JPH09504172A - プライマーの製造方法及びそれらの鋳型バンク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、鋳型を使用して少なくとも２つのショートマーを互いに隣接してハイブリッド化させそしてその後互いに連結してプライマーを形成させる連続ＤＮＡ配列決定用プライマーの製造方法に関するものであって、この方法は（ａ）ヌクレオチド数が少なくとも６個であり且つ使用される全てのショートマーのヌクレオチド総数の約２倍より多くないヌクレオチドの１本鎖形態の鋳型を使用し、そして（ｂ）次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーから分離しそして回収する、ことを特徴とする連続ＤＮＡ配列決定用プライマーの製造方法。本発明はまた、上記方法用の鋳型のバンク（ライブラリー）にも関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 プライマーの製造方法及びそれらの鋳型バンク 技術分野及び背景技術 今日、ＤＮＡの配列決定に使用される方法は主としてマクサム−ギルバート技 術とサンガー法である。サンガー法では、配列を決定すべきＤＮＡ−１本鎖ＤＮ Ａ又は１本鎖に製造されたＤＮＡ−を酵素的に重合化して２本鎖を形成させる。 その目的のためには、ＤＮＡの短い領域を先ず２本鎖にしなければならない。な ぜなら、ＤＮＡポリメラーゼにはヌクレオチド導入用の遊離３'−ヒドロキシル 末端を有する短い２本鎖領域が必要（酵素で触媒されるヌクレオチド導入の鋳型 ／プライマー依存性）であるからである。ショートマー（shortmer）コンセプト （ＥＰ−Ｂ−89 906 358.0）によれば、短い２本鎖領域は、配列を決定すべき鋳 型としての１本鎖ＤＮＡ上に２つ又はそれより多いショートマーを互いに隣接し てハイブリッド化させ、そしてその後これらショートマーを一緒に結合又は連結 させてプライマーを形成させることによって合成される。短い２本鎖領域から開 始し、次いで配列を決定すべきＤＮＡストランドをＤＮＡポリメラーゼで連続的 に酵素的に相補化する。配列全体を読み取って分析を評価するとすぐ、読み取ら れたＤＮＡ配列の３'末端のプライマー結合部位が、次の配列決定操作のために 再び選択される。ショートマーはそのプライマー結合部位で再びハイブリッド化 されそして結合される。この新しいプライマーがその後の配列決定に使用される 。 一方では、プライマーを使用して配列を決定すべきＤＮＡストランドに個々に 取りかかるためにはできるだけ長いプライマーが重要である。他方では、プライ マーを製造するために使用されるショートマーバンクのサイズは、プライマーの 長さが増すにつれて劇的に大きくなる。しかし乍ら、配列を決定すべきＤＮＡス トランドに対して12個から18個のヌクレオチド長のプライマーで十分正確に取り かかることが可能であることが分かった。 加えて、古典的なショートマーコンセプトは次の点に関しては改善できな いことが分かった：高価値配列決定プロトコールは配列を決定すべきＤＮＡスト ランドに対して過剰のプライマーで開始する。プライマーが配列を決定すべきＤ ＮＡに対して１：１又はそれより少ない比率で存在する場合には、実験では、観 察される読み取り幅（reading distance）は過剰のプライマーで予想されるもの より一般的に小さい。従って、ショートマーコンセプトの場合には、ハイブリッ ド化及び連結が１度だけ行われそしてそのプライマー連結生成物を使い果たさず 、そしてその後再びハイブリッド化及び連結を行う場合、使用されるショートマ ーが過剰に存在するにも拘わらず、プライマー対配列を決定すべきＤＮＡストラ ンドがせいぜい約１：１の化学量論しか達成されない。 発明の開示 上記の先行技術は今や、鋳型を使用して少なくとも２つのショートマーを互い に隣接してハイブリッド化させそしてその後互いに連結させてプライマーを形成 させる連続ＤＮＡ配列決定用プライマーの製造方法による本発明の実施態様に従 って改善することができ、この方法は （ａ）ヌクレオチド数が少なくとも６個であり且つ使用される全てのショートマ ーのヌクレオチド総数の約２倍より多くないヌクレオチドの１本鎖形態の鋳型を 使用し、そして （ｂ）次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーから分離しそ して回収する、 ことを特徴としている。 プライマー：「プライマー」は、ここではＤＮＡの短いストランドと理解すべ きであり、このストランドの助けを借りて、配列を決定すべきＤＮＡストランド は対応する短い領域から２本鎖に形成される。 鋳型：配列を決定すべきＤＮＡストランドとは対照的に、ここでの「鋳型」は 、プライマーを製造できるヌクレオチドの１本鎖ストランドと理解すべきであり 、その際プライマーは鋳型から分離された後でしかＤＮＡストランドの配列決定 に使用されない。 ショートマー：「ショートマー」は、プライマーを形成するために連結可能な オリゴヌクレオチドと理解すべきである；ＥＰ−Ｂ−89 906 358.0参照。 それ故本発明に従って、ショートマーの結合又は連結はショートマーコンセプ トに従って鋳型上で実施され、この鋳型は使用されるショートマーと少なくとも 一部相補的である。鋳型は、ヌクレオチドから合成的に製造される短いストラン ドであることができる。これらの合成には天然ＤＮＡを構成するＡ、Ｃ、Ｇ及び Ｔ用の４種のヌクレオチド塩基だけでなく、ショートマーと少なくとも部分的に 相補的である限り誘導体も使用できることは言うまでもない。先行技術に関して は、ＤＥ−Ａ−3 501 306、ＦＲ−Ａ−2 190 505、ＵＳ−Ａ−4 988 617、ＷＯ −Ａ−86/06 413、ＷＯ−Ａ−91/09 623及びＷＯ−Ａ−91/17 239を参照する。 誘導化されるか又は縮重した鋳型を製造するためには、例えば、同じ鋳型位置に 導入するためにイノシン又は４種のヌクレオチド塩基Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴの混合物 を使用することが可能である。 同じように、ショートマーはヌクレオチドから合成して製造される短いストラ ンドであることができる。再度、天然ＤＮＡを構成するＡ、Ｃ、Ｇ及びＴ用の４ 種のヌクレオチド塩基だけでなく、鋳型と少なくとも部分的に相補的である限り 誘導体も上記ショートマーの合成に使用できることは言うまでもない。鋳型に関 して上記した説明が対応して当てはまる。 本発明と先行技術に従って、ヌクレオチド塩基の１つは特に３'末端又は５'末 端に関して、例えば放射線又は蛍光標識することもできる。 本発明によれば、ヌクレオチド塩基の１つは鋳型の分離を促進するラジカル、 例えばビオチンラジカルを有することもできる。 本発明によれば、例えば、形成されたプライマーの融解温度を高めるために、 排他的相補性（exclusive complementarity）を有する修飾ヌクレオチド塩基が 鋳型の少なくとも１つの部位に提供されていることも可能である。 本発明によれば、最初のショートマーを固体相で提供することもできる。次い で、上記した段階（ｂ）で、固体相で提供されなかった鋳型と次のショ ートマー（単数又は複数）は分離される。 本発明によれば、鋳型のヌクレオチド数は、使用される全ショートマーのヌク レオチド総数より、使用されるショートマーの１つのヌクレオチド数まで少ない か又は使用されるショートマーの１つのヌクレオチド数まで多いことができる。 本発明によれば、鋳型のヌクレオチド数は使用される全ショートマーのヌクレ オチド総数にほぼ相当することができる。 本発明によれば、好ましくは６量体、７量体、８量体及び／又は９量体をショ ートマーとして使用することができる。 本発明によれば、２つのショートマーを使用することが好ましく、鋳型のヌク レオチド数は８個から18個までであることが可能である。 本発明によれば、 （ａ）６量体及び／又は７量体のバンクから及び／又は （ｂ）８量体及び／又は９量体のバンクから 得られる２つのショートマーを使用することができ、（ａ）及び／又は（ｂ）の 場合には、（ｂ）のバンクから得られる８量体又は９量体を鋳型として使用する ことができる。 ５量体をプライマー形成用のショートマーとして使用する場合、５量体は７量 体、８量体又は９量体の群から得られる少なくとも１つのショートマーと共に使 用することが好都合である。 それ故、本発明による方法は、配列決定操作で、好都合なプライマーが過剰、 即ち、≧１：１のプライマー対配列を決定すべきＤＮＡの比率を生じさせるのに 十分な連結生成物を使用できるという利点を提供する。 本発明の更なる実施態様に従って、連続ＤＮＡ配列決定用のプライマーの製造 、即ち、 −プライマーを製造するために、上記バンクから得られる鋳型を使用して２、３ 、４個又はそれより多いショートマーを互いに隣接してハイブリッド化させ、 −次に、これらのハイブリッド化されたショートマーを連結して プライマーを形成させ、そして −次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーから分離させそし て回収する。 に適する鋳型のバンク（ライブラリー）が提供され、その際４種の天然ヌクレオ チド塩基のうち少なくとも２つに類似する相補性を有し、該バンク中の少なくと も１個の鋳型から全鋳型において少なくとも１個から最大全ヌクレオチドまでを 有する。但し、上記バンク中の考え得るか又は理論的に可能な全鋳型の総数は上 記プライマーを製造するために考え得る全ショートマーの総数を実際上超えない 。 ショートマーコンセプトの不合理な点までの実行を避けるために、全ショート マー対又は全ショートマー組合せ物用の短い鋳型を提供することは本発明の目的 ではない。むしろ、短い鋳型製造の複雑性は、本発明によるバンク中の１個、数 個又は全ての鋳型の１つの位置又は個々の位置に４種の天然ヌクレオチド塩基の うち少なくとも２つに類似し相補性を有するヌクレオチドを導入することによっ て減少する。本発明の特別の実施態様に従って、４種の天然ヌクレオチド塩基の うち少なくとも２つに類似し相補性を有するヌクレオチドとしてイノシンを上記 目的に提供することができる。 本発明によるバンクは４⁹個までの10−、11−、12−、13−、14−、15−、16 −、17−又は18−量体を含むことができる。本発明によれば、ショートマーとワ トソン−クリック塩基対を形成できる18個までのヌクレオチドを有するオリゴマ ーも含まれる。 更に、本発明の基礎になっている課題は連続ＤＮＡ配列決定用のプライマーの 製造、即ち、 −上記プライマーを製造するために、上記バンクから得られる鋳型を使用して２ 、３、４個又はそれより多いショートマーを互いに隣接してハイブリッド化させ 、 −次に、これらのハイブリッド化されたショートマーを連結してプライマーを形 成させ、そして −次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーか ら分離させそして回収し、 に適する鋳型のバンク（ライブラリー）による更なる実施態様に従って解決され 、その際上記バンクは、４種の天然ヌクレオチド塩基に相補的な２から４種の異 なる塩基が各混合物鋳型の１つ又は幾つかの位置に提供されている１個の鋳型混 合物から数個の鋳型混合物までを含んでいる。但し、混合物で存在していない上 記バンクから得られる鋳型を含めて、考え得る全鋳型混合物の総数は上記プライ マーを製造するために考え得る全ショートマーの総数を実際上超えない。 再度、ショートマーコンセプトの不合理な点までの取り入れを避けるために、 短い鋳型は全ショートマー対又は全ショートマー組合せ物用には提供されていな い。むしろ、短い鋳型製造の複雑性は、この実施態様では一定の長さ又は一定の ヌクレオチド塩基数の鋳型の個々の鋳型位置に１つ以上のヌクレオチドを導入す ることによって減少する。 かくして、本発明によるバンク（ライブラリー）は、混合物では存在していな い10−、11−、12−、13−、14−、15−、16−、17−又は18−量体を含めて、10 −、11−、12−、13−、14−、15−、16−、17−又は18−量体の４⁹個までの混 合物を含むことができる。本発明によれば、ショートマーとワトソン−クリック 塩基対を形成できる18個までのヌクレオチドを有するオリゴマーも含まれる。 誘導化されるか若しくは標識されている塩基又はラジカルを有し且つ分離を促 進する塩基を有する鋳型に関する方法に関して上記した説明が対応して適用され る。最初のショートマーが固体相で提供される場合、次いでプライマー、鋳型及 び未反応ショートマーが再度分離されるときには固体相で提供されていない以後 のショートマー（単数又は複数）は分離される。 発明を実施するための最良の形態 本発明は実験、３つの添付物及び８つの図面によって以下で更に詳細に説明す る。 ショートマー実験 本実験で使用したオリゴヌクレオチド（Ｉ＝イノシン）： Ｆ−オリゴ：５'Ｆ−ＡＡＡＡＣＧＡＣ３' Ｐ−オリゴ：５'Ｐ−ＧＧＣＣＡＧＴＧ３' Ｂ−オリゴ：５'Ｂ−IIIIＧＧＣＣＧＴＣＧIIII３' Ｋ−オリゴ：５'Ｆ−ＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３' 典型的な実験では、５'−フルオレセイン標識オクタヌクレオチド（Ｆ−オリ ゴ）溶液2.2μl(220pmol)を0.5mlの反応容器中で５'−リン酸化オリゴヌクレオ チド（Ｐ−オリゴ）溶液4.1μl（220pmol）及び５'−ビオチン標識オリゴヌクレ オチド（Ｂ−オリゴ）1.5μl（150pmol）並びにＴ4−ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Gi bco）4.2μl及びＡＴＰ溶液（10mM）４μlと組み合わせた。プログラム可能な加 熱ユニット中で、混合成分を含有する容器を２分以内に80℃に加熱し、その温度 で２分間維持し、そして次に20分間以内に10℃に冷却した。連結反応開始時に、 ４μlのＴ4−ＤＮＡリガーゼ（４単位、Gibco）を溶液に加え、そして反応混合 物を10℃で更に２時間維持した。次に、ストップ−ミックス（Stopp−Mix）（Ph armacia）20μlを上記溶液に加えた。 分析的監視のために、ストップ−ミックス３μlを上記最終溶液の水希釈物（ １→1000）３μlに加え、次にこれを市販のＤＮＡシークエンサー（Pharmacia） （1500Ｖ、50℃、34Ｗ、38mＡ、180分）中で18％の変性ポリアクリルアミドゲル でゲル電気泳動に付した。自動的に集めた生データを、フラグメントマネージャ ープログラム（Fragment Manager programme）（Pharmacia）を使用して連結産 生物に関して評価した（添付物１）。 水５μl及び新たに混合したダイナビーズ（Dynabeads）Ｍ−280ストレプトア ビジン懸濁物(Dynal)100μlを上記の最終連結溶液20μlに加え、そして次にこれ を室温で15分間振とうした。磁石を使用して相を分離した。液体相を別の反応溶 液に移し、そして次に上記したようにして分析的監視に付した（添付物２）。固 体相を0.1ＮＮaＯＨ 10μl中に懸濁し、そして室温で15分間振とうした。磁石を 使用して相を再度分離した。液体相は、0.1ＮＨＣｌ を最大10μl添加して中和した。数回の試験で、かろうじて20μlしかない溶液は 、連結され且つ５'−フルオレセイン標識されたプライマーの理論的に達成可能 な75pmolの概ね60から90％までを含有していた。この溶液を上記したようにして 分析的監視に付した（添付物３）。 この連結されたプライマーを、市販で利用可能なプロトコールに従ってＤＮＡ 配列分析に使用した。 平行実験では、市販で入手可能な８塩基長いプライマー（Ｋ−オリゴ）を使用 した。数回の実験で、使用したショートマーの純度に依存して、連結プライマー による読み取り幅は市販のプライマーで得られる読み取り幅の80から100％まで に達した（図１〜８）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９６年２月６日 【補正内容】 請求の範囲 １．鋳型を使用して少なくとも２つのショートマーを互いに隣接してハイブリ ッド化させ、そして次に互いに連結させてプライマーを形成させる連続ＤＮＡ配 列決定用のプライマーの製造方法であって、該方法は （ａ）ヌクレオチド数が少なくとも６個であり且つ１鋳型当たりのハイブリッド 化するショートマーのヌクレオチド総数の約２倍より多くないヌクレオチドの１ 本鎖形態の鋳型を使用し、そして （ｂ）次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーから分離しそ して回収する、 ことを特徴とするプライマーの製造方法。 ２．鋳型のヌクレオチド数が、１鋳型当たりのハイブリッド化するショートマ ーのヌクレオチド総数より、使用されるショートマー１つのヌクレオチドの凡そ の数までだけ少ないか又は使用されるショートマー１つのヌクレオチドの凡その 数までだけ多いことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．鋳型のヌクレオチド数が、１鋳型当たりのハイブリッド化するショートマ ーのヌクレオチド総数にほぼ相当することを特徴とする請求の範囲第１項又は第 ２項に記載の方法。 ４．６量体、７量体、８量体及び／又は９量体をショートマーとして使用する ことを特徴とする上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 ５．２つのショートマーを使用し、鋳型のヌクレオチド数が８個から18個まで であることができることを特徴とする上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方 法。 ６．（ａ）６量体及び／又は７量体のバンクから及び／又は （ｂ）８量体及び／又は９量体のバンクから 得られる２つのショートマーを使用し、そして（ａ）及び／又は（ｂ）の場合に は、（ｂ）のバンクから得られる８量体又は９量体を鋳型として使用することを 特徴とする上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 ７．５量体を、７量体、８量体又は９量体の群から得られる少なくとも１つの ショートマーと共に使用することを特徴とする請求の範囲第１項から第３項のい ずれか１項に記載の方法。 ８．（ａ）ヌクレオチド塩基としてイノシンを有するか又は （ｂ）Ａ、Ｃ、Ｇ及び／又はＴが同じ位置にヌクレオチド塩基（単数又は複数） として存在する 鋳型又はショートマーを使用することを特徴とする上記請求の範囲のいずれか１ 項に記載の方法。 ９．ヌクレオチド塩基の１つが、特に３'末端又は５'末端に関して例えば放射 線又は蛍光標識されている鋳型を使用することを特徴とする上記請求の範囲のい ずれか１項に記載の方法。 １０．ヌクレオチド塩基の１つが鋳型の分離を促進するためにラジカル、例え ばビオチンラジカルを有している鋳型を使用することを特徴とする上記請求の範 囲のいずれか１項に記載の方法。 １１．プライマーの融解温度を高める排他的相補性を有する修飾ヌクレオチド 塩基が少なくとも１つの部位に提供されている鋳型を使用することを特徴とする 上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 １２．４⁹個までの10−、11−、12−、13−、14−、15−、16−、17−又は18 −量体を有し、連続ＤＮＡ配列決定用のプライマーの製造、 −プライマーを製造するために、バンクから得られる鋳型を使用して２、３、４ 個又はそれより多いショートマーを互いに隣接してハイブリッド化させ、 −次に、これらのハイブリッド化されたショートマーを連結してプライマーを形 成させ、そして −次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーから分離させそし て回収する、 に適する鋳型のバンク（ライブラリー）であって、該バンク中の少なくとも１個 の鋳型から全鋳型においての少なくとも１個から最大全ヌクレオチドが４種の天 然ヌクレオチド塩基のうち少なくとも２つに類似する相補性を有し 、但し、上記バンク中の考え得る全鋳型の総数は上記プライマーを製造するため に考え得る全ショートマーの総数を超えないバンク。 １３．４種の天然塩基のうち少なくとも２つに類似する相補性を有するヌクレ オチドが１個、数個又は全部の鋳型の１つの位置又は個々の位置に導入されてい る請求の範囲第１２項に記載のバンク。 １４．イノシンが、４種の天然ヌクレオチド塩基のうち少なくとも２つに類似 する相補性を有するヌクレオチドとして提供される請求の範囲第１３項に記載の バンク。 １５．連続ＤＮＡ配列決定用のプライマーの製造、 −上記プライマーを製造するために、バンクから得られる鋳型を使用して２、３ 、４個又はそれより多いショートマーを互いに隣接してハイブリッド化させ、 −次に、これらのハイブリッド化されたショートマーを連結してプライマーを形 成させ、そして −次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーから分離させそし て回収する、 に適する鋳型のバンク（ライブラリー）であって、 混合物で存在していない10−、11−、12−、13−、14−、15−、16−、17−又は 18−量体を含めて、10−、11−、12−、13−、14−、15−、16−、17−又は18− 量体の４⁹個までの混合物を含んでおり、４種の天然ヌクレオチド塩基に相補的 な２から４種の異なる塩基が混合物の各鋳型の１つ又は幾つかの位置に提供され 、但し、混合物で存在していない上記バンクから得られる鋳型を含めて、考え得 る全鋳型混合物の総数は上記プライマーを製造するために考え得る全ショートマ ーの総数を実際上超えないバンク。 １６．４種の天然塩基のうち少なくとも２つに類似する相補性を有するヌクレ オチドが１個、数個又は全部の鋳型の１つの位置又は個々の位置に導入されてい る請求の範囲第１５項に記載のバンク。 １７．イノシンが、４種の天然ヌクレオチド塩基のうち少なくとも２つに類似 する相補性を有するヌクレオチドとして提供される請求の範囲第１６項 に記載のバンク。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．鋳型を使用して少なくとも２つのショートマーを互いに隣接してハイブリ ッド化させ、そして次に互いに連結させてプライマーを形成させる連続ＤＮＡ配 列決定用のプライマーの製造方法であって、該方法は （ａ）ヌクレオチド数が少なくとも６個であり且つ使用される全てのショートマ ーのヌクレオチド総数の約２倍より多くないヌクレオチドの１本鎖形態の鋳型を 使用し、そして （ｂ）次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーから分離しそ して回収する、 ことを特徴とするプライマーの製造方法。 ２．鋳型のヌクレオチド数が、使用される全ショートマーのヌクレオチド総数 より、使用されるショートマー１つのヌクレオチドの凡その数までだけ少ないか 又は使用されるショートマー１つのヌクレオチドの凡その数までだけ多いことを 特徴とする請求の範囲第１項に記載の方法。 ３．鋳型のヌクレオチド数が、使用される全ショートマーのヌクレオチド総数 にほぼ相当することを特徴とする請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４．６量体、７量体、８量体及び／又は９量体をショートマーとして使用する ことを特徴とする上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 ５．２つのショートマーを使用し、鋳型のヌクレオチド数が８個から18個まで であることができることを特徴とする上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方 法。 ６．（ａ）６量体及び／又は７量体のバンクから及び／又は （ｂ）８量体及び／又は９量体のバンクから 得られる２つのショートマーを使用し、そして（ａ）及び／又は（ｂ）の場合に は、（ｂ）のバンクから得られる８量体又は９量体を鋳型として使用することを 特徴とする上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 ７．５量体を、７量体、８量体又は９量体の群から得られる少なくとも１ つのショートマーと共に使用することを特徴とする請求の範囲第１項から第３項 のいずれか１項に記載の方法。 ８．（ａ）ヌクレオチド塩基としてイノシンを有するか又は （ｂ）Ａ、Ｃ、Ｇ及び／又はＴが同じ位置にヌクレオチド塩基（単数又は複数） として存在する 鋳型又はショートマーを使用することを特徴とする上記請求の範囲のいずれか１ 項に記載の方法。 ９．ヌクレオチド塩基の１つが、特に３'末端又は５'末端に関して例えば放射 線又は蛍光標識されている鋳型を使用することを特徴とする上記請求の範囲のい ずれか１項に記載の方法。 １０．ヌクレオチド塩基の１つが鋳型の分離を促進するためにラジカル、例え ばビオチンラジカルを有している鋳型を使用することを特徴とする上記請求の範 囲のいずれか１項に記載の方法。 １１．プライマーの融解温度を高める排他的相補性を有する修飾ヌクレオチド 塩基が少なくとも１つの部位に提供されている鋳型を使用することを特徴とする 上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。 １２．連続ＤＮＡ配列決定用のプライマーの製造、即ち −プライマーを製造するために、上記バンクから得られる鋳型を使用して２、３ 、４個又はそれより多いショートマーを互いに隣接してハイブリッド化させ、 −次に、これらのハイブリッド化されたショートマーを連結してプライマーを形 成させ、そして −次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーから分離させそし て回収する、 に適する鋳型のバンク（ライブラリー）であって、該バンク中の少なくとも１個 の鋳型から全鋳型においての少なくとも１個から最大全ヌクレオチドが、４種の 天然ヌクレオチド塩基のうち少なくとも２つに類似する相補性を有し、但し、上 記バンク中の考え得る全鋳型の総数は上記プライマーを製造するために考え得る 全ショートマーの総数を実際上超えないバンク。 １３．４種の天然塩基のうち少なくとも２つに類似する相補性を有するヌクレ オチドが１個、数個又は全部の鋳型の１つの位置又は個々の位置に導入されてい る請求の範囲第１２項に記載のバンク。 １４．イノシンが、４種の天然ヌクレオチド塩基のうち少なくとも２つに類似 し相補性を有するヌクレオチドとして提供される請求の範囲第１３項に記載のバ ンク。 １５．４⁹個までの10−、11−、12−、13−、14−、15−、16−、17−又は18 −量体を有する請求の範囲第１２項から第１４項のいずれか１項に記載のバンク 。 １６．連続ＤＮＡ配列決定用のプライマーの製造、即ち −上記プライマーを製造するために、バンクから得られる鋳型を使用して２、３ 、４個又はそれより多いショートマーを互いに隣接してハイブリッド化させ、 −次に、これらのハイブリッド化されたショートマーを連結してプライマーを形 成させ、そして −次に、形成されたプライマーを鋳型及び未反応ショートマーから分離させそし て回収する、 に適する鋳型のバンク（ライブラリー）であって、 ４種の天然ヌクレオチド塩基に相補的な２から４種の異なる塩基が混合物の各鋳 型の１つ又は幾つかの位置に提供されている１個の鋳型混合物から数個の鋳型混 合物までを含んでおり、但し、混合物で存在していない上記バンクから得られる 鋳型を含めて、考え得る全鋳型混合物の総数は上記プライマーを製造するために 考え得る全ショートマーの総数を実際上超えないバンク。 １７．４種の天然塩基のうち少なくとも２つに類似する相補性を有するヌクレ オチドが１個、数個又は全部の鋳型の１つの位置又は個々の位置に導入されてい る請求の範囲第１６項に記載のバンク。 １８．イノシンが、４種の天然ヌクレオチド塩基のうち少なくとも２つに類似 する相補性を有するヌクレオチドとして提供される請求の範囲第１７項 に記載のバンク。 １９．混合物では存在していない10−、11−、12−、13−、14−、15−、16− 、17−又は18−量体を含めて、10−、11−、12−、13−、14−、15−、16−、17 −又は18−量体の４⁹個までの混合物を有する請求の範囲第１６項から第１８項 のいずれか１項に記載のバンク。