CN109971825B - 快速制备桑格测序模板的方法 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种快速制备桑格测序模板的方法，包括：对包含环状DNA样本进行变性处理；对变性产物进行滚环扩增；用通过碱性磷酸酶处理滚环扩增产物去除其中残余的dNTP。

Description

快速制备桑格测序模板的方法

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种快速制备桑格测序模板的方法。

技术背景

桑格(即Sanger)测序法，即双脱氧链终止法，是核酸测序的经典方法。其基本原理是在DNA聚合酶以测序靶DNA为模板合成互补链的反应体系中引入双脱氧核苷酸(ddNTP)，导致合成中的互补链在ddNTP对应的靶DNA核苷酸处终止，形成一系列链终止片段，再利用聚丙烯酰胺凝胶电泳将长度只差一个核苷酸的各DNA链终止片段区分开，根据各片段终点处ddNTP的种类判断靶DNA相应位置上的靶DNA核苷酸的种类。

目前，常规的桑格测序模板制备需要经过摇菌培养和质粒抽提(比如碱裂解法或商业小提试剂盒)两个步骤，共耗时约14小时。本领域对于改进桑格测序的模板样本制备过程，提供能缩短制备时间，同时保证测序效率的样本制备方法存在需求。

滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)技术可用于扩增环状DNA模板，例如质粒和噬菌体DNA，以供桑格测序。该技术是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环式的复制方法而建立的一种核酸扩增技术，它是在恒温条件下发生的一种DNA扩增技术。在RCA反应中，当有环状DNA模板和聚合酶时，通过DNA聚合酶的作用，以环状DNA为模板进行复制，最后形成一条与DNA模板互补的重复序列的DNA单链(Lizardi et al.,1998)。

RCA体系包括:(1)噬菌体phi29DNA聚合酶；(2)环状模板，目前RCA扩增的模板也可为线性；(3)引物为1个或者2个，也可以为多个，一般引物需要具有内切酶抗性。其中噬菌体phi29DNA聚合酶非常重要。它具有很高的链置换活性，无须模板分离就可进行70kb的链置换DNA合成，而且性能稳定，持续合成能力高，可持续数小时高效催化DNA合成，合成速度约为50bp/s。另外，phi29DNA聚合酶的纠错能力强，错误率与pfu酶相当，明显低于TaqDNA聚合酶。RCA是一种等温信号扩增方法，其线性扩增倍数为10⁵，指数扩增能力大于10⁹。RCA技术是一种痕量的分子检测方法，可用于极微量的生物大分子和生物标记物的检测和研究。现在该方法已经成功用于线性双链DNA，甚至是全基因组DNA的扩增(Esteban et al.,1993；Qian et al.,2003；Simison et al.,2006)。RCA技术以其独特的优势在基因检测、基因诊断、原位检测、免疫检测和微阵列固相检测等领域展现了极大的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一在于解决目前桑格测序模板制备周期较长的问题。

为解决该问题，在一个方面，本申请提供了一种快速制备桑格测序模板的方法，该方法包括：对包含环状DNA的样本进行变性处理；将变性产物与滚环扩增反应液混合，进行等温滚环扩增；通过碱性磷酸酶处理滚环扩增产物去除其中残余的dNTP。

在本申请的语境中，“变性”按照本领域对于核酸变性的通常含义理解。根据一些实施方案，变性处理包括在升高的温度下处理样品，随后在变性完成后，降低样品的温度。根据一些更具体的实施方案，通过将样本加热至大约95℃的温度3分钟来实施变性处理。根据一些更具体的实施方案，加热后将样品降温至4℃并保持。根据一些更进一步的实施方案，在变性处理的反应体系中加入用于滚环扩增的随机引物。在一些具体的实施方案中，随机引物的长度为7bp。不希望受限于任何理论，高温可保证初始模板DNA的充分释放，降温过程可让随机引物和环状DNA模板退火结合。通过在变性过程之前加入随机引物，与在变性过程之后加入随机引物相比，可以进一步改善通过滚环扩增的效果。

在一些实施方案中，变性处理的反应体系中含有EDTA。在一些优选实施方案中，变性处理的反应体系中EDTA的浓度约为0.04mM。在一些具体的实施方案中，所述变性处理包括以下步骤：将1ul含有环状DNA的样品加入2ul变性缓冲液(10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA,pH 8.0，25℃)，2ul随机引物(50-150uM)，总体积5ul，混合均匀后，95℃处理3min，变性完成后降温至4℃；

在一些实施方案中，滚环扩增反应体系含有phi29DNA聚合酶。在一些更进一步的实施方案中，滚环扩增包括在30℃的温度下等温扩增。在一些更进一步的实施方案中，滚环扩增的反应体系中含有牛血清白蛋白(BSA)。在一些更进一步的实施方案中，牛血清白蛋白(BSA)的浓度约为0.1mg/mL。在一些实施方案中，滚环扩增的反应体系中含有KCl。在一些更进一步的实施方案中，滚环扩增的反应体系中KCl的浓度约为75mM。

根据本发明方法的一些具体的实施方案，滚环扩增优选包括以下步骤：经过的变性处理步骤的产物加入1ul 10x扩增缓冲液(500mM Tris-HCl,25-75mM MgCl₂,500-1000mMKCl,20-60mM DTT,pH 8.2@25℃)、0.1ul BSA(10mg/ml)、1.6ul dNTP(1-4mM)、1ulphi29DNA聚合酶(5-15U/ul)、1.3ul ddH₂O，最终总反应体系10ul，混合均匀后，在30℃扩增3小时，65℃处理10分钟，降温至4℃；

在一些实施方案中，用来处理滚环扩增产物以去除残余dNTP的碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶(rSAP)。在一些实施方案中，碱性磷酸酶处理包括在0.01-0.1U/uL，优选0.05U/uL的碱性磷酸酶，优选虾碱性磷酸酶的存在下处理滚环扩增产物。在一个具体的实施方案中，对滚环扩增产物的处理包括：向10ul扩增产物加入2ul 10x CutSmart Buffer(250-750mM乙酸钾[potassium acetate],100-300mM Tris-乙酸,50-150mM乙酸镁[magnesiumacetate],1000μg/ml BSA,pH 7.9，25℃)，1ul虾碱性磷酸酶(0.5-1.5U/ul)，7ul ddH₂O，最终总反应体系20ul，37℃反应30分钟，65℃处理5分钟，降温至4℃。

经处理后的扩增产物可直接用于桑格测序，通常1ul即可用于常规桑格测序的PCR扩增、纯化、上机测试。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种桑格测序方法，包括：用本发明前一方面的样本制备方法制备待测序的样本，并直接使用该方法制备的模板样本进行桑格测序。在一个优选的实施方案中，每个制备好的模板样本取1ul的量进行桑格测序。

适用于本发明的样本可以是任何包含环状DNA或基本上由环状DNA组成的生物样品，例如但不限于菌液、菌落、细胞破碎物、质粒、M13噬菌体及其他任何环状DNA样本。样本在应用于本发明的方法之前可以经过或未经过纯化。

有益效果

本发明所采用的滚环扩增方法，基于商业化试剂以及参考文献报道的滚环扩增方法的基础上优化而成，对现有滚环扩增体系、试剂和方法流程进行了整体优化，在保证测序效果与常规抽提质粒或环状DNA制备模板测序效果相当的前提下，有效的解决了传统的测序模板制备周期过长的问题，是一种高效的测序模板快速制备方法。常规测序质粒模板的制备从初始的摇菌到质粒抽提及检测大约需要14小时，常规的RCA方法需要16个小时。本发明通过对RCA的优化，可以在4小时以内完成高质量测序模板的制备，大大缩短了测序结果获得的时间同时大大节省了试剂和人力成本。总体而言，本发明提供的快速制备桑格测序模板的滚环方法能够有效的克服传统测序模板制备方法高成本、耗时和步骤繁琐等短板，其设计独特，操作简便，测序成功率高，能够在不依赖昂贵仪器的基础上，快速简便的实现桑格测序模板的制备。

附图说明：

图1：本发明测序模板制备流程图。

图2：实施例1的pUC57典型测序结果比较。

图3：实施例1的pET典型测序结果比较。

图4：实施例1的pTGE5典型测序结果比较。

图5：实施例1的pcDNA3.1典型测序结果比较。

具体实施方式：

为了进一步了解本发明所阐述的方法，以下结合附图及实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例1：

本实施例比较了三种不同的滚环扩增制备测序模板方法在四小时内制备桑格测序模板的测序效果：

A.NEB phi29DNA聚合酶试剂(货号M0269S，该试剂提供用于RCA反应的部分配套试剂及实验操作方案)(下面以“NEB试剂(phi29DNA聚合酶)”表示)

B.引用自文献(Frank B.Dean.,John R.Nelson.,Theresa L.Giesler.,andRoger S.Lasken.2001.Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA UsingPhi29DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification.GenomeResearch.1095-1099)的RCA实验方案(下面以“文献中的方法”表示)

C.本申请所提供的优化RCA方案(下面以“本申请”表示)

测试样本为32个4种不同类型的质粒转化菌液。用分光光度计测量各菌液的OD600值，结果如表1所示。

用三种不同测序模板制备过程来制备测序模板，如下所述：

1)步骤一(变性流程)：菌液模板的变性及随机引物退火

实验样本是如前所述的经质粒转化后的菌液。三种不同测序模板制备方法的变性反应的体系配置分别如下表所列：

三种不同测序模板制备方法采用相同的变性反应的实验操作流程，如下表所示：

温度	时间(分钟)
		95℃	3
4℃	保持

2)步骤二(扩增流程)：变性退火后等温滚环扩增目的质粒

采用步骤一的反应产物作为实验样品，分别按照三种不同测序模板制备方法进行等温滚环扩增，各方法中扩增反应的体系配置如下表所示：

三种不同测序模板制备方法中扩增反应的体系配置：

三种不同测序模板制备方法采用相同的等温扩增实验操作流程，如下表所示：

温度	时间
		30℃	3小时
65℃	10分钟
		4℃	保持

3)步骤三(消化流程)

本申请提供的方法在等温扩增之后还增加了虾碱性磷酸酶消化处理步骤。该步骤的实验样品为步骤二的扩增产物。

虾碱性磷酸酶处理反应的体系配置如下：

虾碱性磷酸酶处理反应的实验操作流程如下：

温度	时间(分钟)
		37℃	30
65℃	5
		4℃	保持

4)上机测序

取通过上述三种不同制备方法在4小时内制备获得的等浓度测序模板1ul进行桑格测序，并与标准的摇菌培养并抽提质粒(耗时14小时)的测序结果进行对比。我们发现：对于不同的质粒类型，NEB试剂制备的模板的测序结果存在双峰信号(即荧光信号叠加)和峰形重叠(即峰形不独立)的现象；文献报道的方法则存在无信号、测序信号弱(即峰高度过低)和底峰高(即背景信号值过高)的现象；只有本申请优化的RCA方法与标准的摇菌培养加抽提质粒得到的测序效果一致(即主信号峰清晰独立且背景底峰峰值低)。

本实施例利用本申请提供的优化方法，成功实现了4小时内完成测序模板的制备且测序成功率为100％。同时我们也比较了NEB试剂产品方法以及文献中报道方法在同样的4小时内制备的模板和本发明方法的差异，本发明方法的测序成功率远远高于其他两种方法(见表1)，并且与标准的摇菌培养与抽提质粒(耗时14小时)得到的测序效果一致。用未优化的RCA制备桑格测序模板，要达到同样的效果通常需要16个小时。这表明，我们的方法在快速制备质粒测序模板上具有极大的优越性(即测序成功率保持不变的前提下，测序模板制备时间缩短到4小时内)。

表1：实施例1的测序成功率对照

Claims (5)

1.一种快速制备桑格测序模板的方法，其包括下述步骤：对包含环状DNA的样本进行变性处理；对变性产物进行滚环扩增；用通过碱性磷酸酶处理滚环扩增产物去除其中残余的dNTP，其中在开始变性处理之前将样本与用于滚环复制的随机引物混合；变性处理包括将样本加热到95℃保持3分钟，然后降温到4℃并保持；变性处理的体系中含有浓度为0.04 mM的EDTA；其中滚环扩增的反应体系含有浓度为0.5-1.5 U/μL的phi29 DNA聚合酶；其中滚环扩增的反应体系中含有浓度为75 mM的KCl；其中碱性磷酸酶处理包括在0.01-0.1 U/μL的虾碱性磷酸酶的存在下，在37℃处理滚环扩增产物30分钟； 其中滚环扩增包括在30℃的温度下等温扩增3小时； 其中按照该方法的制备全过程在4个小时之内完成。

2.根据权利要求1所述的方法，其中滚环扩增的反应体系中含有浓度为0.1 mg/mL的牛血清白蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其中phi29 DNA聚合酶浓度为0.5 U/μL或1.0 U/μL。

4.根据权利要求1所述的方法，其中碱性磷酸酶处理包括在0.05 U/μL的虾碱性磷酸酶的存在下，在37℃处理滚环扩增产物30分钟。

5.一种桑格测序方法，其包括：用根据权利要求1-4中任一项所述的方法制备待测序的样本，并直接对该样本进行桑格测序。

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