DE69405396T2

DE69405396T2 - Verfahren zur synthese von nukleinsäuren auf einem festträger und verbindungen verwendbar als festträger in diesem verfahren

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Publication number: DE69405396T2
Application number: DE69405396T
Authority: DE
Inventors: Ludmilla F-93250 Villemonble Baranova; Francois F-75020 Paris Chatelain; Viktor F-93250 Villemonble Kumarev
Original assignee: Genset SA
Current assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-07-07
Publication date: 1998-03-26
Anticipated expiration: 2014-07-08
Also published as: EP0707592B1; ES2109005T3; KR960703937A; JPH08512306A; AU7230994A; AU696421B2; ATE157668T1; HK1002731A1; FR2707296B1; DK0707592T3; CA2166765A1; DE69405396D1; WO1995001987A1; FR2707296A1; EP0707592A1; GR3025420T3; TW397839B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Synthese von Nudleinsäuren auf einem festen Träger. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen festen Träger, der insbesondere in der Biotechnologie und speziell in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren verwendbar ist. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des genannten festen Trägers.
Die Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger wird insbesondere bei den automatisierten Synthesen von DNA- oder RNA-Oligonucleotiden angewendet.
In der vorliegenden Anmeldung versteht man unter "Nucleinsäuren" Desoxyribonucleinsäuren oder Ribonedeinsäuren oder, allgemeiner, Polynucleotide oder Oligonucleotide, in denen die Basen, die Phosphat-Bindeglieder zwischen den Nucleotiden oder auch die Ribose-Zyklen der Basen auf bekannte Weise chemisch modifiziert werden können. Es kann sich dabei insbesondere handeln um Oligonucleotide von α- oder β-Anomeren, um Oligonudleotide von Internucleotid-Bindegliedern vom Phosphorothioat- oder Methylphosphonat- Typ, oder auch um Oligothionucleotide.
Die erste Stufe eines Verfahrens zur Synthese von Nuclinsäuren auf einem festen Träger besteht darin, das erste Nucleosid der gewünschten Sequenz auf einem festen Träger zu fixieren, der üblicherweise besteht aus Glaskugeln mit kontrollierter Porosität (CPG) oder allgemeiner aus einem mineralischen oder funktionalisierten organischen Polymer.
Die derzeit angewendeten Verfahren umfassen die Verwendung von acht verschiedenen Reagentien als feste Träger, die bestehen aus einem mineralischen Polymer oder einem funktionalisierten organischen Polymer, die an ein Nucleosid A, T, C, G oder U gebunden sind, je nachdem, ob die herzustellende Sequenz als erstes Desoxyribo- oder Ribonucleotid A, T, C, G oder U aufweist. Die Hersteller liefern außerdem Reaktoren, in denen eines dieser Nucleoside vorher an dem Träger fixiert worden ist. Je nachdem, ob die Sequenz mit A, T, C, G oder U beginnt, wählt man dann den geeigneten Reaktor. Die Verlängerung dieses ersten Nucleosids erfolgt anschließend in der Richtung 3' T 5' oder 5' T 3' durch Kupplungs-Reagentien. Ein Synthesezyklus, d.h. die Kupplung zwischen zwei Nucleotiden, umfaßt mindestens drei Stufen: (1) die Schutzgruppenentfernung aus der OH-Funktion in 5' oder 3'-Stellung eines ersten Nucleotids, insbesondere die Detritylierung, (2) die Aktivierung der genannten OH-Funktion in 5'- oder 3'-Stellung dieses ersten Nucleotids und die Kondensation jeweils mit dem 3'- oder 5'-Ende eines zweiten Nucleotids und schließlich (3) die Oxidation der Phosphit-Gruppe des erhaltenen Internucleotid-Bindeglieds zum Phosphat.
Die Synthese des Oligonucleotids läuft vorzugsweise ab in der Richtung 3' T 5'. In diesem Fall ist das Ausgangsmaterial ein Nucleosid dessen 5'OH- Gruppe geschützt ist und das mit dem 3'-Ende des Desoxyribose- oder Ribose-Zyklus an den Träger gebunden ist. Die Nucleotide, die anschließend hinzugefügt werden, liegen in Form eines in 5'-Stellung geschützten Derivats vor, dessen Hydroxylgruppe in 3'-Stellung eine substituierte Phosphit- oder Phosphat-Gruppe aufweist.
Je nach Substitutions-Typ an dem Phosphat unterscheidet man verschiedene Verfahren: das Phosphoramidit-Verfahren, das insbesondere in EP 61746 und in US 4 455 066 beschrieben ist, ist heute eines der Verfahren der Wahl, da es die Erzielung von hohen Kupplungsausbeuten (von über 98 %) erlaubt. Die Hydroxygruppe in 3'-Stellung weist demnach eine Phosphoramidit-Gruppe auf (vgl. Fig. 1). Über die Bedeutung dieser Gruppen für die Löslichkeit der Nucleoside in dem organischen Lösungsmittel hinaus macht die Phosphoramidit-Gruppe das Phosphoratom empfindlicher für den Angriff durch eine primäre Hydroxyl-Funktion, wie diejenige in der 5'-Stellung der Nucleoside oder der wachsenden detritylierten Ketten. Die von der Schutzgruppe befreite Hydroxyl-Funktion in 5'-Stellung wird ausreichend nucleophil, um mit der Phosphoramidit-Gruppe des zweiten Nucleotids zu reagieren.
Die DNA- und RNA-Synthesen in fester Phase weisen große Homologien auf. Die Monomeren und die Träger sind verschieden, die Apparatur und die Reagentien sind jedoch identisch.
Die am Ende der Synthesezyklen erhaltenen Oligonucleotide müssen von dem Träger abgelöst sein und die Schutzfunktionen müssen eliminiert sein. Die Abspaltung des Trägers, die Schutzgruppenentfernung aus den Basen und die Eliminierung der an Phosphor gebundenen Gruppe werden gleichzeitig in einer Ammoniak-Lösung durchgeführt. Im Falle der RNA erlaubt es Ethanol, die 2'-O-Silyl-oligoribonucleotide zu solubilisieren und die Desilylierung zu minimieren, wobei die native RNA unter basischen Bedingungen nicht stabil ist. Die Ammoniak/Ethanol-Lösung) die das in eine flüssige Phase überführte Oligoribonucleotid enthält, wird anschließend von dem Glasträger abgetrennt und eingedampft. Die Unterdrückung der Silyl-Gruppen erfolgt in Gegenwart von Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) bei Umgebungstemperatur innerhalb von 16 h. Das TBAF wird anschließend mit TEM (Triethylammoniumacetat) neutralisiert.
Es gibt auch andere Verfahren, insbesondere das sogenannte Phosphotriester-Verfahren, das Phosphodiester-Verfahren, das H-Phosphonat- Verfahren und schließlich das Phosphit-Verfahren.
Ein fester Träger, der für die automatisierte Synthese von Oligonucleotiden verwendbar ist, muß die folgenden Charakteristika aufweisen:
1) Der feste Träger muß selektiv mit dem funktionalisierten 3'-Ende des Nucleotids, insbesondere vom Phosphoramidit-Typ, vom H-Phosphonat-Typ, vom Phosphotriester-Typ, vom Phosphodiester-Typ, vom Phosphit-Typ oder auch mit jedem anderen monomeren Reagens je nach dem angewendeten Synthese-Verfahren selektiv reagieren;
2) die Träger-Oligonucleotid-Bindung muß unter den Synthese- Bedingungen stabil sein und
3) die Träger-Oligonucleotid-Bindung muß am Ende der Synthese unter den Bedingungen der Stufe der Schutzgruppenentfernung aus dem Oligonucleotid hydrolysierbar sein, und
4) das kovalente Bindeglied zwischen dem Träger und dem Oligonucleotid muß ein solches sein, daß nach der Ablösung das freigesetzte Oligonucleotid ein solches vom nativen Typ ist, d.h. daß die terminale 3'-Hydroxyl-Funktion frei ist oder keinen Rest trägt, der aus der Synthese stammt.
In der Literatur sind bereits zahlreiche Träger für die Synthese von Oligonucleotiden in fester Phase beschrieben.
Diese Träger können bestehen aus organischen Polymeren, wie Polystyrol ("Nucleic A. Res." 1980, Band 8), Polyacrylamid, Acryloylmorpholid, Polydimethylacrylamid, das auf Kieselguhr polymerisiert worden ist ("Nucleic Ac. Res." 9(7) 1691 (1980)).
Weitere beschriebene Träger sind solche anorganischer Natur, insbesondere auf Basis von Siliciumdioxid, das funktionalisiert worden ist durch einen Kohlenwasserstoffrest, der eine NH&sub2;- und/oder COOH-Gruppe trägt ("J. AM. Chem." 105, 661 (1983)) oder ein Träger auf Basis von Siliciumdioxid, das durch eine 3-Aminopropylmethoxysilan-Gruppe funktionalisiert worden ist, dessen Verwendung in der Phosphit- und Phosphoramidit-Synthese für die Herstellung von Oligonucleotiden zum erstenmal in dem europäischen Patent Nr.0035719 beschrieben worden ist.
Diese Träger weisen jedoch signifikante Mängel auf: sie sind nicht universell und können nur in einer Oligonucleotid-Synthese verwendet werden nach vorheriger Herstellung ihrer entsprechenden Nucleosid-Derivate, wie z.B. CPG-A, CPG-G, CPG-T, CPG-C oder CPG-dA, CPG-dG, CPG-dU, CPG-dC, wobei die Herstellung dieser Derivate ebenfalls eine vorherige Herstellung des 3'-p-Nitrophenylsuccinat-nucleosids bedingt, die mehr Zeit und beträchtliche Ausgaben für das Reagens erfordert.
Um die vier obengenannten Bedingungen zu erfüllen, insbesondere die zuletztgenannte Bedingung, werden die derzeit verwendeten Träger an das erste Ribonucleosid oder Desoxyribonucleosid der zu synthetisierenden Sequenz gebunden, wie weiter oben angegeben. Insbesondere gibt es keine Phosphatgruppe zwischen dem 3'- (oder 5')-Ende des ersten Nucleotids oder Nucleosids und dem funktionalisierten Polymer. Um die Synthese zu starten, muß der Operator auswählen unter Trägern, die im allgemeinen der folgenden Formel entsprechen:
worin bedeuten:
A ein Wasserstoffatom (Desoxyribonucleosid) oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxylgruppe (Ribonucleosid),
B eine Purin- oder Pyrimidin-Base, deren exocyclische Amin-Funktion gegebenenfalls geschützt ist, wobei diese Schutzgruppen, im allgemeinen Benzoyl- oder Isobutyryl-Schutzgruppen, außerdem ihre Solubilisierung in den im Verlaufe der Synthese verwendeten organischen Lösungsmitteln unterstützen,
C die übliche vorübergehende Schutzgruppe für die terminale 5'-Funktion im allgemeinen eine solche vom Trityl-Typ wie Dimethoxytrityl,
P den festen Träger, der aus einem mineralischen oder organischen Polymer besteht, das direkt mit dem 3'-Ende verbunden ist, das gegebenenfalls substituiert ist durch einen divalenten Kohlenwasserstoff-Rest, der über ein Ester-Brückenglied in 3'-Stellung des Nucleosids gebunden ist.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden in fester Phase, insbesondere ein Verfahren zur automatischen Synthese, anzugeben, bei dem man einen sogenannten "universellen" Träger verwendet. Unter einem "universellen" Träger versteht man hier einen festen Träger, den man verwenden kann unabhängig von dem ersten Nucleotid der zu synthetisierenden RNA oder DNA und unabhängig von dem Typ des während der Synthese verwendeten monomeren Reagens, d.h. unabhängig vom Substitutions-Typ an der Phosphat-Gruppe in 3'- oder in 5'- Stellung, je nachdem, ob man die Synthese in der Richtung 5' T 3' oder 3' T 5' durchführt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, diesen "universellen Träger" in einem Verfahren verwenden zu können, das die gleichen Reaktionsbedingungen umfaßt wie die automatisierten Synthesen in fester Phase.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht insbesondere darin, als monomeres Reagens, das dazu dient, das erste Nucleotid an dem festen Träger zu fixieren, ein monomeres Reagens zu verwenden, das identisch ist mit dem monomeren Reagens, das dazu dient, die weiteren Nucleotide der Sequenz während der Synthese zu binden, insbesondere was den Schutz in 5l - und in 3'-Stellung angeht.
Ein weiteres Ziel besteht auch darin, daß der feste Trsäger die vier obengenannten Charakteristika aufweist.
Eine Schwierigkeit beim Erreichen des Ziels, das erfindungsgemäß angestrebt wird, besteht insbesondere darin, daß das erste Nucleotid, das man einführt, in 3'- oder 5'-Stellung eine Gruppe aufweist, die nach der Spaltung zwischen dem Träger und dem Oligonucleotid unter den üblichen Schutzgruppenentfernungs-Bedingungen in einem basischen Medium am Ende der Synthese ein 3'- oder 5'-Ende besitzen können muß, je nach Fall.
Die Herstellung eines solchen universellen Trägers wurde bis heute als undurchführbar angesehen wegen der scheinbaren Inkompatibialität zwischen der Notwendigkeit, beispielsweise ein 3'-OH-Oligonucleotid zu synthetisieren und der direkten Verwendung ab der ersten Base eines Reagens, das mit den üblichen monomeren Reagentien identisch ist, die eine Phosphat-Gruppe in der terminalen 3'-Position tragen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es gelungen, das Polymer des festen Trägers mit einem Kohlenwasserstoff-Rest zu funktionalisieren, der eine reaktionsfähige Gruppe aufweist, z.B.:
1) die Gruppe kann an ein geschütztes 3'- oder 5'-Ende der monomeren Reagentien gekuppelt werden unter den gleichen Bedingungen, unter denen das 3'- oder 5'-Ende des terminalen Nucleotids der bereits synthetisierten Kette mit dem 5'- bzw. 3'-Ende des monomeren Reagens nach dem Fixieren gekuppelt worden ist, und
2) die finale Abspaltung des kovalenten Bindeglieds zwischen dem festen Träger und dem Oligonucleotid über diese Gruppe erfolgt unter den Bedingungen der finalen Schutzgruppenentfernung aus dem Oligonucleotid, und
3) die Hydroxyl-Funktion an dem terminalen 3'- oder 5'-Ende kann frei sein oder, allgemeiner, die terminale Phosphat-Gruppe des ersten Nucleotids bleibt auf dem Träger.
Man erhält die "Universalität" der Träger in fester Phase gemäß der vorliegenden Erfindung durch eine Funktionalisierung des mineralischen oder organischen Polymers mit einem Kohlenwasserstoff-Rest, der Gruppen vom Glycol-Typ trägt, in denen eine OH-Gruppe und eine nucleophile Gruppe sich in vicinaler Position zueinander befinden, d.h. in denen an zwei benachbarten Kohlenstoffatomen am Ende des Kohlenwasserstoff-Restes diese beiden Kohenstoffatome durch inerte Gruppen gegebenenfalls substituiert sein können.
Unter dem Ausdruck "inerte Gruppe" versteht man hier eine Gruppe, die unter den Bedingungen, wie sie bei den verschiedenen Stufen der erfindungsgemäßen Synthese von Nucleinsäuren an einem festen Träger anzutreffen sind, nicht reagiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäuren durch Synthese an einem festen Träger, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als festen Träger ein mineralisches oder organisches Polymer verwendet, das über einen divalenten Kohlenwasserstoff-Rest an eine Epoxid-Gruppe oder an eine Gruppe vom Glycol-Typ gebunden ist, wobei letztere aus zwei benachbarten gesättigten Kohlenstoffatomen besteht, an denen jeweils substituiert sind eine OH-Gruppe und eine nucleophile Gruppe.
Die Verankerung des ersten Nucleotids an dem festen Träger erfolgt in vorteilhafter Weise unter den gleichen Bedingungen und mit dem gleichen monomeren Reagens wie die Kondensation des zweiten Nucleotids mit dem ersten Nucleotid, das an den Träger gebunden ist, welche die Bedingungen und die monomeren Reagentien sein können, wie sie üblicherweise bei der Synthese von Nucleinsäuren an einem festen Träger angewendet werden, wobei das genannte erste Nucleotid dem ersten Nucleotid der Sequenz der genannten Nucleinsäure entspricht.
Bei einer speziellen Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die folgenden Stufen:
1) Kondensation der OH-Gruppe in 5'- oder 3'-Stellung des ersten Nucleotids oder eines Oligonucleotids, das an seinem anderen 3'- oder 5'-Ende mit dem genannten festen Träger verbunden ist, mit Hilfe eines Kupplers mit der gegebenenfalls substituierten Phosphat-Gruppe jeweils in 3'- oder 5'-Position eines in 3' und 5'-Stellung geschützten monomeren Nucleotid-Reagens;
2) Oxidation oder Sulfurierung des Internucleotid-Bindeglieds vom Phosphit-Typ, wie es in der Stufe (1) erhaltenen wird, zu jeweils einem Phosphat- Bindeglied;
3) Schutzgruppenentfernung an dem 5'-O- oder 3'-O-Ende des in der Stufe (2) erhaltenen Produkts;
4) Wiederholung der Stufen (1) bis (3) ebenso oft wie Nucleotide hinzuzufügen sind für die Synthese der Nucleinsäure.
Das Verfahren kann insbesondere die folgenden Stufen umfassen:
1) Kondensation der genannten OH-Gruppe der genannten Gruppe vom Glycol-Typ des festen Trägers mit Hilfe eines Kupplers mit einer gegebenenfalls in der Position 3' oder 5, substituierten Phosphät- oder Phosphit-Gruppe eines in 5'-O- und 3'-O-Position geschützten monomeren Nucleotid-Reagens;
2) Oxidation oder Sulfurierung des kovalenten Bindeglieds vom Phosphit- Typ zwischen dem festen Träger und dem in der Stufe (1) erhaltenen ersten Nucleotid;
3) Schutzgruppenentfernung aus dem 5'-O- oder 3'-O-Ende des in der Stufe (2) erhaltenen Produkts;
4) Kondensation der 5'-OH- oder 3'-OH-Gruppe des in der Stufe (3) erhaltenen Produkts mit der gegebenenfalls in 3'- oder 5'-Position substituierten Phosphat-, Phosphorothioat- oder Phosphit-Gruppe eines jeweils in 5'-O- oder 3'-O-Position geschützten monomeren Nucleotid-Reagens mit Hilfe des ge nannten Kupplers unter den gleichen Bedingungen wie in der Stufe (1);
5) Oxidation oder Sulfurierung des Internucleotid-Bindeglieds vom Phosphit-Typ, das aus der vorhergehenden Stufe resultiert, zu einem Bindeglied vom Phosphat- bzw. Phosphorothioat-Typ;
6) Schutzgruppenentfernung aus dem 5'-O- oder 3'-O-Ende des in der Stufe (5) erhaltenen Produkts;
7) Wiederholung der Stufen (4), (5) und (6), ebenso oft wie Nucleotide hinzuzufügen sind zur Bildung der herzustellenden Nucleinsäure.
Die obigen Stufen führen zu einem Oligonucleotid, das mit dem festen Träger verbunden ist. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt zweckmäßig eine Endstufe zur Ablösung der Nucleinsäure von dem Träger und zur Eliminierung der Schutzgruppen aus den Basen und gegebenenfalls aus den 2'-O- Positionen der Nucleinsäure.
Bei den früheren Verfahren, bei denen der feste Träger bereits mit einem ersten Nucleosid verbunden ist, das dem ersten Nucleotid der herzustellen Sequenz entspricht, bevor mit den Synthesezyklen begonnen wird, umfaßt der genannte Träger im allgemeinen eine Schutzgruppe in 5'- oder 3'-Stellung des genannten Nucleosids. In diesem Fall beginnt der Synthesezyklus mit einer Schutzgruppenentfernungsstufe in einem sauren Medium, im allgemeinen einer Detritylierung mit TFA, DCA oder TCA in Dichlormethan.
Erfindungsgemäß kann das Verfahren auch mit einer Schutzgruppenentfernungsstufe beginnen, und man kann dann als anfänglichen festen Träger einen erfindungsgemäßen Träger verwenden, der eine Epoxidgruppe aufweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt dann eine Vorstufe zur Öffnung der genannten Epoxid-Gruppe des genannten festen Trägers in einem wasserfreien und sauren Medium unter den üblichen Bedingungen zur Schutzgruppenentfernung aus OH-Gruppen in 5' oder 3'-Stellung, wobei man die genannte Gruppe vom Glycol-Typ des festen Trägers erhält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind außerdem Verbindungen der nachstehend angegebenen Formeln und ihre Verwendung als fester Träger in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren:
worin bedeuten:
- einer der Reste R&sub1;&sub1; R'&sub1;, R"&sub1;, R&sub2; und R'&sub2; ein mineralisches oder P- organisches Polymer oder einen Kohlenwasserstoffrest, der durch ein mineralisches oder organisches Polymer substituiert ist, und
- die übrigen Reste H oder eine inerte Gruppe, z.B. eine Alkylgruppe, die gegebenenfalls substituiert ist, insbesondere durch ein oder mehrere Halogenatome,
- Nu eine nucleophile Gruppe wie NH&sub2;, -OAlk, -NHAlk, -N(Alk)&sub2;,
-NHAc, -OAc, -S-Ac, S-Alk, Halogen; wobei die Gruppen Alk und Ac Alkyl- und Acyl-Gruppen mit jeweils 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, sind, die gegebenenfalls substituiert sind, insbesondere durch ein oder mehrere Halogenatome. Insbesondere sind hier zu nennen die Verbindungen, in denen Nu steht für -N(Alk)&sub2;, -NHAc, -OAc, -S-Ac und ein Halogen.
Bei einer zweckmäßigen Ausführungsform umfaßt der genannte feste Träger eine der Formeln:
in denen R&sub1;, R&sub2; und Nu die oben angegebenen Bedeutungen haben.
Noch einfacher entspricht die genannte Verbindung einer der Formeln:
Bei einer Ausführungsvariante bilden (R&sub1; und R&sub2;) oder (R'&sub1; und R'&sub2;) gemeinsam einen Ring, insbesondere einen Heteroring, der durch das Polymer substituiert ist.
Insbesondere ist es möglich, daß (R&sub1; und R&sub2;) oder (R'&sub1; und R'&sub2;) gemeinsam eine Ribose bilden und Nu steht für die 2'-O-Funktion, die durch eine Schutzgruppe substituiert ist, beispielsweise steht Nu für CH&sub3;- =O.
Zeckmäßig besteht in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren der genannte feste Träger aus einer Verbindung (I), (Ia), (Ib), (II), (IIa), (IIb) oder (I') und (I'b) gemäß der Erfindung.
Bei den am häufigsten angewendeten Varianten entspricht das genannte monomere Nucleotid-Reagens der Formel:
worin bedeuten:
A H oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxylgruppe,
B eine Purin- oder Pyrimidin-Base, deren exocyclische Amin-Funktion gegebenenfalls geschützt ist,
C eine konventionelle Schutzgruppe für die 5'-OH-Funktion,
x die Zahl 0 oder 1, wobei
a) dann, wenn x = 1:
. R&sub3; steht für H und R&sub4; steht für ein negativ geladenes Sauerstoffatom oder
R&sub3; steht für ein Sauerstoffatom und R&sub4; steht entweder für ein Sauerstoffatom oder für ein Sauerstoffatom, das eine Schutzgruppe trägt, und
b) dann, wenn x = 0:
R&sub3; für ein Sauerstoffatom steht, das eine Schutzgruppe trägt, und R&sub4; entweder für ein Halogenatom oder eine disubstituierte Amingruppe steht.
- Wenn x = 1 und R&sub3; für ein Sauerstoffatom steht und wenn R&sub4; ein Sauerstoffatom ist, handelt es sich dabei um das sogenannte Phosphodiester Verfahren;
- wenn R&sub4; ein Sauerstoffatom darstellt, das eine Schutzgruppe trägt, handelt es sich dabei um das sogenannte Phosphotriester-Verfahren;
- wenn x = 1 und R&sub3; für ein Wasserstoffatom steht und wenn R&sub4; ein negativ geladenes Sauerstoffatom ist, handelt es sich dabei um das sogenannte H- Phosphonat-Verfahren und
- wenn x = 0 und R&sub3; für ein Sauerstoffatom steht, das eine Schutzgruppe trägt und wenn R&sub4; ein Halogenatom darstellt, handelt es sich dabei um das sogenannte Phosphit-Verfahren; und
- wenn R&sub4; eine austretende Gruppe vom disubstituierten Typ ist, handelt es sich dabei um das sogenannte Phosphoramidit-Verfahren.
Die erfindungsgemäßen Reagentien-Träger der Formel I, I' und II reagieren mit den üblichen monomeren Reagentien III unter den üblichen kondensations-Bedingungen in einem sauren Medium bei den Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger nach dem folgenden Reaktionsschema:
In den Formeln III und IV haben P, A, B, C, D, R&sub3;, R&sub4; und x die oben angegeben Bedeutungen.
Außerdem wird unter den Bedingungen der finalen Stufe der Ablösung und Schutzgruppenentfernung, die nach der letzten Oxidationsstufe durchgeführt wird, das synthetisierte Oligonucleotid von dem Träger in der Weise getrennt, daß die Phosphatgruppe in (3'- oder 5'-Stellung) mit dem Träger verbunden bleibt. Im Falle einer Synthese in der Richtung 3' T 5' erläutert das nachstehende Reaktionsschema diese letzte Stufe, wenn man den festen Träger der Formel I oder I' verwendet:
In den Verbindungen (V) und (VI) steht D für ein Oligonucleotid, die anderen Parameter haben die oben angegebenen Bedeutungen.
Diese Reaktion läuft in einem schwach basischen Medium ab und führt zu einer Zyklisierung in C-5-Stellung durch β-Eliminierung.
Die Verbindungen der Formel (II) entsprechen nämlich Verbindungen der Formel (I), in denen die Gruppe Nu das Polymer trägt in dem Maße, in dem die Gruppe R&sub1;CO-O eine nucleophile Gruppe ist. Wenn man den festen Träger der Formel II verwendet, erhält man das folgende Reaktionsschema:
In diesem Schema kann sich das Polymer in R&sub2; befinden, d.h. es ist substituiert an dem Phosphat-Zyklus oder in R&sub1;.
Als Polymer können Materialien genannt werden, die bestehen aus Mikrokugeln oder Mikrofasern aus Glas, insbesondere porösem Glas, aus Siliciumdioxid, aus Metaixiden oder organischen Polymeren, insbesondere Cellulose oder gegebenenfalls substituiertem Polystyrol.
Das Polymer ist vorzugsweise ein mineralisches Polymer, das aus einer Basis aus Glas oder Siliciumdioxid besteht, insbesondere ein Siliciumdioxid- Gel.
Die Verbindungen der Formeln (I), (I') und (II) können nach Verfahren hergestellt werden, wie sie dem Fachmann allgemein bekannt sind, und unter Verwendung von verfügbaren Reagentien.
Die Verbindungen der Formel (I), (I') oder (II) können beispielsweise hergestellt werden aus einem Polymer, das funktionalisiert worden ist durch eine COOH-Gruppe oder eine NH&sub2;-Gruppe, die man auf bekannte Weise jeweils mit der terminalen Funktion X = NH&sub2; oder COOH einer Verbindung der Formel reagieren lassen kann:
worin
- die Gruppen Nu und OH gegebenenfalls durch Schutzgruppen geschützt sind;
- R einen divalenten Rest eines Kohlenwasserstoff-Restes wie R&sub1; = - R-darstellt.
Man erhält auf diese Weise ein Amid-Brückenglied. Selbstverständlich kann in dem obengenannten Schema X - R auch an R'&sub1; substituiert sein.
Die Verbindungen der Formeln (I') und (II) können auch nach dem gleichen Reaktions-Typ hergestellt werden aus - NH&sub2; und einer Verbindung, in der X - R ein Substituent an R&sub1;, R'&sub1; oder R"&sub1; in den genannten Formeln ist.
Die Verbindungen der Formeln (I') können auch hergestellt werden aus
Wenn der feste Träger durch die Formel (I) dargestellt wird, kann er auch durch eine Reaktion zur Öffnung des Epoxid-Rings der Formel
in einem wasserfreien sauren oder basischen Medium nach einem SN&sub1;- bzw. SN&sub2;-Substitutionsmechanismus in Gegenwart von HNU in dem Medium hergestellt werden, in dem NU die genannte nucleophile Gruppe darstellt.
Wenn der feste Träger durch die Formel (II) dargestellt wird, worin P in R&sub1; enthalten ist, kann er aus einem Polymer hergestellt werden, das durch eine Carboxylfunktion funktionalisiert worden ist (dieser Polymer-Typ ist im Handel erhältlich) nach dem folgenden Schema:
unter den in Beispiel 6 angegebenen Bedingungen.
Wenn das mineralische Polymer aus Siliciumdioxid besteht, kann man die Si - OH-Gruppen desselben mit Verbindungen reagieren lassen
worin R' so ist, daß - Si - R'- für R&sub1; steht, unter dem Fachmann allgemein bekannten Bedingungen, beispielsweise bei 50ºC, wie in Beispiel (I) erläutert wobei die Verbindung (I) erhalten wird durch Behandlung der Oberfläche der Feststoffphase mit 10 %igem Glycidyloxypropyl-trimethoxysilan in einer Acetonitril-Lösung oder mit einem anderen Reagens, das ein Epxod enthält, woran sich eine Öffnung des Epoxid-Ringes unter kontrollierten Bedingungen anschließt.
Die Vorteile eines erfindungsgemäßen festen Trägers und seiner Verwendung in dem Verfahren zur Synthese von Nucleinsäuren, insbesondere in dem automatischen Verfahren, sind vielfach:
- seine Herstellung ist extrem einfach, verglichen mit derjenigen der üblichen Träger:
- seine Kapazität in Mol pro Gramm ist identisch mit derjenigen der klassischen Träger;
- sein Aufbau ist auf alle Typen von Materialien anwendbar, wie sie als fester Träger verwendet werden (CPG, polymere Phasen, Membranen...);
- die Parameter der Oligonucleotid-Synthese werden nicht modifiziert, der Träger ist mit allen Synthetisatoren kompatibel;
- die Stufe der Schutzgruppenentfernung in einem Verfahren zur Synthese von DNA oder RNA wird unter den gleichen Bedingungen wie bei einem klassischen Träger durchgeführt;
- es gibt keine zusätzliche Stufe für den Verwender des universellen Trägers in einem Verfahren zur Synthese von DNA oder RNA;
- vor allem kann der Träger für die Herstellung von Oligonucleotiden, die an dem terminalen 3'-Ende modifiziert sind, ausgenutzt werden unter direkter Verwendung der Monomeren im ersten Zyklus, die der Art der gewünschten Modifikation entsprechen;
- der Umstand, daß nur ein einziger Träger herzustellen ist, bringt eine deutliche Vereinfachung und Senkung der Kosten für die Synthese oder Oligonucleotide mit sich;
- der universelle Träger vereinfacht beträchtlich die Steuerung der verschiedenen Reaktoren, die derzeit für die Synthese der Oligonucleotide erforderlich sind;
- schließlich erlaubt der universelle Träger das Konzipieren eines beträchtlich vereinfachten Multireaktor-Synthese-Systems durch die Unabhängigkeit jedes Reaktors von der zu synthetisierenden Sequenz.
Die folgende allgemeine Formel erläutert erfindungsgemäße feste Träger-Verbindungen:
worin bedeuten:
- ein Material, das aus Mikrokugeln oder Mikrofasern aus Glas, Siliciumdioxid, Metalloxiden, Cellulose oder organischen Polymeren wie Polystyrol, besteht und worin bedeuten:
k eine ganze Zahl, die von 1 bis 20 variieren kann,
l eine ganze Zahl, die von 0 bis 1 variieren kann,
m eine ganze Zahl, die von 0 bis 1 variieren kann,
n eine ganze Zahl, die von 0 bis 100 variieren kann,
X -H, -N(Alk)&sub2;, -NHAcyl, -OAcyl, -SAcyl, -Hal,
y -H,-ou, -O-, -NHAlk, -S-, - -O-
Weitere Charakteristika und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus den folgenden Beispielen. In den folgenden Beispielen 1 bis 6 wurde der Synthetisator APPLIED BIOSYSTEM 394 verwendet. Das angewendete Verfahren ist das Phosphoramidit-Verfahren.
Die Verlängerung erfolgt in der Richtung 3' T 5', ausgehend von dem ersten Nucleosid, das an dem Träger fixiert ist. Ein Synthesezyklus, welcher der Addition eines Nucleotids entspricht, umfaßt ebenfalls drei Stufen: die Deblockierung, die Kupplung und die Oxidation. In der Stufe der Deblockierung (oder Detritylierung) wird die terminale 5'-Hydroxylgruppe des Oligonucleotids, die während der Synthese durch die Gruppe Dmtr geschützt ist, unter der Einwirkung von Trichloressigsäure (TCA) von ihrer Schutzgruppe befreit. Das auf diese Weise freigesetzte Trityl-Kation weist unter sauren Bedingungen eine Absorption bei 495 nm auf, die seine Bestimmung und die Bestimmung der Reaktionsausbeute erlaubt. Im Verlaufe der Kondensationsstufe wird die Phosphoramidit-Gruppe des monomeren Reagens, die in großem Überschuß zugegeben wird, durch das Tetrazol aktiviert und reagiert mit der freien terminalen 5'-Hydroxyl-Gruppe unter Bildung einer Internucleotid-Bindung vom Phosphit-Typ.
Das instabile (trivalente) Phosphit wird anschließend in Gegenwart von Wasser und bd zum (pentavalenten) Phosphortriester oxidiert.
Die Kupplungsausbeute beträgt 97 bis 99 %, wobei es erforderlich ist, die 5'-Hydroxylgruppen der Oligonucleotide, die nicht reagiert haben, nichtreaktionsfähig zu machen. Diese Operation vermeidet eine Verlängerung dieser im Verlaufe der folgenden Zyklen gestutzten Ketten. Diese vierte "Capping"-Stufe besteht in einer Acetylierung der Hydroxylgruppen in 5'- Stellung durch Essigsäureanhydrid und N-Methylimidazol.
Die in den verschiedenen Stufen eingesetzten Reagentien sind insbesondere die folgenden:

1) Detritylierung und Kupplung

Die nachstehend angegebenen Formeln A und B stellen jeweils in schematischer Form das an dem Träger und dem monomeren Phosphoramidit-Reagens fixierte Nucleosid dar, wobei
R&sub1; = R&sub2; = -CH(CH&sub3;)&sub2;
R&sub3; = -(CH&sub2;)&sub2;- C N
Das Schema 1 repräsentiert die Detritylierung.
Das Schema 2 repräsentiert die Kondensation.
An den Träger gebundenes Nucleosid: Phosphoramidit Schema 1 Bestimmung Schema 2 Aktivierung des Phosphoramidits mit Tetrazol 2) Capping-Stufe: Schema 3 Dieses Nucleosid kann nicht mehr verlängert werden 3) Oxidation Schema 4

Beispiel 1

Man gießt 1 g poröses Glaspulver (CPG 00350C , f; CPG INC. USA) in 5 ml einer 10 %igen Lösung von 3-Glycidyloxypropyltrimethoxysilan
[(Me-O)&sub3;-Si - (CH&sub2;)&sub3; - 0 -
] in Acetonitril, läßt 30 min lang bei einer Temperatur von 50ºC ruhen, dann trennt man durch Filtrieren den Träger ab und wäscht ihn mit Acetonitril (3 x 5 ml) und trocknet ihn unter Vakuum.
Man definiert die Anzahl der Oxy-Gruppen nach dem Öffnen des Epoxid-Ringes durch die Reaktion des Dimethoxytritylchlorids in Pyridin und anschließende spektrophotometrische Messung der Absorption des Trityl- Kations in dem Perchlorsäure/Ethanol-Gemisch bei 495 nm. Man erhält eine Kapazität von 50 bis 100 µmol pro Gramm Träger.

Beispiel 2

Man füllt den Reaktor mit 1 mg Träger, wie er in Beispiel 1 erhalten worden ist, und synthetisiert das Oligonucleotid d(ATGC) nach dem Standard- Verfahren über Phosphoramidite, wie oben angegeben, mit einer ersten Stufe unter den Detritylierungs-Bedingungen, die den Epoxid-Ring öffnen. Nach der Synthese erwärmt man das Oligo-CPG 1 h lang auf 1 00ºC in 30 µl einer konzentrierten wäßrige Ammoniak-Lösung. Zu Analysenzwecken setzt man das Oligonucleotid frei, bei dem das letzte Nucleotid in 5'-Stellung geschützt ist, nachstehend abgekürzt als ON-Trityl bezeichnet, mit Hilfe der HPLC in einer Umkehrphasen-Kolonne. Man erhält etwa 90 % ON-Trityl-Oligonucleotid.

Beispiel 3

Man führt die Synthese des Beispiels 2 durch als Synthese von d(AGTC) nach dem H-Phosphonat-Verfahren.
Was die Synthese von Oligodeoxynucleotiden nach dem H- Phosphonat-Verfahren angeht,
- verwendet man die bereits beschriebenen Monomeren (Formel III);
- wobei das Syntheseprinzip identisch ist mit demjenigen des Phosphoramidit-Verfahrens mit einigen Unterschieden:
- das verwendete Aktivierungsagens ist entweder Adamantoylchlorid oder Pivaloylchlorid,
- am Ende der Synthese wird eine einzige Oxidationsstufe durchgeführt;
- die Schutzgruppenentfernung wird unter den gleichen Bedingungen wie bei den Phosphoramiditen durchgeführt.

Beispiel 4

Man führt die Synthese mit dem gleichen Träger wie in Beispiel 2 als eine Synthese von AGTC der RNA-Reihe durch.
Was die Synthese der Oligoribonucleotide (RNA) angeht, so sind die Monomeren vom Typ der 5'-O-Dimethoxytrityl-3'-O-β-cyanoethoxydiisopropylaminophosphin-2'-O-tert-butyl-dimethylsilyl-nucleoside (Formel III mit A = tert- Butyldimethylsilyl).
Das Syntheseverfahren ist das sogenannte Phosphoramidit-Verfahren. Wie weiter oben angegeben, erfordert die Schutzgruppenentfernung eine zusätzliche Stufe.

Beispiel 5

Man wäscht den wie in Beispiel 1 in dem Reaktor erhaltenen Träger mit einer 1 %igen HCl-Lösung von Dichloromethan. Man erhält einen Träger vom Glycol-Typ mit Nu = Cl und man führt die Synthese immer unter den Standard- Bedingungen nach der Phosphoramidit-Methode durch. Die Behandlung und die Ablösung des Oligonucleotids erfolgen wie in Beispiel 2. Man erhält etwa 90 % ON-Trityl-Oligonucleotid.

Beispiel 6

Man behandelt eine Membran in Form einer Scheibe aus Glasfasern ( 4,7 cm, 1 g, f. WATMAN ) wie in Beispiel 1.
Man erhält einen Träger mit einer Kapazität von 20 µmol Oxygruppen pro Gramm Träger.

Beispiel 7

Von der in Beispiel 4 erhaltenen Scheibe schneidet man eine Scheibe ( 4 mm, 1 mg) ab und führt die Synthese durch; die Behandlung und die Ablösung der Oligonucleotide d(AGTC) erfolgen wie in Beispiel 3.
Man erhält nicht weniger als 90 % ON-Trityl-Oligonucleotid.

Beispiel 8

Man behandelt 1 g des Trägers, der ein Carboxymethyl-CPG CML 00350C (der Firma CPG INC) enthält, mit 5 ml einer 10 %igen Ethylenoxid- Lösung von Dichlormethan bei einer Temperatur von 50ºC 1 h lang. Man isoliert den Träger durch Futrieren, man wäscht ihn mit Dichlormethan und man trocknet ihn unter Vakuum.
Man erhält einen Träger mit einer Kapazität von 50 bis 100 µmol Oxygruppen pro Gramm Träger.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Nucleinsäure durch Synthese auf einem festen Träger, dadurch gekennzeichnet, daß man als festen Träger ein mineralisches oder organisches Polymer verwendet, das über einen divalenten Kohlenwasserstoffrest mit einer Epoxid-Gruppe oder einer Gruppe vom Glycol- Typ verbunden ist, wobei letztere aus zwei nebeneinanderliegenden gesättigten Kohlenstoffatomen besteht, die jeweils durch eine OH-Gruppe und eine nucleophile Gruppe substituiert sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Verankerung des ersten Nucleotids an dem festen Träger unter den gleichen Bedingungen und mit dem gleichen monomeren Reagens erfolgt wie die Kondensation des zweiten Nucleotids mit dem an den Träger gebundenen ersten Nucleotid, bei denen es sich um die üblichen Bedingungen und ein übliches monomeres Reagens handeln kann, wie sie bei der Synthese von Nucleinsäuren auf einem festen Träger angewendet werden, wobei das genannte erste Nucleotid dem ersten Nucleotid der Sequenz der genannten Nucleinsäure entspricht.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt;

1) Kondensation der OH-Gruppe in 5'- oder 3'-Stellung des ersten Nucleotidsodereines Oligonucleotids, das an seinem anderen 3' oder 5'-Ende an den genannten festen Träger gebunden ist, mittels eines Kupplungsmittels mit der Phosphatgruppe, die gegebenenfalls jeweils in der 3' oder 5'-Stellung durch ein in 3'- und 5'-Stellung geschütztes monomeres Nucleotid-Reagen substituiert ist;

2) Oxidation oder Sulfurierung des Internucleotid-Bindeglieds vom Phosphit-Typ, wie es in der Stufe (1) erhalten wird, zu einem Phosphat- bzw. Phosphorthioat-Bindeglied,

3) Entfernung der Schutzgruppe aus dem 5'-O- oder 3'-O-Ende des in der Stufe (2) erhaltenen Produkts; und

4) Wiederholung der Stufen (1) bis (3) ebenso oft wie Nucleotide hinzuzufügen sind zur Synthese der Nucleinsäure.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

1) Kondensation der genannten OH-Gruppe der genannten Gruppe vom Glycol-Typ des festen Trägers mittels eines Kupplungsmittels mit einer Phosphat-Gruppe oder einer Phosphit-Gruppe, die gegebenenfalls in 3' oder 5'- Position substituiert ist durch ein in 5'-O- und 3'-O-Stellung geschiitztes Nucleotid-Monomer;

2) Oxidation oder Sulfurierung des kovalenten Bindeglieds vom Phosphit- Typ zwischen dem festen Träger und dem in der Stufe (1) erhaltenen ersten Nucleotid;

3) Entfernung der Schutzgruppe aus dem 5'-O- oder 3'-O-Ende des in der Stufe (2) erhaltenen Produktes;

4) Kondensation der 5'-OH- oder 3'-OH-Gruppe des in der Stufe (3) erhaltenen Produkts mit der Phosphat-, Phosphorthioat- oder Phosphit-Gruppe, die gegebenenfalls in 3'- oder 5'-Stellung substituiert ist, durch ein jeweils in 5'-O- oder 3'-O-Stellung geschütztes Nucleotid-Monomer-Reagens, mit Hilfe des genannten Kupplungsmittels unter den gleichen Bedingungen wie die Kondensation in der Stufe (1);

5) Oxidation oder Sulfurierung des Internucleotid-Bindeglieds vom Phosphit-Typ, das in der vorhergehenden Stufe erhalten wird, zu einem Bindeglied vom Phosphat- oder Phosphorothioat-Typ;

6) Entfernung der Schutzgruppe aus dem 5'-O- oder 3'-O-Ende des in der Stufe (5) erhaltenen Produkts; und

7) Wiederholung der Stufen (4), (5) und (6), ebenso oft wie Nucleotide hinzuzufügen sind, bis die herzustellende Nucleinsäure erhalten wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Endstufe der Ablösung der Nucleinsäure von dem Träger und der Eliminierung der Schutzgruppen aus den Basen und gegebenenfalls aus den 2'-O- Positionen der Nucleinsäure umfaßt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Vorstufe zur Öffnung einer genannten Epoxid-Gruppe an dem genannten festen Träger in einem wasserfreien und sauren Medium unter den üblichen Bedingungen zur Entfernung der Schutzgruppen aus den OH- Gruppen in 5'- oder 3'-Stellung zur Bildung der genannten Gruppe vom Glycol- Typ des festen Trägers umfaßt.

7. Verbindungen&sub1; dargestellt durch die folgenden Formeln: worin bedeuten:

- einer der Reste R&sub1;, R'&sub1;, R"&sub1;, R&sub2; und R'&sub2; ein mineralisches oder organisches Polymer oder einen Kohlenwasserstoffrest, der durch ein mineralisches oder organisches Polymer substituiert ist, und

- die übrigen Reste, die identisch oder verschieden sind, unabhängig voneinander jeweils H oder eine inerte Gruppe, z.B. eine Alkygruppe, die gegebenenfalls insbesondere durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert ist, und

- Nu eine nucleophile Gruppe wie NH&sub2;, Halogen, -OAlk, -SAlk, -NHAlk, -NHAc, -OAc, -SAc, -N(Alk)&sub2;, worin Alk und Ac jeweils für eine Alkyl- und Acyl- Gruppe stehen, die gegebenenfalls insbesondere durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert sind.

8. Verbindungen nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Nu -N(Alk)&sub2;, -NHAc, -OAc, -SAc oder ein Halogenatom bedeutet, worin Alk und Ac jeweils für eine C&sub1;-C&sub4;-Alkyl- und eine C&sub1;-C&sub4;-Acyl-Gruppe stehen, die gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert sind.

9. Verbindungen nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte feste Träger einer der Formeln entspricht:

worin R&sub1;, R&sub2; und Nu die in Anspruch 7 angegebenen Bedeutungen haben.

10. Verbindung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie einer der Formeln entspricht:

11. Verbindung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß (R&sub1; und R&sub2;) oder (R'&sub1; und R'&sub2;) gemeinsam einen Ring, insbesondere einen Heterocyclus bilden, an den das Polymer substituiert ist.

12. Verbindung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß (R&sub1; und R&sub2;) oder (R'&sub1; und R¹&sub2;) gemeinsam einen Ribose-Zyklus bilden und Nu die 2'-O- Funktion darstellt, die durch eine Schutzgruppe wie

geschützt ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte feste Träger aus einer Verbindung nach einem der Ansprüche 7 bis 10 besteht.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Nucleotid-Monomer-Reagens der Formel entspricht:

worin bedeuten:

A H oder eine gegebenenfalls geschützte Hydroxylgruppe,

B eine Purin- oder Pyrimidin-Base, deren exocyclische Amin-Funktion gegebenenfalls geschützt ist,

C eine konventionelle Schutzgruppe für die 5'-OH-Funktion, x = 0 oder 1, wobei

a) dann, wenn x = 1

. R&sub3; für H und R&sub4; für ein negativ geladenes Sauerstoffatom stehen oder

. R&sub3; für ein Sauerstoffatom und R&sub4; für ein Sauerstoffatom oder ein Sauerstoffatom, das eine Schutzgruppe trägt, stehen, und

b) dann, wenn x = 0,

R&sub3; für ein Sauerstoffatom steht, das eine Schutzgruppe trägt, und R&sub4; für ein Halogenatom oder eine disubstituierte Amingruppe steht.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei handelt um ein Verfahren zur Synthese mit Phosphoramiditen, bei dem das monomere Reagens der Formel (III) entspricht, worin x = 0, R&sub3; für ein Sauerstoffatom steht, das eine Schutzgruppe trägt, und R&sub4; für eine disubstituierte Amingruppe steht.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer in Form von Mikrokugeln oder Mikrofasern aus Glas, insbesondere porösem Glas, Siliciumdioxid, Metalloxiden, Cellulose oder einem organischen Polymer, insbesondere aus Cellulose, vorliegt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 und 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer ein mineralisches Polymer ist, das insbesondere aus Glas oder Siliciumdioxid besteht.