WO1995011970A1 - Verfahren zur primer-herstellung und template-bank dafür - Google Patents

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WO1995011970A1
WO1995011970A1 PCT/EP1994/003547 EP9403547W WO9511970A1 WO 1995011970 A1 WO1995011970 A1 WO 1995011970A1 EP 9403547 W EP9403547 W EP 9403547W WO 9511970 A1 WO9511970 A1 WO 9511970A1
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shortmers
template
bank
nucleotides
primer
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PCT/EP1994/003547
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Helmut BLÖCKER
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GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the Maxam-Gilbert technique and the Sanger method are mainly used for DNA sequencing.
  • the single-stranded or single-stranded DNA to be sequenced is enzymatically polymerized to the double strand.
  • the DNA must first be made double-stranded in a short area, since DNA polymerases require a short double-stranded area with a free 3 'hydroxyl end for the incorporation of nucleotides (template / primer dependence of the enzymatically catalyzed incorporation of nucleotides).
  • the synthesis of the short double-strand region is carried out by hybridizing two or more Shortmers in the vicinity of one another on the single-stranded DNA to be sequenced as a template and then connecting the Shortmers together to form a primer or ligated.
  • the DNA strand to be sequenced is then successively complemented enzymatically with DNA polymerase.
  • a primer attachment site is again selected for the next sequencing at the 3 'end of the DNA sequence just read. On this primer shortmers are hybridized and ligated again. This new primer is used for the following sequencing.
  • this prior art can now be improved by a method for producing a primer for consecutive DNA sequencing, in which at least two shortmers in the vicinity of one another are hybridized with a template and then ligated together to form the primer , the method being characterized in that
  • a template in the form of a single strand of nucleotides is used, in which the number of nucleotides is at least 6 and is not greater than approximately twice the total number of nucleotides of all shortmers used, and (b) then separates the primer formed from template and from unconverted shortmers and wins.
  • Primer In the present context, primer is understood to mean a short DNA strand, with the aid of which the DNA strand to be sequenced is made double-stranded over a correspondingly short region.
  • template In contrast to the DNA strand to be sequenced, in the present context, template is understood to mean a single strand of nucleotides on which a primer can be produced, which is only used for sequencing a DNA strand after separation from the template.
  • Shortmers are oligonucleotides that can be ligated to a primer; see. EP-B-89 906 358.0.
  • connection or ligation of the Shortmers is carried out according to the Shortmer concept on Te plates, the templates being at least partially complementary to the Shortmers used.
  • the templates can be short strands made synthetically from nucleotides. It goes without saying that not only the four nucleotide building blocks for A, C, G and T can be used for these syntheses, from which natural DNA is built, but also derivatives, provided that there is at least partial complementarity with the shortmers.
  • the shortmers can be short strands that have been synthesized from nucleotides.
  • syntheses it is not only the four nucleotide building blocks for A, C, G and T. can be used from which natural DNA is built up, but also derivatives, provided that there is at least partial complementarity to the template.
  • the explanations given above for templates apply accordingly.
  • one of the nucleotide building blocks can also be labeled, for example radioactive or fluorescent, in particular for the 3 'end or the 5' end.
  • one of the nucleotide building blocks can also carry a residue for easier template separation, e.g. B. a biotin residue.
  • a modified nucleotide building block with exclusive complementarity can also be provided at at least one location on a template, for example to increase the melting temperature of primers formed.
  • the first shortmer can also be specified on a fixed phase.
  • the template and the further shortmer (s) which have not been specified on a fixed phase are then separated.
  • the number of nucleotides of the template can be up to approximately the number of nucleotides of one of the shortmers used, or up to about the number of nucleotides of one of the shortmers used, greater than the total number of nucleotides of all shortmers used.
  • the number of nucleotides of the template can correspond approximately to the total number of nucleotides of all shortmers used.
  • 6-mers, 7-mers, 8-mers and / or 9-mers are preferably used as shortmers.
  • two shortmers are preferably used, the number of nucleotides of the template being 8 to 18.
  • a 5-mer is used as a shortmer for primer formation, it is advantageous to use the 5-mer with at least one shortmer from the group of 7-mers, 8-mers or 9-mers.
  • the method according to the invention thus offers the advantage that so much of the ligation product can be used in a sequencing that a favorable excess of primer results, that is to say a ratio of primer: DNA strand to be sequenced 1 1: 1.
  • a bank (library) of templates which are suitable for the production of primers for consecutive DNA sequencing,
  • a short template should not be provided for every shortmer pair or combination.
  • nucleotides which have a similar complementarity to at least two of the four natural bases are incorporated in one, more or all templates at one position or at individual positions .
  • inosine can be provided as a nucleotide with a similar complementarity for at least two of the four natural nucleotide bases.
  • a bank according to the invention can comprise up to 4 J 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- or 18-mers. According to the invention, this also includes those oligomers which comprise up to 18 nucleotides which can form Watson-Crick base pairs with the shortmers.
  • the object on which the invention is based is also achieved by a bank (library) of templates which are suitable for the production of primers for consecutive DNA sequencing,
  • the primer formed is separated from the template and from unconverted shortmers and wins, the bank comprising a mixture of several mixtures of templates, two or four different at one or more positions of the templates of a mixture, each of the four natural ones Bases complementary bases are provided, with the proviso that the total number of all conceivable possible Tem ⁇ plate mixtures including Bank's Tem ⁇ plates not present in the mixture practically does not exceed the total number of all possible Shortmers conceivable for the primer production.
  • a short template is not provided for every shortmer pair or combination, so that the shortmer concept is not made unrealistic. Rather, the complexity of producing short templates in this embodiment is reduced by incorporating more than one nucleotide at a template of a predetermined length or number of nucleotide building blocks at individual template positions.
  • a bank (library) according to the invention can contain up to 4 9 mixtures of 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- or 18-mers, including non-mixed 10- , 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- and 18-mers.
  • this also includes those oligomers which comprise up to 18 nucleotides which can form Watson-Crick base pairs with the shortmers.
  • the vessel with the mixed components was heated in a programmable temperature control block to 80 ° C. within 2 minutes, held at this temperature for 2 minutes and then cooled to 10 ° C. within 20 minutes.
  • 4 ⁇ l of T4 DNA ligase (4 units; Gibco) were added to the solution and the mixture was kept at 10 ° C. for a further 2 h.
  • the solution was then mixed with 20 ⁇ l stop mix (Pharmacia).
  • the ligated primer was used according to commercially available protocols in DNA sequence analyzes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Primers für eine konsekutive DNA-Sequenzierung, bei dem man mindestens zwei Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template hybridisiert und danach miteinander zum Primer ligiert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) ein Template in Form eines Einzelstranges aus Nukleotiden verwendet, bei dem die Anzahl der Nukleotide mindestens 6 beträgt und nicht größer als etwa das Doppelte der Gesamtzahl der Nukleotide aller eingesetzten Shortmers ist, und (b) danach den gebildeten Primer von Template und von unumgesetzten Shortmers abtrennt und gewinnt. Ferner betrifft die Erfindung Banken (Bibliotheken) von Templaten für das genannte Verfahren.

Description

Verfahren zur Primer-Herstellung und Template-Bank dafür.
Zur DNA-Sequenzierung werden heute überwiegend die Maxam- Gilbert-Technik und das Sanger-Verfahren angewendet. Bei diesem Sanger-Verfahren wird die zu sequenzierende einzelsträngige oder einzelsträngig gemachte DNA enzymatisch zum Doppelstrang auf- polymerisiert . Dazu muß die DNA zunächst in einem kurzen Bereich doppeisträngig gemacht werden, da DNA-Polymerasen einen kurzen Doppelstrangbereich mit einem freien 3 ' -Hydroxylende für den Einbau von Nukleotiden benötigen (Template/Primer-Abhängigkeit des enzymatisch katalysierten Einbaus von Nukleotiden) . Nach dem Shortmer-Konzept (EP-B-89.906 358.0) geht man zur Synthese des kurzen Doppelstrangbereichs so vor, daß man zwei oder mehr Shortmers in Nachbarschaft zueinander auf der zu sequenzierenden einzelsträngigen DNA als Template hybridisiert und die Shortmers danach miteinander zu einem Primer verbindet oder ligiert. Aus¬ gehend von dem kurzen Doppelstrangbereich wird der zu sequenzie¬ rende DNA-Strang dann mit DNA-Polymerase enzymatisch sukzessiv komplementiert. Sobald zur Auswertung der Analyse die Sequenz vollständig gelesen worden ist, wird für die nächste Sequenzie¬ rung auf dem 3 ' -Ende der soeben gelesenen DNA-Sequenz erneut eine Primer-Anheftungsstelle ausgewählt. Auf dieser Primer-An- heftungsstelle werden erneut Shortmers hybridisiert und ligiert. Dieser neue Primer dient der folgenden Sequenzierung.
Einerseits ist man an möglichst langen Primern interessiert, um mit einem derartigen Primer einen zu sequenzierenden DNA-Strang individuell ansprechen zu können. Andererseits wächst der Umfang der für die Primerherstellung heranzuziehenden Shortmer-Banken mit größerer Primerlänge drastisch an. Es hat sich jedoch ge¬ zeigt, daß man mit Primern einer Länge von 12 bis 18 Nucleotiden befriedigend genau zu sequenzierende DNA-Stränge ansprechen kann.
Außerdem hat sich gezeigt, daß das klassische Shortmer-Konzept in folgender Hinsicht verbesserungsfähig ist. Hochwertige Sequenzierungsprotokolle gehen von einem Überschuß des Primers über den zu sequenzierenden DNA-Strang aus. Liegt der Primer in einem Verhältnis von 1:1 oder im Unterschuß zu dem zu sequen¬ zierenden DNA-Strang vor, so beobachtet man generell im Experi¬ ment kürzere Leseweiten, als man bei einem Primer-Überschuß er¬ warten könnte. Sofern man dementsprechend beim Shortmer-Konzept nur einmal hybridisiert und ligiert und nicht das Pri er-Liga- tionsprodukt abschmilzt, erneut hybridisiert und ligiert, läßt sich trotz eines Überschusses des eingesetzten Shortmers äußer¬ stenfalls eine 1 :1-Stöchiometrie von Primer zu dem zu sequenzie¬ renden DNA-Strang erreichen.
Dieser Stand der Technik läßt sich nun gemäß einer Ausführungs¬ form der Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung eines Primers für eine konsekutive DNA-Sequenzierung verbessern, bei dem man mindestens zwei Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template hybridisiert und danach miteinander zum Pri¬ mer ligiert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) ein Template in Form eines Einzelstranges aus Nukleotiden verwendet, bei dem die Anzahl der Nukleotide mindestens 6 be¬ trägt und nicht größer als etwa das Doppelte der Gesamtzahl der Nukleotide aller eingesetzten Shortmers ist, und (b) danach den gebildeten Primer von Template und von unumge- setzten Shortmers abtrennt und gewinnt .
Primer: Unter Primer wird im vorliegenden Zusammenhang ein kur¬ zer DNA-Strang verstanden, mit dessen Hilfe der zu sequenzie¬ rende DNA-Strang über einen entsprechend kurzen Bereich doppel- strängig gemacht wird.
Template: Im Unterschied zum zu sequenzierenden DNA-Strang wird unter Template im vorliegenden Zusammenhang ein Einzelstrang aus Nucleotiden verstanden, auf dem ein Primer hergestellt werden kann, der erst nach Abtrennung vom Template zur Sequenzierung eines DNA-Stranges eingesetzt wird.
Shortmer: Unter Shortmers werden Oligonucleotide verstanden, die sich zu einem Primer ligieren lassen; vgl. EP-B-89 906 358.0.
Erfindungsgemäß wird also das Verbinden bzw. die Ligation der Shortmers nach dem Shortmer-Konzept auf Te platen durchgeführt, wobei die Templates zu den eingesetzten Shortmers zumindest teilweise komplementär sind. Bei den Templaten kann es sich um kurze Stränge handeln, die synthetisch aus Nucleotiden hergestellt worden sind. Es ist selbstverständlich, daß für diese Synthesen nicht nur die vier Nucleotid-Bausteine für A, C, G und T herangezogen werden können, aus denen sich natürliche DNA aufbaut, sondern auch Derivate, sofern eine zumindest teilweise Komplementarität zu den Shortmers gegeben ist . Zum Stand der Technik sei verwiesen auf DE-A-3 501 306, FR-A-2 490 505, US-A-4 988 617, WO-A-86/06 413, WO-A-91/09 623 und WO-A- 91/17 239. Zur Herstellung eines derivatisierten oder degenerierten Templates kann man beispielsweise an die Verwendung von Inosin oder an eine Mischung der vier Nucleotid- Bausteine A, C, G und T zum Einbau an einundderselben Template- Position denken.
Entsprechend kann es sich bei den Shortmers um kurze Stränge handeln, die synthetisch aus Nucleotiden hergestellt worden sind. Wiederum ist es selbstverständlich, daß für diese Synthe¬ sen nicht nur die vier Nucleotid-Bausteine für A, C, G und T herangezogen werden können, aus denen sich natürliche DNA auf¬ baut, sondern auch Derivate, sofern eine zumindest teilweise Komplementarität zum Template gegeben ist . Die vorstehend für Templates gemachten Ausführungen gelten entsprechend.
Erfindungsgemäß und entsprechend dem Stand der Technik kann einer der Nukleotid-Bausteine auch markiert sein, beispielsweise radioaktiv oder fluoreszierend, insbesondere für das 3 ' -Ende oder das 5 '-Ende.
Erfindungsgemäß kann einer der Nucleotid-Bausteine auch einen Rest zur erleichterten Template-Abtrennung tragen, z. B. einen Biotinrest .
Erfindungsgemäß kann ferner an mindesten einer Stelle eines Tem¬ plates ein modifizierter Nucleotid-Baustein mit ausschließlicher Komplementarität vorgesehen sein, um beispielsweise die Ab- schmelztemperatur gebildeter Primer zu erhöhen.
Erfindungsgemäß kann das erste Shortmer auch an fester Phase vorgegeben werden. Bei der vorstehend angesprochenen Stufe (b) werden dann das Template und der oder die weiteren Shortmers ab¬ getrennt, die nicht an fester Phase vorgegeben wurden.
Erfindungsgemäß kann die Anzahl der Nucleotide des Templates bis um etwa die Anzahl der Nucleotide eines der eingesetzten Short¬ mers kleiner oder bis um etwa die Anzahl der Nucleotide eines der eingesetzten Shortmers größer sein als die Gesamtzahl der Nucleotide aller eingesetzten Shortmers.
Erfindungsgemäß kann die Anzahl der Nucleotide des Templates etwa der Gesamtzahl der Nucleotide aller eingesetzten Shortmers entsprechen.
Erfindungsgemäß wird man vorzugsweise als Shortmers 6-mere, 7- mere, 8-mere und/oder 9-mere verwenden. Vorzugsweise setzt man erfindungsgemäß zwei Shortmers ein, wobei die Anzahl der Nucleotide des Templates 8 bis 18 betragen kann.
Erfindungsgemäß kann man zwei Shortmers
(a) aus einer Bank von 6-meren und/oder 7-meren und/oder
(b) aus einer Bank von 8-meren und/oder 9-meren verwenden und bei (a) bzw. (b) ein 8-meres oder 9-meres aus einer Bank gemäß
(b) als Template einsetzen.
Sofern man ein 5-meres als Shortmer für die Primerbildung heran¬ zieht, ist es vorteilhaft, das 5-mere mit mindestens einem Shortmer aus der Gruppe der 7-mere, 8-mere oder 9-mere zu verwenden.
So bietet das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß man in eine Sequenzierung so viel vom Ligationsprodukt einsetzen kann, daß sich ein günstiger Primerüberschuß ergibt, also ein Verhält¬ nis Primer: zu sequenzierender DNA-Strang ≥ 1:1.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Bank (Bibliothek) von Templates vorgesehen, die für die Herstel¬ lung von Primern für eine konsekutive DNA-Sequenzierung geeignet sind,
- wobei man zur Primer-Herstellung zwei, drei, vier oder mehr Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template der Bank hybridisiert,
- danach die hybridisierten Shortmers zum Primer ligiert und
- danach den gebildeten Primer von Template und von unumgesetz- ten Shortmers abtrennt und gewinnt, wobei bei mindestens einem Template bis allen Templates der Bank mindestens ein bis maximal alle Nucleotide eine ähnliche Komple¬ mentarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid- Basen besitzen, und zwar mit der Maßgabe, daß die Gesamtzahl aller denkbar bzw. theoretisch möglichen Templates der Bank die Gesamtzahl aller für die Primer-Herstellung denkbar möglichen Shortmers praktisch nicht übersteigt. Um das Shortmer-Konzept nicht ad absurdum zu führen, soll erfin¬ dungsgemäß nicht für jedes Shortmer-Paar bzw. jede Shortmer-Kom- bination ein kurzes Template vorgesehen werden. Vielmehr wird die Komplexität der Herstellung kurzer Templates dadurch gemin¬ dert, daß bei einer erfindungsgemäßen Bank bei einem, mehreren oder allen Templates an jeweils einer Position oder an einzelnen ihrer Positionen Nucleotide eingebaut sind, die eine ähnliche Komplementarität zu mindestens zwei der vier natürlichen Basen besitzen. Gemäß einer speziellen Ausführungsform der Erfindung kann man dafür Inosin als Nucleotid mit einer ähnlichen Komple¬ mentarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid- Basen vorsehen.
Eine erfindungsgemäße Bank kann bis zu 4J 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-mere umfassen. Erfindungsgemäß zählen dazu auch solche Oligomere, die bis zu 18 Nukleotide umfassen, die Watson-Cricksche Basenpaare mit den Shortmers ausbilden kön¬ nen.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird ferner gemäß einer weiteren Ausführungsform durch eine Bank (Bibliothek) von Templates gelöst, die für die Herstellung von Primern für eine konsekutive DNA-Sequenzierung geeignet sind,
- wobei man zur Primer-Herstellung zwei, drei, vier oder mehr Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template der Bank hybridisiert,
- danach die hybridisierten Shortmers zum Primer ligiert und
- danach den gebildeten Primer vom Template und von unumgesetz- ten Shortmers abtrennt und gewinnt, wobei die Bank ein Gemisch bis mehrere Gemische von Templates umfaßt, wobei an einer oder an mehreren Positionen der Templates eines Gemischs jeweils zwei bis vier verschiedene, zu den vier natürlichen Basen komplementäre Basen vorgesehen sind, und zwar mit der Maßgabe., daß die Gesamtzahl aller denkbar möglichen Tem¬ plate-Gemische einschließlich nicht im Gemisch vorliegender Tem¬ plates der Bank die Gesamtzahl aller für die Primer-Herstellung denkbar möglichen Shortmers praktisch nicht übersteigt. Wiederum gilt, daß nicht für jedes Shortmer-Paar bzw. jede Shortmer-Kombination ein kurzes Template vorgesehen wird, so daß das Shortmer-Konzept nicht ad absurdum geführt wird. Vielmehr wird die Komplexität der Herstellung kurzer Templates bei dieser Ausführungsform dadurch reduziert, daß man bei einem Template einer vorgegebenen Länge bzw. Anzahl von Nukleotid-Bausteinen an einzelnen Template-Positionen mehr als ein Nucleotid einbaut.
So kann eine erfindungsgemäße Bank (Bibliothek) bis zu 49 Gemi¬ sche von 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-meren einschließlich nicht im Gemisch vorliegender 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- bzw. 18-mere umfassen. Erfindungsgemäß zählen dazu auch solche Oligomere, die bis zu 18 Nukleotide umfassen, die Watson-Cricksche Basenpaare mit den Shortmers ausbilden kön¬ nen.
Die vorstehend zum Verfahren gemachten Ausführungen zu Templates mit derivatisierten, markierten oder Reste tragenden Bausteinen, die die Abtrennung erleichtern, gelten entsprechend. Sofern das erste Shortmer an fester Phase vorgegeben wird, gilt wiederum, daß bei der Trennung von Primer, Template und unumgesetzten Shortmers der oder die weiteren Shortmers abgetrennt werden, die nicht an fester Phase vorgegeben wurden.
Nachstehend wird die Erfindung durch ein Experiment mit 3 Anla¬ gen und 8 Figuren näher erläutert.
Shortmer-Experiment
Im Experiment verwendete Oligonucleotide (I = Inosin)
F-Oligo 5 ' F-AAAACGAC 3 ' P-Oligo 5' P-GGCCAGTG 3 • B-Oligo 5' B-IIIIGGCCGTCGIIII 3' K-Oligo 5' F-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT 3'
In einem typischen Experiment wurden 2,2 μl (220 pMol) einer Lösung eines 5 ' -Fluorescein-markierten Oktanucleotids (F-Oligo) mit 4,1 μl (220 pMol) einer Lösung eines 5 ' -phosphorylierten Oligonucleotids (P-Oligo) und mit 1,5 μl (150 pMol) eines 5'- Biotin-markierten Oligonucleotids (B-Oligo) sowie mit 4,2 μl T4- DNA-Ligase-Puffer (Gibco) und mit 4 μl ATP-Lösung (10 mM) in einem 0,5 ml Reaktionsgefäß kombiniert. Das Gefäß mit dem ge¬ mischten Komponenten wurde in einem programmierbaren Temperier¬ block innerhalb von 2 min auf 80 °C erhitzt, für 2 min bei die¬ ser Temperatur gehalten und dann innerhalb von 20 min auf 10 °C abgekühlt. Zum Start der Ligationsreaktion wurde die Lösung mit 4 μl T4-DNA-Ligase (4 Einheiten; Gibco) versetzt und für weitere 2 h bei 10 °C gehalten. Danach wurde die Lösung mit 20 μl Stopp- Mix (Pharmacia) versetzt.
Zur analytischen Kontrolle wurden 3 μl einer wässrigen Verdün¬ nung (1 ad 1000) der obigen Endlösung mit 3 μl Stopp-Mix ver¬ setzt und einer Gelelektrophorese auf einem 18-proz. denaturie¬ renden Polyacrylamidgel in einem kommerziellen "DNA-Sequencer" (A.L.F.; Pharmacia) unterworfen (1500 V, 50 °C, 34 W, 38 mA, 180 min) . Die automatisch gesammelten Rohdaten wurden mit dem Pro¬ gramm "Fragment Manager" (Pharmacia) hinsichtlich der Ligations- ausbeute ausgewertet (Anlage 1) .
20 μl der obigen Ligationsendlösung wurden mit 5 μl Wasser und dann mit 100 μl einer frisch aufgewirbelten Suspension von Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal) versetzt und für 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Mit Hilfe eines Magneten wurden die Phasen getrennt. Die flüssige Phase wurde in ein anderes Reak¬ tionsgefäß überführt. Danach wurde die flüssige Phase wie oben beschrieben einer analytischen Kontrolle unterworfen (Anlage 2) . Die feste Phase wurde in 10 μl 0,1 N NaOH suspendiert und für 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Phasen wurden mit Hilfe eines Magneten erneut getrennt. Die flüssige Phase wurde durch Zugabe von maximal 10 μl 0,1 N HCl neutralisiert. Die knapp 20 μl Lösung enthielten in mehreren Versuchen etwa 60 bis 90 % der theoretisch erreichbaren 75 pMol ligierten und 5' -Fluorescein- markierten Primers. Die Lösung wurde wie oben beschrieben einer analytischen Kontrolle unterworfen (Anlage 3) .
Der ligierte Primer wurde nach kommerziell erhältlichen Proto¬ kollen in DNA-Sequenzanalysen eingesetzt.
In einem Parallelexperiment wurde mit einem kommerziell erhält¬ lichem und um acht Basen längeren Primer (K-Oligo) gearbeitet. Die Leseweiten mit ligiertem Primer erreichten je nach Reinheit der eingesetzten Shortmers in mehreren Experimenten 80 bis 100 % der Leseweiten mit einem kommerziellen Primer (Figuren 1 bis 8) .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Primers für eine konsekutive DNA-Sequenzierung, bei dem man mindestens zwei Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template hybridisiert und da¬ nach miteinander zum Primer ligiert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man
(a) ein Template in Form eines Einzelstranges aus Nukleotiden verwendet, bei dem die Anzahl der Nukleotide mindestens 6 be¬ trägt und nicht größer als etwa das Doppelte der Gesamtzahl der Nukleotide aller eingesetzten Shortmers ist, und
(b) danach den gebildeten Primer von Template und von unumge- setzten Shortmers abtrennt und gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Nucleotide des Templates bis um etwa die Anzahl der Nucleotide eines der eingesetzten Shortmers kleiner oder bis um etwa die Anzahl der Nucleotide eines der eingesetzten Shortmers größer ist als die Gesamtzahl der Nucleotide aller eingesetzten Shortmers.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Nucleotide des Templates etwa der Gesamtzahl der Nucleotide aller eingesetzten Shortmers entspricht.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Shortmers 6-mere, 7-mere, 8-mere und/oder 9-mere verwendet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man zwei Shortmers einsetzt, wobei die An¬ zahl der Nucleotide des Templates 8 bis 18 betragen kann.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zwei Shortmers (a) aus einer Bank von 6-meren und/oder 7-meren und/oder
(b) aus einer Bank von 8-meren und/oder 9-meren verwendet und bei (a) bzw. (b) ein 8-meres oder 9-meres aus einer Bank gemäß
(b) als Template einsetzt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn¬ zeichnet , daß man ein 5-meres mit mindestens einem Shortmer aus der Gruppe der 7-mere, 8-mere oder 9-mere verwendet.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Template oder Shortmers verwendet,
(a) die Inosin als Nucleotid-Baustein aufweisen oder
(b) bei denen an einundderselben Position A, C, G und/oder T als Nucleotid-Baustein stehen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Template verwendet, bei dem einer der Nucleotid-Bausteine markiert ist, beispielsweise radioaktiv oder fluoreszierend, insbesondere für das 3 ' -Ende oder das 5'- Ende.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Template verwendet, bei dem einer der Nucleotid-Bausteine einen Rest zur erleichterten Template- Abtrennung trägt, beispielsweise einen Biotinrest.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Template verwendet, bei dem an min¬ destens einer Stelle ein modifizierter Nucleotid-Baustein mit ausschließlicher Komplementarität vorgesehen ist, der die Ab- schmelztemperatur eines Primers erhöht .
12. Bank (Bibliothek) von Templates, die für die Herstellung von Primern für eine konsekutive DNA-Sequenzierung geeignet sind,
- wobei man zur Primer-Herstellung zwei, drei, vier oder mehr Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template der Bank hybridisiert, - danach die hybridisierten Shortmers zum Primer ligiert und
- danach den gebildeten Primer von Template und von unumgesetz- ten Shortmers abtrennt und gewinnt, wobei bei mindestens einem Template bis allen Templates der Bank mindestens ein bis maximal alle Nucleotide eine ähnliche Komple¬ mentarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid- Basen besitzen, und zwar mit der Maßgabe, daß die Gesamtzahl aller denkbar möglichen Templates der Bank die Gesamtzahl aller für die Primer-Herstellung denkbar möglichen Shortmers praktisch nicht übersteigt.
13. Bank nach Anspruch 12, bei der bei einem, mehreren oder allen Templates an jeweils einer Position oder an einzelnen ihrer Positionen Nucleotide eingebaut sind, die eine ähnliche Komplementarität zu mindestens zwei der vier natürlichen Basen besitzen.
14. Bank nach Anspruch 13, bei der Inosin als Nucleotid mit einer ähnlichen Komplementarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid-Basen vorgesehen ist.
15. Bank nach einem der Ansprüche 12 bis 14 mit bis zu 49 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-meren.
16. Bank (Bibliothek) von Templates, die für die Herstellung von Primern für eine konsekutive DNA-Sequenzierung geeignet sind,
- wobei man zur Primer-Herstellung zwei, drei, vier oder mehr Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template der Bank hybridisiert,
- danach die hybridisierten Shortmers zum Primer ligiert und
- danach den gebildeten Primer von Template und von unumgesetz- ten Shortmers abtrennt und gewinnt, wobei die Bank ein Gemisch bis mehrere Gemische von Templates umfaßt, wobei an einer oder an mehreren Positionen der Templates eines Gemischs jeweils zwei bis vier verschiedene, zu den vier natürlichen Basen komplementäre Basen vorgesehen sind, und zwar mit der Maßgabe, daß die Gesamtzahl aller denkbar möglichen Tem- plate-Gemische einschließlich nicht im Gemisch vorliegender Tem¬ plates der Bank die Gesamtzahl aller für die Primer-Herstellung denkbar möglichen Shortmers praktisch nicht übersteigt.
17. Bank nach Anspruch 16, bei der bei einem, mehreren oder allen Templates an jeweils einer Position oder an einzelnen ihrer Positionen Nucleotide eingebaut sind, die eine ähnliche Komplementarität zu mindestens zwei der vier natürlichen Basen besitzen.
18. Bank nach Anspruch 17, bei der Inosin als Nucleotid mit einer ähnlichen Komplementarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid-Basen vorgesehen ist.
19. Bank nach einem der Ansprüche 16 bis 18 mit bis zu 49 Gemi¬ schen von 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-meren einschließlich nicht im Gemisch vorliegender 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- bzw. 18-meren.
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