DE69928263T2

DE69928263T2 - Verfahren zur herstellung in vitro von rekombinierten nucleotidsequenzen, und so hergestelte genbanken und sequenzen

Info

Publication number: DE69928263T2
Application number: DE69928263T
Authority: DE
Inventors: Daniel Dupret; Jean-Michel Masson; Fabrice Lefevre
Original assignee: Proteus SA
Current assignee: Proteus SA
Priority date: 1998-08-12
Filing date: 1999-08-11
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2019-08-12
Also published as: FR2782323A1; WO2000009679A1; ATE309342T1; JP2002538763A; NO20015787D0; CA2339901A1; EP1104457B1; IL141373A; ES2253901T3; AU769516B2; CA2339901C; IL141373A0; DE69928263D1; EP1683861A1; NO20015787L; JP4448619B2; AU769516C; FR2782323B1; AU5171799A; DK1104457T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro-Herstellung von rekombinierten Polynukleotidsequenzen. Insbesondere ist es ein Ziel der Erfindung, Polynukleotidsequenzen, die in Bezug auf entsprechende Eigenschaften von Referenzsequenzen eine oder mehrere vorteilhafte Eigenschaften aufweisen können und daher einen verbesserten Phänotyp bereitzustellen und/oder verbesserte Proteine herzustellen vermögen, zu generieren und zu selektieren.
Unter Referenzsequenz versteht man eine Sequenz mit Eigenschaften, die den gesuchten Eigenschaften ähnlich sind.
Zur Begünstigung der In-vitro-Rekombination zwischen unterschiedlichen Polynukleotidsequenzen sind verschiedene Techniken entwickelt worden, unter denen insbesondere das DNA-Shuffling (12) und das StEP (14) zu nennen sind, die beide auf der Anwendung der PCR beruhen.
Das DNA-Shuffling umfaßt zwei Schritte, nämlich die aleatorische Fragmentierung von Polynukleotidsequenzen mittels DNAse I, sowie eine Amplifikation mittels PCR, in der die zuvor erzeugten Fragmente als Primer dienen. In jedem Hybridisierungsschritt führt der Matrizenwechsel zu Rekombinationen in Regionen mit homologen Sequenzen. Eine schematische Darstellung dieses Verfahrens findet sich in der beigelegten 1A.
StEP besteht darin, unterschiedliche Polynukleotidsequenzen, die verschiedene Mutationen enthalten, in Gegenwart eines Primerpaars zu mischen. Mit dieser Mischung wird eine Reaktion des PCR-Typs durchgeführt, wobei die Schritte Hybridisierung und Polymerisation zu einem einzigen, sehr kurzen Schritt zusammengefaßt sind. Diese Bedingungen ermöglichen die Hybridisierung der Primer, setzen jedoch die Polymerisationsgeschwindigkeit herab, sodaß die Fragmente, die teilweise synthetisiert wurden, aleatorisch mit den Polynukleotidsequenzen, die die verschiedenen Mutationen tragen, hybridisieren, wodurch ihre Kombination ermöglicht wird. Eine schematische Darstellung dieses Verfahrens findet sich in der beigelegten 1B.
Bei jedem dieser beiden Verfahren ist der Polymerisationsschritt für den Rekombinationsvorgang unentbehrlich. So kann in Abhängigkeit der gewählten Polymerasen dieser Polymerisationsschritt zu unerwünschten zusätzlichen Mutationen führen. Weiterhin beruhen das DNA-Shuffling und das StEP ausgehend von einer gewissen Anzahl Zyklen auf dem Prinzip der Hybridisierung eines „Mega-Primers" (6) auf einer Matrize, was vermutlich bei Polynukleotidsequenzen mit einer Größe oberhalb 1,5 kBp zu Durchführungsschwierigkeiten führt (11). Schließlich kann mit diesen beiden Techniken die Rekombinationsrate nicht kontrolliert werden, da die Rekombinationen aleatorisch während der aufeinanderfolgenden Polymerisationsschritte entstehen.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht gerade darin, die oben genannten Nachteile dadurch zu überwinden, daß sie ein einfaches Verfahren zur Herstellung von rekombinierten Polynukleotidsequenzen bietet, mit dem Polynukleotidsequenzen erzeugt werden können, die im Vergleich zu entsprechenden Eigenschaften von Referenzsequenzen vorteilhafte Eigenschaften aufweisen können und daher fähig sind, einen verbesserten Phänotyp bereitzustellen und/oder verbesserte Proteine zu herzustellen vermögen.
Diese Zielsetzung wird mittels eines Verfahrens zur Invitro-Herstellung von rekombinierten Polynukleotid sequenzen ausgehend von einer Polynukleotidsequenzbank, im folgenden auch als ursprüngliche Bank bezeichnet, gelöst, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

a) die Fragmentierung einer Bank von doppelsträngigen Polynukleotidsequenzen,
b) die Denaturierung der Fragmente, gegebenenfalls in Gegenwart von einer oder mehreren Verbindungsmatrize(n),
c) die Hybridisierung dieser Fragmente mit einer oder mehreren Verbindungsmatrize(n), falls letztere nicht in Schritt b) vorhanden ist/sind,
d) die Ligation dieser Fragmente zu rekombinierten Polynukleotidsequenzen,
e) die Selektion von rekombinierten Polynukleotidsequenzen, die im Vergleich zu Eigenschaften, die einer oder mehreren Referenzsequenzen entsprechen, vorteilhafte Eigenschaften aufweisen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann am Ende von Schritt d) vor Schritt e) eine Wiederholung der Schritte b), c) und d) umfassen und zwar nicht mit den Fragmenten von Schritt a), sondern mit den Produkten von Schritt d).
Diese Ausführungsform eignet sich besonders dann, wenn am Ende von Schritt d) alle Fragmente nicht ligiert sind. In diesem Fall umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin am Ende von Schritt d) vor Schritt e) einen oder mehrere der folgenden Reaktionszyklen:

– Denaturierung der ligierten und nichtligierten Fragmente aus Schritt d), gegebenenfalls in Gegenwart von einer oder mehreren Verbindungsmatrize(n),
– Hybridisierung dieser Fragmente mit einer oder mehreren Verbindungsmatrize(n), wenn letztere bei der Denaturierung nicht vorhanden ist/sind,
– Ligation dieser Fragmente.

Diese Denaturierungs-, Hybridisierung- und Ligationsreaktionen entsprechen den Schritten b), c) und d), werden jedoch nicht mit den Fragmenten von Schritt a), sondern mit den ligierten und nichtligierten Fragmenten aus Schritt d) durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin einen oder mehrere der folgenden Schritte umfassen:

– Abtrennung von rekombinierten Polynukleotidsequenzen von der bzw. den Verbindungsmatrize(n) vor Schritt e)
– Amplifikation der doppelsträngigen rekombinierten Polynukleotidsequenzen vor Schritt e),
– Klonierung von rekombinierten Polynukleotidsequenzen, gegebenenfalls nach Abtrennung der rekombinierten Stränge von der bzw. den Matrize(n) und Gewinnung des entsprechenden Doppelstrangs vor Schritt e).

Die Enden der in Schritt a) generierten Fragmente sind derart, daß dort eine benachbarte Hybridisierung dieser Enden auf der oder den Verbindungsmatrize(n) in Schritt c) und die Ligation dieser Fragmente miteinander in Schritt d) stattfinden kann. Die Polynukleotidsequenzen der Bank, mit der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, müssen Homologiebereiche untereinander oder mit den Verbindungsmatrizen aufweisen, mit denen es möglich ist, Fragmentenden, wie oben beschrieben, zu generieren.
Eine vorteilhafte Art der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in der gleichzeitigen Durchführung der Schritte c) und d) in Form einer sogenannten RLR-Reaktion (englisch für „Recombining Ligation Reaction").
Außer den oben angegebenen Vorteilen ist das erfindungsgemäße Verfahren insofern bemerkenswert, als es die aleatorische In-vitro-Rekombination von Polynukleotidsequenzen begünstigt und beschleunigt, wobei es sich bei diesen Polynukleotidsequenzen um Gene handeln kann. Unter Gen versteht man ein DNA-Fragment oder eine DNA-Sequenz, das/die mit einer biologischen Funktion assoziiert ist. Ein Gen kann auf unterschiedliche Art und Weise erhalten werden, darunter auch durch chemische Synthese, Polymerisationssynthese oder durch Gewinnen dieses Gens aus einer Nukleinsäurequelle.
Die In-vitro-Rekombination der Polynukleotidsequenzen der ursprünglichen Bank mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglicht es also, zu einer neuen Bank zu gelangen, die Sequenzen enthält, die eine oder mehrere Eigenschaften der Sequenzen der vorhergehenden Bank erworben haben. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt daher eine In-vitro-Evolutionstechnik dar.
Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine Alternative zur rekombinatorischen PCR, wie sie bei den Techniken DNA-Shuffling (12) oder StEP (14) verwendet wird, dar, da bei ihr kein In-vitro-Polymerisationsschritt erforderlich ist, um zu der Rekombination zu gelangen. Ganz im Gegenteil, der Schlüsselschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Schritt d), bei dem eine Ligation an eine Verbindungsmatrize stattfindet, was einen sehr hohen Grad an Irrtumsfreiheit während der Rekombinationsereignisse gewährleistet.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insofern bemerkenswert, als man mit ihm die Reassemblierungseffizienz der zu ligierenden Fragmente beträchtlich erhöhen kann. Bei einer in n Fragmente zerlegten Sequenz gibt es nämlich nⁿ Möglichkeiten, die Fragmente unter Verwendung eines traditionellen Ligationsverfahrens zu reassoziieren (ohne Verwendung einer Verbindungsmatrize, die die Ligation in eine bestimmte Richtung lenkt), unter denen nur eine einzige Form von Interesse ist. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Ligation durch die Verbindungsmatrize in eine bestimmte Richtung gelenkt, wodurch man direkt die einzige Form von Interesse erhält.
Die Fragmentierung dieser Polynukleotidsequenzen in Schritt a) kann auf kontrollierte Weise oder auch aleatorisch erfolgen.
Bei einer Fragmentierung, die auf kontrollierte Weise durchgeführt wird, ermöglicht es die Fragmentierung, den erwünschten Rekombinationsgrad und die Lage der Rekombinationspunkte präzise zu kontrollieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht Schritt a) darin, daß man die Polynukleotidsequenzen der Bank einer Hydrolyse durch Einwirkung eines oder mehrerer Restriktionsenzyme unterwirft. So werden bei einer bestimmten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens der Rekombinationsgrad und die Position der Rekombinationspunkte der rekombinierten Polynukleotidsequenzen von der Fragmentierung von Schritt a) bestimmt.
Je größer also die Anzahl der erzeugten Fragmente pro Sequenz ist, desto höher ist die Anzahl der Fragmente, die erforderlich sind, um eine Sequenz neu zu bilden, was eine erhöhte Rekombinationsrate mit sich bringt. Weiterhin können die Art und die Position der Enden der gebildeten Fragmente in dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bekannt und kontrolliert werden, was folgendes ermöglicht:

– präzise Kontrolle der Regionen, wo die Rekombination stattgefunden hat bzw.
– Induktion der Rekombination zwischen Polynukleotidsequenzen, zum Beispiel Genen, wenn die Enden der Fragmente in Homologiebereichen zwischen diesen Sequenzen oder Homologiebereichen zwischen diesen Sequenzen und der Verbindungsmatrizen geschaffen werden.

Bei der aleatorischen Fragmentierung können alle dem Fachmann bekannten enzymatischen oder mechanischen Mittel verwendet werden, die fähig sind, den DNA-Doppelstrang aleatorisch zu schneiden, wie zum Beispiel Verdauung mittels DNase I oder Ultraschallbehandlung.
Das erfindungsgemäße Verfahren, mit dem die Reassemblierungseffizienz von zu ligierenden Fragmenten beträchtlich erhöht werden kann, kann daher auf die Orientierung der Ligation von mehreren Molekülen mit stumpfen Enden angewandt werden. Bei dieser Anwendung verwendet man als Verbindungsmatrize in den Schritten b) bzw. c) einzel- oder doppelsträngige Oligonukleotide, die zum 3'-Ende eines Fragments und zum 5'-Ende des benachbarten Fragments genau komplementär sind, was die benachbarte Hybridisierung dieser beiden Enden an der gleichen Matrize nach dem Denaturierungsschritt ermöglicht. Sobald sie hybridisiert sind, können die Enden der Fragmente untereinander so ligiert werden, daß sie die Orientierung der Ligationsrichtung der stumpfendigen Fragmente aufweisen. Der gleiche Ansatz kann für die Orientierung der Ligation von Fragmenten mit kohäsiven Enden in Betracht gezogen werden.
Eine ganz besonders bevorzugte Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, bei Schritt c) und/oder Schritt d) Enzyme hinzuzufügen, die die nichthybridisierten Enden der Fragmente spezifisch erkennen und schneiden können, wenn diese Enden andere hybridisierte Fragmente auf der gleiche Matrize überdecken. Ein bevorzugtes Beispiel für solch ein Enzym ist das Enzym Flap-Endonuklease (10).
Eine besondere Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht daher in der Verwendung von Enzymen des Flap-Endonuklease-Typs, wenn die in Schritt a) erzeugten Fragmente sich bei der Hybridisierung auf der Verbindungsmatrize in Schritt c) überdecken.
Bei der Hybridisierung von Einzelstrang-DNA-Fragmenten auf einer Matrize weisen diese Enzyme die Eigenschaft auf, die nichthybridisierten Enden dieser Fragmente spezifisch zu erkennen und zu schneiden, wenn diese Enden andere Fragmente, die an der gleichen Matrize hybridisiert sind, überdecken. Während des Hybridisierungsschritts c) kann daher mit diesen Enzymen die Anzahl der benachbarten Enden, die in Schritt d) ligiert werden können, vermehrt werden, was besonders dann von Wichtigkeit ist, wenn die Fragmente durch aleatorisches Schneiden erhalten wurden, da diese Fragmente Bereiche aufweisen, die einander überdecken, wenn sie an die Verbindungsmatrize hybridisieren.
Bei einer besonderen Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei der in Schritt d) eine Ligase verwendet wird, die bei hoher Temperatur aktiv ist und vorzugsweise hitzestabil ist, weisen die in Schritt c) und/oder in Schritt d) hinzugefügten Endonukleasen, die fähig sind, die nichthybridisierten Enden von Fragmenten spezifisch zu erkennen und zu schneiden, wie die Flap-Endonukleasen, die gleichen Eigenschaften der Hitzeresistenz und Aktivität bei hoher Temperatur wie die genannte Ligase auf.
Die Polynukleotidsequenzbank, an der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, kann nach einem beliebigen Verfahren, mit dem der Fachmann vertraut ist, erzeugt werden, zum Beispiel ausgehend von einem Wildgen durch aufeinanderfolgende gerichtete Mutageneseschritte, mittels „Error-prone"-PCR (2), mittels chemischer aleatorischer Mutagenese, mittels aleatorischer In-vivo-Mutagenese oder durch Kombination von Genen von Familien, die innerhalb der selben Art oder unterschiedlicher Arten verwandt sind oder sich unterscheiden, sodaß man über verschiedene Polynukleotidsequenzen in dieser Bank verfügt.
Unter diesen Techniken betrifft die Erfindung insbesondere ein Verfahren, bei dem die Bank der doppelsträngigen Polynukleotidsequenzen durch ein Kettenpolymerisationsverfahren erhalten wird, da es unter Bedingungen durchgeführt wird, die die Erzeugung von aleatorischen Punktmutationen ermöglichen.
Die ursprüngliche Bank der doppelsträngigen Polynukleotidsequenzen kann aus synthetischen Sequenzen bestehen, die in Schritt a) fragmentiert werden oder die die Fragmente von Schritt a) darstellen können.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht Schritt a) darin, daß die Polynukleotidsequenzen der Bank einer Hydrolyse durch Einwirkung eines oder mehrerer Restriktionsenzyme unterworfen werden.
Um den Rekombinationsgrad, der durch das erfindungsgemäße Verfahren geschaffen wird, zu erhöhen, genügt es, die Anzahl der Restriktionsfragmente zu vermehren, und zwar dadurch, daß man Restriktionsenzyme mit einer großen Anzahl Schnittstellen auf den Polynukleotidsequenzen der Bank verwendet, oder dadurch, daß man mehrere Restriktionsenzyme kombiniert. Wird eine hitzestabile und bei hoher Temperatur aktive Ligase verwendet, so wird die Größe des kleinsten so erzeugten Fragments vorteilhaft 40 Bp oder darüber betragen, um eine Hybridisierungstemperatur weiterverwenden zu können, die mit derjenigen des Ligationsschritts d), der im allgemeinen in der Größenordnung von 65°C liegt, kompatibel ist.
Schritt a) kann auch dadurch durchgeführt werden, daß man durch aleatorische enzymatische oder mechanische Behandlung eine Fragmentbank erzeugt. Insbesondere kann Schritt a) darin bestehen, daß man eine Bank von doppelsträngigen Polynukleotidsequenzen, die teilweise heterolog sind, aleatorisch mit DNAse I behandelt. Verwendet man in Schritt a) eine aleatorische enzymatische oder mechanische Fragmentation, so weist diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Besonderheit auf, daß Fragmente, die durch diese Behandlung erzeugt werden, als Matrizen füreinander, für die Hybridisierung während Schritt c) oder die RLR-Reaktion der gleichzeitig durchgeführten Schritte c) und d) verwendet werden können.
Schritt b) kann dadurch durchgeführt werden, daß man mindestens zwei unterschiedliche, getrennt in Schritt a) ausgehend von der gleichen ursprünglichen Bank durch unterschiedliche Behandlungen, wie zum Beispiel mit unterschiedlichen Restriktionsenzymen, hergestellte Fragmentbanken kombiniert. werden solche Banken verwendet, so verwendet man die in Schritt a) verwendeten Fragmente als Matrizen füreinander, für die Hybridisierung während Schritt c) oder der RLR-Reaktion der gemeinsam durchgeführten Schritte c) und d).
Die Fragmente von Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens können auch durch Amplifikationsreaktionen, wie PCR, die an den Polynukleotidsequenzen der Bank durchgeführt werden, erzeugt werden. Es sind zwei Lösungen denkbar. Im ersten Fall können die Primer-Oligonukleotide dergestalt sein, daß Fragmente geschaffen werden, deren Enden entlang der gesamten Assemblierungssequenz benachbart sind. Im zweiten Fall sind die Primer-Oligonukleotide dergestalt, daß Fragmente mit gemeinsamen Sequenzen geschaffen werden, wobei diese Fragmente als Verbindungsmatrize füreinander in Schritt b) oder in Schritt c) dienen können. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, unterschiedliche Fragmente, die in Schritt a) erhalten werden, aleatorisch zu kombinieren und sie während der Schritte b), c) und d) in einer Polynukleotidsequenz zusammenzubauen. Dieses Verfahren reproduziert daher in vitro die Rekombinationserscheinungen, die in vivo auftreten können, wobei diese begünstigt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher von besonderem Interesse für die Rekombination von Polynukleotidsequenzen untereinander, um neue Polynukleotidsequenzen mit Eigenschaften, die in Bezug auf die entsprechenden Eigenschaften von Referenzsequenzen vorteilhaft sind, zu generieren.
Die Rekombinationseffizienz des erfindungsgemäßen Verfahrens hängt von der Anzahl der Fragmente, die pro Polynukleotidsequenz in Schritt a) erzeugt werden, ab. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden daher Polynukleotidsequenzen verwendet, die in n Fragmente fragmentiert worden sind, wobei n vorteilhafterweise drei oder mehr als drei bedeutet.
Die Verbindungsmatrize in Schritt b) oder c) ist zum Beispiel eine Polynukleotidsequenz, die von der ursprünglichen Bank stammt, oder eine Konsensussequenz dieser Bank, und ist einzel- oder doppelsträngig. Wird die Verbindungsmatrize direkt in Schritt c) der Erfindung eingebaut, so muß diese Matrize in Form eines Einzelstrangs vorliegen.
Gemäß einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens bestehen die Verbindungsmatrizen der Schritte b) bzw. c) aus einzel- oder doppelsträngigen Oligonukleotiden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die einzel- oder doppelsträngigen Oligonukleotide, die eine unterschiedliche Länge aufweisen, zusätzlich zu der Matrize in Schritt b) bzw. c) zugegeben. Diese Oligonukleotide sind dergestalt, daß sie einen Teil der Fragmente in Schritt b) ersetzen können, und zwar ist ihre Sequenz so, daß:

– wenn sie mit der Sequenz des Fragments, das sie ersetzen, völlig homolog sind, sie gewisse Kombinationen begünstigen, oder
– wenn sie mit der Sequenz des Fragments, das sie ersetzen, teilweise heterolog sind, sie eine oder mehrere zusätzliche gerichtete Mutationen einführen.

Vor Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man die rekombinierten Polynukleotidsequenzen mit Hilfe eines Markers, der auf der Verbindungsmatrize oder auf den rekombinierten Polynukleotidsequenzen vorliegt, von der Verbindungsmatrize abtrennen. Es ist nämlich möglich, jeden Strang der Matrize mit Techniken, mit denen der Fachmann vertraut ist, zu markieren. So kann es sich bei dem Marker der Verbindungsmatrize zum Beispiel um ein Hapten handeln, und man trennt die rekombinierten Polynukleotidsequenzen von der Verbindungsmatrize mit Techniken, mit denen der Fachmann vertraut ist, ab, wie zum Beispiel mit einem Antikörper gegen das Hapten, der auf einem Träger fixiert ist, oder mit einer Biotin-Streptavidin-Reaktion, wenn es sich bei dem Hapten um einen Biotinmarker handelt.
Zur Abtrennung der rekombinierten Polynukleotidsequenzen von der Verbindungsmatrize können auch andere Techniken verwendet werden. Die Verbindungsmatrize kann auch spezifisch so hergestellt werden, daß ihre Entfernung am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens erleichtert wird. So kann sie mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung von methylierten dATPs hergestellt werden, wodurch sie mit der Restriktionsendonuklease Dpn I abgebaut werden kann. In diesem Fall dürfen die rekombinierten Polynukleotidsequenzen keine methylierten dATPs enthalten. Die Matrize kann auch mittels PCR-Amplifikation unter Verwendung von dUTPs hergestellt werden, wodurch sie durch Behandlung mit einer Uracyl- DNA-Glycosylase abgebaut werden kann. Umgekehrt ist es möglich, die rekombinierten Polynukleotidsequenzen dadurch zu schützen, daß man sie mittels selektiver PCR mit Oligonukleotiden, die Phosphorothioatgruppen am 5'-Ende enthalten, amplifiziert. Eine Behandlung mit einer Exonuklease ermöglicht es nun, die Verbindungsmatrize spezifisch abzubauen.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vor der gegebenenfalls durchgeführten Klonierung in Schritt e) einen Schritt, in dem rekombinierte Polynukleotidsequenzen amplifiziert werden, umfassen. Es kann jede beliebige Amplifikationsmethode verwendet werden, insbesondere eine Amplifikation mittels PCR. Eine der einfachsten Methoden besteht darin, eine PCR durchzuführen, mit der spezifisch die rekombinierten Polynukleotidsequenzen aufgrund von Primern, die ausschließlich mit den Enden der rekombinierten Sequenzen hybridisieren können, amplifiziert werden können. Die PCR-Produkte werden anschließend kloniert, um charakterisiert zu werden, und die Polynukleotidsequenzen, die in Bezug auf die entsprechenden Eigenschaften von Referenzsequenzen vorteilhafte Eigenschaften aufweisen, werden ausgewählt.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, Polynukleotidsequenzen zu erzeugen, die in Bezug auf die entsprechenden Eigenschaften von Referenzsequenzen vorteilhafte Eigenschaften aufweisen können. Die in Schritt d) erhaltenen, gegebenenfalls klonierten rekombinierten Polynukleotidsequenzen werden mit irgendeinem geeigneten Mittel durchmustert, um die rekombinierten Polynukleotidsequenzen oder die Klone mit in Bezug zu den entsprechenden Eigenschaften von Referenzsequenzen vorteilhaften Eigenschaften auszuwählen. Unter vorteilhaften Eigenschaften versteht man zum Beispiel die Hitzestabilität eines Enzyms oder seine Fähigkeit, unter pH-Bedingungen oder Temperaturbedingungen oder Salzkonzentrations bedingungen, die stärker einem Enzymverfahren angepaßt sind, zu funktionieren als die üblicherweise für dieses Verfahren verwendeten Proteine. Beispielhaft für solch ein Verfahren sind ein Industrieverfahren für die Entschlichtung von Textilfasern oder die Bleichung von Zellstoff oder die Produktion von Aromen in der Milchindustrie, Biokatalyseverfahren für die enzymatische Synthese von neuen therapeutischen Molekülen usw. zu nennen.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Polynukleotidsequenzbank daher aus einer Durchmusterung hervorgehen, bei der durch jedwedes geeignete Mittel die Polynukleotidsequenzen, die in Bezug zu den entsprechenden Eigenschaften von Referenzsequenzen vorteilhafte Eigenschaften aufweisen, selektiert werden können. Die so selektierten Sequenzen stellen eine eingeschränkte Bank dar.
Man kann jedoch auch von einer nichteingeschränkten Bank ausgehen, um die Repräsentativität der in dieser Bank enthaltenen Eigenschaften beizubehalten.
Die Sequenzen, die für das bzw. die Protein(e), das bzw. die in Bezug zu Referenzproteinen vorteilhafte Eigenschaften aufweisen, kodieren, werden nun durch In-vivo- oder In-vitro-Durchmusterung selektiert und können als neue Bank für eine gegebenenfalls wiederholte Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu dienen. Eine vorteilhafte Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht daher in der Verwendung von mehreren, nach einer ersten Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens selektierten Polynukleotidsequenzen, als Bank, gegebenenfalls in Abmischung mit anderen Polynukleotidsequenzen. Unter den Durchmusterungstechniken, die bei jedem der Klone aus Schritt e) angewandt werden können, weisen die In-vitro- Durchmusterungstechniken den Vorteil auf, daß bei ihr keine Probleme mit der Zellphysiologie und keine der mit der In-vivo-Expressionsklonierung im Zusammenhang stehenden Probleme auftreten. Weiterhin kann diese Art der Durchmusterung leicht automatisiert werden, wodurch man eine große Anzahl an rekombinierten Polynukleotidsequenzen durchmustern kann.
Die Erfindung betrifft auch eine mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene rekombinierte Polynukleotidsequenz, sowie einen Vektor, der solch eine rekombinierte Polynukleotidsequenz enthält, eine Wirtszelle, die mit einer erfindungsgemäßen rekombinierten Polynukleotidsequenz oder einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert ist, sowie ein Protein, das von dieser rekombinierten Polynukleotidsequenz kodiert wird. Die Erfindung umfaßt auch die entsprechenden Banken der rekombinierten Polynukleotidsequenzen, der Vektoren, der Wirtszellen oder der Proteine.
Weitere Vorteile und Eigenschaften der Erfindung werden aus den folgenden Ausführungsbeispielen der Erfindung, die sich auf die beigelegten Zeichnungen beziehen, hervorgehen, wobei in diesen Zeichnungen folgendes gilt.
1 ist eine schematische Darstellung der Verfahren des Stands der Technik, die dem DNA-Shuffling (1A) bzw. StEP (1B) entsprechen.
2 ist eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens und von gewissen Varianten und Anwendungen dieses Verfahrens.
In 3 ist die Lage der zehn Mutationsbereiche (Pvu II und Pst I), die von jeder Mutante des für die Durchführungsbeispiele der Erfindung verwendeten ponB-Gens getragen werden, dargestellt.
In 4 ist die Lage der verwendeten Primer in Bezug auf die Sequenz des ponB-Gens dargestellt.
In 5 ist die Wanderung der RLR-Reaktionsprodukte und der PCR der Produkte dieser RLR-Reaktionen in einem Agarosegel dargestellt.
In 6 ist die Lage der Mutationen in Bezug auf die Restriktionsfragmente dargestellt.
I – BEISPIEL
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde ausgehend von einer Bank von Mutanten des ponB-Gens, das für die PBPIb von E. coli kodiert, durchgeführt (1). Es wurden zehn Mutanten dieses Gens verwendet. Die Sequenz des Gens von jeder Mutante unterscheidet sich von der Sequenz des Wildgens durch einen nichthomologen Bereich mit einer Größe von 13 bis 16 Basen, der durch Substitution der fünf am Anfang stehenden Codons durch fünf Alanin-Codons nach der von Lefèvre et al. (8) beschriebenen Technik entstanden ist.
Die von jeder Mutante getragene Substitution ist durch das Vorhandensein einer unikären Stelle des Restriktionsenzyms Pvu II, die von zwei Stellen des Enzyms Pst I umrahmt wird, charakterisiert, wodurch die Mutanten voneinander aufgrund ihres Verdauungsprofils mit diesen Restriktionsendonukleasen unterschieden werden können. In 3 sind die Lagen der zehn Mutationsbereiche (Pvu II und Pst I), die von jeder Mutante getragen werden, dargestellt.
Nachdem die Gene der zehn Mutanten mittels PCR amplifiziert worden waren, wurden die PCR-Produkte aufgereinigt und in äquimolarer Menge vermischt, wodurch man zu der Bank gelangte. Die Polynukleotidsequenzen dieser Bank wurden mit Restriktionsenzymen Hinf I und Bsa I so verdaut, daß man Restriktionsfragmentbanken erhielt. Die Restriktionsfragmente wurden dann in unterschiedlichen Mengen mit der Wildmatrize in Gegenwart einer hitzestabilen Ligase inkubiert. Nach mehreren Denaturierungs-/Hybridisierungs-/Ligationszyklen wurde ein Teil dieser Reaktionsmischung für eine PCR-Amplifikation mit einem Primer-Paar, das für das 5'- und das 3'-Ende der Gene der Mutanten spezifisch und für die 5'- und 3'-Enden der Wildmatrize unspezifisch war, verwendet. Das Amplifikationsprodukt wurde kloniert und die erhaltenen Klone wurde auf ihr Verdauungsprofil mit der Restriktionsendonuklease Pvu II bzw. Pst I untersucht. Mit den erhaltenen Profilen konnte bestimmt werden, welche(s) Fragment(e) der Mutanten mit den anderen rekombinieren konnte(n), um wiederum ein vollständiges Gen zu bilden.
II – MATERIAL
1) Stämme und Plasmide
Der Stamm MC1061 (F^– araD139, Δ(ara-leu)₇₆₉₆, gaIE15, gaIK16, Δ(lac) × 74, rpsL(Str^R), mcrA mcrB1, hsdR2 (r_k ^–mk⁺)) stammt von Escherichia coli K12.
Der Vektor pARAPONB stammt von dem Vektor pARA13 (3), in dem das ponB-Gen, das eine Thrombinspaltstelle enthält (9), zwischen die Nco I und Nar I Restriktionsstellen eingeführt wurde. Der Vektor pET26b+ gehört zur pET-Vektorfamilie, die von Studier und Moffatt (13) entwickelt wurde und von der Fa. Novagen im Handel erhältlich ist.
2) Oligonukleotide
Die Oligonukleotide wurden von der Fa. Isoprim (Toulouse) synthetisiert. Die Oligonukleotidsequenzen sind in Tabelle I unten angegeben.
Tabelle I
3) Reaktanten
Die in Tabelle II unten angegebenen Restriktions- und Modifikationsenzyme wurden nach den Herstellerangaben eingesetzt.
Tabelle II
Die verwendeten Puffer sind in Tabelle III unten angeführt.
Tabelle III
III – HERSTELLUNG DER MATRIZE
Das ponB-Wildgen wurde mittels eines PCR-Reaktionsschritts, bei dem die Oligonukleotide M1 und M2 (4) als Primer verwendet wurden, amplifiziert. Es wurden fünf PCR-Reaktionen durchgeführt, wobei man 50 ng des Plasmids pPONBPBR, das das Wildgen trägt (7), zu einer Mischung, die 10 μl Polymerisationspuffer, 10 μl 2mM dNTPs, 20 pmol jedes der Oligonukleotide M1 und M2 sowie 5U Taq DNA-Polymerase enthält, in einem Endvolumen von 100 μl zugibt. Diese Mischungen wurden in einem Thermocycler von Perkin-Elmer, Typ 9600, gemäß folgendem Programm inkubiert: (94°C-2 Min.) – (94°C-15 Sek. – 60°C-30 Sek. – 72°C-1 Min.) × 29 Zyklen – (72°C-3 Min.).
Das Produkt der fünf PCRs wurde gemischt und auf ein 1%iges TBE-Agarosegel aufgetragen. Nach der Wanderung und Anfärbung des Gels mit Ethidiumbromid wurde die 2651 Bp große Bande, die dem Amplifikationsprodukt des ponB-Gens, das von zwei Fragmenten mit einer Größe von 26 Bp und 90 Bp umrahmt war, durch Beleuchtung mit Ultraviolett sichtbar gemacht und mit Hilfe eines Skalpells herausgeschnitten und dann mit dem Quiaquick-System (QIAGEN) auf gereinigt. Die so aufgereinigte Gesamt-DNA wurde mit 120 μl Puffer T eluiert. Die Konzentration dieser DNA wurde spektrophotometrisch bei 260 nm bei einer Konzentration von 100 ng/μl bestimmt.
IV – HERSTELLUNG DER BANK
1) Amplifikation der mutierten Gene
Die Gene von zehn Mutanten wurden getrennt mit Hilfe einer PCR-Reaktion, bei der die Oligonukleotide N und E verwendet wurden, amplifiziert. Diese Oligonukleotide führen die Nco I bzw. Eco RI Restriktionsstellen ein, wodurch die erhaltenen Produkte mit diesen zwei Stellen kloniert werden können.
Jede PCR-Reaktion wurde dadurch durchgeführt, daß man 50 ng des Plasmids, das das mutierte Gen enthält, zu einer Mischung, die 10 μl Polymerisationspuffer, 10 μl 2 mM dNTPs, 20 pmol jedes der Oligonukleotide N und E sowie 5U Taq DNA-Polymerase enthält, in einem Gesamtvolumen von 100 μl zugibt. Diese Mischung wurde in einem Thermocycler von Perkin-Elmer, Typ 9600, gemäß dem folgendem Programm inkubiert: (94°C-2 Min.) – (94°C-15 Sek. – 60°C-30 Sek. – 72°C-1 Min.) × 29 Zyklen – (72°C-3 Min.).
Die Spezifität der Genamplifikation wurde mit Hilfe eines Restriktionsprofils mit der Endonuklease Pvu II überprüft, und zwar dadurch, daß man 5 μl jedes PCR-Produkts eine Stunde lang bei 37°C in einer Mischung, die 3 μl Restriktionspuffer A und 5U des Enzyms Pvu II in einem Endvolumen von 30 μl enthält, inkubierte. 15 μl dieser Verdauungsreaktion wurden auf ein 1%iges TBE-Agarosegel aufgetragen. Nach der Wanderung und Anfärbung mit Ethidiumbromid wurde das Gel mit Ultraviolett belichtet. Durch Sichtbarmachung der Restriktionsfragmente konnte die Spezifität der Genamplifikation von jedem mutierten Gen bestätigt werden.
Parallel dazu wurden 3 μl von jeder PCR-Reaktion auf ein 1%iges TBE-Agarosegel aufgetragen. Nach der Migration wurde das Gel wie oben beschrieben behandelt. Aufgrund der Intensität von jeder Bande konnte man abschätzen, daß die Genamplifikationen in gleicher Ausbeute vorlagen.
2) ERZEUGUNG VON RESTRIKTIONSFRAGMENTBANKEN
50 μl von jedem der zehn PCR wurden vermischt und auf ein 1%iges TBE-Agarosegel aufgetragen. Nach der Wanderung und Anfärbung mit Ethidiumbromid wurde die 2572 Bp große Bande, die dem Amplifikationsprodukt der Gene der zehn Mutanten entsprach, mit Hilfe eines Skalpells herausgeschnitten und mit dem Quiaquick-System (QIAGEN) auf gereinigt. Die so aufgereinigte Gesamt-DNA wurde mit 120 μl Puffer T eluiert. Die Konzentration dieser DNA wurde spektrophotometrisch bei 260 nm und einer Konzentration von 100 ng/μl ausgewertet.
Zur Erzeugung der Restriktionsfragmentbanken wurden 100 μl dieser DNA eine Stunde lang bei 50°C in einer Mischung, die 12 μl Restriktionspuffer B, 1,2 μl BSA (mit einer Konzentration von 10 mg/ml), 25 U des Enzyms Bsa I und 4 μl Wasser enthielt, inkubiert. Anschließend wurde die Mischung mit 2 μl Restriktionspuffer B, 2 μl BSA (mit einer Konzentration von 1 mg/ml), 50 U des Enzyms Hinf I und 11,5 μl Wasser versetzt und eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Die Gesamtverdauungsmischung wurde auf einer Quiaquick-Säule (QIAGEN) aufgereinigt und mit 30 μl Puffer T eluiert. 1 μl dieses Eluats wurde auf ein 1%iges TBE-Agarosegel aufgetragen, um zu überprüfen, daß die Verdauung vollständig war und daß dadurch sechs Restriktionsfragmente, und daher sechs Fragmentbanken, mit einer Größe von 590 Bp, 500 Bp, 472 Bp, 438 Bp, 298 Bp und 274 Bp erzeugt worden waren. Die Konzentration dieser DNA wurde (spektrophotometrisch bei 260 nm) bei einer Konzentration von 520 ng/μl ausgewertet.
V – RLR (Recombinating Ligation Reaction)
Die RLR (Recombinating Ligation Reaction) -Reaktion wurde dadurch durchgeführt, daß man bestimmte Mengen Hinf I – Bsa I -Restriktionsfragmente der Gene der zehn Mutanten mit der vollständigen Matrize (also dem ponB-Wildgen) in Gegenwart einer hitzestabilen DNA-Ligase inkubierte. Die Zusammensetzung der RLR-Mischungen ist in Tabelle IV unten angegeben.
Tabelle IV
Die Negativkontrolle ist mit der RLR4-Reaktion identisch, enthält jedoch keine hitzestabile DNA-Ligase. Diese unterschiedlichen Mischungen wurden mit einem Tropfen Mineralöl bedeckt und in einem Thermocycler von Perkin-Elmer, Typ 9600, in 200 μl-Hütchen nach dem folgendem Programm inkubiert: (94°C-5 Min.) – (94°C-1 Min. – 65°C-4 Min.) × 35 Zyklen.
10 μl jeder RLR-Reaktion wurden anschließend zu einer PCR-Reaktionsmischung, die 10 μl Polymerisationspuffer, 10 μl 2 mM dNTPs, 40 pmol jedes der Oligonukleotide A1 und A2 sowie 5U Taq DNA-Polymerase enthielt, in einem Endvolumen von 100 μl zugegeben. Diese Mischung wurde in einem Thermocycler von Perkin-Elmer, Typ 9600, nach dem folgenden Programm inkubiert: (94°C-5 Min.) – (94°C-30 Sek. – 46°C-30 Sek. – 72°C-1 Min.) × 29 Zyklen – (72°C-2 Min.). Mit Hilfe dieser PCR-Reaktion konnten spezifisch die während der RLR-Reaktion gebildeten Reaktionsprodukte amplifiziert werden, ohne daß die Matrize amplifiziert wurde, da die Oligonukleotide A1 und A2, wie in 4 dargestellt, nicht an diese hybridisieren können.
5 μl jeder RLR-Reaktion und 10 μl jeder der vorhergehenden RLR-Reaktionen wurden auf ein 1%iges TBE-Agarosegel aufgetragen. Nach Anfärbung mit Ethidiumbromid wurde das Gel, wie in 5 dargestellt, mit Ultraviolett bestrahlt.
Aus der Analyse dieses Gels geht hervor, daß nur die RLR4-Reaktion als Negativkontrolle noch sichtbare Restriktionsfragmente enthält (Bahn 4 und 5).
Die Abwesenheit von PCR-Produkt bei der Negativkontrolle (Bahn 10) zeigt nicht nur, daß die PCR-Reaktion spezifisch ist (keine Amplifikation der vollständigen Matrize), sondern auch, daß die in der Mischung vorliegenden Restriktionsfragmente nicht die Primer ersetzen können, um unter den gewählten Bedingungen ein kontaminierendes PCR-Produkt zu erzeugen.
Parallel dazu zeigt das Vorhandensein einer einzigen Bande bei ungefähr 2500 Bp in Bahn 6, 7 und 8, daß für die RLR-Reaktionen 1, 2 und 3 ein RLR-Produkt mittels PCR amplifiziert werden konnte. Mit diesen drei RLR-Reaktionen konnte(n) daher ausgehend von sechs Restriktionsfragmentbanken wieder ein oder mehrere vollständige(s) Gen(e) hergestellt werden.
VI – ANALYSE DER AMPLIFIKATIONSPRODUKTE DER RLR-REAKTIONEN
1) Klonierung
Die PCR-Amplifikationsprodukte der RLR-Reaktionen 1, 2 und 3 wurden mit dem System von Wizard PCR Preps (Promega) aufgereinigt und mit 45 μl Puffer T eluiert. 6 μl jeder aufgereinigten PCR wurde eine Stunde lang bei 37°C in einer Mischung, die 3 μl Restriktionspuffer C, 3 μl BSA (mit einer Konzentration von 1 mg/ml), 20 U des Enzyms Eco RI, 10 U des Enzyms Nco I und 15 μl Wasser enthielt, inkubiert.
Parallel dazu wurden zwei Vektoren (pARAPONB und pET26b+) für die Klonierung vorbereitet. Diese Vektoren wurden dadurch linearisiert, daß man 3 μg der Plasmide zwei Stunden lang bei 37°C in einer Mischung, die 3 μl Restriktionspuffer C, 3 μl BSA (mit einer Konzentration von 1 mg/ml), 20 U des Enzyms Eco RI, 10 U des Enzyms Nco I und 19 μl Wasser enthielt, inkubierte.
Die linearisierten Vektoren sowie die verdauten PCR-Ansätze wurden auf einem 1%igen TBE-Agarosegel mit dem QIAquick-System (QUIAGEN) aufgereinigt. Jeder Vektor bzw. jedes verdaute PCR-Produkt wurde mit 30 μl Puffer T eluiert.
Die Ligation jedes verdauten PCR-Produkts mit einem der beiden Vektoren wurde unter den in Tabelle V unten beschriebenen Bedingungen durchgeführt, und dann wurde 16 Stunden lang bei 16°C inkubiert.
Tabelle V
200 μl chemisch kompetente MC1061-Zellen (4) wurden mittels Hitzeschock (5) mit 10 μl jedes Ligationsansatzes transformiert und die so transformierten Zellen wurden auf einem Selektionsmedium ausplattiert.
Nach Transformation der Ligationskontrollen TLpAR und TLpET wurde kein einziger Klon erhalten, was zeigt, daß die mit Nco I – Eco RI linearisierten Vektoren pARAPONB und pET26b+ nicht intramolekular ligieren können.
2) Durchmusterung mittels PCR
Es wurde eine erste Durchmusterung der nach Transformation der Ligationsprodukte mit dem Vektor pARAPONB erhaltenen Klone mittels PCR durchgeführt. 42 Kolonien, und zwar 14 von jeder Ligation LpAR1, LpAR2 und LpAR3, wurden einzeln in einer PCR-Mischung, die 5 μl Polymerisationspuffer, 40 pmol der Oligonukleotide A1 und A2, 5 μl 2 mM dNTPs und 5U Taq DNA-Polymerase enthielt, in einem Endvolumen von 50 μl suspendiert. Durch Zugeben von 50 ng des Plasmids pBR322 anstelle einer Kolonie zu der PCR-Mischung schuf man eine Negativkontrolle. Diese 43 Röhrchen wurden in einem Thermocycler von Perkin-Elmer, Typ 9600, gemäß dem folgenden Programm inkubiert: (94°C-5 Min.) – (94°C-30 Sek. – 46°C-30 Sek. – 72°C-1 Min.) × 29 Zyklen – (72°C-2 Min.). 5 μl jeder dieser PCR-Reaktionen wurden anschließend eine Stunde lang bei 37°C in einer Mischung, die 2 μl Restriktionspuffer A, 2 μl BSA (mit einer Konzentration von 1 mg/ml) und 5 U des Restriktionsenzyms Pvu II enthielt, in einem Endvolumen von 20 μl inkubiert.
10 μl jedes dieser Verdaue sowie parallel dazu 5 μl jedes nichtverdauten PCR-Produkts wurden auf ein 1%iges TBE-Agarosegel aufgetragen (wodurch sich vermeiden läßt, daß gegebenenfalls vorhandene unspezifische Banden der PCR mit einem durch Restriktionsverdauung erhaltenen Fragment verwechselt werden). Nach Migration und Anfärbung dieses Gels mit Ethidiumbromid wurden die durch Verdauung mit dem Enzym Pvu II erhaltenen Banden analysiert, um zu bestimmen, welche(s) Fragment(e) der ursprünglichen Mutanten mit den anderen unter Wiederbildung eines ganzen Gens reassoziiert hatte(n). Diese Durchmusterung zeigt, daß 27 Gene, die eine Mutation tragen, 7 Gene, die zwei Mutationen tragen und 8 Gene, die keine Mutation tragen, vorhanden sind.
3) Durchmusterung mittels Miniprep der Plasmid-DNA
Die zweite Durchmusterung wurde dadurch durchgeführt, daß man von 21 Klonen aus der Transformation der Ligationsprodukte mit dem Vektor peT26b+ (7 Klone von jeder Ligation) die Plasmid-DNA extrahierte (5). 5 μl von so für jeden Klon erhaltener Plasmid-DNA wurden eine Stunde lang bei 37°C in Gegenwart einer Mischung, die 1 μl Restriktionspuffer C, 6 U Enzym Pst I, 3 U Enzym Nco I und 6 U Enzym Eco I enthielt, in einem Endvolumen von 10 μl inkubiert. 5 μl jeder dieser Verdaue wurde auf ein 1%iges TBE-Agarosegel aufgetragen. Nach Migration und Anfärbung dieses Gels mit Ethidiumbromid wurden die durch Verdauung mit dem Enzym Pst I erhaltenen Banden analysiert, um zu bestimmen, welche(s) Fragment(e) der ursprünglichen Mutanten mit den anderen unter Wiederbildung eines ganzen Gens reassoziiert hatte(n). Diese Durchmusterung zeigt, daß 13 Gene, die eine Mutation tragen, 5 Gene, die zwei Mutationen tragen und 3 Gene, die keine Mutation tragen, vorhanden sind.
4) Statistische Analyse der Rekombinationen
In Abhängigkeit der Lage von jeder Mutation in Bezug auf die Spaltstellen der Enzyme Hinf I und Bsa I, wie dies in 6 dargestellt ist, kann die Wahrscheinlichkeit, während der RLR-Reaktion ein Gen mit 0, 1, 2, 3 bzw. 4 der Mutationen der ursprünglichen Gene zu erhalten, berechnet werden.
Angesichts der Tatsache, daß die RLR-Reaktion völlig zufallsmäßig verläuft, lauten die Möglichkeiten P:
Mit den beiden durchgeführten Durchmusterungen gelangt man zu Ergebnissen, die den statistischen Vorhersagen ähnlich sind, wie aus Tabelle 6 unten hervorgeht, was anzeigt, daß RLR-Reaktion praktisch zufallsmäßig verläuft. Es wird beobachtet, daß ein etwas höherer Anteil von Genen, die eine Mutation tragen und ein etwas geringerer Anteil von Genen, die null Mutation tragen, vorliegt. Dies könnte auf eine bereits beobachtete schwache Toxizität des PonB-Gens und den leichten Verlust der Expressionsvektoren pARAPONB und pET26b+ zurückgeführt werden, was die Selektion von Genen, die eine inaktivierende Mutation tragen, begünstigen würde.
Tabelle VI
LITERATURHINWEISE

1) Broome-Smith J. K., Edelman A., Yousif S. und Spratt B. G., (1985), The nucleotide sequence of the ponA and ponB genes encoding penicillinbinding proteins 1A and 1B of Escherichia coli K12, Eur. J. Biochem., 147, 437–446.
2) Cadwell R. C. und Joyce G., 1992, Randomization of genes by PCR mutagenesis, PCR Methods and Application, 2, 28–33.
3) Cagnon C., Valaverde V. und Masson J.-M., (1991), A new family of sugar inductible expression vectors for Escherichia coli, Prot. Eng., 4, 843–847.
4) Hanahan D., (1985), Techniques for transformation of Escherichia coli, dans DNA cloning: a practical approach, Glover D. M. (Ed), IRL Press, Oxford Band I, 109–135.
5) Maniatis T., Fristch E. F. und Sambrook J., (1982), Molecular cloning. A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
6) Landt et al., Gene, 96, 125–128, 1990.
7) Lefèvre F., Analyse topologique de la Penicillin Binding Protein 1b d'Escherichia coli, 1997, Dissertation.
8) Lefèvre F., Rèmy M. H. und Masson J. M., 1997 (a), Alanine-stretch scanning mutagenesis: a simple and efficient method to probe protein structure and function, Nuc. Acids Res., 25, 447–448.
9) Lefèvre F., Rèemy M. H. and Masson J. M., 1997 (b), Topographical and functional investigation of Escherichia coli Penicillin Binding Protein 1b by alanine stretch scanning mutagenesis, J. Bacteriol., 179, 4761–4767.
10) Lyamichev V., Mast A. L., Prudent J. R., Kaiser M. W., Takova T., Kwiatkowski R. W., Sander T. J., de Arruda M., Arco D. A., Neri B. P. and Brown M. A. D., 1999, Polymorphism identification and quantitative detection of genomic DNA by invasive cleavage of oligonucleotide probes, Nature Biotechnology, 17, 292–296.
11) Picard et al., Nuc. Acids Res., 22, 2587–2591, 1994.
12) Stemmer W. P. C., (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature, 370, 141–144.
13) Studier F. W. and Moffatt B. A., 1986, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol, 189, 113–130.
14) Zhao H., Giver L., Shao Z., Affholter J. A. and Arnold F., 1998, Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination, Nature Biotech., 16, 258–261.

Claims

Verfahren zur aleatorischen In-vitro-Rekombination von Nukleinsäurefragmenten, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: a) die Fragmentierung einer Polynukleotidsequenzbank b) die Hybridisierung der hergestellten Fragmente auf einer Verbindungsmatrize c) die Ligation der hybridisierten Fragmente, die benachbarte Enden besitzen, mit Hilfe einer Ligase d) die Denaturierung der ligierten Fragmente der Verbindungsmatrize, und die Wiederholung der Schritte Hybridisierung (b), Ligation (c) und Denaturierung (d), um mehrere aleatorische Rekombinierten zu bilden, wobei dieses Verfahren weiterhin dadurch gekennzeichnet ist, daß die Schritte (a) bis (d) ohne Polymerase durchgeführt werden.
Verfahren zur aleatorischen In-vitro-Rekombination von Nukleinsäurefragmenten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ist, daß es weiterhin folgenden Schritt umfaßt e) die Selektion von rekombinierten Polynukleotidsequenzen, die in Bezug auf Eigenschaften, die einer oder mehreren Referenzsequenzen entsprechen, vorteilhafte Eigenschaften aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die Trennung der rekombinierten Polynukleotidsequenzen von der oder den Verbindungsmatrize(n) vor Schritt (e) umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß es die Amplifikation der doppelsträngigen Polynukleotidsequenzen vor Schritt (e) umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es vor Schritt (e) die Klonierung von rekombinierten Polynukleotidsequenzen eventuell nach Trennung der rekombinierten Stränge von der oder den Matrize(n) und Herstellung des entsprechenden Doppelstrangs umfaßt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Enden der in Schritt (a) generierten Fragmente derart sind, daß dort eine benachbarte Hybridisierung dieser Enden auf der oder den Verbindungsmatrize(n) in Schritt (b) und Ligation dieser Fragmente miteinander in Schritt (c) stattfinden kann.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynukleotidsequenzen der Bank entweder untereinander oder mit den Verbindungsmatrizen Homologiebereiche aufweisen, sodaß in Schritt (a) Fragmentenden erzeugt werden, welche die benachbarte Hybridisierung dieser Enden auf der oder den Verbindungsmatrize(n) in Schritt (b) und Ligation dieser Fragmente miteinander in Schritt (c) ermöglichen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte (b) und (c) gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fragmentierung der Polynukleotidsequenzen in Schritt (a) kontrolliert und aleatorisch erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (a) darin besteht, die Polynukleotidsequenzen der Bank einer Hydrolyse durch Einwirkung eines oder mehrerer Restriktionsenzyme zu unterwerfen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Rekombinationsgrad und die Position der Rekombinationspunkte der rekombinierten Polynukleotidsequenzen von der Fragmentierung in Schritt (a) bestimmt werden, wenn diese kontrolliert durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die aleatorische Fragmentierung der Polynukleotidsequenzen in Schritt (a) durch alle bekannten enzymatischen oder mechanischen Mittel erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in einem oder mehreren der Schritte (b) bis (d) Enzyme hinzugefügt werden, die in der Lage sind, die nichthybridisierten Enden der Fragmente zu erkennen und spezifisch abzutrennen, wenn diese Enden andere hybridisierte Fragmente auf derselben Matrize überdecken.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem oder mehreren der Schritte (b) bis (d) das Enzym Flap-Endonuklease hinzugefügt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt (c) eine bei hoher Temperatur aktive und vorzugsweise hitzebeständige Ligase verwendet wird.
Verfahren nach den Ansprüchen 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Endonukleasen, welche die nichthybridisierten Enden in einem oder mehreren der Schritte (b) bis (d) hinzugefügten Fragmente erkennen und spezifisch abtrennen können, dieselben Eigenschaften im Hinblick auf Temperaturbeständigkeit und Aktivität bei hoher Temperatur haben wie die in Schritt (c) verwendete Ligase.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die für die Fragmentierungsschritt (a) verwendete Polynukleotidsequenzbank von mehreren Genen gebildet wird, die durch Mutagenese aus einem Gen oder durch Kombination von Genen von Familien erzeugt wurden, die innerhalb derselben Art oder unterschiedlicher Arten verwandt sind oder sich unterscheiden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynukleotidsequenzen der für Fragmentierungsschritt (a) verwendeten Bank untereinander Homologiebereiche aufweisen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bank doppelsträngiger Polynukleotidsequenzen von synthetischen Sequenzen gebildet wird, die in Schritt (a) fragmentiert werden oder welche die Fragmente in Schritt (a) bilden können.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (a) darin besteht, die Bank einer Hydrolyse durch Einwirkung von Restriktionsenzymen mit einer großen Anzahl von Schnittstellen auf den Polynukleotidsequenzen der Bank oder durch Kombination mehrerer Restriktionsenzyme auszusetzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (a) in einer aleatorischen Behandlung einer Bank doppelsträngiger, teilweise heterologer Polynukleotidsequenzen mit der DNAse I besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß die durch eine Behandlung erzeugten Fragmente für die Hybridation während Schritt (b) oder der Reaktion der simultanen Schritte (b) und (c) füreinander aleatorisch als Matrizen verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 20, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (b) durch Kombination von mindestens zwei unterschiedlichen Fragmentbänken durchgeführt wird, die separat in Schritt (a) aus derselben Bank durch eine Behandlung mit verschiedenen Restriktionsenzymen hergestellt wurden.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt (a) durch eine Behandlung mit Restriktionsenzymen erzeugten Fragmente für die Hybridation während Schritt (b) oder der Reaktion der simultanen Schritte (b) und (c) füreinander als Matrizen verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, 11, 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Fragmente von Schritt (a) durch Amplifikationsreaktionen hergestellt werden, die auf den Polynukleotidsequenzen der Bank durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikationsreaktionen mit Primer-Oligonukleotiden durchgeführt werden, die Fragmente erzeugen können, deren Enden über die gesamte Verbindungssequenz benachbart sind.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikationsreaktionen mit Primer-Oligonukleotiden durchgeführt werden, die Fragmente mit gemeinsamen Sequenzen erzeugen können, wobei diese Fragmente in Schritt (b) füreinander als Verbindungsmatrize dienen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Bank in Schritt (a) in n Fragmente fragmentiert wird, wobei n größer oder gleich drei ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, 23, 25 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungsmatrize in Schritt (b) oder (c) eine Polynukleotidsequenz ist, die aus der Bank hervorgegangen ist, oder eine einsträngige oder doppelsträngige Konsensussequenz dieser Bank.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, 23, 25 bis 28 dadurch gekennzeichnet, daß als Verbindungsmatrize in Schritt (b) oder (c) einsträngige oder doppelsträngige Oligonukleotide verwendet werden, die zum Ende 3' eines Fragments und 5' des benachbarten Fragments genau komplementär sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt (b) zusätzlich zur Matrize einsträngige oder doppelsträngige Oligonukleotide variabler Länge hinzufügt.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die rekombinierten Polynukleotidsequenzen vor dem Schritt (e) von der Verbindungsmatrize mit einem Marker getrennt werden, der auf der Verbindungsmatrize oder auf den rekombinierten Polynukleotidsequenzen vorhanden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt (d) hergestellten und eventuell geklonten rekombinierten Polynukleotidsequenzen durch jedwedes geeignete Mittel sortiert werden, um die rekombinierten Polynukleotidsequenzen oder Klone auszuwählen, die in Bezug zu den entsprechenden Eigenschaften von Referenzsequenzen vorteilhaften Eigenschaften aufweisen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynukleotidsequenzbank von einer oder mehreren Banken gebildet wird, die von einem verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33 erzeugt wurden, eventuell gemischt mit anderen Polynukleotidsequenzen.
Anwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Auswahl einer rekombinierten Polynukleotidsequenz, die in Bezug zu den entsprechenden Eigenschaften von Referenzsequenzen vorteilhaften Eigenschaften aufweist.
Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 34 zur Auswahl einer rekombinierten Polynukleotidsequenz, die in Bezug zu den entsprechenden Eigenschaften von Referenzsequenzen vorteilhaften Eigenschaften aufweist.
Anwendung einer Ligase und der Hybridisierung auf eine Matrize zur Verbindung von Fragmenten. die aus einer Polynukleotidsequenzbank in einem Rekombinationsverfahren hergestellt wurden, um mehrere aleatorische rekombinierte Fragmente herzustellen.
Anwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Rekombination keinen In-vitro-Polymerisationsschritt benötigt.
Anwendung nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Polynukleotidsequenzbank aus einem Gen durch eine Mutagenesetechnik oder durch Kombination von Genen erzeugt wird, die innerhalb derselben Art oder verschiedener Arten verwandt sind oder sich unterscheiden.
Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 34 zur Auswahl einer aleatorisch rekombinierten, für ein neues therapeutisches Molekül kodierenden Polynukleotidsequenz.