DE68928582T2

DE68928582T2 - Automatisches System zur Herstellung und Reinigung von Polynucleotiden

Info

Publication number: DE68928582T2
Application number: DE68928582T
Authority: DE
Inventors: William A Andrus; Christie D Mccollum; Gerald Zon
Original assignee: Perkin Elmer Corp
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1988-12-21
Filing date: 1989-12-14
Publication date: 1998-07-23
Anticipated expiration: 2009-12-15
Also published as: JPH0753749B2; JPH0368593A; US5047524A; EP0794001B1; EP0375278B1; EP0794001A2; DE68929255D1; DE68929255T2; EP0794001A3; DE68928582D1; EP0375278A2; EP0375278A3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Herstellung und Reinigung von Polynucleotiden, und genauer auf automatische Techniken der Festphasenherstellung und -reinigung von Polynucleotiden mit Phosphoramidit und/oder Hydrogenphosphonat.
Ein Hauptfaktor für die neuesten Fortschritte in der Molekularbiologie war die Entwicklung zuverlässiger und zweckmäßiger Verfahren zur Herstellung von Polynucleotiden, z.B. Itakura, Science, Bd. 209, S. 1401-1405 (1980); und Wallace et al., S. 631-663, in Scouten, Hrsg., Solid Phase Biochemistry (John Wiley & Sons, New York, 1982). Da die Verwendung synthetischer Polynucleotide gestiegen ist, ist auch die Nachfrage nach noch größerer zweckmäßigkeit bei der Herstellung reiner, gebrauchsfertiger Polynucleotide gestiegen. Diese Nachfrage hat die Entwicklung vieler Verbesserungen bei den Basisverfahren für die Festphasenherstellung angeregt, z.B. Sinha et al., Nucleic Acids Research, Bd. 12, S. 4539-4557 (1984) (beta-Cyanoethyl in Phosphoramidit); Froehler et al., Tetrahedron Letters, Bd. 27, S. 469-472 (1986) (H-phosphonat); Germann et al., Anal. Biochem., Bd. 165, S. 399-405 (1987); und Ikuta et al., Anal. Biochem., Bd. 56, S. 2253-2256 (1984) (schnelle Reinigung synthetischer Oligonucleotide mittels Tritylanteilen); Molko et al., Europäische Patentschrift 241363 vom 3. April 1987 (verbesserte basenlabile Acyl-Schutzgruppen für exozyklische Amine), und ähnliche.
Verfahren zur Festphasenoligonucleotid-Herstellung durch sequentielle Zugabe von Monomeren, die endblokkiert sind und deren aktive Funktionen geschützt sind, zu einer wachsenden Kette, die über eine selektiv abspaltbare Bindung an einen Träger gebunden ist, sind in EP 0196101 beschrieben.
Potapov et al., Doklady Akademii Nauk SSSR, Bd. 16, Nr. 2, S. 360-363 (1971) beschreibt Kopplungserträge von bis zu 80% bei der Herstellung von Tetrapolynucleotiden mit dem Phosphodiester-Verfahren unter Verwendung eines Festträgers, der entweder aus isotaktischem Polystyrol oder einem stark quervernetzten Copo lymer aus Styrol und Divinylbenzol (bis zu 40%) besteht. Solche Erträge sind jedoch für praktische Anwendungen höchst ungeeignet.
Armarnath et al., Chemical Reviews, Bd. 77, Nr. 2, S. 183-217 (1977) beschreibt die Herstellung von Oligonucleotiden unter Verwendung von Phosphodiestermonomeren auf einem stark porösen, nicht quellbaren Polystyrolträger. Dieser Ansatz führte jedoch zu enttäuschend niedrigen Erträgen.
Gait, S. 435-456, in Hodge, Hrsg., Polymer supported Reactions in Organic Synthesis (John Wiley & Sons, New York, 1980) beschreibt eine Vielzahl von Polystyrolträgern, die verwendet wurden, daraus ging jedoch kei ne zuverlässige Herstellungsmethode hervor. Die Aufmerksamkeit richtete sich auch vergebens auf die Identifikation neuer Polymerträger.
Bei derzeit bevorzugten Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Polynucleotiden wird derivatisiertes Controlled Pore Glass (CPG) verwendet, Schwierigkeiten bleiben jedoch bestehen. CPG kann für falsche Angaben von Kopplungserträgen verantwortlich sein, z.B. Pon et al., Biotechniques, Bd. 6, S. 768-775 (1988). Außerdem fehlt es CPG, wie den meisten Gläsern, an chemischer Stabilität in einigen der stark ätzenden Reagenzien zur Entfernung der Schutzgruppe, z.B. konzentriertem Ammoniak und Trichloressigsäure, die bei der Herstel lung von Polynucleotiden verwendet werden. Folglich kann der CPG-Träger bei der Entfernung der Schutzgruppe abgebaut werden und selbst eine Kontaminationsquelle für das Endprodukt darstellen. Dieses Problem wird durch die relativ langen Reaktionszeiten verstärkt, die erforderlich sind, um die derzeit verwendeten Schutzgruppen für exozyklische Amine zu entfernen. Ein längerer Zeitraum ist für die Entfernung der Schutzgruppe erforderlich, nachdem das Polynucleotid vom Festphasenträger abgespalten wurde. Dadurch war die vollständige Automatisierung der Herstellung und Reinigung nicht möglich. Ein weiteres Problem bei CPG ist, daß seine Oberfläche das Kettenwachstum an anderen Stellen als denen, die mit dem 5'-Terminus eines angehängten Nucleosids assoziiert sind, unterstützt.
Dieses "externe" Kettenwachstum verursacht eine heterogene Population 5'-blockierter (üblicherweise tritylierter) Polynucleotide. Normalerweise fehlen den "externen" tritylierten Produkten ein oder mehrere 3'-Nucleotide. Dies verhindert natürlich eine erfolgreiche Ausnutzung der relativ hohen Hydrophobizität der Trityl-Gruppe, um die Polynucleotide mit der "richtigen Sequenz" zu reinigen. Externe Ketten mit der falschen Sequenz werden ebenfalls trityliert.
Angesichts des oben Gesagten könnte die Herstellung von Festphasen-Nucleotiden durch die Verfügbarkeit alternativen Trägermaterials mit den günstigen mechanischen Eigenschaften von CPG, aber auch einer höheren chemischen Stabilität unter den Reaktionsbedingungen der Polynucleotidherstellung, das externem Kettenwachstum während der Herstellung weniger Gelegenheit bietet, bedeutend vorangebracht werden. Die Verwendung solcher Materialien, zusammen mit verbesserten exozyklischen Schutzgruppen, würde die Automatisierung der Herstellung und Reinigung von Polynucleotiden in einem einzigen Gerät ermöglichen.
Die Erfindung bezieht sich auf ein System und ein Verfahren zur automatischen Herstellung und Reinigung von Polynualeotiden. wichtige Merkmale der Erfindung sind die Verwendung eines stark quervernetzten porösen Polystyrolträgers für die Herstellung von Festphasen- Nucleotiden durch H-phosphonat und/oder Phosphoramidit, sowie schnelle Direktreinigung des Syntheseprodukts. Die Verwendung des Polystyrolträgers senkt die Anzahl an Fehlsequenzen, die durch externe Initiation von Polynucleotid-Kettenwachstum auf dem Trägermaterial verursacht wird, erheblich. Der Polystyrolträger ermöglicht auch die Entfernung der Schutzgruppe des Polynucleotids in Anwesenheit des Trägermaterials durch seine höhere Stabilität in Anwesenheit von Reagenzien zur Aufhebung der Schutzgruppe.
Vorzugsweise sind die exozyklischen Amine der monomerischen Nucleosid-Zwischenprodukte durch Acyl- Schutzgruppen der Form -COCHR&sub1;R&sub2; geschützt, wobei R&sub1; ein H oder ein niederer Alkylrest ist und R&sub2; ein H oder ein niederer Alkyl-, niederer Alkoxy-, niederer Aryloxy oder substituierter niederer Aryloxyrest ist. Vorzugsweise sind die Substituenten des niederen Aryloxyrests elektronenentziehend, wie Nitro, Cyan oder Sulfonat.
Der Begriff "niederer Alkylrest" bezieht sich hierin auf geradkettige, verzweigte oder zyklische Alkylreste, die zwischen einem und 6 Kohlenstoffatomen enthalten. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff "niederer Alkoxyrest" auf einen Methoxy-, Ethoxy-, Isopropoxy-, tert-Butyloxy-Rest oder ähnliches. Vorzugsweise bezieht sich der Begriff "niederer Aryloxyrest" auf einen Phenoxy-, Naphthoxy-, Biphenyloxy-Rest oder ähnliches.
"Elektronenentziehend" bezeichnet die Tendenz eines Substituenten, Valenzelektronen des Moleküls, von dem es getrennt ist, anzuziehen, d.h. es ist elektronegativ, March, Advanced Organic Chemistry, S. 16-18 (John Wiley, New York, 1985).
Diese Acyl-Schutzgruppen ermöglichen bei Verwendung mit den erfindungsgemäßen Polystyrolträgern die Entfernung der Schutzgruppe der exozyklischen Amine und die Abspaltung des Polynucleotids vom Festphasenträger in einem einzigen Schritt. Außerdem kann auch die Entfernung der Schutzgruppe der Internucleosidphosphate bewirkt werden, wenn beim Ansatz mit Phosphoramidit beta-Cyanoethyl-Schutzgruppen verwendet werden. Der einzige Schritt zur Entfernung der Schutzgruppe und Abspaltung erfolgt so schnell, daß das gesamte Verfahren der Herstellung und Reinigung automatisiert werden kann.
Vorzugsweise werden die Polynucleotide mit der richtigen Sequenz aus der Rohmischung gereinigt, die von der Reaktionssäule abgespalten wurde, indem die Rohmischung über ein Adsorbens geführt wurde, das vorzugsweise die 5'-blockierende Gruppe der Polynucleotide mit der richtigen Sequenz adsorbiert. Wenn die 5'-blockierende Gruppe ein Trityl ist, ist als Adsorbens ein nicht-quellbarer Polystyrolfeststoff vorzuziehen.
Fig. 1 stellt ein bevorzugtes Gerät zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in Diagrammform dar.
Fig. 2 veranschaulicht ein Autoradiogramm für zwei Herstellungsverfahren von 18-mer Oligonucleotiden, eines auf CPG (Spuren 1 und 2, roh bzw. gereinigt) und das andere auf Polystyrol (Spuren 3 und 4, roh bzw. gereinigt).
Die Erfindung ist ein Verfahren und ein System zur Herstellung gereinigter Oligonucleotide und/oder Polynucleotide mit einer vorbestimmten Sequenz. Das Verfahren weist folgende Schritte auf: (i) Herstellung eines nicht quellbaren porösen Polystyrolträgers; (ii) Herstellung eines 5'-blockierten Nucleosids mit einer 3'-OH-Gruppe und einer 5'-OH-Gruppe, wobei das 5'-blockierte Nucleosid an den nicht quellbaren Polystyrolträger gebunden ist, üblicherweise durch eine basenlabile Bindung zwischen der 3'-OH-Gruppe des ge schützten Nucleosids und dem Träger, so daß das 5'-blockierte Nucleosid eine geschützte Kette mit der richtigen Sequenz bildet; (iii) Entfernung der Schutzgruppe von der 5'-OH-Gruppe der Kette mit der richtigen Sequenz; (iv) Reaktion der 5'-OH-Gruppe der Kette mit der richtigen Sequenz mit einem 5'-blockierten Nucleosidmonomer, das aus folgender Gruppe ausgewählt wurde: 5'-blockierte Nucleosid-3'-phosphoramidite und 5'-blockierte Nucleosid-3'-hydrogenphosphonate, so daß sie entweder eine Kette mit der richtigen Sequenz oder eine Fehlsequenz bilden, wobei die Fehlsequenz eine 5'-OH-Gruppe hat; (v) capping der Fehlsequenz durch Reaktion eines Capping-Reagenzes mit der 5'-OH-Gruppe der Fehlsequenz; (vi) Wiederholung der Schritte (iii)- (v), bis das Polynucleotid mit der vorbestimmten Sequenz entsteht; (vii) Entfernung der Schutzgruppe der exozyklischen Amine des Polynucleotids und Abspaltung des Polynucleotids vom nicht quellbaren porösen Polystyrolträger zur Bildung einer Abspaltungsmischung; und (viii) Aufreinigung des Polynucleotids aus der Abspaltungsmischung. Vorzugsweise wird beim Aufreinigungsschritt die Abspaltungsmischung einem stark quervernetzten Polystyroladsorbens ausgesetzt, wobei das blockierte Polynucleotid von der Fehlsequenz separiert wird, indem das Polystyroladsorbens gewaschen wird, um vorzugsweise die Fehlsequenzen zu entfernen, wobei die Schutzgruppe der 5'-OH-Gruppe des Polynucleotids entfernt und das Polynucleotid vom Polystyroladsorbens eluiert wird. Vorzugsweise oxidiert beim Reaktionsschritt der Internucleosidphosphor im Phosphoramidit vom trivalenten in den pentavalenten Zustand. Vorzugsweise umfaßt das Verfahren den weiteren Schritt der Oxidierung des Internucleotidphosphors vom trivalenten in den pentavalenten Zustand vor der Entfernung der Schutzgruppe im H-phosphonat.
Der Begriff "Polynucleotid" bezieht sich hierin auf eine einsträngige Kette aus Desoxyribonucleotiden oder Ribonucleotiden mit wenigen, z.B. 2-20, bis hin zu vielen, z.B. 20 bis zu mehreren Hundert oder mehr, Nucleotiden. Der Begriff umfaßt auch Nucleosidketten, die durch Analoga der Phosphatbindung, z.B. Thiophosphate und ähnliches, verbunden sind.
Detaillierte Verfahren für die Herstellung von Polynucleotiden mit Phosphoramidit und Hydrogenphosphonat sind in folgenden Schriften beschrieben, die zu Referenzzwecken beigefügt werden: Caruthers et al., US- Patente 4,458,066 und 4,500,707; Koester et al., US- Patent 4,725,677; Matteucci et al., J. Amer. Chem. Soc., Bd. 103, S. 3185-3191 (1981); Caruthers et al., Genetic Engineering, Bd. 4, S. 1-17 (1984); Jones, Kap. 2, und Atkinson et al., Kap. 3, in Gait, Hrsg., Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Washington, DC., 1984); Froehler et al., Tetrahedron Letters, Bd. 27, S. 469-472 (1986); Garegg et al., Tetrahedron Letters, Bd. 27, S. 4051-4054 und 4055-4058 (1986); Froehler et al., Nucleic Acids Research, Bd. 14, S. 5399-5407 (1986); Usman et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 109, S. 7845-7854 (1987); Froehler, Tetrahedron Letters, Bd. 27, S. 5575-5578 (1986); und Andrus et al., Tetrahedron Letters, Bd. 29, S. 861-864 (1988)
Ein wichtiges Merkmal der Erfindung ist die Verwendung eines nicht quellbaren porösen Polystyrolträgers zur Herstellung. Der Begriff "nicht quellbar" bedeutet hierin, daß das poröse Polystyrolmaterial im wesentlichen mechanisch starr bleibt und insbesondere nicht an Volumen zunimmt, wenn es Lösungsmitteln, Reaktanten und Phosphoramidit und/oder Hydrogenphosphonat ausgesetzt wird. Mechanische Starrheit ist für die effiziente Übertragung von Reagenzien in die Polynucleotidkette bei der Herstellung wünschenswert. Die Nicht- Quellbarkeit des porösen Polystyrols hängt direkt vom Grad der Quervernetzung zwischen den Styrolpolymeren ab. Eine solche Quervernetzung wird üblicherweise durch ein Quervernetzungsverhältnis gemessen, welches das molare Verhältnis zwischen quervernetzendem Material (z.B. Divinylbenzol) und Kettenmaterial (z.B. Styrol) angibt. Vorzugsweise haben die erfindungsgemäßen nicht quellbaren porösen Polystyrole ein Quervernetzungsverhältnis im Bereich von ca. 40-60%, und noch besser ein Quervernetzungsverhältnis von ca. 50%.
Der Begriff "porös" bedeutet hierin, daß das nicht quellbare Polystyrol Poren enthält, die im wesentlichen gleichmäßige Durchmesser im Bereich von 100-4.000 x 10 cm. haben. Vorzugsweise betragen die Porendurchmesser ca. 1.000 x 10&supmin;&sup8; cm. Mehrere verschiedene Mittel sind für die Herstellung poröser Polystyrolfeststoffe verfügbar. Der Begriff "porös" umfaßt hierin auch so genannte makroporöse Polystyrole und sogenannte makroretikulare Polystyrole, ist jedoch nicht auf diese beschränkt. Diese Materialien sind in einer Vielzahl von Formen und Größen verbreitet im Handel erhältlich, z.B. bei Polymer Laboratories, Ltd. (Shropshire, Großbritannien); Hamilton Co. (Reno, NV), oder ähnlichen. Vorzugsweise werden die nicht quellbaren porösen Polystyrolträger in Form von Kugeln mit einem Durchmesser im Bereich von 15-100 x 10&supmin;&sup4; cm und noch besser im Bereich von 50-70 x 10&supmin;&sup4; cm verwendet.
Vor seiner Verwendung bei der Herstellung muß das nicht quellbare Polystyrol an ein 5'-blockiertes Nucleosid gebunden werden, welches das erste Nucleosid des herzustellenden Polynucleotids bildet. Die Art dieser Bindung, das S'-Blockierungsreagenz und die Schutzgruppen der exozyklischen Amine und des Internucleosidphosphors sind wichtige Merkmale der Erfindung. Vorzugsweise ist das erste 5'-blockierte Nucleosid durch eine basenlabile Bindung an den Polystyrolträger gebunden. Noch besser ist diese Bindung eine Aminomethylsuccinat-Gruppe, wie sie üblicherweise bei der Phosphittriesterherstellung verwendet wird, z.B. Atkinson et al., S. 45-49, in Gait, Hrsg., Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984). Die Bindung wird gebildet, indem ein 5'-blockiertes Nucleosid-3'-O-Succinat mit einem aminoderivatisierten Polystyrolträger reagiert. Die Herstellung des 5'-blockierten Nucleosid-3'-O-Succinats ist in der Technik gut bekannt, z.B. Atkinson et al., S. 47-49 (s.o.); und US-Patent 4,458,066. Entsprechend sind diese Texte zu Referenzzwecken beigefügt.
Der Begriff "5'-blockiert" bezieht sich hierin auf eine Gruppe, die an der 5'-OH-Gruppe der in der Erfindung verwendeten monomerischen Nucleosid-Zwischenprodukte oder der Kette geschützter Nucleoside mit der richtigen Sequenz befestigt ist. (Beachten Sie jedoch, daß Ketten, die an "externen" Stellen beginnen, 5'-blockiert sein können, ohne die richtige Sequenz zu haben.) Die Auswahl der 5'-blockierenden Gruppe ist durch drei Kriterien eingeschränkt: (i) Sie muß die 5'-OH-Gruppe des Monomers maskieren, so daß sie während der Monomerzugaben nicht mit den 5'-OH-Gruppen der Ketten mit der richtigen Sequenz konkurriert, (ii) sie muß so säurelabil sein, daß sie so entfernt werden kann, daß sie bei schwach saurer Behandlung die 5'-OH-Gruppe freilegt, und (iii) sie muß ausreichend hydrophob sein, um es 5'-blockierten Ketten mit der richtigen Sequenz zu ermöglichen, über nicht blockierte Fehlsequenzen vorzugsweise auf ein Polystyroladsorbens adsorbiert zu werden. Vorzugsweise sind die 5-OH-Gruppen als Tritylether geschützt, d.h. der Wirkstoff oder die Gruppe, welche die 5'-OH-Gruppe blokkiert, ist ein Trityl-Rest. Am besten ist die blockierende Gruppe 4,4'-Dimethoxytrityl. Die Herstellung von 5'-blockierten Nucleosid-Zwischenprodukten ist in der Technik bekannt, z.B. Froehler et al. (s.o.) und Caruthers et al. (o.g. US-Patente). Die Trityl-Schutzgruppen werden entfernt, d.h. die 5'-OH-Gruppen werden freigelegt, indem sie einer schwach protischen Säure ausgesetzt werden. Mehrere Reagenzien zur Entfernung der Trityl-Schutzgruppe wurden bei der Herstellung von Festphasen-Polynucleotiden verwendet, z.B. Caruthers et al., Genetic Engineering, Bd. 4, S. 1-17 (1984). Vorzugsweise wird die Schutzgruppe entfernt, indem sie bei Raumtemperatur ca. 3 Minuten lang 2%iger Trichloressigsäure ausgesetzt wird.
"Geschützt" in bezug auf die monomerischen Nucleosid- Zwischenprodukte und die Ketten mit der richtigen Sequenz bedeutet hierin, (i) daß die exozyklischen Amine aus jeder Verbindung mit einer Schutzgruppe acyliert wurden, die verhindert, daß die exozyklischen Amine an den synthetischen Reaktionsschritten partizipieren, und (ii) daß der Internucleosidphosphor von Phosphoramidit-Zwischenprodukten von einer basenlabilen Schutzgruppe maskiert wird. Vorzugsweise ist die Phosphor-Schutzgruppe beta-Cyanoethyl, wie von Koester et al., US-Patent 4,725,677, beschrieben. Viele Acyl- Schutzgruppen sind für die Verwendung bei der Erfindung verfügbar, z.B. Jones, S. 23-34, in Gait, Hrsg. (s.o.). Vorzugsweise sind die exozyklischen Amin- Schutzgruppen ausreichend basenlabil, so daß die Schutzgruppen der Ketten mit der richtigen Sequenz entfernt und vom Polystyrolträger im selben Reaktionsschritt abgespalten werden können. Wie oben erwähnt, sind die bevorzugten Schutzgruppen jene, die von Molko et al. (s.o.) beschrieben werden. Kurz, die Gruppen werden durch Acylierung der exozyklischen Aminogruppen der Basen (Adenin, Guanin und Cytosin) der Desoxynudeoside 2'-Desoxyadenosin, 2'-Desoxyguanosin und 2'-Desoxycytosin oder der Ribonudoside Adenosin, Guanosin und Cytidin an den monomerischen Nucleosid- Zwischenprodukten befestigt. Thymidin und Uridin benötigen keinen Basenschutz. Die Acylierung erfolgt durch Reaktion des Säurechlorids, z.B. Methoxyacetylchlorid, Isobutyrylchlorid oder Phenoxyacetylchlorid, oder des Säureanhydrids, z . B. Methoxyessigsäureanhydrid, Isobuttersäureanhydrid oder Phenoxyessigsäureanhydrid, mit den 3'-, 5'-geschützten Nucleosiden. Die 3'- und 5'-schützenden Gruppen können entweder ein Trimethylsilyl- oder Dimethoxytrityl-Rest sein. Die Trimethylsilyl-Gruppen werden entweder mit Hexamethyldisilazan oder Trimethylsilylchlorid aufgetragen und können unter milden, wäßrigen Bedingungen bei neutralem pH-Wert entfernt werden. Die Dimethoxytrityl- Gruppe kann entweder vor oder nach der Acylierung mit Dimethoxytritylchlorid aufgetragen werden. Nach dem Acylierungsschutz der Aminogruppe und der 5'-Dimethoxytritylierung wird die 3'-OH-Gruppe in einen Phosphoramiditanteil umgewandelt. Diese Phosphitylierung wird üblicherweise mit bis(Diisopropylamino)methoxyphosphin oder bis (Diisopropylamino) cyanoethoxyphosphin durch Katalyse mit Diisopropylammonium- Tetrazolid erzielt, so daß Methyl- bzw. Cyanoethylphosphoramidit-Nucleoside entstehen, wie in Formel I dargestellt.

Formel I

Hier sind R&sub1; und R&sub2; wie oben beschrieben. DMT stellt Dimethoxytrityl dar. B stellt Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin dar. R' stellt Methyl oder beta- Cyanoethyl dar, und ipr ist ein Isopropyl-Rest. Bei der obigen Schutzgruppe kann eine Entfernung der Schutzgruppe und Abspaltung durch 6-stündige Behandlung bei 20ºC oder 1-stündige Behandlung bei 55ºC in konzentriertem (29%igem) Ammoniak erzielt werden.
Der Begriff "Kette mit richtiger Sequenz" bezieht sich hierin auf eine Kette aus Nucleosiden, die über ihre 5'-OH-Gruppe mit einem zusätzlichen monomerischen Nucleosid-Zwischenprodukt reagieren kann (d.h. sie wurde keinem Capping unterzogen) und deren Sequenz der des gewünschten Polynucleotids entspricht. Der Begriff umfaßt das erste Nucleosid, das am Festphasenträger befestigt ist (d.h. eine Nucleosidkette aus einer Einheit) sowie das fertige Polynucleotidprodukt mit der vorbestimmten Sequenz. Der Begriff "Fehlsequenz" bezieht sich hierin auf Ketten von Nucleosiden, die während eines Additionsschritts nicht mit einem monomenschen Nucleotid-Zwischenprodukt reagiert haben und nachfolgend einem Capping unterzogen wurden. Der Begriff umfaßt auch Polynucleotidketten, deren Wachstum an einer externen Stelle des Festphasenträgers initiiert wurde.
Thiophosphat-Analoga von Polynucleotiden können ebenfalls mit der Erfindung hergestellt werden, wenn man den von Froehler, Tetrahedron Letters, Bd. 27, S. 5575-5578 (1986) für H-phosphonat oder von Stec et al., J. Am. Chem. Soc., Bd. 106, S. 6077-6079 (1984) für Phosphoramidit gelehrten Thionisierungsschritten folgt.
Der Polystyrolträger wird mit Standardverfahren, z.B. Wallace et al., S. 638-639, in Scouten, Hrsg., Solid Phase Biochemistry (s.o.) amino-derivatisiert. Kurz, Hydroxymethylphthalimid reagiert mit dem Polystyrolträger mit einer katalytischen Menge Methylsulfonsäure, so daß Phthalimidomethylpolystyrol entsteht. Dieses Material wird mit Hydrazin behandelt, um die Phthalmid-Schutzgruppe zu entfernen und aminomethyliertes Polystyrol herzustellen. Die Amino-Ladung variiert von 20 bis 60 umol Amino-Funktion pro Gramm nicht quellbares poröses Polystyrol. Dieser Wert kann durch Einstellen der Konzentration der Reagenzien und der Reaktionszeit gesteuert werden.
Dieses Material reagiert dann mit dem 5'-blockierten Nucleosid-3'-O-Succinat. Nicht reagiertes Amin des Polystyrols wird durch Acylierung mit einer moncarboxylischen Säure, z.B. wie im US-Patent 4,458,066 be schrieben, inaktiviert. Vorzugsweise werden die Amine durch Acetylierung mit Essigsäureanhydrid inaktiviert.
Wie oben beschrieben verläuft die Herstellung des gewunschten Polynucleotids üblicherweise durch wiederholte Zyklen von Entfernung der Schutzgruppe, Zugabe von Monomer und Capping, bis die Herstellung abgeschlossen ist. Der Begriff "Capping" bezieht sich hierin auf die Reaktion entweder der freien 5'-OH-Gruppe einer von 3' auf 5' wachsenden Nucleotidkette oder der freien 3'-OH-Gruppe einer von 5' auf 3' wachsenden Nucleotidkette mit einem Capping-Reagenz, um zu verhindern, daß die Kette an nachfolgenden Kondensationsschritten partizipiert. Die bevorzugten Capping-Reagenzien der Erfindung sind Phosphitmonoester der Form:

Formel II

wobei R, entweder allein oder mit dem Sauerstoff, an dem es befestigt ist, nicht mit den bei der Herstellung der Festphasen-Oligonucleotide verwendeten Reagenzien, insbesondere Phosphoramiditen oder Nucleosidhydrogenphosphonaten, reagiert. Vorzugsweise stellt R einen niederen Alkylrest, einen elektronenentziehenden substituierten niederen Alkylrest, einen niederen Alkyl- oder halo-substituierten Arylrest oder einen Heterozyklus mit Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel und zwischen 5 und 8 Kohlenstoffatomen dar. Noch besser ist R ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, sec-Butyl-, tert-Butyl-, n-Pentyl-, Cyclopentylmethyl-, Isopentyl-, Neopentyl-, n-Hexyl-, Neohexyl, Isohexyl-, Cyclohexylmethyl-, beta- Cyclopentylethyl-, niederer Alkyl- oder halo- substituierten Phenyl-, niederer Alkyl- oder halo- substituierter Benzyl- oder niederer Alkyl- oder halo- substituierter Phenylethyl-, Morpholinyl-, Thiomorpholinyl-, Piperidinyl-, Piperazinyl-, betaelektronenentziehender-substuierter Ethylrest oder ähnliches. Bevorzugt ist der elektronenentziehende Substituent des beta-elektronenentziehenden substituierten Ethylrests ein Cyan-, Nitro-, Phenylsulphonyl- oder Phenylesterrest. Am besten ist der beta-elektronenentziehende-substituierte Ethylrest beta-Cyanoethyl. Bevorzugt sind die niederen Alkylreste oder halo-Substituenten der niederen Alkyl- oder halo-substituierten Phenyl- und Benzylreste Methyl, Chlor oder Brom. Morpholinyl-, Thiomorpholinyl- und Piperidinyl-Reste sind bevorzugt Morpholino, Thiomorpholino bzw. Piperidino.
Die in Formel II veranschaulichten chemischen Strukturen werden in der Literatur sowohl als Phosphite als auch als Phosphonate bezeichnet. Angesichts der annähernden Verwendung in der Literatur werden die Strukturen hierin als Phosphite bezeichnet, außer wenn R ein Nucleosid ist. In solchen Fällen wird die Struktur als Hydrogen- oder H-phosphonat bezeichnet.
Wie von Formel III veranschaulicht, umfaßt das erfin dungsgemäße Capping-Verfahren die Reaktion eines in Formel II definierten Phosphitmonoesters, j, mit der freien 5'- oder 3'-OH-Gruppe einer Fehlsequenz, 2, in Anwesenheit eines sterisch gehinderten Säurechlorids, 3, zur Bildung eines Phosphitdiesters, 4, zwischen der Fehlsequenz und einer Gruppe, die für nachfolgende Reaktionsschritte inert ist. Base
Z = H, OH
B = Purin, Pyrimidin

Formel III

Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Capping- Reagenzien (1 in Formel IV unten) durch alkalische Hydrolyse der symmetrischen Phosphitdiester hergestellt, 5, wie von Gibbs et al. in Synthesis, S. 410-413 (1984) beschrieben, das zu Referenzzwecken beigefügt ist. Der Phosphitmonoester 1 kann nach Evaporation flüchtiger Nebenprodukte der Reaktion oder nach Reinigung mit konventionellen Mitteln direkt als Salz verwendet werden. Base

Formel IV

Im sterisch gehinderten Säurechlorid 3 ist R' vorzugsweise ein tert-Butyl-, sec-Butyl-, Cyclohexyl-, Adamantyl-, Norbornyl-, Phenyl-&sub1; Aryl-Rest oder ähnliches. Noch besser ist R' ein tert-Butyl-, Norbornyloder Adamantyl-Rest. Am besten ist R' ein Adamantyl- Rest.
Vorzugsweise ist X&spplus; Ammonium, niederes Alkylammonium, Pyridinium, Lutidinium, Cyclohexylammonium, 1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en-Ammonium, ein Kation eines Metallsalzes, z.B. Na&spplus;, K&spplus;, Li&spplus;, Ba&spplus;, Mg&spplus; oder ähnliches. Noch besser ist X&spplus; Triethylammonium, Tetrabutylammonium, Diisopropylethylammonium, Pyridinium, Lutidinium oder Cyclohexylammonium. Am besten ist X&spplus; Triethylammonium, Tetrabutylammonium oder 1,8-Diazabicyclo[5.4.0] undec-7-en-Ammonium.
Vorzugsweise werden vor der Abgabe an die Synthesesäule, die das Oligonucleotid enthält, ein erfindungsgemäßes Phosphitmonoester und sein kationisches Gegenion in einer Lösung aufgelöst, die ein aprotisches polares Lösungsmittel, z.B. Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dichloromethan oder ähnliches oder eine Kombination daraus, sowie eine schwache Base, z.B. Pyridin, Picolin, Lutidin, Collidin oder ähnliches, enthält. Pyridin ist die am meisten bevorzugte schwache Base. Vorzugsweise liegt die Konzentration des Phosphitmonoesters zwischen 0,01 und 0,1 M. Gleichermaßen wird das sterisch gehinderte Säurechlorid (3 in Formel III) vor der Abgabe an die Synthesesäule in einer Lösung aufgelöst, die ein aprotisches polares Lösungsmittel, z.B. Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dichloromethan oder ähnliches oder eine Kombination daraus, sowie eine schwache Base, z.B. Pyridin, Picolin, Lutidin, Collidin oder ähnliches enthält. Pyridin ist die am meisten bevorzugte schwache Base. Die entsprechenden Lösungen werden gleichzeitig in die Synthesesäule gegeben, die das wachsende Oligonucleotid enthält, so daß das molare Verhältnis von Phosphitmonoester zum sterisch gehinderten Säurechlorid in der Reaktionsmischung ca. 1:5 beträgt. Dieser Vorgang kann leicht mit einem automatischen DNA-Synthesizer, z.B. den Modellen 380A, 380B oder 381A von Applied Biosystems, durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Capping-Verfahren wird als ein Schritt in jedem Zyklus nach der Kopplungsreaktion durchgeführt, um die Fehlsequenzen inert zu machen. Vorzugsweise wird die Synthesesäule bei Raumtemperatur ca. 20-120 Sekunden lang in die Reaktionsmischung getaucht, woraufhin die Reagenzien mit einem Lösungsmittel, z.B. Acetonitril, Tetrahydrofuran, Dichloromethan, Pyridin oder ähnlichem oder einer Kombination daraus, von der Säule gespült werden. Alle Gefäße im Instrument müssen unter einer Atmosphäre aus einem Inertgas, z.B. Argon, absolut frei von Feuchtigkeit und Sauerstoff gehalten werden.
Bei Beendigung der Herstellung werden die Schutzgruppen der Polynucleotidketten (sowohl Ketten mit der richtigen Sequenz als auch Fehlsequenzen) entfernt und die Polynucleotidketten vom Polystyrolträger abgespalten, so daß eine Abspaltungsmischung gebildet wird. Vorzugsweise geschieht dies durch Behandlung mit konzentriertem Ammoniumhydroxid bei Raumtemperatur 4-5 Stunden lang oder bei 55ºC ca. 1 Stunde lang. Die Abspaltungsmischung wird auf ein Festphasenadsorbens aufgetragen, das vorzugsweise die 5'-blockierten Polynucleotide ohne Schutzgruppe adsorbiert. Die bevorzugte Adsorption wird erreicht, indem eine Blockiergruppe und ein Festphasenadsorbens so ausgewählt werden, daß sie eine starke Anziehungskraft aufeinander im Verhältnis zum Rest des Polynucleotids ausüben. Die Anziehungskraft kann auf Hydrophobizität, Ladung oder anderen physikalisch-chemischen Eigenschaften basieren. Trityl-Schutzgruppen werden vorzugsweise auf der Basis der Hydrophobizität an Polystyrol adsorbiert. Vorzugsweise ist das Festphasenadsorbens ein nicht quellbares poröses Polystyrol, das mit einer konzen trierten Alkylammonium-Salz-Lösung vorbehandelt wurde, wenn Trityl-Schutzgruppen verwendet werden. Vorzugsweise wird das als Adsorbens verwendete nicht quellbare poröse Polystyrol in Form von Kugeln verwendet, die einen Durchmesser im Bereich von ca. 15-100 x 10&supmin;&sup4; cm und Porengrößen im Bereich von 100-1.000 Angström haben. Noch besser liegt der Kugeldurchmesser im Bereich von 50-70 x 10&supmin;&sup4; cm, und der Porendurchmesser beträgt ca. 300 Angström.
Vor dem Auftragen der Abspaltungsmischung auf das Polystyroladsorbens wird das Adsorbens mit einem organischen Lösungsmittel, z.B. Acetonitril, gespült, um die Oberfläche zu benetzen, dann wird eine konzentrierte Alkylammonium-Salz-Lösung, vorzugsweise eine 2 M Lösung aus Triethylaminacetat, aufgetragen, um ein lipophiles Gegenion einzurichten. Danach wird die Abspaltungslösung, welche die Polynucleotid-Synthesemischung in konzentriertem Ammoniak enthält, auf das Polystyroladsorbens aufgetragen. Das Adsorbens wird dann gewaschen, vorzugsweise mit verdünntem Ammoniak (3%ige Lösung) und Wasser, um die Fehlsequenzen und andere Kontaminanten zu entfernen, die Schutzgruppen der Ketten mit der richtigen Sequenz werden entfernt, d.h. die Ketten werden detrityliert, und das detritylierte Polynucleotid wird aus dem Adsorbens eluiert. Vorzugsweise erfolgt die Elution mit einem neutralen Lösungsmittel, z.B. 20% Acetonitril in Wasser oder einem ähnlichen Lösungsmittel.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren automatisiert. Das Gerät zur Automatisierung kann verschiedene Formen annehmen. Allgemein weist das Gerät eine Reihe von Reagenzienbehältern auf, eine Synthesekammer, welche den Träger aus nicht quellbarem porösen Polystyrol enthält, eine Reinigungskammer (die mit der Synthesekammer identisch sein kann, aber nicht muß), welche das Festphasenadsorbens enthält, und eine computergesteuerte Vorrichtung zur Übertragung von Reagenzien aus den Reagenzienbehältern in die und aus der Synthesekammer und der Reinigungskammer auf eine vorbestimmte Weise. Die computergesteuerte Vorrichtung zur übertragung der Reagenzien kann durch einen Allzweck-Laborroboter realisiert werden, z.B. wie von Wilson et al., BioTechniques, Bd. 6. S. 779 (1988) beschrieben, oder durch ein eigenes Rohrsystem und elektronisch gesteuerte Ventile. Vorzugsweise wird die computergesteuerte Vorrichtung durch ein eigenes Ventil- und Rohrsystem realisiert, welches die ver schiedenen Behälter und Kammern verbindet. Vorzugsweise werden die Reagenzien durch die Rohre geleitet, indem mittels eines unter Druck gesetzten Inertgases, z.B. Argon, ein positiver Druck in den Reagenzienbehältern aufrechterhalten wird, wie in vielen verbreitet erhältlichen automatischen Synthesizern, z.B. den DNA-Synthesizer-Modellen 380B oder 381A von Applied Biosystems.
Eine Darstellung einer bevorzugten Ausführung eines solchen Geräts ist in Fig. 1 in Diagrammform veranschaulicht. Das Gerät aus Fig. 1 ist so ausgelegt, als ob Phosphoramidit verwendet würde. Dasselbe Gerät kann auch verwendet werden, um die Herstellung und Reinigung von H-phosphonat mit deutlichen Veränderungen, z.B. unterschiedliche Synthesereagenzien werden verwendet, unterschiedliche Reaktionszeiten sind erforderlich, und ähnliches, zu automatisieren. Diese Veränderungen sind leicht durch ein programmierbares Steuergerät 48, oder eine ähnliche Vorrichtung zu realisieren. 5'-blockierte Nucleosid-Zwischenprodukte werden in den Behältern 2 bis 10 gelagert, jeweils ein Behälter für die vier natürlichen Nucleoside. Optional ist ein zusätzlicher Behälter 10 für ein 5'-blockiertes Nucleosid-Analog, z.B. Desoxymosin, einen Bindungsstoff, z.B. US-Patent 4,757,141, oder ähnliche Zwischenprodukte vorgesehen. Die Behälter 2 bis 10, welche die Synthese-Zwischenprodukte enthalten, sind über einen Ventilblock 24, dessen Betrieb durch das Steuergerät 48 gesteuert wird, mit der Synthesekammer 28 verbunden. In den Behältern 12 bis 18 werden Synthesereagenzien gelagert. Bei Phosphoramidit können dies z.B. 12 Trichloressigsäure in Dichloromethan zur Entfernung der Schutzgruppe, 13 Jod-Lutidin- Wasser-Tetrahydrofuran-Lösung zur Oxidierung von Internucleosidphosphor, 14 Tetrazol-Acetonitril-Lösung zur Aktivierung der Nucleosid-Zwischenprodukte, 15 Ammoniumhydroxid zur Abspaltung der vollständigen Kette vom Syntheseträger, 16 l-Methylimidazol- Tetrahydrofuran-Lösung, 17 Tetrahydrofuran-Lutidin- Essigsäureanhydrid-Lösung für das Capping, und 18 Acetonitril zum Waschen sein. Diese Reagenzienbehälter sind über einen Ventilblock 22, der vom Steuergerät 48 gesteuert wird, mit der Synthesekammer 28 verbunden. Die Herstellung erfolgt unter programmierter Steuerung, wobei jedes Nucleotid der wachsenden Kette durch die aufeinanderfolgenden Zyklen Entfernung der Schutzgruppe, Zugabe, Capping und Oxidierung zugegeben wird. Die aus der Synthesekammer 28 entnommenen Reagenzien werden mittels eines Ventilblocks 32, der vom Steuergerät 48 gesteuert wird, entweder der Tritylsammelstation 30, dem Abfallbehälter 38 oder der Reinigungskammer 34 zugeführt. Während jedes Zyklus werden Trityl- Schutzgruppen, die durch die Entfernung der Schutzgruppe freigesetzt werden, photometrisch an der Tritylsammelstation 30 überwacht, um die Effizienz der Herstellung zu verfolgen.
Wenn die Herstellung abgeschlossen ist, wird der Syntheseträger mit konzentriertem Ammoniumhydroxid behandelt, um die Schutzgruppe der Polynucleotidketten zu entfernen und die Polynucleotidketten abzuspalten. Bevor die entstandene Lösung (die Abspaltungslösung) in die Reinigungskammer 34 überführt wird, wird das Polystyroladsorbens in der Kammer zuerst mit Acetonitril und dann mit Triethylammoniumacetat aus den Behältern 40 bzw. 41 gespült. Die Abspaltungsmischung wird über den Ventilblock 32 in die Reinigungskammer 34 überführt, wo sie mit dem Polystyroladsorbens reagiert. Das Polystyroladsorbens wird dann mit einer Reihe Reinigungsreagenzien aus den Behältern 40 bis 46 behandelt, um Fehlsequenzen und Verunreinigungen von den Polynucleotiden mit der richtigen Sequenz zu separieren und die Polynucleotide mit der richtigen Sequenz vom Adsorbens zu eluieren. Die Übertragung der Reagenzien aus den Behältern sowie in die und aus der Reinigungskammer 34 erfolgt über Ventilblöcke 26 und 36, die vom Steuergerät 48 gesteuert werden. Zuerst wird die Reinigungskammer 34 mit verdünntem Ammoniumhydroxid aus 40 gespült, um Fehlsequenzen mit Capping und andere Kontaminanten zu entfernen. Als nächstes werden die tritylierten Polynucleotide durch Behandlung mit einer 2%igen Trifluoressigsäure-Lösung in Wasser, Behälter 44, detrityliert, und die detritylierten Polynucleotide werden mit einer 20%igen Acetonitril-Lösung in Wasser, Behälter 42, eluiert und im Produktgefäß 50 gesammelt.
Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung. Die Konzentration der Reagenzien, Temperaturen und die Werte anderer variabler Parameter sollen nur als Beispiel für die Erfindung dienen und sind nicht als Beschränkungen derselben anzusehen.

BEISPIELE

Beispiel 1. Vergleich externer Ketteninitiation auf CPG und Polystyrolträgern während der Herstellung

Ein 5'-tritylierter Thymidin-derivatisierter Polystyrolträger (Porengröße 4.000 Angström), ein 5'-tritylierter Thymidin-derivatisierter CPG-Träger (Porengröße 1.000 Angström) und ein 5'-tritylierter Thimidin-derivatisierter CPG-Träger (Porengröße 500 Angström) wurden mit 5'-Trityldesoxyadenosin-3'-Phosphoramidit (A) und Tetrazol-Aktivator eine Stunde lang behandelt und dann detrityliert. Das Nucleosid- Material wurde dann durch Behandlung der Träger mit Ammoniak entfernt und separat mit HPLC analysiert; die relevanten Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt. Die Zugabe von A zu den Trägern kann nur an zwei Arten von Stellen erfolgen: (i) reaktive Stellen auf der Trägeroberfläche, die keinem Capping unterzogen wurden oder deren Capping rückgängig gemacht wurde, oder (ii) detrityliertes Thymidin. Die Reaktion an den erstgenannten Stellen führt zur Erfassung von Adenosinmonophosphat (AMP) bei der HPLC-Analyse und in der Praxis zu einer heterogenen Population tritylierter Polynucleotide, die vom Syntheseträger abgespalten wurden (wie unten noch besprochen wird). Die Reaktion an den zweitgenannten Stellen führt zur Erfassung eines A-T- Dinucleotids bei der HPLC-Analyse. Die Anwesenheit der zweitgenannten Stellen reflektiert die Instabilität der Tritylgruppe während der Lagerung. Andere bei der HPLC-Analyse erfaßte Verbindungen sind Thymidin (der überwiegende Bestandteil) und Benzamid, ein Nebenprodukt der Entfernung der Schutzgruppe von Adenin. Tabelle I Relative Mengen von Chromatogrammspitzen
Diese Daten zeigen, daß der Polystyrolträger im Vergleich zu CPG weniger als die Hälfte der externen Startstellen generiert. Daher sind Polynucleotide, die mit dem Polystyrolträger hergestellt wurden, reiner und können leichter gereinigt werden als auf einem CPG-Träger hergestellte Polynucleotide.

Beispiel II. Herstellung und Reinigung eines 18-mer Oligonucleotids auf CPG und Polystyrol: Vergleich tritylierter Fehlsequenzen

Zwei 18-mer Oligonucleotide derselben Sequenz wurden auf einem Synthesizer-Modell 380B von Applied Biosystem, das für die Verwendung von Phosphoramidit programmiert wurde, hergestellt, eines auf einem CPG- Träger und das andere auf einem erfindungsgemäßen Polystyrolträger. Jedes Oligonucleotid wurde durch ³²P-Phosphorylation radioaktiv markiert. Das Produkt jeder Synthese wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese vor und nach der Reinigung analysiert. Fig. 2 ist ein Autoradiogramm des Gels nach Separation der Bestandteile der gereinigten und der ungereinigten Produkte. Die Spuren 1 und 2 entsprechen den ungereinigten bzw. gereinigten Oligonucleotiden, die auf CPG hergestellt wurden. Die Spuren 3 und 4 entsprechen den ungereinigten bzw. gereinigten Oligonucleotiden, die erfindungsgemäß auf Polystvrol hergestellt wurden. In beiden Fällen wurden die Produkte mit einem erfindungsgemäßen Polystyroladsorbens gereinigt. Im einzelnen wurde Polystyroladsorbens (50 mg pro 5 OD- Einheiten zu reinigender Oligonucleotide) in eine Relnigungskammer, z.B. einen Standardfluß durch eine Chromatographiesäule, mit einem Innenvolumen von ca. 500 ul gefüllt. Das Polystyroladsorbens wurde mit 5 ml Acetonitril vorgewaschen, dann mit 5 ml 2 M Triethylammoniumacetat gespült. Die Abspaltungsmischung wurde langsam mit einer Geschwindigkeit von ca. 2 ml pro Minute mit einer 5 ml-Spritze manuell durch die Reinigungskammer gedrückt, um die tritylierten Sequenzen zu laden. Nach dem Laden wurde die Reinigungskammer zuerst mit 10 ml 3%igem Ammoniak/Wasser und dann mit 10 ml Wasser gewaschen. 3 ml 2%ige Trifluoressigsäure in Wasser wurden in die Reinigungskammer gegeben, wo sie sich 3 Minuten lang absetzen konnten, woraufhin 15 ml Wasser durch die Kammer gespült wurden, um restliche Säure zu entfernen. Schließlich wurde das gereinigte Oligonucleotid mit 1 ml 20% Acetonitril/Wasser aus dem Adsorbens eluiert.
Tabelle II gibt die relativen Mengen der Polynucleotide mit der richtigen Sequenz und die Haupt- Fehlsequenzen in den vier Produkten basierend auf einer densitometrischen Analyse des Autoradiogramms an. Es wird deutlich, daß, obwohl die CPG-Synthese zu einem reineren Rohprodukt führt, die Polystyrolsynthese eine bedeutend höheren Ertrag nach der Reinigung liefert, da die Population an tritylierten Polynucleotiden in ihrem Rohprodukt sehr viel homogener ist als die der CPG-Synthese. Tabelle II Densitometerdaten

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polynucleotids mit einer vorbestimmten Sequenz, aufweisend folgende Schritte:

(a) Herstellung eines nicht quellbaren porösen Polystyrolträgers;

(b) Herstellung eines 5'-blockierten Nucleosids mit einer 3'-OH-Gruppe und einer 5'-OH-Gruppe, wobei das 5'-blockierte Nucleosid an den nicht quellbaren porösen Polystyrolträger gebunden ist, so daß das 5'-blockierte Nucleosid eine geschützte Kette mit der richtigen Sequenz bildet;

(c) Entfernung der Schutzgruppe der 5'-OH-Gruppe der Kette mit der richtigen Sequenz;

(d) Reaktion der 5'-OH-Gruppe der Kette mit der richtigen Sequenz mit einem 5'-blockierten Nucleosidmonomer, das aus folgender Gruppe ausgewählt wurde: 5'-blockiertes Nucleosid-3'-phosphoramidit und 5'-blockiertes Nucleosid-3'-hydrogenphosphonat, so daß sie entweder eine Kette mit der richtigen Sequenz oder eine Fehlsequenz bilden, wobei die Fehlsequenz eine 5'-OH-Gruppe hat;

(e) Wiederholung der Schritte (c) und (d), bis das Polynucleotid der vorbestimmten Sequenz erhalten wird; und

(f) Abspaltung des Polynucleotids vom nicht quellbaren porösen Polystyrolträger zur Bildung einer Abspaltungsmischung.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Abspaltungsschritt eine Entfernung der Schutzgruppe des Polynucleotids umfaßt.

3. Das Verfahren nach Anspruch 2, außerdem umfassend einen Schritt zum Capping der Fehlsequenz durch Reaktion eines Capping-Reagenzes mit der 5'-OH-Gruppe der Fehlsequenz.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, außerdem umfassend den Schritt der Reinigung des Polynucleotids aus der Abspaltungsmischung.

5. Das Verfahren nach Anspruch 41 wobei bei der Reinigung die Abspaltungsmischung einem nicht quellbaren Polystyroladsorbens ausgesetzt wird, das nicht quellbare Polystyroladsorbens gewaschen wird, um vorzugsweise nicht blockierte Polynucleotide zu entfernen, die Schutzgruppe der 5'-OH-Gruppe des Polynucleotids entfernt wird, so daß ein ungeschütztes Polynucleotid entsteht, und das nicht blockierte Polynucleotid aus dem nicht quellbaren Polystyroladsorbens eluiert wird.

6. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das 5'-blockierte Nucleosidmonomer ein 5'-blockiertes Nucleosid-3'-hydrogenphosphonat ist und wobei das Capping nach dem Reaktionsschritt erfolgt.

7. Das Verfahren nach Anspruch 3, wobei das 5'-blockierte Nucleosidmonomer ein 5'-blockiertes Nucleosid-3'-phosphoramidit ist, und wobei das Capping nach dem Reaktionsschritt erfolgt.

8. Das Verfahren nach Anspruch 7, wobei das 5'-blockierte Nucleosid-3'-phosphoramidit durch folgende Formel definiert ist:

wobei:

R&sub1; Wasserstoff oder ein niederer Alkylrest ist;

R&sub2; Wasserstoff, ein niederer Alkyl-, ein niederer Alkoxy-, ein niederer Aryloxy- oder Cyan-, Nitrooder Sulfon-substituierter niederer Aryloxyrest ist;

R' ein Methyl- oder Beta-Cyanoethylrest ist; DMT Dimethoxytrityl ist; und

B Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin ist.

9. Das Verfahren nach Anspruch 8, wobei R&sub1; Wasserstoff, ein Methyl-, Ethyl- oder Propylrest ist, und wobei R&sub2; Wasserstoff, ein Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Methoxy-, Ethoxy-, Isopropoxy-, tert-Butyloxy-, Phenoxy-, Naphthoxy- oder Biphenoxyrest ist.

Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei R&sub1; Wasserstoff oder ein Methylrest ist, und wobei R&sub2; Wasserstoff, ein Methyl-, Ethoxy- oder Phenoxyrest ist.

11. Ein Gerät zur Herstellung eines Polynucleotids mit einer vorbestimmten Sequenz, aufweisend:

einen nicht quellbaren porssen Polystyrolträger in einer Synthesekammer, wobei der nicht quellbare poröse Polystyrolträger ein 5'-blockiertes Nucleosid aufweist, das so gebunden ist, daß das 5'-blockierte Nucleosid eine Kette mit der richtigen Sequenz bildet;

is einen oder mehr Reaktantenbehälter, die 5'-blockierte Nucleosidmonomere enthalten, die aus folgender Gruppe ausgewählt wurden: 5'-blockierte Nucleosid-3'-phosphoramidite, 5'-blockierte Nucleosid-3'-hydrogenphosphonate und ihre Analoga;

einen oder mehr erste Reagenzbehälter, die Synthesereagenzien fur die Bindung der 5'-blockierten Nucleosidmonomere an die Kette mit der richtigen Sequenz enthalten; und

ein Flüssigkeitstransfermittel für den automatischen Transfer 5'-blockierter Nucleosidmonomere aus dem einen oder mehreren Reaktantenbehältern in die Synthesekammer und für den automatischen Transfer der synthesereagenzien in die Synthesekammer, so daß das Polynucleotid mit der vorbestimmten Sequenz hergestellt wird.

12. Das Gerät nach Anspruch 11, wobei der eine oder mehr erste Reagenzbehälter einen Behälter umfassen, der ein Reagenz zur Entfernung der Schutzgruppe enthält, um die Schutzgruppe des Polynucleotids zu entfernen und das Polynucleotid vom nicht quellbaren porösen Polystyrolträger abzuspalten.

13. Das Gerät nach Anspruch 12, außerdem enthaltend (i) ein nicht quellbares Polystyroladsorbens und (ii) einen oder mehr zweite Reagenzbehälter mit Reinigungsreagenzien

14. Das Gerät nach Anspruch 13, wobei das nicht quellbare Polystyroladsorbens in der Synthesekammer vorhanden ist.

15. Das Gerät nach Anspruch 13, wobei das nicht quellbare Polystyroladsorbens in einer Reinigungskammer enthalten ist, die durch das Flüssigkeitstransfer mittel mit der Synthesekammer operativ verbunden ist, und der eine oder mehr zweite Reagenzbehälter durch das Flüssigkeitstransfermittel mit der Reinigungskammer operativ Verbunden sind, so daß nach der Abspaltung des Polynucleotids und der Entfer nung der Schutzgruppe in der Synthesekammer eine Abspaltungsmischung gebildet wird, die in das nicht quellbare Polystyroladsorbens in der Reinigungskammer transferiert wird und die Reinigungsreagenzien nacheinander in die Reinigungskammer transferiert werden, um das Polynucleotid aus dem nicht quellbaren Polystyroladsorbens zu reinigen und zu eluieren.