CN102134566B - 一种无差别扩增双链cDNA及基因组DNA的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种无差别扩增双链cDNA及基因组DNA的方法。所述方法包括：构建含有稀有限制性内切酶I-SceI识别位点的OligodT引物I-SceIdT，利用该引物对样品RNA进行逆转录合成第一链cDNA；往第一链cDNA中加入RNAseH酶和DNA Polymerase I酶，合成双链cDNA，然后抹平双链cDNA末端(基因组DNA扩增从此步骤开始做)，接着使双链cDNA(或基因组DNA)的3‘末端加上碱基A，最后在双链两端都加上接头Zip T，使双链DNA可以变性成单链环状结构，在phi29DNA聚合酶作用下进行滚环扩增，产生大量双链cDNA或基因组DNA。本发明方法能够高效并切无差别的扩增各种cDNA及基因组DNA，对珍稀样本的基因组DNA和cDNA有扩大保存的作用，并能高效的扩增高GC含量以及复杂二级结构的DNA。

Description

一种无差别扩增双链cDNA及基因组DNA的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种无差别扩增双链cDNA及基因组DNA的方法。

(二)背景技术

当样品比较小、稀少以及珍贵时，要往往要先对其RNA进行逆转录和扩增，才能得到足够的cDNA用于构建cDNA文库、基因克隆及表达情况分析等实验。目前扩增的方法主要有三种：①在逆转录过程中加入T7、T3或SP6等RNA聚合酶的启动子序列，合成双链cDNA后再利用这些RNA聚合酶转录RNA，进而使其得到扩增；②逆转录过程中加入其它接头序列，然后利用与接头序列相匹配的引物通过PCR扩增cDNA；③逆转录后，将单链cDNA用Circligase(Epicentre Biotechnologies)连接成环状，然后滚环扩增。这些方法都有各自的缺点，由于逆转录过程中长链和GC含量高的cDNA本身就不容易合成到头，方法①中转录出来的RNA还需要再重新逆转录成cDNA才能用于其它用途，长链和GC含量高的cDNA在所有cDNA中的丰度会成倍降低，同时RNA也不易于保存；方法②则因为PCR对长链和GC含量高的cDNA的扩增效率远低于普通的短链cDNA，容易丢失长链和GC含量高的cDNA，抑制性PCR只能部分解决长链cDNA扩增不足的问题；方法③则由于长链cDNA的两个末端碰撞的概率比短链的低很多，不容易形成环状，造成其扩增比例大幅下降。因此需要一种等效的cDNA扩增方法，这种方法既能够高效扩增长链cDNA，也能够高效扩增GC含量高的cDNA。另外，稀有样品的基因组等效扩增也存在相似的问题。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种无差别扩增双链cDNA及基因组DNA的方法，能够高效并切无差别的扩增各种cDNA及基因组DNA，对珍稀样本的基因组DNA和cDNA有扩大保存的作用，并能高效的扩增高GC含量以及复杂二级结构的cDNA。

本发明采用的技术方案是：

一种无差别扩增DNA的方法，所述DNA可以是直接从样品中提取获得的基因组DNA，也可以是对样品RNA进行逆转录获得的cDNA，所述方法包括：

(1)往DNA片段中加入T4DNA polymerase抹平末端；

(2)步骤(1)产物加入Taq DNA polymerase使DNA片段的3‘末端加上碱基A；

(3)步骤(2)产物在T4DNAligase和T4polynucleotide kinase的作用下在DNA片段两端都加上接头Zip T；

(4)步骤(3)产物在phi29DNA聚合酶作用下进行滚环扩增，产生大量DNA。

一种所述DNA为基因组DNA时，所述方法如下：

(1)提取待测样品基因组DNA；

(2)往基因组DNA片段中加入T4DNA polymerase抹平末端；

(3)步骤(2)产物加入Taq DNA polymerase使基因组DNA的3‘末端加上碱基A；

(4)步骤(3)产物在T4DNA ligase和T4polynucleotide kinase的作用下在基因组DNA两端都加上接头Zip T；

(5)步骤(4)产物在phi29DNA聚合酶作用下进行滚环扩增，产生大量基因组DNA。

所述DNA为双链cDNA时，所述方法如下：

(1)构建含有稀有限制性内切酶I-SceI识别位点的Oligo dT引物I-SceIdT，利用该引物对样品RNA进行逆转录合成第一链cDNA；

(2)往第一链cDNA中加入RNaseH酶和DNAPolymerase I酶，合成双链cDNA；

(3)往双链cDNA中加入T4DNApolymerase抹平双链cDNA末端；

(4)步骤(3)产物加入Taq DNA polymerase使双链cDNA的3‘末端加上碱基A；

(5)步骤(4)产物在T4DNA ligase和T4polynucleotide kinase的作用下在双链cDNA两端都加上接头Zip T；

(6)步骤(5)产物在phi29DNA聚合酶作用下进行滚环扩增，产生大量双链cDNA。

本发明关键在于操作路线的涉及和酶的选择，其各步骤具体操作过程可按本领域常规方法进行选择。本发明方法原理参见图1，首先，利用一个含有识别序列为非回文序列的稀有限制性内切酶I-SceI识别位点位点的Oligo dT引物(I-SceIdT)先成第一链cDNA，在Oligo dT中引用此位点为接下来全长cDNA的定向克隆提供基础。第一链cDNA合成完成后，加入RNAse H使和第一链cDNA结合的RNA出现切割，这些断掉的RNA被DNAPolymerase I利用合成第二链cDNA。接着，利用T4DNApolymerase的3’→5’外切核酸酶活性使双链cDNA变成平末端，基因组DNA可直接进行该步骤。然后，加入Taq DNA polymerase使双链cDNA的3‘末端加上碱基A。结果以上处理后，合成的双链cDNA就可以在T4DNA ligase以及T4polynucleotide kinase的作用下两端都加上接头Zip T。ZipT是一个含有I-SceI限制性酶切位点的发夹型的寡核苷酸，其3’末端有个突出的碱基T。加上Zip T之后，双链cDNA经变性会形成一个单链的环状DNA，然后在phi29等具有链置换活性的DNA聚合酶的作用下进行滚环扩增，产生大量的双链cDNA。这些cDNA经过I-Sce I酶切，可以进行定向克隆。

所述引物I-SceIdT带有识别序列为非回文结构的稀有限制性内切酶I-SceI的位点，可以用于定向克隆，序列包括但不限于如下：

GACGCTAGGGATAACAGGGTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN

下划线部分为内切酶I-SceI识别位点，V表示碱基A、C或G的简并碱基，N表示碱基A、T、C或G的简并碱基。

所述接头Zip T序列可形成3‘末端有个突出碱基T的发夹结构，并带有识别序列为非回文结构的稀有限制性内切酶I-SceI的位点，序列包括但不限于如下：

GCGGCCGCACGCTAGGGATAACAGGGTAATGCGGCCGCT

下划线部分为内切酶I-SceI识别位点。

本发明的有益效果主要体现在：(a)本发明方法利用一个接头ZipT使cDNA或基因组DNA成环，因此对不同cDNA及基因组DNA环化效率相同，因此可以无差别的扩增双链cDNA及基因组DNA，这与利用连接酶使自身环化的方法相比更具有“无差别扩增“的优势；(b)与PCR方法扩增双链cDNA及基因组DNA相比，这种方法对长片段以及高GC含量的DNA的扩增效率不会受到影响。

(四)附图说明

图1为本发明方法原理示意图；

图2为使用原始双链cDNA和稀释不同倍数的扩增后双链cDNA做模板，扩增GC含量正常的产物电泳结果图；

图3为使用原始双链cDNA和稀释不同倍数的扩增后双链cDNA做模板，进行PCR扩增高GC含量基因的产物电泳结果图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：扩增小鼠的脊髓双链cDNA

步骤如下：

一、第一链cDNA合成

1.在冰上加入

5μl    Total RNA(约2μg)

4μl    5×RT buffer(Takara)

1μl    10mM dNTPs  (Takara)

0.5μl  I-SceIdT(50M，as OligodT primer)

0.5μl  RNase Inhibitor(40u/μl)(NEB)

1μl    PrimeScriptII(200u/μl)(Takara)

8μl    DEPC-treated H₂O

总体积20μl；

I-SceIdT序列如下：GACGCTAGGGATAACAGGGTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN，下划线部分为内切酶I-SceI识别位点；

2.轻柔混匀后短暂离心，42℃孵育1小时、接着45℃30分钟，再在50℃10分钟。

二、双链cDNA的合成

1.加入20μl第一链cDNA合成反应产物至以下体系(冰上操作)：

8μl    10×RNase H buffer(NEB)

1.5μl  10mM dNTPs

0.2μl  RNase H(5u/μl)(NEB)

1μl    DNAPolymerase I(10u/μl)(NEB)

69.3μl H₂O

总体积100μl

2.轻柔混匀后短暂离心，15℃孵育2小时，避免温度超过15℃。

3.加入0.5μl(5u/μl)T4DNA Polymerase(NEB)后15℃孵育10分钟，使末端平滑。

4.加入1μl Taq DNA Polymerase(5u/μl)，72℃孵育20分钟，使T4DNAPolymerase失活并在双链cDNA末端加3′-A。

5.加入250μl的乙醇，混匀-20℃沉淀1小时。

6.12,000X×g离心10分钟，轻轻倒掉上清，加入1ml的75％乙醇。

7.12,000×g离心5分钟，轻轻倒掉上清，小心吸干残留乙醇。

8.加入4μl 10μM ZipT(adaptor)溶解。

Zip T序列如下：GCGGCCGCACGCTAGGGATAACAGG GTAATGCGGCCGCT，下划线部分为内切酶I-SceI识别位点；

三、接头连接

1.加入以下反应液至上述溶解的双链cDNA中：

1μl  10×Ligation buffer

1μl    50％PEG4000

0.25μl T4Polynucleotide Kinase(10u/μl)(NEB)

1μl    T4DNA Ligase(NEB)

2.75μl H₂O

总体积10μl

2.轻柔混匀后短暂离心，16℃孵育过夜。

四、滚环扩增

1.加入如下：

2μl    连接了接头的双链cDNA

2μl    250μM exonuclease resistant random octamer(NNNNNN^SN^SN)

2μl    10mM dNTPs

11μl   H₂O

将混合物在95℃孵育5分钟，使变性，冰上迅速冷却

2.在上述样品中加入下列试剂：

2μl    10×Phi29Buffer

0.5μl  BSA(10mg/ml)

0.5μl  Phi29DNA Polymerase(10u/μl)

总体积20μl

3.轻柔混匀后短暂离心，30℃孵育过夜。65℃孵育10分钟使Phi29DNAPolymerase失活终止反应，即可获得大量小鼠脊髓双链cDNA。

实施例2：使用扩增完成的小鼠脊髓双链cDNA对GC含量正常的目的片段的扩增：

根据Genbank的中目的基因Gpr178的序列设计引物，扩增一段583bp的片段，其GC含量为53.69％。

引物序列如下：

正向引物：TGCTTGGCTTCCCTGGTGGCTC

反向引物：ATGGGCTGGTTCAGGTGC

PCR反应体系组成如下：

17.25μl  H₂O

2.5μl    10×Taq Buffer(Fermentas)

1.5μl    MgCl2(25mM，Fermentas)

0.5μl    dNTPs(10mM，NEB)

1μl      正向引物(10μM)

1μl      反向引物(10μM)

1μl      模板cDNA

0.25μl   Taq DNA Polymerrase(Fermentas)

总体积25μl每管。

PCR条件如下：

94℃预变性4min

72℃10min

扩增后的产物如图2所示。箭头表示目的基因的扩增产物，M表示marker，泳道1为使用扩增前cDNA进行扩增，泳道2到4将扩增后的cDNA稀释到不同倍数作为模板进行扩增。其他泳道为扩增后产物稀释10⁵到10⁸做PCR模板的产物结果显示，结果显示稀释到100～10000倍的扩增后产物均可以顺利扩增出目的片段。可见，扩增的cDNA稀释1000倍作为模板扩增的产物亮度和扩增前cDNA相同，说明使用这种cDNA扩增方法进行扩增，至少将cDNA扩增了1000倍以上。10000倍稀释的扩增后cDNA做模板的PCR产物经连接、转化、测序证实是Gpr178片段，说明这种方法是可行的。

实施例3：使用扩增完成的小鼠脊髓双链cDNA对扩增高GC含量的基因进行扩增：

目的基因为Wnt10B，其开放式阅读框(ORF)区域GC含量高达62.22％，长度为1170bp，扩增Wnt10B的ORF区域。

引物序列如下：

正向引物：ATGCTGGAGGAGCCCCGG

反向引物：TCATTTACACACATTGAC

PCR反应体系组成如下：

17.25μl  H₂O

2.5μl    10×Taq Buffer(Fermentas)

1.5μl    MgCl2(25mM，Fermentas)

0.5μl    dNTPs(10mM，NEB)

1μl      正向引物(10μM)

1μl      反向引物(10μM)

1μl      模板cDNA

0.25μl   Taq DNA Polymerrase(Fermentas)

总体积25μl每管

PCR条件如下：

94℃预变性4min

72℃10min

扩增后的产物如图3。箭头表示目的基因的扩增产物，M表示marker，泳道1为使用扩增前cDNA进行扩增，泳道2到4将扩增后的cDNA稀释到不同倍数作为模板进行扩增。结果显示，在扩增前cDNA中没有Wnt10B特异性的片段，扩增的cDNA稀释100、1000倍后可以得到目的大小的条带，但是产物中也有其他一些杂带(因为GC含量高的片段扩增十分容易产生杂带)，扩增后产物稀释10000倍做PCR模板，得到的PCR产物只有一条杂带，十分适合克隆。结果显示，cDNA经扩增后，Wnt10B目的条带出现，并且扩增后cDNA稀释到10000时，更能减少非特异性扩增，说明这种扩增方法不但能增加双链cDNA的量，而且对GC含量高的cDNA扩增也很有效。

                        SEQUENCE LISTING

 

<110>  杭州师范大学

 

<120>  一种无差别扩增双链cDNA及基因组DNA的方法

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  40

<212>  DNA

<213>  Unknown

 

<220>

<223>  人工序列

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (40)..(40)

<223>  n is a, c, g, or t

 

<400>  1

gacgctaggg ataacagggt aatttttttt ttttttttvn                           40

 

 

<210>  2

<211>  39

<212>  DNA

<213>  Unknown

 

<220>

<223>  人工序列

 

<400>  2

gcggccgcac gctagggata acagggtaat gcggccgct                            39

 

 

Claims (1)

1.一种无差别扩增双链cDNA的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)构建含有稀有限制性内切酶I-SceI识别位点的Oligo dT引物I-SceIdT，利用该引物对样品RNA进行逆转录合成第一链cDNA；

所述引物I-SceIdT序列如下：

GACGCTAGGGATAACAGGGTAATTTTTTTTTTTTTTTTVN；

下划线部分为内切酶I-SceI识别位点，V表示碱基A、C或G，N表示碱基A、T、C或G；

(2)往第一链cDNA中加入RNaseH酶和DNA Polymerase I酶，合成双链cDNA；

(3)往双链cDNA中加入T4 DNA polymerase抹平双链cDNA末端；

(4)步骤(3)产物加入Taq DNA polymerase使双链cDNA的3‘末端加上碱基A；

(5)步骤(4)产物在T4 DNA ligase和T4 polynucleotide kinase的作用下在双链cDNA两端都加上接头Zip T；

所述接头Zip T序列如下：

GCGGCCGCACGCTAGGGATAACAGGGTAATGCGGCCGCT；

下划线部分为内切酶I-SceI识别位点；

(6)步骤(5)产物在phi29 DNA聚合酶作用下进行滚环扩增，产生大量双链cDNA。

Images