CN117255711A

CN117255711A - 用于纯化信使rna的方法

Info

Publication number: CN117255711A
Application number: CN202180076853.1A
Authority: CN
Inventors: J·阿比萨尔赫; F·德罗莎; J·E·瓦格斯; C·史密斯
Original assignee: Translation Bio Co
Current assignee: Translation Bio Co
Priority date: 2020-10-01
Filing date: 2021-10-01
Publication date: 2023-12-19
Also published as: AU2021351541A1; WO2022072836A3; EP4222258A2; JP2023544167A; WO2022072836A2; CA3197638A1; US20230357751A1

Abstract

本发明部分涉及使用在较低重力下运行的过滤离心机大规模纯化mRNA的方法、系统和过程。本发明还涉及纯化mRNA的组合物及其用途。

Description

用于纯化信使RNA的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年10月1日提交的美国临时申请序列号63/086,095的优先权，将所述申请的公开内容通过引用特此并入。

背景技术

信使RNA(mRNA)治疗药是有前途的新型治疗剂；例如，mRNA替代治疗药可以是传统蛋白质替代疗法的替代方案。在mRNA替代治疗药中，将编码特定蛋白质序列的完整mRNA递送至靶细胞，并且通过细胞的天然翻译机制翻译成完整蛋白质。用于此类治疗药的mRNA典型地是这样合成的，使用体外转录系统用酶(诸如RNA聚合酶)从模板(诸如质粒DNA)转录mRNA，同时或随后添加5'-帽和3'-聚腺苷酸化。此类反应的结果是包含全长mRNA和各种不期望的污染物(例如，蛋白质、盐、缓冲剂和非RNA核酸)的组合物，所述污染物典型地被去除以提供可用于mRNA替代治疗药的洁净且均匀的mRNA。

传统上，通过可商购的基于二氧化硅的柱系统(诸如Qiagen 试剂盒)或者通过将蛋白质提取到有机混合物(苯酚:氯仿:异戊醇)中并且随后进行乙醇沉淀，从体外转录反应中纯化mRNA。这些方法在规模上是有限制性的，因为它们可以提供最多5至10mg洁净且均匀的mRNA；因此，它们不足以满足mRNA的临床和商业用途的需要。最近的新颖方法(诸如切向流过滤(TFF))已经被修改为从体外转录反应中纯化沉淀mRNA；这大大增加了纯化的规模。适用于大规模纯化mRNA的另外的方法可用于mRNA治疗药的临床和商业开发。例如，另一种方法使用过滤离心。然而，这些方法中的许多方法在纯化过程中需要大体积的洗涤缓冲剂，以实现适用于临床制剂的洗涤效率。鉴于安全法规(其限制了可储存于设施中的易燃溶剂的量)，这些大体积的洗涤缓冲剂(通常包括乙醇)使批量大小受到限制。因此，这些已知的方法在不重新配置现有设施的情况下通常只能用于较小的批量大小。

因此，需要一种有成本效益方式且可扩大的方法，其避免了现有技术方法的缺点，并且产生具有治疗用途可接受的纯度和完整性水平的洁净且均匀的mRNA组合物。

发明内容

本发明尤其提供了一种纯化信使RNA(mRNA)的高效且有成本效益的方法。所述方法涉及使不纯的RNA制剂沉淀，并且使用过滤离心机对其进行纯化。本发明部分基于这样一个出乎意料的发现，即将包含沉淀mRNA的悬浮液加载到过滤离心机中并且洗涤所保留的沉淀mRNA可以以比先前使用的离心机速度更低的离心机速度进行。特别地，加载步骤可以以较低的离心机速度进行，同时仍确保mRNA可以被有效地洗涤和纯化。这是违反直觉的，因为较高的离心机速度在本领域中用于加载过滤离心机。人们认为，较高的速度是确保悬浮液中沉淀mRNA被过滤器有效地保留从而避免所得滤饼被逐出所必要的。出乎意料地是，诸位发明人发现，在加载步骤和洗涤步骤中均使用较低的离心机速度降低了纯化过程期间所需的挥发性有机溶剂(例如，乙醇)的体积。确实，在本发明的一些方面，在使用较低的速度来加载和洗涤沉淀mRNA时可以完全避免使用挥发性有机溶剂(例如，乙醇)。根据这些观察结果，与先前的方法相比，本发明的方法可以在加载和洗涤步骤两者中使用相同的较低离心机速度，简化和自动化纯化过程，这两者均有助于增加可扩大性。因此，本发明提供了一种纯化mRNA的有效、可靠且更安全的方法，所述方法可以适用于使用现有制造设施的大规模制造过程，提供非常高产率的具有临床级完整性和纯度的mRNA。

在一方面，本发明提供了一种用于纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：a)使mRNA从包含来自所述mRNA的制造的一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物的溶液中沉淀，以提供包含沉淀mRNA的悬浮液；b)将包含所述沉淀mRNA的悬浮液加载到包含过滤器的过滤离心机中，其中所述沉淀mRNA被所述过滤器保留；c)通过向所述过滤离心机中添加洗涤缓冲剂来洗涤所保留的沉淀mRNA；以及d)从所述过滤器中回收所保留的沉淀mRNA，其中在加载步骤(b)和洗涤步骤(c)期间使所述过滤离心机以施加小于1300g的重力(g)的离心机速度运行。

在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约150g与约1300g之间的重力(g)。在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约300g与约1300g之间，例如在约400g与约1100g之间的重力(g)。在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约500g与约900g之间，例如在约550g与约850g之间的重力(g)。在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约550g与约750g之间的重力(g)。在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约650g与约750g之间的重力(g)。在特定实施方案中，所述离心机速度施加在约700g与约900g之间，例如在约750g与850g之间(例如约800g)的重力(g)。

在一些实施方案中，在加载步骤(b)和洗涤步骤(c)期间使过滤离心机以相同的离心机速度运行。

在一些实施方案中，从过滤器中回收所保留的沉淀mRNA包括以下步骤：(i)使所保留的沉淀mRNA溶解；以及(ii)收集溶解的mRNA。

在一些实施方案中，所述mRNA的沉淀包括添加一种或多种促进mRNA沉淀的试剂，例如醇、两亲性聚合物、缓冲剂、盐和/或表面活性剂中的一种或多种。在一些实施方案中，所述一种或多种促进所述mRNA沉淀的试剂是：盐、和醇或两亲性聚合物。在一些实施方案中，所述醇是乙醇。在一些实施方案中，所述盐是离液盐。在一些实施方案中，所述盐的最终浓度为2-4M，例如为2.5-3M。在特定实施方案中，所述盐的最终浓度为约2.7M。硫氰酸胍鎓(GSCN)是特别适用于本发明的方法的离液盐。在一些实施方案中，所述两亲性聚合物选自普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、三乙二醇单甲醚(MTEG)或其组合。

在一些实施方案中，所述PEG的分子量为约200至约40,000g/mol。在一些实施方案中，所述PEG的分子量为约200-600g/mol、约2000-10000g/mol或约4000-8000g/mol。在特定实施方案中，所述PEG的分子量为约6000g/mol(例如，PEG-6000)。

在一些实施方案中，所述PEG的最终浓度为约10％至约100％重量/体积。在一些实施方案中，所述PEG的最终浓度为约50％重量/体积。在一些实施方案中，所述PEG的最终浓度小于25％重量/体积。在一些实施方案中，所述PEG的最终浓度为约5％至20％重量/体积。在特定实施方案中，所述PEG的最终浓度为约10％至15％重量/体积。

在一些实施方案中，所述两亲性聚合物是MTEG。在一些实施方案中，所述MTEG的最终浓度为约10％至约100％重量/体积的浓度。在一些实施方案中，所述MTEG的最终浓度为约15％至约45％重量/体积，例如约20％至约40％重量/体积。在一些实施方案中，所述MTEG的最终浓度为约20％、约25％、约30％或约35％重量/体积。在特定实施方案中，所述MTEG的最终浓度为约25％重量/体积。

在一些实施方案中，所述悬浮液包含沉淀mRNA、盐和MTEG。在一些实施方案中，所述悬浮液中的盐是硫氰酸胍鎓(GSCN)。在一些实施方案中，所述悬浮液不含醇，例如乙醇。

在一些实施方案中，本发明方法的步骤(a)进一步包括向包含沉淀mRNA的悬浮液中添加至少一种助滤剂。在一些实施方案中，所述沉淀mRNA与所述至少一种助滤剂的质量比为约1:2；约1:5；约1:10或约1:15。在特定实施方案中，所述沉淀mRNA与所述至少一种助滤剂的质量比为约1:10。在一些实施方案中，所述助滤剂是分散剂。在一些实施方案中，所述分散剂是灰、粘土、硅藻土、玻璃珠、塑料珠、聚合物、聚合物珠(例如，聚丙烯珠、聚苯乙烯珠)、盐(例如，纤维素盐)、砂和糖中的一种或多种。在特定实施方案中，所述聚合物是天然存在的聚合物，例如纤维素(例如，粉状纤维素纤维)。

在一些实施方案中，所述悬浮液包含至少100mg、1g、10g、100g、250g、500g、1kg、10kg、100kg、1公吨或10公吨或其之间任何量的mRNA。在一些实施方案中，所述悬浮液包含大于1kg的mRNA。

在一些实施方案中，所述过滤器包括多孔基质。在一些实施方案中，所述多孔基质是滤布、滤纸、筛网和丝网。在一些实施方案中，所述过滤器是微滤膜或超滤膜。在一些实施方案中，所述过滤器的平均孔径为约0.5微米或更大、约0.75微米或更大、约1微米或更大、约2微米或更大、约3微米或更大、约4微米或更大或约5微米或更大。在一些实施方案中，所述过滤器的平均孔径为约0.01微米至约200微米、约1微米至约2000微米、约0.2微米至约5微米、或约1微米至约3微米，例如约1微米。在特定实施方案中，所述滤布是平均孔径为约1微米的聚丙烯布。

在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/gmRNA与约8L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于2L/g mRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约1.5L/g mRNA之间，例如约0.5L/g mRNA。在特定实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积为约0.5L/gmRNA或更少。

在一些实施方案中，将洗涤缓冲剂以约1升/min至约60升/min的速率，例如以约5升/min至约45升/min的速率加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，例如通过使用转子尺寸(即，转筒直径)为约30cm至约170cm的过滤离心机，在约0.5小时至约4小时之间，将总体积的洗涤缓冲剂加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，在约0.5小时至约4小时之间，例如小于约90分钟，将所保留的沉淀mRNA洗涤至在约50％至约100％之间的纯度。在特定实施方案中，在小于90分钟内，将所保留的沉淀mRNA洗涤至至少95％的纯度。在一些实施方案中，将洗涤缓冲剂以取决于过滤离心机的过滤器表面积(即，m²)的速率(例如，约5升/min/m²至约25升/min/m²，例如约15升/min/m²)加载至过滤离心机中。

在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂包含醇、两亲性聚合物、缓冲剂、盐和/或表面活性剂中的一种或多种。在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂包含醇或两亲性聚合物。

在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂包含乙醇。在一些实施方案中，所述乙醇为约80％重量/体积的浓度。

在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂包含选自以下的两亲性聚合物：普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、三乙二醇单甲醚(MTEG)或其组合。

在一些实施方案中，所述两亲性聚合物是PEG。在一些实施方案中，所述PEG以约10％至约100％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述PEG以约50％至约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在特定实施方案中，所述PEG以约90％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述PEG的分子量为约100至约1,000g/mol。在一些实施方案中，所述PEG的分子量为约200-600g/mol。在一些实施方案中，所述PEG的分子量为约400g/mol(例如，PEG-400)。

在一些实施方案中，其中所述两亲性聚合物是MTEG。在一些实施方案中，所述MTEG以约75％、约80％、约85％、约90％或约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述MTEG以约90％重量/体积的浓度或约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在特定实施方案中，所述MTEG以约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。

在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂不含醇，例如乙醇。

在一些实施方案中，所保留的mRNA的回收是在所述过滤离心机运行时发生的。在一些实施方案中，所保留的mRNA的回收是经由叶片发生的，所述叶片将所保留的沉淀mRNA从所述过滤离心机的过滤器中去除。在一些实施方案中，所保留的mRNA的回收是在所述过滤离心机不运行时发生的。

在一些实施方案中，根据本发明的纯化方法不含醇，例如乙醇。

在一些实施方案中，所保留的mRNA的溶解包括将所述mRNA溶解于水性介质中。在一些实施方案中，所述水性介质包括水、缓冲剂(例如，Tris-EDTA(TE)缓冲剂或柠檬酸钠缓冲剂)、糖溶液(例如，蔗糖或海藻糖溶液)或其组合。在一些实施方案中，所述水性介质是注射用水。在一些实施方案中，所述水性介质是TE缓冲剂。在一些实施方案中，所述水性介质是10％海藻糖溶液。在一些实施方案中，所述溶解发生在所述过滤离心机内。在一些实施方案中，所述溶解发生在所述过滤离心机外。

在一些实施方案中，所溶解的mRNA的收集包括一个或多个将所述助滤剂与所溶解的mRNA分离的步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个用于将所述助滤剂与所溶解的mRNA分离的步骤包括将包含所溶解的mRNA和助滤剂的溶液应用到过滤器上，其中所述助滤剂被所述过滤器保留，从而产生纯化mRNA的溶液。在特定实施方案中，通过离心将包含所溶解的mRNA和助滤剂的悬浮液应用到过滤离心机的过滤器上。在一些实施方案中，以小于3100g，例如在约1000g与约3000g之间的重力(g)进行离心。

在一些实施方案中，所述过滤离心机是连续离心机和/或所述过滤离心机是竖直或水平取向的，或者所述离心机是倒置卧式离心机。在一些实施方案中，所述过滤离心机包括样品进料口和/或样品排出口。

在一些实施方案中，将所述mRNA悬浮液以约1升/min至约60升/min的速率，例如以约5升/min至约45升/min的速率加载到所述过滤离心机中。在一些实施方案中，例如通过使用转子尺寸(即，转筒直径)为约30cm至约170cm的过滤离心机，在约0.5小时至约8小时之间，将总mRNA悬浮液加载到过滤离心机中。

在一些实施方案中，所述mRNA的制造包括所述mRNA的体外转录(IVT)合成。在一些实施方案中，所述mRNA的制造包括所述mRNA的3’-加尾的单独步骤。在一些实施方案中，所述mRNA的3’-加尾的单独步骤进一步包括所述mRNA的5’加帽。在一些实施方案中，所述mRNA的IVT合成包括所述mRNA的5’-加帽和任选地3’-加尾。

在特定实施方案中，在mRNA的IVT合成后进行本发明方法的步骤(a)至(d)。在一些实施方案中，用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于8L/gmRNA，例如小于6L/g mRNA或小于5L/g mRNA。在一些实施方案中，用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约4L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约1.5L/g mRNA之间。

在一些实施方案中，在mRNA的IVT合成后并且再次在mRNA的3’-加尾的单独步骤后进行本发明的步骤(a)至(d)。在一些实施方案中，用于在IVT合成后和/或在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积小于8L/gmRNA，例如小于6L/g mRNA或小于5L/g mRNA。在一些实施方案中，用于在IVT合成后和/或在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积在约0.5L/g mRNA与约4L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于在IVT合成后和/或在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积在约0.5L/g mRNA与约1.5L/g mRNA之间，例如约1L/g mRNA。在特定实施方案中，用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积为约0.5L/g mRNA。在一个特定实施方案中，用于在mRNA的3’-加尾和/或加帽的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积为约0.5L/g mRNA。在一个具体实施方案中，用于在IVT合成后以及在mRNA的3’-加尾和/或5’-加帽的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积为约1L/g mRNA。

在一些实施方案中，所述mRNA的长度为或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb。

在一些实施方案中，所述mRNA包含一种或多种核苷酸修饰。在一些实施方案中，所述一种或多种核苷酸修饰包括经修饰的糖、经修饰的碱基和/或经修饰的糖磷酸酯骨架。

在一些实施方案中，所述mRNA不包含核苷酸修饰。

在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为每单一批至少10g、20g、50g、100g、250g、500g、1kg、5kg、10kg、50kg或100kg。在一个实施方案中，纯化mRNA的回收量为每单一批至少250g。在另一个实施方案中，纯化mRNA的回收量为每单一批至少500g。在一个特定实施方案中，纯化mRNA的回收量为每单一批至少1kg。在一些实施方案中，以导致产率为至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的量回收总纯化mRNA。在一些实施方案中，以导致产率为约80％至约100％的量回收总纯化mRNA。在一些实施方案中，以导致产率为约90％至约99％的量回收总纯化mRNA。在特定实施方案中，以导致产率为至少约90％的量回收总纯化mRNA。

在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度在约60％与约100％之间。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度在约80％与99％之间。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度在约90％与约99％之间。

在一些实施方案中，所述纯化mRNA的完整性为至少约80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的完整性为或大于约95％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的完整性为或大于约98％。在特定实施方案中，所述纯化mRNA的完整性为或大于约99％。

在一些实施方案中，其中所述纯化mRNA在不经进一步纯化的情况下具有临床级纯度。在一些实施方案中，在不进行选自以下的进一步纯化的情况下实现所述临床级纯度：高效液相色谱(HPLC)纯化、基于配体或结合的纯化、切向流过滤(TFF)纯化和/或离子交换色谱。

在一些实施方案中，如通过毛细管电泳确定的，所述纯化mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的蛋白质污染物或者基本上不含蛋白质污染物。在一些实施方案中，如通过高效液相色谱(HPLC)确定，所述纯化mRNA包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的盐污染物或者基本上不含盐污染物。在一些实施方案中，如通过高效液相色谱(HPLC)确定，所述纯化mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的短流产性转录物污染物或者基本上不含短流产性转录物污染物。在一些实施方案中，如通过毛细管电泳确定的，所述纯化mRNA的完整性为95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或者99％或更多。

在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物包括IVTmRNA合成中使用的酶试剂。在特定实施方案中，所述酶试剂包括聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和加帽酶。

在一些实施方案中，本发明的方法还去除了长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留溶剂和/或残留盐。在一些实施方案中，所述短流产性转录物污染物包含小于15个碱基。在一些实施方案中，所述短流产性转录物污染物包含约8-12个碱基。在一些实施方案中，本发明的方法还去除了RNA酶抑制剂。

在另一方面，本发明提供了通过本发明的任一种方法获得的纯化mRNA。

在另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含通过本发明的任一种方法获得的纯化mRNA。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。

在另一方面，本发明提供了一种用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用通过本发明的任一种方法获得的纯化mRNA或包含纯化mRNA的组合物。

在另一个方面，本发明提供了通过本发明的任一种方法获得的纯化mRNA或包含纯化mRNA的组合物，用于疗法。

在另一方面，本发明提供了一种用于纯化mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：I)在第一器皿中提供包含沉淀mRNA的悬浮液，其中所述沉淀mRNA包含来自所述mRNA的制造中的一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物；II)在第二器皿中提供洗涤缓冲剂；III)将所述第一器皿的内容物转移到包括过滤器的过滤离心机中，其中所述转移以相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m²至约25升/min/m²(例如，约15升/min/m²)的速率发生，同时所述过滤离心机以第一离心机速度运行使得所述沉淀mRNA保留在所述过滤离心机的过滤器上；IV)将所述第二器皿的内容物转移到所述过滤离心机中，其中所述转移以相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m²至约25升/min/m²(例如，约15升/min/m²)的速率发生，同时所述过滤离心机保持以所述第一离心机速度运行，从而用所述洗涤缓冲剂洗涤保留在所述过滤离心机的过滤器上的沉淀mRNA；以及V)从所述过滤离心机的过滤器上回收所洗涤的沉淀mRNA。

在一些实施方案中，第一离心机速度施加小于1300g的重力(g)。

在本发明方法的一些实施方案中，通过泵送进行步骤(III)和(IV)中的转移。在一些实施方案中，通过与第一和第二器皿可操作连接的单个泵进行步骤(III)和(IV)中的泵送。

在本发明方法的一些实施方案中，一个或多个阀门控制从第一器皿和第二器皿的转移。

在本发明方法的一些实施方案中，经由样品进料口将第一器皿的内容物和第二器皿的内容物转移到过滤离心机。

在本发明方法的一些实施方案中，在步骤(V)之后，将过滤离心机的过滤器用包含1％10N NaOH的注射用水冲洗。

在本发明方法的一些实施方案中，所述包含沉淀mRNA的悬浮液包含助滤剂。

在本发明方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括：i)使步骤(V)中回收的包含助滤剂的所洗涤的沉淀mRNA溶解；ii)将来自步骤(i)的溶解的mRNA以相对于过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m²至约25升/min/m²(例如，约15升/min/m²)的速率转移到一个或所述过滤离心机中，其中所述过滤离心机包括用于保留助滤剂的过滤器；以及iii)通过离心从过滤离心机收集溶解的纯化mRNA。

在本发明方法的一些实施方案中，通过过滤离心机的样品进料口进行转移。

在本发明方法的一些实施方案中，步骤(iii)包括经由过滤离心机的样品排出口收集溶解的纯化mRNA。

在一个进一步的方面，本发明提供了一种用于纯化mRNA的系统，其中所述系统包括：a)用于接收沉淀mRNA的第一器皿；b)用于接收洗涤缓冲剂的第二器皿；c)用于接收洗涤的沉淀mRNA和/或用于使沉淀mRNA溶解的水性介质的第三器皿；d)过滤离心机，所述过滤离心机包括：

i)过滤器，其中所述过滤器的布置和尺寸设置为保留沉淀mRNA和/或助滤剂，并且使溶解的mRNA通过；

ii)样品进料口；和

iii)样品排出口；

e)用于接收纯化mRNA的第四器皿，其中所述器皿与过滤离心机的样品排出口连接；f)泵，所述泵被配置为以相对于过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m²至约25升/min/m²(例如，约15升/min/m²)的速率引导流过所述系统；其中所述第一器皿、所述第二器皿和所述第三器皿与所述泵的输入端可操作连接，并且其中所述过滤离心机的样品进料口与所述泵的输出端连接；以及g)一个或多个阀门，所述一个或多个阀门被配置为阻止从第一、第二和第三器皿的同时流动。

在本发明系统的一些实施方案中，所述系统进一步包括数据处理设备，所述数据处理设备包括用于控制所述系统进行本发明的任何方法的装置。在一些实施方案中，所述数据处理设备是(a)包括指令的计算机程序，或者(b)包括指令的计算机可读存储介质。

在一个进一步的方面，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含在无菌的不含RNA酶的容器中的相对浓度为约1:1:10的10-1000g mRNA、两亲性聚合物和助滤剂。

在本发明组合物的一些实施方案中，所述两亲性聚合物包括分子量为约2000-10000g/mol；4000-8000g/mol或约6000g/mol的PEG(例如，PEG-6000)。在一些实施方案中，所述两亲性聚合物包括MTEG。在一些实施方案中，所述助滤剂是基于纤维素的。

本发明的各个方面详细描述于以下章节中。章节的使用不意在限制本发明。每个章节可以适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。

附图说明

以下附图仅用于说明目的而非用于限制。

图1是具有15cm转筒的千克级实验室过滤离心机的照片。

图2是具有30cm转筒的千克级水平过滤刮刀离心机的照片。

图3示出了本发明的或用于本发明的方法或过程的示例性系统的组件的配置。

图4示出了概述本发明的方法或过程的示例性步骤的流程图。虚线表示所述过程或方法中的任选步骤。

图5示出了概述使用本发明示例性系统的本发明示例性方法的步骤的示意图。

定义

为了更容易地理解本发明，下文首先定义某些术语。以下术语和其他术语的另外的定义在整个说明书中都有阐述。

除非上下文另有明确说明，否则如在本说明书及所附权利要求中所使用的，单数形式“一种/一个(a)”、“一种/一个(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。

除非特别说明或在上下文中显而易见，如本文所用，术语“或”应理解为包含性的，并且涵盖“或”和“和”二者。

如本文所用的术语“例如”和“即”仅以举例的方式使用而不旨在限制，并且不应被解释为仅指说明书中明确列举的那些项目。

术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如，“至少一个/种”应理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其之间的任何更大的数字或分数。

相反，术语“不多于”包括小于所陈述值的每个值。例如，“不多于100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其之间的任何更小的数字或分数。

术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二个”等被理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000个或更多个。还包括其之间的任何更大的数字或分数。

大约或约：如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与所述参考值类似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指在所陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内。除非上下文另外清楚，否则本文提供的所有数值都被术语“大约”或“约”修饰。

批次：如本文所用，术语“批次”是指同时纯化(例如，在同一制造周期期间根据单一制造指令纯化)的mRNA的数量或量。批次可以是指在单个纯化运行中纯化mRNA的量。

生物活性的：如本文所用，短语“生物活性的”是指在生物系统中、特别是在生物体中具有活性的任何药剂的特征。例如，在被施用至生物体时对该生物体具有生物作用的药剂被认为是生物活性的。

dsRNA：如本文所用，术语“dsRNA”是指在体外转录(IVT)反应期间互补RNA序列的产生。互补RNA序列可以由于多种原因而产生，所述原因包括例如可以与新生RNA链中的互补序列杂交的短流产性转录物、用作RNA依赖性非DNA依赖性RNA转录的引物的短流产性转录物以及可能的RNA聚合酶模板逆转。

重力(g)：如本文所用，术语“重力(g)”是指施加在离心机中样品上的加速度。在本文中，将由离心机产生的重力(g)施加到保留在过滤器上的沉淀mRNA和通过过滤离心机的转筒或转鼓的其他物质上。过滤离心机产生的重力(g)取决于离心机的尺寸。由于离心机转筒的运动是圆形的，将加速度计算为半径与角速度平方的乘积。历史上称为“相对离心力”(RCF)，g力是在圆周运动中施加至样品的加速度的量度并且以重力为单位测量。在本文中，重力(g)和RCF可互换使用，并且不要与转筒的每分钟转数(RPM)混淆。重力(g)或RCF与根据转筒的半径的RPM相关，并且与重力相关。RPM与RCF之间的区别很重要，因为两个直径不同的转筒以相同的转速(RPM)运行将导致不同的加速度(其中直径较大的转筒在相同的转速下获得较高的重力(g))。

基于不同尺寸的离心转筒的重力(g)或RCF与RPM之间的转换对本领域技术人员来说是常规的。可以由过滤离心机转筒的半径和RPM使用以下公式确定重力(g)：

g＝(n)²x 1.118×10^-5x r

其中：

g＝重力(g)(RCF)

r＝旋转半径(cm)

n＝每分钟转数(RPM)

可以由过滤离心机转筒的半径和重力(g)使用以下公式确定RPM：

n＝√[g/(r x 1.118)]x 1x 10⁵

其中：

g＝重力(g)(RCF)

r＝旋转半径(cm)

n＝每分钟转数(RPM)

根据上述内容，特定的过滤离心机将具有不同的RPM到重力(g)的转换，并且反之亦然。在本文中，对于转筒直径为30cm的离心机(例如，Heinkel H300P)可以在3450RPM的速度下施加约1996g的重力(g)。因此，RPM到重力(g)的转换是约0.578的因子，并且重力(g)到RPM的转换是约1.73的因子。在本文中，对于转筒直径为50cm的离心机(例如，RousseletRobatel EHBL 503)可以在约2600RPM的速度下施加约1890g的重力(g)。因此，RPM到重力(g)的转换是约0.723的因子，并且重力(g)到RPM的转换是约1.38的因子。

杂质：如本文所用，术语“杂质”是指限制量的液体、气体或固体内部与目标材料或化合物的化学组成不同的物质。杂质也被称为“污染物”。

体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中(例如，在试管或反应器皿中、在细胞培养中等)，而不是在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体(诸如人和非人动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的情况下，所述术语可以用于指代在活细胞内(与例如体外系统相反)发生的事件。

分离的：如本文所用，术语“分离的”是指如下物质和/或实体：已经被(1)与最初产生时(在自然界中和/或在实验环境中)与其相连的至少一些组分分开，和/或(2)人工地产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的最初与其相连的其他组分分开。在一些实施方案中，分离的药剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则所述物质是“纯的”。如本文所用，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)。

信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用的mRNA涵盖经修饰的RNA和未经修饰的RNA两者。mRNA可以含有一个或多个编码区和非编码区。

mRNA完整性：如本文所用，术语“mRNA完整性”通常是指mRNA的质量。在一些实施方案中，mRNA完整性是指在纯化过程后未降解的mRNA的百分比。

核酸：如本文所用，术语“核酸”以其最广泛含义指代被掺入或可以被掺入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯键被掺入或可以被掺入多核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指单独核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含单独核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即，具有除了磷酸二酯骨架外的类似物。例如，本领域中已知且在骨架中用肽键代替磷酸二酯键的所谓的“肽核酸”被认为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可以包含内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在合适的情况下，例如，在化学合成分子的情形中，核酸可以包含核苷类似物(诸如具有经化学修饰的碱基或糖的类似物)、骨架修饰等。除非另有指示，否则核酸序列以5’至3’方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；嵌入的碱基；经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺连接)。在一些实施方案中，本发明具体涉及“未经修饰的核酸”，意指尚未进行化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。

沉淀：如本文所用，术语“沉淀”(或其任何语法等效物)是指在溶液中形成固体。在结合mRNA使用时，术语“沉淀”是指在液体中形成不溶或固体形式的mRNA。

过早流产的RNA序列：如本文所用的术语“过早流产的RNA序列”、“短流产性RNA种类”、“短体(shortmer)”和“长流产性RNA种类”是指mRNA合成反应(例如，体外合成反应)的不完全产物。出于多种原因，RNA聚合酶并非总是完全转录DNA模板；例如，RNA合成过早终止。RNA合成过早终止的可能原因包括DNA模板的质量、模板中存在的特定聚合酶的聚合酶终止子序列、降解缓冲剂、温度、核糖核苷酸的耗尽以及mRNA二级结构。过早流产的RNA序列可能具有小于期望转录产物的预期长度的任何长度。例如，过早流产的mRNA序列可以为小于1000个碱基、小于500个碱基、小于100个碱基、小于50个碱基、小于40个碱基、小于30个碱基、小于20个碱基、小于15个碱基、小于10个碱基或更小。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现目的特征或特性的总体或接近总体范围或程度的定性情况。生物领域的普通技术人员应理解，生物和化学现象很少(如果有过的话)完成和/或进行至完成或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕捉在许多生物和化学现象中固有的潜在完整性缺乏。

基本上不含：如本文所用，术语“基本上不含”是指其中存在相对很少量或没有待去除的物质(例如，过早流产的RNA序列)的状态。例如，“基本上不含过早流产的RNA序列”意指过早流产的RNA序列以小于大约5％、4％、3％、2％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(w/w)杂质的水平存在。可替代地，“基本上不含过早流产的RNA序列”意指过早流产的RNA序列以小于约100ng、90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng、10ng、1ng、500pg、100pg、50pg、10pg或更低的水平存在。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域普通技术人员一般理解的以及与本申请所属领域常用的相同的含义；这样的技术通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。

具体实施方式

本发明尤其提供了一种使用通过离心过滤来纯化mRNA的改进方法。另外，本发明提供了通过本发明方法产生的组合物，以及用于实施本发明方法的过程和系统。

为了满足制造需求，用于mRNA纯化的方法需要稳健且可扩大，以确保大规模制造能力到位，满足所有临床和商业需求，同时与目前可用的行业标准mRNA纯化方法相比，提供等效或更好的产品。诸位发明人证明了与当前可用的方法相比，离心过滤通过在加载和洗涤由体外合成方法获得的沉淀mRNA两者中使用较低的离心机速度可以实现从过程相关的污染物(诸如酶和短流产性RNA种类)中大于95％的体外合成mRNA的回收率，同时需要减少体积的洗涤缓冲剂。另外，诸位发明人表明，无论在沉淀和洗涤体外合成mRNA的方法中使用有机溶剂(例如，乙醇)还是两亲性聚合物(例如，MTEG)，都可以使用相同的方法参数来纯化mRNA。减少或避免对有机溶剂的需要是非常有利的。例如，与增加体积的挥发性和/或易燃洗涤缓冲剂相关的安全性限制限制了现有设施中基于有机溶剂的方法的可扩大性。使用本发明的方法，诸位发明人证明了可以使用体积为四分之一的洗涤缓冲剂(1L/g纯化mRNA，相比于现有技术方法中的4L/g纯化mRNA)来纯化通过在第一反应中单独合成mRNA并且然后在第二反应中将其加帽和加尾而制造的mRNA。减少洗涤缓冲剂的体积使纯化更高效且成本更低，并且减少了对环境的影响。

用于加载和洗涤从体外合成方法获得的沉淀mRNA的降低的离心机速度施加小于1300g的重力(g)。例如，诸位发明人已经发现，施加小于1300g的重力(g)的离心机速度导致纯化mRNA的滤饼不那么紧密，所述滤饼更容易且完全地被剥离并且更容易再溶解，从而进一步增加了纯化的效率和速度。此外，在加载步骤中使用较低的速度允许所述过程在加载和洗涤步骤两者中使用相同的较低离心机速度，从而提供了更直接的方法，有助于自动化和增加的可扩大性。

离心

离心已经在本领域中用于固液分离。离心机放大重力以分离各相(例如，固体和液体)。过滤离心机利用诸如织布等介质来保留固相，同时允许液相通过。过滤离心也已经被用于mRNA纯化。

例如，WO 2018/157141使用通过多孔基质的离心来从mRNA的悬浮液中去除污染物。这些mRNA纯化方法建议在加载步骤中使用高离心机速度。确实，WO 2018/157141使用施加在约1700g与2100g之间的重力(g)的离心机速度。这些较高的速度被认为对于确保沉淀mRNA的悬浮液被过滤离心机的过滤器有效地保留并且避免保留的沉淀mRNA滤饼在纯化过程中被逐出是重要的。

如上文所概述的，诸位发明人已经证明在加载步骤中高速不是必需的。事实上，在加载步骤中使用较低的离心机速度来施加减小的重力(g)导致保留的沉淀mRNA滤饼的密度较低。如下文所概述的，密度较低的滤饼尤其允许使用较低体积的洗涤缓冲剂高效纯化mRNA，并且使滤饼能够从过滤离心机的过滤器中完全移出。

过滤离心机

过滤离心机的工作原理是离心力，所述离心力是当设备(通常称为转筒或转鼓)在固定轴上高速旋转时产生的。过滤离心机能够通过使液体通过过滤器或筛网(例如，丝网)从固液混合物中分离固体(例如，沉淀mRNA)和液体(例如，用于合成mRNA的缓冲剂)。此类离心机可以包括被穿孔以允许流体流动的可移除转筒或固定的转鼓。被穿孔的转筒或转鼓可以适于接受多孔基质，诸如滤布或滤纸。典型地，所述多孔基质是可移除的。在常用的过滤离心机中，悬浮液从离心机的内部流到外部，从而穿过多孔基质(例如，可移除的多孔基质)，并且然后穿过转筒或被穿孔的转鼓。以这种方式，添加到离心机内部的固液混合物中的固体材料被保留，并且将液体从悬浮液中去除。

适用于本发明方法的离心机是本领域熟知的。参见例如，Scott,K.和Hughes,R.,“Industrial Membrane Separation Technology”.Springer Science&Business Media,1996；Tarleton,S.和Wakeman,R.,“Filtration:Equipment Selection,Modelling andProcess Simulation”,Elsevier,1999；Tarleton,S.和Wakeman,R.,“Solid/LiquidSeparation:Scale-up of Industrial Equipment”.Elsevier,2005；Wakeman,R.和Tarleton,S.,“Solid/Liquid Separation:Principles of Industrial Filtration”.Elsevier,2005；Tarleton,S.和Wakeman,R.,“Solid/liquid separation:equipmentselection and process design”.Elsevier,2006；以及Sutherland,K.和Chase,G.,“Filters and Filtration Handbook”.Elsevier,2011，将所述文献中的每一个均通过引用以其整体并入本文。还参见US 1292758 A；US 1478660A；US 3269028 A；US 3411631 A；US 3419148 A；US 3438500 A；US 3483991 A；US 3491888A；US 3623613 A；US 3684099 A；US 3774769 A；US 3980563 A；US 4193874A；US 4193874 A；US 4193874 A；US 4269711 A；US 4381236 A；US 4944874 A；US 5004540A；US 5091084 A；US 5092995 A；US 5244567 A；US 5277804 A；US 5286378A；US 5306423 A；US 5378364 A；US 5380434 A；US 5397471 A；US 5421997 A；US 5433849A；US 5468389 A；US 5472602 A；US 5713826 A；US 6736968B2；US 6736968B2；US 6736968 B2；US 7168571 B2；US 7425264 B2；US 8021289 B2；US8257587 B2；US 9126233B2；US 9297581B2；US 20040108281A1；US 20040108281A1；US20050245381A1；US 20060021931 A1；US 20060175245 A1；US 20080149558 A1；US20100120598A1；US 20100216623 A1；US 20120285868 A1；US 20140360039 A1；AU2007350788A1；AU 2007350788 B2；EP 1372862 A1；EP 3040127 A1；EP 845296A1；WO2004033105A1；WO 2008122067A1；WO 2014043541A1；WO 2016025862A1；WO 2016112426A1；WO 2016112427A1；和WO 2016112428A1，将所述文献中的每一个均通过引用以其整体并入本文。

合适的离心机类型的非限制性例子包括分批过滤离心机、倒置过滤离心机、推料离心机(pusher centrifuge)、刮刀离心机(peeler centrifuge)(例如，水平刮刀离心机、竖直刮刀离心机和虹吸刮刀离心机(siphon peeler centrifuge))、摆式离心机(pendulumcentrifuge)、筛网/螺旋式离心机(screen/scroll centrifuge)和滑动卸料式离心机(sliding discharge centrifuge)。

在一些实施方案中，过滤离心机是连续离心机。在一些实施方案中，过滤离心机是竖直取向的。在一些实施方案中，在一些实施方案中，过滤离心机是水平取向的。在一些实施方案中，过滤离心机是倒置卧式离心机。用于本发明方法的适当过滤离心机的例子示于图1和图2中。

在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径为约30cm至约170cm。在一个特定实施方案中，过滤离心机的转筒直径为100cm或更大，例如至多约170cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒深度为约15cm至约80cm。在一个特定实施方案中，过滤离心机的转筒深度为60cm或更深，例如至多约80cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径:深度为约30cm:15cm至约170cm:80cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径为30cm并且深度为15cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径为50cm并且深度为25cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径为63cm并且深度为31.5cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径为81cm并且深度为35cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径为105cm并且深度为61cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径为115cm并且深度为61cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径为132cm并且深度为72cm。在一些实施方案中，过滤离心机的转筒直径为166cm并且深度为76cm。在一些实施方案中，过滤离心机的可用体积为约20升至约725升。在一些实施方案中，过滤离心机的最大载量为约30kg至约900kg。在一个特定实施方案中，过滤离心机的最大载量为大于250kg，例如多达900kg。在一些实施方案中，过滤离心机的最大过滤表面积为约0.5m²至约4m²。在一些实施方案中，过滤离心机的最大速度(RPM)为1000RPM至约3500RPM。在一些实施方案中，过滤离心机可以施加约900g至约2000g的最大重力(g)。

过滤离心机的配置

图3示出了本发明的以及用于本发明的方法和过程的系统的配置。所述系统包括：用于接收沉淀mRNA的第一器皿(4)；用于接收洗涤缓冲剂的第二器皿(2)；第三器皿(3)，所述第三器皿用于接收洗涤的沉淀mRNA和/或用于溶解沉淀mRNA的水性介质；包括过滤器、样品进料口(18)和样品排出口(22)的过滤离心机(20)；用于接收纯化mRNA的第四器皿(34)和用于接收污染物的第五器皿(30)；被配置为引导流过系统的泵(14)；和一个或多个阀门(10、12和26)，其被配置为阻止从系统的不同器皿的同时流出或同时流入系统的不同器皿。第一、第二和第三器皿与泵(14)的输入端可操作连接(5、6和8)，并且过滤离心机的样品进料口(18)与泵(14)的输出端可操作连接(16)。第四和第五器皿与过滤离心机的样品排出口(22)可操作连接(28和34)。此外，离心机包括样品排出通道(21)，通过所述通道可以从过滤离心机回收(21)沉淀mRNA组合物。图3所展示的系统可以用于本发明的方法中，所述方法包括通过从过滤器中逐出沉淀mRNA的组合物来回收保留的洗涤沉淀mRNA，或者通过使保留在过滤器上的沉淀mRNA溶解并且随后将其收集来回收所保留的洗涤的沉淀mRNA。在本发明的一个特定实施方案中，第三器皿(3)和第四器皿(34)是任选的组件(即，沉淀mRNA可以经由样品排出通道(21)回收(24)，而不需要溶解步骤)。在另一个特定实施方案中，第三器皿(3)和第四器皿(34)用于包括使沉淀mRNA溶解以及回收纯化mRNA(即，到第四器皿(34)中)的那些实施方案。

在一些实施方案中，过滤离心机包括样品进料口。在一些实施方案中，样品进料口接收来自一个或多个器皿的物质(例如，沉淀mRNA的悬浮液、洗涤缓冲剂和/或溶解缓冲剂)。在一些实施方案中，样品进料口与所述一个或多个器皿可操作连接。在一些实施方案中，通过泵送将物质从一个或多个器皿转移到过滤离心机的样品进料口。在一些实施方案中，通过与一个或多个器皿和样品进料口可操作连接的单个泵进行泵送。在一些实施方案中，通过一个或多个阀门控制物质从一个或多个器皿转移到样品进料口。

在一些实施方案中，过滤离心机包括样品排出口。在一些实施方案中，样品排出口允许从过滤离心机回收纯化mRNA。在一些实施方案中，样品排出口与用于回收过滤的纯化mRNA的一个或多个器皿可操作连接。在一些实施方案中，将纯化mRNA回收到用于回收过滤的纯化mRNA的一个或多个器皿中。在一些实施方案中，样品排出口与用于回收纯化过程期间的污染物的一个或多个器皿(例如，废物桶)可操作连接。在一些实施方案中，通过泵送经由过滤器排出口将纯化mRNA和/或污染物从过滤离心机转移到一个或多个器皿中。在一些实施方案中，通过与样品排出口和用于回收纯化mRNA和/或污染物的一个或多个器皿可操作连接的单个泵进行泵送。在一些实施方案中，通过一个或更多个阀门控制纯化mRNA和/或污染物从过滤离心机经由过滤器排出口转移到一个或多个器皿。

在一些实施方案中，过滤离心机包括样品排出通道，其被配置为在使用过滤离心机的犁刀(plough)或叶片后接收来自离心机的转筒或转鼓的沉淀mRNA。

运行过滤离心机

加载和卸载过滤离心机

在一些实施方案中，与一个或多个器皿和过滤离心机的样品进料口可操作连接的泵被配置为将来自用于提供沉淀mRNA的悬浮液、洗涤缓冲剂和/或溶解缓冲剂的一个或多个器皿的物质以随过滤离心机的过滤器的表面积变化而确定的速率转移到样品进料口。在一些实施方案中，所述泵被配置为将来自样品排出口的物质以约5升/min/m²至约25升/min/m²(相对于过滤离心机的过滤器的表面积)的速率转移到用于回收纯化mRNA和/或污染物的一个或多个器皿中。在一些实施方案中，所述泵被配置为将来自样品排出口的物质以约10升/min/m²至约20升/min/m²的速率转移到用于回收纯化mRNA和/或污染物的一个或多个器皿中。在一些实施方案中，转移速率为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25升/min/m²。在特定实施方案中，转移速率为约15升/min/m²或更小。

在一些实施方案中，在约0.5小时至约8小时(例如，约2小时至约6小时)之间，将总体积的悬浮液、洗涤缓冲剂和/或溶解缓冲剂加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，在约少于约8小时、少于约7小时、少于约6小时、少于约5小时、少于约4小时、少于约3小时、少于约2小时、少于约1小时或少于约0.5小时内，将总体积加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，将总体积的悬浮液、洗涤缓冲剂和/或溶解缓冲剂加载到过滤离心机所花费的时间可以取决于所述过滤离心机的转子尺寸(即，转筒直径)，例如，将总体积的1000g沉淀mRNA的悬浮液加载到转子尺寸为约50cm的过滤离心机中可能花费约3小时(参见表D)。在一些实施方案中，例如通过使用转子尺寸(即，转筒直径)为约30cm至约170cm的过滤离心机，在约0.5小时至约4小时之间，将总体积的洗涤缓冲剂加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，在少于约4小时、少于约3小时、少于约2小时、少于约1小时或少于约0.5小时内，将总体积的洗涤缓冲剂加载到过滤离心机中。例如，诸位发明人已经使用转子尺寸为约50cm的过滤离心机使用500升洗涤缓冲剂在约80分钟内(即，以6L/min的洗涤缓冲剂加载速率或15L/min/m²)实现了一批1000g mRNA的杂质去除(参见表D)。

在一些实施方案中，将总体积的悬浮液分批或连续地加载到过滤离心机中。

在一些实施方案中，在约1分钟至约90分钟之间，从过滤离心机中回收总体积的纯化mRNA和/或污染物。在一些实施方案中，在少于约90分钟、少于约80分钟、少于约70分钟、少于约60分钟、少于约50分钟、少于约30分钟、少于约20分钟、少于约10分钟、少于约5分钟、少于约4分钟、少于约3分钟、少于约2分钟或少于约1分钟内，从过滤离心机回收总体积。

在一些实施方案中，过滤离心机包括叶片刮刀或犁刀，其被配置为去除保留在过滤离心机的过滤器上的沉淀mRNA。在一些实施方案中，在过滤离心机运行时使用叶片。

离心机速度

诸位发明人已经发现，当使用施加减小的重力(g)的离心机速度时，使用离心过滤纯化mRNA的方法实现了更高的洗涤效率和增加的纯化mRNA的产率。这是违反直觉的，因为预期在更高的速度下会有更好的过滤。确实，如上文所概述的，WO 2018/157141(采用离心进行mRNA纯化)使用达到超过1500g(例如，约1750-2250g)的重力(g)的离心机速度，以在沉淀样品上施加最大的力，从而改善过滤并且保持滤饼与过滤离心机的过滤器的接触。诸位发明人在本文中证明，使用施加较低重力(g)的离心机速度实现了等效或改进的纯化，同时大大增加了洗涤效率(即，需要较低体积的洗涤缓冲剂来从沉淀mRNA中清除污染物)。

在不希望受理论束缚，诸位发明人认为降低的速度(即，施加在沉淀mRNA上的降低的重力(g))降低了由沉淀mRNA的离心产生的滤饼的密度，使得鉴于滤饼堆积的减少，洗涤滤饼的过程更高效。因此，与先前的方法相比，本发明的方法需要较少的洗涤缓冲剂以便实现临床级mRNA纯化。因此，本发明的方法减少了在洗涤缓冲剂中包含挥发性有机溶剂(例如，醇)的那些方案中洗涤沉淀mRNA所需的挥发性有机溶剂(例如，醇)的体积。与先前的方法相比，本发明的方法能够使洗涤缓冲剂减少75％，从而允许本发明的方法显著放大为适用于纯化的临床级mRNA的商业生产的较大批量大小。

另外，与先前的方法相比，尤其是鉴于对减少体积的洗涤缓冲剂的需求，增加了本发明方法的速度，允许以商业规模更高效地生产。此外，如上文所概述的，降低的离心机速度导致密度较低的滤饼产物，其具有较少的聚集物和更均匀的一致性。这种降低的密度提高了可以从过滤离心机的过滤器中回收滤饼的效率，避免了滤饼形成残留硬皮(heel)时离心机叶片可能对过滤器造成的潜在损坏。此外，滤饼密度的降低也增加了滤饼的悬浮液功效，提高了溶解后可获得的纯化mRNA的量。

因此，根据本发明的方法，选择避免压实滤饼并且施加重力(g)的离心机速度，使得沉淀mRNA保留在过滤离心机的过滤器上，同时缓冲剂和一种或多种污染物通过过滤器。选择适于施加用于本发明方法的加载和洗涤步骤的特定重力(g)的离心机速度。在一些实施方案中，离心机速度也适于施加用于本发明方法的收集步骤的特定重力(g)。

在一些实施方案中，离心机速度施加小于1300g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于1200g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于1100g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于1000g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于900g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于800g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于700g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于600g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于500g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于400g的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加小于300g的重力(g)。在特定实施方案中，离心机速度施加小于750g，例如小于730g，例如约725g的重力(g)。在特定实施方案中，离心机速度施加小于600g，例如小于585g，例如约575g的重力(g)。

在一些实施方案中，离心机速度施加在约150g与约1300g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约250g与约900g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约300g与约1300g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约350g与约1250g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约350g与约1050g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约400g与约1100g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约400g与约600g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约450g与约1050g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约500g与约1000g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约500g与约900g之间的重力(g)。在特定实施方案中，离心机速度施加在约700g与约900g之间，例如在约750g与约850g之间(例如，约800g)的重力(g)。已经发现这种g力适合一系列不同尺寸的离心机。

在一些实施方案中，离心机速度施加在约500g与约750g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约550g与约850g之间的重力(g)。在一些实施方案中，离心机速度施加在约550g与约750g之间的重力(g)。在特定实施方案中，离心机速度施加在约550g与约650g之间，例如在约570g与580g之间，例如约575g的重力(g)。在特定实施方案中，离心机速度施加在约650g与约750g之间，例如在约720g与约730g之间，例如约725g的重力(g)。

如上文所概述的，可以基于转筒直径和每分钟转数(RPM)计算g力。在转筒直径为50cm的离心机上以1000RPM的速度离心产生约725g的重力。在转筒直径为30cm的离心机上以1000RPM的速度离心产生约575g的重力。在特定实施方案中，已经发现不论过滤离心机的转筒直径如何，施加在约700g与约900g之间，例如在约750g与约850g之间(例如，约800g)的重力(g)的离心机速度特别适合于实现杂质去除。

在一些实施方案中，在本发明方法的整个过程中，使过滤离心机以相同的离心机速度运行。在一些实施方案中，在本发明方法的加载步骤和洗涤步骤期间使过滤离心机以相同的离心机速度运行。在本发明方法的整个过程中维持相同的离心机速度增加了本发明纯化方法的易用性和再现性。

在一些实施方案中，过滤离心机以小于1500RPM的离心机速度运行。在一些实施方案中，过滤离心机以小于1250RPM的离心机速度运行。在特定实施方案中，过滤离心机以小于1000RPM的离心机速度运行。在一些实施方案中，于加载和洗涤步骤两者，过滤离心机对以相同的离心机速度运行。

施加如与本发明方法所需相同的重力将显示出本发明方法的相同优点，不论过滤离心机和/或所述过滤离心机上实现这些重力(g)所需的RPM如何。因此，本发明的方法可以用于本领域中任何已知的过滤离心机，条件是过滤离心机可以对沉淀mRNA施加适当的重力(g)。确实，较大的商业离心机具有最大速度并且因此具有它们可以施加的最大重力(g)。例如，加载能力为550kg的Rousselet Robatel EHBL 1323可以施加1130g的最大重力(g)。鉴于本文公开的诸位发明人的观察结果，本发明的方法可以应用于较大的商业离心机，使得能够以较大的规模有效纯化mRNA。

多孔基质

在典型的实施方案中，用于本发明方法的过滤离心机包括多孔基质(例如，过滤器或膜)。多孔基质保留沉淀mRNA，同时允许溶解的RNA(例如，短流产性RNA种类)通过。在一些实施方案中，可以从过滤离心机中去除多孔基质。如本文所用，术语“膜”或“过滤器”是指任何多孔层或材料片。在本申请中，术语“膜”与“过滤器”可互换使用。

本文所述的任何方法中使用的过滤器可以具有各种过滤器孔径和类型。例如，离心过滤器的平均孔径可以为约0.01微米至约200微米、约1微米至约2000微米、约0.2微米至约5微米或约1微米至约3微米。在一些实施方案中，平均孔径为约0.5微米或更大、约0.75微米或更大、约1微米或更大、约2微米或更大、约3微米或更大、约4微米或更大或约5微米或更大。

在一些实施方案中，所述过滤器的孔径适于捕获或保留沉淀mRNA，同时使杂质(包括可溶性杂质和/或尺寸小于孔径的不溶物)作为渗透物通过。在一些实施方案中，所述过滤器的孔径适于捕获杂质(包括尺寸大于孔径的不溶性杂质，例如助滤剂)，同时使溶解的mRNA通过。在一些实施方案中，所述过滤器的平均孔径为或大于约0.10μm、0.20μm、0.22μm、0.24μm、0.26μm、0.28μm、0.30μm、0.40μm、0.5μm或1.0μm。在一些实施方案中，所述过滤器的平均孔径为约0.5μm至约2.0μm。在特定实施方案中，所述过滤器的平均孔径为约1μm。

在一些实施方案中，可以通过沉淀mRNA的标称分子量极限(NMWL)(也称为截留分子量(MWCO))来确定用于保留沉淀mRNA的适当孔径。典型地，使用孔径小于沉淀mRNA的NMWL或MWCO的过滤器。在一些实施方案中，使用孔径比沉淀mRNA的NMWL或MWCO低二至六倍(例如，2、3、4、5或6倍)的过滤器。在一些实施方案中，用于本发明的合适过滤器的孔径可以为或大于约100千道尔顿(kDa)、300kDa、500kDa、1,000kDa、1,500kDa、2,000kDa、2,500kDa、3,000kDa、3,500kDa、4,000kDa、4,500kDa、5,000kDa、5,500kDa、6,000kDa、6,500kDa、7,000kDa、7,500kDa、8,000kDa、8,500kDa、9,000kDa、9,500kDa或10,000kDa。在一些实施方案中，过滤器的孔径大于mRNA的NMWL和MWCO，但小于沉淀mRNA的NMWL和MWCO。

用于本发明的过滤器可以由任何材料制成。示例性过滤器材料包括但不限于聚醚砜(mPES)(未改性)、聚醚砜(mPES)中空纤维膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)、乙酸纤维素、硝化纤维素、MCE(混合纤维素酯)、超高MW聚乙烯(UPE)、聚四氟乙烯(PTFE)、尼龙、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚丙烯、聚氯乙烯及其组合。例如，已经发现由热塑性聚合物，特别是部分结晶和非极性热塑性高分子(例如，聚烯烃，诸如聚丙烯)制成的织物特别适用于本发明。此类织物可以以约0.5μm至约2.0μm的平均孔径(例如，约1.0μm的平均孔径)生产。

用于本发明的合适过滤器可以具有各种表面积。在一些实施方案中，过滤器具有足够大的表面积以促进mRNA的大规模生产。例如，过滤器的表面积可以为或大于约2,000cm²、2,500cm²、3,000cm²、3,500cm²、4,000cm²、4,500cm²、5,000cm²、7,500cm²、10,000cm²、5m²、10m²、12m²、15m²、20m²、24m²、25m²、30m²或50m²。

本文的方法可以适应各种过滤器孔径，同时仍保留mRNA并且不污染过滤器。

方法步骤

本发明的方法涉及通过一系列步骤纯化体外合成的mRNA，所述一系列步骤包括使体外合成的mRNA沉淀以产生包含沉淀mRNA的悬浮液，将悬浮液加载到过滤离心机中，并且将沉淀mRNA在过滤离心机中洗涤。然后可以将洗涤的沉淀mRNA溶解于储存溶液(例如，适用于冻干的溶液)或药学上可接受的液体(例如，注射用水)中。

图4提供了概述本发明示例性方法的步骤(包括另外任选的步骤(通过虚线展示))的流程图。在一些实施方案中，本发明方法包括图4中提供的步骤。在一些实施方案中，本发明方法进一步包括图4中提供的任选步骤。

此外，图5提供了概述在本发明的示例性系统上进行的本发明示例性方法的步骤的示意性流程图。图5中的系统和方法仅被配置用于这些实施方案，其中从过滤离心机的过滤器中回收沉淀mRNA作为沉淀mRNA的组合物，并且随后溶解，然后使用过滤离心机收集以提供纯化mRNA。所述系统包括：用于接收沉淀mRNA的悬浮液(40)的第一器皿(2)；用于溶解洗涤的沉淀mRNA或者用于接收用于溶解沉淀mRNA的水性介质的第二器皿(3)；用于收集污染物(38)的第三器皿(例如，废物桶)(30)；用于接收纯化mRNA(60)的第四器皿(34)；过滤离心机(20)，其包括具有多孔基质的转筒或转鼓(36)(例如，过滤器)、样品进料口(18)、输入喷嘴(44)、样品排出口(22)、样品排出通道(21)、犁刀或叶片(48)(用于从过滤器中逐出保留的沉淀mRNA)和一个或多个喷洒器(54)(用于分配冲洗溶液)。图5中展示的方法包括如下所示的以下步骤[1]至[16]：[1]提供过滤离心机；[2]将沉淀mRNA与助滤剂组合的悬浮液(40)提供到第一器皿(2)中；[3]经由样品进料口(18)，将沉淀mRNA的悬浮液(40)从第一器皿(2)转移到以第一离心机速度(例如，施加小于1300g的重力(g)的离心机速度)运行的过滤离心机中，使得与助滤剂组合的沉淀mRNA保留(42)在过滤离心机的过滤器上并且污染物(可溶性的或尺寸小于过滤器孔的)(38)通过过滤器进入废物桶(30)；[4]继续运行离心机直到基本上全部收集到沉淀mRNA的悬浮液的水性部分；[5]经由输入喷嘴(44)，将洗涤缓冲剂(46)(任选地来自其他器皿)转移到以第二离心机速度运行的过滤离心机中，使得通过洗涤缓冲剂洗涤与助滤剂组合的沉淀的保留的mRNA；[6]和[7]继续运行过滤离心机，使得洗涤缓冲剂通过与助滤剂组合的保留的沉淀mRNA(42)以及过滤离心机的过滤器，从而携带污染物(例如，盐污染物)与其一起到废物桶(30)中；[8]和[9]任选地使离心机以第一、第二或第三离心机速度继续运行，使得与助滤剂组合的保留的洗涤的沉淀mRNA干燥；[10]-[12]使用犁刀或叶片(48)并且从以第三离心机速度运行的过滤离心机的过滤器中逐出与助滤剂组合的保留的洗涤的沉淀mRNA，使得经由样品排出通道(21)，将洗涤的沉淀mRNA收集，作为沉淀mRNA与助滤剂组合的组合物(50)(此步骤还可以在离心机不运行的情况下手动进行(未显示))；[13]和[14]任选地，可以经由喷洒器(54)，将过滤离心机的过滤器和转筒用转移到过滤离心机中的冲洗缓冲剂(例如，包含NaOH的水)(52)冲洗(这也称为就地清洗(CIP)系统)并且收集在废物桶(30)中；[15]将沉淀mRNA与助滤剂组合的组合物(50)溶解于溶解缓冲剂中以提供溶解的mRNA与助滤剂组合的水溶液(56)，将其转移到用于接收溶解的mRNA的器皿(3)中(溶解步骤可以在此器皿(3)内发生)；[15]经由样品进料口(18)，将mRNA与助滤剂组合的水溶液从器皿(3)转移到以第四离心机运行的过滤离心机中，使得助滤剂被过滤离心机的过滤器保留并且水性mRNA溶液通过过滤器进入用于接收纯化mRNA的溶液(60)的其他器皿(34)中。在一些实施方案中，在所述方法的所有步骤中，离心机以相同的离心机速度运行。在一些实施方案中，第一、第二和任选地第三离心机速度是相同的。下文详细提供了示例性离心机速度。特别地，方法的步骤[2]-[7]在施加小于1300g的重力(g)的离心机速度下发生。

在一些实施方案中，本发明方法包括制备体外合成的mRNA的一个或多个步骤。在其他实施方案中，通过体外合成制造mRNA与其纯化在物理上和在时间上都是分开的。更典型地，本发明的纯化方法是合成mRNA的完整方法，即，根据本发明的体外合成方法可以包括根据本发明进行的一个或多个纯化步骤。

在一些实施方案中，本发明的方法包括纯化后溶解mRNA的一个或多个步骤。在其他实施方案中，将纯化mRNA在不同的时间储存和溶解。例如，运输纯化的沉淀mRNA可能是有利的，因为其在溶解之前体积较小。

mRNA合成

体外转录(IVT)典型地用以下来进行：包含启动子的线性或环状DNA模板、核糖核苷酸三磷酸库、可以包含DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切的条件将根据具体的应用而变化。因此，在一些实施方案中，mRNA的制造包括以下步骤：通过混合(i)包含合适启动子的DNA模板和(ii)RNA聚合酶进行体外转录(IVT)，以产生包含全长mRNA的不纯制剂，然后使其经受本文公开的纯化方法。这些IVT的存在是最终产物中不希望的，并且因此可以称为杂质，并且含有这些杂质中的一种或多种的制剂可以称为不纯制剂。

在特定实施方案中，IVT反应包括两步过程，第一步包括mRNA的体外转录，然后是根据本发明的纯化步骤，以及第二步骤包括体外转录的mRNA的加帽和加尾，随后是根据本发明的第二纯化步骤。在一些实施方案中，IVT反应是导致加帽和加尾mRNA的体外转录的一步过程。例如，在一些实施方案中，体外转录导致产生加帽和加尾mRNA，随后对其进行纯化。例如，这是通过使用包含聚T区和/或(即，在水性缓冲剂中的呈钠盐形式的50mMm7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG)的质粒来实现的。

在一些实施方案中，DNA模板是线性DNA模板。在一些实施方案中，DNA模板是环状DNA模板。在一些实施方案中，聚合酶是SP6聚合酶。在一些实施方案中，混合进一步包括混合核糖核苷酸三磷酸库。在一些实施方案中，混合进一步包括RNA酶抑制剂(例如，RNA酶I抑制剂)、RNA酶A、RNA酶B和RNA酶C。

在一些实施方案中，可以优化待转录的DNA模板以促进更高效的转录和/或翻译。例如，可以针对顺式调节元件(例如，TATA盒、终止信号和蛋白质结合位点)、人工重组位点、chi位点、CpG二核苷酸含量、阴性CpG岛、GC含量、聚合酶滑移位点和/或与转录相关的其他元件方面优化DNA模板；可以针对隐蔽剪接位点、mRNA二级结构、mRNA的稳定自由能、重复序列、mRNA不稳定基序和/或与mRNA加工和稳定性相关的其他元件方面优化DNA模板；可以针对密码子使用偏好、密码子适应性、内部chi位点、核糖体结合位点(例如，IRES)、过早聚A位点、夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno，SD)序列和/或与翻译相关的其他元件方面优化DNA模板；和/或可以针对密码子背景、密码子-反密码子相互作用、翻译暂停位点和/或与蛋白质折叠相关的其他元件方面优化DNA模板。本领域已知的优化方法可以用于本发明，例如ThermoFisher的GeneOptimizer和描述于US 20110081708中的OptimumGene^TM，将所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，DNA模板包含5'和/或3'非翻译区。在一些实施方案中，5'非翻译区包含一种或多种影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁反应元件。在一些实施方案中，5'非翻译区可以具有在约50与500个核苷酸之间的长度。

在一些实施方案中，3'非翻译区包含以下中的一种或多种：聚腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的位置的稳定性的蛋白质的结合位点或miRNA的一个或多个结合位点。在一些实施方案中，3'非翻译区可以具有在50与500个核苷酸之间或更长的长度。

示例性3'和/或5'UTR序列可以源自稳定的mRNA分子(例如，珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白和柠檬酸循环酶)，以增加有义mRNA分子的稳定性。例如，5'UTR序列可以包括CMV立即早期1(IE1)基因的部分序列或其片段，以改善mRNA的核酸酶抗性和/或改善多核苷酸的半衰期。还公开了将编码人生长激素(hGH)的序列或其片段包含到多核苷酸(例如，mRNA)的3'端或非翻译区以进一步稳定多核苷酸。通常，相对于没有此类特征的相同多核苷酸，这些特征改善了多核苷酸的稳定性和/或药代动力学特性(例如，半衰期)，并且包括例如为改善多核苷酸对体内核酸酶消化的这种抗性而具有的特征。

在一些实施方案中，在单独的反应中进行体外合成的mRNA的加帽。在此类反应中，典型地如下添加5'帽：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后，经由鸟苷酰基转移酶向末端磷酸中添加鸟苷三磷酸(GTP)，产生5’5’5三磷酸键联；然后，通过甲基转移酶甲基化鸟嘌呤的7-氮。帽结构的例子包括但不限于m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)、m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeA)、m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeG)、m7(3’OMeG)(5’)ppp(5’)(2’OMeA)、m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。在具体实施方案中，帽结构是m7G(5’)ppp(5’)(2’OMeG)。另外的帽结构描述于公开的美国申请号US 2016/0032356和2017年2月27日提交的美国临时申请62/464,327中，将其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，mRNA的制造包括用于大规模生产全长mRNA分子的方法。在一些实施方案中，mRNA的制造包括用于生产富集长度大于500个核苷酸的全长mRNA分子的组合物的方法，在一些实施方案中，至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.01％、99.05％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％的纯化mRNA分子是全长mRNA分子。

在一些实施方案中，组合物或批次包含至少200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、250g、500g、750g、1kg、5kg、10kg、50kg、100kg、1000kg或更多mRNA。在一些实施方案中，沉淀mRNA的悬浮液包含至少100mg、1g、10g、100g、250g、500g、1kg、10kg、100kg、1公吨或10公吨或其之间任何量的mRNA。在一个实施方案中，沉淀mRNA的悬浮液包含至少250g的mRNA。在另一个实施方案中，沉淀mRNA的悬浮液包含至少500g的mRNA。在一个特定实施方案中，沉淀mRNA的悬浮液包含大于1kg的mRNA。

在一些实施方案中，mRNA分子的长度大于600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、10,000或更多个核苷酸；本发明还包括具有其之间任何长度的mRNA。

mRNA的沉淀

根据本发明的方法，使体外合成的mRNA沉淀，以提供包含沉淀mRNA的悬浮液，使得可以借助过滤离心机将其与污染物分离。所述悬浮液可以包含各种污染物，例如，质粒DNA和酶。

适用于使mRNA沉淀的任何和所有方法均可以用于实践本发明。

用于使mRNA沉淀的试剂

在一些实施方案中，所述mRNA的沉淀包括添加一种或多种促进mRNA沉淀的试剂，例如醇、两亲性聚合物、缓冲剂、盐和/或表面活性剂中的一种或多种。在特定实施方案中，一种或多种促进mRNA沉淀的试剂是(i)盐(例如，离液盐)和(ii)醇或两亲性聚合物。

在一些实施方案中，一种或多种促进mRNA沉淀的试剂是盐。已知高浓度的盐会导致蛋白质和核酸两者从水溶液中沉淀出。在一些实施方案中，使用多于一种盐。在一些实施方案中，高浓度的盐可以在1M与10M之间，包括端值。在一些实施方案中，高浓度的盐可以在2M与9M之间，包括端值。在一些实施方案中，高浓度的盐可以在2M与8M之间，包括端值。在一些实施方案中，高浓度的盐可以在2M与5M之间，包括端值。在一些实施方案中，高浓度的盐可以大于1M浓度。在一些实施方案中，高浓度的盐可以大于2M浓度。在一些实施方案中，高浓度的盐可以大于3M浓度。在一些实施方案中，高浓度的盐可以大于4M浓度。在一些实施方案中，高浓度的盐可以大于5M浓度。在一些实施方案中，高浓度的盐可以大于6M浓度。在一些实施方案中，高浓度的盐可以大于7M浓度。在一些实施方案中，高浓度的盐可以大于8M浓度。在一些实施方案中，使用单一的盐。在一些实施方案中，盐的最终浓度为2-4M，例如为2.5-3M。在特定实施方案中，所述盐的最终浓度为约2.7M。

在一些实施方案中，盐可以是钙盐、铁盐、镁盐、钾盐、钠盐或其组合。在一些实施方案中，适合用作促进mRNA沉淀的试剂的示例性特定盐包括但不限于氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化钙(CaCl₂)、溴化钾(KBr)、溴化钠(NaBr)、溴化锂(LiBr)。在一些实施方案中，不纯制剂所经受的变性剂是氯化钾(KCl)。在一些实施方案中，添加KCl使得所得KCl浓度为约1M或更大。在一些实施方案中，添加KCl使得所得KCl浓度为约2M或更大、3M或更大、4M或更大、或者5M或更大。

在一些实施方案中，所述盐是离液盐。离液剂是通过干扰非共价力(诸如氢键和范德华力)来破坏大分子(诸如蛋白质和核酸)的结构的物质。在一些实施方案中，离液盐的最终浓度为2-4M，例如为2.5-3M。在特定实施方案中，离液盐的最终浓度为约2.7M。

在一些实施方案中，将盐(例如，离液盐，诸如硫氰酸胍(GSCN))添加到含有mRNA的悬浮液中，以使污染性蛋白质变性和溶解。因此，在一个实施方案中，GSCN是悬浮液中的盐。在此之后添加两亲性聚合物或醇以使mRNA选择性沉淀。mRNA沉淀后，将所得沉淀mRNA加载到过滤离心机中，并且被过滤器保留，洗涤过滤器以产生不含污染物(例如，短流产性RNA种类、长流产性RNA种类、dsRNA、质粒DNA、残留体外转录酶、残留盐和残留溶剂)的沉淀物。随后，通过溶解缓冲剂(例如，水)溶解沉淀mRNA产生纯化mRNA组合物。

因此，在一些实施方案中，一种促进mRNA沉淀的试剂包含离液盐，例如硫氰酸胍(例如，包含约1-5M硫氰酸胍的溶液)。例如，所述溶液包含约1M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M或约5M的离液盐，例如GSCN。合适的GSCN缓冲剂的例子包括，例如，包含4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠pH 6.5、0.5％ N-月桂酰肌氨酸钠盐的水溶液。GSCN缓冲剂的另一个例子是包含在10mM二硫苏糖醇(DTT)缓冲剂中的5M GSCN的水溶液。在一些实施方案中，GSCN的最终浓度为2-4M。在一些实施方案中，GSCN(例如，5M GSCN-10mM DTT缓冲剂)的最终浓度为2.5-3M。在特定实施方案中，GSCN的最终浓度为约2.7M。

在一些实施方案中，使用两种试剂来促进mRNA的沉淀，其中一种试剂包含硫氰酸胍(例如，硫氰酸胍的水溶液，诸如GSCN缓冲剂)，并且第二种试剂包含挥发性有机溶剂，诸如醇(例如，乙醇)或两亲性聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))。在实施方案中，依序或同时使用这两种试剂。在实施方案中，所述方法包括使用包含硫氰酸胍(例如，GSCN缓冲剂)和(i)醇(例如，无水乙醇或醇的水溶液，诸如乙醇水溶液)或(ii)两亲性聚合物(例如，分子量为约4000至约8000g/mol的PEG，典型地在水溶液中的最终浓度为约10％至约20％(重量/体积)的溶液。在典型的实施方案中，溶液进一步包含助滤剂(例如，基于纤维素的助滤剂，例如Solka Floc)。助滤剂可以与沉淀mRNA以约10:1的质量比存在于最终溶液中。在一些实施方案中，当使mRNA沉淀时，不使用助滤剂。在一些实施方案中，将助滤剂添加到包含沉淀mRNA的水性悬浮液中。

在一些实施方案中，促进mRNA沉淀的一种或多种试剂包括挥发性有机溶剂，诸如醇(例如，乙醇，诸如无水乙醇)。在实施方案中，促进mRNA沉淀的一种或多种试剂是醇的水溶液(例如，乙醇水溶液)。在实施方案中，促进mRNA沉淀的一种或多种试剂是无水乙醇。

在一些实施方案中，最终悬浮液包含挥发性有机溶剂，诸如醇。合适的醇包括乙醇、异丙醇和苯甲醇。典型地，最终悬浮液包含约50％、60％、70％、80％或90％重量/体积浓度的醇(例如，乙醇)。在一些实施方案中，最终悬浮液包含小于约50％、40％、30％、20％或10％重量/体积浓度的醇(例如，乙醇)。在特定实施方案中，最终悬浮液包含约50％重量/体积浓度的醇(例如，乙醇)。

在一些实施方案中，悬浮液不含挥发性有机溶剂，特别是不含醇，所述挥发性有机溶剂是高度易燃的并且因此对可储存在设施中的体积具有安全性限制。在具体实施方案中，洗涤缓冲剂包含两亲性聚合物代替醇，诸如乙醇。用于本发明的无醇(特别是无乙醇)方法的合适两亲性聚合物是本领域已知的。在一些实施方案中，用于本文方法中的两亲性聚合物包括普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)或其组合。在一些实施方案中，两亲性聚合物选自以下中的一种或多种：PEG三乙二醇、四乙二醇、PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1,000、PEG 1,500、PEG 2,000、PEG 3,000、PEG 3,350、PEG 4,000、PEG 6,000、PEG 8,000、PEG 10,000、PEG 20,000、PEG 35,000和PEG 40,000或其组合。在一些实施方案中，两亲性聚合物包括使用两个或更多个种类的分子量PEG聚合物的混合物。例如，在一些实施方案中，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种分子量PEG聚合物构成两亲性聚合物。因此，在一些实施方案中，PEG溶液包含一种或多种PEG聚合物的混合物。在一些实施方案中，PEG聚合物的混合物包含具有不同分子量的聚合物。

在一些实施方案中，使悬浮液中的mRNA沉淀包括一种或多种两亲性聚合物。在一些实施方案中，使悬浮液中的mRNA沉淀包括PEG聚合物。本领域中认可多个种类的PEG聚合物，其中一些具有不同的几何构型。适合于本文方法的PEG聚合物包括例如具有直链、支链、Y形或多臂构型的PEG聚合物。在一些实施方案中，PEG处于包含具有不同几何构型的一种或多种PEG的悬浮液中。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用PEG-6000沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用PEG-400沉淀mRNA来实现。在特定实施方案中，使mRNA沉淀可以使用典型地以约10％至约20％(重量/体积)的最终浓度的分子量为约4000至约8000g/mol，例如约6000g/mol的PEG(例如，PEG-6000)来实现。

在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用三乙二醇(TEG)沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用三乙二醇单甲醚(MTEG)沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用TEG-O-丙酸叔丁酯沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用TEG-二甲基丙烯酸酯沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用TEG-二甲醚沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用TEG-二乙烯醚沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用TEG-单丁醚沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用TEG-甲醚甲基丙烯酸酯沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用TEG-单癸醚沉淀mRNA来实现。在一些实施方案中，使mRNA沉淀可以使用TEG-二苯甲酸酯沉淀mRNA来实现。这些基于PEG或TEG的试剂中的任一种都可以与硫氰酸胍鎓组合使用来沉淀mRNA。这些试剂中的每一种的结构示于下表A中。

表A：用于纯化mRNA(mRNA的沉淀和/或洗涤)的非有机溶剂试剂

在一些实施方案中，使悬浮液中的mRNA沉淀包括PEG聚合物，其中所述PEG聚合物包含经PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质是DOPA-PEG缀合物。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质是泊洛沙姆-PEG缀合物。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质包括DOTAP。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质包括胆固醇。

在一些实施方案中，使包含两亲性聚合物的悬浮液中的mRNA沉淀。在一些实施方案中，使在包含前述PEG试剂中的任一种的悬浮液中的mRNA沉淀。在一些实施方案中，PEG以约10％至约100％重量/体积浓度处于悬浮液中。例如，在一些实施方案中，PEG以约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％重量/体积和其之间任何值的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约5％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约6％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约7％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约8％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约9％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约10％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约12％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约15％重量/体积存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约18％重量/体积存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约20％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约25％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约30％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约35％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约40％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约45％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约50％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约55％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约60％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约65％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约70％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约75％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约80％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约85％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约90％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约95％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约100％重量/体积的浓度存在于悬浮液中。

在一些实施方案中，使悬浮液中的mRNA沉淀包括约0.1至约5.0的PEG与总mRNA悬浮液体积的体积:体积比率。例如，在一些实施方案中，PEG以以下体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0。因此，在一些实施方案中，PEG以约0.1的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.2的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.3的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.4的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.5的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.6的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.7的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.8的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.9的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约1.0的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约1.25的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约1.5的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约1.75的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约2.0的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约2.25的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约2.5的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约2.75的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约3.0的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约3.25的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约3.5的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约3.75的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约4.0的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约4.25的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约4.50的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约4.75的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约5.0的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。在特定实施方案中，PEG以约1.0、约1.5或约2.0的体积:体积比率存在于mRNA悬浮液中。

在一些实施方案中，用于mRNA沉淀的反应体积包括GSCN和PEG。在特定实施方案中，用于mRNA沉淀的反应体积包括GSCN和分子量为约4000至约8000g/mol，例如约6000g/mol的PEG(例如，PEG-6000)。GSCN的最终浓度典型地在2M与4M之间。PEG的最终浓度典型地为约10％至约20％(重量/体积)。

在一些实施方案中，使悬浮液中的mRNA沉淀，所述悬浮液包含最终浓度在约2-4M之间的GSCN；最终浓度在约5％与约20％(重量/体积)之间，分子量为约4000至约8000g/mol，例如约6000g/mol的PEG(例如，PEG-6000)；以及与沉淀mRNA的质量比率为约2:1；约5:1；约10:1或约15:1的助滤剂(例如，基于纤维素的助滤剂)。在一些实施方案中，使悬浮液中的mRNA沉淀，所述悬浮液包含最终浓度为约2.5-3M的GSCN；最终浓度在约10％与约15％(重量/体积)之间，分子量为约6000g/mol的PEG(例如，PEG-6000)；以及与沉淀mRNA的质量比率为约10:1的助滤剂(例如，基于纤维素的助滤剂)。在特定实施方案中，使悬浮液中的mRNA沉淀，所述悬浮液包含最终浓度为约2.7M的GSCN；最终浓度为约12％(重量/体积)，分子量为约6000g/mol的PEG(例如，PEG-6000)；以及与沉淀mRNA的质量比率为约10:1的助滤剂(例如，基于纤维素的助滤剂，例如Solka-Floc)。如例子所示，在本发明的方法中，包含这些浓度的mRNA、盐和PEG的悬浮液实现了mRNA的高效纯化。

在一些实施方案中，可以使用MTEG替代PEG来提供沉淀mRNA的悬浮液。在特定实施方案中，MTEG以约15％至约45％重量/体积的最终浓度用于此目的。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约20％至约40％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为20％重量/体积约的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为25％重量/体积约的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为30％重量/体积约的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为35％重量/体积约的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度小于35％重量/体积的MTEG。MTEG诱导的沉淀中使用的其余条件与PEG诱导的沉淀中所使用的条件相同。特别适合于在本发明方法中高效回收mRNA的是包含mRNA、GSCN和MTEG的悬浮液，其中MTEG的最终浓度为约25％，以及与沉淀mRNA的质量比率为约10:1的助滤剂(例如，基于纤维素的助滤剂)。

例如，可以以4-8M溶液(例如，在10mM DTT缓冲剂中)提供GSCN，然后将其与mRNA(典型地浓度为1mg/ml)和MTEG(可用纯度≥97.0％)合并以制备沉淀mRNA的悬浮液。在一些实施方案中，悬浮液包含体积比率为1:2-3:1-2的沉淀mRNA、离液盐(例如，GSCN)和MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含体积比率为1:2-2.5:1-2的沉淀mRNA、离液盐(例如，GSCN)和MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含体积比率为1:2.3:1-2的沉淀mRNA、离液盐(例如，GSCN)和MTEG。在特定实施方案中，悬浮液包含比率为1:2.3:2的沉淀mRNA、GSCN和MTEG。在特定实施方案中，悬浮液包含体积比率为1:2.3:1.7的沉淀mRNA、GSCN和MTEG。在特定实施方案中，悬浮液包含比率为1:2.3:1的沉淀mRNA、GSCN和MTEG。如例子所示，包含体积比率为1:2.3:1、1:2.3:1.7和1:2.3:2的mRNA、GSCN和MTEG的悬浮液特别适合于在本发明的方法中与最终浓度为约95％的MTEG洗涤溶液组合(这种步骤组合确保了mRNA的高效纯化和回收)获得纯化mRNA。

在一些实施方案中，使用两种试剂来促进mRNA的沉淀，其中一种试剂包含硫氰酸胍(例如，硫氰酸胍的水溶液，诸如GSCN缓冲剂)，并且第二种试剂包含两亲性聚合物(例如，PEG和/或MTEG)。在一些实施方案中，依序或同时使用这两种试剂。在一些实施方案中，所述方法包括使用包含硫氰酸胍(例如，GSCN缓冲剂)和两亲性聚合物(例如，PEG和/或MTEG)的溶液。

在一些实施方案中，沉淀步骤包括使用离液盐(例如，硫氰酸胍)和/或两亲性聚合物(例如，PEG和/或MTEG)和/或醇溶剂(例如，无水乙醇或醇的水溶液，诸如乙醇水溶液)。因此，在一些实施方案中，沉淀步骤包括分别使用离液盐和两亲性聚合物，诸如GSCN和PEG和/或MTEG。

在一些实施方案中，用于使mRNA沉淀的悬浮液包含沉淀mRNA、盐和MTEG。在一些实施方案中，所述悬浮液不含醇，例如乙醇。

助滤剂(包括分散剂)

在一些实施方案中，在本文所述的方法中(例如，离心期间)使用助滤剂。当使用过滤离心机纯化沉淀mRNA时，可以使用助滤剂。助滤剂可以帮助将沉淀mRNA保留在过滤离心机的过滤器上，并且可以促进从过滤离心机过滤器的表面去除保留的mRNA。

在一些实施方案中，助滤剂是分散剂。在一些实施方案中，沉淀mRNA组合物包含至少一种分散剂，例如灰、粘土、硅藻土、玻璃珠、塑料珠、聚合物、聚合物珠(例如，聚丙烯珠、聚苯乙烯珠)、盐(例如，纤维素盐)、砂和糖中的一种或多种。在一些实施方案中，所述聚合物是天然存在的聚合物，例如纤维素(例如，粉状纤维素纤维)。

在一些实施方案中，适合与本发明方法一起使用的助滤剂是基于纤维素的。在实施方案中，纤维素助滤剂是粉状纤维素纤维(例如，或Sigmacell Cellulose20)。在实施方案中，纤维素助滤剂是粉状纤维素纤维，诸如/>100NF或SigmacellCellulose类型20。在一些实施方案中，基于纤维素的助滤剂的粒度为约20μm。

在一些实施方案中，沉淀mRNA与助滤剂(例如，粉状纤维素纤维，诸如Solka Floc)的质量比率为1:2；1:5；1:10或1:15。在特定实施方案中，沉淀mRNA与助滤剂(例如，粉状纤维素纤维，诸如Solka Floc)的质量比率为1:10。

在一些实施方案中，在不存在助滤剂的情况下进行mRNA的沉淀。在一些实施方案中，沉淀mRNA组合物不包含助滤剂。

在一些实施方案中，在存在至少一种助滤剂的情况下进行mRNA的沉淀。

在一些实施方案中，将助滤剂添加到mRNA沉淀后获得的浆料中。

在一些实施方案中，纯化方法可以进一步包括将助滤剂与保留的沉淀mRNA分离的一个或多个步骤。所述方法可以进一步包括以下步骤：使用水性介质(例如，水)从滤饼中溶解沉淀和纯化的mRNA，并且收集溶解的mRNA，同时将助滤剂保留在过滤器上(例如，使用过滤离心机)。

保留的沉淀mRNA的洗涤

洗涤缓冲剂的组合物

纯化mRNA的方法包括洗涤保留的沉淀mRNA以去除沉淀步骤所需的盐并且去除沉淀mRNA的悬浮液中的任何污染物。洗涤保留的沉淀mRNA的步骤涉及用洗涤缓冲剂洗涤保留的沉淀mRNA。术语“洗涤缓冲剂”和“洗涤溶液”在本文中可互换使用。

在一些实施方案中，洗涤缓冲剂包含挥发性有机溶剂，例如醇。合适的醇包括乙醇、异丙醇和苯甲醇。典型地，洗涤缓冲剂包含约至少50％、60％、70％、80％或90％重量/体积浓度的醇(例如，乙醇)。在一些实施方案中，洗涤缓冲剂包含约50％、60％、70％、80％或90％重量/体积浓度的醇(例如，乙醇)。在特定实施方案中，洗涤缓冲剂包含约80％重量/体积浓度的醇。在特定实施方案中，洗涤缓冲剂中的醇是乙醇。

在一些实施方案中，洗涤缓冲剂不含挥发性有机溶剂，特别是不含醇，所述挥发性有机溶剂是高度易燃的并且因此对可储存在设施中的体积具有安全性限制。在具体实施方案中，洗涤缓冲剂包含两亲性聚合物代替醇，诸如乙醇。用于本发明的无醇(并且特别是无乙醇)方法的合适两亲性聚合物选自普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、三乙二醇单甲醚(MTEG)或其组合。聚乙二醇(PEG)(例如，具有低分子量(特别是约200-600g/mol)的PEG)并且尤其是三乙二醇单甲醚(MTEG)特别适用于实践本发明的无醇(特别是无乙醇)的实施方案。

在一些实施方案中，两亲性聚合物是聚乙二醇(PEG)。因此，在一些实施方案中，PEG溶液(“PEG洗涤溶液”)用于洗涤保留的mRNA。PEG洗涤溶液包含三乙二醇、四乙二醇、PEG200、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1,000、PEG 1,500、PEG 2,000、PEG 3,000、PEG 3,350、PEG 4,000、PEG 6,000、PEG 8,000、PEG 10,000、PEG 20,000、PEG 35,000、和PEG 40,000、或其组合。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含三乙二醇。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含四乙二醇。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 200。在一些实施方案中，PEG溶液包含PEG 300。在一些实施方案中，洗涤PEG洗涤溶液包含PEG 400。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 600。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 1,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 1,500。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 2,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 3,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG3,350。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 4,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 6,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 8,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 10,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 20,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 35,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 40,000。

在一些实施方案中，洗涤溶液中PEG的分子量为约100至约1000g/mol。在一些实施方案中，洗涤溶液中PEG的分子量为约200至约6000g/mol。在一些实施方案中，洗涤溶液中PEG的分子量为约100g/mol；200g/mol(例如，PEG 200)；300g/mol(例如，PEG 300)；400g/mol(例如，PEG 400)；500g/mol；600g/mol(例如，PEG 600)或1000g/mol(例如，PEG 1000)。在特定实施方案中，洗涤溶液中PEG的分子量为约400g/mol(例如，PEG 400)。

在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤包括一次或多次洗涤，所述洗涤包括粘度为90厘沱或更低的PEG。在一些实施方案中，用于沉淀mRNA的PEG的粘度为80厘沱或更低。在一些实施方案中，用于沉淀mRNA的PEG的粘度为70厘沱或更低。在一些实施方案中，用于沉淀mRNA的PEG的粘度为60厘沱或更低。在一些实施方案中，用于沉淀mRNA的PEG的粘度为50厘沱或更低。在一些实施方案中，用于沉淀mRNA的PEG的粘度为40厘沱或更低。在一些实施方案中，用于沉淀mRNA的PEG的粘度为30厘沱或更低。在一些实施方案中，用于沉淀mRNA的PEG的粘度为20厘沱或更低。在一些实施方案中，用于沉淀mRNA的PEG的粘度为10厘沱或更低。液体溶液的粘度可以在室温下(例如，在约18℃与25℃之间)使用本领域熟知的方法(例如，使用粘度计)来测量。

在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用三乙二醇(TEG)来实现。在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用三乙二醇单甲醚(MTEG)来实现。在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用TEG-O-丙酸叔丁酯来实现。在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用TEG-二甲基丙烯酸酯来实现。在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用TEG-二甲醚来实现。在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用TEG-二乙烯醚来实现。在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用TEG-单丁基来实现。在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用TEG-甲醚甲基丙烯酸酯来实现。在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用TEG-单癸醚来实现。在一些实施方案中，沉淀mRNA的洗涤可以使用TEG-二苯甲酸酯来实现。这些试剂中的每一种的结构示于上表A中。

在一些实施方案中，PEG洗涤溶液中的PEG包括经PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液中的PEG是经PEG修饰的脂质1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质是DOPA-PEG缀合物。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质是泊洛沙姆-PEG缀合物。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质包括DOTAP。在一些实施方案中，经PEG修饰的脂质包括胆固醇。

在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含两个或更多个种类的分子量PEG聚合物的混合物。例如，在一些实施方案中，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种分子量PEG聚合物构成PEG洗涤溶液。因此，在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含一种或多种PEG聚合物的混合物。在一些实施方案中，PEG聚合物的混合物包含具有不同分子量的聚合物。

PEG洗涤溶液中使用的PEG可以具有各种几何构型。例如，合适的PEG聚合物包括具有直链、支链、Y型或多臂构型的PEG聚合物。在一些实施方案中，PEG处于包含具有不同几何构型的一种或多种PEG的悬浮液中。

在一些实施方案中，PEG以约10％至约100％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约50％至约95％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。例如，在一些实施方案中，PEG以约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％重量/体积和其之间任何值的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约10％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约15％重量/体积存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约20％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约25％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约30％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约35％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约40％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约45％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约50％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约55％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约60％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约65％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约70％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约75％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约80％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约85％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约90％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约95％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约100％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在特定实施方案中，所述PEG以约90％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。

在一些实施方案中，洗涤缓冲剂包含浓度为在约80％与100％之间的PEG-400。因此，在一些实施方案中，洗涤缓冲剂包含浓度为约80％的PEG-400。在一些实施方案中，洗涤缓冲剂包含浓度为约85％的PEG-400。在一些实施方案中，洗涤缓冲剂包含浓度为约90％的PEG-400。在一些实施方案中，洗涤缓冲剂包含浓度为约95％的PEG-400。在一些实施方案中，洗涤缓冲剂包含浓度为约100％的PEG-400。

在一些实施方案中，PEG以约90％至约100％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在特定实施方案中，PEG(例如，PEG-400)以约90％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。如例子中所示，在本发明的方法中，约95％的最终浓度的分子量为约400g/mol的PEG(例如，PEG-400)导致高产率和高纯度的mRNA样品。

在一些实施方案中，将沉淀mRNA在包含两亲性聚合物的溶液中洗涤。在一些实施方案中，所述两亲性聚合物是MTEG。在一些实施方案中，MTEG以在约75％与约95％重量/体积之间的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，MTEG以约75％、约80％、约85％、约90％或约95％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，MTEG以按重量/体积计约90％至约100％的浓度存在于洗涤溶液中。在特定实施方案中，MTEG以按重量/体积计约95％的浓度存在于洗涤溶液中。如例子所示，在本发明的方法中，约95％重量/体积的最终浓度的MTEG实现了mRNA的高效回收。

在一些实施方案中，例如包含PEG或MTEG的洗涤溶液包含非水性组分，诸如乙醇、异丙醇或苯甲醇。在一些实施方案中，用于洗涤捕获的mRNA的洗涤溶液是水溶液。因此，在一些实施方案中，洗涤溶液不含非水性组分，特别是挥发性有机溶剂，诸如醇，例如乙醇、异丙醇或苯甲醇。

在一些实施方案中，沉淀mRNA可以洗涤1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或多于10次。因此，在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤一次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤两次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤三次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤四次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤五次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤六次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤七次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤八次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤九次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤十次。在一些实施方案中，将沉淀mRNA用例如包含PEG或MTEG的溶液洗涤超过十次。

在一些实施方案中，洗涤步骤包括使用包含两亲性聚合物(例如，聚乙二醇或MTEG)的溶液进行多个冲洗周期。在一些实施方案中，洗涤步骤包括使用包含一种或多种不同的两亲性聚合物的溶液进行多次冲洗。在一些实施方案中，洗涤步骤可以通过使用包含约10％至约100％两亲性聚合物的溶液的多个冲洗周期来进行。在某些实施方案中，多个冲洗周期包括2个周期、3个周期、4个周期、5个周期、6个周期、7个周期、8个周期、9个周期、10个周期或多于10个周期。

洗涤缓冲剂的体积

如上文所概述的，与现有技术的方法相比，本发明的方法允许使用减少体积的洗涤缓冲剂进行mRNA的高效和临床级纯化。因此，本发明方法的优点在于，所述方法使用较少的洗涤缓冲剂，从而允许更具成本和时间效益的用于纯化更大的商业规模的mRNA的方法。如例子所示，与现有技术相比，使用对沉淀mRNA施加较低力的降低的离心机速度的本发明方法需要较低体积的洗涤缓冲剂来实现等效或改善的mRNA纯度。

在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/gmRNA与约8L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约7L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约6L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/gmRNA与约5L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约4L/gmRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约3L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约2.5L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约2L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约1.5L/g mRNA之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约1L/gmRNA之间。在特定实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积为约0.5L/g或更少。

在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于8L/gmRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于7L/gmRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于6L/gmRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于5L/gmRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于4L/gmRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于3L/gmRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于2L/gmRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于1.5L/gmRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于1L/gmRNA。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于0.5L/gmRNA。

在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积为约1.5、1或0.5L/g mRNA。在特定实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积为约0.5L/g mRNA或更少。

在一些实施方案中，mRNA的制造包括mRNA的体外转录(IVT)合成。在一些实施方案中，mRNA的制造进一步包括mRNA的3’-加尾的单独步骤。在一些实施方案中，mRNA的3’-加尾的单独步骤包括mRNA的5’-加帽。在一些实施方案中，mRNA的IVT合成包括mRNA的5’-加帽和/或3’-加尾。在一些实施方案中，在mRNA的IVT合成后进行本发明方法的步骤(a)至(d)。在一些实施方案中，在mRNA的IVT合成后并且再次在mRNA的3’加尾的单独步骤后进行本发明方法的步骤(a)至(d)。在一些实施方案中，在mRNA的IVT合成后并且再次在mRNA的5’-加帽的单独步骤后进行本发明方法的步骤(a)至(d)。

在一些实施方案中，在mRNA制造方法的每个步骤后(例如，在IVT合成、mRNA的5’-加帽和/或3’-加尾后)，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积是不同的。在一些实施方案中，在mRNA制造方法的每个不同步骤中(例如，在IVT合成、mRNA的5’-加帽和/或3’-加尾后)，用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积是相同的。

洗涤缓冲剂的体积可以取决于在本发明纯化方法的单次运行(即，步骤(a)至(d)中的每一个仅进行一次)中待纯化mRNA的总量。在一些实施方案中，用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于8L/g mRNA，例如小于6L/gmRNA或小于5L/gmRNA。在一些实施方案中，用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约4L/g mRNA之间。在特定实施方案中，用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约1.5L/g mRNA之间，例如约0.5L/g mRNA。

在一些实施方案中，进行多于单次运行的本发明纯化方法。例如，在某些实施方案中，对从IVT合成反应获得的mRNA第一次进行步骤(a)至(d)。然后可以使第一次进行所述方法后获得的纯化mRNA经受加帽反应，并且通过第二次进行步骤(a)至(d)来纯化所得的加帽mRNA。在一个特定实施方案中，在进行加帽反应的同时进行加尾反应。可替代地，然后可以使在第一次进行所述方法后获得的纯化mRNA经受加尾反应，并且通过第二次进行步骤(a)至(d)来纯化所得的加尾mRNA。在一个特定实施方案中，在进行加尾反应的同时进行加帽反应。

因此，在一些实施方案中，用于在IVT合成后和/或在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积小于8L/g mRNA，例如小于6L/g mRNA或小于5L/g mRNA。在一些实施方案中，用于在IVT合成后和/或在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积在约0.5L/gmRNA与约4L/g mRNA之间。在特定实施方案中，用于在IVT合成后和/或在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积在约0.5L/gmRNA与约1.5L/g mRNA之间，例如约1L/g mRNA。在特定实施方案中，用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积为约0.5L/g mRNA。在一个特定实施方案中，用于在mRNA的3’-加尾和/或加帽的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积为约0.5L/g mRNA。在一个具体实施方案中，用于在IVT合成后以及在mRNA的3’-加尾和/或5’-加帽的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积为约1L/g mRNA。

回收洗涤的保留的沉淀mRNA

因此，本发明的纯化mRNA的方法包括从过滤离心机的过滤器中回收保留的沉淀mRNA的步骤。保留的沉淀mRNA的回收发生在已经使用洗涤缓冲剂洗涤所保留的沉淀mRNA之后。如上文所概述的，与现有技术的方法相比，使用对沉淀mRNA施加减小的重力(g)的离心机速度确保了沉淀mRNA的滤饼不那么紧密(即，密度较低的)。这降低了残留硬皮形成的可能性，当试图从过滤离心机的过滤器收集保留的mRNA时，所述残留硬皮可能引起问题。使用助滤剂可以进一步降低这种可能性，但是为了利用本发明的改进之处，它的使用不是必要的。因此，本发明的方法确保了在不损坏过滤器并且不需要复杂技术的情况下可以容易地从过滤器中去除最大保留的mRNA，从而使过滤器上的残留mRNA(这将降低纯化方法的总产率)的量最小化。另外，避免损坏过滤器避免了昂贵的更换，并且也确保了过滤器可以在随后的纯化过程中重复使用。

在一些实施方案中，从过滤离心机的过滤器中回收保留的沉淀mRNA(任选地与助滤剂组合)是通过以下方式发生的：将保留的沉淀mRNA从过滤离心机的过滤器中逐出，提供沉淀的mRNA(任选地与助滤剂组合)的组合物。沉淀mRNA(任选地与助滤剂组合)的这种组合物可以(i)储存和/或运输，或(ii)溶解以便提供mRNA(任选地与助滤剂组合)的水溶液形式。在一些实施方案中，从过滤离心机的过滤器中回收保留的沉淀mRNA(任选地与助滤剂组合)包括使由过滤离心机的过滤器保留的沉淀mRNA溶解，提供mRNA(任选地与助滤剂组合)的水溶液形式。在一些实施方案中，可以经由离心收集mRNA(任选地与助滤剂组合)的水溶液以提供纯化mRNA，任选地将助滤剂保留在过滤离心机的过滤器上。

回收沉淀mRNA的组合物

在一些实施方案中，从过滤离心机的过滤器回收保留的沉淀mRNA是通过以下方式发生的：将保留的沉淀mRNA(任选地与助滤剂组合)从过滤离心机的过滤器逐出。如上文所概述的，沉淀mRNA(任选地与助滤剂组合)的密度较低的滤饼更容易从过滤离心机的过滤器中逐出，确保了在不损坏过滤器的情况下回收最大产率的沉淀mRNA。

在一些实施方案中，从过滤离心机的过滤器中回收保留的沉淀mRNA的步骤之前是干燥保留的沉淀mRNA(任选地与助滤剂一起)的步骤。在一些实施方案中，干燥是在过滤离心机中经由离心发生的。在一些实施方案中，用于干燥纯化mRNA组合物的离心可以以施加在约30g至约350g之间的重力(g)的离心机速度进行。在一些实施方案中，用于干燥纯化mRNA组合物的离心可以以施加在约100g至约150g之间的重力(g)的离心机速度进行。

本发明的方法允许在过滤离心机内使用叶片(或犁刀)来回收最大量的保留的沉淀mRNA，而不需要进一步的手动(非自动)步骤。因此，在一些实施方案中，回收保留的沉淀mRNA是在过滤离心机运行时发生的。在一些实施方案中，回收保留的沉淀mRNA是经由叶片(犁刀)发生的，所述叶片将保留的沉淀mRNA从过滤离心机的过滤器中去除。在一些实施方案中，叶片从过滤离心机的过滤器中去除基本上全部的保留的沉淀mRNA。在一些实施方案中，经由过滤离心机的样品排出通道收集保留的沉淀mRNA。

在一些实施方案中，回收保留的沉淀mRNA是在过滤离心机不运行时发生的。在一些实施方案中，例如使用单独的叶片或犁刀从过滤离心机的过滤器中手动回收保留的沉淀mRNA。在一些实施方案中，在从过滤离心机移除过滤器之后，从过滤离心机的过滤器中回收保留的沉淀mRNA。在一些实施方案中，在打开离心机门时，从过滤离心机的转筒或转鼓中直接回收保留的沉淀mRNA。

在一些实施方案中，将回收的沉淀mRNA与助滤剂组合。

在一些实施方案中，在回收保留的沉淀mRNA之后，冲洗过滤离心机。在一些实施方案中，在回收保留的沉淀mRNA之后，重复使用过滤离心机的过滤器。

因此，本发明的方法提供了大量回收(任选地与助滤剂组合)的沉淀mRNA。此类沉淀mRNA的组合物以呈固体形式的大量mRNA容易地运输和储存，同时避免了在大得多体积的水溶液中的等效量mRNA的较困难运输。因此，本发明的方法提供了基本上不含污染物(不包括助滤剂)、盐和溶剂/两亲性聚合物的沉淀mRNA的组合物，所述组合物可以容易地运输和储存。在适当的时候，组合物中的mRNA可以溶解，以允许使用本发明的其他方法从助滤剂中分离mRNA，从而提供纯化mRNA，如下文详细概述的。

在一些实施方案中，保留的沉淀mRNA的回收提供了纯化的沉淀mRNA的组合物。在一些实施方案中，纯化的沉淀mRNA的组合物呈适用于运输和长期储存的形式。在一些实施方案中，保留的沉淀mRNA的回收提供了沉淀mRNA与助滤剂组合的组合物。在一些实施方案中，沉淀mRNA与助滤剂组合的组合物呈适用于运输和长期储存的形式。

在一些实施方案中，沉淀mRNA的组合物包含通过本发明的任何方法收集的沉淀mRNA。在一些实施方案中，沉淀mRNA的组合物包含通过本发明的任何方法制备的纯化mRNA沉淀物。

因此，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含在无菌的不含RNA酶的容器中的相对浓度为约1:1:10的mRNA、两亲性聚合物和助滤剂。在一些实施方案中，所述组合物包含10g、50g、100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1kg、5kg、10kg、50kg、100kg、1公吨、10公吨或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述两亲性聚合物包括分子量为约2000-10000g/mol；4000-8000g/mol或约6000g/mol的PEG(例如，PEG-6000)。在其他实施方案中，两亲性聚合物包括MTEG。在特定实施方案中，助滤剂是基于纤维素的。

在一些实施方案中，将沉淀mRNA的组合物(任选地包括助滤剂)转移到用于溶解mRNA的器皿中。在一些实施方案中，沉淀mRNA的组合物的溶解提供了纯化mRNA的水溶液。在一些实施方案中，沉淀mRNA的组合物的溶解提供了mRNA与助滤剂组合的水溶液。在一些实施方案中，例如在过滤离心机中经由离心，将水溶液中的mRNA与助滤剂分离，以通过将助滤剂保留在过滤离心机的过滤器上来提供纯化mRNA。

回收呈溶解形式的洗涤的保留的沉淀mRNA

如上文所概述的，在一些实施方案中，通过溶解mRNA以提供mRNA(任选地与助滤剂组合)的水溶液，从过滤离心机的过滤器中回收洗涤的保留的沉淀mRNA(任选地与助滤剂组合)。因此，在一些实施方案中，使沉淀mRNA在过滤离心机内溶解，以从过滤离心机的过滤器中回收保留的沉淀mRNA。如上文所概述的，使用对沉淀mRNA施加减小的重力(g)的离心机速度确保了沉淀mRNA的滤饼不那么紧密(即，密度较低的)，使保留的沉淀mRNA更容易溶解并且使回收的mRNA的产率最大化。

下面提供了用于溶解沉淀mRNA的示例性水性介质。

在一些实施方案中，呈溶解形式的保留的沉淀mRNA的回收提供了纯化mRNA的水溶液。在一些实施方案中，本发明的方法包括例如在过滤离心机中经由离心，从mRNA的水溶液中收集纯化mRNA的其他步骤。在一些实施方案中，呈溶解形式的保留的沉淀mRNA的回收提供了mRNA与助滤剂组合的水溶液。在一些实施方案中，本发明的方法包括例如在过滤离心机中经由离心(通过将助滤剂保留在过滤离心机的过滤器上)，从mRNA与助滤剂组合的水溶液中收集纯化mRNA的其他步骤。因此，在一些实施方案中，回收呈溶解形式的保留的沉淀mRNA的步骤包括例如在过滤离心机中使用离心收集溶解的mRNA的步骤。用于收集纯化mRNA的示例性方法在下文中详细概述。

在一些实施方案中，呈溶解形式的保留的沉淀mRNA的回收从过滤离心机的过滤器中回收任何残留洗涤的保留的沉淀mRNA，从而在不需要另外的步骤的情况下使在所述过程中回收的mRNA的产率最大化。在一些实施方案中，呈溶解形式的保留的沉淀mRNA的回收允许重复使用过滤离心机的过滤器。

溶解沉淀mRNA并且收集纯化mRNA

典型地，可以通过使沉淀mRNA溶解到水溶液中并且收集溶解的纯化mRNA(例如，通过在离心机运行时通过过滤离心机的过滤器洗脱)来收集纯化mRNA。如上文所概述的，本发明的方法是有利的，因为它们使得纯化mRNA的回收率显著增加(高达100％)。使用较低的离心机速度来减少施加在沉淀mRNA上的重力会导致密度较低的滤饼。这种密度较低的滤饼中沉淀mRNA更容易溶解在水溶液中，因为水溶液可以更容易和广泛地渗透滤饼，并且从而溶解更大百分比的保留的mRNA。因此，本发明的方法实现了改善的溶解功效，从而增加了纯化mRNA的产率。

溶解沉淀mRNA

在一些实施方案中，沉淀mRNA的溶解包括将mRNA溶解于水性介质中。在一些实施方案中，水性介质包括水。在一些实施方案中，所述水是不含RNA酶的水(例如，注射用水)。在一些实施方案中，水性介质包括缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是Tris-EDTA(TE)缓冲剂或柠檬酸钠缓冲剂。在一些实施方案中，水性介质包括糖溶液。在一些实施方案中，所述糖溶液是蔗糖或海藻糖溶液。在一些实施方案中，水溶液包含水与(i)缓冲剂或(ii)糖溶液的组合。

在一些实施方案中，所述水性介质是注射用水。在特定实施方案中，水性介质是TE缓冲剂。在其他特定实施方案中，水性介质是10％海藻糖溶液。在一些实施方案中，用于溶解沉淀mRNA的水性介质(例如，10mM柠檬酸钠)的选择是因为其与纯化mRNA的包封相容。

在一些实施方案中，沉淀mRNA的溶解发生在过滤离心机内。在一些实施方案中，沉淀mRNA的溶解从过滤离心机的过滤器中回收洗涤的保留的沉淀mRNA。在一些实施方案中，沉淀mRNA的溶解在过滤离心机之外发生，例如溶解从过滤离心机的过滤器回收的沉淀mRNA的组合物。在一些实施方案中，溶解步骤可以包括在从过滤离心机的过滤器回收沉淀mRNA的组合物的步骤之后，溶解保留在过滤离心机的过滤器上的残留mRNA的步骤。以这种方式，可以回收最大量的保留的mRNA。

收集纯化mRNA

在一些实施方案中，从水溶液中收集溶解的mRNA以提供基本上不含任何污染物(例如，助滤剂)的纯化mRNA。在一些实施方案中，所溶解的mRNA的收集包括一个或多个将所述助滤剂与所溶解的mRNA分离的步骤。在一些实施方案中，用于将助滤剂与溶解的mRNA分离的一个或多个步骤包括将包含溶解的mRNA和助滤剂的溶液应用到多孔基质(例如，过滤器)上，其中助滤剂被多孔基质(例如，过滤器)保留，从而产生纯化mRNA的溶液。

在一些实施方案中，所述过滤器的孔径适于捕获杂质(包括尺寸大于孔径的不溶性杂质，例如助滤剂和/或PEG或MTEG沉淀物)，同时使溶解的mRNA通过。在一些实施方案中，过滤器的孔径适于捕获助滤剂(例如，粒度为约20μm或更大的基于纤维素的助滤剂)，同时让溶解的mRNA通过。在一些实施方案中，过滤器的孔径适于捕获PEG或MTEG沉淀物，同时让溶解的mRNA通过。上文提供了示例性过滤器孔径。

在一些实施方案中，通过离心将包含溶解的mRNA和助滤剂的溶液应用到过滤离心机的多孔基质(例如，过滤器)上。在一些实施方案中，使溶解的mRNA通过过滤器，同时助滤剂被过滤器保留，从而提供基本上不含污染物的纯化mRNA。在一些实施方案中，使溶解的mRNA通过过滤器，并且将其经由过滤离心机的一个或多个样品排出口收集。在一些实施方案中，在收集纯化mRNA的步骤中使用的过滤器与用于保留、洗涤和回收沉淀mRNA的步骤的过滤器是相同的过滤器。在一些实施方案中，与用于保留、洗涤和回收沉淀mRNA的步骤的过滤器相比，在收集纯化mRNA的步骤中使用的过滤器是新的过滤器。在一些实施方案中，根据本发明方法的相关步骤所需的孔径来选择过滤器，例如具有适于捕获沉淀mRNA或让溶解的mRNA通过的孔径。因此，本发明的方法可能需要用于保留、洗涤和回收沉淀mRNA的步骤的第一过滤器和用于收集纯化mRNA的步骤的第二过滤器。

在一些实施方案中，收集步骤期间的离心机速度施加小于3100g的重力(g)。在一些实施方案中，收集步骤期间的离心机速度施加在约1000g与约3000g之间的重力(g)。在一些实施方案中，收集步骤期间的离心机速度施加与保留沉淀mRNA和/或洗涤保留的沉淀mRNA的步骤中使用的重力等效的重力(g)。在一些实施方案中，在收集步骤期间，过滤离心机以与本发明纯化方法的加载步骤(b)和洗涤步骤(c)期间使用的离心机速度相同的离心机速度运行。

在一些实施方案中，以适用于药物组合物的形式(例如，具有临床级纯度)收集溶解的mRNA。

纯化方法中的任选步骤

本文所述的方法可以由本领域普通技术人员容易地修改。本文描述了示例性修改，包括另外的示例性步骤。

在一些实施方案中，本发明的方法进一步包括进一步纯化(例如，透析、渗滤和/或超滤)纯化mRNA溶液的步骤。在一些实施方案中，使用100kDa截留分子量(MWCO)膜将纯化mRNA溶液用1mM柠檬酸钠透析。

在一些实施方案中，本发明的方法可以在合成期间或之后进行。在一些实施方案中，如本文所述的纯化步骤可以在mRNA合成的每个步骤之后，任选地连同其他纯化过程(诸如透析、渗滤和/或超滤；例如，使用切向流过滤(TFF))进行。例如，mRNA可以在初始合成后(例如，有或没有尾)经历进一步纯化(例如，透析、渗滤和/或超滤)以去除短体，然后使其经受如本文所述的沉淀和纯化，然后在添加帽和/或尾后，将其通过沉淀和纯化再次纯化。在实施方案中，进一步的纯化包括使用切向流过滤(TFF)。

在一些实施方案中，本发明的方法可以包括将纯化mRNA包封在脂质体中的其他步骤。在一些实施方案中，此步骤可能需要纯化mRNA的进一步浓缩和/或纯化。在一些实施方案中，将纯化mRNA包封在脂质体中的其他步骤可以在本发明方法的溶解和收集步骤之后立即进行，因为纯化mRNA可以溶解在与包封相容的水性介质中。

用于与本发明方法一起使用的系统和方法

本发明还提供了一种用于纯化mRNA的系统，其中所述系统包括：a)用于接收沉淀mRNA的第一器皿；b)用于接收洗涤缓冲剂的第二器皿；c)用于接收洗涤的沉淀mRNA和/或用于使沉淀mRNA溶解的水性介质的第三器皿；d)过滤离心机，所述过滤离心机包括：

ii)样品进料口；和

iii)样品排出口；

e)用于接收纯化mRNA的第四器皿，其中所述器皿与过滤离心机的样品排出口连接；f)泵，所述泵被配置为以(相对于过滤离心机的过滤器的表面积)约5升/min/m²至约25升/min/m²的速率引导流过所述系统；其中所述第一器皿、所述第二器皿和所述第三器皿与所述泵的输入端可操作连接，并且其中所述过滤离心机的样品进料口与所述泵的输出端连接；以及g)一个或多个阀门，所述一个或多个阀门被配置为阻止从第一、第二和第三器皿的同时流动。

在一些实施方案中，第三和第四器皿是系统的任选组件，例如用于回收保留的沉淀mRNA的组合物(参见图3中的(24))的那些系统。因此，本发明还提供了一种用于纯化mRNA的系统，其中所述系统包括：a)用于接收沉淀mRNA的第一器皿；b)用于接收洗涤缓冲剂的第二器皿；c)过滤离心机，所述过滤离心机包括：

ii)样品进料口；和

iii)样品排出通道；

d)泵，所述泵被配置为以(相对于过滤离心机的过滤器的表面积)约5升/min/m²至约25升/min/m²的速率引导流过所述系统；其中所述第一器皿和第二器皿与所述泵的输入端可操作连接，并且其中所述过滤离心机的样品进料口与所述泵的输出端连接；以及e)一个或多个阀门，所述一个或多个阀门被配置为阻止从所述第一和第二器皿的同时流动。

在一些实施方案中，所述泵被配置为以随过滤离心机的过滤器的表面积(m²)变化而确定的速率引导流过系统。在一些实施方案中，所述泵被配置为以约10升/min/m²至约20升/min/m²的速率引导流过系统。在一些实施方案中，所述泵被配置为以约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25升/min/m²的速率引导流过系统。在特定实施方案中，所述泵被配置为以约15升/min/m²或更低的速率引导流过系统。

所述系统可以使用以下过程操作：在第一器皿中提供包含沉淀mRNA的悬浮液。可以通过如上所述的沉淀步骤来制备沉淀mRNA。沉淀mRNA包含来自制造所述沉淀mRNA(例如，通过使用一个或多个上述合成步骤)的一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物。例如，可以通过体外合成制造mRNA。可替代地，可以使体外合成的mRNA制剂经受如上所述的加帽和/或加尾步骤，以制造加帽和/或加尾mRNA。为了纯化沉淀mRNA，在第二器皿中提供洗涤缓冲剂。将第一器皿中的内容物转移到包括过滤器的过滤离心机中，如图3-图5所示。所述转移可以以约5升/min/m²至约25升/min/m²(相对于过滤离心机的过滤器的表面积)的速率发生，同时使所述过滤离心机以第一离心机速度运行使得所述沉淀mRNA保留在过滤离心机的过滤器上。将第二器皿的内容物转移到过滤离心机中，从而洗涤保留在所述过滤离心机的过滤器上的沉淀mRNA。所述转移可以以约5升/min/m²至约25升/min/m²(相对于过滤离心机的过滤器的表面积)的速率发生，同时使所述过滤离心机保持以第一离心机速度运行，从而用洗涤缓冲剂洗涤沉淀mRNA。一旦完成洗涤步骤，可以从过滤离心机的过滤器中回收洗涤的沉淀mRNA，例如经由过滤离心机的样品排出通道提供沉淀mRNA的组合物(参见图3中的(24))。可以通过泵送进行转移。在一些实施方案中，通过与第一和第二器皿可操作连接的单个泵进行泵送。

在一些实施方案中，所述泵被配置为以约10升/min/m²至约20升/min/m²的速率(相对于过滤离心机的过滤器的表面积)将物质从用于提供包含沉淀mRNA的悬浮液和/或洗涤缓冲剂的一个或多个器皿转移到过滤离心机中。在一些实施方案中，转移速率为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25升/min/m²。在特定实施方案中，转移速率为约15升/min/m²或更小。

在一些实施方案中，在约0.5小时至约8小时之间(例如，在约2小时至约6小时之间)，将总体积的悬浮液和/或洗涤缓冲剂加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，在约少于约8小时、少于约7小时、少于约6小时、少于约5小时、少于约4小时、少于约3小时、少于约2小时、少于约1小时或少于约0.5小时内，将总体积加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，将总体积的悬浮液、洗涤缓冲剂和/或溶解缓冲剂加载到过滤离心机所花费的时间可以取决于所述过滤离心机的转子尺寸(即，转筒直径)，例如，将总体积的1000g沉淀mRNA的悬浮液加载到转子尺寸为约50cm的过滤离心机中可能花费约3小时(参见表D)。在一些实施方案中，例如通过使用转子尺寸(即，转筒直径)为约30cm至约170cm的过滤离心机，在约0.5小时至约4小时之间，将总体积的洗涤缓冲剂加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，在少于约4小时、少于约3小时、少于约2小时、少于约1小时或少于约0.5小时内，将总体积的洗涤缓冲剂加载到过滤离心机中。例如，诸位发明人已经使用转子尺寸为约50cm的过滤离心机使用500升洗涤缓冲剂在约80分钟内(即，以6L/min的洗涤缓冲剂加载速率或15L/min/m²)实现了一批1000g mRNA的杂质去除(参见表D)。

在一些实施方案中，一个或多个阀门控制从第一器皿和第二器皿的转移。在一些实施方案中，经由样品进料口将第一器皿的内容物和第二器皿的内容物转移到过滤离心机中。在一些实施方案中，在从过滤离心机的过滤器上覆盖洗涤的沉淀mRNA之后，将过滤离心机的过滤器用包含1％10N NaOH的注射用水冲洗。

在一些实施方案中，从过滤器中回收洗涤的沉淀mRNA包括以下步骤：使保留的沉淀mRNA溶解以及收集溶解的mRNA。在一些实施方案中，沉淀mRNA包括助滤剂。因此，在一些实施方案中，所述方法进一步包括：i)将包含助滤剂的洗涤的沉淀mRNA(例如，洗涤步骤后从过滤离心机回收的沉淀mRNA的组合物)溶解，例如在第三器皿中，所述第三器皿用于接收洗涤的沉淀mRNA和/或用于溶解沉淀mRNA的水性介质；ii)将来自步骤(i)的溶解的mRNA以约0.1升/min至约5升/min的速率转移到离心机中，其中所述过滤离心机包括保留助滤剂的过滤器；以及iii)通过离心将溶解的纯化mRNA从过滤离心机例如收集到用于接收纯化mRNA的第四器皿中。步骤(ii)中的过滤离心机可以是用于洗涤沉淀的mRNA的相同过滤离心机，或者是不同的过滤离心机。在一些实施方案中，将溶解的mRNA经由样品进料口转移到过滤离心机中。

在一些实施方案中，通过泵送进行步骤(ii)中的转移。在一些实施方案中，所述泵被配置用于将溶解的mRNA以约5升/min/m²至约25升/min/m²(相对于过滤离心机的过滤器的表面积)的速率转移到过滤离心机中。在一些实施方案中，转移速率为约10升/min/m²至约20升/min/m²。在一些实施方案中，转移速率为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25升/min/m²。在特定实施方案中，转移速率为约15升/min/m²或更小。在一些实施方案中，在约1分钟至约90分钟之间，将总体积的溶解的mRNA加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，在少于约90分钟、少于约80分钟、少于约70分钟、少于约60分钟、少于约50分钟、少于约30分钟、少于约20分钟、少于约10分钟、少于约5分钟、少于约4分钟、少于约3分钟、少于约2分钟或少于约1分钟内，将总体积加载到过滤离心机中。

在一些实施方案中，通过泵送将步骤(iii)中收集的溶解的纯化mRNA转移到其他器皿中。在一些实施方案中，泵送是通过与含有溶解的纯化mRNA的器皿和/或用于收集溶解的纯化mRNA的器皿可操作地连接的单个泵进行的。在一些实施方案中，通过过滤离心机的样品排出口进行溶解的纯化mRNA的转移。在一些实施方案中，所述泵被配置用于将从过滤离心机收集的溶解的纯化mRNA以约5升/min/m²至约25升/min/m²(相对于过滤离心机的过滤器的表面积)，例如约15升/min/m²或更低的速率转移到用于收集溶解的纯化mRNA的器皿中。在一些实施方案中，在约1分钟至约90分钟之间，从过滤离心机回收总体积的纯化mRNA。在一些实施方案中，在少于约90分钟、少于约80分钟、少于约70分钟、少于约60分钟、少于约50分钟、少于约30分钟、少于约20分钟、少于约10分钟、少于约5分钟、少于约4分钟、少于约3分钟、少于约2分钟或少于约1分钟内，从过滤离心机回收总体积。

在一些实施方案中，所述方法的步骤(ii)中使用的过滤器是与用于将沉淀mRNA保留在过滤离心机的过滤器上的过滤器相同的过滤器。在一些实施方案中，过滤器可以被重新用于随后的几轮纯化。因此，本发明的方法特别适用于提供高效实现大规模纯化mRNA的高效方法，因为本发明的方法不需要更换过滤器，因为所述方法的步骤(ii)中使用的过滤器(即，用于捕获助滤剂同时让溶解的mRNA通过)是与用于将与助滤剂组合的沉淀mRNA保留在过滤离心机的过滤器上的过滤器相同的过滤器。

在一些实施方案中，本发明的方法不需要更换过滤器，因为沉淀mRNA的悬浮液任选地不包含助滤剂。因此，在沉淀mRNA溶解后，从过滤离心机的过滤器中回收沉淀mRNA的步骤提供纯化mRNA。因此，本发明的方法提供了一种纯化mRNA的更直接方法。此外，本发明的方法能够在不需要更换过滤器的情况下重复进行mRNA纯化周期，因此降低了纯化大规模mRNA的成本和负担。

用于与本发明方法一起使用的示例性系统和方法概述于图3-图5。

用于本文所述方法的合适核酸

mRNA长度

根据各种实施方案，本发明用于纯化各种长度的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化长度为或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb 6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于纯化长度范围为约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb或约8-15kb的体外合成的mRNA。例如，典型的mRNA长度可以为约1kb至约5kb。更典型地，mRNA将具有约1kb至约3kb的长度。然而，在一些实施方案中，本发明组合物中的mRNA要长得多(大于约20kb)。

mRNA修饰

在一些实施方案中，本发明用于纯化含有典型地增强稳定性的一种或多种经修饰的mRNA。在一些实施方案中，一种或多种修饰选自经修饰的核苷酸、经修饰的糖磷酸酯骨架、5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，本发明用于纯化未经修饰的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，mRNA不包含核苷酸修饰。

典型地，对mRNA进行修饰以增强稳定性。mRNA的修饰可以包括，例如，RNA的核苷酸的修饰。因此，根据本发明的经修饰的mRNA可以包括例如骨架修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，编码抗体的mRNA(例如，编码重链和轻链的mRNA)可以从天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)合成，所述天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，例如像1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、辫苷、.β.-D-甘露糖基-辫苷、维布托辛(wybutoxosine)和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。此类类似物的制备是本领域技术人员例如从以下文献中已知的：美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，将所述参考文献的披露内容通过引用以其全部范围包括在此处。

典型地，mRNA合成包括在N末端(5’)添加“帽”并且在C末端(3’)添加“尾”。帽的存在对于提供在大多数真核细胞中发现的对核酸酶的抗性很重要。“尾”的存在用于保护mRNA免于外切核酸酶降解。

因此，在一些实施方案中，使用本文所述方法纯化mRNA包括5’帽结构。典型地如下添加5'帽：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后，经由鸟苷酰基转移酶向末端磷酸中添加鸟苷三磷酸(GTP)，产生5’5’5三磷酸键联；然后，通过甲基转移酶甲基化鸟嘌呤的7-氮。帽结构的例子包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。

虽然在一些实施方案中，由体外转录反应提供的mRNA可能是希望的，但是也可以使用本发明的方法纯化其他来源的mRNA，包括从细菌、真菌、植物和/或动物产生的野生型mRNA。

在一些实施方案中，本文所述的方法中用于纯化的mRNA包括5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，5’非翻译区包含一种或多种影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁反应元件。在一些实施方案中，5’非翻译区可以具有在约50与500个核苷酸之间的长度。

本发明可以用于纯化编码任何蛋白质的mRNA。

回收的mRNA

规模和回收量

本发明提供的一个特别优点是能够以大规模或商业规模纯化mRNA，特别是体外合成的mRNA。例如，在一些实施方案中，以每批为或大于约100毫克、1克、10克、50克、100克、200克、300克、400克、500克、600克、700克、800克、900克、1kg、5kg、10kg、50kg、100kg、1公吨、10公吨或更多的规模纯化体外合成的mRNA。在特定实施方案中，以为或大于约500g的规模纯化体外合成的mRNA。如实施例中所证明的，本发明的方法是可扩大的，以允许纯化至少约500g批量的体外合成的mRNA。特别地，与先前的方法相比，所述方法需要减少体积的洗涤缓冲剂，因此对于那些需要溶剂洗涤的方案需要更少的溶剂，并且还允许更高效且更有成本效益地纯化较大批次的mRNA。

在一些实施方案中，纯化mRNA的规模取决于过滤离心机的转筒的尺寸。例如，转筒直径为30cm并且深度为15cm的过滤离心机可以容纳最大载量为约4kg的沉淀mRNA(任选地包括助滤剂)。在一些实施方案中，转筒直径为50cm并且深度为25cm的过滤离心机(例如，Rousselet Robatel EHBL 503)可以容纳最大载量为约30kg的沉淀mRNA(任选地包括助滤剂)。在一些实施方案中，转筒直径为63cm并且深度为31.5cm的过滤离心机(例如，Rousselet Robatel EHBL 633)可以容纳最大载量为约50kg的沉淀mRNA(任选地包括助滤剂)。在一些实施方案中，转筒直径为81cm并且深度为35cm的过滤离心机(例如，RousseletRobatel EHBL 813)可以容纳最大载量为约120kg的沉淀mRNA(任选地包括助滤剂)。在一些实施方案中，转筒直径为105cm并且深度为61cm的过滤离心机(例如，Rousselet RobatelEHBL 1053)可以容纳最大载量为约275kg的沉淀mRNA(任选地包括助滤剂)。在一些实施方案中，转筒直径为115cm并且深度为61cm的过滤离心机(例如，Rousselet Robatel EHBL1153)可以容纳最大载量为约410kg的沉淀mRNA(任选地包括助滤剂)。在一些实施方案中，转筒直径为132cm并且深度为72cm的过滤离心机(例如，Rousselet Robatel EHBL 1323)可以容纳最大载量为约550kg的沉淀mRNA(任选地包括助滤剂)。

在一个特定实施方案中，以每批10克的规模纯化体外合成的mRNA。在一个特定实施方案中，以每批20克的规模纯化体外合成的mRNA。在一个特定实施方案中，以每批25克的规模纯化体外合成的mRNA。在一个特定实施方案中，以每批50克的规模纯化体外合成的mRNA。在另一个特定实施方案中，以每批100克的规模纯化体外合成的mRNA。在又另一个特定实施方案中，以每批1kg的规模纯化体外合成的mRNA。在又另一个特定实施方案中，以每批10kg的规模纯化体外合成的mRNA。在又另一个特定实施方案中，以每批100kg的规模纯化体外合成的mRNA。在又另一个特定实施方案中，以每批1,000kg的规模纯化体外合成的mRNA。在又另一个特定实施方案中，以每批10,000kg的规模纯化体外合成的mRNA。

在一些实施方案中，以为或大于每批1克、5克、10克、15克、20克、25克、30克、35克、40克、45克、50克、75克、100克、150克、200克、250克、300克、350克、400克、450克、500克、550克、600克、650克、700克、750克、800克、850克、900克、950克、1kg、2.5kg、5kg、7.5kg、10kg、25kg、50kg、75kg、100kg或更多的规模纯化mRNA。

在一些实施方案中，包含纯化mRNA的溶液包含至少一克、十克、一百克、一千克、十千克、一百千克、一公吨、十公吨或更多或其之间的任何量的mRNA。在一些实施方案中，本文所述的方法用于纯化至少约250mg mRNA的量的mRNA。在一个实施方案中，本文所述的方法用于纯化至少约250mg mRNA、约500mg mRNA、约750mg mRNA、约1000mg mRNA、约1500mgmRNA、约2000mg mRNA或约2500mg mRNA的量的mRNA。在实施方案中，本文所述的方法用于纯化至少约250mg mRNA至约500gmRNA的量的mRNA。在实施方案中，本文所述的方法用于纯化至少约500mg mRNA至约250g mRNA、约500mg mRNA至约100g mRNA、约500mg mRNA至约50gmRNA、约500mg mRNA至约25g mRNA、约500mg mRNA至约10g mRNA或约500mg mRNA至约5gmRNA的量的mRNA。在实施方案中，本文所述的方法用于纯化至少约100mg mRNA至约10gmRNA、约100mg mRNA至约5g mRNA或约100mg mRNA至约1gmRNA的量的mRNA。

在一些实施方案中，本文所述的方法提供了至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％的回收量(或“产率”)的纯化mRNA。因此，在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约40％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约45％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约50％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约55％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约60％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约65％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约70％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约75％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约75％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约80％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约85％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约90％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约91％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约92％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约93％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约94％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约95％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约96％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约97％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约98％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约99％。在一些实施方案中，纯化mRNA的回收量为约100％。

在一些实施方案中，以导致产率为约80％至约100％的量回收总纯化mRNA。在一些实施方案中，以导致产率为约90％至约99％的量回收总纯化mRNA。在一些实施方案中，以导致产率为至少约90％的量回收总纯化mRNA。在特定实施方案中，纯化mRNA的回收量大于约80％或大于约90％，例如在约90％与100％之间。在特定实施方案中，纯化mRNA的回收量大于约95％。

纯化mRNA的表征

本文提供的mRNA组合物导致基本上不含污染物的纯化mRNA组合物，所述污染物包含短流产性RNA种类、长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留体外转录酶、残留溶剂和/或残留盐。如例子所证明和上文所概述的，与先前的方法相比，本发明的方法使用减少体积的洗涤缓冲剂和更快且更直接的纯化方案来实现纯化mRNA的显著回收。

在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约60％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约65％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约70％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约75％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约80％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约85％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约90％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约91％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约92％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约93％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约94％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约95％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约96％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约97％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约98％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约99％。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度为约100％。在特定实施方案中，所述纯化mRNA的纯度大于99％，例如99.9％。

在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度在约60％与约100％之间。在一些实施方案中，所述纯化mRNA的纯度在约80％与99％之间。在特定实施方案中，所述纯化mRNA的纯度在约90％与约99％之间。

如上文所概述的，本发明的方法为获得大量具有临床级纯度的纯化mRNA提供了更快且更直接的程序。特别地，所述方法需要减少体积的洗涤缓冲剂以实现显著纯度和高产率的纯化mRNA。在一些实施方案中，在约0.5小时至约4小时之间，将所保留的沉淀mRNA洗涤至在约50％至约100％之间的纯度。在一些实施方案中，使用特定体积的洗涤缓冲剂实现从保留的沉淀mRNA中去除杂质所花费的时间可以取决于所述过滤离心机的转子尺寸(即，转筒直径)，并且因此取决于沉淀mRNA的批量大小和所需洗涤缓冲溶液的体积(参见表D)。在一些实施方案中，在少于约4小时、少于约3小时、少于约2小时、少于约1小时或少于约0.5小时内，将保留的沉淀mRNA洗涤至至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或约100％的纯度。在一些实施方案中，在小于约90分钟内，将保留的沉淀mRNA洗涤至大于约95％(例如，99％)的纯度。例如，诸位发明人已经使用转子尺寸为约50cm的过滤离心机使用500升洗涤缓冲剂在约80分钟内(即，以6L/min的洗涤缓冲剂加载速率或15L/min/m²)实现了一批1000g mRNA的杂质去除(参见表D)。因此，本发明的方法特别适用于放大纯化mRNA，以适应用于商业和治疗用途的大批量。

在一些实施方案中，使用本发明方法纯化的mRNA基本上不含一种或多种污染物，例如一种或更多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物。在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物包括IVT mRNA合成中使用的酶试剂。在一些实施方案中，所述酶试剂包括聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和加帽酶。在一些实施方案中，所述方法还去除了长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留溶剂和/或残留盐。在一些实施方案中，所述短流产性转录物污染物包含小于15个碱基。在一些实施方案中，所述短流产性转录物污染物包含约8-12个碱基。在一些实施方案中，所述方法还去除了RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，所述纯化mRNA在不经进一步纯化的情况下具有临床级纯度。

在一些实施方案中，由本文公开的方法产生的mRNA具有小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％和/或小于0.1％的除了全长mRNA外的杂质。所述杂质包括IVT污染物，例如，蛋白质、酶、DNA模板、游离核苷酸、残留溶剂、残留盐、双链RNA(dsRNA)、过早流产的RNA序列(“短体”或“短流产性RNA种类”)和/或长流产性RNA种类。在一些实施方案中，纯化mRNA基本上不含过程酶。

在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约1pg/mg、小于约2pg/mg、小于约3pg/mg、小于约4pg/mg、小于约5pg/mg、小于约6pg/mg、小于约7pg/mg、小于约8pg/mg、小于约9pg/mg、小于约10pg/mg、小于约11pg/mg或小于约12pg/mg。因此，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约1pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约2pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约3pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约4pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约5pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约6pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约7pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约8pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约9pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约10pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约11pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述纯化方法的纯化mRNA中的残留质粒DNA小于约12pg/mg。

在一些实施方案中，本发明去除或消除了高程度的过早流产的RNA序列(也称为“短体”)。在一些实施方案中，根据本发明的方法去除超过约90％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上全部过早流产的RNA序列。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA基本上不含过早流产的RNA序列。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA含有小于约5％(例如，小于约4％、3％、2％或1％)的过早流产的RNA序列。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA含有小于约1％(例如，小于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的过早流产的RNA序列。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA含有无法检测的过早流产的RNA序列，如通过例如以下所确定：高效液相色谱(HPLC)(例如，肩峰或单独峰)、溴乙锭、考马斯染色、毛细管电泳或乙二醛凝胶电泳(例如，单独较低区带的存在)。如本文所用，术语“短体”、“短流产性RNA种类”、“过早流产的RNA序列”或“长流产性RNA种类”是指小于全长的任何转录物。在一些实施方案中，“短体”、“短流产性RNA种类”或“过早流产的RNA序列”的长度小于100个核苷酸，长度小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20或小于10个核苷酸。在一些实施方案中，在添加5’-帽和/或3’-聚A尾之后对短体进行检测或定量。在一些实施方案中，过早流产的RNA转录物包含小于15个碱基(例如，小于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个碱基)。在一些实施方案中，过早流产的RNA转录物含有约8-15、8-14、8-13、8-12、8-11或8-10个碱基。

在一些实施方案中，根据本发明的方法去除或消除了高程度的用于体外合成中的酶试剂，包括但不限于T7 RNA聚合酶、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，本发明对于去除T7 RNA聚合酶是特别有效的。在一些实施方案中，根据本发明的方法去除超过约90％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上全部的用于体外合成中的酶试剂，包括。在一些实施方案中，根据本发明纯化mRNA基本上不含用于体外合成中的酶试剂，包括。在一些实施方案中，根据本发明纯化mRNA含有小于约5％(例如，小于约4％、3％、2％或1％)的用于体外合成中的酶试剂，包括。在一些实施方案中，根据本发明纯化mRNA含有小于约1％(例如，小于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的用于体外合成中的酶试剂，包括。在一些实施方案中，根据本发明纯化mRNA含有无法检测的用于体外合成中的酶试剂，包括，如通过例如以下所确定：银染色、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)和/或毛细管电泳、溴乙锭和/或考马斯染色。

在各种实施方案中，使用本文所述方法纯化的mRNA维持高完整性程度。如本文所用，术语“mRNA完整性”通常是指mRNA在纯化后的质量。mRNA完整性可以使用本领域中熟知的方法来确定，例如，通过RNA琼脂糖凝胶电泳。在一些实施方案中，mRNA完整性可以通过RNA琼脂糖凝胶电泳的带型来确定。在一些实施方案中，与RNA琼脂糖凝胶电泳的参考取代相比，根据本发明纯化的mRNA显示出很少或没有显带。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA的完整性大于约80％、约85％或约90％。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA的完整性大于约95％(例如，大于约96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA的完整性大于98％。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA的完整性大于99％。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA的完整性为大约100％。在一些实施方案中，本文所述的方法提供了一种组合物，所述组合物相对于具有较低百分比的全长mRNA分子的组合物具有增加的活性，例如至少两倍、三倍、四倍、五倍或更多的翻译多肽。在一些实施方案中，可以通过确定HPLC色谱图的主产物峰(相对于全长mRNA)的曲线下面积％来评估完整性百分比。

在一些实施方案中，本发明的方法包括表征纯化mRNA的其他步骤。在一些实施方案中，表征纯化mRNA的其他步骤包括评估纯化mRNA的以下特征中的一个或多个：外观、身份、量、浓度、杂质的存在、微生物评估、pH水平和活性。在一些实施方案中，可接受的外观包括基本上不含可见微粒的透明无色溶液。在一些实施方案中，通过测序方法来评估mRNA的身份。在一些实施方案中，通过合适的方法(诸如UV分光光度法)来评估浓度。在一些实施方案中，合适的浓度在约90％与110％标称值之间(0.9-1.1mg/mL)。

在一些实施方案中，表征纯化mRNA的其他步骤包括mRNA完整性的评估、残留质粒DNA的评估以及残留溶剂的评估。在一些实施方案中，用于评估mRNA完整性的其他步骤包括琼脂糖凝胶电泳。分析凝胶以确定带型和表观核苷酸长度是否与分析参考标准一致。在一些实施方案中，将阳性对照用作来自琼脂糖凝胶电泳的银染色的比较物，以确定mRNA的纯度％。在一些实施方案中，其他步骤包括评估RNA完整性，包括例如使用毛细管凝胶电泳(CGE)对纯化mRNA的评估。在一些实施方案中，可接受的如通过CGE确定的纯化mRNA的纯度是，纯化mRNA组合物具有不大于约55％的长流产性/降解种类。在一些实施方案中，其他步骤包括通过本领域中的方法(例如，通过使用qPCR)来评估残留质粒DNA。在一些实施方案中，小于10pg/mg(例如，小于10pg/mg、小于9pg/mg、小于8pg/mg、小于7pg/mg、小于6pg/mg、小于5pg/mg、小于4pg/mg、小于3pg/mg、小于2pg/mg或小于1pg/mg)是可接受的残留质粒DNA水平。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过10,000ppm、9,000ppm、8,000ppm、7,000ppm、6,000ppm、5,000ppm、4,000ppm、3,000ppm、2,000ppm、1,000ppm。因此，在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过10,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过9,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过8,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过7,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过6,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过5,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过4,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过3,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过2,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过1,000ppm。

在一些实施方案中，其他步骤包括对纯化mRNA进行微生物测试，其包括例如对细菌内毒素的评估。在一些实施方案中，细菌内毒素为<0.5EU/mL、<0.4EU/mL、<0.3EU/mL、<0.2EU/mL或<0.1EU/mL。因此，在一些实施方案中，纯化mRNA中的细菌内毒素为<0.5EU/mL。在一些实施方案中，纯化mRNA中的细菌内毒素为<0.4EU/mL。在一些实施方案中，纯化mRNA中的细菌内毒素为<0.3EU/mL。在一些实施方案中，纯化mRNA中的细菌内毒素为<0.2EU/mL。在一些实施方案中，纯化mRNA中的细菌内毒素为<0.2EU/mL。在一些实施方案中，纯化mRNA中的细菌内毒素为<0.1EU/mL。在一些实施方案中，纯化mRNA具有不超过1CFU/10mL、1CFU/25mL、1CFU/50mL、1CFU/75mL或不超过1CFU/100mL。因此，在一些实施方案中，纯化mRNA具有不超过1CFU/10mL。在一些实施方案中，纯化mRNA具有不超过1CFU/25mL。在一些实施方案中，纯化mRNA具有不超过1CFU/50mL。在一些实施方案中，纯化mRNA具有不超过1CFR/75mL。在一些实施方案中，纯化mRNA具有1CFU/100mL。

在一些实施方案中，其他步骤包括评估纯化mRNA的pH。在一些实施方案中，纯化mRNA的可接受pH在5与8之间。因此，在一些实施方案中，纯化mRNA的pH为约5。在一些实施方案中，纯化mRNA的pH为约6。在一些实施方案中，纯化mRNA的pH为约7。在一些实施方案中，纯化mRNA的pH为约7。在一些实施方案中，纯化mRNA的pH为约8。

在一些实施方案中，其他步骤包括评估纯化mRNA的翻译保真度。翻译保真度可以通过多种方法来评估并且包括例如转染和蛋白质印迹分析。纯化mRNA的可接受的特征包括蛋白质印迹上在与参考标准类似的分子量处移行的带型。

在一些实施方案中其他步骤包括评估纯化mRNA的电导率。在一些实施方案中，纯化mRNA的可接受特征包括在参考标准的约50％与150％之间的传导率。

在一些实施方案中，其他步骤包括评估纯化mRNA的帽百分比和聚A尾长度。在一些实施方案中，可接受的帽百分比包括帽1，面积％：NLT90。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约100-1500个核苷酸(例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、和1000、1100、1200、1300、1400或1500个核苷酸)。因此，在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约100个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约200个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约250个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约300个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约350个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约400个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约450个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约500个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约550个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约600个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约650个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约700个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约750个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约800个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约850个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约900个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约950个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1000个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1100个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1200个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1300个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1400个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1500个核苷酸。

在一些实施方案中，其他步骤包括例如使用超高效液相色谱(UPLC)和/或质谱(MS)分析，评估纯化mRNA的任何残留PEG。在一些实施方案中，纯化mRNA具有小于10ng PEG/mg纯化mRNA与1000ng PEG/mg mRNA之间。因此，在一些实施方案中，纯化mRNA具有小于约10ng PEG/mg纯化mRNA。在一些实施方案中，纯化mRNA具有小于约100ng PEG/mg纯化mRNA。在一些实施方案中，纯化mRNA具有小于约250ng PEG/mg纯化mRNA。在一些实施方案中，纯化mRNA具有小于约500ng PEG/mg纯化mRNA。在一些实施方案中，纯化mRNA具有小于约750ngPEG/mg纯化mRNA。在一些实施方案中，纯化mRNA具有小于约1000ng PEG/mg纯化mRNA。

对mRNA纯度进行检测和定量的多种方法是本领域中已知的。例如，此类方法包括印迹、毛细管电泳、色谱、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染色、光谱法、紫外线(UV)或UPLC或其组合。在一些实施方案中，在凝胶电泳(“乙二醛凝胶电泳”)之前首先通过乙二醛染料使mRNA变性。在一些实施方案中，本发明的方法包括在加帽或加尾之前表征合成mRNA的其他步骤。在一些实施方案中，本发明的方法包括在加帽和加尾之后表征合成mRNA的其他步骤。

在一些实施方案中，其他步骤包括通过毛细管电泳确定纯化mRNA中的蛋白质污染物的％。在一些实施方案中，如通过毛细管电泳确定的，所述纯化mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的蛋白质污染物或者基本上不含蛋白质污染物。在一些实施方案中，其他步骤包括通过高效液相色谱(HPLC)确定纯化mRNA中的盐污染物的％。在一些实施方案中，通过HPLC确定，所述纯化mRNA包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的盐污染物或者基本上不含盐污染物。在一些实施方案中，其他步骤包括通过HPLC确定的纯化mRNA中的短流产性转录物污染物的％。在一些实施方案中，通过HPLC确定，纯化mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的短流产性转录物污染物或者基本上不含短流产性转录物污染物。在一些实施方案中，其他步骤包括通过毛细管电泳确定的纯化mRNA的完整性％。在一些实施方案中，如通过毛细管电泳确定的，所述纯化mRNA的完整性为95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或者99％或更多。

在特定实施方案中，在不进行选自以下的进一步纯化的情况下实现所述临床级纯度：高效液相色谱(HPLC)纯化、基于配体或结合的纯化、切向流过滤(TFF)纯化和/或离子交换色谱。

药物组合物和治疗方法

药物组合物

本发明提供了生产富含长度大于500个核苷酸并且编码目的肽或多肽的全长mRNA分子的组合物的方法。

本发明提供了通过本发明的任何方法制备的纯化mRNA。本发明还提供了包含通过本发明的任何方法制备的纯化mRNA的溶液。

本发明还提供了通过本发明的任何方法产生的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含通过本发明的任何方法获得的纯化mRNA。在一些实施方案中，本发明的组合物是呈水溶液形式的纯化mRNA。在一些实施方案中，本发明的组合物是通过溶解并且收集沉淀mRNA获得的。在一些实施方案中，本发明的组合物是通过将溶解的mRNA与助滤剂分离(例如，使用过滤离心机)并且收集纯化mRNA获得的。在一些实施方案中，将沉淀mRNA溶解在与并入药物组合物相容的水性介质中。

因此，在一些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂(例如，包含本发明纯化mRNA组合物和至少一种医学上可接受的赋形剂的药物组合物)。

本发明还提供了用于生产富含编码目的肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者，例如，人类受试者或者人类受试者的细胞或者被处理并且递送至人类受试者的细胞。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肺或肺细胞。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码囊性纤维化跨膜传导调节(CFTR)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码ATP结合盒亚家族A成员3蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码动力蛋白轴丝中间链1蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码动力蛋白轴丝重链5(DNAH5)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码α-1-抗胰蛋白酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码叉头框P3(FOXP3)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码一种或多种表面活性蛋白(例如，表面活性A蛋白、表面活性B蛋白、表面活性C蛋白和表面活性剂D蛋白中的一种或更多种)的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于递送至或治疗受试者的肝或肝细胞。此类肽和多肽可以包括与尿素循环障碍相关、与溶酶体贮积障碍相关、与糖原储存障碍相关、与氨基酸代谢障碍相关、与脂质代谢或纤维化障碍相关、与甲基丙二酸血症相关、或与任何其他代谢障碍相关的那些，将富含的全长mRNA递送至肝或肝细胞或用其治疗肝或肝细胞提供了治疗益处。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码与尿素循环障碍相关的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码精氨酰琥珀酸合成酶1蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码氨甲酰磷酸合成酶I蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码精氨酰琥珀酸裂解酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码精氨酸酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码与溶酶体贮积障碍相关的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码α半乳糖苷酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码葡糖脑苷脂酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码艾杜糖醛酸酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码乙酰肝素N-硫酸酯酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码半乳糖胺-6硫酸酯酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码β-半乳糖苷酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码溶酶体脂肪酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码芳基硫酸酯酶B(N-乙酰基半乳糖胺-4-硫酸酶)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码转录因子EB(TFEB)的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码与糖原贮积障碍相关的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码酸性α-葡糖苷酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码肝糖原磷酸化酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码肌磷酸甘油酸变位酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码糖原脱支酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码与氨基酸代谢相关的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码苯丙氨酸羟化酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码戊二酰-CoA脱氢酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码丙酰-CoA羧化酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码草酸酶丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码与脂质代谢或纤维化障碍相关的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码mTOR抑制剂的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码ATP酶磷脂转运8B1(ATP8B1)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码一种或多种NF-κB抑制剂(诸如I-κBα、干扰素相关发育调节剂1(IFRD1)和瑟土因1(SIRT1)中的一种或多种)的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码PPAR-γ蛋白或活性变体的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码与甲基丙二酸血症相关的蛋白质的全长mRNA的治疗组合物的方法。例如，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码甲基丙二酰CoA变位酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码甲基丙二酰CoA差向异构酶蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于产生富含全长mRNA的药物组合物的方法，所述药物组合物递送至或治疗肝可以提供治疗益处。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码ATP7B蛋白(也称为威尔逊病蛋白(Wilson disease protein))的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码胆色素原脱氨酶的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码一种或凝结酶(诸如因子VIII、因子IX、因子VII和因子X)的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码人血色素沉着病(HFE)蛋白的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码肽或多肽的全长mRNA的治疗组合物的方法，所述治疗组合物用于为受试者或受试者的细胞递送疫苗或者用疫苗治疗受试者或处理受试者的细胞。例如，在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自感染原(诸如细菌或病毒)的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自伯氏疏螺旋体(导致莱姆病的细菌)的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自流感病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自呼吸道合胞病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自狂犬病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自巨细胞病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自轮状病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自SARS-CoV-2病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自肝炎病毒(诸如甲肝病毒、乙肝病毒或丙肝病毒)的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自人乳头瘤病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自单纯疱疹病毒(诸如单纯疱疹病毒1或单纯疱疹病毒2)的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自人类免疫缺陷病毒(诸如人类免疫缺陷病毒1型或人类免疫缺陷病毒2型)的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自人偏肺病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自人副流感病毒(诸如人副流感病毒1型、人副流感病毒2型或人副流感病毒3型)的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自疟疾病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自寨卡病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码来自基孔肯亚病毒的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。

在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码与受试者的癌症相关或者从受试者的癌细胞中鉴定出的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码从受试者自身的癌细胞确定的抗原的全长mRNA的治疗组合物，即提供个性化癌症疫苗的方法。在某些实施方案中，本发明提供了一种用于生产富含编码从突变KRAS基因表达的抗原的全长mRNA的治疗组合物的方法。

医学用途和治疗方法

本发明还提供了一种用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的纯化mRNA或药物组合物的步骤。本发明进一步提供了一种用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的药物组合物的步骤。

本发明还提供了本发明的纯化mRNA，用于疗法。本发明还提供了本发明的药物组合物，用于疗法。

实施例

实施例1.mRNA的合成

IVT反应条件

在以下实施例中，除非另有说明，否则mRNA是使用T7聚合酶或SP6聚合酶经由体外转录(IVT)合成的。简言之，在SP6聚合酶IVT反应中，对于每克转录的mRNA，用不含RNA酶的水制备这样的反应，所述反应含有20mg具有RNA聚合酶特异性启动子的线性化双链DNA质粒、SP6 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶、5mM NTP、10mM DTT和反应缓冲剂(10x-250mMTris-HCl(pH 7.5)、20mM亚精胺(spirmidine)、50mM NaCl)，然后将所述反应在37C下孵育60min。然后通过添加DNA酶I和DNA酶I缓冲剂(10x-100mM Tris-HCl、5mM MgCl2和25mMCaCl2，pH 7.6)以促进双链DNA模板的消化来淬灭反应，以准备用于纯化。最终反应体积为204mL。

5’帽

除非另有描述，否则通过包括帽结构作为IVT反应的一部分或者在随后的酶促步骤中，使IVT转录的mRNA在其5’末端加帽。对于作为IVT反应的一部分的加帽，可以将帽类似物作为新生RNA链中的第一个“碱基”掺入。帽类似物可以是帽0、帽1、帽2、m6Am或非天然帽。可替代地，可以在IVT后酶促修饰未加帽且纯化的体外转录(IVT)的mRNA以包括帽，例如通过使用鸟苷酸转移酶添加5’N7-甲基鸟苷酸帽0结构，并且使用2’O-甲基转移酶在倒数第二个核苷酸的2’O位置添加甲基以产生帽1结构，如由Fechter,P.；Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239-1249所述。

3’尾

除非另有描述，否则通过在线性化质粒中包括尾模板(作为IVT反应的一部分将mRNA加尾)或在随后的酶促步骤中使IVT转录的mRNA在其3’末端加尾。对于作为IVT反应的一部分的加尾，将聚T或类似的加尾特征掺入pDNA模板中，使得作为IVT过程的一部分在mRNA上形成聚A尾或类似的适当尾。可替代地，可以在IVT反应后，例如使用聚A聚合酶，将聚A尾酶促地添加到IVT产生的mRNA的3’末端。

实施例2.纯化mRNA的分析

RNA完整性分析(片段分析仪-毛细管电泳)

使用CE片段分析仪和可商购的RNA检测试剂盒评估RNA完整性和尾长度。对原始数据以及归一化数据集进行了针对完整性的峰谱以及针对尾长度的大小偏移的分析。

mRNA帽种类分析(HPLC/MS)

使用描述于美国专利号9,970,047中的色谱方法对最终纯化mRNA产物中存在的帽种类进行定量。这种方法能够将未加帽的mRNA准确地定量为占总mRNA的百分比。这种方法还可以定量特定帽结构的量(诸如帽G、帽0和帽1的量)，其可以报告为占总mRNA的百分比。

dsRNA检测(J2斑点印迹)

使用先前由Kariko等人,Nucleic Acids Research,2011.39,第21期描述的J2抗dsRNA斑点印迹，测量单独mRNA样品中双链RNA(dsRNA)的存在。简言之，将200ng RNA或25ngdsRNA对照印迹到带超电荷的Nytran上。将印迹干燥，用5％脱脂干乳封闭，然后每个印迹用1μg J2抗体探测。洗涤印迹，用HRP缀合的驴抗小鼠探测，然后再次洗涤。用ECL加蛋白质印迹检测试剂检测印迹并且在膜上捕获图像。如果与缺乏任何dsDNA的对照相比，相应的印迹未显示出明显较深的颜色，则认为包含纯化mRNA的样品基本上不含dsRNA。

实施例3.使用降低的离心机速度经由离心纯化mRNA

此实施例证明了使用过滤离心机纯化沉淀的mRNA可以实现非常高的纯化mRNA回收率。特别地，此实施例出乎意料地证明，与以相同的高离心机速度进行加载和洗涤的方法相比，当以相同的低速进行沉淀mRNA的加载和洗涤时，需要较少的洗涤缓冲剂。

根据如上述实施例1中所述的IVT反应以及加帽和加尾(C/T)反应，使用SP6聚合酶合成mRNA。使用不同批量大小的mRNA进行此实验。通过汇集来自多个IVT合成反应的mRNA来实现最大批量大小(500克)。

在此实施例中，使用以1:2.3:1.7的mRNA:GSCN:100％ EtOH比率的离液盐硫氰酸胍(GSCN(5M GSCN-10mM DTT缓冲剂))和乙醇(EtOH)的组合来沉淀mRNA。将沉淀mRNA悬浮液与助滤剂(Solka Floc)以1:10的mRNA:助滤剂比率混合，并且然后将其作为悬浮液加载到过滤离心机H300P或EHBL503(这取决于通过样品进料口的mRNA批量大小)上。然后通过离心将mRNA悬浮液保留在过滤离心机的过滤器上，并且使其经受用特定体积的80％ EtOH洗涤，然后将纯化mRNA洗脱并且定量。程序条件和回收率％提供于下表B中。

表B.条件和回收率％

表B中的数据证明了在加载和洗涤步骤两者中使用相同的低速同时使用低体积的洗涤缓冲剂可以实现纯化mRNA的高回收率％。表中提供的洗涤缓冲剂的体积表示纯化过程(即，用于在(i)IVT合成步骤和(ii)5’-加帽和3’-加尾步骤之后纯化mRNA)中使用的洗涤缓冲溶液的总体积。因此，为了纯化最大测试批次的mRNA，使用纯化过程的一个周期，在每个制造步骤之后，只需要0.5L/g mRNA的洗涤体积来纯化mRNA。与需要至少4L/g mRNA的总体积的洗涤缓冲剂的深度过滤相比，本发明的方法需要的洗涤缓冲剂的体积减少4倍(即，75％)。即使对较大量沉淀mRNA应用低速离心时，纯化mRNA的质量也是一致的，这表明可以在不损失纯度的情况下放大所述方法以纯化千克量的mRNA。

实施例4.较低速离心即使在较大批量大小的情况下也维持纯化mRNA的完整性和纯度

此实施例证明了即使当使用较低速离心纯化大规模批次的mRNA两次(在IVT以及加帽和加尾(C/T)反应两者之后)时，也可以维持mRNA的完整性和纯度。

如实施例2所述合成和纯化250g批次的OTC mRNA，在IVT和C/T反应后均在过滤离心机上进行纯化。对于纯化过程，根据表B中提供的250g批次的条件运行EHBL503过滤离心机。使用CE涂片分析评估纯化的OTC mRNA的完整性，并且使用银染色分析检测残留的过程酶来评估mRNA纯度。

显著地，在IVT步骤后使用这些较低离心机速度获得的纯化mRNA的完整性为约94％，并且在加帽和加尾步骤后为约91％(其中尾长度为172个核苷酸)。此外，纯化的OTCmRNA的银染色分析显示，没有来自IVT或加帽和加尾(C/T)步骤的污染物。

因此，在纯化方案中较低离心机速度的使用维持了mRNA的完整性和纯度，即使是在较大批量大小的情况下也是如此。因此，使用较低离心机速度的本发明方法可以被放大到适应较大量的mRNA，同时维持纯化mRNA的适用于临床用途的纯度和完整性。

实施例5.较低速离心适用于无乙醇纯化方案

此实施例证明了可以在避免挥发性有机溶剂诸如乙醇的纯化程序中实现在过滤离心机中使用相同低离心机速度加载和洗涤沉淀mRNA(即，在低洗涤缓冲剂使用的情况下良好的mRNA回收率)的优点。

如实施例1中所述，经由IVT合成来合成CFTR mRNA，并且添加5’帽和3’聚A尾。使用GSCN和两亲性聚合物来沉淀mRNA。使用两亲性聚合物(PEG或MTEG)来代替100％乙醇。mRNA、GSCN(5M GSCN-10mM DTT缓冲剂)和PEG或MTEG(100％重量/体积)在沉淀反应中的体积比率为1:2.3:1。以1:10的mRNA:助滤剂质量比率添加纤维素助滤剂。将悬浮液在具有底部安装的叶轮的60L Lee器皿中以60Hz混合。将悬浮液加载到过滤离心机(H300P)中并且用95％PEG或MTEG以如下表C中总结的体积和离心机速度洗涤。用NanoDrop2000分光光度计测量280nm处的吸光度，对最终的mRNA产量进行定量。RNA的回收率％示于表C中。此外，使用CE涂片分析评估纯化mRNA的完整性，并且使用银染色分析检测残留的过程酶来评估mRNA纯度。

使用PEG或MTEG作为沉淀聚合物和洗涤缓冲剂组分导致mRNA的回收率百分比与实施例3中用基于乙醇的纯化方法观察到的回收率百分比相当。在加载和洗涤期间使用低离心机速度，此实施例中测试的纯化方法需要低体积的洗涤缓冲剂，与实施例3中观察到的结果相当。

表C.在较低离心机速度下使用PEG或MTEG的高效mRNA回收

表中提供的洗涤缓冲剂的体积表示纯化过程(即，用于在(i)IVT合成步骤和(ii)5’-加帽和3’-加尾步骤之后纯化mRNA)中使用的洗涤缓冲溶液的总体积。因此，每个纯化周期使用1L/g沉淀mRNA体积的洗涤缓冲剂。在用MTEG的纯化方案中使用降低的离心机速度维持了mRNA的完整性和纯度。mRNA的完整性为约82％，并且所获得的mRNA的纯度为约99.9％。

因此，在使用过滤离心机的纯化方法中使用较低的离心机速度确保了完整性和纯度适用于临床用途的mRNA的高效纯化，并且观察到此结果无论是与使用挥发性有机溶剂还是两亲性聚合物都无关。

实施例6.基于过滤离心机尺寸放大加载和洗涤时间

下表D概述了特定过滤离心机(根据尺寸进行分类(即，转子尺寸或转筒直径))上特定批量大小的沉淀mRNA的预测加载和洗涤时间。基于约15L/min/m²的恒定系统流速、约0.5L/g沉淀mRNA的洗涤体积以及沉淀缓冲剂体积与沉淀mRNA质量的1:1比率来计算所述值。可以根据参数(诸如系统流速)的改变来调整这些值。例如，在过滤离心机的过滤器上，流速可以在含有沉淀mRNA的悬浮液的加载与保留的沉淀mRNA的洗涤之间变化。

表D.基于过滤离心机尺寸放大加载次数和洗涤次数

等效方案和范围

本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明具体实施方案的许多等效方案。本发明的范围并不旨在受限于上文说明，而是如以下权利要求中所述：

Claims

1.一种用于纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括以下步骤：

I.使mRNA从包含来自所述mRNA的制造的一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物的溶液中沉淀，以提供包含沉淀mRNA的悬浮液；

II.将包含所述沉淀mRNA的悬浮液加载到包含过滤器的过滤离心机中，其中所述沉淀mRNA被所述过滤器保留；

III.通过向所述过滤离心机中添加洗涤缓冲剂来洗涤所保留的沉淀mRNA；以及

IV.从所述过滤器中回收所保留的沉淀mRNA；

其中在加载步骤(b)和洗涤步骤(c)期间使所述过滤离心机以施加小于1300g的重力(g)的离心机速度运行。

2.根据权利要求1所述的方法，其中离心机速度施加在约300g与约1300g之间，例如在约400g与约1100g之间的重力(g)。

3.根据权利要求2所述的方法，其中离心机速度施加在约500g与约900g之间，例如在约700g与约900g之间，例如在约750g与850g之间(例如，约800g)的重力(g)。

4.根据权利要求2所述的方法，其中离心机速度施加在约550g与约750g之间，例如在约650g与约750g之间的重力(g)。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在加载步骤(b)和洗涤步骤(c)期间使所述过滤离心机以相同的离心机速度运行。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从所述过滤器中回收所保留的沉淀mRNA包括以下步骤：

i.使所保留的沉淀mRNA溶解；以及

ii.收集所溶解的mRNA。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA的沉淀包括添加一种或多种促进mRNA沉淀的试剂，例如醇、两亲性聚合物、缓冲剂、盐和/或表面活性剂中的一种或多种。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述一种或多种促进所述mRNA沉淀的试剂是：

i.盐，和

ii.醇或两亲性聚合物。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述醇是乙醇。

10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述盐是离液盐。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述盐的最终浓度为2-4M，例如为2.5-3M。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述盐的最终浓度为约2.7M。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所述离液盐是硫氰酸胍鎓(GSCN)。

14.根据权利要求7、8或10-13所述的方法，其中所述两亲性聚合物选自普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、三乙二醇单甲醚(MTEG)或其组合。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述PEG的分子量为约200至约40,000g/mol。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述PEG的分子量为约200-600g/mol、约2000-10000g/mol或约4000-8000g/mol。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述PEG的分子量为约6000g/mol(例如，PEG-6000)。

18.根据权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述PEG的最终浓度为约10％至约100％重量/体积。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述PEG的最终浓度为约50％重量/体积。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述PEG的最终浓度小于25％重量/体积。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述PEG的最终浓度为约5％至20％重量/体积。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述PEG的最终浓度为约10％至15％重量/体积。

23.根据权利要求7、8或10-14所述的方法，其中所述两亲性聚合物是MTEG。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述MTEG的最终浓度为约10％至约100％重量/体积的浓度。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述MTEG的最终浓度为约15％至约45％重量/体积，例如约20％至约40％重量/体积。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述MTEG的最终浓度为约20％、约25％、约30％或约35％重量/体积。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述MTEG的最终浓度为约25％重量/体积。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述悬浮液包含沉淀mRNA、盐和MTEG。

29.根据权利要求26中任一项所述的方法，其中所述盐是硫氰酸胍鎓(GSCN)。

30.根据权利要求1-8和10-29中任一项所述的方法，其中所述悬浮液不含醇，例如乙醇。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包括向包含沉淀mRNA的所述悬浮液中添加至少一种助滤剂。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述沉淀mRNA与所述至少一种助滤剂的质量比为约1:2；约1:5；约1:10或约1:15。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述沉淀mRNA与所述至少一种助滤剂的质量比为约1:10。

34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述助滤剂是分散剂。

35.根据权利要求34所述的方法，其中所述分散剂是灰、粘土、硅藻土、玻璃珠、塑料珠、聚合物、聚合物珠(例如，聚丙烯珠、聚苯乙烯珠)、盐(例如，纤维素盐)、砂和糖中的一种或多种。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述聚合物是天然存在的聚合物，例如纤维素(例如，粉状纤维素纤维)。

37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述悬浮液包含至少100mg、1g、10g、100g、250g、500g、1kg、10kg、100kg、1公吨或10公吨或其之间任何量的mRNA。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述悬浮液包含大于1kg的mRNA。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器包括多孔基质。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述多孔基质是滤布、滤纸、筛网和丝网。

41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器是微滤膜或超滤膜。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤器的平均孔径为约0.5微米或更大、约0.75微米或更大、约1微米或更大、约2微米或更大、约3微米或更大、约4微米或更大或约5微米或更大。

43.根据权利要求42所述的方法，其中所述过滤器的平均孔径为约0.01微米至约200微米、约1微米至约2000微米、约0.2微米至约5微米、或约1微米至约3微米，例如约1微米。

44.根据权利要求40、42和43中任一项所述的方法，其中所述滤布是平均孔径为约1微米的聚丙烯布。

45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约8L/g mRNA之间。

46.根据权利要求45所述的方法，其中用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于2L/g mRNA。

47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约1.5L/g mRNA之间。

48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用于洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积为约0.5L/g mRNA。

49.根据权利要求45-48中任一项所述的方法，其中将所述洗涤缓冲剂以约5升/min/m²至约25升/min/m²(相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积)的速率，例如以约10升/min/m²至约20升/min/m²的速率，例如以约15升/min/m²的速率加载到所述过滤离心机中。

50.根据权利要求49所述的方法，其中在约0.5小时至约4小时之间，例如在小于约90分钟内，将总体积的洗涤缓冲剂加载到所述过滤离心机中。

51.根据权利要求50所述的方法，其中在约0.5小时至约4小时之间，将所保留的沉淀mRNA洗涤至在约50％至约100％之间的纯度。

52.根据权利要求51所述的方法，其中在小于约90分钟内，将所保留的沉淀mRNA洗涤至至少95％，例如约99％的纯度。

53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂包含醇、两亲性聚合物、缓冲剂、盐和/或表面活性剂中的一种或多种。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂包含醇或两亲性聚合物。

55.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂包含乙醇，任选地其中所述乙醇为约80％重量/体积的浓度。

56.根据权利要求53或54所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂包含选自以下的两亲性聚合物：普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、三乙二醇单甲醚(MTEG)或其组合。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述两亲性聚合物是PEG。

58.根据权利要求57所述的方法，其中所述PEG以约10％至约100％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。

59.根据权利要求58所述的方法，其中所述PEG以约50％至约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述PEG以约90％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。

61.根据权利要求57-60中任一项所述的方法，其中所述PEG的分子量为约100至约1,000g/mol。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述PEG的分子量为约200-600g/mol。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述PEG的分子量为约400g/mol(例如，PEG-400)。

64.根据权利要求56所述的方法，其中所述两亲性聚合物是MTEG。

65.根据权利要求64所述的方法，其中所述MTEG以约75％、约80％、约85％、约90％或约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。

66.根据权利要求65所述的方法，其中所述MTEG以约90％重量/体积的浓度或约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。

67.根据权利要求66所述的方法，其中所述MTEG以约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。

68.根据权利要求53、54和56-67中任一项所述的方法，其中所述洗涤缓冲剂不含醇，例如乙醇。

69.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所保留的mRNA的回收是在所述过滤离心机运行时发生的。

70.根据权利要求69所述的方法，其中所保留的mRNA的回收是经由叶片发生的，所述叶片将所保留的沉淀mRNA从所述过滤离心机的过滤器中去除。

71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所保留的mRNA的回收是在所述过滤离心机不运行时发生的。

72.根据权利要求1-6、10-29、31-52和56-71中任一项所述的方法，其中所述方法不含醇，例如乙醇。

73.根据权利要求3-72中任一项所述的方法，其中所保留的mRNA的溶解包括将所述mRNA溶解于水性介质中。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述水性介质包括水、缓冲剂(例如，Tris-EDTA(TE)缓冲剂或柠檬酸钠缓冲剂)、糖溶液(例如，蔗糖或海藻糖溶液)或其组合。

75.根据权利要求74所述的方法，其中所述水性介质是注射用水。

76.根据权利要求74所述的方法，其中所述水性介质是TE缓冲剂。

77.根据权利要求74所述的方法，其中所述水性介质是10％海藻糖溶液。

78.根据权利要求73-77中任一项所述的方法，其中所述溶解发生在所述过滤离心机内。

79.根据权利要求73-77中任一项所述的方法，其中所述溶解发生在所述过滤离心机外。

80.根据权利要求31-79中任一项所述的方法，其中所溶解的mRNA的收集包括一个或多个将所述助滤剂与所溶解的mRNA分离的步骤。

81.根据权利要求80所述的方法，其中所述一个或多个用于将所述助滤剂与所溶解的mRNA分离的步骤包括将包含所溶解的mRNA和助滤剂的溶液应用到过滤器上，其中所述助滤剂被所述过滤器保留，从而产生纯化mRNA的溶液。

82.根据权利要求81所述的方法，其中通过离心将包含所溶解的mRNA和助滤剂的溶液应用到过滤离心机的过滤器上。

83.根据权利要求82所述的方法，其中所述离心机速度施加小于3100g，例如在约1000g与约3000g之间的重力(g)。

84.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤离心机是连续离心机和/或所述过滤离心机是竖直或水平取向的，或者所述离心机是倒置卧式离心机。

85.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述过滤离心机包括样品进料口和/或样品排出口。

86.根据前述权利要求中任一项所述的方法、根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述mRNA悬浮液以约1升/min至约60升/min的速率，例如以约5升/min至约45升/min的速率加载到所述过滤离心机中。

87.根据权利要求86所述的方法，其中在约0.5小时至约8小时之间，例如在约2小时至约6小时之间，将所述总mRNA悬浮液加载到所述过滤离心机中。

88.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA的制造包括所述mRNA的体外转录(IVT)合成。

89.根据权利要求88所述的方法，其中所述mRNA的制造包括所述mRNA的3’-加尾的单独步骤。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述mRNA的3’-加尾的单独步骤进一步包括所述mRNA的5’加帽。

91.根据权利要求88所述的方法，其中所述mRNA的IVT合成包括所述mRNA的5’-加帽和任选地3’-加尾。

92.根据权利要求88-91中任一项所述的方法，其中在所述mRNA的IVT合成之后进行步骤(a)至(d)。

93.根据权利要求92所述的方法，其中用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积小于8L/g mRNA，例如小于6L/g mRNA或小于5L/g mRNA。

94.根据权利要求93所述的方法，其中用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约4L/g mRNA之间。

95.根据权利要求94所述的方法，其中用于在IVT合成后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的体积在约0.5L/g mRNA与约1.5L/g mRNA之间。

96.根据权利要求87-91中任一项所述的方法，其中在所述mRNA的IVT合成后并且再次在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后进行步骤(a)至(d)。

97.根据权利要求96所述的方法，其中用于在IVT合成后和/或在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积小于8L/g mRNA，例如小于6L/gmRNA或小于5L/g mRNA。

98.根据权利要求97所述的方法，其中用于在IVT合成后和/或在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积在约0.5L/g mRNA与约4L/gmRNA之间。

99.根据权利要求98所述的方法，其中用于在IVT合成后和/或在所述mRNA的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mRNA的洗涤缓冲剂的总体积在约0.5L/g mRNA与约1.5L/gmRNA之间，例如约1L/g mRNA。

100.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA的长度为或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb。

101.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA包含一种或多种核苷酸修饰。

102.根据权利要求101所述的方法，其中所述一种或多种核苷酸修饰包括经修饰的糖、经修饰的碱基和/或经修饰的糖磷酸酯骨架。

103.根据权利要求1-100中任一项所述的方法，其中所述mRNA不包含核苷酸修饰。

104.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中纯化mRNA的回收量为每单一批至少10g、20g、50g、100g、250g、500g、1kg、5kg、10kg、50kg或100kg。

105.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以导致产率为至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的量回收总纯化mRNA。

106.根据权利要求105所述的方法，其中以导致产率为约80％至约100％的量回收总纯化mRNA。

107.根据权利要求106所述的方法，其中以导致产率为约90％至约99％的量回收总纯化mRNA。

108.根据权利要求107所述的方法，其中以导致产率为至少约90％的量回收总纯化mRNA。

109.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纯化mRNA的纯度在约60％与约100％之间。

110.根据权利要求109所述的方法，其中所述纯化mRNA的纯度在约80％与99％之间。

111.根据权利要求110所述的方法，其中所述纯化mRNA的纯度在约90％与约99％之间。

112.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纯化mRNA的完整性为至少约80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。

113.根据权利要求112所述的方法，其中所述纯化mRNA的完整性为或大于约95％。

114.根据权利要求113所述的方法，其中所述纯化mRNA的完整性为或大于约98％。

115.根据权利要求114所述的方法，其中所述纯化mRNA的完整性为或大于约99％。

116.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纯化mRNA在不经进一步纯化的情况下具有临床级纯度。

117.根据权利要求116所述的方法，其中如通过毛细管电泳确定的，所述纯化mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的蛋白质污染物或者基本上不含蛋白质污染物。

118.根据权利要求116或117所述的方法，其中通过高效液相色谱(HPLC)确定，所述纯化mRNA包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的盐污染物或者基本上不含盐污染物。16

119.根据权利要求116-118中任一项所述的方法，其中通过高效液相色谱(HPLC)确定，所述纯化mRNA包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的短流产性转录物污染物或者基本上不含短流产性转录物污染物。

120.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如通过毛细管电泳确定的，所述纯化mRNA的完整性为95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多或者99％或更多。

121.根据权利要求116-120中任一项所述的方法，其中在不进行选自以下的进一步纯化的情况下实现所述临床级纯度：高效液相色谱(HPLC)纯化、基于配体或结合的纯化、切向流过滤(TFF)纯化和/或离子交换色谱。

122.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物包括IVT mRNA合成中使用的酶试剂。

123.根据权利要求122所述的方法，其中所述酶试剂包括聚合酶(例如，T7 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和加帽酶。

124.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还去除了长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留溶剂和/或残留盐。

125.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述短流产性转录物污染物包含小于15个碱基。

126.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述短流产性转录物污染物包含约8-12个碱基。

127.根据前述权利要求所述的方法，其中所述方法还去除了RNA酶抑制剂。

128.一种通过根据权利要求1-127中任一项所述的方法获得的纯化mRNA。

129.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求128所述的纯化mRNA。

130.根据权利要求129所述的组合物，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。

131.一种用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据权利要求128所述的纯化mRNA或根据权利要求129或130所述的组合物。

132.根据权利要求128所述的纯化mRNA或根据权利要求129或130所述的组合物，用于疗法。

133.一种用于纯化mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：

I.在第一器皿中提供包含沉淀mRNA的悬浮液，其中所述沉淀mRNA包含来自所述mRNA的制造中的一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物；

II.在第二器皿中提供洗涤缓冲剂；

III.将所述第一器皿的内容物转移到包括过滤器的过滤离心机中，其中所述转移以约5升/min/m²至约25升/min/m²(相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积)的速率发生，同时使所述过滤离心机以第一离心机速度运行使得所述沉淀mRNA保留在所述过滤离心机的过滤器上；

IV.将所述第二器皿的内容物转移到所述过滤离心机中，其中所述转移以约5升/min/m²至约25升/min/m²(相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积)的速率发生，同时使所述过滤离心机保持以所述第一离心机速度运行，从而用所述洗涤缓冲剂洗涤保留在所述过滤离心机的过滤器上的所述沉淀mRNA；以及

V.从所述过滤离心机的过滤器上回收所洗涤的沉淀mRNA。

134.根据权利要求133所述的方法，其中通过泵送进行步骤(III)和(IV)中的转移。

135.根据权利要求134所述的方法，其中通过与所述第一和第二器皿可操作连接的单个泵进行步骤(III)和(IV)中的泵送。

136.根据权利要求135所述的方法，其中一个或多个阀门控制从所述第一器皿和所述第二器皿的转移。

137.根据权利要求133-136中任一项所述的方法，其中经由样品进料口将所述第一器皿的内容物和所述第二器皿的内容物转移到所述过滤离心机中。

138.根据权利要求133所述的方法，其中在步骤(V)之后，将所述过滤离心机的过滤器用包含1％10N NaOH的注射用水冲洗。

139.根据权利要求133-138中任一项所述的方法，其中所述包含沉淀mRNA的悬浮液包含助滤剂。

140.根据权利要求139所述的方法，所述方法进一步包括：

i.使在步骤(V)中回收的包含所述助滤剂的所洗涤的沉淀mRNA溶解；

ii.将来自步骤(i)的溶解的mRNA以相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m²至约25升/min/m²(例如，约15升/min/m²)的速率转移到一个或所述过滤离心机中，其中所述过滤离心机包括用于保留所述助滤剂的过滤器；以及

iii.通过离心从所述过滤离心机收集所溶解的纯化mRNA。

141.根据权利要求140所述的方法，其中通过所述过滤离心机的样品进料口进行所述转移。

142.根据权利要求140或141所述的方法，其中步骤(iii)包括经由所述过滤离心机的样品排出口收集所溶解的纯化mRNA。

143.一种用于纯化mRNA的系统，其中所述系统包括：

I.用于接收沉淀mRNA的第一器皿；

II.用于接收洗涤缓冲剂的第二器皿；

III.第三器皿，所述第三器皿用于接收所洗涤的沉淀mRNA和/或用于使沉淀mRNA溶解的水性介质；

IV.过滤离心机，所述过滤离心机包括：

i.过滤器，其中所述过滤器的布置和尺寸设置为保留沉淀mRNA和/或助滤剂，并且使溶解的mRNA通过；

ii.样品进料口；和

iii.样品排出口；

V.用于接收纯化mRNA的第四器皿，其中所述器皿与所述过滤离心机的样品排出口连接；

VI.泵，所述泵被配置为以相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m²至约25升/min/m²(例如，约15升/min/m²)的速率引导流过所述系统；其中所述第一器皿、所述第二器皿和所述第三器皿与所述泵的输入端可操作连接，并且其中所述过滤离心机的样品进料口与所述泵的输出端连接；以及

VII.一个或多个阀门，所述一个或多个阀门被配置为阻止从所述第一、第二和第三器皿的同时流动。

144.根据权利要求143所述的系统，其中所述第一离心机速度施加小于1300g的重力(g)。

145.根据权利要求144所述的系统，其中所述系统进一步包括数据处理设备，所述数据处理设备包括用于控制所述系统以进行根据权利要求137所述的方法的装置。

146.根据权利要求145所述的系统，其中所述数据处理设备是(a)包括指令的计算机程序，或者(b)包括指令的计算机可读存储介质。

147.一种组合物，所述组合物包含在无菌的不含RNA酶的容器中的相对浓度为约1:1:10的mRNA、两亲性聚合物和助滤剂。

148.根据权利要求147所述的组合物，其中所述组合物包含10g、50g、100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1kg、5kg、10kg、50kg、100kg、1公吨、10公吨或更多的mRNA。

149.根据权利要求147或148所述的组合物，其中所述两亲性聚合物包括分子量为约2000-10000g/mol；4000-8000g/mol或约6000g/mol的PEG(例如，PEG-6000)。

150.根据权利要求147或148所述的组合物，其中所述两亲性聚合物包括MTEG。

151.根据权利要求147-150中任一项所述的组合物，其中所述助滤剂是基于纤维素的。