CN109628457B - 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途 - Google Patents

单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途 Download PDF

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Abstract

本发明是一种单链DNA核酸适配体，属病原微生物检测技术领域。具体是用于幽门螺旋杆菌特异性检测的核酸适配体。本发明单链DNA核酸适配体能够高亲和性、高特异性结合幽门螺旋杆菌。本发明还公开了该核酸适配体的筛选方法与用途。本发明单链DNA核酸适配体具有80个碱基和特殊的二级结构，其对幽门螺旋杆菌菌体表面蛋白的亲和力达到26.48±5.72 nM。通过检测其对幽门螺旋杆菌的结合率、荧光强度和荧光显微成像确定它能特异性作用于幽门螺旋杆菌。

Description

单链DNA核酸适配体及其筛选方法与用途
技术领域
本发明属于病原微生物检测技术领域，具体涉及一种可用于特异性检测幽门螺旋杆菌的单链DNA核酸适配体，本发明还公开了其筛选方法与用途。
背景技术
幽门螺旋杆菌（Helicobacter pylori）是一种能够高度适应人体胃部强酸环境的病原微生物，能够引起急性胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡甚至胃腺癌等疾病。据报道，全球大约有一半人口被幽门螺旋杆菌感染，其中发展中国家的感染率较高。胃癌是最难预后的癌症之一，而幽门螺旋杆菌是引起胃癌的最主要的病原菌。幽门螺旋杆菌被发现已有30年，但寻找对其有效的治疗与消除方法依旧是医学界的难题。
核酸适配体（Aptamer）是通过指数级富集的配体系统进化技术(SystematicEvolution of Ligands by Exponential Enrichment, SLEXE)筛选得到的小片段核苷酸序列。核酸适配体因其碱基排列不同从而形成独特的三维结构与相应靶标分子特异性结合。因免疫原性低、靶标特异性高、稳定性高、灵敏度高等优势，核酸适配体在分子生物学、医学、分子生物化学等诸多领域引起关注，成为极具潜力的新型分子探针。
目前，将适配体应用于细胞检测，肿瘤成像，菌体检测和蛋白分子检测方面的研究较多，但将适配体用于幽门螺旋杆菌检测的文章却鲜有报道，利用幽门螺旋杆菌菌体表面重组蛋白来筛选针对幽门螺旋杆菌菌体的适配体的研究更是未见报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可以用于用于幽门螺旋杆菌快速检测的单链DNA核酸适配体。
本发明的另一个目的是提供所述核酸适配体的筛选方法。
本发明的再一个目的是提供所述核酸适配体的用途。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案。本发明是一种单链DNA核酸适配体，其特点是：其核苷酸序列如下所示：
5’-AGTGTGCTCTTCTCAGGTCTCGGCGCGGTTGTGGGTACCTAGGGTTGTTGTTGCTTCTCAGCAGTGTCTCAGCATACGCA-3’。
本发明还公开了一种如以上技术方案所述的的单链DNA核酸适配体的筛选方法，其特点是，
（1）合成含有80个碱基的单链DNA文库和PCR所需引物，序列如下：
文库序列：5’-AGTGTGCTCTTCTCAGGTCT-40N-GCAGTGTCTCAGCATACGCA-3’
正向引物（P1）：5’-AGTGTGCTCTTCTCAGGTCT-3’
反向引物（P2）：5’-TGCGTATGCTGAGACACTGC-3’
(2) 单链DNA文库和靶标蛋白的准备：用蛋白包被液稀释小牛血清白蛋白BSA和幽门螺旋杆菌菌体表面蛋白HP-Ag分别包被在酶联免疫结合板中；将单链DNA文库用结合缓冲液稀释，高温变性后立即冰浴；
(3) 筛选：将步骤（2）中处理的文库先加入包被有BSA蛋白的酶联免疫结合板中并进行恒温振荡孵育，丢弃能够和BSA结合的核酸序列，该过程为反筛过程；将未与BSA结合的序列加入上述包被有HP-Ag蛋白的酶联免疫结合板中进行恒温振荡孵育，去除未结合序列，该过程为正向筛选过程；通过添加胰蛋白酶稀释液将结合到酶联免疫板的HP-Ag蛋白变性，从而使与其结合的核酸序列脱落，高温煮沸使胰蛋白酶变性，得到次级筛选文库，用于下一轮筛选；
(4) 次级筛选文库的扩增：将步骤（3）得到的次级筛选文库通过常规PCR进行扩增；
(5) 次级筛选文库单链的制备：将步骤（4）得到的PCR产物进行不对称PCR扩增，通过提高正向引物P1的量和减少反向引物P2的量来得到大量与初始文库两端引物序列一致的DNA序列；将不对称PCR产物进行12%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过切胶和胶回收的方式获得纯化的单链次级筛选库；
(6) 重复筛选：将步骤（5）得到的次级文库代替步骤（2）中的初始文库，重复（2）-（5）过程7次，最后一轮筛选即第9轮在步骤（4）结束，此时获得双链扩增产物；
(7) 测序：将第9轮筛选所得双链DNA产物进行高通量测序，利用Miseq平台产生54711条原始数据，并按各序列总数数由高到低进行排列；
(8) 性质检测：将步骤（7）测序所得序列的前15条进行聚类分析，合成富集程度最高的前7条序列并在5’端添加FAM荧光标签，将该7条序列稀释并与
包被有HP-Ag蛋白的酶联免疫板孵育结合，用PBS清洗后检测荧光值，选出能够与HP-Ag结合的序列3条；通过检测这3条序列的平衡解离常数Kd值从而判断其亲和力大小，结果显示Kd值最小的Hp4即为筛选得到单链DNA核酸适配体。
文库序列中，N代表A、T、C、G中任意碱基，即40N代表40个连续排列的随机碱基。
进一步优选的筛选方法具体步骤如下：
(1)合成含有80个随机碱基的单链DNA文库和PCR所需的引物，序列如下：
文库序列：5’-AGTGTGCTCTTCTCAGGTCT-40N-GCAGTGTCTCAGCATACGCA-3’
正向引物：5’-AGTGTGCTCTTCTCAGGTCT-3’
反向引物：5’-TGCGTATGCTGAGACACTGC-3’；
(2) 用蛋白包被液稀释BSA和幽门螺旋杆菌菌体表面蛋白HP-Ag，各取100 μL包被在酶联免疫结合板中；
(3) 将步骤（2）中未结合到酶联免疫结合板的BSA蛋白倒出并用含吐温-20的PBS清洗结合板3次，每次2 min；
(4) 将初始文库用结合缓冲液稀释为1 μM，95℃热变性处理后立即在冰上冷却；
(5) 将步骤（4）处理的文库取90 μL加入步骤（3）处理的含BSA的酶联免疫结合板，37℃孵育；
(6) 将步骤（2）中未结合到酶联免疫结合板的HP-Ag蛋白倒出并用含吐温-20的PBS清洗结合板3次，每次2 min；
(7) 将步骤（5）中未结合的文库加到步骤（6）处理的酶联免疫结合板，37℃孵育；
(8) 将步骤（7）中结合ssDNA文库的酶联免疫板用结合缓冲液、PBS和水分别清洗3次；
(9) 在步骤（8）处理后的酶联免疫板中加入110 μL用PBS稀释的胰蛋白酶液，37℃反应3 min后煮沸5 min使胰蛋白酶失活；
(10) 用冰乙醇将步骤（8）处理的溶液醇沉并干燥，加入超纯水重溶；
(11) 将步骤（10）得到的溶液作为模板进行PCR扩增；
(12) 将步骤（11）得到的PCR扩增产物按步骤（10）进行醇沉；
(13) 将步骤（12）得到的产物作为模板进行不对称PCR；
(14) 将步骤（13）得到的不对称PCR产物进行12%变性聚丙烯酰胺凝胶检测；
(15) 重复步骤（1）至步骤（14）8轮，第九轮至步骤（11）时进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，高通量测序；
(16) 将测序得到的序列进行聚类分析，合成出现次数最多的7条并在5’端添加FAM标签；
(17) 将步骤（16）合成的7条序列用结合缓冲液稀释至50nM并与HP-Ag蛋白结合，选出结合量较多的序列；
(18) 将步骤（17）选出的两条序列稀释为不同浓度，与相同浓度的HP-Ag蛋白结合进行亲和力分析；筛选得到单链DNA核酸适配体Hp4。
本发明所公开的单链DNA核酸适配体可以用于幽门螺旋杆菌特异性检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果是： 本发明提供了一条特异性强，亲和力高的幽门螺旋杆菌核酸适配体，能够快速的对微量幽门螺旋杆菌菌体细胞进行检测，可广泛的应用于病原微生物幽门螺旋杆菌的快速检测，在胃病及胃癌的预防中具有重要的应用价值。本发明利用SELEX技术筛选幽门螺旋杆菌菌体表面重组蛋白的核酸适配体，并检测其对幽门螺旋杆菌的特异性，有望应用于幽门螺旋杆菌的快速检测和预防，降低由幽门螺旋杆菌引起的疾病的发生。
附图说明：
图1 为本发明中核酸适配体筛选流程图；
图2 为本发明中筛选得到候选适配体序列的聚类分析图；
图3为本发明中筛选得到候选适配体与HP-Ag蛋白结合量比较；
图4 为本发明中筛选得到的核酸适配体HP-4与HP-Ag蛋白结合亲和力；
图5 为本发明中筛选得到核酸适配体HP-4在4种对照菌中的特异性检测对比图；
图6 为本发明中筛选得到的与幽门螺旋杆菌菌体细胞具有高特异性、高亲和力的核酸适配体HP-4的二级结构预测图。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述。
实施例1：参照图1，核酸适配体HP-4的筛选：
(1)由上海生工合成含有80个随机碱基的单链DNA文库和PCR所需引物，序列如下：
文库序列：5’-AGTGTGCTCTTCTCAGGTCT-40N-GCAGTGTCTCAGCATACGCA-3’
正向引物：5’-AGTGTGCTCTTCTCAGGTCT-3’
反向引物：5’-TGCGTATGCTGAGACACTGC-3’
(2) 用蛋白包被液将BSA稀释至0.1mg/mL，取100 μL包被在酶联免疫结合板中（37℃，2h）；
(3) 用蛋白包被液将幽门螺旋杆菌菌体表面蛋白（HP-Ag）稀释为10 ng/mL，取100μL包被在酶联免疫结合板中37℃，2h并轻轻震荡；
(4) 将步骤（2）中未结合到酶联免疫结合板的BSA蛋白倒出并用含吐温-20的PBS清洗结合板3次，每次2 min；
(5) 将初始文库用结合缓冲液稀释为1 μM，95℃热变性处理5min后立即在冰上冷却15min；
(6) 将步骤（5）处理的文库取90 μL加入步骤（4）处理的酶联免疫结合板，37℃孵育；
(7) 将步骤（3）中未结合到酶联免疫结合板的HP-Ag蛋白倒出并用含吐温-20的PBS清洗结合板3次，每次2 min；
(8) 将步骤（6）中未结合的文库加到步骤（7）处理的酶联免疫结合板，37℃孵育；
(9) 将步骤（8）中结合ssDNA文库的酶联免疫板用结合缓冲液、PBS和水分别清洗3次；
(10) 在步骤（9）处理后的酶联免疫板中加入110 μL用PBS稀释的胰蛋白酶液，37℃反应3 min后煮沸5 min使胰蛋白酶失活。
(11) 用冰乙醇将步骤（9）处理的溶液醇沉并干燥，加入超纯水重溶；
(12) 将步骤（11）得到的溶液作为模板进行PCR扩增；
(13) 将步骤（12）得到的PCR扩增产物按步骤（11）进行醇沉；
(14) 将步骤（13）得到的产物作为模板进行不对称PCR；
(15) 将步骤（14）得到的不对称PCR产物进行12%变性聚丙烯酰胺凝胶检测；
(16) 重复步骤（1）至步骤（15）8轮，第九轮至步骤（12）时进行琼脂糖凝胶电泳检测，并送上海生工进行高通量测序并按核酸序列出现次数统计数据。
核酸适配体性质鉴定：
聚类分析：
将测序得到的出现次数最多的15条序列用Clustal软件进行聚类分析，将相似性较高的序列排为一组，根据序列相似则结构与功能相近的原理，选出每分组中出现次数最高的序列，分别为Hp1, Hp2, Hp3, Hp4, Hp5, Hp6 和Hp7（图2）。
结合能力检测：
根据聚类分析结果，将Hp-1、Hp-2、Hp-3、Hp-4、Hp-5、Hp-6 和Hp-7分别合成并标记FAM标签，用结合缓冲液稀释至50 nM并与10 ng/mL HP-Ag包被的酶联免疫板结合，用PBS清洗三遍的板作为空白对照板，清洗结合板后检测结合到板上的荧光值，结果显示当减去空白对照后，HP-1、HP-2、HP-4有较高的荧光值（图3）。
亲和力检测：
在相同浓度的蛋白包被下的酶联免疫结合板以100 μL不同浓度 (5、25、50、75、100、125、150、175、200、400 和600 nM) 的适配体结合，结合后洗去未结合适配体，检测结合适配体的荧光强度。根据不同浓度适配体与蛋白结合后荧光值变化，利用SigmaPlot 软件和Y=Bmax·(Kd+X)公式进行线性拟合并得出Kd值。结果证明适配体HP-4有较高的亲和力（图4）。
适配体HP-4的序列为：
5’-AGTGTGCTCTTCTCAGGTCTCGGCGCGGTTGTGGGTACCTAGGGTTGTTGTTGCTTCTCAGCAGTGTCTCAGCATACGCA-3’
本实施例中，FAM荧光素标签均标记在核酸适配体的5’端。适配体浓度测定中使用的仪器为超微量紫外分光光度计（Q5000，美国）。适配体结合荧光强度检测实验的仪器为全波长多功能微孔板检测仪（M1000 Pro，瑞士）。适配体结合荧光强度检测实验的仪器为全波长多功能微孔板检测仪（M1000 Pro，瑞士）。适配体结合荧光成像实验的仪器为奥林巴斯倒置显微镜（IX53，日本）。
实施例2，适配体HP-4特异性检测实验：
亲和力检测结果表明适配体HP-4具有较高的亲和力，接下来我们利用幽门螺旋杆菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鳗弧菌对适配体HP-4进行特异性检测。
1)用含5％去纤维羊血的胰蛋白酶大豆琼脂肉汤培养基培养幽门螺旋杆菌，用LB培养基培养大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和鳗弧菌。4种菌株分别在各自的最适培养条件下进行培养，根据OD值和菌体计数法确保其每毫升中所含菌体数目大致相同。
2)离心获取个菌株菌体细胞清洗后与相同体积和浓度的单链适配体HP-4进行混合，30℃孵育结合1h（结合前分别测定各适配体的浓度和荧光值）。
3)结合完成后5000g离心5分钟后用去离子水重悬，各自吸取微量菌悬液稀释后涂布于载玻片上，自然晾干。
4)荧光显微成像。分别在明场和荧光视场下对4种菌种适配体结合效果进行观察，结果再次证明适配体HP-4只对鳗弧菌菌体细胞具有较高的结合能力（图5）。
实施例3，适配体HP-4的二级结构检测：
用Oligo Analyzer (version 3.1, IDT) 在线分析系统对HP-4的二级结构进行在线预测，发现在适配体的第4、第33、第53和第72位碱基处分别形成茎环，且四个位置处的碱基均为G（图6）。
序列表
<110> 淮海工学院
<120> 单链DNA核酸适配体及其筛选方法与用途
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 80
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agtgtgctct tctcaggtct cggcgcggtt gtgggtacct agggttgttg ttgcttctca 60
gcagtgtctc agcatacgca 80
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgcgtatgct gagacactgc 20

Claims (1)

1.一种单链DNA核酸适配体，其特征在于：其核苷酸序列如下所示：
5’-AGTGTGCTCTTCTCAGGTCTCGGCGCGGTTGTGGGTACCTAGGGTTGTTGTTG
CTTCTCAGCAGTGTCTCAGCATACGCA-3’。
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