KR102589836B1 - 핵산 형광 표지용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 형광 표지 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 형광 표지용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 형광 표지 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산 내 아데노신(adenosine) 염기의 N6 위치의 아릴화(6N-Arylation)를 통해 천연 핵산에 직접적으로 형광 표지가 가능한 핵산 형광 표지용 조성물 및 핵산 형광 표지 방법에 관한 것이다.

Description

핵산 형광 표지용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 형광 표지 방법{Composition for fluorescent labeling of nucleic acid and method for fluorescent labeling of nucleic acid using the same}
본 발명은 핵산 형광 표지용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 형광 표지 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 핵산 내 아데노신(adenosine) 염기의 N6 위치의 아릴화(6N-Arylation)를 통해 천연 핵산에 직접적으로 형광 표지가 가능한 핵산 형광 표지용 조성물 및 핵산 형광 표지 방법에 관한 것이다.
세포내에서 일어나는 다양한 분자 수준의 변화를 평가하기 위해 분자진단 기법이 다양하게 개발되고 있으며, 그 중에서 뉴클레오시드(nucleoside) 및 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)의 형광 표지가 생물학적 과정을 모니터링 하는데 응용되어왔다. 세포 내 핵산을 시각화하기 위해 많은 형광 표지 기술이 개발되었으며, 그 종류로는 형광 동소 교잡법(FISH, fluorescent in situ hybridization), 핵산의 비특이적 염색, 당백질 융합 등이 있다.
한편, DNA와 RNA의 아릴화(arylation) 반응은 핵 염기에 직접 형광성질을 부여하여 바이오 이미징에 사용하기 적합하여 많은 연구가 되어왔다. 이러한 DNA 및 RNA에 형광체를 도입하는 방법은 DNA 합성기를 이용한 고체상 합성법(solid phase phosphoramidite synthesis)이 있으나, 고체상 합성법의 경우 합성과정이 복잡하고 올리고뉴클레오티드 합성과정 동안 민감하게 반응할 수 있는 다양한 시약들을 사용하기 때문에 형광체의 도입에 한계가 있었다.
DNA 및 RNA에 형광체를 도입하는 또 다른 방법으로는, DNA 중합효소 혹은 RNA 중합효소를 이용하여 형광성 단량체를 도입하는 방법이 있다. 그러나 중합효소를 이용하는 경우 중합효소의 활성 사이트 부분이 협소한 관계로 직접적으로 형광 단량체를 인식하는데 문제가 있어 DNA 및 RNA에 형광 단량체를 도입하는데 어려움이 있었다.
이러한 문제를 해결하기 위해 제3의 방법(도 1, a)이 개발되었으며, 이 방법은 아릴화(arylation) 반응을 통해 DNA 및 RNA에 아릴 할라이드(aryl halide), 알켄(alkene), 알킨(alkyne), 붕소산(boronic acie), 주석 화합물(tin compound) 등 다양한 작은 크기의 덜 민감한 작용기를 먼저 도입한 후에 다양한 형광성 아릴 화합물들과의 반응을 통한 형광표지 방법이다. 그러나 이 방법은 많은 합성과정과 정제 및 분리단계를 요구하며, 형광 표지를 위해 DNA 및 RNA에 사전 작용기를 가진 뉴클레오시드를 도입해야하는 어려움이 있었다.
따라서 상기와 같은 문제를 해결하기 위해 사전에 작용기를 가진 뉴클레오시드의 도입이 필요없고, 복잡한 합성 및 정제 과정을 거칠 필요가 없이, 간단한 핵산 형광 표지방법의 연구 개발이 요구되고 있다.
A. Omumi et al., J. Am. Chem. Soc., 133, 42-50, 2011 L. Lercher et al., Angew. Chem. Int. Ed., 52, 10553-10558, 2013 L. Wicke et al., Bioconjugate Chem., 23, 627-642, 2012
본 발명의 목적은 상기의 문제를 해결하기 위한 것으로, 핵산과 플루오로 아릴 화합물의 친핵성 아로마틱 치환반응(6N-arylation)에 의해 직접적이고 간단히 형광 표지가 가능한 형광 표지용 조성물 및 핵산의 형광 표지 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핵산 및 플루오로 아릴(fluoro aryl) 화합물을 포함하는 핵산 형광 표지용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA 중에서 선택되는 어느 하나이며, 아데노신(adenosine)을 하나 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥 구조를 포함하는 구조일 수 있으며, 더욱 상세하게는, 단일가닥(single strand), 헤어핀(hairpin), G 사중가닥(g-quadruplex) 구조 중에서 선택되는 어느 하나의 구조를 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 헤어핀 구조를 갖는 핵산은 루프(loop) 구조체 내에 하나 이상의 아데노신을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 G 사중가닥 구조를 갖는 핵산은 수소결합이 불가능한 단일 가닥 영역에 하나 이상의 아데노신을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 플루오로 아릴 화합물은 플루오로기(F-*, fluoro)를 기준으로 오쏘(ortho-) 위치 또는 파라(para-) 위치에 전자받개 작용기(electroattractive group)가 결합된 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 염기를 더 포함하며, 상기 염기는 탄산칼륨(K2CO3), NaH, 제3인산칼륨(K3PO4), 인산완충액(Phosphate buffer) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 용매에 핵산과 플루오로 아릴 화합물을 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 핵산과 상기 플루오로 아릴을 반응시키는 단계를 포함하는 핵산의 형광 표지 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 반응은 친핵성 아로마틱 치환반응일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA 중에서 선택되는 어느 하나이며, 아데노신을 하나 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥 구조를 포함하는 구조일 수 있으며, 더욱 상세하게는, 단일가닥, 헤어핀, G 사중가닥 구조 중에서 선택되는 어느 하나의 구조를 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 헤어핀 구조를 갖는 핵산은 루프 구조체 내에 하나 이상의 아데노신을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 G 사중가닥 구조를 갖는 핵산은 수소결합이 불가능한 단일 가닥 영역에 하나 이상의 아데노신을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 플루오로 아릴 화합물은 플루오로를 기준으로 오쏘 위치 또는 파라 위치에 전자받개 작용기가 결합된 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 염기를 더 혼합할 수 있으며, 상기 염기는 탄산칼륨(K2CO3), NaH, 제3인산칼륨(K3PO4), 인산완충액(Phosphate buffer) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 핵산 형광 표지용 조성물 및 이를 이용한 핵산의 형광 표지 방법은 작용기를 가진 뉴클리오시드를 도입없이 직접적으로 자연의 DNA 및 RNA에 형광을 표지할 수 있어 매우 간단하게 형광 표지가 가능하다.
또한, 중합효소, 금속 촉매, 민감한 시약 등의 사용을 하지 않기 때문에 DNA 또는 RNA의 변형 또는 파괴를 피할 수 있으며, 금속의 불순물이 포함되지 않은 형광 표지된 핵산의 합성이 가능하다.
도 1은 핵산의 형광 표지방법을 개략도로 도시한 것으로, (a)는 종래의 형광 표지방법, (b)는 본 발명에 따른 형광 표지방법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 실시예 1의 형광 표지 반응 결과를 나타낸 것으로, (a)는 UV-Vis 흡수, (b)는 아릴화 반응 이후 생성된 생성물(16 mM)의 형광 스펙트럼, (c)는 상기 생성물의 용액 사진이다.
도 3의 (a)는 실시예 1-6, 실시예 1-9 및 실시예 1-10의 생성물 용액을 UV 램프에서 촬영한 사진으로, 각각의 파장은 365 nm, 400 nm 및 450 nm에서 촬영한 사진이고, (b)는 UV-Vis 스펙트럼, (c)는 실시예 1-6, 실시예 1-9 및 실시예 1-10의 생성물의 정규화된 스펙트럼을 도시한 것이다.
도 4는 실시예 2의 반응을 위한 반응식을 도시한 것이다.
도 5는 실시예 3 내지 실시예 5의 반응을 위한 반응식을 도시한 것이다.
도 6의 (a) 내지 (c)는 아릴화된 올리고뉴클레오티드의 형광 스펙트럼을 도시한 것이고((a)는 330 nm, (b)는 400 nm, (c)는 450 nm), (d)는 UV 램프 하에서 사진을 촬영한 것으로, 각각의 파장은 356 nm, 400 nm, 450 nm이다.
도 7은 PAGE 분석을 수행한 결과로, EtBr로 염색하기 전(a)과 후(b)를 도시한 것이다. (레인 1 : 실시예 3-1 반응 전, 레인 2 : 실시예 3-1 반응 후, 레인 3 : 실시예 3-2 반응 전, 레인 4 : 실시예 3-2 반응 후, 레인 5 : 실시예 3-3 반응 전, 레인 6 : 실시예 3-3 반응 후)
도 8은 실시예 4의 다양한 DNA 구조 및 반응을 도식화 한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 핵산 및 플루오로 아릴(fluoro aryl) 화합물을 포함하는 핵산 형광 표지용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA 중에서 선택되는 어느 하나이며, 아데노신(adenosine)을 하나 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥 구조를 포함하는 구조일 수 있으며, 더욱 상세하게는, 단일가닥(single strand), 헤어핀(hairpin), G 사중가닥(g-quadruplex) 구조 중에서 선택되는 어느 하나의 구조를 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 헤어핀 구조를 갖는 핵산은 루프 구조체 내에 하나 이상의 아데노신을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 G 사중가닥 구조를 갖는 핵산은 수소결합이 불가능한 단일 가닥 영역에 하나 이상의 아데노신을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산 형광 표지용 조성물의 상기 핵산은 아데노신을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 아데노신 모이어티(moiety)는 N6 위치에 강 염기성 아미노 작용기를 갖는 뉴클레오사이드로, 상기 아미노 작용기는 친핵체로 작용할 수 있으며, 여기에 플루오로 아릴 화합물을 도입하여 친핵성 아로마틱 치환반응에 의해 직접적이고 간단히 형광 표지가 가능하다(도 1, b).
또한, 상기 핵산은 그 구조 내에 일부라도 단일 가닥의 구조를 포함하면 N6 위치의 아릴화가 가능하기 때문에 형광 표지가 가능한 특징이 있다.
여기서, 플루오로 아릴 화합물은 푸시-풀(push-full) 형광 턴-온(turn-on) 반응을 유도하기 위해 적합한 전자 끌기 그룹(electron-withdrawing group)을 나타내는 특징이 있다.
이 방법은 DNA 및 RNA에 사전에 작용기를 가진 뉴클레오시드의 도입이 필요없으며, 복잡한 합성 과정을 거칠 필요 없이 직접적으로 자연의 DNA 및 RNA에 형광표지가 가능하게 함으로써 저렴하고 간단히 형광표지를 할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 플루오로 아릴 화합물은 플루오로기(F-*, fluoro)를 기준으로 오쏘(ortho-) 위치 또는 파라(para-) 위치에 전자받개 작용기(electroattractive group)가 결합된 화합물일 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 전자받개 작용기의 종류로는 시아노기(-CN), 니트로기(-NO2), 알데하이드기(-CHO), 케톤기(-C=OR), 카르복시기(-COOH), 에스테르기(-COOR) 및 상기 작용기에 아릴, 알켄 또는 방향족(heteroaromatic) 그룹이 결합된 치환체일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
여기서, 상기 플루오로 화합물의 예시로는 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 3]을 들 수 있다.
[화학식 1] [화학식 2] [화학식 3]
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 염기를 더 포함하며, 상기 염기는 탄산칼륨(K2CO3), NaH, 제3인산칼륨(K3PO4), 인산완충액(Phosphate buffer) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 (a) 용매에 핵산과 플루오로 아릴(fluoro aryl) 화합물을 혼합하는 단계; 및 (b) 상기 핵산과 상기 플루오로 아릴을 반응시키는 단계를 포함하는 핵산의 형광 표지 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 반응은 친핵성 아로마틱 치환반응으로, 상기 핵산 내 아데노신 모이어티의 N6 위치에 아릴화(6N-arylation) 반응에 의해 형광 표지가 가능하다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 DNA 및 RNA 중에서 선택되는 어느 하나이며, 아데노신(adenosine)을 하나 이상 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 핵산은 단일 가닥 구조를 포함하는 구조일 수 있으며, 더욱 상세하게는, 단일가닥(single strand), 헤어핀(hairpin), G 사중가닥(g-quadruplex) 구조 중에서 선택되는 어느 하나의 구조를 가질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 헤어핀 구조를 갖는 핵산은 루프 구조체 내에 하나 이상의 아데노신을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 G 사중가닥 구조를 갖는 핵산은 수소결합이 불가능한 단일 가닥 영역에 하나 이상의 아데노신을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 플루오로 아릴 화합물은 플루오로기(F-*, fluoro)를 기준으로 오쏘(ortho-) 위치 또는 파라(para-) 위치에 전자받개 작용기가 결합된 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 플루오로 화합물의 예시로는 상기 [화학식 1] 내지 [화학식 3]을 들 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 있어서, 상기 (a)단계는 염기를 더 혼합할 수 있으며, 상기 염기는 탄산칼륨(K2CO3), NaH, 제3인산칼륨(K3PO4), 인산완충액(Phosphate buffer) 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다양한 플루오로 아릴(fluoro aryl) 화합물 스크리닝
전자 끌기 그룹을 갖는 다양한 플루오로 아릴 화합물을 스크리닝 하기 위해, 하기 반응식 1과 같이 반응을 진행하였다.
[반응식 1]
디메톡시트리틸로 보호된 데옥시아데노신 (0.3 mmol, 1eq) 및 K3PO4 (0.6 mmol, 2eq)를 DMSO (1mL)에 용해시킨 다음 플루오로 아릴 화합물 (0.36 mmol, 1.2eq)을 첨가한 후 생성된 혼합물을 100℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응은 TLC (CH2Cl2 / MeOH, 95 : 5)를 사용하여 모니터링 하였다. 반응이 완료되면 혼합물을 EtOAc (20 mL)로 희석하고 H2O (2 × 15 mL)로 세척하였다. 유기 상을 분리하고 건조(무수 Na2SO4)시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 상응하는 아릴화된 생성물을 34 내지 96%의 수율로 수득 하였다.
상기 플루오로 아릴 화합물은 각각 o-플루오로 벤즈알데히드(o-fluoro benzaldehyde, 실시예 1-1), p-플루오로 벤즈알데히드(p-fluoro benzaldehyde, 실시예 1-2), o-플루오로아세토페논(o-fluoro acetophenone, 실시예 1-3), p-플루오로아세토페논(p-fluoro acetophenone, 실시예 1-4), o-플루오로 벤조니트릴(o-fluoro benzonitrile, 실시예 1-5), p-플루오로 벤조니트릴(p-fluoro benzonitrile, 실시에 1-6), o-플루오로니트로벤젠(o-fluoronitrobenzene, 실시예 1-7), p-플루오로니트로벤젠(p-fluoronitrobenzene, 실시예 1-8), 2-cyano-4-styrylpyridine(실시예 1-9) 및 2-cyano-4-styrylmethylpyridinium(실시예 1-10)을 사용하였으며, 그 결과는 하기 표 1, 도 2 및 도 3에 나타내었다.
실시예 아릴(Ar)기 시간
(h)		 수율
(%)a 		Abs
(λmax)		 Em
(λmax)		 QY
(φF)
실시예 1-1 16 92 320 410 0.002
실시예 1-2 16 86 320 - -
실시예 1-3 24 65 321 411 0.004
실시예 1-4 24 54 324 405 0.004
실시예 1-5 16 93 300 372 0.034
실시예 1-6 16 96 320 400 0.102
실시예 1-7 16 94 330 - -
실시예 1-8 16 89 330 - -
실시예 1-9 16 65 410 474 0.11
실시예 1-10 16 34 450 576 0.24
aIsolated yield; conditions: dADMT (1 equiv), corresponding fluoroaryl (1.2 equiv), K3PO4 (2 equiv), DMSO (1 mL), 110℃, 24h.
실시예 1-1 및 실시예 1-2는 각각 92% 및 86%의 높은 수율로 생성물을 얻었다. 반면에 실시예 1-3 및 실시예 1-4는 생성물로의 전환시간이 더 오래걸렸고, 더 낮은 수율(65% 및 54%)로 생성물을 얻었으며, 이는 더 약한 전자 끌기 능력과 기본 조건에서 에놀레이트(enolate) 형성 가능성 때문인 것으로 판단된다.
실시예 1-5 및 실시예 1-6에서는 각각 높은 수율(93% 및 96%)을 나타냈으며, 실시예 1-7 및 실시예 1-8도 유사하게 높은 수율(94% 및 89%)로 생성물을 얻었다. 니트로아릴 데옥시아데노신(nitroaryl deoxyadenosine) 유도체인 실시예 1-7 및 실시예 1-8의 생성물은 대사 활성화를 통해 돌연변이 유발성과 발암성을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 추가 용매 분해 시 니트레늄(nitrenium) 이온이 생성되어 불안정한 N-하이드록시 유도체가 많이 생성되는 문제가 있다.
아릴화된 데옥시아데노신 유도체인 실시예 1-1, 실시예 1-3 내지 실시예 1-6, 실시예 1-9 및 실시예 1-10의 생성물은 턴-온 형광을 나타냈다(도 2). 플루오로 아릴 화합물은 그 자체로는 형광성이 없었지만, 아릴화 후에 형광 턴-온 특성을 나타냈는데, 이는 아릴 단위(전자 끌기, electron withdrawing)와 데옥시 아데노신의 6N- 아미노 그룹 (전자 기증, electron donating) 사이에 형성된 푸시-풀 전자 전달 시스템과 관련이 있을 것으로 판단된다.
시아노기가 추가된 아릴기를 특징으로 하는 커플링 생성물의 양자 수율(QY)은 포르밀(formyl-) 및 아세틸(acetyl-)이 존재하는 대응물보다 높았다. 실제로 파라-포밀 유도체는 어떠한 형광도 나타내지 않았다.
실시예 1-7 및 실시예 1-8의 형광이 없는 것은 비록 강한 전자를 끌어당기는 단위체 임에도 불구하고 니트로 그룹의 켄칭 효과(quenching effect)에 기인한 것으로 판단된다. 도 3에 도시한 바와 같이, 턴-온 시스템 중에서 p-시아노 유도체(실시예 1-6) 및 o-시아노 유도체(실시예 1-9 및 실시예 1-10)는 상당히 높은 형광 QY (각각 0.10, 0.11 및 0.24)를 제공했으며, 파란색(λmax = 405 nm), 청녹색 (λmax = 474 nm) 및 황색-주황색 (λmax = 580 nm) 방출은 각각 핵산 이미징에 유용할 수 있음을 시사한다.
실시예 2. 핵산 염기에 대한 선택성 확인
핵산 염기에 대한 선택성을 확인하기 위하여, 도 4에 도시한 반응식과 같이 데옥시아데노신(deoxyadenosine), 데옥시시토신(deoxycitosine) 또는 데옥시구아노신(deoxyguanosine)을 포함하는 폴리티민 올리고뉴클레오티드(polythymine oligonucleotide)를 인산염 완충액에서 2-cyano-4-styrylmethylpyridinium과 반응시켰으며, 반응 결과를 하기 표 2에 나타냈다.
실시예 올리고뉴클레오티드 수율(%) SM(%)a
실시예 2-1 5´-PO4 3-ATTTTTTTTTTTTTT-3´
(서열번호 1)		 64 36
실시예 2-2 5´-PO4 3-CTTTTTTTTTTTTTT-3´
(서열번호 2)		 2 98
실시예 2-3 5´-PO4 3-GTTTTTTTTTTTTTT-3´
(서열번호 3)		 5 95
aSM=회수된 출발물질(Recovered starting material)
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 아릴화는 데옥시아데노신 함유 올리고뉴클레오티드에 대해서만 선택적인 것을 확인하였다. 따라서, 아릴화는 실제로 뉴클레오사이드 중에서 데옥시아데노신에 대해 선택적이고 심지어 올리고 뉴클레오타이드 내의 잔기로서도 선택적임을 확인하였다.
실시예 3. 핵산 내 아데노신 갯수에 따른 형광 턴-온 분석
핵산 내 아데노신 갯수에 따른 형광 턴-온 수준을 분석하기 위해, 끝과 중간 위치에 각각 1개 내지 3개의 아데노신염기를 포함하고 티민(thymine, T)이 풍부한 올리고뉴클레오티드에 대하여 형광 턴-온 반응을 조사하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 열대말라리아원충(Plasmodium falciparum) 유전자(ATTTTTAC, >6000 motifs)에서 흔히 발견되며, I형 인터페론(IFN)을 유도하는 것으로 알려져 있다.
각각의 반응은 5에 도시한 반응식과 같이 진행하였으며, 반응조건은 올리고뉴클레오티드(100 pmol/μL, 50 μL)를 phosphate buffer (0.1M, pH 7.5, 200 μL)에 용해시킨 후 여기에 플루오로 아릴 화합물 (5 mg)을 넣고 37℃ 에서 16 h 반응하여 수율을 HPLC로 확인하였다. 이 반응조건은 in vivo 세포 내에서의 반응에 유리하다.
또 다른 반응 조건은 5 mM 올리고뉴클레오티드 (1eq)를 DMSO에 용해한후, 5 mM의 K3PO4를 첨가한 후 DMSO 혹은 DMSO:H2O (7:3)에 용해되어 있는 10 mM의 플루오로 아릴 화합물(2eq)을 첨가 한 후 37℃, 24 시간동안 반응시켰다. 이 반응 조건은 in vitro 세포 외에서의 반응에 유리하다.
실시예 3-1 내지 실시예 3-3은 화학식 1을 플루오로 아릴 화합물로 사용하였고, 실시예 3-4 내지 실시예 3-6 및 실시예 3-7 내지 실시예 3-9는 각각 화학식 2 및 화학식 3을 플루오로 아릴 화합물로 사용하였으며, 반응 결과는 하기 표 3, 도 6 및 도 7에 도시하였다.
실시예 올리고뉴클레오티드 아릴(Ar)기 수율(%) SM(%) Calculated
MALDI		 Observed
MARLDI
실시예 3-1 5´-PO4 3-ATTTTTTTTTTTTTT-3´
(서열번호 1)		 75 25 4692.84 4692.71
실시예 3-2 5´-PO4 3-ATTTTTTTATTTTTT-3´
(서열번호 4)		 73 27 4804.85 4802.17
실시예 3-3 5´-PO4 3-ATTTTTTATTTTTTA-3´
(서열번호 5)		 70 30 4916.66 4908.71
실시예 3-4 5´-PO4 3-ATTTTTTTTTTTTTT-3´
(서열번호 1)		 77 16 4796.08 4801.00
실시예 3-5 5´-PO4 3-ATTTTTTTATTTTTT-3´
(서열번호 4)		 73 15 5010.48 5009.32
실시예 3-6 5´-PO4 3-ATTTTTTATTTTTTA-3´
(서열번호 5)		 59 13 5226.58 5223.11
실시예 3-7 5´-PO4 3-ATTTTTTTTTTTTTT-3´
(서열번호 1)		 99 0 4810.83 4806.33
실시예 3-8 5´-PO4 3-ATTTTTTTATTTTTT-3´
(서열번호 4)		 99 0 5041.41 5046.72
실시예 3-9 5´-PO4 3-ATTTTTTATTTTTTA-3´
(서열번호 5)		 99 0 5271.70 5272.96
상기 반응 조건에서 p-플루오로벤조니트릴(화학식 1)을 사용한 실시예 3-1 내지 실시예 3-3의 아릴 화는 아데노신 잔기의 위치에 관계없이 진행되었다. MALDI-TOF 질량 분석법을 통해 여러 데옥시아데노신 잔류물의 아릴화와 일치하는 정확한 질량을 확인하였다. 형광 겔 전기영동을 통해 실시예 3-1 내지 실시예 3-3의 아릴화가 일어난 것을 확인했다(도 7). 이중 및 삼중 아릴화된 올리고뉴클레오티드로부터 강한 방출 신호를 관찰(실시예 3-2 및 실시예 3-3)한 반면, 단일 아릴화된 올리고뉴클레오티드(실시예 3-1)는 상대적으로 약한 방출을 나타내는 것을 확인했다. 이는 형광 턴-온이 데옥시아데노신 잔기의 수에 따라 달라진다는 것을 시사한다.
또한, 실시예 3-1 내지 실시예 3-3의 형광 턴-온 여부를 확인하기 위해 형광 방출 스펙트럼을 기록했다. λmax = 405 nm에서의 방출은 올리고뉴클레오티드에서 데옥시아데노신의 수가 증가함에 따라 증가했다(도 6a).
실시예 3-4 내지 실시예 3-9에서는 높은 좋은 수율로 아릴화된 생성물을 얻었다. 상기 실시예 3-4 내지 실시예 3-9도 마찬가지로 데옥시아데노신 잔기의 수에 따라 λmax = 474 nm 및 λmax = 565 nm에서 방출량에서 증가하는 것으로 나타났다(도 6b 및 6c). 이를 통해 본 발명은 사전 기능화 없이 천연 DNA의 직접 형광 턴-온 표지가 가능함을 확인하였다.
실시예 4. 2차 구조에 따른 아릴화 반응성 분석
2차 구조가 아데노신 N6 위치의 아릴화에 미치는 영향을 조사하기 위해, 상기 화학식 3 화합물을 도 8에 도시한 바와 같이 ssDNA(실시예 4-1), dsDNA(실시예 4-2), 헤어핀 루프(loop) 구조에 아데노신을 포함하는 구조(실시예 4-3), 헤어핀 스템(stem)에 아데노신을 포함하는 구조(실시예 4-4), G 사중가닥(G-Quadraplex, 실시예 4-5), ssRNA(실시예 4-6) 및 상보적인 서열을 포함하는 dsRNA(실시예 4-7)의 다양한 DNA 구조와 반응시켰으며, 반응 조건은 실시예 3과 동일하게 진행하였으며, 그 반응 결과를 하기 표 4에 나타냈다.
실시예 올리고뉴클레오티드 아릴(Ar)기 수율(%) SM(%) Calculated
MALDI		 Observed
MARLDI
실시예 4-1 5´-PO4 3-GCGTTACGTGTGCTC-3´
(서열번호 6)		 89 11 4874.44 4875.31
실시예 4-2 5´-PO4 3-GCGTTACGTGTGCTC-3´
(서열번호 6)		 0 99 - -
실시예 4-3 5´-PO4 3-GGG CGC GGC AGC TTT CGT TTG GCG CCC-3´
(서열번호 7)		 99 0 8595.59 8601.16
실시예 4-4 5´-PO4 3-GGG CAC GGC GGC TTT CGT TTG GTG CCC-3´
(서열번호 8)		 0 99 - -
실시예 4-5 5´-PO4 3-TG TGG GTG GGT AGG GTG GGT TT-3´
(서열번호 9)		 89 0 7264.3 7266.67
실시예 4-6 5´-PO4 3-GCG GCG AGC GCG GCG-3´
(서열번호 10)		 39 0 5199.67 5205.07
실시예 4-7 5´-PO4 3-GCG GCG AGC GCG GCG-3´
(서열번호 10)		 0 99 - -
4개의 핵 염기를 모두 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드(실시예 4-1)는 아릴화를 거쳐 형광성 올리고뉴클레오티드를 생산하는 하는 반면, 이중 DNA인 실시예 4-2는 반응하지 않았다. 이는 이중 DNA의 수소 결합으로 인한 크라우딩 효과(crowding effect) 때문인 것으로 판단된다. 아데노신이 스템에 위치한 헤어핀 구조(실시예 4-4)의 아데노신 모이어티는 아릴화가 진행되지 않았으며, 이는 실시예 4-2와 마찬가지로 이중구조 스템에서 수소 결합에 관여했기 때문인 것으로 사료된다. 반면, 아데노신이 루프에 위치한 헤어핀(실시예 4-3)과 G 사중가닥(실시예 4-5)은 아데노신 잔기가 가닥 간 수소 결합이 불가능한 단일 가닥 영역에 위치하여 아릴화가 진행되었다.
또한 RNA 서열의 단일 가닥(실시예 4-6) 및 이중 형태(실시예 4-7)의 아릴화를 실시했으며, 단일 가닥 RNA만이 아릴화가 진행된 반면, 이중 RNA는 반응하지 않은 채로 남아있었다. 이러한 결과는 이중 형태의 가닥 간 수소 결합이 아데노신의 N6 위치의 아릴화 반응성을 억제함을 시사한다.
실시예 5. 천연 DNA에 대한 형광 표지 분석
천연 DNA에서도 본 발명의 형광 표지가 가능한지를 조사하기 위해, 프라이머가 확장(30 mer)된 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 반응 조건은 실시예 3과 동일하게 진행하였으며, 그 반응 결과를 하기 표 5에 나타냈다.
실시예 올리고뉴클레오티드 아릴(Ar)기 수율(%) SM(%) Calculated
MALDI		 Observed
MARLDI
실시예 5 5´-PO4 3-TTTTTTTTTTTTTTATTTTTATTTTTATTT-3´
(서열번호 11)		 72 28 9480.39 9425.04
3개의 아데노신은 상기 화학식 1과의 반응을 통해 아릴화된 것을 확인하여, 천연 DNA 및 RNA에서도 본 발명에 따른 형광 표지 방법을 이용하여 형광 표지가 가능함을 확인하였다.
이상과 같이 실시예를 통하여 본 발명을 설명하였다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상술한 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해되어야 한다. 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
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Claims (19)

  1. 핵산 및 플루오로 아릴(fluoro aryl) 화합물을 포함하는 핵산 형광 표지용 조성물로서,
    상기 핵산은 DNA 및 RNA 중에서 선택되는 어느 하나이며, 아데노신(adenosine)을 하나 이상 포함하는 것이고,
    상기 플루오로 아릴 화합물은 플루오로기(F-*, fluoro)를 기준으로 오쏘(ortho-) 위치 또는 파라(para-) 위치에 전자받개 작용기(electroattractive group)가 결합된, 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 3]으로 표시되는 화합물 중에 선택되는 어느 하나 이상의 화합물인 것인, 핵산 형광 표지용 조성물:
    [화학식 1]

    [화학식 2]

    [화학식 3]
    .
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산은 데옥시아데노신(deoxyadenosine)을 하나 이상 포함하는 폴리티민 올리고뉴클레오티드(polythymine oligonucleotide)인 것을 특징으로 하는 핵산 형광 표지용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 핵산은 단일 가닥 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 형광 표지용 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 핵산은 단일가닥(single strand) 구조, 루프(loop) 구조체 내에 하나 이상의 아데노신을 포함하는 헤어핀(hairpin) 구조 및 수소결합이 불가능한 단일 가닥 영역에 하나 이상의 아데노신을 포함하는 G 사중가닥(g-quadruplex) 구조 중에서 선택되는 어느 하나의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 형광 표지용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 플루오로 아릴 화합물은 핵산 내 데옥시아데노신에 선택적으로 반응하여 턴-온 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 핵산 형광 표지용 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 플루오로 아릴 화합물은 핵산 내 데옥시아데노신 잔기의 수가 증가할 수록 형광 세기가 증가하는 것을 특징으로 하는 핵산 형광 표지용 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 염기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 형광 표지용 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 염기는 탄산칼륨(K2CO3), NaH, 제3인산칼륨(K3PO4), 인산완충액(Phosphate buffer) 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산 형광 표지용 조성물.
  10. (a) 용매에 핵산과 플루오로 아릴 화합물을 혼합하는 단계; 및
    (b) 상기 핵산과 상기 플루오로 아릴을 반응시키는 단계를 포함하는 핵산의 형광 표지 방법으로서,
    상기 핵산은 DNA 및 RNA 중에서 선택되는 어느 하나이며, 아데노신(adenosine)을 하나 이상 포함하는 것이고,
    상기 플루오로 아릴 화합물은 플루오로기를 기준으로 오쏘 위치 또는 파라 위치에 전자받개 작용기가 결합된, 하기 [화학식 1] 내지 [화학식 3]으로 표시되는 화합물 중에 선택되는 어느 하나 이상의 화합물인 것인, 핵산의 형광 표지 방법:
    [화학식 1]

    [화학식 2]

    [화학식 3]
    .
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 반응은 친핵성 아로마틱 치환반응인 것을 특징으로 하는 핵산의 형광 표지 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 핵산은 데옥시아데노신을 하나 이상 포함하는 폴리티민 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 핵산의 형광 표지 방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 핵산은 단일 가닥 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 형광 표지 방법.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 핵산은 단일가닥 구조, 루프 구조체 내에 하나 이상의 아데노신을 포함하는 헤어핀 구조 및 수소결합이 불가능한 단일 가닥 영역에 하나 이상의 아데노신을 포함하는 G 사중가닥 구조 중에서 선택되는 어느 하나의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 핵산의 형광 표지 방법.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 플루오로 아릴 화합물은 핵산 내 데옥시아데노신에 선택적으로 반응하여 턴-온 형광을 나타내는 것을 특징으로 하는 핵산의 형광 표지 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 플루오로 아릴 화합물은 핵산 내 데옥시아데노신 잔기의 수가 증가할 수록 형광 세기가 증가하는 것을 특징으로 하는 핵산의 형광 표지 방법.
  17. 삭제
  18. 제 10항에 있어서,
    상기 (a)단계는 염기를 더 혼합하는 것을 특징으로 하는 핵산의 형광 표지 방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 염기는 탄산칼륨(K2CO3), NaH, 제3인산칼륨(K3PO4), 인산완충액(Phosphate buffer) 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산의 형광 표지 방법.
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