DE4336911A1 - Verfahren zur Primer-Herstellung und Template-Bank dafür - Google Patents

Verfahren zur Primer-Herstellung und Template-Bank dafür

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Description

Zur DNA-Sequenzierung werden heute überwiegend die Maxam-Gilbert- Technik und das Sanger-Verfahren angewendet. Bei diesem Sanger- Verfahren wird die zu sequenzierende einzelsträngige oder einzel­ strängig gemachte DNA zum Doppelstrang aufpolymerisiert. Dazu muß die DNA zunächst in einem kurzen Bereich doppelsträngig gemacht werden, da DNA-Polymerasen einen kurzen Doppelstrangbereich mit einem freien 3′-Hydroxylende für den Einbau von Nukleotiden benötigen (Template/Primer-Abhängigkeit des enzymatisch katalysierten Einbaus von Nukleotiden). Nach dem Shortmer-Konzept (EP 89.906 358.0) geht man zur Synthese des kurzen Doppelstrang­ bereichs so vor, daß man zwei oder mehr Shortmers in Nachbarschaft zueinander auf der zu sequenzierenden einzelsträngigen DNA als Template hybridisiert und die Shortmers danach miteinander zu einem Primer verbindet oder ligiert. Ausgehend von dem kurzen Doppelstrangbereich wird der zu sequenzierende DNA-Strang dann mit DNA-Polymerase enzymatisch sukzessiv komplementiert. Sobald zur Auswertung der Analyse die Sequenz vollständig gelesen worden ist, wird für die nächste Sequenzierung auf dem 3′-Ende der soeben gelesenen DNA-Sequenz erneut eine Primer-Anheftungsstelle ausgewählt. Auf dieser Primer-Anheftungsstelle werden erneut Shortmers hybridisiert und ligiert. Dieser neue Primer dient der folgenden Sequenzierung.
Einerseits ist man an möglichst langen Primern interessiert, um mit einem derartigen Primer einen zu sequenzierenden DNA-Strang individuell ansprechen zu können. Andererseits wächst der Umfang der für die Primerherstellung heranzuziehenden Shortmer-Banken mit größerer Primerlänge drastisch an. Es hat sich jedoch gezeigt, daß man mit Primern einer Länge- von 12 bis 18 Nucleotiden befriedigend genau zu sequenzierende DNA-Stränge ansprechen kann.
Es hat sich nun gezeigt, daß das klassische Shortmer-Konzept in folgender Hinsicht verbesserungsfähig ist. Hochwertige Sequen­ zierungsprotokolle gehen von einem Überschuß des Primers über den zu sequenzierenden DNA-Strang aus. Liegt der Primer in einem Verhältnis von 1 : 1 oder im Unterschuß zum sequenzierenden DNA- Strang vor, so beobachtet man generell im Experiment kürzere Leseweiten, als man bei einem Primer-Überschuß erwarten könnte. Sofern man beim Shortmer-Konzept nur einmal hybridisiert und ligiert und nicht das Primer Ligationsprodukt abschmilzt, erneut hybridisiert und ligiert, läßt sich trotz einem Überschuß des eingesetzten Shortmer äußerstenfalls eine 1 : 1-Stöchiometrie von Primer zu dem zu sequenzierenden DNA-Strang erreichen.
Dieser Stand der Technik läßt sich nun gemäß einer Ausführungsform der Erfindung durch ein Verfahren zur Herstellung eines Primers für eine konsekutive DNA-Sequenzierung verbessern, bei dem man mindestens zwei Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template hybridisiert und danach miteinander zum Primer ligiert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man
  • (a) ein Template in Form eines Einzelstranges aus Nukleotiden verwendet, bei dem die Anzahl der Nukleotide mindestens 6 beträgt und nicht größer als das Doppelte der Gesamtzahl der Nukleotide aller eingesetzten Shortmers ist, und
  • (b) danach den gebildeten Primer von Template und von unumge­ setzten Shortmers abtrennt und gewinnt.
Unter Primer wird im vorliegenden Zusammenhang ein kurzer DNA- Strang verstanden, mit dessen Hilfe der zu sequenzierende DNA- Strang über einen entsprechend kurzen Bereich doppelsträngig gemacht wird. Im Unterschied zum zu sequenzierenden DNA-Strang wird unter Template im vorliegenden Zusammenhang ein Einzelstrang aus Nucleotiden verstanden, auf dem ein Primer hergestellt werden kann, der erst nach Abtrennung vom Template zur Sequenzierung eines DNA-Stranges eingesetzt wird.
Erfindungsgemäß wird also das Verbinden bzw. die Ligation der Shortmers nach dem Shortmer-Konzept auf Templaten durchgeführt, die zu den eingesetzten Shortmers zumindest teilweise komplementär sind. Bei den Templaten kann es sich um kurze Stränge handeln, die synthetisch aus Nucleotiden hergestellt worden sind. Es ist selbstverständlich, daß für diese Synthesen nicht nur die vier Nucleotid-Bausteine für A, C, G und T herangezogen werden können, aus denen sich natürliche DNA aufbaut, sondern auch Derivate, sofern eine zumindest teilweise Komplementarität zu den Shortmers gegeben ist. Zum Stand der Technik sei verwiesen auf DE-A-35 01 306, FR-A-2 490 505, US-A-4 988 617, WO 86/06 413, WO 91/09 623 und WO 91/17 239. Erfindungsgemäß und entsprechend dem Stand der Technik kann einer der Nukleotid-Bausteine auch maskiert sein, beispielsweise radioaktiv oder fluoreszierend, insbesondere für das 3′-Ende oder das 5′-Ende. Er kann auch einen Rest zur erleich­ terten Template-Abtrennung tragen, z. B. einen Biotinrest.
Erfindungsgemäß kann das erste Shortmer auch an fester Phase vorgegeben werden.
Erfindungsgemäß kann die Anzahl der Nucleotide des Templates bis um etwa die Anzahl der Nucleotide eines der eingesetzten Shortmers kleiner oder bis um etwa die Anzahl der Nucleotide eines der ein­ gesetzten Shortmers größer sein als die Gesamtzahl der Nucleotide aller eingesetzten Shortmers.
Erfindungsgemäß kann die Anzahl der Nucleotide des Templates etwa der Gesamtzahl der Nucleotide aller eingesetzten Shortmers entsprechen.
Erfindungsgemäß wird man vorzugsweise als Shortmers 6-mere, 7- mere, 8-mere und/oder 9-mere verwenden.
Vorzugsweise setzt man erfindungsgemäß zwei Shortmers ein, wobei die Anzahl der Nucleotide des Templates 8 bis 18 betragen kann.
Erfindungsgemäß kann man zwei Shortmers
  • (a) aus einer Bank von 6-meren und/oder 7-meren und/oder
  • (b) aus einer Bank von 8-meren und/oder 9-meren verwenden und bei (a) bzw. (b) ein 8-meres oder 9-meres aus einer Bank gemäß (b) als Template einsetzen.
So bietet das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß man in eine Sequenzierung so viel vom Ligationsprodukt einsetzen kann, daß sich ein günstiger Primerüberschuß ergibt, also ein Verhältnis Primer zu sequenzierender DNA-Strang 1 : 1.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Bank (Bibliothek) von Templates vorgesehen, die für die Herstellung von Primern für eine konsekutive DNA-Sequenzierung geeignet sind,
  • - wobei man zur Primer-Herstellung zwei, drei oder vier Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template der Bank hybridisiert,
  • - danach die hybridisierten Shortmers zum Primer ligiert und
  • - danach den gebildeten Primer von Template und von unumgesetzten Shortmers abtrennt und gewinnt,
wobei bei mindestens einem Template bis allen Templates der Bank mindestens ein bis maximal alle Nucleotide eine ähnliche Komple­ mentarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid- Basen besitzen, und zwar mit der Maßgabe, daß die Gesamtzahl aller denkbar bzw. theoretisch möglichen Templates der Bank die Gesamt­ zahl aller für die Primer-Herstellung denkbar möglichen Shortmers praktisch nicht übersteigt.
Um das Shortmer-Konzept nicht ad absurdum zu führen, soll erfin­ dungsgemäß nicht für jedes Shortmer-Paar ein kurzes Template vor­ gesehen werden. Vielmehr wird die Komplexität der Herstellung kurzer Templates dadurch gemindert, daß bei einer erfindungs­ gemäßen Bank bei einem, mehreren oder allen Templates an jeweils einer Position oder an einzelnen ihrer Positionen Nucleotide ein­ gebaut sind, die eine ähnliche Komplementarität zu mindestens zwei der vier natürlichen Basen besitzen. Gemäß einer speziellen Aus­ führungsform der Erfindung kann man dafür Inosin als Nucleotid mit einer ähnlichen Komplementarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid-Basen vorsehen.
Eine erfindungsgemäße Bank kann bis zu 4⁹ 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-mere umfassen. Erfindungsgemäß zählen dazu auch solche Oligomere, die bis zu 18 Nukleotide umfassen, die Watson-Cricksche Basenpaare mit den Shortmers ausbilden können.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird ferner gemäß einer weiteren Ausführungsform durch eine Bank (Bibliothek) von Templates gelöst, die für die Herstellung von Primern für eine konsekutive DNA-Sequenzierung geeignet sind,
  • - wobei man zur Primer-Herstellung zwei, drei oder vier Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template der Bank hybridi­ siert,
  • - danach die hybridisierten Shortmers zum Primer ligiert und
  • - danach den gebildeten Primer vom Template und von unumgesetzten Shortmers abtrennt und gewinnt,
wobei die Bank ein Gemisch bis mehrere Gemische von Templates umfaßt, die sich dadurch voneinander unterscheiden, daß an einer oder an mehreren Positionen der Templates eines Gemischs jeweils zwei bis vier verschiedene, zu den vier natürlichen Basen komple­ mentäre Basen vorgesehen sind, und zwar mit der Maßgabe, daß die Gesamtzahl aller denkbar möglichen Template-Gemische einschließ­ lich nicht im Gemisch vorliegender Templates der Bank die Gesamt­ zahl aller für die Primer-Herstellung denkbar möglichen Shortmers praktisch nicht übersteigt.
Wiederum gilt, daß nicht für jedes Shortmer-Paar ein kurzes Template vorgesehen wird, so daß das Shortmer-Konzept nicht ad absurdum geführt wird. Vielmehr wird die Komplexität der Herstel­ lung kurzer Template bei dieser Ausführungsform dadurch reduziert, daß man an einzelnen ihrer Positionen mehr als ein Nucleotid ein­ baut.
So kann eine erfindungsgemäße Bank (Bibliothek) bis zu 4⁹ Gemischen von 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-meren einschließlich nicht im Gemisch vorliegender 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- bzw. 18-mere umfassen. Erfindungsgemäß zählen dazu auch solche Oligomere, die bis zu 18 Nukleotide umfassen, die Watson-Cricksche Basenpaare mit den Shortmers ausbilden können.
Die vorstehend zum Verfahren gemachten Ausführungen zu Templates mit derivatisierten, markierten oder Reste tragenden Bausteinen, die die Abtrennung erleichtern, gelten entsprechend.
Nachstehend wird die Erfindung durch ein Experiment mit 5 Anlagen näher erläutert.
Shortmer-Experiment
Im Experiment verwendete Oligonucleotide (I = Inosin)
F-Oligo: 5′ F-AAAACGAC 3′
P-Oligo: 5′ P-GGCCAGTG 3′
B-Oligo: 5′ B-IIIIGGCCGTCGIIII 3′
K-Oligo: 5′ F-CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT 3′.
In einem typischen Experiment wurden 2,2 µl (220 pMol) einer Lösung eines 5′-Fluorescein-markierten Oktanucleotids (F-Oligo) mit 4,1 µl (220 pMol) einer Lösung eines 5′-phosphorylierten Oligonucleotids (P-Oligo) und mit 1,5 µl (150 pMol) eines 5′- Biotin-markierten Oligonucleotids (B-Oligo) sowie mit 4,2 µl T4- DNA-Ligase-Puffer (Gibco) und mit 4 µl ATP-Lösung (10 mM) in einem 0,5 ml Reaktionsgefäß kombiniert. Das Gefäß mit dem gemischten Komponenten wurde in einem programmierbaren Temperierblock inner­ halb von 2 min auf 80°C erhitzt, für 2 min bei dieser Temperatur gehalten und dann innerhalb von 20 min auf 10°C abgekühlt. Zum Start der Ligationsreaktion wurde die Lösung mit 4 µl T4-DNA- Ligase (4 Einheiten; Gibco) versetzt und für weitere 2 h bei 10°C gehalten. Danach wurde die Lösung mit 20 µl Stopp-Mix (Pharmacia) versetzt.
Zur analytischen Kontrolle wurden 3 µl einer wäßrigen Verdünnung (1 ad 1000) der obigen Endlösung mit 3 µl Stopp-Mix versetzt und einer Gelelektrophorese auf einem 18-proz. denaturierenden Polyacrylamidgel in einem kommerziellen "DNA-Sequencer (A. L. F.; Pharmacia) unterworfen (1500 V, 50°C, 34 W, 38 mA, 180 min). Die automatisch gesammelten Rohdaten wurden mit dem Programm "Fragment Manager" (Pharmacia) hinsichtlich der Ligationsausbeute ausge­ wertet (Anlage 1).
20 µl der obigen Ligationsendlösung wurden mit 5 µl Wasser und dann mit 100 µl einer frisch aufgewirbelten Suspension von Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal) versetzt und für 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Mit Hilfe eines Magneten wurden die Phasen getrennt. Die flüssige Phase wurde in ein anderes Reak­ tionsgefäß überführt. Danach wurde die flüssige Phase wie oben beschrieben einer analytischen Kontrolle unterworfen (Anlage 2). Die feste Phase wurde in 10 µl 0,1 N NaOH suspendiert und für 15 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Phasen wurden mit Hilfe eines Magneten erneut getrennt. Die flüssige Phase wurde durch Zugabe von maximal 10 µl 0,1 N HCl neutralisiert. Die knapp 20 µl Lösung enthielten in mehreren Versuchen etwa 60 bis 90% der theo­ retisch erreichbaren 75 pMol ligierten und 5′-Fluorescein- markierten Primers. Die Lösung wurde wie oben beschrieben einer analytischen Kontrolle unterworfen (Anlage 3).
Der ligierte Primer wurde nach kommerziell erhältlichen Proto­ kollen in DNA-Sequenzanalysen eingesetzt.
In einem Parallelexperiment wurde mit einem kommerziell erhält­ lichem und um acht Basen längeren Primer (K-Oligo) gearbeitet. Die Leseweiten mit ligiertem Primer erreichten je nach Reinheit der eingesetzten Shortmers in mehreren Experimenten 80 bis 100% der Leseweiten mit einem kommerziellen Primer (Anlagen 4 und 5).

Claims (16)

1. Verfahren zur Herstellung eines Primers für eine konsekutive DNA-Sequenzierung, bei dem man mindestens zwei Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template hybridisiert und danach miteinander zum Primer ligiert, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man
  • (a) ein Template in Form eines Einzelstranges aus Nukleotiden verwendet, bei dem die Anzahl der Nukleotide mindestens 6 beträgt und nicht größer als das Doppelte der Gesamtzahl der Nukleotide aller eingesetzten Shortmers ist, und
  • (b) danach den gebildeten Primer von Template und von unumgesetzten Shortmers abtrennt und gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Nucleotide des Templates bis um etwa die Anzahl der Nucleotide eines der eingesetzten Shortmers kleiner oder bis um etwa die Anzahl der Nucleotide eines der eingesetzten Shortmers größer ist als die Gesamtzahl der Nucleotide aller eingesetzten Shortmers.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Nucleotide des Templates etwa der Gesamtzahl der Nucleotide aller eingesetzten Shortmers entspricht.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Shortmers 6-mere, 7-mere, 8-mere und/oder 9-mere verwendet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zwei Shortmers einsetzt, wobei die Anzahl der Nucleotide des Templates 8 bis 18 betragen kann.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zwei Shortmers
  • (a) aus einer Bank von 6-meren und/oder 7-meren und/oder
  • (b) aus einer Bank von 8-meren und/oder 9-meren verwendet und bei (a) bzw. (b) ein 5-meres oder 9-meres aus einer Bank gemäß (b) als Template einsetzt.
7. Bank (Bibliothek) von Templates, die für die Herstellung von Primern für eine konsekutive DNA-Sequenzierung geeignet sind,
  • - wobei man zur Primer-Herstellung zwei, drei oder vier Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template der Bank hybridisiert,
  • - danach die hybridisierten Shortmers zum Primer ligiert und
  • - danach den gebildeten Primer von Template und von unumgesetzten Shortmers abtrennt und gewinnt,
wobei bei mindestens einem Template bis allen Templates der Bank mindestens ein bis maximal alle Nucleotide eine ähnliche Komplementarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid-Basen besitzen, und zwar mit der Maßgabe, daß die Gesamtzahl aller denkbar möglichen Templates der Bank die Gesamtzahl aller für die Primer-Herstellung denkbar möglichen Shortmers praktisch nicht übersteigt.
8. Bank nach Anspruch 7, bei der bei einem, mehreren oder allen Templates an jeweils einer Position oder an einzelnen ihrer Positionen Nucleotide eingebaut sind, die eine ähnliche Komplementarität zu mindestens zwei der vier natürlichen Basen besitzen.
9. Bank nach Anspruch 8, bei der Inosin als Nucleotid mit einer ähnlichen Komplementarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid-Basen vorgesehen ist.
10. Bank nach einem der Ansprüche 7 bis 9 mit bis zu 4⁹ 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-meren.
11. Bank (Bibliothek) von Templates, die für die Herstellung von Primern für eine konsekutive DNA-Sequenzierung geeignet sind,
  • - wobei man zur Primer-Herstellung zwei, drei oder vier Shortmers in Nachbarschaft zueinander mit einem Template der Bank hybridi­ siert,
  • - danach die hybridisierten Shortmers zum Primer ligiert und
  • - danach den gebildeten Primer von Template und von unumgesetzten Shortmers abtrennt und gewinnt,
wobei die Bank ein Gemisch bis mehrere Gemische von Templates um­ faßt, die sich dadurch voneinander unterscheiden, daß an einer oder an mehreren Positionen der Templates eines Gemischs jeweils zwei bis vier verschiedene, zu den vier natürlichen Basen komple­ mentäre Basen vorgesehen sind, und zwar mit der Maßgabe, daß die Gesamtzahl aller denkbar möglichen Template-Gemische einschließ­ lich nicht im Gemisch vorliegender Templates der Bank die Gesamt­ zahl aller für die Primer-Herstellung denkbar möglichen Shortmers praktisch nicht übersteigt.
12. Bank nach Anspruch 11, bei der bei einem, mehreren oder allen Templates an jeweils einer Position oder an einzelnen ihrer Positionen Nucleotide eingebaut sind, die eine ähnliche Komplemen­ tarität zu mindestens zwei der vier natürlichen Basen besitzen.
13. Bank nach Anspruch 12, bei der Inosin als Nucleotid mit einer ähnlichen Komplementarität für mindestens zwei der vier natürlichen Nucleotid-Basen vorgesehen ist.
14. Bank nach einem der Ansprüche 11 bis 13 mit bis zu 4⁹ Gemischen von 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- oder 18-meren einschließlich nicht im Gemisch vorliegender 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17- bzw. 18-meren.
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