi- und Terphenyl, Azobenzol, Azopyridin, Pyridin, Bipyridinen, Bischinolinen und Verbindungen der nachstehenden Formeln ausgewählt ist: -C₂H₄-X₁-C₆H₄-X₂-C₂H₄- -C₂H₄-X₁-CH₂-C₆H₄-CH₂-X₂-C₂H₄-, wobei X₁ und X₂ gleich oder verschieden sein können und für Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel stehen,
wobei X für Sauerstoff oder Wasserstoff steht.
Konjugat nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fluoreszenzmarker um ein Seltenerdmetallkryptat handelt, das aus einem durch eine der nachstehenden makrocyclischen Verbindungen komplexierten Terbium- oder Europiumion besteht: (22)Phenanthrolin, (22)Phenanthrolinamid, (22)Anthracen, (22)Anthracenamid, (22)Biisochinolin, (22)Biphenyl-bis-pyridin, (22)Bipyridin, (22)Bi-pyridinamid und Trisbipyridin-, Tris-phenanthrolin-, Phenanthrolin-bis-bipyridin-, Bi-isochinolin-bis-bipyridin- und Bis-bipyridin-diphenylbipyridin-Makropolycyclen.
Konjugat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fluoreszenzmarker um das Europiumkryptat Eu-trisbipyridin handelt.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fluoreszenzmarker um ein Seltenerdmetallkryptat handelt, das aus mindestens einem durch eine makropolycyclische Verbindung mit einer unter Bipyrazinen, Bipyrimidinen und Stickstoffheterocyclen mit N-Oxid-Gruppen ausgewählten Molekülgruppierung komplexierten Seltenerdmetallsalz besteht.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Fluoreszenzmarker um ein Seltenerdmetallkryptat handelt, das aus mindestens einem durch eine makropolycyclische Verbindung einer der nachstehenden Formeln II oder III komplexierten Seltenerdmetallsalz besteht:
worin: – es sich bei dem Ring der Formel
um einen der folgenden Ringe handelt:
– Y für eine Gruppe oder einen Spacer steht, der aus einem zweiwertigen organischen Rest besteht, der unter linearen oder verzweigten C₁-bis C₂₀-Alkylengruppen, die gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen und/oder gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, oder eine oder mehrere Carbamoyl- oder Carbonsäureamidgruppen enthalten können; C₅- bis C₈-Cycloalkylengruppen oder C₆- bis C₁₄-Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls durch Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind, ausgewählt ist; – Z für eine funktionelle Gruppe, die mit einer biologischen Substanz eine kovalente Bindung eingehen kann, steht; – R für eine Methylgruppe oder die Gruppe -Y-Z steht; – R' für Wasserstoff oder eine COOR''-Gruppe, worin R'' eine C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe und vorzugsweise Methyl, Ethyl oder tert.-Butyl bedeutet, oder eine -CO-NH-Y-Z-Gruppe steht.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoreszenzmarker über einen Spacer an das Ribo- oder Desoxyribonucleosid oder -nucleotid gebunden ist, welcher aus einem zweiwertigen organischen Rest besteht, der unter linearen oder verzweigten C₁-C₂₀-Alkylengruppen, die gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen und/oder gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor, oder eine oder mehrere Carbamoyl- oder Carbonsäureamidgruppen enthalten können; C₅-C₈-Cycloalkylengruppen und C₆-C₁₄-Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls durch Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen substituiert sind, ausgewählt ist.
Konjugat nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Spacer unter den Gruppen:
ausgewählt ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Desoxyribonucleotid um Desoxyuridin, bei dem Fluoreszenzmarker um das Europiumkryptat Eutrisbipyridin und bei dem Spacer um eine 3-Aminoallylgruppe handelt.
Verfahren zur Herstellung von Konjugaten nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man ein natives oder chemisch modifiziertes oder mit einem oder mehreren Markermolekülen konjugiertes Ribo- oder Desoxyribonucleosid oder -nucleotid, worin mindestens ein Kohlenstoffatom des Rings, ein exocyclisches Stickstoffatom des Purin- oder Pyrimidinrings oder ein Kohlenstoffatom der Pentofuranoseeinheit mit dem Fluoreszenzmarker eine Bindung eingehen kann, mit mindestens einem an das Atom bzw. die Atome gebundenen Fluoreszenzmarker, der aus einem Seltenerdmetallkryptat besteht, umsetzt.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 17 als Marker.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und 6 bis 16 als Nucleotidbaustein bei einer Nucleinsäure-Synthesereaktion.
Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 7 bis 16 zum Nachweis und/oder zur Lokalisierung von Verbindungen mit mindestens einer Nucleinsäuresequenz.
Verwendung nach Anspruch 20 bei einem Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität eines an einer Nucleinsäure-Synthesereaktion beteiligten Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man die von dem Konjugat direkt oder indirekt emittierte Fluoreszenz mißt, wobei die Fluoreszenzemission mit dem Einbaugrad des Konjugats in das synthetisierte Nucleinsäure-Polynucleotid korreliert wird.
Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der enzymatischen Aktivität um die Aktivität von DNA- oder RNA-Polymerase, inverser Transkriptase, Transferase oder Ligase handelt.
Verwendung nach Anspruch 20 bei einem Verfahren zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität mit einer Nucleinsäure als Substrat.
Polynucleotid, enthaltend mehr als 1 Konjugat nach einem der Ansprüche 9 bis 16.