CN109750032A - 一种构建基因多点突变和进化的方法 - Google Patents

一种构建基因多点突变和进化的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109750032A
CN109750032A CN201910148066.8A CN201910148066A CN109750032A CN 109750032 A CN109750032 A CN 109750032A CN 201910148066 A CN201910148066 A CN 201910148066A CN 109750032 A CN109750032 A CN 109750032A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
mutation
evolution
sequence
recombinant plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910148066.8A
Other languages
English (en)
Inventor
张小飞
王尧
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd
Original Assignee
SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd filed Critical SYNCORE LABORATORIES (SHANGHAI) Co Ltd
Priority to CN201910148066.8A priority Critical patent/CN109750032A/zh
Publication of CN109750032A publication Critical patent/CN109750032A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Abstract

本发明通过设计单条含有多点突变或饱和突变的引物(15‑25bp)，结合载体本身的通用引物(20bp)，在高保真聚合酶作用下，扩增出带有多个突变信息的长片段序列(500‑1500bp)；再以获得的长片段序列为引物，经过20‑30个循环后获得重组质粒的全长序列；全长序列转化感受态细胞后，便可获得理想的突变体或突变库。本方法有效的降低了多点突变的失败率和进化突变库中具有相同突变的概率，同时在引物的合成上使得成本降低了50％，在分子生物学的应用上有着重要意义。

Description

一种构建基因多点突变和进化的方法
技术领域：
本发明属于蛋白质工程领域，具体涉及一种提高外源基因多点突变和进化效率的方法。
背景技术：
PCR扩增技术的问世，为分子生物学带来飞跃式发展，尤其是在蛋白质工程领域的应用，由原来的外源基因单点突变技术到现在实现了多点同时饱和突变，人为的加快外源基因进化速度，构建出非天然酶用于替代工业上高污染、高成本、高危险的化学法催化反应。
目前，在构建基因改造的方案中主要包含理性的定点突变技术、半理性的饱和突变技术和非理性的随机突变技术，由于理性和半理性构建的库容量较低和筛选难度不大而被广泛采用。在这两种基因改造方案中，进行分子操作前都需要设计一对包含突变位点的引物，这些引物在高保真聚合酶的作用下用于全质粒扩增，但当突变相邻几个位点的氨基酸时，由于引物与模板的特异结合位点减少而导致全质粒扩增的失败。后期研究者利用多对引物和多次的突变实现了多个相邻位点氨基酸的突变，但这严重增加了操作的复杂性和延长了突变的周期性，加重了基因改造的程度。2002年Kentaro Miyazaki教授在文献BioTechniques 33:1033-1038中提出设计大片段引物来扩增全质粒，虽然降低了扩增的失败率，但通常设计的引物要在500bp以上，成本大幅度提高。另外，在改造蛋白的过程中，引物的用量都是微量的，整对引物的加倍延长合成也带来浪费和后期污染，对于进化的饱和突变来说，更是如此。基于以上的分析，为了提高多点突变和进化的效率、降低成本和污染，必须开发一种简便、成本低、高效率的操作方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种高效构建基因多点突变和进化的方法，为获得非天然酶或蛋白质提供捷径。
本发明通过设计单条突变引物，有效构建出多点突变或进化突变库，提高外源基因多点突变和进化效率，其主要步骤是：
(I)设计单条基因突变引物，为正向引物P1或反向引物P2；
(II)以正向引物P1和重组质粒的下游通用引物T2为一对引物，在DNA聚合酶作用下，扩增出含有多个位点突变的长片段序列；或者以反向引物P2和重组质粒的上游通用引物T1为一对引物，在DNA聚合酶的作用下，扩增出含有多个位点突变的长片段序列；
(III)以扩增得到的长片段序列为引物，利用DNA聚合酶，全质粒扩增出线性重组质粒；
(IV)经限制性内切酶DpnI处理模板后，将扩增含有多点突变的线性重组质粒转入感受态细胞，在抗性条件的筛选下，获得基因突变菌株或进化突变库。
进一步，设计的单条基因突变引物长度一般在15bp～25bp。
进一步，单条突变引物和重组质粒上的通用引物扩增出的序列长度大于200bp，优选500～1500bp。
进一步，所述的正向引物P1或反向引物P2包含1～4个位点的突变信息或含有饱和突变信息。
更进一步，饱和突变信息可以含有NNN突变碱基信息，也可以用NNK、NNM替代。
进一步，通用引物T1或者T2来自于载体自身。
进一步，单条基因突变引物用于蛋白质定点突变。
进一步，单条基因突变引物用于蛋白质定向进化突变，构建突变库进行高通量筛选。
本发明的有益效果体现在：常规操作是采用成对引物进行位点突变，本发明选用单条引物设计是个变革，该引物只需要控制在15-25bp的长度，减少过多合成碱基的浪费；单条引物可以实现两个位点以上的有效突变，降低了多个点突变需要多步骤操作的繁琐性；在定向进化和定点突变的引物设计上，由原来的一对减少为单条，成本上降低了一半；将单条引物用于蛋白质进化过程，能够减少相同突变的概率，提高后期高通量筛选效率。
附图说明
图1、外源基因单点突变的示意图
图2、获得长片段序列的电泳图
图3、长片段序列扩增全质粒电泳图
图4、三个相邻氨基酸突变的原理图
图5、三个相邻氨基酸突变的比对图
图6、饱和突变得到的单克隆平板
图7、单个氨基酸饱和突变后的测序比对图
图8、相邻氨基酸饱和突变后的测序比对图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，同时列举出在原核和真核两种体系中进行新方法的应用。
实施例1单个氨基酸的定点突变
根据本发明的设计原理(见图1)，以重组质粒pET-28a-PLE为模板，设计突变130位点氨基酸。根据引物设计原理设计反向引物P-r-130，并取载体上通用引物T7为正向引物，具体引物信息见表1，带下划线为突变基因。
表1单个氨基酸突变的引物信息表
引物名称 引物序列信息(5’→3’)
T7 TAATACGACTCACTATAGGG
P-r-130 TGGCCC<u>GAG</u>CAAAACAGTACC
利用Primer STAR DNA聚合酶(TaKaRa公司)的高保真性，在引物P-r-130和T7的参与下，以重组质粒pET-28a-PLE为模板，根据表2的扩增条件，扩增出长片段TP。扩增结果见图2，明显观察到长片段的扩增产物。
表2长片段引物的扩增条件
将PCR扩增后的产物，直接取5uL，添加到新的PCR扩增体系中，新的扩增体系中仅仅含有混合型的Primer STAR max DNA聚合酶和无菌水，参考新的扩增条件(见表3)，扩增出全质粒片段，扩增结果见图3。
表3全质粒片段的扩增条件
向全质粒扩增后反应液中直接加入0.5uL的FD DpnI限制性内切酶，用于除去模板DNA，在37℃水浴条件下，反应1h。之后再利用DNA纯化试剂盒，除去小片段，得到全质粒片段78ng/uL，取5uL混合于BL21(DE3)感受态，42℃热击90s，再加入1mL LB培养基，37℃孵育1h后直接涂布100uL到含有卡那霉素抗性的平板上。37℃倒置培养过夜，第二天挑取单克隆，经测序进一步确定为想要突变菌株。
实施例2三个相邻氨基酸的突变构建
在单点突变的技术上，重新设计三个氨基酸突变的策略，突变的原理见图4。以穿梭重组质粒pPIC9k-HAM为模板，设计突变321，324和326三个位点氨基酸。根据引物设计原理设计正向引物P-u-146，并取载体上通用引物3’-AOX为反向引物，具体引物信息见表4，带下划线为突变基因。
表4三个相邻氨基酸突变的引物信息表
引物名称 引物序列(5’→3’)
P-u-146 ATC<u>GTT</u>CCGGGC<u>ATC</u>GTGTGCCCGGTT
3’-AOX GGCAAATGGCATTCTCACAT
同样在Primer STAR DNA聚合酶(TaKaRa公司)的作用下，扩增出长片段，扩增条件见表5，延伸时间改为1min。取扩增后的产物5ul，直接转入Primer STAR max DNA聚合酶和无菌水组成的新的扩增体系，在表6的扩增条件下，扩增出全质粒片段，经过FD DpnI限制性内切酶消化后，转入DH5α感受态中，隔夜培养后，挑取单克隆进行测序，结果显示三个点同时发生了突变(见图5)，也证明该方法对多点饱和突变的有效性。
表5长片段引物的扩增条件
表6全质粒片段的扩增条件
实施例3单个氨基酸的饱和突变建库
以重组质粒pET24a-ATA为模板，设计188位点的饱和突变。根据密码子的简并性以NNK作为饱和突变序列，设计正向引物P-u-188，并取载体上通用引物T7-Ter为反向引物，具体引物信息见表7，带下划线为饱和突变基因。
表7单个氨基酸的饱和突变引物信息表
引物名称 引物序列(5’→3’)
P-u-188 TGACCTG<u>NNK</u>CGTGGTATG
T7-Ter TGCTAGTTATTGCTCAGCGG
同样在Primer STAR DNA聚合酶(TaKaRa公司)的作用下，扩增出长片段，扩增条件见表8，延伸时间改为50s。取扩增后的产物5ul，直接转入Primer STAR max DNA聚合酶和无菌水组成的新的扩增体系，在表9的扩增条件下，扩增出全质粒片段，经过FD DpnI限制性内切酶消化后，转入BL21(DE3)感受态中，隔夜培养后，在含有卡那霉素的平板上长出单克隆(见图6)，能够满足于构建饱和突变库。随机挑取3个单克隆进行测序，结果(见图7)显示3个单克隆在基因的188位点都发生了不同密码子的突变，证明该方法在蛋白进化中实用性。
表8长片段引物的扩增条件
表9全质粒片段的扩增条件
实施例4两个相邻氨基酸的饱和突变构建
为了证明该方法也是适用于多点饱和突变的进化，设计了两个相邻氨基酸的饱和突变引物，以重组pET24a-ATA为模板，设计131位点和133位点的两个饱和突变。设计正向引物P-u-131/133，并取载体上通用引物T7-Ter为反向引物，具体引物信息见表10，带下划线为饱和突变基因。
表10两个相邻氨基酸的饱和突变引物信息表
引物名称 引物序列(5’→3’)
P-u-131/133 GTACC<u>NNK</u>CCG<u>NNK</u>GACATC
T7-Ter TGCTAGTTATTGCTCAGCGG
在Primer STAR DNA聚合酶(TaKaRa公司)的作用下，扩增出长片段，扩增条件见表11，改变延伸时间改为1min。取扩增后的产物5ul，直接转入Primer STAR max DNA聚合酶和无菌水组成的新的扩增体系，在表9的扩增条件下，扩增出全质粒片段，经过FD DpnI限制性内切酶消化后，转入BL21(DE3)感受态中，隔夜培养后，在含有卡那霉素的平板上长出单克隆，用于构建饱和突变库。随机挑取3个单克隆进行测序，结果(见图8)显示3个单克隆在两个饱和突变位点处都发生了不同的改变，进一步延伸了新方法的应用范围。
表11长片段引物的扩增条件

Claims (8)

1.一种提高外源基因多点突变和进化效率的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(I)设计单条基因突变引物，为正向引物P1或反向引物P2；
(II)以正向引物P1和重组质粒的下游通用引物T2为一对引物，在DNA聚合酶作用下，扩增出含有多个位点突变的长片段序列；或者以反向引物P2和重组质粒的上游通用引物T1为一对引物，在DNA聚合酶的作用下，扩增出含有多个位点突变的长片段序列；
(III)以扩增得到的长片段序列为引物，利用DNA聚合酶，全质粒扩增出线性重组质粒；
(IV)经限制性内切酶DpnI处理模板后，将扩增含有多点突变的线性重组质粒转入感受态细胞，在抗性条件的筛选下，获得基因突变菌株或进化突变库。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单条基因突变引物长度为15bp～25bp。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单条突变引物和重组质粒上的通用引物扩增出的序列长度大于200bp，优选500～1500bp。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正向引物P1或反向引物P2包含1～4个位点的突变信息或含有饱和突变信息。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的饱和突变信息含有NNN突变碱基信息，或者用NNK、NNM替代。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的通用引物T1或者T2的序列来自于载体自身序列。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单条基因突变引物用于定点突变。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单条基因突变引物用于定向进化突变，构建突变库进行高通量筛选。
CN201910148066.8A 2019-02-28 2019-02-28 一种构建基因多点突变和进化的方法 Pending CN109750032A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910148066.8A CN109750032A (zh) 2019-02-28 2019-02-28 一种构建基因多点突变和进化的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910148066.8A CN109750032A (zh) 2019-02-28 2019-02-28 一种构建基因多点突变和进化的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109750032A true CN109750032A (zh) 2019-05-14

Family

ID=66407826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910148066.8A Pending CN109750032A (zh) 2019-02-28 2019-02-28 一种构建基因多点突变和进化的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109750032A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021136194A1 (zh) * 2019-12-30 2021-07-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 构建基因突变文库的方法
WO2021190600A1 (zh) * 2020-03-25 2021-09-30 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种基因自动化组装系统和方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5556747A (en) * 1990-07-09 1996-09-17 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for site-directed mutagenesis
WO1999025871A1 (en) * 1997-11-17 1999-05-27 The Babraham Institute Methods and means for mutagenesis of dna
US20050130141A1 (en) * 2001-07-23 2005-06-16 Bovenberg Roelof A.L. Process for preparing variant polynucleotides
WO2008065505A2 (en) * 2006-11-29 2008-06-05 Universtà Degli Studi Del Piemonte Orientale 'ameddeo Avogadro' Simultaneous mixed site-specific mutagenesis method
US20160319272A1 (en) * 2015-04-29 2016-11-03 Jiangnan University Method for Directed DNA Evolution using Combinatorial DNA Libraries
CN108424907A (zh) * 2018-05-09 2018-08-21 北京大学 一种高通量dna多位点精确碱基突变方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5556747A (en) * 1990-07-09 1996-09-17 E. R. Squibb & Sons, Inc. Method for site-directed mutagenesis
WO1999025871A1 (en) * 1997-11-17 1999-05-27 The Babraham Institute Methods and means for mutagenesis of dna
US20050130141A1 (en) * 2001-07-23 2005-06-16 Bovenberg Roelof A.L. Process for preparing variant polynucleotides
WO2008065505A2 (en) * 2006-11-29 2008-06-05 Universtà Degli Studi Del Piemonte Orientale 'ameddeo Avogadro' Simultaneous mixed site-specific mutagenesis method
US20160319272A1 (en) * 2015-04-29 2016-11-03 Jiangnan University Method for Directed DNA Evolution using Combinatorial DNA Libraries
CN108424907A (zh) * 2018-05-09 2018-08-21 北京大学 一种高通量dna多位点精确碱基突变方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021136194A1 (zh) * 2019-12-30 2021-07-08 南京金斯瑞生物科技有限公司 构建基因突变文库的方法
CN114901820A (zh) * 2019-12-30 2022-08-12 南京金斯瑞生物科技有限公司 构建基因突变文库的方法
CN114901820B (zh) * 2019-12-30 2024-01-19 南京金斯瑞生物科技有限公司 构建基因突变文库的方法
WO2021190600A1 (zh) * 2020-03-25 2021-09-30 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种基因自动化组装系统和方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhong et al. Plant genome editing using FnCpf1 and LbCpf1 nucleases at redefined and altered PAM sites
CN105238806B (zh) 一种用于微生物的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建及其应用
US10421957B2 (en) DNA assembly using an RNA-programmable nickase
JP6745599B2 (ja) 分子の作製
US20110117544A1 (en) Method for producing an amplified polynucleotide sequence
CN110446783A (zh) 环状dna的复制或扩增方法
CN109750032A (zh) 一种构建基因多点突变和进化的方法
CN115335536A (zh) 用于即时核酸检测的组合物和方法
CN107338256B (zh) 一种在真核细胞中表达固氮酶基因的方法
CN106906233A (zh) 一种基于CcdB致死基因和SmaI酶切位点的酶切连接共体系同时进行的方法
CN100383248C (zh) 用于t-a克隆的t载体制备方法
CN109706233A (zh) 一种复杂长片段核酸序列的扩增技术
CN107760697A (zh) 用于表达限制性内切酶FspI的甲基化保护菌株的筛选方法
CN105861533A (zh) 一种通过镁离子诱导大肠杆菌裂解的重组载体及应用
CN108048384B (zh) 一种glnA基因缺失的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用
CN112063642A (zh) 一种依赖t5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用
CN104404029A (zh) 一种基于甲基化环状dna分子的突变方法
CN103205449A (zh) 一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法
CN111979258B (zh) 一种高通量的基因编辑方法
Manman et al. Small Amplicons Mutation Library for Vaccine Screening by Error-Prone Polymerase Chain Reaction.
CN109971825B (zh) 快速制备桑格测序模板的方法
CN117604036A (zh) 一种多样化碱基编辑器及其应用
Zhang et al. Simultaneous Multiplex Genome Loci Editing of Halomonas bluephagenesis Using an Engineered CRISPR-guided Base Editor
CN117247959A (zh) 一种基于基因编辑技术的dna克隆技术
CN116178563A (zh) 一种dna合成纠错酶及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190514

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication