CN105802956A - 一种利用聚乙烯亚胺提高rca扩增效率的方法 - Google Patents

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戚智青
肖志勇
肖桂清
齐晓雪
刘楠辛
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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Abstract

本发明提供一种利用聚乙烯亚胺提高RCA扩增效率的方法，步骤如下：配置聚乙烯亚胺溶液，使用TempliPhi DNA测序模板扩增试剂盒，按照试剂盒的说明进行质粒的变性和培育操作，通过在滚环扩增过程中添加聚乙烯亚胺溶液，然后将RCA扩增产物于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。本发明显著地提高滚环扩增的效率，增强滚环扩增的灵敏度，实现了对市售RCA试剂盒的进一步优化。

Description

一种利用聚乙烯亚胺提高RCA扩增效率的方法
【技术领域】
本发明涉及一种利用阳离子多聚化合物聚乙烯亚胺提高RCA扩增效率的方法。
【背景技术】
核酸扩增技术，是一项现代基本生物技术，在医学、生命科学、环境监测、法医鉴定等领域具有重大的研究意义。通过对核酸分子进行扩增，我们可以获得靶标DNA的直接信息，其在克隆、核算测序、基因诊断及法医鉴定等领域均发挥着重大作用。同时，作为分子生物学研究的基础，核酸体外扩增的效率跟灵敏度也一直受到关注，如何提高扩增的效率也是研究的热门问题。
变温扩增主要是聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction，PCR)，1983年由Mullis等发明。该技术通过变性、退火、延伸等过程，实现了对DNA扩增的多循环重复，从而使其产量呈指数倍增加。该方法虽然能对特定序列的DNA片段进行大量扩增，但仍具有以下不足之处：产物特异性较差从而导致假阳性或假阴性产物；难以扩增高CG含量片段；实验需反复热循环无法摆脱精良仪器的限制等。
随着分子生物学不断发展，新型核酸扩增技术不断出现，21世纪出现的等温扩增技术成为关注焦点。等温扩增是在恒定温度下操作的一种扩增技术，包括滚环扩增(Rollingcircleamplification，RCA)，DNA链置换扩增(StrandDisplacementAmplification，SDA)，缺口酶依赖的链置换扩增(NickaseDependentAmplification,NDA)，多重置换扩增(MultipleDisplacementAmplification,MDA)，环介导的恒温扩增(LoopMediatedIsothermalAmplification，LAMP)等，他们能在某一特定温度下，扩增特定的DNA或者RNA。其中，滚环扩增技术作为一种简单高效的核酸扩增手段，具有反应条件温和、引物设计简单、引物末端易固定和产物分析手段多样等优点，在DNA芯片、蛋白质芯片、核酸测序等方面是一个很有潜力的分析工具，同时也是现阶段应用最广泛的恒温扩增技术之一。RCA充分利用核酸链的位移和高活性的DNA聚合酶将环状DNA进行高速循环复制，有报道称，RCA已经可以产50万左右碱基长度的单链DNA。实际上这个反应可一直持续，除非外界因素的影响终止反应，例如核酸耗尽，温度变化破坏酶活等。
近年来，基于细菌噬菌体Phi29DNA聚合酶和六碱基随机引物的多引物RCA技术生产的TempliPhiDNA测序模板扩增试剂盒，可从1pg-10ngDNA的起始材料，经4-18小时反应获得3-4μg高纯度的DNA。该试剂盒可扩增质粒、噬菌体DNA、人工细菌染色体(Bacteriaartificialchromosome，BAC)、粘粒等大的环状DNA，对于无法克隆的环状模板，也可用此法进行体外增殖。而且得到的高质量DNA产物是加入的扩增模板的串联重复拷贝，是高分子量的线性双链，可直接用于测序、酶切或其他克隆、标记和检测等方面。
虽然具有许多优点，RCA在实际应用中仍存在一些不足，如反应速度较慢、灵敏度较低等，由于反应体系中模板含量较低导致引物不能与模板配对，从而导致错配降低扩增效率。现在虽有使用单链结合蛋白TthSSB来提高RCA扩增效率方法，但实验前需纯化得到有活力的蛋白，步骤繁琐。因此需要开发一种简洁省力的提高RCA扩增效率的方法。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种利用聚乙烯亚胺提高RCA扩增效率的方法，其显著地提高滚环扩增的效率，增强滚环扩增的灵敏度，实现了对市售RCA试剂盒的进一步优化。
本发明是这样实现的：
一种利用聚乙烯亚胺提高RCA扩增效率的方法，所述方法步骤如下：
步骤(1)分别配置浓度为5×10-6(w/v)～5×10-8(w/v)的聚乙烯亚胺溶液，备用；
步骤(2)使用TempliPhiDNA测序模板扩增试剂盒对目标质粒进行扩增：
A.变性：以PET22b-IHF质粒DNA作为模板，在样品缓冲液中加入PET22b-IHF质粒DNA，混匀，加热使其变性，后冷却，获得变性样品溶液；
B.培育：在反应缓冲液中加入Phi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上，得到预制混合酶液；将预混合酶液加入上述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在RCA反应液中加入聚乙烯亚胺溶液，然后于30℃下水浴4-18h；加热并灭活DNA聚合酶，冷却后；取RCA产物，混合loadingbuffer，于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。
进一步地，所述步骤(2)的具体步骤如下：
使用TempliPhiDNA测序模板扩增试剂盒对目标质粒进行扩增：
A.变性：以PET22b-IHF质粒DNA作为模板，在5μl样品缓冲液中加入3ngPET22b-IHF质粒DNA，混匀，95℃加热3min使其变性，后冷却至4℃，获得变性样品溶液；
B.培育：在5μl反应缓冲液中加入0.2μlPhi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上，得到预制混合酶液；将5μl预混合酶液加入上述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在RCA反应液中加入步骤(1)所制聚乙烯亚胺溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min灭活DNA聚合酶，冷却至4℃；取3μlRCA产物，混合1μlloadingbuffer，于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。
进一步地，所述步骤(2)B中，聚乙烯亚胺溶液加入量为0.5μl。
本发明具有如下优点：
通过在RCA反应过程中加入PEI溶液，可以显著地提高滚环扩增的效率，增强滚环扩增的灵敏度，实现了对市售RCA试剂盒的进一步优化。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
图1为本发明实施例中以PET22b-IHF质粒DNA为模板，不同浓度PEI溶液对RCA扩增效率影响情况的电泳示意图。
【具体实施方式】
请参阅图1所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
一种利用聚乙烯亚胺提高RCA扩增效率的方法，包括以下步骤：
步骤(1)分别配置浓度为5×10-6(w/v)、10-6(w/v)、5×10-7(w/v)、5×10-8(w/v)的PEI(聚乙烯亚胺)溶液，备用；
(2)使用AmershamBiosciences公司的TempliPhiDNA测序模板扩增试剂盒，按照试剂盒的说明进行操作：
A.变性：以PET22b-IHF质粒DNA作为模板，在5μl样品缓冲液中加入3ngPET22b-IHF质粒DNA，混匀后，95℃加热3min使其变性，然后冷却至4℃，获得变性样品液；
B.培育：在5μl反应缓冲液中加入0.2μlPhi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上，得到预制混合酶液；将5μl预制混合酶液加入所述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在四组RCA反应液中分别加入步骤(1)所配制浓度分别为5×10-6(w/v)、10-6(w/v)、5×10-7(w/v)、5×10-8(w/v)的PEI溶液；各RCA反应液分别于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min使DNA聚合酶变性，冷却至4℃；所述各浓度PEI溶液加入量为均为0.5μl，所用质粒DNA模板为本实验室构建。
C.RCA扩增产物检测：取3μlRCA产物以1％琼脂糖凝胶为电泳支持介质，在1×TAE和95V电压下电泳30min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图1。
上述各RCA扩增产物的电泳结果见图1。其中，图1中各泳道表示：M为1kbDNALadderMarker；1为市售RCA试剂盒的滚环扩增产物；2、3、4、5分别表示在RCA反应体系中加入浓度为5×10-6(w/v)、10-6(w/v)、5×10-7(w/v)、5×10-8(w/v)的PEI溶液0.5μl后反应结果。
由图1可以看出，随着加入的PEI溶液浓度的增加，DNA条带明显变粗、变亮，DNA滚环扩增效率显著提高，在达到一定量后，RCA产物的扩增开始受到抑制。
本发明通过在RCA反应体系中添加不同浓度的PEI溶液，可以将分散在体系中的目标DNA模板和随机引物聚集起来，提高了RCA各组分的相对浓度，增加了目标核酸模板和引物之间的配对几率，从而实现对目标核酸序列的高效扩增，在很大程度上解决了RCA技术反应速度慢、灵敏度低等问题。总之，本发明可以显著地提高滚环扩增的效率，增强滚环扩增的灵敏度，实现了对市售RCA试剂盒的进一步优化。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (3)

1.一种利用聚乙烯亚胺提高RCA扩增效率的方法，其特征在于：所述方法步骤如下：
步骤(1)分别配置浓度为5×10-6(w/v)～5×10-8(w/v)的聚乙烯亚胺溶液，备用；
步骤(2)使用TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒对目标质粒进行扩增：
A.变性：以PET22b-IHF质粒DNA作为模板，在样品缓冲液中加入PET22b-IHF质粒DNA，混匀，加热使其变性，后冷却，获得变性样品溶液；
B.培育：在反应缓冲液中加入Phi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上，得到预制混合酶液；将预混合酶液加入上述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在RCA反应液中加入聚乙烯亚胺溶液，然后于30℃下水浴4-18h；加热并灭活DNA聚合酶，冷却后；取RCA产物，混合loadingbuffer，于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。
2.如权利要求1所述的一种利用聚乙烯亚胺提高RCA扩增效率的方法，其特征在于：所述步骤(2)的具体步骤如下：
使用TempliPhiTMDNA测序模板扩增试剂盒对目标质粒进行扩增：
A.变性：以PET22b-IHF质粒DNA作为模板，在5μl样品缓冲液中加入3ngPET22b-IHF质粒DNA，混匀，95℃加热3min使其变性，后冷却至4℃，获得变性样品溶液；
B.培育：在5μl反应缓冲液中加入0.2μlPhi29DNA聚合酶，混匀，置于冰上，得到预制混合酶液；将5μl预混合酶液加入上述变性样品液中，混匀，得到RCA反应液；在RCA反应液中加入步骤(1)所制聚乙烯亚胺溶液，然后于30℃下水浴4-18h；65℃加热10min灭活DNA聚合酶，冷却至4℃；取3μlRCA产物，混合1μlloadingbuffer，于1％琼脂糖凝胶中进行电泳。
3.根据权利要求2所述的一种利用聚乙烯亚胺提高RCA扩增效率的方法，其特征在于：所述步骤(2)B中，聚乙烯亚胺溶液加入量为0.5μl。
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