JPH08512306A

JPH08512306A - 固体の支持体上で核酸を合成する方法および特に前記方法における固体の支持体として有用である化合物

Info

Publication number: JPH08512306A
Application number: JP7503866A
Authority: JP
Inventors: バラノバ，リュドミーア; シャトラン，フランソワ; キュマレフ，ビクトール
Original assignee: ジェンセット
Priority date: 1993-07-09
Filing date: 1994-07-07
Publication date: 1996-12-24
Also published as: FR2707296A1; ATE157668T1; DE69405396D1; ES2109005T3; AU7230994A; FR2707296B1; DE69405396T2; DK0707592T3; TW397839B; CA2166765A1; AU696421B2; EP0707592B1; EP0707592A1; GR3025420T3; WO1995001987A1; KR960703937A; HK1002731A1

Abstract

(57)【要約】本発明の目的は、２価の炭化水素基によりエポキシまたはグリコール型の基に結合した、鉱物または有機のポリマーを固体の支持体として使用し、前記エポキシまたはグリコール型の基はＯＨおよび求核性基が置換されている２つの隣接する飽和炭素原子を含むことを特徴とする、固相核酸を合成する方法である。本発明は、また、固体の支持体の核酸合成法において固体の支持体として有用な、上記のエポキシまたはグリコール型の基を含有する化合物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】固体の支持体上で核酸を合成する方法および特に前記方法における固体の支持体として有用である化合物本発明は、固体の支持体上で核酸を合成する方法に関する。本発明は、また、特にバイオテクノロジーにおいておよび特に本発明による核酸の合成法において有用である固体の支持体に関する。本発明は、最後に、前記固体の支持体の製造方法に関する。固体の支持体上における核酸の合成は、ＤＮＡまたはＲＮＡのオリゴヌクレオチドの自動合成において特に使用される。この出願において、用語「核酸」はデオキシリボ核酸またはリボ核酸あるいは、より一般には、塩基、中間ヌクレオチド(internucleotide)ホスフェート結合または塩基のリボース環を既知の方法で化学的に変更することができるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを意味すると理解される。核酸は特にα−またはβアノマーのオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネート型の中間ヌクレオチド結合のオリゴヌクレオチド、あるいはオリゴチオヌクレオチドであることができる。固体の支持体上における核酸の合成法の第１工程は、所望の配列の第１ヌクレオチドを固体の支持体に取り付けることにあり、固体の支持体は伝統的にはコントロールされた多孔度のガラスビーズ（ＣＰＧ）あるいは、いっそう一般には、官能化された有機または無機のポリマーから成る。現在使用されている技術は、製造すべき配列が第１デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドとしてＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵを含有するかどうかに依存して、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵヌクレオチドに結合した官能化された有機または無機のポリマーから成る８つの異なる試薬を使用することを包含する。更に、これらのヌクレオシドの１つが支持体に既に取り付けられている反応器を製造業者は供給する。こうして、配列がＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵで開始するかどうかに依存して、適当な反応器は選択される。次いで、この第１ヌクレオチドの伸長は、カップリング試薬により、３’→５’または５’→３’の方向に起こる。１つの合成サイクル、すなわち、２つのヌクレオチドの間のカップリングは、少なくとも３つの工程を包含する：（１）第１ヌクレオチドの５’または３’ＯＨ官能の脱保護、特に脱トリチル反応、（２）この第１ヌクレオチドの前記５’または３’ＯＨ官能(function)の活性化および第２ヌクレオチドのそれぞれ３’または５’末端との縮合、および、最後に、（３）得られた中間ヌクレオチド結合のホスファイト基のホスフェートへの酸化。オリゴヌクレオチドは好ましくは３’→５’方向に合成される。この場合において、出発物質はジオキシリボースまたはリボース環の３’末端を介して支持体に取り付けられた５’ＯＨ保護されたヌクレオシドである。引き続いて付加されるヌクレオチドは、その３’ヒドロキシルが置換ホスファイトまたはホスフェート基を有する５’−保護誘導体の形態である。異なる方法はホスフェート上の置換の型に依存して区別される：ホスホルアミダイト方法は、特に欧州特許（ＥＰ）第６１，７４６号および米国特許第４，４５８，０６６号に記載されており、高いカップリング収率（９８％より大きい）の達成を可能とするので、今日選択される方法の１つである。こうして、３’ヒドロキシルはホスホルアミダイト基を有する（第１図参照）。有機溶媒中のヌクレオシドの溶解度のためのこれらの基の重要性の外に、ホスホルアミダイト基は、第１ヒドロキシル官能、例えば、脱トリチルされた、成長するヌクレオシドまたは鎖の５’位置における第１ヒドロキシル官能、による攻撃に対して、リン原子をいっそう感受性とする。脱保護された５’ヒドロキシル官能は、第２ヌクレオチドのホスホルアミダイト基と反応するために十分に求核性となる。ＤＮＡおよびＲＮＡの固相合成は大きい類似性を有する。モノマーおよび支持体は異なるが、使用装置および試薬は同一である。合成サイクルの終わりにおいて得られたオリゴヌクレオチドを支持体から分離し、そして保護官能は除去しなくてはならない。支持体の切り放し、塩基の脱保護およびリンに結合した基の除去は水性アンモニア溶液中で同時に実施される。ＲＮＡの場合において、エタノールは２’−Ｏ−シリル−オリゴリボヌクレオチドを可溶化し、そして脱シリルを最小することができ、天然のＲＮＡは塩基性条件下に安定ではない。次いで、液相の中に入ったオリゴリボヌクレオチドを含有する水性アンモニア／エタノール溶液をガラス支持体から分離し、そして蒸発させる。シリル基の除去は、室温において１６時間の間フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）の存在下に起こる。次いで、ＴＢＡＦをＴＥＡＡ（酢酸トリエチルアンモニウム）で中和する。また、他の方法、特にいわゆるホスホトリエステル法、ホスホジエステル法、Ｈ−ホスホネート法および、最後に、ホスファイト法が存在する。オリゴヌクレオチドの自動合成に使用できる固体の支持体は、次の特性満足しなくてはならない：１）固体の支持体は、ヌクレオチド、特にホスホルアミダイト、Ｈ−ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホジエステルまたはホスファイト型の官能化３ ’末端と、あるいは使用する合成法に従う任意の他のモノマー試薬と、選択的に反応しなくてはならない；２）支持体−オリゴヌクレオチド結合は合成の条件下に安定でなくてはならない、および３）支持体−オリゴヌクレオチド結合は、オリゴヌクレオチドの脱保護工程のための条件下において、合成の終わりにおいて加水分解されることができなくてはならない、および４）支持体とオリゴヌクレオチドとの間の共有結合は、分離の間に、解放されたオリゴヌクレオチドが自然の型である、すなわち、３’末端のヒドロキシル官能は遊離であるか、あるいは合成から誘導された残基をもたないのようなものでなくてはならない。多数の支持体は、オリゴヌクレオチドの固相合成について文献の中に既に記載されてきている。これらの支持体は、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン（ＮｕｃｌｅｉｃＡ．Ｒｅｓ．１９８０、Ｖｏｌ．８）、多孔質珪藻土上で重合したポリアクリルアミドアクリロイルモルホリド、ポリジメチルアクリルアミド（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ．Ｒｅｓ．９（７）１６９１（１９８０））から成ることができる。記載されている他の支持体は、無機の特質を有するものであり、特にＮＨ₂および／またはＣＯＯＨ基を有する炭化水素基で官能化したシリカに基づく（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．、１０５、６６１（１９８３）か、あるいはオリゴヌクレオチドの製造のためのホスファイトおよびホスホルアミダイトの合成におけるその使用が欧州特許第０，０３５，７１９号に最初に記載された、３−アミノプロピルトリエトキシシラン基で官能化されたシリカに基づく支持体である。しかしながら、これらの支持体は有意な欠点を有する：それらは万能ではなく、そしてオリゴヌクレオチド合成において、その対応するヌクレオチド誘導体、例えば、ＣＰＧ−Ａ、ＣＰＧ−Ｇ、ＣＰＧ−Ｔ、ＣＰＧ−ＣまたはＣＰＧ−Ｄａ、ＣＰＧ−ｄＧ、ＣＰＧ−ｄＵ、ＣＰＧ−Ｄｃを前もって製造した後にのみ使用することができる；これらの誘導体の製造は、また、３’−ｐ−ニトロフェニルスクシネート−ヌクレオシドの前製造を含み、この前製造はより多い時間および試薬のかなりの費用を必要とする。前述の４つの条件、特に最後の条件を満足するために、現在使用されている支持体は、前述したように、合成すべき配列の第１リボヌクレオシドまたはデオキシリボヌクレオシドと結合される。特に、第１ヌクレオチドまたはヌクレオシドの３’（または５’）末端と官能化ポリマーとの間にホスフェート基が存在しない。従って、合成を開始するために、オペレーターは一般に下記式に相当する支持体の中から選択しなくてはならない：（式中、 −Ａは水素原子（デオキシリボヌクレオシド）または保護されていてもよいヒドロキシル基（リボヌクレオシド）を表し、 −Ｂはその環外のアミド官能が保護されていてもよいプリンまたはピリミジンの塩基である。これらの保護剤、一般にベンゾイルまたはイソプチリルは、また、合成の過程において使用される有機溶媒中のその安定化を促進する、 −Ｃは、一般にトリチル型の、５’末端の官能のための通常の保護基、例えば、ジメトキシトリチルであり、 −Ｐは、必要に応じてヌクレオシドの３’位のエステル結合を介して結合された２価の炭化水素基で置換されていてもよい、３’末端に直接結合された有機または無機のポリマーから成る固体の支持体である。本発明の１つの目的は、オリゴヌクレオチドの固相合成法、さらに詳しくは、いわゆる「万能」支持体を使用する、自動合成法を提供することである。「万能支持体」という表現は、ここにおいて、合成すべき第１ＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチドに無関係に、および合成の間に使用するモノマー試薬の型に無関係に、すなわち、合成を５’→３’または３’→５’の方向で実施するかどうかに依存する３’位置または５’位置におけるホスフェート基上における置換型に無関係に、使用することができる固体の支持体を意味する。本発明の他の目的は、自動固相合成と同一の反応条件を包含する方法においてこの「万能支持体」を使用できるようにすることである。特に、本発明の１つの目的は、第１ヌクレオチドを固体の支持体に取り付けるために働くモノマー試薬が、合成の間に配列の他のヌクレオチドを、特に５’保護および３’保護に関して、取り付けるために働くモノマー試薬と同一であるモノマー試薬であるべきであることである。他の目的は、また、固体の支持体が前述の４つの特性に従うべきであることである。特に、本発明が処理しようとする目的における１つの困難は、導入される第１ヌクレオチドが、塩基性媒質中の脱保護の通常の件下において支持体とオリゴヌクレオチドとの間を切り放した後、場合によっては、合成の終わりにおいて、末端の３’または５’ＯＨを遊離できなくてはならない５’または３’ホスフェート基を含有するという事実にある。このような万能支持体を作ることは、従来、例えば、３’ＯＨオリゴヌクレオチドを合成する必要性と、一番最初の塩基から、末端の３’位にホスフェート基を有する通常のモノマー試薬と同一の試薬を直接使用することとの間の明らかな不適合性のために、想像も及ばないとして考えられた。本発明によれば、われわれは、次のように、固体の支持体のポリマーを反応性基を含有する炭化水素基で官能化することに成功した：１）既に合成された鎖の中の末端のヌクレオチドの３’または５’末端を、取り付けるべき次のモノマー試薬のそれぞれの５’または３’末端と、カップリングさせるための条件と同一の条件下において、炭化水素基をモノマー試薬の保護された３’または５’末端にカップリングさせることができ、そして２）この基を介する、固体の支持体とオリゴヌクレオチドとの間の共有結合の最終の切り放しは、オリゴヌクレオチドの最終の脱保護の条件下に起こり、そして３）末端の３’または５’末端におけるヒドロキシル官能は遊離であるか、あるいは、より一般的には、第１ヌクレオチドの末端ホスフェート基が支持体上に残るようなものであることができる。本発明による支持体の固相の「万能性」は、炭化水素基の末端において、ＯＨ基および求核性基が隣接して配置されている、すなわち、２つの隣接する炭素（これらの２つの炭素は必要に応じて不活性基で置換することができる）上に位置する、グリコール型の基を含有する炭化水素基で、無機または有機のポリマーを官能化することによって得られる。「不活性基」という表現は、本発明において、固体の支持体上の核酸の本発明による合成の種々の工程の間に直面する条件下に反応しない基を意味する。従って、本発明は、無機または有機のポリマーを固体の支持体として使用し、前記ポリマーは２価の炭化水素基を介してエポキシド基またはグリコール型の基に結合されており、後者の基は２つの隣接する飽和炭素から成り、その炭素上においてＯＨおよび求核性基がそれぞれ置換されていることを特徴とする、固体の支持体上における合成により核酸を製造する方法である。第１ヌクレオチドは、有利には、第２ヌクレオチドと支持体に結合した第１ヌクレオチドとの縮合と同一の条件下でかつ同一のモノマー試薬を使用して、固体の支持体に取り付けられ、前記条件およびモノマー試薬は固体の支持体上の核酸合成の間に使用される普通の条件およびモノマー試薬であることができ、前記第１ヌクレオチドは前記核酸の配列の中の第１ヌクレオチドに相当する。１つの特定の態様において、本発明の方法は、次の工程からなる：１）カップリング剤を使用して、他の３’末端または５’末端において前記固体の支持体と結合された第１ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’または３’ＯＨ基を、３’および５’位において保護されたヌクレオチドのモノマー試薬のそれぞれ３’または５’位において置換されていてもよいホスフェート基と縮合させ、２）工程１）において得られたホスファイト型の中間ヌクレオチド（internuc leotide）結合を、それぞれ、ホスフェート結合に酸化または硫黄化し、３）工程２）において得られた生成物の５’−Ｏまたは３’−Ｏ末端を脱保護し、４）核酸を合成するために付加すべきヌクレオチドが存在するときに、工程１）〜３）を反復する。より正確には、この方法は、次の工程からなる：１）カップリング剤を使用して、固体の支持体のグリコール型の前記基の前記ＯＨ基を、５’Ｏおよび３−Ｏ位において保護されたヌクレオチドのモノマー試薬の３’または５’位において置換されていてもよいホスフェートまたはホスファイト基と縮合させ、２）工程１）において得られた固体の支持体と第１ヌクレオチドとの間のホスファイト型の共有結合を酸化または硫黄化し、３）工程２）において得られた生成物の５’−Ｏまたは３’−Ｏ末端を脱保護し、４）工程３）において得られた生成物の５’ＯＨまたは３’ＯＨ基を、それぞれ５’−Ｏまたは３’−Ｏ位において保護されたヌクレオチドのモノマー試薬の３’または５’位において置換されていてもよいホスフェート、ホスホロチオエートまたはホスファイト基と、前記カップリング剤を使用して、工程１）と同一条件下に、縮合させ、５）上記工程から生ずるホスファイトホスファイト型の中間ヌクレオチド基を、それぞれ、ホスフェートまたはホスホロチオエート型の基に酸化または硫黄化し、６）工程５）において得られた生成物の５’−Ｏまたは３’−Ｏ末端を脱保護し、７）製造すべき核酸を得るために付加すべきヌクレオチドが存在するときに、工程（４）、（５）および（６）を反復する。上記工程は固体の支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを生じさせる。適当な方法において、本発明による方法は、核酸を支持体から分離し、そして塩基からそして、適当ならば、核酸の２’−Ｏ位置から、保護基を除去する、最終の工程を含む。合成サイクルを開始する前に、固体の支持体が製造すべき配列の第１ヌクレオチドに相当する第１ヌクレオチドと既に結合されている前の技術において、前記支持体は一般に５’または３’位に前記ヌクレオシドの保護を含有する。この場合において、合成サイクルは酸性媒質中の脱保護の工程、一般にジクロロメタン中のＴＦＡ、ＤＣＡまたはＴＣＡを使用する脱トリチル反応で開始する。本発明によれば、この方法は、また、脱保護工程で開始し、次いでエポキシド基を含有する本発明による支持体を初期の固体の支持体として使用することができる。本発明による方法は、この場合において、無水の酸性媒質中で、固体の支持体のグリコール型の前記基を与えるために、５’または３’ＯＨ基の脱保護用の通常の条件下において、前記固体の支持体の前記エポキシド基を開環する前工程を含む。本発明は、また、次の式の化合物および本発明による核酸を合成する方法において固体の支持体としてそれらを使用することである。（式中、 −Ｒ₁、Ｒ’₁、Ｒ”₁、Ｒ₂およびＲ’₂の１つは無機または有機のポリマーその他はＨまたは不活性基、例えば、特に１または２以上のハロゲンで、置換されていてもよいアルキル基を表し、 −Ｎｕは求核性基、例えば、ＮＨ₂、−Ｏ−Ａｌｋ、−ＮＨＡｌｋ、−Ｎ（Ａｌｋ）₂、−ＮＨＡｃ、−ＯＡｃ、−Ｓ−Ａｃ、−Ｓ−Ａｌｋまたはハロゲンを表し；基ＡｌｋおよびＡｃは、それぞれ、Ｃ₁−Ｃ₇、好ましくはＣ₁−Ｃ₄アルキルおよびアシル基を表し、前記基は、特に１または２以上のハロゲンで、置換されていてもよい。）特に、Ｎｕが−Ｎ（Ａｌｋ）₂、−ＮＨＡｃ、−Ｏ−Ａｃ、−ＳＡｃおよびハロゲンである化合物が挙げられる。適当な態様において、前記支持体は下記式の１つであることができる。（式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＮｕは前述の意味を有する。）更に簡潔には、前記化合物は、下記式の１つに相当する：一の態様の変形によれば、Ｒ₁およびＲ₂またはＲ’₁およびＲ’₂は一緒になって、ポリマーが置換されている環、特に複素環、を形成する。特に、（Ｒ₁およびＲ₂）または（Ｒ’₁およびＲ₂）は一緒になってリボーされている２’−Ｏ官能を表すことができる。適当な方法で、本発明による核酸の合成法において、前記固体の支持体は本発明による化合物（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）または（Ｉ’）および（Ｉ’ｂ）から成る。最も普通に使用される変法によれば、前記ヌクレオチドのモノマー試薬は、下記式に相当する。（式中、 −ＡはＨまたは保護されていてもよいヒドロキシル基を表し、 −Ｂはその環外のアミン官能が保護されていてもよいプリンまたはピリミジンの塩基であり、 −Ｃは５’−ＯＨ官能の通常の保護基であり、 −ｘは０または１であり、ここでａ）ｘ＝１のとき：Ｒ₃はＨを表し、そしてＲ₄は負に帯電した酸素原子を表すか、あるいはＲ₃は酸素原子であり、そしてＲ₄は酸素原子または保護基を有する酸素原子を表し、そしてｂ）ｘ＝０のとき：Ｒ₃は保護基を有する酸素原子であり、そしてＲ₄はハロゲンまたは２置換アミン基である。 −ｘが１に等しく、Ｒ₃が酸素原子でありそしてＲ₄が酸素原子であるとき、この置換はいわゆるホスホジエステル法に関し、Ｒ₄が保護基を有する酸素原子であるとき、この置換はいわゆるホスホロトリエステル法に関する。 −ｘが１等しく、Ｒ₃が水素原子であり、そしてＲ₄が水素原子であり、そしてＲ₄が負に帯電した酸素原子であるとき、この置換はいわゆるＨ−ホスホスホネート法に関し、そして −ｘが０に等しく、Ｒ₃が保護基を有する酸素原子であり、そしてＲ₄がハロゲンであるとき、この置換はいわゆるホスファイト法に関し、そして、Ｒ₄が２置換アミン型の離脱基であるとき、この置換はいわゆるホスホルアミダイト法に関する。本発明による式Ｉ、Ｉ’およびＩＩの支持体−試薬を、通常のモノマー試薬ＩＩＩと、次の反応の概要に従い、固体の支持体上の核酸の合成法において酸性媒質中の縮合条件下に反応させる。述の意味を有する。さらに、最後の工程後に実施する最後の分離および脱保護工程の条件下において、（３’または５’）ホスフェート基が支持体に取り付けられたままである支持体から合成されたオリゴヌクレオチドを分離する。３’→５’方向の合成の場合において、下記の反応の概要は、式ＩまたはＩ’の固体の支持体を使用するときの、この最後の工程を例示する。化合物（Ｖ）および（ＶＩ）において、Ｄはオリゴヌクレオチドを表し、そして他のパラメーターは前述の意味を有する。この反応は弱く塩基性の媒質中で起こり、そしてβ−脱離によるＣ−５環化を生ずる。式（ＩＩ）の化合物は、事実、基Ｒ₁ＣＯ−Ｏが求核性基であるかぎり、基Ｎｕがポリマーを含有する、式（Ｉ）の化合物に相当する。式ＩＩの固体の支持体を使用するとき、これは次の反応の概要を与える。この反応の概要において、ポリマーはＲ₂の中に存在することができる、すなわち、ホスフェート環上またはＲ₁の中で置換されることができる。ポリマーとして、ガラスの微小ビーズまたは微小繊維、特に多孔質のもの、シリカ、金属酸化物または有機ポリマー、特にセルロースまたは置換されていてもよいポリスチレンから成る材料から作られたポリマーが挙げられる。ポリマーは、好ましくは、ガラスまたはシリカの基材、特にシリカゲルの基材、から作られた無機ポリマーである。式（Ｉ）、（Ｉ’）および（ＩＩ）の化合物は、当業者に知られている方法により、そして入手可能な試薬を使用して製造することができる。式（Ｉ）、（Ｉ’）および（ＩＩ）の化合物は、例えば、ＣＯＯＨまたはＮＨ₂ 基で官能化されたポリマーから製造することができ、このポリマーは、既知の方法で、下記化合物の、それぞれ、末端の官能Ｘ＝ＮＨ₂またはＣＯＯＨと反応させる。 −基ＮｕおよびＯＨは保護基で保護されていてもよく、こうしてアミド結合が確立される。明らかなように、上の反応の概要において、Ｘ−ＲはＲ’₁における置換とちょうど同じように容易に置換されることができる。式（Ｉ’）および（ＩＩ）の化合物は、また、この同一の型の反応に従い、Ｒ”₁に置換されている化合物を使用して出発して製造することができる。から製造することができる。固体の支持体が式（Ｉ）により表されるとき、それは、また、式のエポキシド環を、無水の、酸性または塩基性の媒質中で、それぞれ、ＳＮ₁またはＳＮ₂置換機構に従い、前記媒質中のＨＮｕ（ここでＮｕは前記求核性基を表す）の存在下に、開環する反応により製造することができる。は次の反応の概要に従い、実施例６に例示する条件下において、カルボキシル官能で官能化されたポリマー（この型のポリマーは商業的に入手可能である）を使用して出発して製造することができる。シリカから作られた無機のポリマーを使用するとき、そのＳｉ−ＯＨ基を化合物：と、当業者に知られている条件下において、例えば、実施例１に例示されているように５０℃において、反応させることができ、ここで化合物（１）は固相の表面を１０％のグリシジルオキシプロピルトリメトキシシランでアセトニトリル溶液中で処理するか、あるいはエポキシドを含有する他の試薬で処理し、次いで制御条件下においてエポキシド環を開環することによって得られる。本発明による固体の支持体の利点および核酸の合成法、特に自動合成におけるその使用は、次の通りである： − 通常の支持体と比較したとき、製造が極めて簡単である； − その容量（モル／グラム）は標準の支持体のそれと同一である； −その原理を固体の支持体として使用するすべての型の材料に適用することができる（ＣＰＧ）ポリマー相、膜など）； −オリゴヌクレオチドの合成のパラメーターは変更されず、支持体はすべての合成装置と適合する； −ＤＮＡまたはＲＮＡの合成法において、脱保護工程は標準の支持体についてと同一の条件下に実施される； −ＤＮＡまたはＲＮＡの合成法において、支持体の使用者が行う追加の工程は存在しない； −支持体は末端の３’末端において修飾されたオリゴヌクレオチドの製造のために、第１サイクルにおいて、修飾の所望の性質に相当するモノマーを直接使用することによって、利用することができる； −製造にただ１つの支持体を有するという事実は、簡素化を生じ、そしてオリゴヌクレオチドの合成のコストを実質的に減少する； −万能支持体は、オリゴヌクレオチドの合成に現在要求される種々の反応器の管理をかなり簡素化する； −最後に、万能支持体は、合成すべき配列に関して各反応器の独立性によりかなり簡素化される、多反応器の合成系の設計を可能とする。下記一般式は、本発明による固体の支持体の化合物を例示する。（式中、もしくは有機ポリマー、例えば、ポリスチレンであり、そしてｋは１〜２０の範囲であることができる整数であり、ｌは０〜１の範囲であることができる整数であり、ｍは０〜１の範囲であることができる整数であり、ｎは１〜１００の範囲であることができる整数であり、Ｘは−Ｈ、−Ｎ（Ａｌｋ）、−ＮＨＡｃｙｌ、−ＯＡｃｙｌ、−ＳＡｃｙｌまたはＨａｌであり、本発明の他の特性および利点は、次の実施例を読むと明らかとなるであろう。以下の実施例１〜６において、アプライド・バイオシステムス（ＡＰＰＬＩＥＤＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）３９４（商品名）合成装置を使用した。使用した方法はホスホルアミダイト法である。伸長は支持体に取り付けられた第１ヌクレオチドを使用して出発して３’→５ ’方向に実施する。ヌクレオチドの付加に相当する、１つの合成サイクルは、また、３工程：アンマスキング、カップリングおよび酸化からなる。アンマスキング工程（または脱トリチル反応）の間に、基Ｄｍｔｒにより保護された合成を行うオリゴヌクレオチドの末端の５’−ヒドロキシルは、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の作用下に脱保護される。こうして解放されたトリチルカチオンは、酸性条件下に、４９８ｎｍにおける吸収を有し、これによりトリチルカチオンをアッセイし、そして反応についての収率を推定することができる。縮合工程の間に、大過剰で送り出されるモノマー試薬のホスホルアミダイト基はテトラゾールにより活性化され、そして遊離の末端５’ヒドロキシルと反応して、ホスファイト型の中間ヌクレオチド結合を形成する。次いで、不安定な（３価の）ホスファイトは水およびヨウ素の存在下に（５価の）ホスホトリエステルに酸化される。カップリング収率は９７〜９９％である；未反応のオリゴヌクレオチドの５’ ヒドロキシルを非反応性とすることが必要である。この操作は、次のサイクルの間のこれらの端が切り取られた鎖の拡張を回避することができる。「キャッピング」のこの第４工程は、５’ヒドロキシルを酢酸無水物およびＮ−メチルイミダゾールでアシル化することから成る。より正確には、種々の工程において使用する試薬は次の通りである：１）脱トリチル反応およびカップリング下の式ＡおよびＢは、それぞれ、支持体に取り付けられたヌクレオシドおよびホスホルアミダイトモノマーモノマー試薬を概略的に表し、ここでＲ₁＝Ｒ₂＝−ＣＨ（Ｈ₃）₂ Ｒ₃＝−（ＣＨ₂）₂−Ｃ≡Ｎである。反応の概要１は脱トリチル反応を表す。反応の概要２は縮合反応を表す。支持体に取り付けられたヌクレオシド：ホスホルアミダイト：２）キャッピング：３）酸化：実施例１アセトニトリル中の３−グリシジルオキシプロピルメトキシシランの１０％の溶液の５ｍｌ中の１ｇの多孔質ガラス粉末（ＣＰＧ００３５０Ｃ（商品名）；ｆ；ＣＰＧＩＮＣ．米国）、この混合物を５０℃の温度において３０分間放置し、次いで支持体を濾過により分離し、アセトニトリル（３×５ｍｌ）で洗浄し、そして真空下に乾燥する。エポキシド環の開環後、ピリジン中の塩化ジメトキシトリチルの反応、引き続いて過塩素酸とエタノールとの混合物中のトリチルカチオンの４９５ｎｍにおける吸収分光光度測定により、オキシ基の数を決定する。５０〜１００マイクロモル／１ｇの支持体の容量が得られる。実施例２実施例１において得られた支持体の１ｍｇを反応器に充填し、そして前述の標準のホスホルアミダイト法に従い、エポキシド環を開く脱トリチル条件下に第１工程により、オリゴヌクレオチドｄ（ＡＴＧＣ）を合成する。合成後、オリゴ− ＣＰＧを３０μｌの濃水性アンモニア溶液中で１００℃に１時間加熱する。分析の目的のために、オリゴヌクレオチド（その最後のヌクレオチドは５’位置において保護されており、簡素化のために以後ＯＮ−トリチルと呼ぶ）を逆相カラムのＨＰＬＣにより遊離させる。実施例３Ｈ−ホスホネート法に従いｄ（ＡＧＴＣ）の合成により、実施例２の合成を実施する。Ｈ−ホスホネート法によりオリゴデオキシヌクレオチドの合成に関し、次を使用する： −前述のモノマー（式ＩＩＩ）； −合成の原理は、次のわずかの差を除外して、ホスホルアミダイト法の原理と同一である：・使用する活性化剤は塩化アダマントイルまたは塩化ピバロイルである、・ただ１つの酸化工程を合成の終わりに実施する； −脱保護はホスホルアミダイトと同一の条件下に実施する。実施例４実施例２と同一の支持体を使用して、ＲＮＡ系列におけるＡＧＴＣの合成により、合成を実施する。オリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の合成に関し、モノマーは５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−３’−Ｏ−β−シアノエトキシジイソプロピルアミノホスフィン−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリルーヌクレオシド（式ＩＩＩ、Ａ＝ｔ− ブチルジメチルシリル）型である。合成法はいわゆるホスホルアミダイト法である。前述したように、脱保護は追加の工程を必要とする。実施例５実施例１において得られた支持体を、反応器の中で、１％のジクロロメタンの濃度のＨＣｌ溶液で洗浄する。Ｎｕ＝Ｃｌのグリコール型の支持体が得られ、そして合成を再びホスホルアミダイト法の標準の条件下に実施する。オリゴヌクレオチドの処理および分離を実施例２におけるように実施する。約９０％のＯＮ− トリチルオリゴヌクレオチドが得られる。実施例６ガラス繊維のディスク（φ４．７ｃｍ、１ｇ、ｆ．ＷＡＴＭＡＮ（商品名））の形態の膜を実施例１のように処理する。２０μｍｏｌのオキシ基／１ｇの支持体の容量をもつ支持体が得られる。実施例７実施例４において得られたディスクを使用して、ディスクを切断し（φ４ｍｍ、１ｍｇ）そして合成、処理およびオリゴヌクレオチドｄ（ＡＧＴＣ）の分離を実施例３のように実施する。少なくとも９０％のＯＮ−トリチルオリゴヌクレオチドが得られる。実施例８カルボキシメチルを含有する支持体ＣＰＧＣＭＬ（商品名）００３５０Ｃ（ＣＰＧＩＮＣ）の１ｇを、１０％のジクロロメタンの濃度のエチレンオキシドの溶液の５ｍｌで５０℃の温度において１時間処理する。支持体を濾過により単離し、ジクロロメタンで洗浄し、そして真空下に乾燥する。５０〜１００μｍｏｌのオキシ基／１ｇの支持体の容量をもつ支持体が得られる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ０８Ｆ 12/00 Ｃ０８Ｆ 12/00

Claims

【特許請求の範囲】１．無機または有機のポリマーを固体の支持体として使用し、前記ポリマーは２価の炭化水素基を介してエポキシド基またはグリコール型の基に結合されており、後者の基は２つの隣接する飽和炭素から成り、その炭素上においてＯＨおよび求核性基がそれぞれ置換されていることを特徴とする、固体の支持体上における合成により核酸を製造する方法。２．第２ヌクレオチドと支持体に結合した第１ヌクレオチドとの縮合と同一の条件下でかつ同一のモノマー試薬を使用して、第１ヌクレオチドが有利には固体の支持体に取り付けられ、前記条件およびモノマー試薬は固体の支持体上の核酸合成の間に使用される普通の条件およびモノマー試薬であることができ、前記第１ヌクレオチドは前記核酸の配列の中の第１ヌクレオチドに相当することを特徴とする、請求項１に記載の方法。３．下記工程：１）カップリング剤を使用して、他の３’末端または５’末端において前記固体の支持体と結合された第１ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’または３’ＯＨ基を、３’および５’位において保護されたモノマーのヌクレオチド試薬のそれぞれ３’または５’位において置換されていてもよいホスフェート基と縮合させ、２）工程１）において得られたホスファイト型の中間ヌクレオチド結合を、それぞれ、ホスフェートまたはホスホロチオエートの結合に酸化または硫黄化し、３）工程２）において得られた生成物の５’−Ｏまたは３’−Ｏ末端を脱保護し、４）核酸を合成するために付加すべきヌクレオチドが存在するときに、工程１）〜３）を反復する、を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。４．下記工程：１）カップリング剤を使用して、固体の支持体のグリコール型の前記基の前記ＯＨ基を、５’−Ｏおよび３−Ｏ位において保護されたモノマーのヌクレオチド試薬の３’または５’位において置換されていてもよいホスフェートまたはホスファイト基と縮合させ、２）工程１）において得られた固体の支持体と第１ヌクレオチドとの間のホスファイト型の共有結合を酸化または硫黄化し、３）工程２）において得られた生成物の５’−Ｏまたは３’−Ｏ末端を脱保護し、４）工程３）において得られた生成物の５’ＯＨまたは３’ＯＨ基を、それぞれ５’−Ｏまたは３’−Ｏ位において保護されたモノマーのヌクレオチド試薬の３’または５’位において置換されていてもよいホスフェート、ホスホロチオエートまたはホスファイト基と、前記カップリング剤を使用して、工程１）と同一条件下に、縮合させ、５）上記工程から生ずるホスファイトホスファイト型の中間ヌクレオチド基を、それぞれ、ホスフェートまたはホスホロチオエート型の基に酸化または硫黄化し、６）工程５）において得られた生成物の５’−Ｏまたは３’−Ｏ末端を脱保護し、７）製造すべき核酸を得るために付加すべきヌクレオチドが存在するときに、工程（４）、（５）および（６）を反復する、を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。５．核酸を支持体から分離し、そして塩基からそして、適当ならば、核酸の２’−Ｏから保護基を除去する、最終工程を含むことを特徴とする、請求項４に記載の方法。６．無水の酸性媒質中で、固体の支持体のグリコール型の前記基を与えるために、５’−または３’−ＯＨ基の脱保護用の通常の条件下において、前記固体の支持体の前記エポキシド基を開環する前工程を含むことを特徴とする、請求項４または５に記載の方法。７．下記式により表される化合物。（式中、 −Ｒ₁、Ｒ’₁、Ｒ”₁、Ｒ₂およびＲ’₂の１つは無機または有機のポリマーあるいは無機または有機のポリマーで置換された炭化水素基を表し、そしてその他は同一であるか、または異なっていてもよく、互いに独立して、Ｈまたは不活性基、例えば、特に１または２以上のハロゲンで、置換されていてもよいアルキル基を表し、 −Ｎｕは求核性基、例えば、ＮＨ₂、ハロゲン、−ＯＡｌｋ、−ＳＡｌｋ、−ＮＨＡｌｋ、−ＮＨＡｃ、−ＯＡｃ、−ＳＡｃまたは−Ｎ（Ａｌｋ）₂を表し、ここでＡｌｋおよびＡｃは、それぞれ、アルキルおよびアシル基を表し、前記基は、特に１または２以上のハロゲンで、置換されていてもよい）８．Ｎｕが−Ｎ（Ａｌｋ）₂、−ＮＨＡｃ、−ＯＡｃ、−ＳＡｃまたはハロゲンを表し、ここでＡｌｋおよびＡｃは、それぞれ、１または２以上のハロゲンで置換されていてもよいＣ₁−Ｃ₄アルキルおよびアシル基を表すことを特徴とする、請求項７に記載の化合物。９．前記固体の支持体が下記式の１つに相当することを特徴とする、請求項７または８に記載の化合物。（式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびＮｕは請求項７で定義された意味を有する）１０．前記固体の支持体が下記式の１つに相当することを特徴とする、請求項９に記載の化合物。１１．（Ｒ₁およびＲ₂）または（Ｒ’₁およびＲ’₂）が一緒になって、ポリマーが置換されている環、特に複素環、を形成することを特徴とする、請求項７〜９のいずれか一項に記載化合物。１２．（Ｒ₁およびＲ₂）または（Ｒ’₁およびＲ₂）が一緒になってリボいる２’−Ｏ官能を表すことを特徴とする、請求項１１に記載の組成物。１３．前記固体の支持体が請求項７〜１０いずれか一項に記載の化合物から成ることを特徴とする、請求項１〜６いずれか一項に記載の方法。１４．前記ヌクレオチドのモノマー試薬が、下記式に相当することを特徴とする、請求項２〜６および１３いずれか一項に記載の方法。式中、 −ＡはＨまたは保護されていてもよいヒドロキシル基を表し、 −Ｂはその環外のアミン官能が保護されていてもよいプリンまたはピリミジンの塩基であり、 −Ｃは５’−ＯＨ官能の通常の保護基であり、 −ｘは０または１であり、ここでａ）ｘ＝１のとき：Ｒ₃はＨを表し、そしてＲ₄は負に帯電した酸素原子を表すか、あるいはＲ₃は酸素原子であり、そしてＲ₄は酸素原子または保護基を有する酸素原子を表し、そしてｂ）ｘ＝０のとき：Ｒ₃は保護基を有する酸素原子であり、そしてＲ₄はハロゲンまたは２置換アミン基である）１５．モノマー試薬が式（ＩＩＩ）に相当し、ここでｘが０であり、Ｒ₃が保護基を有する酸素原子であり、そしてＲ₄が２置換アミン基である、ホスホルアミダイト合成法であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。１６．ポリマーがガラスの微小ビーズまたは微小繊維、特に多孔質のもの、シリカ、金属酸化物、セルロースまたは有機ポリマー、特にセルロースの形態であることを特徴とする、請求項１〜６および１３いずれか一項に記載の方法。１７．ポリマーが、特にガラスまたはシリカの基材から作られた、無機ポリマーであることを特徴とする、請求項１〜６および１３いずれか一項に記載の方法。