DE60202478T3 - Verfahren zur herstellung von polynukleotidvarianten - Google Patents

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Description

  • Proteinkonstruktionstechnologie umfasst die Erzeugung neuer Proteine durch eine oder mehrere zielgerichtete Modifikationen bekannter Proteine. Ein auf eine zielgerichtete Modifikation gerichteter Ansatz ist jedoch nur auf Proteine oder Proteinfamilien anwendbar, von denen die dreidimensionale Struktur des Proteins oder mindestens eines der Familie angehörigen Proteins bestimmt worden ist. Weiterhin haben viele Versuche, die Eigenschaften von Enzymen durch diesen Ansatz zu verändern, versagt, da unerwartete Veränderungen in der Struktur eingeführt wurden. Wenn zufällige (random) Mutagenese angewandt wird, um modifizierte Proteine zu erzeugen, stellte sich heraus, dass erfolgreich modifizierte Proteine oftmals Aminosäuresubstitutionen in Regionen aufwiesen, welche durch Proteinmodellieren nicht vorhergesagt werden konnten.
  • Es sind verschiedene Ansätze entwickelt worden, um die Rekombinationsstrategie der Natur, die Evolution von Proteinen zu vorteilhafteren Molekülen zu dirigieren, nachzuahmen und zu beschleunigen. Direkte Evolution ist ein allgemeiner Ausdruck, der für Methoden zur zufälligen in vitro oder in vivo homologen Rekombination von Pools homologer Polynucleotide verwendet wird. Verschiedene Formate sind beschrieben, beispielsweise zufällige Fragmentierung, gefolgt von Polymerase-gestützter Reassemblierung ( WO 9522625 ), in vivo Rekombination ( WO 97/07205 , WO 98/31837 ) oder gestaffelte Extension einer Population von Polynucleotidtemplaten ( WO 97/07205 , WO 98/01581 ). Auf diese Weise kann eine Akkumulation günstiger Mutationen in einem Molekül erreicht werden.
  • Die Methode der vorliegenden Erfindung ermöglicht vorteilhaft, die Mutagenese eines Polynucleotids und die zufällige Kombination von mutierten Positionen in einem Verfahren durchzuführen, ohne die Notwendigkeit einer vorausgehenden Fragmentierung des Polynucleotids.
  • Die Methode ist reproduzierbar, in hohem Maße steuerbar und sehr schnell. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Methode besteht darin, dass die Rekombinationshäufigkeit hoch ist und die Wahrscheinlichkeit, das Ausgangspolynucleotid erneut zu isolieren, gering ist.
  • Ausführliche Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines varianten Polynucleotids bereit.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die folgenden Stufen:
    eine Population von Polynucleotiden wird zwei oder mehr getrennten PCR's unterworfen, wobei jede getrennte PCR Folgendes umfasst: eine erste PCR mit einem mutationsspezifischen Vorwärts-Primer für eine zu mutierende Position und einem reversen universellen Primer, eine zweite PCR mit einem universellen Vorwärts-Primer und einem mutationsspezifischen reversen Primer für eine zu mutierende Position, und gegebenenfalls eine dritte oder weitere PCR mit einem geeigneten Vorwärts-Primer und reversen Primer,
    die Produkte von zwei oder mehr PCR's werden durch eine Polymerase getrennten zusammengesetzt,
    die zusammengesetzten Polynucleotide werden gegebenenfalls amplifiziert,
    eine Bibliothek der erhaltenen varianten Polynucleotide wird hergestellt,
    die Bibliothek von varianten Polynucleotiden wird auf ein variantes Polynucleotid mit einer gewünschten Eigenschaft abgesucht.
  • Ein variantes Polynucleotid ist hierin definiert als ein Polynucleotid, das sich an mindestens einer Position von jedem der Mitglieder der Population von Polynucleotiden, welche das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren bildet, unterscheidet.
  • Die Population von Polynucleotiden, welche das Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren bildet, umfasst Polynucleotidmitglieder, die eine wesentliche Homologie zueinander aufweisen. Eine wesentliche Homologie ist hierin definiert als eine Homologie von 70–100%, vorzugsweise von 75–100%, vorzugsweise von 80–100%, vorzugsweise von 85–100%, insbesondere von 90–100% und ganz besonders von 95–100%. Eine Population von Polynucleotiden, welche Polynucleotidmitglieder umfasst, die eine wesentliche Homologie zueinander aufweisen, kann beispielsweise eine Population von Polynucleotiden sein, bei der die Polynucleotidmitglieder identische Polynucleotide sind und/oder Mutanten eines parentalen Polynucleotids sind und/oder Mitglieder einer Genfamilie sind.
  • Eine Population von Polynucleotiden kann beispielsweise eine Population von Polynucleotiden sein, die für ein Wildtyp-Polypeptid kodieren.
  • Eine Population von Mutanten, welche von einem parentalen Polynucleotid abgeleitet sind, kann unterschiedliche Mutanten umfassen, wobei jeder individuelle Mutant in der Population sich an mindestens einer Position von dem parentalen Polynucleotid unterscheidet. Eine Population von unterschiedlichen Mutanten, die von einem parentalen Polynucleotid abgeleitet sind, kann durch Verfahren erhalten werden, die in der Technik bekannt sind. Beispielsweise können die Mutanten durch klassische, zufällige oder stellengerichtete Mutagenesetechniken erhalten werden. Eine geeignete zufällige Mutagenesetechnik ist beispielsweise die fehleranfällige PCR-Technik.
  • Die Population von Mutanten kann Mutanten umfassen, die zuvor gescreent worden und aufgrund einer gewünschten Eigenschaft ausgewählt worden sind.
  • Eine Population von Mitgliedern einer Genfamilie enthält typischerweise unterschiedliche Mitglieder einer Genfamilie, d. h. Polynucleotide, welche eine beträchtliche Sequenzhomologie aufweisen, d. h. mindestens 70%, und eine ähnliche Funktion in einem Organismus haben. Derartige Polynucleotide können beispielsweise für verwandte Proteine kodieren, die aus unterschiedlichen Stämmen, unterschiedlichen Spezies, unterschiedlichen Gattungen, unterschiedlichen Familien stammen. Ein Beispiel ist die Phytase-Genfamilie aus der Gattung Aspergillus, welche eine Homologie von mindestens 90% innerhalb der Spezies Aspergillus niger aufweist.
  • Die Ausgangspopulation von Polynucleotiden kann dem erfindungsgemäßen Verfahren günstig unterworfen werden, wenn sie in einem Vektor kloniert und/oder als isolierte Fragmente vorliegt. In einer Situation, bei der die Ausgangspopulation von Polynucleotiden durch ein vorangehendes Screening- und Selektionsverfahren erhalten wird, kann der Vektor günstig ein Expressionsvektor sein.
  • Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Ausgangspopulation von Polynucleotiden zwei oder mehr getrennten Polymerasekettenreaktionen (PCR's) unterworfen, wobei jede getrennte PCR eine erste PCR mit einem mutationsspezifischen Vorwärts-Primer für eine zu mutierende Position und einem reversen universellen Primer, eine zweite PCR mit einem universellen Vorwärts-Primer und einem mutationsspezifischen reversen Primer für eine zu mutierende Position, und gegebenenfalls eine dritte oder weitere PCR mit einem geeigneten Vorwärts-Primer und reversen Primer umfasst.
  • Die erste PCR erzeugt Fragmente mit einem gemeinsamen 3'-Ende und unterschiedlichen 5'-Enden, wobei das 5'-Ende durch die Position des mutationsspezifischen Vorwärts-Primers innerhalb der Sequenz des Ausgangspolynucleotids bestimmt wird. Die zweite PCR erzeugt Fragmente mit einem gemeinsamen 5'-Ende und unterschiedlichen 3'-Enden, wobei das 3'-Ende durch die Position des mutationsspezifischen reversen Primers innerhalb der Sequenz des Ausgangspolynucleotids bestimmt wird.
  • Die dritte oder weitere PCR kann Fragmente erzeugen, die beispielsweise innerhalb der in der ersten und zweiten PCR erzeugten Fragmente positioniert sind. Eine dritte oder weitere PCR kann beispielsweise angewandt werden, wenn die Ausgangspopulation von Polynucleotiden Mitglieder umfasst, deren Größe derart ist, so dass die Anwendung der zwei PCR's zu einer ungünstig niedrigen Ausbeute des zusammengesetzten Volllängenprodukts nach der Zusammensetz-PCR (Fusions-PCR) führt. Geeignete Vorwärts-Primer und reverse Primer für die dritte oder weitere PCR werden derart ausgewählt, so dass das bzw. die resultierenden PCR-Produkte mit den angrenzenden 5'- und 3'-Fragmenten überlappen. Die für die dritte oder weitere PCR geeigneten Primer können eine mutierte Position enthalten.
  • Vorzugsweise hat jeder mutationsspezifische Vorwärts-Primer einen entsprechenden mutationsspezifischen reversen Primer, d. h. es werden Sätze von mutationsspezifischen Vorwärts-Primern und reversen Primern konstruiert, die auf die gleiche Nucleotidposition bzw. die gleichen Nucleotidpositionen innerhalb eines Polynucleotidmitglieds der Ausgangspopulation von Polynucleotiden gerichtet sind.
  • Es wird eine Serie von zwei oder mehr getrennten PCR's durchgeführt, unter Verwendung eines Satzes von Vorwärts- und entsprechendem mutationsspezifischen reversen Primer pro getrennter PCR, was zu einer Serie von getrennten PCR-Produkten führt.
  • Der mutationsspezifische Vorwärts-Primer ist derart konstruiert, so dass sich mindestens eine Position innerhalb des Primers von der entsprechenden Nucleotidposition innerhalb eines Mitglieds der Ausgangspopulation von Polynucleotiden unterscheidet. Diese Position bzw. diese Positionen werden als die mutierte Position bzw. die mutierten Positionen bezeichnet. Die mutierte Position bzw. die mutierten Positionen innerhalb des Primer ist bzw. sind typischerweise mindestens ein Nucleotid vom Ende des Primers lokalisiert. Die Anzahl an mutierten Positionen pro Primer und die Länge des Primers sind für die Erfindung nicht kritisch und können zweckmäßig fallweise bestimmt werden. Die Anzahl an mutierten Positionen pro Primer kann beispielsweise von der Länge des Primers abhängen, während die Länge des Primers von dem verwendeten Typ an Primer (z. B. gesättigt oder ”spiked”) abhängen kann.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung sind ein mutationsspezifischer Primer bzw. eine Serie von mutationsspezifischen Primern derart konstruiert, so dass eine mutierte Position in einem Primer einer ausgewählten Position in einem Mitglied der Ausgangspopulation von Polynucleotiden entspricht, z. B. einer Position, die nachgewiesenermaßen eine effektive Mutation ist.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung sind ein mutationsspezifischer Primer bzw. eine Serie von mutationsspezifischen Primern derart konstruiert, so dass der bzw. die Primer das Einführen von Mutationen innerhalb der Ausgangspopulation von Polynucleotiden an zufälligen Positionen gewährleisten.
  • In einer nochmals anderen Ausführungsform der Erfindung ist der mutationsspezifische Primer ein gesättigter Primer, d. h. ein Primer, welcher konstruiert ist, um geänderte Nucleotide in einem für eine Aminosäure kodierenden Triplett einzuführen, so dass mehr als eine Aminosäuresubstitution an einer besonderen Position in dem Polypeptid, welches von dem zu modifizierenden Polynucleotid kodiert wird, eingeführt wird. Vorzugsweise ist ein gesättigter Primer derart konstruiert, so dass eine Substitution einer Aminosäure nach Wahl durch jede der 19 anderen Aminosäuren, die natürlicherweise in einem Protein vorkommen, möglich ist. Ein gesättigter Primer hat typischerweise eine Länge von etwa 18–30 Nucleotiden. Ein gesättigter Primer umfasst effektiv ein Gemisch von individuellen Oligonucleotiden, wobei jedes individuelle Oligonucleotid die Substitution einer ausgewählten Aminosäure durch jede der anderen Aminosäuren ermöglicht.
  • In einer nochmals anderen Ausführungsform der Erfindung ist der mutationsspezifische Primer ein ”spiked” Primer (oder ein ”spiked” Oligonucleotid). Ein ”spiked” Oligonucleotid enthält pro zu mutierendem Nucleotid, beispielsweise einem Nucleotid innerhalb eines Codons, eine Mehrzahl des ursprünglichen Nucleotids und eine Minderzahl des zu substituierenden Nucleotids. Ein geeigneter Prozentanteil für die Mehrzahl des ursprünglichen Nucleotids ist 80–99%. Die Länge eines ”spiked” Oligonucleotids kann von der Länge des zu mutierenden Polynucleotids und/oder der Anzahl an gewünschten Mutationen abhängen. Es ist günstig, dass an den Enden eines ”spiked” Oligonucleotids mindestens zwei Nucleotide 100% zu der ursprünglichen Nucleotidsequenz ähnlich sind, d. h. nicht mutiert sind.
  • Beispielsweise wird ein Oligonucleotid von 55 Nucleotiden, das 5 Nucleotide an beiden Enden enthält, die nicht mutiert sind, und über die restlichen 45 Nucleotide mit einem Prozentanteil von 4,5% ”gespiked” ist, etwa zwei Substitutionen pro Oligonucleotid ergeben.
  • Der Fachmann ist natürlich sehr wohl in der Lage, alle der vorstehend ausgeführten Ausführungsformen zu kombinieren, falls gewünscht.
  • Die universellen Primer, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, können gegen den Vektor und/oder das zu verwendende Polynucleotid gerichtet sein. Vorzugsweise enthalten die universellen Primer eine einzigartige Restriktionsenzymstelle, welche die Klonierung der resultierenden varianten Polynucleotide in einem geeigneten Vektor ermöglicht.
  • Erfindungsgemäß werden die Produkte von zwei oder mehr getrennten PCR's gemischt, vorzugsweise in äquimolaren Mengen, und durch eine Polymerase in einer so genannten Zusammensetz-PCR oder Fusions-PCR zusammengesetzt. Dem Zusammensetzreaktionsgemisch kann gegebenenfalls zusätzlicher universeller Vorwärts-Primer und reverser Primer zugegeben werden, um die zusammengesetzten Polynucleotide mittels PCR gleichzeitig zu amplifizieren.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Serie von getrennten PCR-Produkten, welche aus einer Serie von zwei oder mehr getrennten PCR's erhalten wurden, durch eine Polymerase in einem Röhrchen zusammengesetzt, in anderen Worten einer Fusions-PCR in einem Röhrchen unterworfen. Vorzugsweise werden die getrennten PCR-Produkte in äquimolaren Mengen gemischt.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird die Serie von getrennten PCR-Produkten, welche aus einer Serie von zwei oder mehr getrennten PCR's erhalten wurden, getrennt durch eine Polymerase zusammengesetzt, in anderen Worten getrennten Fusions-PCR's unterworfen.
  • In einer Situation, in der Mutationen nur an dem bzw. den Enden eines Polynucleotids erwünscht sind, könnte es eine Option sein, eine PCR anzuwenden, welche die zwei oder mehr PCR's und die Fusions-PCR effektiv in einer Reaktion kombiniert.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht vorteilhaft die Mutagenese eines Polynucleotids und die zufällige Kombination von mutierten Positionen in einem Verfahren. Zusätzlich ermöglicht die vorliegende Erfindung vorteilhaft die Option, die ”intermediären” varianten Polynucleotidprodukte zu isolieren, indem die Produkte von beliebigen zwei oder mehr getrennten PCR's getrennten Fusions-PCR's unterworfen werden. (Ausgewählte) Variante Polynucleotide, welche aus verschiedenen getrennten erfindungsgemäßen PCR's resultieren, können danach als Ausgangsmaterial für eine weitere erfindungsgemäße PCR verwendet werden.
  • Jede der PCR's, wie im erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführt, kann unter Befolgung von Bedingungen, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, durchgeführt werden. Die Bedingungen können typischerweise von den Primern und dem verwendeten Enzym abhängen. Es kann eine weitere Option sein, jede beliebige der PCR's unter fehleranfälligen Bedingungen durchzuführen, d. h. unter Bedingungen, bei denen die Genauigkeit des Nucleotideinbaus vermindert ist, wodurch in den durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen varianten Polynucleotiden somit zusätzliche Zufallsmutationen eingeführt werden. Fehleranfällige Bedingungen können beispielsweise bereitgestellt werden, indem unabhängig voneinander die Konzentrationen von Mangan und dGTP in der PCR-Reaktion variiert werden. Typischerweise kann die Mutageneserate durch eine Erhöhung der Menge an Mangan und/oder dGTP in der PCR-Reaktion erhöht werden.
  • Die Polynucleotidprodukte der Zusammensetzreaktion werden in einem geeigneten Vektor kloniert, um die Herstellung einer Bibliothek von varianten Polynucleotiden zu ermöglichen. Die Auswahl des Vektors wird von dem Wirt abhängen, in dem die Bibliothek propagiert wird. Danach wird die Bibliothek von varianten Polynucleotiden mittels eines geeigneten Screening-Verfahrens abgesucht (gescreent), um die Auswahl eines varianten Polynucleotids mit einer gewünschten Eigenschaft zu ermöglichen.
  • Das zum Screenen der Bibliothek von varianten Polynucleotiden verwendete Verfahren ist für die Erfindung nicht kritisch. Typischerweise wird das verwendete Verfahren von einer Eigenschaft des interessierenden Polynucleotids abhängen. Wenn das interessierende Polynucleotid ein Gen umfasst, welches für ein Polypeptid kodiert, kann ein geeignetes Screening-Verfahren darauf gerichtet sein, direkt auf das Polypeptid zu untersuchen. Ein geeignetes Screening-Verfahren kann weiterhin darauf gerichtet sein, auf einen primären oder sekundären Metaboliten zu untersuchen, wenn das Polypeptid ein Enzym ist, welches an der Produktion des primären oder sekundären Metaboliten beteiligt ist, beispielsweise ein Enzym, welches ein Bestandteil des Biosynthesewegs des Metaboliten ist. Beispiele derartiger Metabolite sind eine Aminosäure, ein Vitamin, ein Antibiotikum, ein Carotinoid.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Mutagenese jedes Polynucleotids von Interesse geeignet.
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das interessierende Polynucleotid ein Gen, welches für ein Polypeptid kodiert. Das Polypeptid kann beispielsweise ein Strukturprotein, ein Peptidhormon, ein Wachstumsfaktor, ein Antikörper oder ein Enzym sein. Das Polypeptid kann intrazellulär produziert werden oder von der Zelle in die Umgebung sezerniert werden, beispielsweise in das Kulturmedium. Das Polynucleotid kann ein einzelnes Gen umfassen oder kann ein Gencluster umfassen. Das Gencluster kann Gene umfassen, welche für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese eines besonderen Metaboliten beteiligt sind, und/oder Gene, welche für regulatorische Faktoren kodieren, die an der Regulation der Expression eines oder mehrerer Gene beteiligt sind, die an der Produktion eines besonderen Metaboliten beteiligt sind.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das interessierende Polynucleotid ein nicht-kodierendes Polynucleotid sein, beispielsweise eine regulatorische Region, welche an der Kontrolle der Genexpression beteiligt ist, auf dem Niveau der Transkription und/oder der Translation. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch auf ein Polynucleotid, das ein Gen bzw. ein Gencluster und entsprechende regulatorische Regionen umfasst, angewandt werden.
  • Ein variantes Polypeptid kann produziert werden durch Exprimieren eines varianten Polynucleotids, welches gemäß der Erfindung produziert und ausgewählt worden ist, in einem geeigneten Wirtsorganismus, und gegebenenfalls Gewinnen des erzeugten Polypeptids.
  • Dazu wird das ausgewählte Polynucleotid in einen Expressionsvektor nach Wahl kloniert und in einen Wirtsorganismus nach Wahl transformiert. Transformierte Wirtszellen werden durch jedes geeignete Mittel gegen den nicht-transformierten Hintergrund selektiert. Die transformierten Zellen werden in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet und können weiterhin auf eine Expression des varianten Polynucleotids gescreent werden. Techniken für die Transformation von Wirtszellen und für die Selektion von transfomierten Zellen sind dem Fachmann gut bekannt.
  • Zur Produktion des varianten Polypeptids in einem größeren Maßstab kann eine transformierte Zelle, welche eine geeignete Menge des interessierenden varianten Polypeptids produziert, unter Bedingungen kultiviert werden, welche für die Produktion des Polypeptids förderlich sind. Gegebenenfalls kann das Polypeptid aus dem Kulturmedium und/oder aus dem Wirtsorganismus gewonnen werden. Die Gewinnung des varianten Polypeptids kann, in Abhängigkeit von seiner weiteren Verwendung, seine Formulierung in einer geeigneten flüssigen oder festen Formulierung und/oder seine Immobilisierung umfassen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1. Schematische Darstellung von (gesättigter) Mutationsprimer-PCR-DNA-Rekombination.
    • * mutierte Position ⊗ gesättigte Mutationsstelle
  • 2. Agarosegelelektrophorese der Einzelschritt-PCR's.
    • Oben 1–9: DNA-Produkt nach einer PCR-Reaktion mit dem universellen 5'-Primer und Mutationsprimern 1–9.
    • Unten 1'–90': DNA-Produkt nach einer PCR-Reaktion mit dem universellen 3'-Primer und Mutationsprimern 1'–9'.
  • 3. Typische Ergebnisse der Umsetzungsaktivitäten einer Gruppe von Mutanten aus einem Teil der KKN07-Bibliothek, ausgewählt nach der ersten MTP-Analyse.
  • Experimenteller Teil
  • MTP-Screening
  • Einzelkolonien der zu screenenden Bibliothek wurden angeimpft in individuellen Wells von Mikrotiterplatten (MTP's), gefüllt mit SE-Flüssigmedium (enthaltend 10 g/l Bactotrypton, 5 g/l Bactohefe und 5 g/l NaCl), ergänzt mit Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 μg/ml. Gegebenenfalls wurde Arabinose-Induktor zugegeben (Endkonzentration 0,002%). Normale Wachstumsbedingungen waren bei 37°C, induzierte Wachstumsbedingungen waren bei 28°C und 280 UpM. 50 μl der 20–24 Stunden gewachsenen Kulturen wurden mit D,L-α-methylphenylglycinamid (Femam) bei 55°C in Platten mit tiefen Wells inkubiert. Nach 2,5-stündiger Inkubation wurde die Amidaseaktivität der Kulturbrühe durch Messen der Menge an gebildetem L-α-Methylphenylglycin (Femac) gemessen.
  • CFE-Screening
  • Zellfreie Extrakte (CFE's, cell-free extracts) wurden hergestellt unter Verwendung eines Bakterienprotein-Extraktionsreagenzes gemäß den Anweisungen des Herstellers (BPER, Pierce, Rockford, IL, USA) und ihre L-Amidaseaktivität wurde gemessen.
  • Amidaseaktivitätsassay
  • Amidaseaktivität wurde als Umsetzungsaktivität von Femam zu Femac gemessen. Der Nachweis erfolgte mittels NMR.
  • Beispiel 1
  • Herstellung und Screening einer fehleranfälligen Bibliothek von O. anthropi-L-Amidase
  • Mit dem L-Amidase-Gen von Ochrobactrum anthropi (siehe SEQ ID NO.: 1) wurde eine fehleranfällige PCR durchgeführt, unter Verwendung des DiversifyTM PCR Random Mutagenesis Kit von Clontech (Palo Alto, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die PCR-Produkte wurden in die EagI/HindIII-Stellen des Vektors pBAD/Myc-HisC (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) kloniert und in E. coli Top10F-Zellen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) transformiert. Klone wurden zunächst auf MTP gescreent und CFE's einer Teilmenge von Klonen wurden weiter gescreent (siehe Experimenteller Teil). Verbesserte Mutanten wurden sequenziert, um die modifizierte(n) Position(en) zu bestimmen. Die modifizierten Positionen von sieben verbesserten Mutanten sind nachstehend hierin angegeben; V52A, F93V, T143A, T193P, N212D, N981/L124P, K138R/G234V (siehe SEQ ID NO.: 2).
  • Beispiel 2
  • Mutagenese und Rekombination von verbesserten Mutanten mittels Mutationsprimer-PCR
  • Gesättigte Mutagenese an Stellen, welche nach dem Screening von fehleranfällige Mutagenese-Bibliotheken entdeckt worden waren, führt alle 20 Aminosäuren in diese Positionen ein. Gesättigte Vorwärts-Primer und reverse Primer wurden für jede Mutation der sieben in Beispiel 1 erhaltenen verbesserten Mutanten konstruiert. Die gesättigten Primer sind mit drei N's am Codon der zu mutierenden Aminosäure konstruiert.
  • Wie aus 1 ersichtlich ist, wurden zwei PCR-Reaktionen für jede Mutationsstelle durchgeführt, 1) unter Verwendung eines gesättigten Vorwärts-Primers in Kombination mit einem universellen reversen Primer, und 2) dem gesättigten reversen Primer in Kombination mit einem universellen Vorwärts-Primer.
  • Die PCR-Produkte dieser PCR-Reaktionen (siehe 2) wurden in äquimolaren Mengen gemischt und mittels Polymerase zusammengesetzt. Die Produkte dieser so genannten Fusions-PCR-Reaktion wurden danach in einer fehleranfälligen PCR amplifiziert. Die DNA-Produkte wurden in die EagI/HindIII-Stellen des Vektors pBAD/Myc-HisC kloniert und in E. coli Top10F-Zellen transformiert.
  • 5000 Klone der resultierenden KKN07-Bibliothek wurden in MTP gescreent. Annähernd 40% aller analysierten Mutanten stellten sich als inaktiv in MTP heraus.
  • Eine große Gruppe von Mutanten, die im MTP-Screening ausgewählt worden waren, wurde in einem sekundären Screening getestet. In diesem Screening wurden CVE's und verschiedene Verdünnungen davon mittels NMR auf Umsetzungsaktivität analysiert. Die Umsetzung/μl wurde berechnet und hinsichtlich der Proteinmenge korrigiert. Danach wurde die Umsetzung/μl/mg Protein der Mutanten mit der Umsetzung/μl/mg Protein des Wildtyps verglichen, und die Verbesserung der Aktivität wurde bestimmt.
  • In 3 sind die Gesamtergebnisse von ausgewählten Mutanten aus der KKN07-Bibliothek dargestellt.
  • Die DNA von 10 zufällig ausgewählten Mutanten und von den 10 Mutanten mit der größten Verbesserung wurde sequenziert. Die Ergebnisse dieser Sequenzanalysen sind in Tabelle 1 dargestellt.
  • Aus den Sequenzergebnissen der zufällig ausgewählten Mutanten wurde eine Rekombinationshäufigkeit von etwa 70% berechnet (3 dreifache, 4 doppelte und 3 einzelne Mutationen). Die Mutationsrate der verwendeten fehleranfälligen Bedingungen betrug annähernd 0,9 Mutationen/Gen.
  • Unter Verwendung eines Mutationszyklus mittels fehleranfälliger PCR, Sättigungsmutagenese in Kombination mit Rekombination und Screening/Auswahl eines Teils der Bibliothek wurde die spezifische Aktivität der Ochrobactrum anthropi-L-Amidase für Femam im Vergleich zum Wildtyp annähernd 5- bis 6-fach verbessert.
  • Tabelle 1: Sequenzergebnisse von 10 zufällig ausgewählten Mutanten (KKN07-1/10) sowie von den 10 Mutanten mit der größten Verbesserung aus der KKN07-Bibliothek. Oben in der Tabelle sind die 7 ausgewählten Mutanten angegeben, die als Ausgangsmaterial verwendet wurden. Die Umsetzungsaktivität relativ zum Wildtyp ist angegeben.
    • * bedeutet Stopcodon
    Mutationen EP Mutationen Umsetzungsaktivität
    WT 1
    T1 T143A 1,8–2,3
    T8 F93V 1,5
    F10 N98I L124P 1,4
    F162 K138R G234V 1,3
    F190 N212D 1,1
    R9 T193P 1,4
    R10 V52A 2,0–2,5
    KKN07-1 V52A K138R N212C T123R, T273A
    KKN07-2 F93T R132C, Deletion
    KKN07-3 V52W N98E T143A
    KKN07-4 L124T T193P
    KKN07-5 V52A T143K N212D
    KKN07-6 V52T Deletion
    KKN07-7 T143A C285Y
    KKN07-8 T143K N212D
    KKN07-9 K138* T143L D222N
    KKN07-10 V52A G234V F306S, A281T
    F308 V52A T143A T193P G234C R229W 5,6
    F317 N98I L124G T193P 4,5
    F303 V52A T143E 4,5
    F386 N98L K138R T193P R132C 4,3
    F409 V52A T143A G234Q L240F 4,1
    F382 V52A K138R T193P P224T 4
    F384 F93V T193P A116T 3,7
    F389 V52S T143A T193P 3,6
    F302 V52S N98V 3,7
    F401 T193P N212T 3,6
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001

Claims (11)

  1. Verfahren zur Herstellung eines varianten Polynucleotids mit einer erwünschten Eigenschaft, umfassend folgende Stufen: eine Population von Polynucleotiden wird zwei oder mehr getrennten PCR's unterworfen, wobei jede getrennte PCR Folgendes umfasst: eine erste PCR mit einem mutationspezifischen Vorwärts-Primer für eine zu mutierende Position und einem reversen universellen Primer, eine zweite PCR mit einem universellen Vorwärts-Primer und einem mutationsspezifischen reversen Primer für eine zu mutierende Position und gegebenenfalls eine dritte oder weitere PCR mit einem geeigneten Vorwärts-Primer und reversen Primer; die Produkte von zwei oder mehr getrennten PCR's werden durch eine Polymerase in einem Röhrchen zusammengesetzt; die zusammengesetzten Polynucleotide werden gegebenenfalls amplifiziert; eine Bibliothek der erhaltenen varianten Polynucleotide wird hergestellt; die Bibliothek von varianten Polynucleotiden wird auf ein variantes Polynucleotid mit einer erwünschten Eigenschaft abgesucht.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Mitglieder der Population von Polynucleotiden eine Homologie im Bereich von 70–100%, vorzugsweise von 75–100%, vorzugsweise von 80–100%, vorzugsweise von 85–100%, insbesondere von 90–100% und ganz besonders von 95–100% zeigen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population von Polynucleotiden aus folgender Gruppe ausgewählt ist: eine Population von identischen Polynucleotiden, eine Population von unterschiedlichen Mutanten eines parentalen Polynucleotids und eine Population von unterschiedlichen Mitgliedern einer Genfamilie.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem mutationsspezifischen Primer um einen gesättigten Primer handelt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem mutationsspezifischen Primer um ein ”spiked” Oligonucleotid handelt.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population von Polynucleotiden einer Serie von zwei oder mehr getrennten PCR's unterworfen wird und die erhaltene Serie von getrennten PCR-Produkten durch eine Polymerase in einem einzigen Röhrchen zusammengesetzt werden.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population von Polynucleotiden einer Serie von zwei oder mehr getrennten PCR's unterworfen wird und die erhaltene Serie von getrennten PCR-Produkten getrennt durch eine Polymerase zusammengesetzt werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zusammensetzen in Gegenwart von zusätzlich zugegebenem universellem Vorwärts- und reversem Primer durchgeführt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zwei oder mehr getrennten PCR's und/oder die Amplifikation der zusammengesetzten Polynucleotide unter fehleranfälligen Bedingungen durchgeführt werden.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Polynucleotid ein oder mehr Gene, die für ein Polypeptid kodieren, umfasst.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid am Biosyntheseweg eines primären oder sekundären Metaboliten beteiligt ist.
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