JP2023544167A - メッセンジャーｒｎａの精製のための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、一部には、より低い重力で作動する濾過遠心分離機を使用したｍＲＮＡの大規模精製のための方法、システムおよびプロセスに関する。本発明は、精製されたｍＲＮＡの組成物およびその使用にも関する。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１０月１日に提出の米国特許仮出願第６３／０８６，０９５号の優先権を主張し、前記特許文献の開示はこれにより参照によって組み入れる。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）治療薬は有望な新しい治療薬であり；例えば、ｍＲＮＡ補充治療薬は従来のタンパク質補充療法の代替物になることができる。ｍＲＮＡ補充治療薬では、特定のタンパク質配列をコードする無傷のｍＲＮＡが標的細胞に送達され、細胞の天然の翻訳機械により無傷のタンパク質に翻訳される。そのような治療薬のためのｍＲＮＡは、一般的に、プラスミドＤＮＡのような鋳型からｍＲＮＡを転写するＲＮＡポリメラーゼのような酵素を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ転写システムを使用して、５’キャップの付加および３’ポリアデニル化と共に合成される、または続いて５’キャップの付加および３’ポリアデニル化がおこる。そのような反応の結果は、完全長ｍＲＮＡおよび種々の望ましくない夾雑物、例えば、タンパク質、塩、バッファー、および非ＲＮＡ核酸を含む組成物であり、これらの夾雑物は典型的には取り除かれて、ｍＲＮＡ補充治療薬中で使用可能である汚れていない均質なｍＲＮＡを提供する。

伝統的に、ｍＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットのような市販のシリカベースのカラム系により、または有機混合液（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）中へのタンパク質抽出およびそれに続くエタノール沈殿によりｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応から精製される。これらの方法は、提供できる汚れていない均質なｍＲＮＡは最大でも５～１０ｍｇなので規模が制限され；したがって、ｍＲＮＡの臨床使用および商業使用の要求に十分ではない。接線流濾過（ＴＦＦ）のような最近の新しい方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応から沈殿したｍＲＮＡを精製するように改変されており；このために精製の規模が大幅に増加した。ｍＲＮＡの大規模精製に適した追加の方法は、ｍＲＮＡ治療薬の臨床展開および商業発展のために有用になることができる。例えば、別の方法は濾過遠心分離を使用する。しかし、これらの方法の多くは、臨床製剤に適した洗浄効率を達成するためには精製方法において大量の洗浄バッファーを必要とする。これら大量の洗浄バッファーは、エタノールを含むことが多く、安全規則に照らしてバッチサイズを制限し、そのために施設に貯蔵することができる引火性溶剤の量が制限される。したがって、こうした既知の方法は、既存の施設を再設計せずにより小規模のバッチサイズでしか用いることができない場合が多い。

したがって、先行技術方法の不都合を避け、治療用途にふさわしいレベルの純度および完全性を有する汚れがなく均質なｍＲＮＡ組成物を生産する費用効果が高い方法およびスケーラブルな方法の必要性が存在する。

本発明は、とりわけ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製する非常に効率的で費用効果がよい方法を提供する。本方法は、不純物を含むＲＮＡ調製物を沈殿させ、濾過遠心分離機を使用してそれを精製することを含む。本発明は、一部には、沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を濾過遠心分離機に投入し、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄することが、以前使用されたものより低い遠心分離速度で実行することができるという意外な発見に基づく。特に、ｍＲＮＡを効果的に洗浄して精製することができることをなお確実にしながら、投入工程をより低い遠心分離速度で実行することができる。濾過遠心分離機に投入するためにより高い遠心分離速度が当技術分野で使用されるので、これは直観に反している。懸濁液中の沈殿したｍＲＮＡがフィルターによって効果的に保持され、生じたケークが除去されることを回避することを確実にするために、より高い速度が必要であると考えられていた。驚くべきことに、本発明者らは、投入および洗浄工程の両方でのより低い遠心分離速度の使用が、精製プロセスの間に必要とされる揮発性有機溶媒（例えば、エタノール）の量を低減することを見出した。実際、本発明の一部の態様では、沈殿したｍＲＮＡの投入および洗浄のためにより低い速度を使用しながら、揮発性有機溶媒（例えば、エタノール）の使用を完全に回避することができる。これらの観察と一致して、本発明の方法は投入および洗浄工程の両方のために同じより低い遠心分離速度を使用することができ、精製プロセスを合理化および自動化し、その両方は以前の方法と比較してスケーラビリティの増加に役立つ。したがって、本発明は、ｍＲＮＡを精製する有効で、信頼できてより安全な方法を提供し、それは既存の製造施設を使用した大規模製造プロセスのために適合させることができ、臨床グレードの完全性および純度を有する、非常に高い収量のｍＲＮＡを提供する。

一態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製するための方法であって、ａ）１つまたはそれ以上のタンパク質および／またはｍＲＮＡの製造に由来する短い不全型の転写夾雑物を含む溶液からｍＲＮＡを沈殿させて、沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を提供する工程と；ｂ）沈殿したｍＲＮＡを保持するフィルターを含む濾過遠心分離機に沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を投入する工程と；ｃ）洗浄バッファーを濾過遠心分離機に加えることによって保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄する工程と；ｄ）保持された沈殿したｍＲＮＡをフィルターから回収する工程とを含み、濾過遠心分離機は投入工程（ｂ）および洗浄工程（ｃ）の間１３００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度で運転される、方法を提供する。

一部の実施形態では、遠心分離速度は約１５０ｇから約１３００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約３００ｇから約１３００ｇの間、例えば約４００ｇから約１１００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約５００ｇから約９００ｇの間、例えば約５５０ｇから約８５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約５５０ｇから約７５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約６５０ｇから約７５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。特定の実施形態では、遠心分離速度は約７００ｇから約９００ｇの間、例えば約７５０ｇから８５０ｇの間（例えば約８００ｇ）の重力（ｇ）を発揮する。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は投入工程（ｂ）および洗浄工程（ｃ）の間同じ遠心分離速度で運転される。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡをフィルターから回収することは、（ｉ）保持された沈殿したｍＲＮＡを可溶化する工程と；（ｉｉ）可溶化されたｍＲＮＡを収集する工程とを含む。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤、例えばアルコール、両親媒性ポリマー、バッファー、塩および／または界面活性剤の１つまたはそれ以上を加えることを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤は：塩、およびアルコールまたは両親媒性ポリマーである。一部の実施形態では、アルコールはエタノールである。一部の実施形態では、塩はカオトロピック塩である。一部の実施形態では、塩は２～４Ｍ、例えば２．５～３Ｍの最終濃度である。特定の実施形態では、塩は約２．７Ｍの最終濃度である。グアニジニウムチオシアネート（ＧＳＣＮ）は、本発明の方法のために特に好適であるカオトロピック塩である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）またはその組合せから選択される。

一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は約２００～約４０，０００ｇ／ｍｏｌである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は約２００～６００ｇ／ｍｏｌ、約２０００～１００００ｇ／ｍｏｌまたは約４０００～８０００ｇ／ｍｏｌである。特定の実施形態では、ＰＥＧの分子量は約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えばＰＥＧ－６０００）である。

一部の実施形態では、ＰＥＧは約１０％～約１００％重量／容量の最終濃度である。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５０％重量／容量の最終濃度である。一部の実施形態では、ＰＥＧは２５％重量／容量未満の最終濃度である。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５％～２０％重量／容量の最終濃度である。特定の実施形態では、ＰＥＧは約１０％～１５％重量／容量の最終濃度である。

一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＭＴＥＧである。一部の実施形態では、ＭＴＥＧは約１０％～約１００％重量／容量の濃度の最終濃度である。一部の実施形態では、ＭＴＥＧは約１５％～約４５％重量／容量、例えば約２０％～約４０％重量／容量の最終濃度である。一部の実施形態では、ＭＴＥＧは約２０％、約２５％、約３０％または約３５％重量／容量の最終濃度である。特定の実施形態では、ＭＴＥＧは約２５％重量／容量の最終濃度である。

一部の実施形態では、懸濁液は沈殿したｍＲＮＡ、塩およびＭＴＥＧを含む。一部の実施形態では、懸濁液中の塩はグアニジニウムチオシアネート（ＧＳＣＮ）である。一部の実施形態では、懸濁液はアルコール、例えばエタノールを含まない。

一部の実施形態では、本発明の方法の工程（ａ）は、少なくとも１つの濾過助剤を、沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液に加えることをさらに含む。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡおよび少なくとも１つの濾過助剤は約１：２；約１：５；約１：１０または約１：１５の質量比である。特定の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡおよび少なくとも１つの濾過助剤は約１：１０の質量比である。一部の実施形態では、濾過助剤は分散剤である。一部の実施形態では、分散剤は灰、粘土、珪藻土、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、ポリマー、ポリマービーズ（例えば、ポリプロピレンビーズ、ポリスチレンビーズ）、塩（例えば、セルロース塩）、砂および糖の１つまたはそれ以上である。特定の実施形態では、ポリマーは天然に存在するポリマー、例えばセルロース（例えば、粉末セルロース繊維）である。

一部の実施形態では、懸濁液は、少なくとも１００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、１ｋｇ、１０ｋｇ、１００ｋｇ、１メートルトンまたは１０メートルトンのｍＲＮＡ、またはその間の任意の量を含む。一部の実施形態では、懸濁液は１ｋｇより多くのｍＲＮＡを含む。

一部の実施形態では、フィルターは多孔性基質を含む。一部の実施形態では、多孔性基質はフィルター布、フィルター紙、スクリーンおよびワイヤメッシュである。一部の実施形態では、フィルターは微量濾過膜または限外濾過膜である。一部の実施形態では、フィルターは約０．５ミクロンもしくはそれ以上、約０．７５ミクロンもしくはそれ以上、約１ミクロンもしくはそれ以上、約２ミクロンもしくはそれ以上、約３ミクロンもしくはそれ以上、約４ミクロンもしくはそれ以上、または約５ミクロンもしくはそれ以上の平均孔径を有する。一部の実施形態では、フィルターは約０．０１ミクロン～約２００ミクロン、約１ミクロン～約２０００ミクロン、約０．２ミクロン～約５ミクロン、または約１ミクロン～約３ミクロン、例えば約１ミクロンの平均孔径を有する。特定の実施形態では、フィルター布は約１ミクロンの平均孔径を有するポリプロピレン布である。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約８Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量はｍＲＮＡ １ｇにつき２Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５Ｌの間、例えばｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌである。特定の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌまたはそれ以下である。

一部の実施形態では、洗浄バッファーは約１リットル／分～約６０リットル／分の速度で、例えば約５リットル／分～約４５リットル／分の速度で濾過遠心分離機に投入される。一部の実施形態では、洗浄バッファーの総容量は、例えば、約３０ｃｍ～約１７０ｃｍのローターサイズ（すなわち、バスケット直径）を有する濾過遠心分離機を使用して、約０．５時間から約４時間の間に濾過遠心分離機に投入される。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡは約０．５時間から約４時間の間に、例えば約９０分未満に、約５０％から約１００％の間の純度まで洗浄される。特定の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡは９０分未満に少なくとも９５％の純度まで洗浄される。一部の実施形態では、洗浄バッファーは、濾過遠心分離機のフィルターの表面積（すなわち、ｍ^２）に依存する速度（例えば約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２、例えば約１５リットル／分／ｍ^２）で濾過遠心分離機に投入される。

一部の実施形態では、洗浄バッファーはアルコール、両親媒性ポリマー、バッファー、塩および／または界面活性剤の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、洗浄バッファーはアルコールまたは両親媒性ポリマーを含む。

一部の実施形態では、洗浄バッファーはエタノールを含む。一部の実施形態では、エタノールは約８０％重量／容量の濃度である。

一部の実施形態では、洗浄バッファーは、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）またはその組合せから選択される両親媒性ポリマーを含む。

一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＰＥＧである。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１０％～約１００％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５０％～約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。特定の実施形態では、ＰＥＧは約９０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は約１００～約１，０００ｇ／ｍｏｌである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は約２００～６００ｇ／ｍｏｌである。一部の実施形態では、ＰＥＧの分子量は約４００ｇ／ｍｏｌ（例えばＰＥＧ－４００）である。

一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＭＴＥＧである。一部の実施形態では、ＭＴＥＧは約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＭＴＥＧは約９０％重量／容量の濃度または約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。特定の実施形態では、ＭＴＥＧは約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。

一部の実施形態では、洗浄バッファーはアルコール、例えばエタノールを含まない。

一部の実施形態では、保持されたｍＲＮＡを回収することは濾過遠心分離機が運転中である間に生じる。一部の実施形態では、保持されたｍＲＮＡを回収することは、保持された沈殿したｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルターから除去する刃を通して生じる。一部の実施形態では、保持されたｍＲＮＡを回収することは濾過遠心分離機が運転中でない間に生じる。

一部の実施形態では、本発明による精製方法はアルコール、例えばエタノールを含まない。

一部の実施形態では、保持されたｍＲＮＡを可溶化することは水性媒体にｍＲＮＡを溶解することを含む。一部の実施形態では、水性媒体は水、バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーまたはクエン酸ナトリウムバッファー）、糖溶液（例えば、スクロースまたはトレハロース溶液）またはその組合せを含む。一部の実施形態では、水性媒体は注射用水である。一部の実施形態では、水性媒体はＴＥバッファーである。一部の実施形態では、水性媒体は１０％トレハロース溶液である。一部の実施形態では、可溶化することは濾過遠心分離機内で生じる。一部の実施形態では、可溶化することは濾過遠心分離機の外側で生じる。

一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡを収集することは、可溶化されたｍＲＮＡから濾過助剤を分離する１つまたはそれ以上の工程を含む。一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡから濾過助剤を分離する１つまたはそれ以上の工程は、可溶化されたｍＲＮＡおよび濾過助剤を含む溶液をフィルターに適用することを含み、濾過助剤はフィルターによって保持され、精製されたｍＲＮＡの溶液をもたらす。特定の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡおよび濾過助剤を含む懸濁液は遠心分離によって濾過遠心分離機のフィルターに適用される。一部の実施形態では、遠心分離は３１００ｇ未満、例えば約１０００ｇから約３０００ｇの間の重力（ｇ）である。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は連続遠心分離機であり、および／または濾過遠心分離機は垂直もしくは水平に配向されるか、または遠心分離機は反転水平遠心分離機である。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は試料供給ポートおよび／または試料排出ポートを含む。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡ懸濁液は約１リットル／分～約６０リットル／分の速度で、例えば約５リットル／分～約４５リットル／分の速度で濾過遠心分離機に投入される。一部の実施形態では、全ｍＲＮＡ懸濁液は、例えば、約３０ｃｍ～約１７０ｃｍのローターサイズ（すなわち、バスケット直径）を有する濾過遠心分離機を使用して、約０．５時間から約８時間の間に濾過遠心分離機に投入される。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡを製造することはｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）合成を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを製造することはｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程はｍＲＮＡの５’キャッピングをさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成はｍＲＮＡの５’－キャッピングおよび場合により３’－テーリングを含む。

特定の実施形態では、本発明の方法の工程（ａ）～（ｄ）は、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後に実行される。一部の実施形態では、ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき８Ｌ未満、例えばｍＲＮＡ １ｇにつき６Ｌ未満またはｍＲＮＡ １ｇにつき５Ｌ未満である。一部の実施形態では、ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約４Ｌの間である。一部の実施形態では、ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５Ｌの間である。

一部の実施形態では、本発明の工程（ａ）～（ｄ）はｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後に、そしてｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程の後に再び実行される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後および／または３’－テーリングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき８Ｌ未満、例えばｍＲＮＡ １ｇにつき６Ｌ未満またはｍＲＮＡ １ｇにつき５Ｌ未満である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後および／または３’－テーリングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約４Ｌの間である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後および／または３’－テーリングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５Ｌの間、例えばｍＲＮＡ １ｇにつき約１Ｌである。特定の実施形態では、ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌである。特定の実施形態では、ｍＲＮＡの３’－テーリングおよび／またはキャッピングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌである。具体的な実施形態では、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後のならびに３’－テーリングおよび／または５’－キャッピングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約１Ｌである。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは長さが約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂであるかまたはそれ以上である。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは１つまたはそれ以上のヌクレオチド修飾を含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のヌクレオチド修飾は修飾された糖、修飾された塩基および／または修飾された糖リン酸骨格を含む。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡはヌクレオチド修飾を含まない。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収は、単一のバッチにつき少なくとも１０ｇ、２０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇまたは１００ｋｇである。一実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収は、単一のバッチにつき少なくとも２５０ｇである。別の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収は、単一のバッチにつき少なくとも５００ｇである。特定の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収は、単一のバッチにつき少なくとも１ｋｇである。一部の実施形態では、全精製ｍＲＮＡは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％の収率をもたらす量で回収される。一部の実施形態では、全精製ｍＲＮＡは、約８０％～約１００％の収率をもたらす量で回収される。一部の実施形態では、全精製ｍＲＮＡは、約９０％～約９９％の収率をもたらす量で回収される。特定の実施形態では、全精製ｍＲＮＡは、少なくとも約９０％の収率をもたらす量で回収される。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は約６０％から約１００％の間である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は約８０％から９９％の間である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は約９０％から約９９％の間である。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の完全性を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９５％またはそれ以上の完全性を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９８％またはそれ以上の完全性を有する。特定の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９９％またはそれ以上の完全性を有する。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡはさらなる精製なしで臨床グレードの純度を有する。一部の実施形態では、臨床グレードの純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、リガンドもしくは結合をベースとした精製、接線流濾過（ＴＦＦ）精製および／またはイオン交換クロマトグラフィーから選択されるさらなる精製なしで達成される。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動によって決定されるように、５％もしくはそれ以下、４％もしくはそれ以下、３％もしくはそれ以下、２％もしくはそれ以下、１％もしくはそれ以下のタンパク質夾雑物を含むか、またはタンパク質夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定される、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の塩夾雑物を含むか、または塩夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定される、５％もしくはそれ以下、４％もしくはそれ以下、３％もしくはそれ以下、２％もしくはそれ以下、１％もしくはそれ以下の短い不全型の転写夾雑物を含むか、または短い不全型の転写夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動によって決定されるように、９５％もしくはそれ以上、９６％もしくはそれ以上、９７％もしくはそれ以上、９８％もしくはそれ以上、または９９％もしくはそれ以上の完全性を有する。

一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のタンパク質および／または短い不全型の転写夾雑物は、ＩＶＴ ｍＲＮＡ合成で使用される酵素試薬を含む。特定の実施形態では、酵素試薬はポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ピロホスファターゼおよびキャッピング酵素を含む。

一部の実施形態では、本発明の方法は、長い不全型のＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ残留溶媒および／または残留塩も除去する。一部の実施形態では、短い不全型の転写夾雑物は１５未満の塩基を含む。一部の実施形態では、短い不全型の転写夾雑物は約８～１２塩基を含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、ＲＮアーゼ阻害剤も除去する。

別の態様では、本発明は、本発明の方法のいずれか１つによって得られる精製されたｍＲＮＡを提供する。

別の態様では、本発明は、本発明の方法のいずれか１つによって得られる精製されたｍＲＮＡを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。

別の態様では、本発明は、疾患または障害を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、本発明の方法のいずれか１つによって得られる精製されたｍＲＮＡまたは精製されたｍＲＮＡを含む組成物を投与することを含む方法を提供する。

別の態様では、本発明は、療法で使用するための、本発明の方法のいずれか１つによって得られる精製されたｍＲＮＡまたは精製されたｍＲＮＡを含む組成物を提供する。

別の態様では、本発明は、ｍＲＮＡを精製するための方法であって：Ｉ）１つまたはそれ以上のタンパク質および／またはｍＲＮＡの製造に由来する短い不全型の転写夾雑物を含む沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を第１の容器で提供する工程と；ＩＩ）第２の容器で洗浄バッファーを提供する工程と；ＩＩＩ）フィルターを含む濾過遠心分離機に第１の容器の内容物を移す工程であって、移すことは、沈殿したｍＲＮＡが前記濾過遠心分離機のフィルターの上で保持されるように、濾過遠心分離機が第１の遠心分離速度で運転中である間に、濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（例えば約１５リットル／分／ｍ^２）の速度で生じる、工程と；ＩＶ）濾過遠心分離機に第２の容器の内容物を移す工程であって、移すことは、濾過遠心分離機が第１の遠心分離速度でそのまま運転中である間に、濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（例えば約１５リットル／分／ｍ^２）の速度で起こり、それによって前記濾過遠心分離機のフィルターの上で保持される沈殿したｍＲＮＡを洗浄バッファーで洗浄する、工程と；Ｖ）洗浄された沈殿したｍＲＮＡを前記濾過遠心分離機のフィルターから回収する工程とを含む方法を提供する。

一部の実施形態では、第１の遠心分離速度は１３００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。

本発明の方法の一部の実施形態では、工程（ＩＩＩ）および（ＩＶ）において移すことはポンピングによる。一部の実施形態では、工程（ＩＩＩ）および（ＩＶ）におけるポンピングは第１および第２の容器に作動可能に連結される単一のポンプによる。

本発明の方法の一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の弁が第１の容器および第２の容器から移すことを制御する。

本発明の方法の一部の実施形態では、第１の容器の内容物および第２の容器の内容物は試料供給ポートを通して濾過遠心分離機に移される。

本発明の方法の一部の実施形態では、工程（Ｖ）の後に濾過遠心分離機のフィルターは１％の１０Ｎ ＮａＯＨを含む注射用水ですすがれる。

本発明の方法の一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液は濾過助剤を含む。

本発明の方法の一部の実施形態では、本方法は、以下をさらに含む：ｉ）工程（Ｖ）で回収された濾過助剤を含む洗浄された沈殿したｍＲＮＡを可溶化すること；ｉｉ）工程（ｉ）からの可溶化されたｍＲＮＡを、濾過助剤を保持するためのフィルターを含む濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（例えば約１５リットル／分／ｍ^２）の速度で濾過遠心分離機または前記濾過遠心分離機に移すこと；およびｉｉｉ）可溶化された精製されたｍＲＮＡを遠心分離によって濾過遠心分離機から収集すること。

本発明の方法の一部の実施形態では、移すことは濾過遠心分離機の試料供給ポートを通して行われる。

本発明の方法の一部の実施形態では、工程（ｉｉｉ）は濾過遠心分離機の試料排出ポートを通して可溶化された精製されたｍＲＮＡを収集することを含む。

さらなる態様では、本発明は、ｍＲＮＡを精製するためのシステムであって：ａ）沈殿したｍＲＮＡを受けるための第１の容器；ｂ）洗浄バッファーを受けるための第２の容器；ｃ）洗浄された沈殿したｍＲＮＡおよび／または沈殿したｍＲＮＡを可溶化するための水性媒体を受けるための第３の容器；ｄ）以下を含む濾過遠心分離機：
ｉ）沈殿したｍＲＮＡおよび／または濾過助剤を保持し、可溶化したｍＲＮＡを通過させるように配置され、寸法を合わせたフィルター；
ｉｉ）試料供給ポート；および
ｉｉｉ）試料排出ポート；
ｅ）濾過遠心分離機の試料排出ポートに連結される、精製されたｍＲＮＡを受けるための第４の容器；ｆ）濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（例えば約１５リットル／分／ｍ^２）の速度でシステムの中を通して流れを導くように構成されるポンプであって、第１の容器、第２の容器および第３の容器はポンプのインプットに作動可能に連結され、濾過遠心分離機の試料供給ポートはポンプのアウトプットに連結される、ポンプ；ならびにｇ）第１、第２および第３の容器からの同時の流れを妨げるように構成される１つまたはそれ以上の弁を含むシステムを提供する。

本発明のシステムの一部の実施形態では、システムは、本発明の方法のいずれかを実行するようにシステムを制御する手段を含むデータ処理装置をさらに含む。一部の実施形態では、データ処理装置は、（ａ）命令を含むコンピュータプログラムまたは（ｂ）命令を含むコンピュータ可読記憶媒体である。

さらなる態様では、本発明は、無菌のＲＮアーゼ不含容器に、１０～１０００ｇのｍＲＮＡ、両親媒性ポリマーおよび濾過助剤を約１：１：１０の相対濃度で含む組成物も提供する。

本発明の組成物の一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは約２０００～１００００ｇ／ｍｏｌ；４０００～８０００ｇ／ｍｏｌまたは約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ（例えばＰＥＧ－６０００）を含む。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＭＴＥＧを含む。一部の実施形態では、濾過助剤はセルロースをベースとしている。

本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定するものでない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願では、「または」の使用は別途指示されない限り「および／または」を意味する。

以下の図は説明のみを目的とし、限定するためではない。

１５ｃｍバスケットを備えたキログラム規模の実験用濾過遠心分離機の写真である。 ３０ｃｍバスケットを備えたキログラム規模の水平濾過ピーラー遠心分離機の写真である。 本発明のまたは本発明の方法またはプロセスにおいて使用するための例示的なシステムの構成要素の配置を示す図である。 本発明の方法またはプロセスの例示的工程の概要を述べるフローチャートである。点線は、プロセスまたは方法での任意選択の工程を表す。 本発明の例示的システムを使用する本発明の例示的方法の工程の概略を述べる模式図である。 図５－１の続き。

定義
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語を先ず下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通じて表明される。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段はっきりと指示しなければ、複数の参照対照を含む。

具体的に述べられているまたは文脈から明白であるということがなければ、本明細書で使用される場合、用語「または」はすべてを含んでいると理解され、「または」と「および」の両方を包含する。

本明細書で使用される用語「例えば」および「すなわち」は、限定を意図せず、例としてのみ使用され、本明細書にはっきりと列挙されている項目のみに言及していると解釈されるべきではない。

用語「またはそれ以上」、「少なくとも」、「より多い」、および同類のもの、例えば、「少なくとも１つ」は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または述べられた値よりも多い、を含むがこれらに限定されないと理解される。中間のいずれかのより大きな数または分数も含まれる。

逆に、用語「以下」はそれぞれ、述べられた値よりも少ない値を含む。例えば、「１００ヌクレオチド以下」は、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、および０ヌクレオチドを含む。中間のいずれかのより小さい数または分数も含まれる。

用語「複数」、「少なくとも２つ」、「２つまたはそれ以上」、「少なくとも２番目」、および同類のものは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００またはそれ以上を含むがこれらに限定されないと理解される。中間のいずれかのより大きな数または分数も含まれる。

おおよそまたは約：本明細書で使用される場合、用語「おおよそ」または「約」は、目的の１つまたはそれ以上の値に提供される場合、述べられた参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、用語「おおよそ」または「約」は、述べられた値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、または０．００１％以内であることを指す。文脈から別段はっきりしなければ、本明細書に提供されるすべての数値は用語「おおよそ」または「約」が修飾している。

バッチ：本明細書で使用される場合、用語「バッチ」とは、１度に精製される、例えば、同一サイクルの製造中に単一の製造指図表に従って精製されるｍＲＮＡの量または含量のことである。バッチは、単一精製運転で精製されるｍＲＮＡの量のことでもよい。

生物学的に活性な：本明細書で使用される場合、語句「生物学的に活性な」とは、生体系において、特に、生物において活性を有する任意の作用物質の特徴のことである。例えば、生物に投与されると、その生物に生物学的効果を及ぼす作用物質は、生物学的に活性であると見なされる。

ｄｓＲＮＡ：本明細書で使用される場合、用語「ｄｓＲＮＡ」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応中の相補的ＲＮＡ配列の生成のことである。相補的ＲＮＡ配列は、例えば、新生ＲＮＡ鎖中の相補的配列にハイブリダイズすることができる短い不全型の転写物、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ非依存性ＲＮＡ転写用のプライマーとして作用する短い不全型の転写物、および考えられるＲＮＡポリメラーゼ鋳型逆転を含む多種多様な理由で生成することができる。

重力（ｇ）：本明細書で使用される場合、用語「重力（ｇ）」とは、遠心分離機中の試料に加えられる加速度の度合いのことである。本明細書では、遠心分離機により生み出される重力（ｇ）は、フィルター上に保持される沈殿したｍＲＮＡおよび濾過遠心分離機のバスケットまたはドラムを通過するその他の物質上に発揮される。濾過遠心分離機により生み出される重力（ｇ）は、遠心分離機のサイズに依拠する。遠心分離機のバスケットの動きは円形なので、加速力は、半径と角運動速度の二乗の積として計算される。歴史的に「相対遠心力」（ＲＣＦ）として知られている、ｇ力は円形運動内の試料に加わる加速度の測定値であり、重力の単位で測定される。本明細書では、重力（ｇ）およびＲＣＦは互換的に使用することができ、バスケットの毎分回転数（ＲＰＭ）と混同するべきではない。重力（ｇ）またはＲＣＦは、バスケットの半径によるＲＰＭに関係しており、引力に関連する。ＲＰＭとＲＣＦの区別は重要である。なぜならば、異なる直径を有し同一の回転速度（ＲＰＭ）で動く２つのバスケットは異なる加速度を生じる（有する直径が大きなバスケットほど同一の回転速度でより大きな重力（ｇ）を達成する）からである。

異なるサイズの遠心バスケットに基づく重力（ｇ）またはＲＣＦとＲＰＭの間の変換は当業者にはルーチンだと考えられる。重力（ｇ）は、以下の式：
ｇ＝（ｎ）^２×１．１１８×１０^－５×ｒ
ｇ＝重力（ｇ）（ＲＣＦ）
ｒ＝回転半径（ｃｍ）
ｎ＝毎分回転数（ＲＰＭ）
を使用して濾過遠心分離機のバスケットの半径とＲＰＭから決定することができる。
ＲＰＭは、以下の式：
ｎ＝ν［ｇ／（ｒ×１．１１８）］×１×１０^５
ｇ＝重力（ｇ）（ＲＣＦ）
ｒ＝回転半径（ｃｍ）
ｎ＝毎分回転数（ＲＰＭ）
を使用して濾過遠心分離機のバスケットの半径と重力（ｇ）から決定することができる。
上記に従って、特定の濾過遠心分離機は、重力（ｇ）へのＲＰＭの異なる変換を有し、逆の場合も同じである。本明細書では、３０ｃｍのバスケット直径を有する遠心分離機（例えば、Ｈｅｉｎｋｅｌ Ｈ３００Ｐ）では、３４５０ＲＰＭの速度で約１９９６ｇの重力（ｇ）を発揮しうる。したがって、重力（ｇ）へのＲＰＭの変換は、約０．５７８の係数であり、重力（ｇ）からＲＰＭへの変換は、約１．７３の係数である。本明細書では、５０ｃｍのバスケット直径を有する遠心分離機（例えば、Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ Ｒｏｂａｔｅｌ ＥＨＢＬ ５０３）では、約２６００ＲＰＭの速度で約１８９０ｇの重力（ｇ）を発揮しうる。したがって、重力（ｇ）へのＲＰＭの変換は、約０．７２３の係数であり、重力（ｇ）からＲＰＭへの変換は、約１．３８の係数である。

不純物：本明細書で使用される場合、用語「不純物」とは、限られた量の液体、気体、または固体内部で、ターゲット材料または化合物の化学組成とは異なる物質のことである。不純物は「夾雑物」とも呼ばれる。

ｉｎ Ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」とは、多細胞生物内部ではなく、人工的環境で、例えば、試験管または反応容器中で、細胞培養中に、等で生じるイベントのことである。

ｉｎ Ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」とは、ヒトおよび非ヒト動物のような多細胞生物内で生じるイベントのことである。細胞ベースの系という文脈では、この用語は、生細胞内で生じるイベントを指すのに使用してもよい（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系とは対照的に）。

単離された：本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、（１）最初に生成されたときに（天然においてであれおよび／もしくは実験的状況においてであれ）物質および／または実体が会合していた成分の少なくとも一部から分離されている、ならびに／または（２）人の手により生成された、調製された、および／もしくは製造された物質および／または実体のことである。単離された物質および／または実体は、最初に会合していたその他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％よりも多くから分離される。一部の実施形態では、単離された作用物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％よりも多く純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、実質的に他の成分がなければ「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体のパーセント純度の計算は賦形剤（例えば、バッファー、溶媒、水、等）を含むべきではない。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのことである。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾ＲＮＡと非修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上のコードおよび非コード領域を含有してもよい。

ｍＲＮＡ完全性：本明細書で使用される場合、用語「ｍＲＮＡ完全性」は一般的にはｍＲＮＡの質のことである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ完全性とは、精製方法後に分解していないｍＲＮＡのパーセンテージのことである。

核酸：本明細書で使用される場合、用語「核酸」はその最も広い意味で、ポリヌクレオチド鎖中に組み込まれるまたは組み込むことができる任意の化合物および／または物質のことである。一部の実施形態では、核酸は、リン酸ジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖中に組み込まれるまたは組み込むことができる化合物および／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」とは個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）のことである。一部の実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖のことである。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似する用語は、核酸類似物、すなわち、リン酸ジエステル骨格以外のものを有する類似物を含む。例えば、いわゆる「ペプチド核酸」は、当技術分野で公知であり骨格にリン酸ジエステル結合の代わりにペプチド結合を有するが、本発明の範囲内であると見なされる。用語「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重版であるおよび／または同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質および／またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでいてもよい。核酸は、天然源から精製される、組換え発現系を使用して生成され、場合により、精製され、化学的に合成される、等である。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学的に修飾された塩基または糖、骨格修飾、等を有する類似物のようなヌクレオシド類似物を含むことができる。核酸配列は、別段指示されなければ、５’から３’方向に提示される。一部の実施形態では、核酸は、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似物（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレート塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホラミダイト連鎖）であるまたはこれを含む。一部の実施形態では、本発明は「非修飾核酸」を具体的に対象とし、この核酸は送達を促進するまたは達成するために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチドおよび残基）を意味する。

沈殿：本明細書で使用される場合、用語「沈殿」（またはその任意の文法的等価物）とは、溶液中での固体の形成のことである。ｍＲＮＡに関連して使用される場合、用語「沈殿」とは液体中の不溶または固体型のｍＲＮＡの形成のことである。

早期不全ＲＮＡ配列：本明細書で使用される用語「早期不全ＲＮＡ配列」、「短い不全型のＲＮＡ種」、「ショートマー」、および「長い不全型のＲＮＡ種」とは、ｍＲＮＡ合成反応（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成反応）の不完全な産物のことである。多種多様な理由で、ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ鋳型の転写を必ずしも完了させず；例えば、ＲＮＡ合成は早まって終結する。ＲＮＡ合成の早期終結の考えうる原因は、ＤＮＡ鋳型の質、鋳型に存在する特定のポリメラーゼに対するポリメラーゼ終結配列、劣化したバッファー、温度、リボヌクレオチドの欠乏、およびｍＲＮＡ二次構造を含む。早期不全ＲＮＡ配列は、所望の転写産物の意図された長さよりも少ない任意の長さの場合がある。例えば、早期不全ｍＲＮＡ配列は、１０００塩基未満、５００塩基未満、１００塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、３０塩基未満、２０塩基未満、１５塩基未満、１０塩基未満またはそれよりも少ない場合がある。

実質的に：本明細書で使用される場合、用語「実質的に」とは、目的の特徴または特性の全またはほぼ全範囲または程度を示す質的状態のことである。当業者であれば、生物学的および化学的現象が完了まで行くおよび／もしくは完全まで進むもしくは絶対的結果を達成することはまずめったにないまたは絶対的結果を回避することを理解している。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的欠如を表現するのに本明細書では使用される。

実質的にない：本明細書で使用される場合、用語「実質的にない」とは、除去される物質（例えば、早期不全ＲＮＡ配列）で存在している量が比較的少ないまたは全くない状態のことである。例えば、「早期不全ＲＮＡ配列が実質的にない」は、早期不全ＲＮＡ配列が、おおよそ５％、４％、３％、２％、１．０％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％またはそれよりも少ない（ｗ／ｗ）不純物未満のレベルで存在していることを意味する。あるいは、「早期不全ＲＮＡ配列が実質的にない」は、早期不全ＲＮＡ配列が約１００ｎｇ、９０ｎｇ、８０ｎｇ、７０ｎｇ、６０ｎｇ、５０ｎｇ、４０ｎｇ、３０ｎｇ、２０ｎｇ、１０ｎｇ、１ｎｇ、５００ｐｇ、１００ｐｇ、５０ｐｇ、１０ｐｇ、またはそれよりも少ない未満のレベルで存在していることを意味する。

別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての専門用語および科学用語は、本出願が属する技術分野の当業者が一般的に理解しているのと同じ、ならびに本出願が属する技術分野で一般的に使用されているのと同じ意味を有し；そのような技術は参照によってその全体を組み入れる。対立がある場合には、定義を含めて本明細書が支配する。

発明の詳細な説明
本発明は、とりわけ、遠心分離による濾過を使用してｍＲＮＡを精製するための改良された方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の方法により生成される組成物、ならびに本発明の方法を実行するための方法およびシステムを提供する。

製造要求を満たすためには、ｍＲＮＡ精製のための方法は、現在利用可能な業界基準ｍＲＮＡ精製法と比べた場合、等価なまたはより良好な産物を提供しつつ、あらゆる臨床および商業上の要求を満たすのに適した大規模製造能力を保証するために頑強でスケーラブルである必要がある。本発明者らは、遠心分離濾過が、現在利用可能な方法と比べて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成方法から得られる沈殿したｍＲＮＡの投入と洗浄の両方のためにより低い遠心分離速度を使用することにより、必要とする洗浄バッファーの量を減らしつつ、酵素および短い不全型のＲＮＡ種のような方法関連夾雑物からｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡの９５％よりも大きな回収率を達成できることを実証した。さらに、本発明者らは、同じ方法パラメータを使用すれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡを沈殿させ洗浄するための方法が有機溶媒（例えば、エタノール）を用いようと両親媒性ポリマー（例えば、ＭＴＥＧ）を用いようとｍＲＮＡを精製できることを示している。有機溶媒の必要性を減らすまたは回避することは、非常に好都合である。例えば、揮発性および／または引火性洗浄バッファーの量の増加に関連する安全規制は、既存の施設での有機溶媒ベースの方法のスカラビリティーを制限する。本発明の方法を使用して、本発明者らは、４分の１量の洗浄バッファー（１Ｌ／ｇ精製ｍＲＮＡ対先行技術方法での４Ｌ／ｇ精製ｍＲＮＡ）を使用すれば、第１の反応でｍＲＮＡを別に合成し、次に第２の反応でｍＲＮＡにキャッピングおよびテーリングすることにより製造されるｍＲＮＡを精製できることを実証する。洗浄バッファーの量を減らせば、精製はより効率よくなり、費用も少なくなって、環境への影響は減少する。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成方法から得られる沈殿したｍＲＮＡを投入し洗浄するための減少した遠心分離速度は、１３００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。例えば、本発明者らは、１３００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度により、より容易で完全にはがれ、より容易に再可溶化される精製されたｍＲＮＡのより詰まっていない濾過ケークが得られ、精製の効率および速度をさらに増すことを見出した。さらに、投入工程中に使用する速度がより低いと、方法は、投入と洗浄工程の両方で同じより低い遠心分離速度を使用することができ、より単純な方法を提供し、自動操作および増大したスカラビリティーにふさわしくなる。

遠心分離
当技術分野では固体－液体分離に遠心分離が使用されてきた。遠心分離機は重力を増して相を分離する（例えば、液体から固体を）。濾過遠心分離機は、織布のような媒体を利用して、液相は通過させつつ固相を保持する。濾過遠心分離はｍＲＮＡ精製のためにも使用されてきた。

例えば、ＷＯ２０１８／１５７１４１は、多孔性基質を通る遠心分離を使用してｍＲＮＡの懸濁液から夾雑物を除去する。ｍＲＮＡ精製のこれらの方法は、投入工程での高遠心分離速度の使用を推奨する。実際、ＷＯ２０１８／１５７１４１は、約１７００ｇから２１００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度を使用する。これらのより高い速度は、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液が濾過遠心分離機のフィルターに効果的に保持されることを保証するのに重要であり、保持された沈殿したｍＲＮＡのケークが精製方法中に取り外されるのを回避すると考えられた。

上で概説されたように、本発明者らは、高い速度は投入工程では必要ではないことを実証した。実際、より低い遠心分離速度を使用して投入工程で加える重力（ｇ）を減らすと、保持された沈殿したｍＲＮＡの詰まりがより少ないケークが得られる。下で概説するように、詰まりがより少ないケークであれば、特に、使用する洗浄バッファーの量をより少なくして、濾過遠心分離機のフィルターからのケークの完全な取り外しを可能にし、ｍＲＮＡの効率的な精製が可能になる。

濾過遠心分離機
濾過遠心分離機は、遠心力という原理に基づいて機能し、この遠心力は、通常はバスケットまたはドラムと呼ばれる装置が固定軸で高速で回転されると生み出される。濾過遠心分離機は、フィルターまたはスクリーン（例えば、ワイヤメッシュ）の中を液体を通すことにより固体－液体混合物から固体（例えば、沈殿したｍＲＮＡ）と液体（例えば、ｍＲＮＡの合成で使用されるバッファー）を分離することができる。そのような遠心分離機は、流体流動を可能にするよう穴を開けられている取り外しできるバスケットまたは固定されたドラムを含んでもよい。穴を開けられたバスケットまたはドラムは、フィルター布またはフィルター紙のような多孔性基質を受け入れるように適合していてもよい。典型的には、多孔性基質は取り外し可能である。一般的に使用されている濾過遠心分離機では、懸濁液は遠心分離機の内側から外側に流れ、それによって多孔性基質（例えば、取り外し可能な多孔性基質）を通過し、次に、バスケットまたは穴を開けられたドラムを通過する。このようにして、遠心分離機の内側に添加された固体－液体混合物中の固体物質は保持され、液体は懸濁液から除去される。

本発明の方法で使用するのに適した遠心分離機は当技術分野では周知である。例えば、Ｓｃｏｔｔ、Ｋ．ａｎｄ Ｈｕｇｈｅｓ、Ｒ．、「Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ、１９９６年；Ｔａｒｌｅｔｏｎ、Ｓ．ａｎｄ Ｗａｋｅｍａｎ、Ｒ．、「Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９９９年；Ｔａｒｌｅｔｏｎ、Ｓ．ａｎｄ Ｗａｋｅｍａｎ、Ｒ．、「Ｓｏｌｉｄ／Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｓｃａｌｅ－ｕｐ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ」．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００５年； Ｗａｋｅｍａｎ、Ｒ． ａｎｄ Ｔａｒｌｅｔｏｎ、Ｓ．、「Ｓｏｌｉｄ／Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ」．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００５年；Ｔａｒｌｅｔｏｎ、Ｓ．ａｎｄ Ｗａｋｅｍａｎ、Ｒ．、「Ｓｏｌｉｄ／ｌｉｑｕｉｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ：ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｓｉｇｎ」．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２００６年；ａｎｄ Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ、Ｋ．ａｎｄ Ｃｈａｓｅ、Ｇ．、「Ｆｉｌｔｅｒｓ ａｎｄ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２０１１年を参照のこと。前記文献はそれぞれ参照によってその全体を本明細書に組み入れる。ＵＳ１２９２７５８Ａ；ＵＳ１４７８６６０Ａ；ＵＳ３２６９０２８Ａ；ＵＳ３４１１６３１Ａ；ＵＳ３４１９１４８Ａ；ＵＳ３４３８５００Ａ；ＵＳ３４８３９９１Ａ；ＵＳ３４９１８８８Ａ；ＵＳ３６２３６１３Ａ；ＵＳ３６８４０９９Ａ；ＵＳ３７７４７６９Ａ；ＵＳ３９８０５６３Ａ；ＵＳ４１９３８７４Ａ；ＵＳ４１９３８７４Ａ；ＵＳ４１９３８７４Ａ；ＵＳ４２６９７１１Ａ；ＵＳ４３８１２３６Ａ；ＵＳ４９４４８７４Ａ；ＵＳ５００４５４０Ａ；ＵＳ５０９１０８４Ａ；ＵＳ５０９２９９５Ａ；ＵＳ５２４４５６７Ａ；ＵＳ５２７７８０４Ａ；ＵＳ５２８６３７８Ａ；ＵＳ５３０６４２３Ａ；ＵＳ５３７８３６４Ａ；ＵＳ５３８０４３４Ａ；ＵＳ５３９７４７１Ａ；ＵＳ５４２１９９７Ａ；ＵＳ５４３３８４９Ａ；ＵＳ５４６８３８９Ａ；ＵＳ５４７２６０２Ａ；ＵＳ５７１３８２６Ａ；ＵＳ６７３６９６８Ｂ２；ＵＳ６７３６９６８Ｂ２；ＵＳ６７３６９６８Ｂ２；ＵＳ７１６８５７１Ｂ２；ＵＳ７４２５２６４Ｂ２；ＵＳ８０２１２８９Ｂ２；ＵＳ８２５７５８７Ｂ２；ＵＳ９１２６２３３Ｂ２；ＵＳ９２９７５８１Ｂ２；ＵＳ２００４０１０８２８１Ａ１；ＵＳ２００４０１０８２８１Ａ１；ＵＳ２００５０２４５３８１Ａ１；ＵＳ２００６００２１９３１Ａ１；ＵＳ２００６０１７５２４５Ａ１；ＵＳ２００８０１４９５５８Ａ１；ＵＳ２０１００１２０５９８Ａ１；ＵＳ２０１００２１６６２３Ａ１；ＵＳ２０１２０２８５８６８Ａ１；ＵＳ２０１４０３６００３９Ａ１；ＡＵ２００７３５０７８８Ａ１；ＡＵ２００７３５０７８８Ｂ２；ＥＰ１３７２８６２Ａ１；ＥＰ３０４０１２７Ａ１；ＥＰ８４５２９６Ａ１；ＷＯ２００４０３３１０５Ａ１；ＷＯ２００８１２２０６７Ａ１；ＷＯ２０１４０４３５４１Ａ１；ＷＯ２０１６０２５８６２Ａ１；ＷＯ２０１６１１２４２６Ａ１；ＷＯ２０１６１１２４２７Ａ１；およびＷＯ２０１６１１２４２８Ａ１も参照のこと。前記特許文献はそれぞれ参照によってその全体を本明細書に組み入れる。

適切な遠心分離機タイプの非限定的例は、バッチ濾過遠心分離機、反転濾過遠心分離機、プッシャー遠心分離機、ピーラー遠心分離機（例えば、水平ピーラー遠心分離機、垂直ピーラー遠心分離機、およびサイホンピーラー遠心分離機）、振り子遠心分離機、スクリーン／スクロール遠心分離機、およびスライディング排出遠心分離機を含む。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は連続遠心分離機である。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は垂直に配向している。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は水平に配向している。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、反転水平遠心分離機である。本発明の方法で使用するのに適した濾過遠心分離機の例は、図１および２に示されている。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、約３０ｃｍ～約１７０ｃｍのバスケット直径を有する。特定の実施形態では、濾過遠心分離機は、１００ｃｍまたはそれ以上、例えば、約１７０ｃｍまでのバスケット直径を有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、約１５ｃｍ～約８０ｃｍのバスケット深さを有する。特定の実施形態では、濾過遠心分離機は、６０ｃｍまたはそれ以上、例えば、約８０ｃｍまでのバスケット深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、約３０ｃｍ：１５ｃｍ～約１７０ｃｍ：８０ｃｍのバスケット直径：深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、３０ｃｍのバスケット直径および１５ｃｍの深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、５０ｃｍのバスケット直径および２５ｃｍの深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、６３ｃｍのバスケット直径および３１．５ｃｍの深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、８１ｃｍのバスケット直径および３５ｃｍの深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、１０５ｃｍのバスケット直径および６１ｃｍの深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、１１５ｃｍのバスケット直径および６１ｃｍの深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、１３２ｃｍのバスケット直径および７２ｃｍの深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、１６６ｃｍのバスケット直径および７６ｃｍの深さを有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、約２０リットル～約７２５リットルの有用な容量を有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、約３０ｋｇ～約９００ｋｇの最大荷重を有する。特定の実施形態では、濾過遠心分離機は、２５０ｋｇを超える、例えば、９００ｋｇまでの最大荷重を有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、約０．５ｍ^２～約４ｍ^２の最大濾過表面積を有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、１０００ＲＰＭ～約３５００ＲＰＭの最大速度（ＲＰＭ）を有する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、約９００ｇ～約２０００ｇの最大重力（ｇ）を及ぼすことができる。

濾過遠心分離機の構成
図３は、本発明のならびに本発明の方法およびプロセスにおいて使用するためのシステムの構成を示す。システムは：沈殿したｍＲＮＡを受けるための第１の容器（４）；洗浄バッファーを受けるための第２の容器（２）；洗浄された沈殿したｍＲＮＡおよび／または沈殿したｍＲＮＡを可溶化するための水性媒体を受けるための第３の容器（３）；フィルター、試料供給ポート（１８）および試料排出ポート（２２）を含む濾過遠心分離機（２０）；精製されたｍＲＮＡを受けるための第４の容器（３４）および夾雑物を受けるための第５の容器（３０）；システムの中を通して流れを導くように構成されるポンプ（１４）；ならびにシステム中の異なる容器からのまたは異なる容器への同時の流れをブロックするように構成される１つまたはそれ以上の弁（１０、１２および２６）を含む。第１の、第２のおよび第３の容器は、ポンプ（１４）のインプットに作動可能に連結（５、６および８）されており、濾過遠心分離機の試料供給ポート（１８）はポンプ（１４）のアウトプットに作動可能に連結（１６）されている。第４および第５の容器は、濾過遠心分離機の試料排出ポート（２２）に作動可能に連結（２８および３４）されている。さらに、遠心分離機は試料排出チャネル（２１）を含み、このチャネルを通じて沈殿したｍＲＮＡ組成物は濾過遠心分離機から回収する（２１）ことができる。図３に表示されるシステムは、フィルターから沈殿したｍＲＮＡの組成物を取り外すことによる保持され洗浄された沈殿したｍＲＮＡの回収またはフィルター上に保持された沈殿したｍＲＮＡの可溶化およびそれに続くその収集による保持され洗浄された沈殿したｍＲＮＡの回収を含む本発明の方法において使用することができる。本発明の特定の実施形態では、第３（３）および第４の容器（３４）は任意選択の構成要素（すなわち、沈殿したｍＲＮＡは、可溶化工程を必要とせずに、試料排出チャネル（２１）を経て回収する（２４）ことができる）である。別の特定の実施形態では、第３（３）および第４の容器（３４）は、沈殿したｍＲＮＡの可溶化および精製されたｍＲＮＡの回収（すなわち、第４の容器（３４）中への）を含む実施形態のために使用される。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は試料供給ポートを含む。一部の実施形態では、試料供給ポートは、１つまたはそれ以上の容器から物質（例えば、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液、洗浄バッファーおよび／または可溶化バッファー）を受ける。一部の実施形態では、試料供給ポートは、１つまたはそれ以上の容器に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の容器から濾過遠心分離機の試料供給ポートへの物質の輸送はポンピングによる。一部の実施形態では、ポンピングは、１つまたはそれ以上の容器および試料供給ポートに作動可能に連結されている単一のポンプによる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の容器から試料供給ポートへの物質の輸送は、１つまたはそれ以上の弁により制御されている。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は試料排出ポートを含む。一部の実施形態では、試料排出ポートは濾過遠心分離機からの精製されたｍＲＮＡの回収を可能にする。一部の実施形態では、試料排出ポートは、濾過された精製ｍＲＮＡを回収するための１つまたはそれ以上の容器に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、濾過された精製ｍＲＮＡを回収するための１つまたはそれ以上の容器中に回収される。一部の実施形態では、試料排出ポートは、精製方法中に夾雑物を回収するための１つまたはそれ以上の容器、例えば、廃棄物ドラムに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、濾過遠心分離機からフィルター排出口を経た１つまたはそれ以上の容器への精製されたｍＲＮＡおよび／または夾雑物の輸送はポンピングによる。一部の実施形態では、ポンピングは、精製されたｍＲＮＡおよび／または夾雑物を回収するための試料排出ポートおよび１つまたはそれ以上の容器に作動可能に連結されている単一のポンプによる。一部の実施形態では、濾過遠心分離機からフィルター排出口を経た１つまたはそれ以上の容器への精製されたｍＲＮＡおよび／または夾雑物の輸送は、１つまたはそれ以上の弁により制御されている。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、濾過遠心分離機のプラウまたは刃を配置すると、遠心分離機のバスケットまたはドラムから沈殿したｍＲＮＡを受けるように構成される試料排出チャネルを含む。

濾過遠心分離機を運転する
濾過遠心分離機に投入するおよびアンロードする
一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の容器および濾過遠心分離機の試料供給ポートに作動可能に連結されているポンプは、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液、洗浄バッファーおよび／または可溶化バッファーを供給するための１つまたはそれ以上の容器から試料供給ポートに濾過遠心分離機のフィルターの表面積の関数として決定された速度で物質を輸送するように構成されている。一部の実施形態では、ポンプは、試料排出ポートから精製されたｍＲＮＡおよび／または夾雑物を回収するための１つまたはそれ以上の容器に約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に関して）の速度で物質を輸送するように構成されている。一部の実施形態では、ポンプは、試料排出ポートから精製されたｍＲＮＡおよび／または夾雑物を回収するための１つまたはそれ以上の容器に約１０リットル／分／ｍ^２～約２０リットル／分／ｍ^２の速度で物質を輸送するように構成されている。一部の実施形態では、輸送速度は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５リットル／分／ｍ^２である。特定の実施形態では、輸送速度は、約１５リットル／分／ｍ^２またはそれ以下である。

一部の実施形態では、懸濁液、洗浄バッファーおよび／または可溶化バッファーの総容量は、約０．５時間から約８時間の間、例えば、約２時間から約６時間の間で濾過遠心分離機中に投入される。一部の実施形態では、総容量は、約８時間未満、約７時間未満、約６時間未満、約５時間未満、約４時間未満、約３時間未満、約２時間未満、約１時間未満、または約０．５時間未満で濾過遠心分離機中に投入される。一部の実施形態では、懸濁液、洗浄バッファーおよび／または可溶化バッファーの総容量を濾過遠心分離機中に投入するのにかかる時間は、前記濾過遠心分離機のローターサイズ（すなわち、バスケット直径）に依存する場合があり、例えば、沈殿したｍＲＮＡ １０００ｇの懸濁液の総容量を約５０ｃｍのローターサイズを有する濾過遠心分離機中に投入するには約３時間かかる場合がある（表Ｄ参照）。一部の実施形態では、洗浄バッファーの総容量は、例えば、約３０ｃｍ～約１７０ｃｍのローターサイズ（すなわち、バスケット直径）を有する濾過遠心分離機を使用することにより、約０．５時間から約４時間の間で濾過遠心分離機中に投入される。一部の実施形態では、洗浄バッファーの総容量は、約４時間未満、約３時間未満、約２時間未満、約１時間未満、または約０．５時間未満で濾過遠心分離機中に投入される。例えば、本発明者らは、約５０ｃｍのローターサイズを有する濾過遠心分離機を使用して、ｍＲＮＡの１０００ｇのバッチでは５００リットルの洗浄バッファーを使用して約８０分で（すなわち、６Ｌ／分または１５Ｌ／分／ｍ^２の洗浄バッファー投入速度で）不純物除去を達成した（表Ｄ参照）。

一部の実施形態では、懸濁液の総容量はバッチでまたは連続して濾過遠心分離機中に投入される。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡおよび／または夾雑物の総容量は、約１分から約９０分の間で濾過遠心分離機から回収される。一部の実施形態では、総容量は、約９０分未満、約８０分未満、約７０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約３０分未満、約２０分未満、約１０分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、約２分未満、または約１分未満で濾過遠心分離機から回収される。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、濾過遠心分離機のフィルター上に保持された沈殿したｍＲＮＡを取り外すように構成される刃ピーラーまたはプラウを含む。一部の実施形態では、刃は、濾過遠心分離機が運転中である間に配置される。

遠心分離速度
本発明者らは、遠心分離濾過を使用してｍＲＮＡを精製する方法が、発揮する重力（ｇ）を減らした遠心分離速度が使用される場合に、より高い洗浄効率および精製されたｍＲＮＡの収率の増加を達成することを見出した。これは、速度が大きいほどより良好な濾過が予想されたことを考慮すると、反直感的である。実際、上で概説されたように、ＷＯ２０１８／１５７１４１は、ｍＲＮＡ精製のために遠心分離を用いて、濾過を改善し濾過遠心分離機のフィルターとのケークの接触を保持するために、１５００ｇよりも多い、例えば、およそ１７５０～２２５０ｇの重力（ｇ）を達成する遠心分離速度を使用して沈殿した試料に最大力を加える。本発明者らは、より低い重力（ｇ）を加える遠心分離速度を使用すれば、洗浄効率が大幅に増加した（すなわち、沈殿したｍＲＮＡから夾雑物を取り除くのにより少ない量の洗浄バッファーで済む）等価なまたは改善された精製を達成することを本明細書で実証している。

理論に縛られるものではないが、本発明者らは、低下させた速度（すなわち、沈殿したｍＲＮＡ上に加えられる重力（ｇ）が減少する）が、沈殿したｍＲＮＡの遠心分離により生み出されるケークの密度を減少させるので、ケークの詰め込みの減少に照らしてケークを洗浄する方法がより効率的になると考える。その結果、本発明の方法は、臨床グレードのｍＲＮＡ精製を達成するために以前の方法と比べて必要な洗浄バッファーは少なくなる。したがって、本発明の方法では、洗浄バッファー中に揮発性有機溶媒（例えば、アルコール）を含むプロトコルで沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために必要な揮発性有機溶媒（例えば、アルコール）の量が減少する。本発明の方法では、以前の方法と比べて洗浄バッファーの７５％の減少が可能になり、したがって、精製された臨床グレードのｍＲＮＡの商業生産に適したより大型のバッチサイズのための本発明の方法の著しいアップスケーリングが可能になる。

さらに、特に洗浄バッファー量を減少させるという要件に照らして、本発明の方法の速度は以前の方法と比べて増加され、商業規模でのより効率的な生産が可能になる。さらに、上で概説したように、遠心分離速度を減らすと、より密ではないケーク産物をもたらし、このケークは凝集が少ないより均質な密度を有する。この密度の減少により、濾過遠心分離機のフィルターからケークを回収できる有効性が改善され、ケークが残存ヒールを形成する場合に引き起こすことがある遠心分離機の刃によるフィルターの潜在的損傷が回避される。さらに、ケークの密度が減少したことは、ケークの懸濁有効性も増加させて、可溶化により達成できる精製されるｍＲＮＡの量が改善される。

それゆえに、本発明の方法に従って、沈殿したｍＲＮＡは濾過遠心分離機のフィルター上に保持され、バッファーおよび１つまたはそれ以上の夾雑物はフィルターを通過するように、フィルターケークを圧縮することを回避し重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度が選択される。本発明の方法の投入および洗浄工程のために特定の重力（ｇ）を発揮するのに適した遠心分離速度が選択される。一部の実施形態では、遠心分離速度は、本発明の方法の収集工程のために特定の重力（ｇ）を発揮するのにも適している。

一部の実施形態では、遠心分離速度は１３００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は１２００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は１１００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は１０００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は９００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は８００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は７００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は６００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は５００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は４００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は３００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。特定の実施形態では、遠心分離速度は７５０ｇ未満、例えば、７３０ｇ未満、例えば、約７２５ｇの重力（ｇ）を発揮する。特定の実施形態では、遠心分離速度は６００ｇ未満、例えば、５８５ｇ未満、例えば、約５７５ｇの重力（ｇ）を発揮する。

一部の実施形態では、遠心分離速度は約１５０ｇから約１３００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約２５０ｇから約９００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約３００ｇから約１３００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約３５０ｇから約１２５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約３５０ｇから約１０５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約４００ｇから約１１００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約４００ｇから約６００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約４５０ｇから約１０５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約５００ｇから約１０００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約５００ｇから約９００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。特定の実施形態では、遠心分離速度は約７００ｇから約９００ｇの間、例えば、約７５０ｇから約８５０ｇの間（例えば、約８００ｇ）の重力（ｇ）を発揮する。このｇ力は、異なるサイズの遠心分離機の範囲でふさわしいことが見出されている。

一部の実施形態では、遠心分離速度は約５００ｇから約７５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約５５０ｇから約８５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、遠心分離速度は約５５０ｇから約７５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。特定の実施形態では、遠心分離速度は約５５０ｇから約６５０ｇの間、例えば、約５７０ｇから５８０ｇの間、例えば、約５７５ｇの重力（ｇ）を発揮する。特定の実施形態では、遠心分離速度は約６５０ｇから約７５０ｇの間、例えば、約７２０ｇから約７３０ｇの間、例えば、約７２５ｇの重力（ｇ）を発揮する。

上に概説されるように、ｇ力は、バスケット直径および毎分回転数（ＲＰＭ）に基づいて計算することができる。バスケット直径５０ｃｍの遠心分離機上１０００ＲＰＭの速度での遠心分離は、約７２５ｇの重力を発揮する。バスケット直径３０ｃｍの遠心分離機上１０００ＲＰＭの速度での遠心分離は、約５７５ｇの重力を発揮する。特定の実施形態では、濾過遠心分離機のバスケット直径に関わりなく、約７００ｇから約９００ｇの間、例えば、約７５０ｇから約８５０ｇの間（例えば、約８００ｇ）の重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度は、不純物の除去を達成するのに特に適していることが見出された。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、本発明の方法全体を通じて同じ遠心分離速度で運転される。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、本発明の方法の投入および洗浄工程の間、同じ遠心分離速度で運転される。本発明の方法全体を通じて同じ遠心分離速度を維持すれば、本発明の精製方法の容易さおよび再現性が増加する。

一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、１５００ＲＰＭ未満の遠心分離速度で運転される。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、１２５０ＲＰＭ未満の遠心分離速度で運転される。特定の実施形態では、濾過遠心分離機は、１０００ＲＰＭ未満の遠心分離速度で運転される。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、投入と洗浄工程の両方について同じ遠心分離速度で運転される。

本発明の方法により必要とされるのと同じ重力を発揮すると、濾過遠心分離機および／またはその重力（ｇ）を達成するのに前記濾過遠心分離機上で必要とされるＲＰＭに関わらず、本発明の方法の同じ利点を示す。したがって、本発明の方法は、濾過遠心分離機が沈殿したｍＲＮＡ上に適切な重力（ｇ）を発揮することができる限り、当技術分野で公知のいかなる濾過遠心分離機上でも使用できる。実際、より大きな商業用の遠心分離機は最大速度、したがって、遠心分離機が発揮することができる最大重力（ｇ）を有する。例えば、Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ Ｒｏｂａｔｅｌ ＥＨＢＬ １３２３は、５５０ｋｇの投入容量を有し、１１３０ｇの最大重力（ｇ）を発揮することができる。本明細書で開示される本発明者らの所見に照らせば、本発明の方法は、より大きな規模でｍＲＮＡの効果的な精製を可能にするより大きな商業用遠心分離機に適用することができる。

多孔性基質
典型的な実施形態では、本発明の方法において使用するための濾過遠心分離機は多孔性基質（例えば、フィルターまたは膜）を含む。多孔性基質は、可溶化ＲＮＡ（例えば、短い不全型のＲＮＡ種）を通過させつつ、沈殿したｍＲＮＡを保持する。一部の実施形態では、多孔性基質は濾過遠心分離機から取り外すことができる。本明細書で使用される場合、用語「膜」または「フィルター」とは、物質の任意の多孔層またはシートのことである。本出願では、用語「膜」は「フィルター」と互換的に使用される。

本明細書に記載される方法のいずれかにおいて使用されるフィルターは、多種多様なフィルター孔径および種類を特徴としうる。例えば、遠心分離機フィルターは、約０．０１ミクロン～約２００ミクロン、約１ミクロン～約２０００ミクロン、約０．２ミクロン～約５ミクロン、または約１ミクロン～約３ミクロンの平均孔径を有することができる。一部の実施形態では、平均孔径は、約０．５ミクロンもしくはそれ以上、約０．７５ミクロンもしくはそれ以上、約１ミクロンもしくはそれ以上、約２ミクロンもしくはそれ以上、約３ミクロンもしくはそれ以上、約４ミクロンもしくはそれ以上、または約５ミクロンもしくはそれ以上である。

一部の実施形態では、フィルターは、不純物（可溶性不純物および／または不溶性で孔径よりも小さいサイズを有する不純物を含む）を浸透物として通過させつつ、沈殿したｍＲＮＡを捕獲するまたは保持するのに適した孔径を有する。一部の実施形態では、フィルターは、可溶化ｍＲＮＡを通過させつつ、不純物（孔径よりも大きなサイズを有する不溶性不純物、例えば、濾過助剤を含む）を捕獲するのに適した孔径を有する。一部の実施形態では、フィルターは、約０．１０μｍ、０．２０μｍ、０．２２μｍ、０．２４μｍ、０．２６μｍ、０．２８μｍ、０．３０μｍ、０．４０μｍ、０．５μｍ、または１．０μｍの平均孔径またはこれよりも大きなサイズを有する。一部の実施形態では、フィルターは、約０．５μｍ～約２．０μｍの平均孔径を有する。特定の実施形態では、フィルターは約１μｍの平均孔径を有する。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを保持するのに適した孔径は、沈殿したｍＲＮＡの公称分画分子量（ＮＭＷＬ）により決定してもよく、この分子量は分画分子量（ＭＷＣＯ）とも呼ばれる。典型的には、沈殿したｍＲＮＡのＮＭＷＬまたはＭＷＣＯ未満の孔径を有するフィルターが使用される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡのＮＭＷＬまたはＭＷＣＯの２分の１～６分の１（例えば、１／２、１／３、１／４、１／５、または１／６）の孔径を有するフィルターが使用される。一部の実施形態では、本発明にふさわしいフィルターは、約１００キロダルトン（ｋＤａ）、３００ｋＤａ、５００ｋＤａ、１，０００ｋＤａ、１，５００ｋＤａ、２，０００ｋＤａ、２，５００ｋＤａ、３，０００ｋＤａ、３，５００ｋＤａ、４，０００ｋＤａ、４，５００ｋＤａ、５，０００ｋＤａ、５，５００ｋＤａ、６，０００ｋＤａ、６，５００ｋＤａ、７，０００ｋＤａ、７，５００ｋＤａ、８，０００ｋＤａ、８，５００ｋＤａ、９，０００ｋＤａ、９，５００ｋＤａ、または１０，０００ｋＤａのまたはこれよりも大きな孔径を有していてもよい。一部の実施形態では、フィルターは、ｍＲＮＡのＮＭＷＬおよびＭＷＣＯよりも大きな、しかし、沈殿したｍＲＮＡのＮＭＷＬおよびＭＷＣＯ未満の孔径を有する。

本発明において使用するためのフィルターはいかなる材料で作製してもよい。例示的フィルター材料は、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）（修飾されていない）、ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）中空糸膜、フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）、酢酸セルロース、ニトロセルロース、ＭＣＥ（混合セルロースエステル）、超高分子量ポリエチレン（ＵＰＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ナイロン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、およびその組合せを含むがこれらに限定されない。例えば、熱可塑性ポリマー、特に部分的に結晶性で非極性熱可塑性ポリマー（例えば、ポリプロピレンなどのポリオレフィン）から作製される織物は、本発明で使用するのに特に適していることが見出されている。そのような織物は、約０．５μｍ～約２．０μｍの平均孔径（例えば、約１．０μｍの平均孔径）を用いて作製することができる。

本発明において使用するのに適切なフィルターは、種々の表面積を有していてよい。一部の実施形態では、フィルターは、ｍＲＮＡの大規模生産を促進するのに十分大きな表面積を有する。例えば、フィルターは、約２，０００ｃｍ^２、２，５００ｃｍ^２、３，０００ｃｍ^２、３，５００ｃｍ^２、４，０００ｃｍ^２、４，５００ｃｍ^２、５，０００ｃｍ^２、７，５００ｃｍ^２、１０，０００ｃｍ^２、５ｍ^２、１０ｍ^２、１２ｍ^２、１５ｍ^２、２０ｍ^２、２４ｍ^２、２５ｍ^２、３０ｍ^２、または５０ｍ^２のまたはこれよりも大きい表面積を有していてもよい。

本明細書の方法は、それでもｍＲＮＡを保持しつつ、フィルターを塞ぐことなく多種多様なフィルター孔径を適応させることができる。

方法工程
本発明の方法は、沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を産するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡの沈殿、濾過遠心分離機中への懸濁液の投入、および濾過遠心分離機での沈殿したｍＲＮＡの洗浄を含む一連の工程を通じたｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡの精製に関する。次に、洗浄された沈殿したｍＲＮＡは保存液（例えば、凍結乾燥に適した溶液）中にまたは薬学的に許容できる液体（例えば、注射用水）中に可溶化することができる。

図４は、追加の任意工程（破線により表示される）を含む、本発明の例示的方法の工程を概説するフローチャートを提供する。一部の実施形態では、本発明の方法は、図４に提供される工程を含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、図４に提供される任意の工程をさらに含む。

さらに、図５は、本発明の例示的システム上で実行される本発明の例示的方法の工程の概要を述べる系統図を提供する。図５のシステムおよび方法は、沈殿したｍＲＮＡが濾過遠心分離機のフィルターから沈殿したｍＲＮＡの組成物として回収され、それに続いて濾過遠心分離機を使用して収集される前に可溶化されて精製されたｍＲＮＡを提供する実施形態のみについて構成される。システムは、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液（４０）を受けるための第１の容器（２）；洗浄された沈殿したｍＲＮＡを可溶化するためのまたは沈殿したｍＲＮＡを可溶化するための水性媒体を受けるための第２の容器（３）；夾雑物（３８）を収集するための第３の容器（例えば、廃棄物ドラム）（３０）；精製されたｍＲＮＡ（６０）を受けるための第４の容器（３４）；多孔性基質（例えば、フィルター）を有するバスケットまたはドラム（３６）、試料供給ポート（１８）、インプットノズル（４４）、試料排出ポート（２２）、試料排出チャネル（２１）、保持された沈殿したｍＲＮＡをフィルターから取り外すためのプラウまたは刃（４８）およびすすぎ液を分配するための１つまたはそれ以上のスプリンクラー（５４）を含む濾過遠心分離機（２０）を含む。図５に表示される方法は、示される以下の工程［１］から［１６］までを通して含み：［１］濾過遠心分離機が提供される；［２］濾過助剤と組み合わせた沈殿したｍＲＮＡの懸濁液（４０）が第１の容器（２）に供給される；［３］沈殿したｍＲＮＡの懸濁液（４０）は、濾過助剤と組み合わせた沈殿したｍＲＮＡが濾過遠心分離機のフィルター上に保持され（４２）、夾雑物（可溶性またはフィルターポアよりも小さなサイズ）（３８）がフィルターを通過して廃棄物ドラム（３０）中に入るように、試料供給ポート（１８）を経て、第１の容器（２）から第１の遠心分離速度（例えば、１３００ｇ未満の重力（ｇ）を加える遠心分離速度）で運転中の濾過遠心分離機中に移される；［４］遠心分離機は、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液の実質的にすべての水性部分が収集されるまで作動し続ける；［５］洗浄バッファー（４６）（場合によりさらなる容器から）は、濾過助剤と組み合わせた沈殿し保持されたｍＲＮＡが洗浄バッファーにより洗浄されるように、インプットノズル（４４）を経て、第２の遠心分離速度で運転中の濾過遠心分離機中に移される；［６］および［７］濾過遠心分離機は、洗浄バッファーが、濾過助剤と組み合わせた保持された沈殿したｍＲＮＡ（４２）および一緒に夾雑物（例えば、塩夾雑物）を保有する濾過遠心分離機のフィルターの中を通過して、廃棄物ドラム（３０）中に入るように作動し続ける；［８］および［９］場合により、遠心分離機は、濾過助剤と組み合わせた保持され洗浄された沈殿したｍＲＮＡが乾燥されるように、第１の、第２のまたは第３の遠心分離速度で作動し続ける；［１０］～［１２］プラウまたは刃（４８）は、洗浄された沈殿したｍＲＮＡが、試料排出チャネル（２１）を経て濾過助剤と組み合わせた沈殿したｍＲＮＡの組成物（５０）として収集されるように、配置され、第３の遠心分離速度で作動する濾過遠心分離機のフィルターから濾過助剤と組み合わせた保持され洗浄された沈殿したｍＲＮＡを取り外す（この工程は、遠心分離機が運転中でなくても、手動で実施することもできる（示されてはいない））；［１３］および［１４］場合により、濾過遠心分離機のフィルターおよびバスケットは、スプリンクラー（５４）を経て濾過遠心分離機中に移されるすすぎバッファー（例えば、ＮａＯＨを含む水）ですすがれ（５２）（これは定置洗浄（ＣＩＰ）システムとして知られる）廃棄物ドラム（３０）中に収集することができる；［１５］濾過助剤と組み合わせた沈殿したｍＲＮＡの組成物（５０）は可溶化バッファーに可溶化されて濾過助剤と組み合わせた可溶化ｍＲＮＡの水溶液（５６）を供給し、これは可溶化ｍＲＮＡを受けるための容器（３）中に移される（可溶化の工程はこの容器（３）の内部でも生じ得る）；［１６］濾過助剤と組み合わせたｍＲＮＡの水溶液は、濾過助剤が濾過遠心分離機のフィルターにより保持され水性ｍＲＮＡ溶液がフィルターを通過して精製されたｍＲＮＡの溶液（６０）を受けるためのさらなる容器（３４）中に入るように、試料供給ポート（１８）を経て、容器（３）から第４の遠心分離速度で運転中の濾過遠心分離機中に移される。一部の実施形態では、遠心分離機は、方法の工程のすべてについて同じ遠心分離速度で運転される。一部の実施形態では、第１と第２、および場合により第３の遠心分離速度は同じである。例示的遠心分離速度は下に詳細に提供される。特に、方法の工程［２］～［７］は、１３００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度で生じる。

一部の実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡを調製する１つまたはそれ以上の工程を含む。他の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を通してｍＲＮＡを製造することは、その精製と物理的におよび一時的に別である。より一般的に、本発明の精製方法は、ｍＲＮＡを合成する統合方法である、すなわち、本発明によるｉｎ ｖｉｔｒｏ合成方法は、本発明によって実行される１つまたはそれ以上の精製工程を含むことができる。

一部の実施形態では、本発明の方法は、精製後にｍＲＮＡを可溶化する１つまたはそれ以上の工程を含む。他の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは異なる時間で保存され、可溶化される。例えば、可溶化前のそのより小さい容量のために、精製された沈殿したｍＲＮＡを出荷することが有利であり得る。

ｍＲＮＡ合成
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）は、プロモーターを含む線状もしくは環状のＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含むことができるバッファー系、ならびに適当なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ピロホスファターゼおよび／またはＲＮアーゼ阻害剤で一般的に実行される。正確な条件は、具体的な適用によって異なる。したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡを製造することは、（ｉ）好適なプロモーターを含むＤＮＡ鋳型および（ｉｉ）ＲＮＡポリメラーゼを混合することによってｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）を実行して、完全長ｍＲＮＡを含む不純調製物を生成し、それを次に本明細書に開示される精製方法にかける工程を含む。最終生成物においてこれらのＩＶＴの存在は望ましくなく、したがって不純物と呼ぶことができ、これらの不純物の１つまたはそれ以上を含有する調製物は不純調製物と呼ぶことができる。

特定の実施形態では、ＩＶＴ反応は２ステップ法を含み、第１のステップはｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写および続く本発明による精製工程を含み、第２のステップは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡのキャッピングおよびテーリングならびに続く本発明による第２の精製工程を含む。一部の実施形態では、ＩＶＴ反応は、キャッピングおよびテーリングされたｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写をもたらす１ステップ法である。例えば、一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写は、その後精製されるキャッピングおよびテーリングされたｍＲＮＡの生成をもたらす。これは、例えばｐｏｌｙＴ領域および／またはＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）を含むプラスミドを使用して達成される（すなわち水性バッファー中のナトリウム塩の形の５０ｍＭ ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ）。

一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は線状のＤＮＡ鋳型である。一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は環状のＤＮＡ鋳型である。一部の実施形態では、ポリメラーゼはＳＰ６ポリメラーゼである。一部の実施形態では、混合することはリボヌクレオチド三リン酸のプールを混合することをさらに含む。一部の実施形態では、混合することは、ＲＮアーゼ阻害剤、例えばＲＮアーゼＩ阻害剤、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＢおよびＲＮアーゼＣをさらに含む。

一部の実施形態では、転写されるＤＮＡ鋳型は、より効率的な転写および／または翻訳を促進するように最適化することができる。例えば、ＤＮＡ鋳型は、シス調節エレメント（例えば、ＴＡＴＡボックス、終止シグナルおよびタンパク質結合部位）、人工組換え部位、カイ部位、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、負のＣｐＧ島、ＧＣ含有量、ポリメラーゼずれ部位および／または転写関連の他のエレメントに関して最適化することができ；ＤＮＡ鋳型は潜在性スプライス部位、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡの安定した自由エネルギー、反復配列、ｍＲＮＡ不安定性モチーフおよび／またはｍＲＮＡプロセシングおよび安定性に関する他のエレメントに関して最適化することができ；ＤＮＡ鋳型は、コドン利用バイアス、コドン適応性、内部カイ部位、リボソーム結合部位（例えば、ＩＲＥＳ）、未熟ポリＡ部位、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列および／または翻訳に関連する他のエレメントに関して最適化することができ；および／または、ＤＮＡ鋳型は、コドン文脈、コドン－アンチコドン相互作用、翻訳休止部位および／またはタンパク質フォールディングに関連する他のエレメントに関して最適化することができる。当技術分野で公知である最適化方法、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによるＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒおよびＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）を本発明で使用することができ、それはＵＳ２０１１００８１７０８に記載され、その内容を完全に参照によって本明細書に組み入れる。

一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つまたはそれ以上のエレメント、例えば鉄応答エレメントを含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さが約５０から５００ヌクレオチドの間であってよい。

一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置安定性に影響を及ぼすタンパク質のための結合部位、またはｍｉＲＮＡのための１つまたはそれ以上の結合部位の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが５０から５００ヌクレオチドの間またはそれ以上であってよい。

例示的な３’および／または５’ＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために、安定したｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストンおよびクエン酸回路酵素）に由来することができる。例えば、ヌクレアーゼ抵抗性を向上させるため、および／またはポリヌクレオチドの半減期を向上させるために、５’ＵＴＲ配列はＣＭＶ極初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列またはその断片を含むことができる。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列またはその断片の３’末端への組入れ、またはポリヌクレオチドをさらに安定させるポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の非翻訳領域の組入れも開示される。一般的に、これらの特徴は、そのような特徴のない同じポリヌクレオチドと比較してポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態学的特性（例えば、半減期）を向上させ、例としては、ｉｎ ｖｉｖｏヌクレアーゼ消化へのそのようなポリヌクレオチドの抵抗性を向上させる特徴が含まれる。

一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡのキャッピングは、別々の反応で実行される。そのような反応では、５’キャップは一般的に以下の通りに加えられる：先ず、ＲＮＡ末端ホスファターゼは５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを除去し、２つの末端リン酸基を残す；グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリル転移酵素を通して末端リン酸基に次に加えられ、５’５’５’三リン酸連結を生成する；グアニンの７窒素がメチルトランスフェラーゼによって次にメチル化される。キャップ構造の例には、限定されずに、ｔｏｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）、ｍ７（３’ＯＭｅＧ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡおよびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが含まれる。具体的な実施形態では、キャップ構造はｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）である。追加のキャップ構造は、参照によって本明細書に組み入れる、２０１７年２月２７日に出願された米国特許出願公開第２０１６／００３２３５６号および米国特許仮出願第６２／４６４，３２７号に記載される。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡを製造することは、完全長ｍＲＮＡ分子の大規模生産のための方法を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを製造することは、長さが５００ヌクレオチドより大きい完全長ｍＲＮＡ分子を富化させた組成物を生成するための方法を含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ分子の少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．０１％、９９．０５％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％は完全長ｍＲＮＡ分子である。

一部の実施形態では、組成物またはバッチは、少なくとも２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１０００ｋｇまたはそれ以上のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液は、少なくとも１００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、１ｋｇ、１０ｋｇ、１００ｋｇ、１メートルトンまたは１０メートルトンのｍＲＮＡ、またはその間の任意の量を含む。一実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液は、少なくとも２５０ｇのｍＲＮＡを含む。別の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液は、少なくとも５００ｇのｍＲＮＡを含む。特定の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液は、１ｋｇより多くのｍＲＮＡを含む。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡ分子は長さが６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００またはそれ以上のヌクレオチドであり；その間の任意の長さを有するｍＲＮＡも本発明に含まれる。

ｍＲＮＡの沈殿
本発明の方法により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは沈殿して沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を提供し、そのためそれは濾過遠心分離機によって夾雑物から分離することができる。懸濁液は、様々な夾雑物、例えばプラスミドＤＮＡおよび酵素を含むことができる。

ｍＲＮＡを沈殿させるために好適なあらゆる方法を、本発明を実施するために使用することができる。

ｍＲＮＡを沈殿させるための薬剤
一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤、例えばアルコール、両親媒性ポリマー、バッファー、塩および／または界面活性剤の１つまたはそれ以上を加えることを含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤は、（ｉ）塩（例えば、カオトロピック塩）および（ｉｉ）アルコールまたは両親媒性ポリマーである。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤は塩である。高濃度の塩は、タンパク質および核酸の両方を水性溶液から沈殿させることが知られている。一部の実施形態では、複数の塩が使用される。一部の実施形態では、高濃度の塩は、両端値を含めて１Ｍから１０Ｍの間であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は、両端値を含めて２Ｍから９Ｍの間であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は、両端値を含めて２Ｍから８Ｍの間であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は、両端値を含めて２Ｍから５Ｍの間であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は１Ｍより高い濃度であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は２Ｍより高い濃度であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は３Ｍより高い濃度であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は４Ｍより高い濃度であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は５Ｍより高い濃度であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は６Ｍより高い濃度であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は７Ｍより高い濃度であってよい。一部の実施形態では、高濃度の塩は８Ｍより高い濃度であってよい。一部の実施形態では、単一の塩が使用される。一部の実施形態では、塩は２～４Ｍ、例えば２．５～３Ｍの最終濃度である。特定の実施形態では、塩は約２．７Ｍの最終濃度である。

一部の実施形態では、塩はカルシウム塩、鉄塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩またはその組合せであってよい。一部の実施形態ではｍＲＮＡの沈殿を促進する薬剤としての使用に好適な例示的な具体的な塩には、限定されずに、塩化カリウム（ＫＣｌ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化リチウム（ＬｉＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）、臭化リチウム（ＬｉＢｒ）が含まれる。一部の実施形態では、不純調製物は、変性剤塩化カリウム（ＫＣｌ）にさらされる。一部の実施形態では、ＫＣｌは、生じるＫＣｌ濃度が約１Ｍまたはそれ以上であるように加えられる。一部の実施形態では、ＫＣｌは、生じるＫＣｌ濃度が約２Ｍもしくはそれ以上、３Ｍもしくはそれ以上、４Ｍもしくはそれ以上、または５Ｍもしくはそれ以上であるように加えられる。

一部の実施形態では、塩はカオトロピック塩である。カオトロピック剤は、水素結合およびファンデルワールス力などの非共有力に干渉することによって、タンパク質および核酸などの高分子の構造を破壊する物質である。一部の実施形態では、カオトロピック塩は２～４Ｍ、例えば２．５～３Ｍの最終濃度である。特定の実施形態では、カオトロピック塩は約２．７Ｍの最終濃度である。

一部の実施形態では、塩（例えば、チオシアン酸グアニジン（ＧＳＣＮ）などのカオトロピック塩）は、混入タンパク質を変性および可溶化するためにｍＲＮＡ含有懸濁液に加えられる。したがって、一実施形態では、ＧＳＣＮが懸濁液中の塩である。これの後に、ｍＲＮＡを選択的に沈殿させるために両親媒性ポリマーまたはアルコールの付加が続く。ｍＲＮＡの沈殿の後、生じる沈殿したｍＲＮＡは濾過遠心分離機に投入されてフィルターで保持され、それは洗浄されて混入物、例えば、短い不全型のＲＮＡ種、長い不全型のＲＮＡ種、ｄｓＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、残留ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写酵素、残留塩および残留溶媒のない沈殿物をもたらす。沈殿したｍＲＮＡの可溶化バッファー、例えば水による以降の溶解は、精製されたｍＲＮＡ組成物をもたらす。

したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つの薬剤は、カオトロピック塩、例えばチオシアン酸グアニジン（例えば、約１～５Ｍのチオシアン酸グアニジンを含む溶液）を含む。例えば、溶液は、約１Ｍ、１．５Ｍ、２．０Ｍ、２．５Ｍ、３．０Ｍ、３．５Ｍ、４．０Ｍ、４．５Ｍ、または約５Ｍのカオトロピック塩、例えばＧＳＣＮを含む。好適なＧＳＣＮバッファーの例には、例えば、４Ｍのチオシアン酸グアニジン、２５ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ６．５、０．５％のＮ－ラウロイルサルコシンナトリウム塩を含む水性溶液が含まれる。ＧＳＣＮバッファーのさらなる例は、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）バッファー中に５ＭのＧＳＣＮを含む水性溶液である。一部の実施形態では、ＧＳＣＮは２～４Ｍの最終濃度である。一部の実施形態では、ＧＳＣＮ（例えば５Ｍ ＧＳＣＮ－１０ｍＭ ＤＴＴバッファー）は２．５～３Ｍの最終濃度である。特定の実施形態では、ＧＳＣＮは約２．７Ｍの最終濃度である。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進するために２つの薬剤が使用され、１つの薬剤はチオシアン酸グアニジン（例えば、ＧＳＣＮバッファーなどのチオシアン酸グアニジンの水性溶液）を含み、第２の薬剤は、アルコールなどの揮発性の有機溶媒（例えば、エタノール）または両親媒性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む。実施形態では、２つの薬剤は、逐次的にまたは同時に使用される。実施形態では、本方法はチオシアン酸グアニジン、および（ｉ）アルコール（例えば、無水エタノールまたは水性エタノールなどのアルコールの水性溶液）または（ｉｉ）両親媒性ポリマー（例えば、約４０００～約８０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有し、一般的に水性溶液に約１０％～約２０％（重量／容量）の最終濃度のＰＥＧ）を含む溶液（例えば、ＧＳＣＮバッファー）の使用を含む。一般的な実施形態では、溶液は濾過助剤（例えばセルロースをベースとした濾過助剤、例えば、Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ）をさらに含む。濾過助剤は、沈殿したｍＲＮＡと約１０：１の質量比で最終溶液中に存在することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させるときに濾過助剤は使用されない。一部の実施形態では、濾過助剤は、沈殿したｍＲＮＡを含む水性懸濁液に加えられる。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤には、アルコール（例えば、無水エタノールなどのエタノール）などの揮発性の有機溶媒が含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤は、アルコールの水性溶液（例えば、水性エタノール）である。実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤は、無水エタノールである。

一部の実施形態では、最終懸濁液は、アルコールなどの揮発性の有機溶媒を含む。好適なアルコールには、エタノール、イソプロピルアルコールおよびベンジルアルコールが含まれる。一般的に、最終懸濁液は、アルコール（例えば、エタノール）を約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％重量／容量の濃度で含む。一部の実施形態では、最終懸濁液は、アルコール（例えば、エタノール）を約５０％未満、４０％、３０％、２０％または１０％重量／容量の濃度で含む。特定の実施形態では、最終懸濁液は、アルコール（例えば、エタノール）を約５０％重量／容量の濃度で含む。

一部の実施形態では、懸濁液は、非常に可燃性であり、したがって施設に保管することができる量に対する安全性の規制がかけられる揮発性の有機溶媒を含まず、特にアルコールを含まない。具体的な実施形態では、洗浄バッファーは、エタノールなどのアルコールの代わりに両親媒性ポリマーを含む。本発明の無アルコール（特に、無エタノール）方法のための好適な両親媒性ポリマーは、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、本明細書の方法で使用される両親媒性ポリマーには、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはその組合せが含まれる。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、以下の１つまたはそれ以上から選択される：ＰＥＧトリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ ２００、ＰＥＧ ３００、ＰＥＧ ４００、ＰＥＧ ６００、ＰＥＧ １，０００、ＰＥＧ １，５００、ＰＥＧ ２，０００、ＰＥＧ ３，０００、ＰＥＧ ３，３５０、ＰＥＧ ４，０００、ＰＥＧ ６，０００、ＰＥＧ ８，０００、ＰＥＧ １０，０００、ＰＥＧ ２０，０００、ＰＥＧ ３５，０００およびＰＥＧ ４０，０００またはその組合せ。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは２種類またはそれ以上の分子量のＰＥＧポリマーの混合物を含む。例えば、一部の実施形態では、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１または、１２の分子量ＰＥＧポリマーは、両親媒性ポリマーを含む。したがって、一部の実施形態では、ＰＥＧ溶液は１つまたはそれ以上のＰＥＧポリマーの混合物を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧポリマーの混合物は、異なる分子量を有するポリマーを含む。

一部の実施形態では、懸濁液中のｍＲＮＡを沈殿させることは、１つまたはそれ以上の両親媒性ポリマーを含む。一部の実施形態では、懸濁液中のｍＲＮＡを沈殿させることは、ＰＥＧポリマーを含む。様々な種類のＰＥＧポリマーが当技術分野で認識され、その幾つかは異なる幾何構成を有する。本明細書の方法のために好適なＰＥＧポリマーには、例えば、線状、分枝状、Ｙ形またはマルチアームの構成を有するＰＥＧポリマーが含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧは、異なる幾何構成の１つまたはそれ以上のＰＥＧを含む懸濁液中にある。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＰＥＧ－６０００を使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＰＥＧ－４００を使用して達成することができる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、約４０００～約８０００ｇ／ｍｏｌ、例えば約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ（例えばＰＥＧ－６０００）を、一般的に約１０％～約２０％（重量／容量）の最終濃度で使用して達成することができる。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにトリエチレングリコール（ＴＥＧ）を使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにトリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）を使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにｔｅｒｔ－ブチル－ＴＥＧ－Ｏ－プロピオネートを使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＴＥＧ－ジメタクリレートを使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＴＥＧ－ジメチルエーテルを使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＴＥＧ－ジビニルエーテルを使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＴＥＧ－モノブチルエーテルを使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＴＥＧ－メチルエーテルメタクリレートを使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＴＥＧ－モノデシルエーテルを使用して達成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡを沈殿させるためにＴＥＧ－ジベンゾエートを使用して達成することができる。ｍＲＮＡを沈殿させるために、これらのＰＥＧまたはＴＥＧをベースとした試薬のいずれか１つをグアニジニウムチオシアネートと組み合わせて使用することができる。これらの試薬の各々の構造は、下の表Ａに示す。

一部の実施形態では、懸濁液中のｍＲＮＡを沈殿させることはＰＥＧポリマーを含み、ＰＥＧポリマーはＰＥＧ修飾脂質を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセリン、メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ＤＯＰＡ－ＰＥＧコンジュゲートである。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、ポロキサマー－ＰＥＧコンジュゲートである。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＤＯＴＡＰを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はコレステロールを含む。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、両親媒性ポリマーを含む懸濁液中で沈殿させる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、前記のＰＥＧ試薬のいずれかを含む懸濁液中で沈殿させる。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１０％～約１００％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。例えば、一部の実施形態では、ＰＥＧは約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％重量／容量の濃度、およびその間の任意の値で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約６％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約７％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約８％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約９％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１０％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１２％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１８％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約２０％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約２５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約３０％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約３５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約４０％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約４５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５０％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約５５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約６０％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約６５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約７０％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約７５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約８０％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約８５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約９０％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約９５％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは約１００％重量／容量の濃度で懸濁液中に存在する。

一部の実施形態では、懸濁液中のｍＲＮＡを沈殿させることは、ＰＥＧと全ｍＲＮＡ懸濁液容量との約０．１～約５．０の容量：容量比を含む。例えば、一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０の容量：容量比で存在する。したがって、一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．１の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．２の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．３の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．４の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．６の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．７の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．８の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約０．９の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約１．０の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約１．２５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約１．５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約１．７５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約２．０の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約２．２５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約２．５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約２．７５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約３．０の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約３．２５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約３．５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約３．７５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約４．０の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約４．２５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約４．５０の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約４．７５の容量：容量比で存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約５．０の容量：容量比で存在する。特定の実施形態では、ＰＥＧはｍＲＮＡ懸濁液中に約１．０、約１．５または約２．０の容量：容量比で存在する。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿のための反応容量は、ＧＳＣＮおよびＰＥＧを含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡ沈殿のための反応容量は、約４０００～約８０００ｇ／ｍｏｌ、例えば約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＧＳＣＮおよびＰＥＧ（例えばＰＥＧ－６０００）を含む。ＧＳＣＮは、一般的に２Ｍから４Ｍの間の最終濃度である。ＰＥＧは、一般的に約１０％～約２０％（重量／容量）の最終濃度である。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約２から４Ｍの間の最終濃度のＧＳＣＮ；約４０００～約８０００ｇ／ｍｏｌ、例えば約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、約５％から約２０％の間（重量／容量）の最終濃度のＰＥＧ（例えばＰＥＧ－６０００）；および、沈殿したｍＲＮＡと約２：１、約５：１、約１０：１または約１５：１の質量比の濾過助剤（例えばセルロースをベースとした濾過助剤）を含む懸濁液中で沈殿させる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約２．５～３Ｍの最終濃度のＧＳＣＮ；約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、約１０％から約１５％の間（重量／容量）の最終濃度のＰＥＧ（例えばＰＥＧ－６０００）；および、沈殿したｍＲＮＡと約１０：１の質量比の濾過助剤（例えばセルロースをベースとした濾過助剤）を含む懸濁液中で沈殿させる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、約２．７Ｍの最終濃度のＧＳＣＮ；約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、約１２％（重量／容量）の最終濃度のＰＥＧ（例えばＰＥＧ－６０００）；および、沈殿したｍＲＮＡと約１０：１の質量比の濾過助剤（例えばセルロースをベースとした濾過助剤、例えば、Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ）を含む懸濁液中で沈殿させる。例で示すように、ｍＲＮＡ、塩およびＰＥＧのこれらの濃度を含む懸濁液は、本発明の方法でｍＲＮＡの非常に有効な精製を達成する。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液を提供するために、ＰＥＧの代わりにＭＴＥＧを使用することができる。特定の実施形態では、ＭＴＥＧは約１５％～約４５％重量／容量の最終濃度でこの目的のために使用される。一部の実施形態では、懸濁液は約２０％～約４０％重量／容量の最終濃度のＭＴＥＧを含む。一部の実施形態では、懸濁液は約２０％重量／容量の最終濃度のＭＴＥＧを含む。一部の実施形態では、懸濁液は約２５％重量／容量の最終濃度のＭＴＥＧを含む。一部の実施形態では、懸濁液は約３０％重量／容量の最終濃度のＭＴＥＧを含む。一部の実施形態では、懸濁液は約３５％重量／容量の最終濃度のＭＴＥＧを含む。一部の実施形態では、懸濁液は３５％重量／容量未満の最終濃度のＭＴＥＧを含む。ＭＴＥＧによって誘導された沈殿で使用された残りの条件は、ＰＥＧによって誘導された沈殿で使用されたものと同じである。本発明の方法でｍＲＮＡの効率的な回収のために、沈殿したｍＲＮＡと約１０：１の質量比の濾過助剤（例えばセルロースをベースとした濾過助剤）に加えてｍＲＮＡ、ＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを含む懸濁液が特に好適であり、ＭＴＥＧは約２５％の最終濃度である。

例えば、ＧＳＣＮは４～８Ｍ溶液（例えば１０ｍＭのＤＴＴバッファー中の）として提供することができ、それは、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液を調製するために、ｍＲＮＡ（一般的に１ｍｇ／ｍｌの濃度）およびＭＴＥＧ（≧９７．０％の純度で入手可能）と次に組み合わされる。一部の実施形態では、懸濁液は沈殿したｍＲＮＡ、カオトロピック塩、例えばＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを、１：２～３：１～２の容量比で含む。一部の実施形態では、懸濁液は沈殿したｍＲＮＡ、カオトロピック塩、例えばＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを、１：２～２．５：１～２の容量比で含む。一部の実施形態では、懸濁液は沈殿したｍＲＮＡ、カオトロピック塩、例えばＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを、１：２．３：１～２の容量比で含む。特定の実施形態では、懸濁液は沈殿したｍＲＮＡ、ＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを、１：２．３：２の比で含む。特定の実施形態では、懸濁液は沈殿したｍＲＮＡ、ＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを、１：２．３：１．７の容量比で含む。特定の実施形態では、懸濁液は沈殿したｍＲＮＡ、ＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを、１：２．３：１の比で含む。例で示すように、ｍＲＮＡ、ＧＳＣＮおよびＭＴＥＧを１：２．３：１、１：２．３：１．７および１：２．３：２の容量比で含む懸濁液が、約９５％の最終濃度のＭＴＥＧ洗浄溶液と組み合わせた本発明の方法で精製されたｍＲＮＡを達成するために特に好適である－工程のこの組合せは、ｍＲＮＡの効率的な精製および回収を確実にする。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進するために２つの薬剤が使用され、１つの薬剤はチオシアン酸グアニジン（例えば、ＧＳＣＮバッファーなどのチオシアン酸グアニジンの水性溶液）を含み、第２の薬剤は両親媒性ポリマー（例えば、ＰＥＧおよび／またはＭＴＥＧ）を含む。一部の実施形態では、２つの薬剤は逐次的にまたは同時に使用される。一部の実施形態では、本方法は、チオシアン酸グアニジン（例えば、ＧＳＣＮバッファー）および両親媒性ポリマー（例えば、ＰＥＧおよび／またはＭＴＥＧ）を含む溶液の使用を含む。

一部の実施形態では、沈殿工程は、カオトロピック塩（例えば、チオシアン酸グアニジン）および／または両親媒性ポリマー（例えば、ＰＥＧおよび／またはＭＴＥＧ）および／またはアルコール溶媒（例えば、無水エタノールまたは水性エタノール溶液などのアルコールの水性溶液）の使用を含む。したがって、一部の実施形態では、沈殿工程はカオトロピック塩および両親媒性ポリマー、例えばＧＳＣＮおよびＰＥＧおよび／またはＭＴＥＧの使用をそれぞれ含む。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させるための懸濁液は、沈殿したｍＲＮＡ、塩およびＭＴＥＧを含む。一部の実施形態では、懸濁液はアルコール、例えばエタノールを含まない。

濾過助剤（分散剤を含む）
一部の実施形態では、濾過助剤は、本明細書に記載される方法（例えば、遠心分離中）において使用される。濾過助剤は、濾過遠心分離機を用いて沈殿したｍＲＮＡを精製するときに使用することができる。濾過助剤は、沈殿したｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルター上に保持するのを助け、濾過遠心分離機のフィルターの表面から保持されたｍＲＮＡの除去を容易にすることができる。

一部の実施形態では、濾過助剤は分散剤である。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡ組成物は、少なくとも１つの分散剤、例えば、灰、粘土、珪藻土、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、ポリマー、ポリマービーズ（例えば、ポリプロピレンビーズ、ポリスチレンビーズ）、塩（例えば、セルロース塩）、砂および糖の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、ポリマーは天然に存在するポリマー、例えば、セルロース（例えば、粉末セルロース繊維）である。

一部の実施形態では、本発明の方法での使用に適した濾過助剤はセルロースをベースとしている。実施形態では、セルロース濾過助剤は、粉末セルロース繊維（例えば、Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ（登録商標）またはＳｉｇｍａｃｅｌｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ２０）である。実施形態では、セルロース濾過助剤は、Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ（登録商標）１００ＮＦまたはＳｉｇｍａｃｅｌｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｔｙｐｅ ２０などの粉末セルロース繊維である。一部の実施形態では、セルロースをベースとしている濾過助剤は、約２０μｍの粒子サイズを有する。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡおよび濾過助剤（例えば、Ｓｏｌｋａ Ｆｌｏｃなどの粉末セルロース繊維）は、１：２；１：５；１：１０または１：１５の質量比である。特定の実施形態において、沈殿したｍＲＮＡおよび濾過助剤（例えば、Ｓｏｌｋａ Ｆｌｏｃのような粉末セルロース繊維）は、１：１０の質量比である。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、濾過助剤の不存在下で実行される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡ組成物は、濾過助剤を含まない。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿は、少なくとも１つの濾過助剤の存在下で実行される。

一部の実施形態では、濾過助剤は、ｍＲＮＡの沈殿後に得られるスラリーに添加される。

一部の実施形態では、精製方法は、保持された沈殿したｍＲＮＡから濾過助剤を分離するための１つまたはそれ以上の工程をさらに含むことができる。本方法は、水性媒体、例えば、水を用いてケークから沈殿および精製されたｍＲＮＡを可溶化し、可溶化されたｍＲＮＡを回収する工程を含み、一方、濾過助剤をフィルター上に保持し、例えば、濾過遠心分離機を用いる工程をさらに含むことができる。

保持された沈殿したｍＲＮＡの洗浄
洗浄バッファーの組成
ｍＲＮＡを精製する方法は、沈殿工程に必要な塩を除去し、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液中のあらゆる夾雑物を除去するために、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄する工程を含む。保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄する工程は、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄バッファーで洗浄する工程を伴う。用語「洗浄バッファー」および「洗浄溶液」は、本明細書中で互換的に使用することができる。

一部の実施形態では、洗浄バッファーは、アルコール、両親媒性ポリマー、バッファー、塩、および／または界面活性剤の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、洗浄バッファーは、アルコールまたは両親媒性ポリマーを含む。

一部の実施形態では、洗浄バッファーは、揮発性有機溶媒、例えば、アルコールを含む。適切なアルコールには、エタノール、イソプロピルアルコール、およびベンジルアルコールが含まれる。典型的には、洗浄バッファーは、アルコール（例えば、エタノール）を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％重量／容量の濃度で含む。一部の実施形態では、洗浄バッファーは、アルコール（例えば、エタノール）を約５０％、６０％、７０％、８０％または９０％重量／容量の濃度で含む。特定の実施形態では、洗浄バッファーは、アルコールを約８０％重量／容量の濃度で含む。特定の実施形態では、洗浄バッファー中のアルコールはエタノールである。

一部の実施形態では、洗浄バッファーは、揮発性有機溶媒を含まない、特にアルコールを含まないものであり、非常に引火性が高く、したがって、施設内で貯蔵することができる容量に対して安全上の制限をもたらす。特定の実施形態では、洗浄バッファーは、エタノールなどのアルコールの代わりに両親媒性ポリマーを含む。本発明のアルコール不含（特に、エタノール不含）方法に適した両親媒性ポリマーは、プルロニクス、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）、またはそれらの組合せから選択される。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、低分子量、特に約２００～６００ｇ／ｍｏｌを有するＰＥＧ）および特にトリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）は、本発明のアルコール不含（特に、エタノール不含）実施形態を行うのに特に適している。

一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。したがって、一部の実施形態では、ＰＥＧ溶液（「ＰＥＧ洗浄溶液」）は、保持されたｍＲＮＡを洗浄するために使用される。ＰＥＧ洗浄溶液は、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１，０００、ＰＥＧ１，５００、ＰＥＧ２，０００、ＰＥＧ３，０００、ＰＥＧ３，３５０、ＰＥＧ４，０００、ＰＥＧ６，０００、ＰＥＧ８，０００、ＰＥＧ１０，０００、ＰＥＧ２０，０００、ＰＥＧ３５，０００、およびＰＥＧ４０，０００、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、トリエチレングリコールを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、テトラエチレングリコールを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ２００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ溶液は、ＰＥＧ３００を含む。一部の実施形態では、洗浄ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ４００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ６００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ１，０００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ１，５００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ２，０００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ３，０００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ３，３５０を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ４，０００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ６，０００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ８，０００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ１０，０００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ２０，０００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ３５，０００を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、ＰＥＧ４０，０００を含む。

一部の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧの分子量は、約１００～約１０００ｇ／ｍｏｌである。一部の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧの分子量は、約２００～約６０００ｇ／ｍｏｌである。一部の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧの分子量は、約１００ｇ／ｍｏｌ；２００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ２００）；３００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ３００）；４００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ４００）；５００ｇ／ｍｏｌ；６００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ６００）または１０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ１０００）である。特定の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧの分子量は、約４００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ４００）である。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、９０センチストロークまたはそれ以下の粘度を有するＰＥＧを含む１つまたはそれ以上の洗浄を含む。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、８０センチストロークまたはそれ以下の粘度を有する。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、７０センチストロークまたはそれ以下の粘度を有する。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、６０センチストロークまたはそれ以下の粘度を有する。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、５０センチストロークまたはそれ以下の粘度を有する。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、４０センチストロークまたはそれ以下の粘度を有する。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、３０センチストロークまたはそれ以下の粘度を有する。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、２０センチストロークまたはそれ以下の粘度を有する。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用されるＰＥＧは、１０センチストロークまたはそれ以下の粘度を有する。液体溶液の粘度は、当該技術分野において周知である方法を用いて、例えば、粘度計を用いて、室温（例えば、約１８から２５℃の間）で測定することができる。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）を用いて達成することができる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）を用いて達成することができる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ｔｅｒｔ－ブチル－ＴＥＧ－Ｏ－プロピオネートを用いて達成することができる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－ジメタクリレートを用いて達成することができる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－ジメチルエーテルを用いて達成することができる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－ジビニルエーテルを用いて達成することができる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－モノブチルを用いて達成することができる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－メチルエーテルメタクリレートを用いて達成することができる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－モノデシルエーテルを用いて達成することができる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの洗浄は、ＴＥＧ－ジベンゾエートを用いて達成することができる。これらの試薬の各々の構造を上記の表Ａに示す。

一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液中のＰＥＧは、ＰＥＧ修飾脂質を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液中のＰＥＧは、ＰＥＧ修飾脂質１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセリン、メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ）である。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＤＯＰＡ－ＰＥＧコンジュゲートである。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はポロキサマー－ＰＥＧコンジュゲートである。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はＤＯＴＡＰを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質はコレステロールを含む。

一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、２種またはそれ以上の分子量のＰＥＧポリマーの混合物を含む。例えば、一部の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の分子量のＰＥＧポリマーは、ＰＥＧ洗浄溶液を含む。したがって、一部の実施形態では、ＰＥＧ洗浄溶液は、１つまたはそれ以上のＰＥＧポリマーの混合物を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧポリマーの混合物は、異なる分子量を有するポリマーを含む。

ＰＥＧ洗浄溶液において使用されるＰＥＧは、様々な幾何学的構成を有することができる。例えば、適切なＰＥＧポリマーには、直鎖状、分枝状、Ｙ字状、または複数アーム構成の形態を有するＰＥＧポリマーが含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧは、異なる幾何学的構成の１つまたはそれ以上のＰＥＧを含む懸濁液中にある。

一部の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、約１０％～約１００％重量／容量の濃度で存在する。一部の実施形態では、洗浄溶液中のＰＥＧは、約５０％～約９５％重量／容量の濃度で存在する。例えば、一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％重量／容量の濃度、およびその間の任意の値で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約２０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約２５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約３０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約３５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約４０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約４５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約５０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約５５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約６０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約６５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約７０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約７５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約８０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約８５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約９０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＰＥＧは、約１００％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。特定の実施形態では、ＰＥＧは、約９０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。

一部の実施形態では、洗浄バッファーは、約８０から１００％の間の濃度でＰＥＧ－４００を含む。したがって、一部の実施形態では、洗浄バッファーは、約８０％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。一部の実施形態では、洗浄バッファーは、約８５％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。一部の実施形態では、洗浄バッファーは、約９０％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。一部の実施形態では、洗浄バッファーは、約９５％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。一部の実施形態では、洗浄バッファーは、約１００％の濃度でＰＥＧ－４００を含む。

一部の実施形態では、ＰＥＧは、約９０％～約１００％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。特定の実施形態では、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４００）は、約９０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。実施例に示されるように、約９５％の約４００ｇ／ｍｏｌの分子量（例えば、ＰＥＧ－４００）を有するＰＥＧの最終濃度は、本発明の方法において、高収率であり、高純度のｍＲＮＡ試料をもたらした。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、両親媒性ポリマーを含む溶液中で洗浄される。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはＭＴＥＧである。一部の実施形態では、ＭＴＥＧは、約７５％から約９５％の間の重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＭＴＥＧは、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。一部の実施形態では、ＭＴＥＧは、約９０％～約１００％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。特定の実施形態では、ＭＴＥＧは、約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する。実施例に示すように、約９５％重量／容量のＭＴＥＧの最終濃度は、本発明の方法においてｍＲＮＡの高効率的な回収を達成した。

一部の実施形態では、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む洗浄溶液は、非水性成分、例えば、エタノール、イソプロピルアルコールまたはベンジルアルコールを含む。一部の実施形態では、捕捉されたｍＲＮＡを洗浄するために使用される洗浄溶液は水性である。したがって、一部の実施形態では、洗浄溶液は、非水性成分、特にアルコール、例えば、エタノール、イソプロピルアルコール、またはベンジルアルコールなどの揮発性有機溶媒を含まない。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０回を超えて洗浄することができる。したがって、一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で１回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で２回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で３回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で４回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で５回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で６回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で７回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で８回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で９回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で１０回洗浄される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、溶液、例えば、ＰＥＧまたはＭＴＥＧを含む溶液で１０回を超えて洗浄される。

一部の実施形態では、洗浄工程は、両親媒性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールまたはＭＴＥＧ）を含む溶液を使用する複数のすすぎサイクルを含む。一部の実施形態では、洗浄工程は、１つまたはそれ以上の別個の両親媒性ポリマーを含む溶液を使用する複数のすすぎを含む。一部の実施形態では、洗浄工程は、約１０％～約１００％の両親媒性ポリマーを含む溶液を使用して、複数のすすぎサイクルによって行うことができる。ある特定の実施形態では、複数のすすぎサイクルは、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、６サイクル、７サイクル、８サイクル、９サイクル、１０サイクルまたは１０を超えるサイクルを含む。

洗浄バッファーの容量
上で概説したように、本発明の方法は、従来技術の方法と比較して、減少した容量の洗浄バッファーを使用してｍＲＮＡを効率的であり、臨床グレードで精製することができる。したがって、本発明の方法の利点は、方法が、より少ない洗浄バッファーを使用して、より大きな商業的スケールでｍＲＮＡを精製するためのより多くのコストと時間効率の良い方法を可能にすることである。実施例において実証されるように、本発明の方法は、沈殿したｍＲＮＡに対してより低い力を発揮する減少した遠心分離速度を使用して、従来技術と比較して同等または改良されたｍＲＮＡ純度を達成するために、より少ない容量の洗浄バッファーを必要とする。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約８Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約７Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約６Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約５Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約４Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約３Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約２．５Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約２Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５Ｌの間である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約１Ｌの間である。特定の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、約０．５Ｌ／ｇまたはそれ以下である。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき８Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき７Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき６Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき５Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき４Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき３Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき２Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき１．５Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき１Ｌ未満である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき０．５Ｌ未満である。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５、１または０．５Ｌである。特定の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌまたはそれ以下である。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡを製造することは、ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）合成を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを製造することは、ｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程をさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程は、ｍＲＮＡの５’－キャッピングを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成は、ｍＲＮＡの５’－キャッピングおよび／または３’－テーリングを含む。一部の実施形態では、本発明の方法の工程（ａ）～（ｄ）は、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後に実行される。一部の実施形態では、本発明の方法の工程（ａ）～（ｄ）は、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後に、そしてｍＲＮＡの３’テーリングの別個の工程の後に再び実行される。一部の実施形態では、本発明の方法の工程（ａ）～（ｄ）は、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後に、そしてｍＲＮＡの５’－キャッピングの別個の工程の後に再び実行される。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ製造方法の各工程の後（例えば、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成、５’－キャッピングおよび／または３’－テーリングの後）に異なる。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ製造方法の異なる工程（例えば、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成、５’－キャッピングおよび／または３’－テーリングの後）の各々と同じである。

洗浄バッファーの容量は、本発明の精製方法の単一の運転で精製されるべきｍＲＮＡの総量に依存することができ、すなわち、工程（ａ）～（ｄ）の各々は、１回だけ実行される。一部の実施形態では、ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき８Ｌ未満、例えば、ｍＲＮＡ １ｇにつき６Ｌ未満、またはｍＲＮＡ １ｇにつき５Ｌ未満である。一部の実施形態では、ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約４Ｌの間である。特定の実施形態では、ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５Ｌの間であり、例えば、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌである。

一部の実施形態では、本発明の精製方法の１回を超える運転が実行される。例えば、ある特定の実施形態では、工程（ａ）～（ｄ）は、ＩＶＴ合成反応から得られたｍＲＮＡについて１回目に実行される。本方法を１回目に実行した後に得られた精製されたｍＲＮＡは、次に、キャッピング反応に供され、得られたキャップされたｍＲＮＡは、２回目の工程（ａ）～（ｄ）を実行することによって精製される。特定の実施形態では、テーリング反応は、キャッピング反応が実行されると同時に実行される。あるいは、本方法を１回目に実行した後に得られた精製されたｍＲＮＡは、次に、テーリング反応に供され、その結果テーリングされたｍＲＮＡは、２回目の工程（ａ）～（ｄ）を実行することによって精製される。特定の実施形態では、キャッピング反応は、テーリング反応が実行されると同時に実行される。

したがって、一部の実施形態では、ＩＶＴ合成の後および／またはｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき８Ｌ未満、例えば、ｍＲＮＡ １ｇにつき６Ｌ未満、またはｍＲＮＡ １ｇにつき５Ｌ未満である。一部の実施形態では、ＩＶＴ合成の後および／またはｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約４Ｌの間である。特定の実施形態では、ＩＶＴ合成の後および／またはｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌ／ｇからｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５Ｌの間であり、例えば、ｍＲＮＡ １ｇにつき約１Ｌである。特定の実施形態では、ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌである。特定の実施形態では、ｍＲＮＡの３’－テーリングおよび／またはキャッピングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌである。特定の実施形態では、ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後のならびに３’－テーリングおよび／または５’－キャッピングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約１Ｌである。

洗浄された保持された沈殿したｍＲＮＡを回収すること
したがって、本発明のｍＲＮＡを精製する方法は、保持された沈殿したｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルターから回収する工程を含む。保持された沈殿したｍＲＮＡの回収は、保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄バッファーを用いて洗浄した後に生じる。上で概説したように、沈殿したｍＲＮＡに減少された重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度の使用は、先行技術の方法と比較して、沈殿したｍＲＮＡのケークがよりコンパクト（すなわち、密度が低い）であることを保証する。これは、保持されたｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルターから収集しようとする場合に問題を引き起こし得る残留ヒール形成の可能性を減少させる。濾過助剤の使用は、その可能性をさらに減少させることができるが、本発明の改良を利用するためにその使用は必要ではない。したがって、本発明の方法は、フィルターを損傷することなく、複雑な技術を必要とせずに、精製方法の全収率を減少させるフィルター上の残留ｍＲＮＡ量を最小限にしながら、最大に保持されたｍＲＮＡをフィルターから容易に除去し得ることを確実にする。加えて、フィルターへの損傷を回避することにより、高価な交換が回避され、また、フィルターは、その後の精製方法において再利用することができることを確実にする。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡの回収は、濾過遠心分離機のフィルターから、場合により濾過助剤と組み合わせて、濾過遠心分離機のフィルターから保持された沈殿したｍＲＮＡを取り外し、場合により濾過助剤と組み合わせて、沈殿したｍＲＮＡの組成物を提供することによって行われる。沈殿したｍＲＮＡのこの組成物は、場合により濾過助剤と組み合わせて、（ｉ）貯蔵および／もしくは輸送されるか、または（ｉｉ）水性形態のｍＲＮＡを得るために、場合により濾過助剤と組み合わせて可溶化することができる。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡの回収は、濾過遠心分離機のフィルターから、場合により濾過助剤と組み合わせて、濾過遠心分離機のフィルターによって保持された沈殿したｍＲＮＡを可溶化し、場合により濾過助剤と組み合わせて、水性形態のｍＲＮＡを提供することを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの水溶液は、場合により濾過助剤と組み合わせて、遠心分離によって収集され、精製されたｍＲＮＡを提供し、場合により濾過助剤を濾過遠心分離機のフィルター上に保持することができる。

沈殿したｍＲＮＡの組成物を回収すること
一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルターから回収することは、保持された沈殿したｍＲＮＡを、場合により濾過助剤と組み合わせて、濾過遠心分離機のフィルターから取り外すことによって生じる。上で概説したように、沈殿したｍＲＮＡのより密度の低いケークは、場合により濾過助剤と組み合わせて、濾過遠心分離機のフィルターからより容易に取り外され、フィルターを損傷することなく、沈殿したｍＲＮＡの最大収率の回収を確実にする。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルターから回収する工程に先立って、保持された沈殿したｍＲＮＡを、場合により濾過助剤を用いて乾燥する工程を行う。一部の実施形態では、乾燥は、濾過遠心分離機における遠心分離を介する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物を乾燥するための遠心分離は、約３０ｇから約３５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度であり得る。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ組成物を乾燥するための遠心分離は、約１００ｇから約１５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度であり得る。

本発明の方法は、さらなる手動（自動化されていない）工程を必要とせずに、保持された沈殿したｍＲＮＡの最大量を回収するために、濾過遠心分離機内で刃（またはプラウ）を使用することを可能にする。したがって、一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを回収することは、濾過遠心分離機が運転中である間に生じる。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを回収することは、濾過遠心分離機のフィルターから保持された沈殿したｍＲＮＡを除去する刃（プラウ）を介して生じる。一部の実施形態では、刃は、濾過遠心分離機のフィルターから、保持された沈殿したｍＲＮＡの実質的に全てを除去する。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡは、濾過遠心分離機の試料排出チャネルを介して収集される。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡを回収することは、濾過遠心分離機が運転中でない間に生じる。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡは、例えば、別個の刃またはプラウを用いて、濾過遠心分離機のフィルターから手動で回収される。一部の実施形態では、フィルターが濾過遠心分離機から除去された後、保持された沈殿したｍＲＮＡは濾過遠心分離機のフィルターから回収される。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡは、遠心分離機ドアの開放時に、濾過遠心分離機のバスケットまたはドラムから直接回収される。

一部の実施形態では、回収された沈殿したｍＲＮＡは、濾過助剤と組み合わされる。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡの回収後、濾過遠心分離機をすすぐ。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡの回収後、濾過遠心分離機のフィルターを再利用する。

したがって、本発明の方法は、場合により濾過助剤と組み合わせて、大量の、回収された沈殿したｍＲＮＡを提供する。沈殿したｍＲＮＡのこのような組成物は容易に輸送され、固体形態で大量のｍＲＮＡに貯蔵され、より大量の水溶液中で同量のｍＲＮＡのより困難な輸送を回避する。したがって、本発明の方法は、夾雑物（濾過助剤を除く）、塩および溶媒／両親媒性ポリマーを実質的に含まない、容易に輸送および貯蔵することができる、沈殿したｍＲＮＡの組成物を提供する。適切な時点で、組成物中のｍＲＮＡを可溶化して、以下に詳細に概説するように、ｍＲＮＡを濾過助剤から分離して、精製されたｍＲＮＡを提供するために本発明のさらなる方法を使用できるようにすることができる。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡの回収は、精製された沈殿したｍＲＮＡの組成物を提供する。一部の実施形態では、精製された沈殿したｍＲＮＡの組成物は、輸送および長期貯蔵に適した形態である。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡの回収は、濾過助剤と組み合わせた沈殿したｍＲＮＡの組成物を提供する。一部の実施形態では、濾過助剤と組み合わせた沈殿したｍＲＮＡの組成物は、輸送および長期貯蔵に適した形態である。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの組成物は、本発明の任意の方法によって収集された沈殿したｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの組成物は、本発明の任意の方法によって調製された精製されたｍＲＮＡ沈殿物を含む。

したがって、本発明は、無菌のＲＮアーゼ不含容器内に、ｍＲＮＡ、両親媒性ポリマーおよび濾過助剤を約１：１：１０の相対濃度で含む組成物を提供する。一部の実施形態では、組成物は、１０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、６００ｇ、７００ｇ、８００ｇ、９００ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１メートルトン、１０メートルトンまたはそれ以上のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、約２０００～１００００ｇ／ｍｏｌ；４０００～８０００ｇ／ｍｏｌまたは約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－６０００）の分子量を有するＰＥＧを含む。他の実施形態では、両親媒性ポリマーはＭＴＥＧを含む。特定の実施形態では、濾過助剤はセルロースをベースとしている。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの組成物は、場合により濾過助剤を含むが、ｍＲＮＡの可溶化のために容器に移される。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの組成物の可溶化は、精製されたｍＲＮＡの水溶液を提供する。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡの組成物の可溶化は、濾過助剤と組み合わせてｍＲＮＡの水溶液を提供する。一部の実施形態では、水溶液中のｍＲＮＡは、濾過助剤から、例えば、濾過遠心分離機における遠心分離を介して分離されて、濾過助剤を濾過遠心分離機のフィルター上に保持することによって、精製されたｍＲＮＡを提供する。

洗浄された保持された沈殿したｍＲＮＡを可溶化形態で回収すること
上で概説したように、一部の実施形態では、洗浄され、保持された沈殿したｍＲＮＡは、場合により濾過助剤と組み合わせて、ｍＲＮＡを可溶化することによって濾過遠心分離機のフィルターから回収されて、場合により濾過助剤と組み合わせて、ｍＲＮＡの水溶液を提供する。したがって、一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、濾過遠心分離機内で可溶化され、濾過遠心分離機のフィルターから保持された沈殿したｍＲＮＡを回収する。上で概説したように、沈殿したｍＲＮＡに軽減された重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度の使用は、沈殿したｍＲＮＡのケークがよりコンパクトであり（すなわち、密度が低い）、保持された沈殿したｍＲＮＡをより容易に可溶化し、回収されたｍＲＮＡの収率を最大にすることを確実にする。

沈殿したｍＲＮＡを可溶化するための例示的な水性媒体は、以下に提供される。

一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡをフィルターから回収することは、（ｉ）保持された沈殿したｍＲＮＡを可溶化する工程と、（ｉｉ）可溶化されたｍＲＮＡを収集する工程とを含む。

一部の実施形態では、可溶化された形態の保持された沈殿したｍＲＮＡの回収は、精製されたｍＲＮＡの水溶液を提供する。一部の実施形態では、本発明の方法は、精製されたｍＲＮＡをｍＲＮＡの水溶液から、例えば、濾過遠心分離機における遠心分離を介して収集するさらなる工程を含む。一部の実施形態では、可溶化形態の保持された沈殿したｍＲＮＡの回収は、濾過助剤と組み合わせてｍＲＮＡの水溶液を提供する。一部の実施形態では、本発明の方法は、濾過助剤と組み合わせて、ｍＲＮＡの水溶液から精製されたｍＲＮＡを収集するさらなる工程、例えば、濾過助剤を濾過遠心分離機のフィルター上に保持することによって、濾過遠心分離機における遠心分離を介して収集する工程を含む。したがって、一部の実施形態では、可溶化された形態の保持された沈殿したｍＲＮＡを回収する工程は、可溶化されたｍＲＮＡを収集する工程、例えば、濾過遠心分離機における遠心分離を使用する工程を含む。精製されたｍＲＮＡを収集するための例示的な方法は、以下に詳細に概説される。

一部の実施形態では、可溶化形態の保持された沈殿したｍＲＮＡの回収は、濾過遠心分離機のフィルターからいずれもの残留の洗浄された保持された沈殿したｍＲＮＡを回収し、したがって、追加の工程を必要とせずに、方法において回収されたｍＲＮＡの収率を最大にする。一部の実施形態では、可溶化形態の保持された沈殿したｍＲＮＡの回収は、濾過遠心分離機のフィルターを再利用することを可能にする。

沈殿したｍＲＮＡを可溶化すること、および精製されたｍＲＮＡを収集すること
典型的には、精製されたｍＲＮＡは、沈殿したｍＲＮＡを水溶液に可溶化し、可溶化された精製されたｍＲＮＡを収集することによって（例えば、遠心分離機が運転中に濾過遠心分離機のフィルターを通して溶出することによって）収集することができる。上で概説したように、本発明の方法は、精製されたｍＲＮＡの回収率を有意に増加させる（最大１００％）ことができるため、有利である。沈殿したｍＲＮＡにおいて発揮される重力を減少させるために、より低い遠心分離速度を使用すると、より密度の低いケークが得られる。この沈殿したｍＲＮＡは、濃くないケーク内では、水溶液中でより容易に可溶化することができるが、これは、水溶液がケークをより容易かつ広範囲に浸透し、したがって、保持されたｍＲＮＡのより大きなパーセンテージを溶解することができるためである。したがって、本発明の方法は、精製されたｍＲＮＡの収率を増加させることを可能にする改良された可溶化効果を達成する。

沈殿したｍＲＮＡを可溶化すること
一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを可溶化することは、ｍＲＮＡを水性媒体に溶解することを含む。一部の実施形態では、水性媒体は水を含む。一部の実施形態では、水は、ＲＮアーゼ不含水（例えば、注射用水）である。一部の実施形態では、水性媒体はバッファーを含む。一部の実施形態では、バッファーは、ＴｒｉｓＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーまたはクエン酸ナトリウムバッファーである。一部の実施形態では、水性媒体は、糖溶液を含む。一部の実施形態では、糖溶液は、スクロースまたはトレハロース溶液である。一部の実施形態では、水溶液は、水と、（ｉ）バッファーまたは（ｉｉ）糖溶液との組合せを含む。

一部の実施形態では、水性媒体は注射用水である。特定の実施形態では、水性媒体はＴＥバッファーである。他の特定の実施形態では、水性媒体は１０％トレハロース溶液である。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを可溶化するための水性媒体は、それが精製されたｍＲＮＡのカプセル化に適合するために選択され、例えば、１０ｍＭクエン酸ナトリウムである。

一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを可溶化することは、濾過遠心分離機内で生じる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを可溶化することは、洗浄された保持された沈殿したｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルターから回収する。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡを可溶化することは、濾過遠心分離機の外側で生じ、例えば、濾過遠心分離機のフィルターから回収された沈殿したｍＲＮＡの組成物の可溶化である。一部の実施形態では、可溶化工程は、沈殿したｍＲＮＡの組成物を濾過遠心分離機のフィルターから回収する工程の後、濾過遠心分離機のフィルター上に保持された残留ｍＲＮＡを可溶化する工程を含むことができる。このようにして、最大量の保持されたｍＲＮＡを回収することができる。

精製されたｍＲＮＡを収集すること
一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡは、水溶液から収集され、任意の夾雑物、例えば、濾過助剤を実質的に含まない精製されたｍＲＮＡを提供する。一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡの収集は、可溶化されたｍＲＮＡから濾過助剤を分離する１つまたはそれ以上の工程を含む。一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡから濾過助剤を分離するための１つまたはそれ以上の工程は、可溶化されたｍＲＮＡおよび濾過助剤を含む溶液を多孔質基質（例えば、フィルター）に適用することを含み、濾過助剤は多孔質基質（例えば、フィルター）によって保持され、精製されたｍＲＮＡの溶液をもたらす。

一部の実施形態では、フィルターは、可溶化されたｍＲＮＡを通過させる一方で、不純物（孔径よりも大きいサイズを有する不溶性不純物、例えば、濾過助剤および／またはＰＥＧもしくはＭＴＥＧ沈殿物を含む）を捕捉するのに適した孔径を有する。一部の実施形態では、フィルターは、可溶化されたｍＲＮＡを通過させる一方で、濾過助剤（例えば、約２０μｍまたはそれ以上の粒子サイズを有するセルロースをベースとしている濾過助剤）を捕捉するのに適した孔径を有する。一部の実施形態では、フィルターは、可溶化されたｍＲＮＡを通過させる一方で、ＰＥＧまたはＭＴＥＧ沈殿物を捕捉するのに適した孔径を有する。例示的なフィルター孔径は上記に提供される。

一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡおよび濾過助剤を含む溶液は、遠心分離により濾過遠心分離機の多孔質基質（例えば、フィルター）に加えられる。一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡはフィルターを通過し、一方、濾過助剤はフィルターによって保持され、夾雑物を実質的に含まない精製されたｍＲＮＡを提供する。一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡはフィルターを通過し、濾過遠心分離機の１つまたはそれ以上の試料排出ポートを介して収集される。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡを収集する工程において使用されるフィルターは、沈殿したｍＲＮＡを保持し、洗浄しおよび回収する工程で使用されるフィルターと同じフィルターである。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡを収集する工程において使用されるフィルターは、沈殿したｍＲＮＡを保持し、洗浄しおよび回収する工程で使用されるものと比較して、新規なフィルターである。一部の実施形態では、フィルターは、本発明の方法の関連する工程に必要な孔径に従って選択され、例えば、沈殿したｍＲＮＡを捕捉するため、または可溶化されたｍＲＮＡを通過させるために適切な孔径を有する。したがって、本発明の方法は、沈殿したｍＲＮＡを保持し、洗浄しおよび回収する工程のための第１のフィルターと、精製されたｍＲＮＡを収集する工程のための第２のフィルターとを必要とすることができる。

一部の実施形態では、収集工程中の遠心分離速度は、３１００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、収集工程中の遠心分離速度は、約１０００ｇから約３０００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、収集工程中の遠心分離速度は、沈殿したｍＲＮＡを保持する工程および／または保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄する工程において使用されるものと同等の重力（ｇ）を発揮する。一部の実施形態では、濾過遠心分離機は、本発明の精製方法の投入工程（ｂ）および洗浄工程（ｃ）中に使用された収集工程の間に、同じ遠心分離速度で運転される。

一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡは、医薬組成物に適した形態、例えば、臨床グレードの純度を有する形態で収集される。

精製方法における任意の工程
本明細書に記載される方法は、当業者によって容易に修飾することができる。さらなる例示的な工程を含む例示的な修飾が本明細書に記載される。

一部の実施形態では、本発明の方法は、精製されたｍＲＮＡ溶液をさらに精製する工程（例えば、透析、透析濾過、および／または限外濾過）をさらに含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ溶液を１００ｋＤａ分画分子量（ＭＷＣＯ）膜を用いて１ｍＭクエン酸ナトリウムで透析する。

一部の実施形態では、本発明の方法は、合成の間またはその後に行われる。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製工程は、ｍＲＮＡ合成の各工程の後、場合により、透析、透析濾過、および／または限外濾過などの他の精製工程とともに、例えば、接線流濾過（ＴＦＦ）を用いて、実行することができる。例えば、ｍＲＮＡは、初期合成後（例えば、テールを有するかまたは有さない）ショートマーを除去するために、さらなる精製（例えば、透析、透析濾過、および／または限外濾過）を受けることができ、次に、本明細書に記載されるように沈殿および精製に供され、続いて、キャップおよび／またはテールの添加後、沈殿および精製によって再度精製することができる。実施形態では、さらなる精製は接線流濾過（ＴＦＦ）の使用を含む。

一部の実施形態では、本発明の方法は、精製されたｍＲＮＡをリポソーム中にカプセル化するさらなる工程を含むことができる。一部の実施形態では、この工程は、精製されたｍＲＮＡのさらなる濃縮および／または精製を必要とし得る。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡをリポソーム中にカプセル化するさらなる工程は、精製されたｍＲＮＡをカプセル化に適合する水性媒体中に可溶化することができるため、本発明の方法の可溶化および収集工程の直後に実行することができる。

本発明の方法で使用するためのシステムおよび方法
本発明はまた、ｍＲＮＡを精製するためのシステムを提供し、システムは：ａ）沈殿したｍＲＮＡを受けるための第１の容器；ｂ）洗浄バッファーを受けるための第２の容器；ｃ）洗浄された沈殿したｍＲＮＡおよび／または沈殿したｍＲＮＡを可溶化するための水性媒体を受けるための第３の容器；ｄ）以下を含む濾過遠心分離機：
ｉ）沈殿したｍＲＮＡおよび／または濾過助剤を保持し、可溶化されたｍＲＮＡを通過させるように配置され、寸法を合わせたフィルター；
ｉｉ）試料供給ポート；および
ｉｉｉ）試料排出ポート；
ｅ）濾過遠心分離機の試料排出ポートに連結される、精製されたｍＲＮＡを受けるための第４の容器；ｆ）約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度でシステムの中を通して流れを導くように構成されるポンプであって；第１の容器、第２の容器および第３の容器はポンプのインプットに作動可能に連結され、濾過遠心分離機の試料供給ポートはポンプのアウトプットに連結される、ポンプ；ならびにｇ）第１、第２および第３の容器からの同時の流れを妨げるように構成される１つまたはそれ以上の弁を含む。

一部の実施形態では、第３および第４の容器は、システムの任意の構成要素であり、例えば、保持された沈殿したｍＲＮＡの組成物を回収するためのシステムである（図３の（２４）を参照されたい）。したがって、本発明はまた、ｍＲＮＡを精製するためのシステムを提供し、システムは：ａ）沈殿したｍＲＮＡを受けるための第１の容器；ｂ）洗浄バッファーを受けるための第２の容器；ｃ）以下を含む濾過遠心分離機：
ｉ）沈殿したｍＲＮＡおよび／または濾過助剤を保持し、可溶化されたｍＲＮＡを通過させるように配置され、寸法を合わせたフィルター；
ｉｉ）試料供給ポート；および
ｉｉｉ）試料排出ポート；
ｄ）約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度でシステムの中を通して流れを導くように構成されるポンプであって；第１の容器および第２の容器はポンプのインプットに作動可能に連結され、濾過遠心分離機の試料供給ポートはポンプのアウトプットに連結される、ポンプ；ならびにｅ）第１および第２の容器からの同時の流れを妨げるように構成される１つまたはそれ以上の弁を含む。

一部の実施形態では、ポンプは、濾過遠心分離機のフィルターの表面積（ｍ^２）の関数として決定される速度で、システムの中を通して流れを導くように構成される。一部の実施形態では、ポンプは、約１０リットル／分／ｍ^２～約２０リットル／分／ｍ^２の速度でシステムの中を通して流れを導くように構成される。一部の実施形態では、ポンプは、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５リットル／分／ｍ^２の速度でシステムの中を通して流れを導くように構成される。特定の実施形態では、ポンプは、約１５リットル／分／ｍ^２またはそれ以下の速度でシステムの中を通して流れを導くように構成される。

本発明のシステムの一部の実施形態では、システムは、本発明の方法のいずれかを行うためにシステムを制御する手段を含むデータ処理装置をさらに含む。一部の実施形態では、データ処理装置は、（ａ）命令を含むコンピュータプログラム、または（ｂ）命令を含むコンピュータ可読記憶媒体である。

このシステムは、次の方法を用いて運転することができる：沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を第１の容器に提供する。沈殿したｍＲＮＡは、上記のように沈殿工程によって調製することができる。沈殿したｍＲＮＡは、（例えば、上記される１つまたはそれ以上の合成工程を用いることによって）それを製造することからの１つまたはそれ以上のタンパク質および／または短い不全型の転写夾雑物を含む。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を介して製造される。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡ調製物を、キャッピングおよび／またはテーリングされたｍＲＮＡを製造するために、上記されるキャッピングおよび／またはテーリング工程に供することができる。沈殿したｍＲＮＡを精製するために、洗浄バッファーを第２の容器に提供する。第１の容器の内容物は、図３～５に概略的に示されるように、フィルターを含む濾過遠心分離機に移される。この移動は、沈殿したｍＲＮＡが濾過遠心分離機のフィルター上に保持されるように、濾過遠心分離機が第１の遠心分離速度で運転中である間に約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度で生じ得る。第２の容器の内容物を濾過遠心分離機に移し、それによって、前記濾過遠心分離機のフィルター上に保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄する。この移動は、濾過遠心分離機が第１の遠心分離速度でそのまま運転中である間に約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度で生じ、それによって、沈殿したｍＲＮＡを洗浄バッファーで洗浄する。洗浄工程が完了すると、洗浄された沈殿したｍＲＮＡは、濾過遠心分離機のフィルターから回収され、例えば、濾過遠心分離機の試料排出チャネルを介して沈殿したｍＲＮＡの組成物を提供することができる（図３の（２４）を参照されたい）。移動は、ポンピングによって行うことができる。一部の実施形態では、ポンピングは、第１および第２の容器に作動可能に連結される単一のポンプによって実行される。

一部の実施形態では、ポンプは、沈殿したｍＲＮＡおよび／または洗浄バッファーを含む懸濁液を濾過遠心分離機に約１０リットル／分／ｍ^２～約２０リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度で提供するために、１つまたはそれ以上の容器から物質を移すように構成される。一部の実施形態では、移動速度は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５リットル／分／ｍ^２である。特定の実施形態では、移動速度は、約１５リットル／分／ｍ^２またはそれ以下である。

一部の実施形態では、懸濁液および／または洗浄バッファーの全容量は、約０．５時間から約８時間の間、例えば、約２時間から約６時間の間に濾過遠心分離機に投入される。一部の実施形態では、全容量は、約８時間未満、約７時間未満、約６時間未満、約５時間未満、約４時間未満、約３時間未満、約２時間未満、約１時間未満、または約０．５時間未満で濾過遠心機に投入される。一部の実施形態では、懸濁液、洗浄バッファーおよび／または可溶化バッファーの全容量を濾過遠心分離機に投入するのに要する時間は、上記濾過遠心分離機のローターサイズ（すなわちバスケット直径）に依存することができ、例えば、約５０ｃｍのローターサイズを有する濾過遠心分離機に沈殿した１０００ｇのｍＲＮＡ懸濁液の全容量を投入するのに約３時間を要することがある（表Ｄを参照されたい）。一部の実施形態では、洗浄バッファーの全容量は、約０．５時間から約４時間の間に、例えば、約３０ｃｍから約１７０ｃｍのローターサイズ（すなわちバスケット直径）を有する濾過遠心分離機を使用することによって、濾過遠心分離機に投入される。一部の実施形態では、洗浄バッファーの全容量は、約４時間未満、約３時間未満、約２時間未満、約１時間未満、または約０．５時間未満で濾過遠心分離機に投入される。例えば、本発明者らは、約５０ｃｍのローターサイズを有する濾過遠心分離機を用いて、約８０分間に５００リットルの洗浄バッファーを用いて（すなわち、６Ｌ／分または１５Ｌ／分／ｍ^２の洗浄バッファー投入速度で）、１０００ｇのｍＲＮＡのバッチについて不純物除去を達成した（表Ｄを参照されたい）。

一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の弁が、第１の容器および第２の容器からの移動を制御する。一部の実施形態では、第１の容器の内容物および第２の容器の内容物は、試料供給ポートを介して濾過遠心分離機に移される。一部の実施形態では、濾過遠心分離機のフィルターは、洗浄された沈殿したｍＲＮＡが濾過遠心分離機のフィルターから覆われた後、１％の１０Ｎ ＮａＯＨを含む注射用水ですすがれる。

一部の実施形態では、洗浄された沈殿したｍＲＮＡをフィルターから回収することは、保持された沈殿したｍＲＮＡを可溶化し、可溶化されたｍＲＮＡを収集する工程を含む。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは濾過助剤を含む。したがって、一部の実施形態では、本方法は：ｉ）濾過助剤を含む洗浄された沈殿したｍＲＮＡ、例えば、洗浄工程後に濾過遠心分離機から回収された沈殿したｍＲＮＡの組成物を、例えば、洗浄された沈殿したｍＲＮＡおよび／または沈殿したｍＲＮＡを可溶化するための水性媒体を受けるための第３の容器において可溶化する工程；ｉｉ）工程（ｉ）から可溶化されたｍＲＮＡを、約０．１リットル／分～約５リットル／分の速度で遠心分離機に移す工程であって、濾過遠心分離機が、濾過助剤を保持するフィルターを含む工程；およびｉｉｉ）遠心分離により、濾過遠心分離機から可溶化された精製されたｍＲＮＡを、例えば、精製されたｍＲＮＡを受けるための第４の容器に収集する工程をさらに含む。工程（ｉｉ）における濾過遠心分離機は、沈殿したｍＲＮＡを洗浄するために使用された同じ濾過遠心分離機、または異なる濾過遠心分離機であり得る。一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡは、試料供給ポートを介して濾過遠心分離機に移される。

一部の実施形態では、工程（ｉｉ）における移すことはポンピングによる。一部の実施形態では、ポンプは、約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度で、可溶化されたｍＲＮＡを濾過遠心分離機に移すように構成される。一部の実施形態では、移動速度は、約１０リットル／分／ｍ^２～約２０リットル／分／ｍ^２である。一部の実施形態では、移動速度は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５リットル／分／ｍ^２である。特定の実施形態では、移動速度は、約１５リットル／分／ｍ^２またはそれ以下である。一部の実施形態では、可溶化されたｍＲＮＡの全容量は、約１分から約９０分の間に濾過遠心分離機に投入される。一部の実施形態では、全容量は、約９０分未満、約８０分未満、約７０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約３０分未満、約２０分未満、約１０分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、約２分未満または約１分未満で濾過遠心分離機に投入される。

一部の実施形態では、工程（ｉｉｉ）において収集された可溶化された精製されたｍＲＮＡは、ポンピングによりさらなる容器に移される。一部の実施形態では、ポンピングは、可溶化された精製されたｍＲＮＡを含有する容器、および／または可溶化された精製されたｍＲＮＡを収集する容器に作動可能に連結される単一のポンプによる。一部の実施形態では、可溶化された精製されたｍＲＮＡを移すことは、濾過遠心分離機の試料排出ポートを介して行われる。一部の実施形態では、ポンプは、濾過遠心分離機から収集された可溶化された精製されたｍＲＮＡを、約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度で、例えば、約１５リットル／分／ｍ^２またはそれ以下で、可溶化された精製されたｍＲＮＡを収集するための容器に移すように構成される。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの全容量は、約１分から約９０分の間に濾過遠心分離機から回収される。一部の実施形態では、全容量は、約９０分未満、約８０分未満、約７０分未満、約６０分未満、約５０分未満、約３０分未満、約２０分未満、約１０分未満、約５分未満、約４分未満、約３分未満、約２分未満または約１分未満で濾過遠心分離機から回収される。

一部の実施形態では、本方法の工程（ｉｉ）において使用されるフィルターは、沈殿したｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルター上に保持するために使用されるものと同じフィルターである。一部の実施形態では、フィルターは、その後の精製ラウンドのために再利用することができる。したがって、本発明の方法はフィルターの交換を必要としないため、本発明の方法は、ｍＲＮＡの大規模精製を効率的に達成する効率的な方法を提供するのに特に適している。これは、本方法の工程（ｉｉ）において使用されるフィルター（すなわち、可溶化されたｍＲＮＡを通過させながら濾過助剤を捕捉するため）は、濾過遠心分離機のフィルター上の濾過助剤と組み合わせて沈殿したｍＲＮＡを保持するために使用されるものと同じフィルターであるためである。

一部の実施形態では、本発明の方法は、沈殿したｍＲＮＡの懸濁液が場合により濾過助剤を含まないため、フィルターの交換を必要としない。したがって、沈殿したｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルターから回収する工程は、沈殿したｍＲＮＡを可溶化する際に精製されたｍＲＮＡを提供する。したがって、本発明の方法は、ｍＲＮＡを精製する、より簡単な方法を提供する。さらに、本発明の方法は、フィルターを交換する必要なく、ｍＲＮＡ精製のサイクルを繰り返すことを可能にし、したがって、大規模なｍＲＮＡを精製するコストおよび負担を減少させる。

本発明の方法を用いて使用するための例示的なシステムおよび方法は、図３～５に概説される。

本明細書に記載される方法に適切な核酸
ｍＲＮＡの長さ
種々の実施形態によれば、本発明は、種々の長さのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製するために使用される。一部の実施形態では、本発明は、長さが約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、または２０ｋｂまたはそれ以上であるｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製するために使用することができる。一部の実施形態では、本発明は、長さが約１～２０ｋｂ、約１～１５ｋｂ、約１～１０ｋｂ、約５～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、約５～１２ｋｂ、約５～１０ｋｂ、約８～２０ｋｂ、または約８～１５ｋｂの範囲であるｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されたｍＲＮＡを精製するために使用することができる。例えば、典型的なｍＲＮＡは、長さが約１ｋｂ～約５ｋｂであり得る。より典型的には、ｍＲＮＡは、約１ｋｂ～約３ｋｂの長さを有する。しかしながら、一部の実施形態では、本発明の組成物中のｍＲＮＡは、はるかに長い（約２０ｋｂより大きい）。

ｍＲＮＡ修飾
一部の実施形態では、本発明は、安定性を一般的に増強する１つまたはそれ以上の修飾を含有するｍＲＮＡを精製するために使用される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上の修飾は、修飾されたヌクレオチド、修飾された糖リン酸骨格、５’および／または３’非翻訳領域から選択される。一部の実施形態では、本発明は未修飾のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡを精製するために使用される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはヌクレオチド修飾を含まない。

一般的に、ｍＲＮＡは、安定性を増強するように修飾される。ｍＲＮＡの修飾には、例えば、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾を含めることができる。したがって、本発明による修飾されたｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾を含むことができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡをコードする抗体（例えば、ｍＲＮＡをコードする重鎖および軽鎖）は、プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、ならびに修飾されたヌクレオチドとして、プリンおよびピリミジンの類似体または誘導体、例えば１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、プソイドウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－プソイドウラシル、ケオシン、ベータ－Ｄ－マンノシル－ケオシン、ワイブトキソシン、およびホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシンおよびイノシンを限定されずに含む、天然に存在するヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾されたヌクレオチド）から合成することができる。そのような類似体の調製は、例えば米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号および５，７００，６４２号から当業者に公知であり、その開示は参照により完全にここに含まれる。

一般的に、ｍＲＮＡの合成は、Ｎ末端（５’）末端の「キャップ」およびＣ末端（３’）末端の「テール」の付加を含む。ほとんどの真核生物の細胞で見出されるヌクレアーゼへの抵抗性を提供することにおいて、キャップの存在は重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役目をする。

したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して精製されるｍＲＮＡは５’キャップ構造を含む。５’キャップは一般的に以下の通りに加えられる：先ず、ＲＮＡ末端ホスファターゼは５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを除去し、２つの末端リン酸基を残す；グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリル転移酵素を通して末端リン酸基に次に加えられ、５’５’５三リン酸連結を生成する；グアニンの７窒素がメチルトランスフェラーゼによって次にメチル化される。キャップ構造の例には、限定されずに、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡおよびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが含まれる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応から提供されるｍＲＮＡは一部の実施形態では望ましい可能性があるが、細菌、真菌、植物および／または動物から生成される野生型ｍＲＮＡを含むｍＲＮＡの他の供給源も本発明の方法を使用して精製することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法での精製のためのｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす１つまたはそれ以上のエレメント、例えば鉄応答エレメントを含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さが約５０から５００ヌクレオチドの間であってよい。

一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞中のｍＲＮＡの位置安定性に影響を及ぼすタンパク質のための結合部位、またはｍｉＲＮＡのための１つまたはそれ以上の結合部位の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが５０から５００ヌクレオチドの間またはそれ以上であってよい。

本発明は、任意のタンパク質をコードするｍＲＮＡを精製するために使用することができる。

回収されるｍＲＮＡ
規模および回収される量
本発明により提供される特定の利点は、ｍＲＮＡ、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡを大規模または商業規模で精製する能力である。例えば、一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき約１００ミリグラム、１グラム、１０グラム、５０グラム、１００グラム、２００グラム、３００グラム、４００グラム、５００グラム、６００グラム、７００グラム、８００グラム、９００グラム、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１メートルトン、１０メートルトンまたはそれ以上の規模、またはそれ以上で精製される。特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは約５００ｇの規模またはそれ以上で精製される。例で実証されるように、本発明の方法は、少なくとも約５００ｇのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡのバッチの精製を可能にするために規模調整が可能である。特に、本方法は低減された洗浄バッファーの量を必要とし、このように溶媒洗浄を必要とするプロトコルのためにより少ない溶媒を必要とし、さらに、以前の方法と比較してより大きなバッチのｍＲＮＡのより効率的で経済的な精製を可能にする。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの規模は、濾過遠心分離機のバスケットのサイズに依存する。例えば、３０ｃｍのバスケット直径および１５ｃｍの深さを有する濾過遠心分離機は、場合により濾過助剤を含む、沈殿したｍＲＮＡの約４ｋｇの最大投入量を受け入れることができる。一部の実施形態では、５０ｃｍのバスケット直径および２５ｃｍの深さを有する濾過遠心分離機（例えば、Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ Ｒｏｂａｔｅｌ ＥＨＢＬ ５０３）は、場合により濾過助剤を含む、沈殿したｍＲＮＡの約３０ｋｇの最大投入量を受け入れることができる。一部の実施形態では、６３ｃｍのバスケット直径および３１．５ｃｍの深さを有する濾過遠心分離機（例えば、Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ Ｒｏｂａｔｅｌ ＥＨＢＬ ６３３）は、場合により濾過助剤を含む、沈殿したｍＲＮＡの約５０ｋｇの最大投入量を受け入れることができる。一部の実施形態では、８１ｃｍのバスケット直径および３５ｃｍの深さを有する濾過遠心分離機（例えば、Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ Ｒｏｂａｔｅｌ ＥＨＢＬ ８１３）は、場合により濾過助剤を含む、沈殿したｍＲＮＡの約１２０ｋｇの最大投入量を受け入れることができる。一部の実施形態では、１０５ｃｍのバスケット直径および６１ｃｍの深さを有する濾過遠心分離機（例えば、Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ Ｒｏｂａｔｅｌ ＥＨＢＬ １０５３）は、場合により濾過助剤を含む、沈殿したｍＲＮＡの約２７５ｋｇの最大投入量を受け入れることができる。一部の実施形態では、１１５ｃｍのバスケット直径および６１ｃｍの深さを有する濾過遠心分離機（例えば、Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ Ｒｏｂａｔｅｌ ＥＨＢＬ １１５３）は、場合により濾過助剤を含む、沈殿したｍＲＮＡの約４１０ｋｇの最大投入量を受け入れることができる。一部の実施形態では、１３２ｃｍのバスケット直径および７２ｃｍの深さを有する濾過遠心分離機（例えば、Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔ Ｒｏｂａｔｅｌ ＥＨＢＬ １３２３）は、場合により濾過助剤を含む、沈殿したｍＲＮＡの約５５０ｋｇの最大投入量を受け入れることができる。

特定の一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき１０ｇの規模で精製される。特定の一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき２０ｇの規模で精製される。特定の一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき２５ｇの規模で精製される。特定の一実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき５０ｇの規模で精製される。別の特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき１００ｇの規模で精製される。さらに別の特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき１ｋｇの規模で精製される。さらに別の特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき１０ｋｇの規模で精製される。さらに別の特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき１００ｋｇの規模で精製される。さらに別の特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき１，０００ｋｇの規模で精製される。さらに別の特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ｍＲＮＡは、１バッチにつき１０，０００ｋｇの規模で精製される。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１バッチにつき１グラム、５グラム、１０グラム、１５グラム、２０グラム、２５グラム、３０グラム、３５グラム、４０グラム、４５グラム、５０グラム、７５グラム、１００グラム、１５０グラム、２００グラム、２５０グラム、３００グラム、３５０グラム、４００グラム、４５０グラム、５００グラム、５５０グラム、６００グラム、６５０グラム、７００グラム、７５０グラム、８００グラム、８５０グラム、９００グラム、９５０グラム、１ｋｇ、２．５ｋｇ、５ｋｇ、７．５ｋｇ、１０ｋｇ、２５ｋｇ、５０ｋｇ、７５ｋｇ、１００ｋｇまたはそれ以上の規模またはそれ以上で精製される。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡを含む溶液は、少なくとも１グラム、１０グラム、１００グラム、１キログラム、１０キログラム、１００キログラム、１メートルトン、１０メートルトンまたはそれ以上のｍＲＮＡ、またはその間の任意の量を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも約２５０ｍｇのｍＲＮＡのｍＲＮＡ量を精製するために使用される。一実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも約２５０ｍｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡ、約７５０ｍｇのｍＲＮＡ、約１０００ｍｇのｍＲＮＡ、約１５００ｍｇのｍＲＮＡ、約２０００ｍｇのｍＲＮＡまたは約２５００ｍｇのｍＲＮＡのｍＲＮＡ量を精製するために使用される。実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも約２５０ｍｇのｍＲＮＡから約５００ｇのｍＲＮＡのｍＲＮＡ量を精製するために使用される。実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも約５００ｍｇのｍＲＮＡから約２５０ｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡから約１００ｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡから約５０ｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡから約２５ｇのｍＲＮＡ、約５００ｍｇのｍＲＮＡから約１０ｇのｍＲＮＡ、または約５００ｍｇのｍＲＮＡから約５ｇのｍＲＮＡのｍＲＮＡ量を精製するために使用される。実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも約１００ｍｇのｍＲＮＡから約１０ｇのｍＲＮＡ、約１００ｍｇのｍＲＮＡから約５ｇのｍＲＮＡ、または約１００ｍｇのｍＲＮＡから約１ｇのｍＲＮＡのｍＲＮＡ量を精製するために使用される。

一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、精製されたｍＲＮＡの少なくとも約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％または約１００％である回収量（または、「収率」）を提供する。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約４０％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約４５％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約５０％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約５５％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約６０％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約６５％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約７０％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約７５％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約８０％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約８５％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９０％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９１％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９２％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９３％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９４％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９５％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９６％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９７％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９８％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９９％である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約１００％である。

一部の実施形態では、全精製ｍＲＮＡは、約８０％～約１００％の収率をもたらす量で回収される。一部の実施形態では、全精製ｍＲＮＡは、約９０％～約９９％の収率をもたらす量で回収される。一部の実施形態では、全精製ｍＲＮＡは、少なくとも約９０％の収率をもたらす量で回収される。特定の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約８０％を超えるかまたは約９０％を超え、例えば約９０％から１００％の間である。特定の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの回収量は約９５％を超える。

精製されたｍＲＮＡの特徴付け
本明細書で提供されるｍＲＮＡ精製方法は、短い不全型のＲＮＡ種、長い不全型のＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む夾雑物を実質的に含まない、精製されたｍＲＮＡ組成物をもたらす。例で実証され、上で概説されるように、本発明の方法は、以前の方法と比較して低減された量の洗浄バッファーを使用した精製されたｍＲＮＡの著しい回収、およびより速くより直接的な精製プロトコルを達成する。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約６０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約６５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９１％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９２％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９３％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９４％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９６％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９７％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９８％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９９％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約１００％の純度を有する。特定の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは９９％より高い、例えば９９．９％の純度を有する。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は約６０％から約１００％の間である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は約８０％から９９％の間である。特定の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの純度は約９０％から約９９％の間である。

上で概説されるように、本発明の方法は、臨床グレードの純度を有する大量の精製されたｍＲＮＡを得るためのより速くてより直接的な手順を提供する。特に、本方法は、精製されたｍＲＮＡのかなりの純度および高い収率を達成するために、低減された洗浄バッファーの量を必要とする。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡは、約０．５時間から約４時間の間に約５０％から約１００％の間の純度まで洗浄される。一部の実施形態では、特定の量の洗浄バッファーを使用した、保持された沈殿したｍＲＮＡからの不純物除去を達成するためにかかる時間は、前記濾過遠心分離機のローターサイズ（すなわち、バスケット直径）に、したがって沈殿したｍＲＮＡのバッチサイズおよび必要とされた洗浄バッファーの量に依存することができる（表Ｄを参照する）。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡは、約４時間未満、約３時間未満、約２時間未満、約１時間未満、または約０．５時間未満に、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または約１００％の純度まで洗浄される。一部の実施形態では、保持された沈殿したｍＲＮＡは、約９０分未満に約９５％を超えた（例えば９９％）純度まで洗浄される。例えば、本発明者らは約５０ｃｍのローターサイズを有する濾過遠心分離機を使用して、５００リットルの洗浄バッファーを使用して約８０分で（すなわち、６Ｌ／分または１５Ｌ／分／ｍ^２の洗浄バッファー投入速度で）１０００ｇのｍＲＮＡのバッチの不純物除去を達成した（表Ｄを参照する）。したがって、本発明の方法は、商業的および治療的使用のために大きなバッチを受け入れるためにｍＲＮＡの精製規模を調整するために特に好適である。

一部の実施形態では、本発明の方法を使用して精製されたｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上の夾雑物、例えば１つまたはそれ以上のタンパク質および／または短い不全型の転写夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のタンパク質および／または短い不全型の転写夾雑物は、ＩＶＴ ｍＲＮＡ合成で使用される酵素試薬を含む。一部の実施形態では、酵素試薬はポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ピロホスファターゼおよびキャッピング酵素を含む。一部の実施形態では、本方法は、長い不全型のＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ残留溶媒および／または残留塩をさらに除去する。一部の実施形態では、短い不全型の転写夾雑物は１５未満の塩基を含む。一部の実施形態では、短い不全型の転写夾雑物は約８～１２塩基を含む。一部の実施形態では、本方法はＲＮアーゼ阻害剤も除去する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡはさらなる精製なしで臨床グレードの純度を有する。

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成されるｍＲＮＡは、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、および／または０．１％未満の完全長ｍＲＮＡ以外の不純物を有する。不純物には、ＩＶＴ夾雑物、例えば、タンパク質、酵素、ＤＮＡ鋳型、遊離ヌクレオチド、残留溶媒、残留塩、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、早期不全ＲＮＡ配列（「ショートマー」または「短い不全型のＲＮＡ種」）および／または長い不全型のＲＮＡ種が含まれる。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、プロセス酵素を実質的に含まない。

一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１ｐｇ／ｍｇ未満、約２ｐｇ／ｍｇ未満、約３ｐｇ／ｍｇ未満、約４ｐｇ／ｍｇ未満、約５ｐｇ／ｍｇ未満、約６ｐｇ／ｍｇ未満、約７ｐｇ／ｍｇ未満、約８ｐｇ／ｍｇ未満、約９ｐｇ／ｍｇ未満、約１０ｐｇ／ｍｇ未満、約１１ｐｇ／ｍｇ未満または約１２ｐｇ／ｍｇ未満である。したがって、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約２ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約３ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約４ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約５ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約６ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約７ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約８ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約９ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１０ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１１ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、本明細書に記載される精製方法を使用して精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１２ｐｇ／ｍｇ未満である。

一部の実施形態では、本発明は、高い程度の早期不全ＲＮＡ配列（「ショートマー」としても知られる）を除去または排除する。一部の実施形態では、本発明による方法は、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くの、または実質的に全ての早期不全ＲＮＡ配列を除去する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、早期不全ＲＮＡ配列を実質的に含まない。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、約５％未満（例えば、約４％、３％、２％または１％未満）の早期不全ＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、約１％未満（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％未満）の早期不全ＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、肩または別個のピーク）、臭化エチジウム、クーマシー染色、キャピラリー電気泳動またはグリオキサールゲル電気泳動（例えば、別個の下部バンドの存在）によって決定されるような、検出不能な早期不全ＲＮＡ配列を含有する。本明細書で使用されるように、用語「ショートマー」、「短い不全型のＲＮＡ種」、「早期不全ＲＮＡ配列」、または「長い不全型のＲＮＡ種」は、完全長未満である任意の転写物を指す。一部の実施形態では、「ショートマー」、「短い不全型のＲＮＡ種」または「早期不全ＲＮＡ配列」は、長さが１００未満のヌクレオチド、長さが９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満または１０未満のヌクレオチドである。一部の実施形態では、５’－キャップおよび／または３’－ポリＡテールを加えた後に、ショートマーは検出または定量化される。一部の実施形態では、早期不全ＲＮＡ転写物は、１５未満の塩基（例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４または３未満の塩基）を含む。一部の実施形態では、早期不全ＲＮＡ転写物は、約８～１５、８～１４、８～１３、８～１２、８～１１または８～１０の塩基を含有する。

一部の実施形態では、本発明による方法は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮアーゼＩ、ピロホスファターゼおよび／またはＲＮアーゼ阻害剤を限定されずに含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成で使用される酵素試薬を高い程度で除去または排除する。一部の実施形態では、本発明は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを除去するのに特に有効である。一部の実施形態では、本発明による方法は、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くの、または実質的に全てのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成で使用される酵素試薬を除去する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成で使用される酵素試薬を実質的に含まない。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、約５％未満（例えば、約４％、３％、２％または１％未満）のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成で使用される酵素試薬を含有する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、約１％未満（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％または０．１％未満）のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成で使用される酵素試薬を含有する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、例えば銀染色、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）および／またはキャピラリー電気泳動、臭化エチジウムおよび／またはクーマシー染色によって決定されるような、検出不能なｉｎ ｖｉｔｒｏ合成で使用される酵素試薬を含有する。

様々な実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して精製されたｍＲＮＡは、高度の完全性を維持する。本明細書で使用されるように、用語「ｍＲＮＡ完全性」は、精製後のｍＲＮＡの品質を一般的に指す。ｍＲＮＡ完全性は、当技術分野で周知である方法を使用して、例えばＲＮＡアガロースゲル電気泳動によって決定することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ完全性は、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動のバンディングパターンによって決定することができる。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動の参照バンドと比較して、ほとんどまたは全くバンディングを示さない。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、約８０％、約８５％または約９０％より大きい完全性を有する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、約９５％より大きい（例えば、約９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上より大きい）完全性を有する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、９８％より大きい完全性を有する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、９９％より大きい完全性を有する。一部の実施形態では、本発明により精製されたｍＲＮＡは、概ね１００％の完全性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、完全長ｍＲＮＡ分子のより低いパーセンテージを有する組成物と比較して増加した活性、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍またはそれ以上の翻訳されたポリペプチドを有する組成物を提供する。一部の実施形態では、パーセンテージ完全性は、ＨＰＬＣクロマトグラムの完全長ｍＲＮＡに関連する主生成物ピークの曲線下％面積を決定することによって調査することができる。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の完全性を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９５％またはそれ以上の完全性を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９８％またはそれ以上の完全性を有する。特定の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９９％またはそれ以上の完全性を有する。

一部の実施形態では、本発明の方法は、精製されたｍＲＮＡを特徴付けるさらなる工程を含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡを特徴付けるさらなる工程は、精製されたｍＲＮＡの以下の特徴の１つまたはそれ以上を調査することを含む：外観、同一性、量、濃度、不純物の存在、微生物学的調査、ｐＨレベルおよび活性。一部の実施形態では、許容される外観には、可視的微粒子を事実上含まない透明無色の溶液が含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの同一性は、シークエンシング方法によって調査される。一部の実施形態では、濃度は紫外分光測光などの好適な方法によって調査される。一部の実施形態では、好適な濃度は名目上約９０％から１１０％の間（０．９～１．１ｍｇ／ｍＬ）である。

一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡを特徴付けるさらなる工程は、ｍＲＮＡ完全性の調査、残留プラスミドＤＮＡの調査および残留溶媒の調査を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ完全性を調査するためのさらなる工程は、アガロースゲル電気泳動を含む。バンディングパターンおよび見かけのヌクレオチド長が分析参照標準と一貫しているかどうかを決定するためにゲルを分析する。一部の実施形態では、陽性対照は、ｍＲＮＡの％純度を決定するためのアガロースゲル電気泳動からの銀染色のコンパレーターとして使用される。一部の実施形態では、さらなる工程は、例えばキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を使用した精製されたｍＲＮＡの調査を含む、ＲＮＡ完全性の調査を含む。一部の実施形態では、ＣＧＥによって決定されるような精製されたｍＲＮＡの許容される純度とは、精製されたｍＲＮＡ組成物が約５５％より多くの長い不全型／分解された種を有しないということである。一部の実施形態では、さらなる工程は、当技術分野の方法によって、例えばｑＰＣＲを用いて残留プラスミドＤＮＡを調査することを含む。一部の実施形態では、１０ｐｇ／ｍｇ未満（例えば、１０ｐｇ／ｍｇ未満、９ｐｇ／ｍｇ未満、８ｐｇ／ｍｇ未満、７ｐｇ／ｍｇ未満、６ｐｇ／ｍｇ未満、５ｐｇ／ｍｇ未満、４ｐｇ／ｍｇ未満、３ｐｇ／ｍｇ未満、２ｐｇ／ｍｇ未満または１ｐｇ／ｍｇ未満）が、残留プラスミドＤＮＡの許容レベルである。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは１０，０００ｐｐｍ、９，０００ｐｐｍ、８，０００ｐｐｍ、７，０００ｐｐｍ、６，０００ｐｐｍ、５，０００ｐｐｍ、４，０００ｐｐｍ、３，０００ｐｐｍ、２，０００ｐｐｍ、１，０００ｐｐｍより高くない。したがって、一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは１０，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは９，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは８，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは７，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは６，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは５，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは４，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは３，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは２，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは１，０００ｐｐｍ以下である。

一部の実施形態では、さらなる工程は、精製されたｍＲＮＡに対して、例えば細菌エンドトキシンの調査を含む、微生物学的試験を実行することを含む。一部の実施形態では、細菌エンドトキシンは、＜０．５ＥＵ／ｍＬ、＜０．４ＥＵ／ｍＬ、＜０．３ＥＵ／ｍＬ、＜０．２ＥＵ／ｍＬまたは＜０．１ＥＵ／ｍＬである。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．５ＥＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．４ＥＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．３ＥＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．２ＥＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌エンドトキシンは、＜０．１ＥＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１ＣＦＵ／１０ｍＬ、１ＣＦＵ／２５ｍＬ、１ＣＦＵ／５０ｍＬ、１ＣＦＵ／７５ｍＬより多く、または１ＣＦＵ／１００ｍＬより多くを有しない。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／１０ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／２５ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／５０ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／７５ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／１００ｍＬを有する。

一部の実施形態では、さらなる工程は、精製されたｍＲＮＡのｐＨを調査することを含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの許容されるｐＨは５から８の間である。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約５のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約６のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８のｐＨを有する。

一部の実施形態では、さらなる工程は、精製されたｍＲＮＡの翻訳忠実度を調査することを含む。翻訳忠実度は様々な方法によって調査することができ、例えば、トランスフェクションおよびウエスタンブロット分析を含むことができる。精製されたｍＲＮＡの許容される特徴には、参照標準と類似した分子量で移動するウエスタンブロットのバンディングパターンが含まれる。

一部の実施形態では、さらなる工程は、精製されたｍＲＮＡをコンダクタンスについて調査することを含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの許容される特徴には、参照標準の約５０％から１５０％の間のコンダクタンスが含まれる。

一部の実施形態では、さらなる工程は、精製されたｍＲＮＡをＣａｐパーセンテージおよびポリＡテール長について調査することを含む。一部の実施形態では、許容されるＣａｐパーセンテージは、Ｃａｐ１、％面積：ＮＬＴ９０を含む。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は、約１００～１５００ヌクレオチド（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０および１０００、１１００、１２００、１３００、１４００または１５００ヌクレオチド）である。したがって、一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約２５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約３５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約４５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約５５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約６００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約６５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約７００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約７５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約８００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約８５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約９００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約９５０ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約１０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約１１００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約１２００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約１３００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約１４００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は約１５００ヌクレオチドである。

一部の実施形態では、さらなる工程は、例えば超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）および／または質量分析（ＭＳ）を使用して、精製されたｍＲＮＡを任意の残留ＰＥＧについて調査することを含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、精製されたｍＲＮＡ １ｍｇにつき１０ｎｇ未満のＰＥＧからｍＲＮＡ １ｍｇにつき１０００ｎｇの間のＰＥＧを有する。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、精製されたｍＲＮＡ １ｍｇにつき約１０ｎｇ未満のＰＥＧを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、精製されたｍＲＮＡ １ｍｇにつき約１００ｎｇ未満のＰＥＧを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、精製されたｍＲＮＡ １ｍｇにつき約２５０ｎｇ未満のＰＥＧを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、精製されたｍＲＮＡ １ｍｇにつき約５００ｎｇ未満のＰＥＧを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、精製されたｍＲＮＡ １ｍｇにつき約７５０ｎｇ未満のＰＥＧを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、精製されたｍＲＮＡ １ｍｇにつき約１０００ｎｇ未満のＰＥＧを有する。

ｍＲＮＡ純度を検出および定量化する様々な方法が、当技術分野で公知である。例えば、そのような方法には、ブロッティング、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、銀染色、分光法、紫外線（ＵＶ）またはＵＰＬＣまたはその組合せが含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはグリオキサール色素によって先ず変性させてからゲル電気泳動（「グリオキサールゲル電気泳動」）にかける。一部の実施形態では、本発明の方法は、キャッピングまたはテーリングの前に合成されたｍＲＮＡを特徴付けるさらなる工程を含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、キャッピングおよびテーリングの後に合成されたｍＲＮＡを特徴付けるさらなる工程を含む。

一部の実施形態では、さらなる工程は、精製されたｍＲＮＡ中のタンパク質夾雑物の％をキャピラリー電気泳動によって決定することを含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動によって決定されるように、５％もしくはそれ以下、４％もしくはそれ以下、３％もしくはそれ以下、２％もしくはそれ以下、１％もしくはそれ以下のタンパク質夾雑物を含むか、またはタンパク質夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、さらなる工程は、精製されたｍＲＮＡ中の塩夾雑物の％を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定することを含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、ＨＰＬＣによって決定される、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の塩夾雑物を含むか、または塩夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、さらなる工程は、精製されたｍＲＮＡ中の短い不全型の転写夾雑物の％をＨＰＬＣによって決定することを含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、ＨＰＬＣによって決定される、５％もしくはそれ以下、４％もしくはそれ以下、３％もしくはそれ以下、２％もしくはそれ以下、１％もしくはそれ以下の短い不全型の転写夾雑物を含むか、または短い不全型の転写夾雑物を実質的に含まない。一部の実施形態では、さらなる工程は、精製されたｍＲＮＡの％完全性をキャピラリー電気泳動によって決定することを含む。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡはキャピラリー電気泳動によって決定されるように、９５％もしくはそれ以上、９６％もしくはそれ以上、９７％もしくはそれ以上、９８％もしくはそれ以上、または９９％もしくはそれ以上の完全性を有する。

特定の実施形態では、臨床グレードの純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、リガンドもしくは結合をベースとした精製、接線流濾過（ＴＦＦ）精製および／またはイオン交換クロマトグラフィーから選択されるさらなる精製なしで達成される。

医薬組成物および処置方法
医薬組成物
本発明は、長さが５００ヌクレオチドよりも大きく目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡ分子で濃縮された組成物を作製するための方法を提供する。

本発明は、本発明のいずれかの方法により調製される精製されたｍＲＮＡを提供する。本発明は、本発明のいずれかの方法により調製される精製されたｍＲＮＡを含む溶液も提供する。

本発明は、本発明のいずれかの方法により作製される組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本発明のいずれかの方法により得られる精製されたｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、水性型の精製されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、本発明の組成物は、沈殿したｍＲＮＡを可溶化し収集することにより得られる。一部の実施形態では、本発明の組成物は、可溶化されたｍＲＮＡを濾過助剤から分離し（例えば、濾過遠心分離機を使用して）、精製されたｍＲＮＡを収集することにより得られる。一部の実施形態では、沈殿したｍＲＮＡは、医薬組成物中への組込みに適合する水性媒体に可溶化される。

したがって、一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む（例えば、本発明の精製されたｍＲＮＡ組成物および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物）。

本発明は、対象、例えば、ヒト対象もしくはヒト対象の細胞への送達もしくはその処置において、または処置されヒト対象に送達される細胞において使用するための目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡ分子で濃縮された治療組成物を作製するための方法も提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肺または肺細胞への送達またはその処置において使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸中間鎖１タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸重鎖５（ＤＮＡＨ５）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、１つまたはそれ以上の肺サーファクタントタンパク質、例えば、１つまたはそれ以上の肺サーファクタントＡタンパク質、肺サーファクタントＢタンパク質、肺サーファクタントＣタンパク質、および肺サーファクタントＤタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肝臓または肝臓細胞への送達またはその処置において使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。そのようなペプチドおよびポリペプチドは、尿素サイクル異常症に関連する、リソソーム蓄積症に、糖原貯蔵障害に関連する、アミノ酸代謝障害に関連する、脂質代謝もしくは線維性障害に関連する、メチルマロン酸血症に関連する、または濃縮された完全長ｍＲＮＡでの肝臓もしくは肝臓細胞への送達もしくはその処置が治療効果をもたらす他の任意の代謝障害に関連するペプチドおよびポリペプチドを含むことができる。

ある特定の実施形態では、本発明は、尿素サイクル異常症に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギノコハク酸シンテターゼ１タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、カルバモイルリン酸シンテターゼＩタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギノコハク酸リアーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギナーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、リソソーム蓄積症に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファガラクトシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロン酸－２－スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロニダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヘパランＮ－スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ガラクトサミン－６スルファターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、リソソームリパーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アリルスルファターゼＢ（Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、糖原貯蔵障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、酸アルファ－グルコシダーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、肝グリコーゲンホスホリラーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉ホスホグリセリン酸ムターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン脱分岐酵素をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸代謝に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オキサレートアラニン－グリオキシレートアミノトランスフェラーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、脂質代謝または線維性障害に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰアーゼリン脂質輸送８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｉ－カッパＢアルファ、インターフェロン関連発生調節因子１（ＩＦＲＤ１）、およびサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）のうちの１つまたはそれ以上のような、１つまたはそれ以上のＮＦ－カッパＢ阻害剤をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＰＰＡＲ－ガンマタンパク質または活性バリアントをコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロン酸血症に関連するタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡムターゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓への送達またはその処置が治療効果をもたらすことができる完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ウィルソン病タンパク質としても知られるＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ酵素をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子のような１つまたはそれ以上の凝固酵素をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、対象または対象の細胞用のワクチンの送達またはワクチンを用いたその処置において使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、細菌またはウイルスのような感染病原体由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ボレリア・ブルグドルフェリ（ライム病の原因である細菌）由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、呼吸器多核体ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、サイトメガロウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ロタウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスのような肝炎ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパピローマウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、単純ヘルペスウイルス１型または単純ヘルペスウイルス２型のような単純ヘルペスウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型またはヒト免疫不全ウイルス２型のようなヒト免疫不全ウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトメタニューモウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、ヒトパラインフルエンザウイルス２型、またはヒトパラインフルエンザウイルス３型のようなヒトパラインフルエンザウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、マラリアウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、チクングニアウイルス由来の抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

ある特定の実施形態では、本発明は、対象のがんに関連するまたは対象のがん細胞から同定された抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象自身のがん細胞から決定される抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための、すなわち、個人化されたがんワクチンを提供するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、変異ＫＲＡＳ遺伝子から発現される抗原をコードする完全長ｍＲＮＡで濃縮された治療組成物を作製するための方法を提供する。

医学的使用および処置方法
本発明は、本発明の精製されたｍＲＮＡまたは医薬組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む疾患または障害を処置するための方法も提供する。本発明は、本発明の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与する工程を含む疾患または障害を処置するための方法をさらに提供する。

本発明は、療法で使用するための本発明の精製されたｍＲＮＡも提供する。本発明は、療法で使用するための本発明の医薬組成物も提供する。

ｍＲＮＡの合成
ＩＶＴ反応条件
以下の実施例では、別段記載されなければ、ｍＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）により合成した。手短に言えば、ＳＰ６ポリメラーゼＩＶＴ反応では、転写された１グラムのｍＲＮＡごとに、ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼ阻害剤、ピロホスファターゼ、５ｍＭのＮＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴおよび反応バッファー（１０×－２５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのスペルミジン、５０ｍＭのＮａＣｌ）と共に２０ｍｇの直線化二本鎖ＤＮＡプラスミドを含有する反応物をＲＮアーゼ不含水で調製し、次に３７℃で６０分間インキュベートした。その後、反応は、ＤＮアーゼＩおよびＤＮアーゼＩバッファー（１０×－１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２および２５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．６）の添加によりクエンチして、精製に備えて二本鎖ＤＮＡ鋳型の消化を促進した。最終反応量は２０４ｍＬであった。

５’キャップ
別段記載されなければ、ＩＶＴ転写ｍＲＮＡは、ＩＶＴ反応の一部としてキャップ構造を含むことにより、またはそれに続く酵素的工程において、その５’末端でキャップした。ＩＶＴ反応の一部としてのキャッピングでは、キャップ類似物を、新生ＲＮＡ鎖の第１の「塩基」として組み込むことができる。キャップ類似物は、キャップ０、キャップ１、キャップ２、ｍ６Ａｍ、または非天然のキャップでもよい。代わりに、未キャップの精製されたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡは、例えば、グアニレートトランスフェラーゼを使用して５’Ｎ７－メチルグアニレートキャップ０構造を付加することによりおよびＦｅｃｈｔｅｒ、Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｇ．Ｇ．「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５年、８６、１２３９～１２４９頁に記載される通りに、２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼを使用してキャップ１構造を生じるペナルチメートヌクレオチドの２’Ｏ位でのメチル基の付加により、ＩＶＴに続いて酵素的に修飾してキャップを含めることができる。

３’テール
別段記載されなければ、ＩＶＴ転写ｍＲＮＡは、ＩＶＴ反応の一部としてｍＲＮＡにテーリングする直線化プラスミドにテール鋳型を含むことにより、またはそれに続く酵素的工程において、その３’末端でテーリングした。ＩＶＴ反応の一部としてのテーリングでは、ポリＴまたは類似するテーリング機能のｐＤＮＡ鋳型中への組込みは、ポリＡテールまたは類似の適切なテールがＩＶＴ方法の一部としてｍＲＮＡ上に形成されるように実施される。代わりに、ポリＡテールは、ＩＶＴ反応に続いて、例えば、ポリＡポリメラーゼを使用して、ＩＶＴ産生ｍＲＮＡの３’末端に酵素的に付加することができる。

精製されたｍＲＮＡの分析
ＲＮＡ完全性分析（断片アナライザー－キャピラリー電気泳動）
ＲＮＡ完全性およびテール長は、ＣＥ断片アナライザーおよび市販のＲＮＡ検出キットを使用して評価した。完全性についてのピークプロファイルの分析およびテール長についてのサイズシフトを、生データならびに正規化されたデータセットで実施した。

ｍＲＮＡキャップ種分析（ＨＰＬＣ／ＭＳ）
最終精製ｍＲＮＡ産物中に存在するキャップ種は、米国特許第９，９７０，０４７号に記載されるクロマトグラフィー法を使用して定量化した。この方法は、全ｍＲＮＡのパーセントとして未キャップｍＲＮＡを正確に定量化することができる。この方法は、キャップＧ、キャップ０およびキャップ１量のような特定のキャップ構造の量を定量化することもでき、これらのキャップ構造は全ｍＲＮＡのパーセンテージとして報告することができる。

ｄｓＲＮＡ検出（Ｊ２ドットブロット）
個々のｍＲＮＡ試料中の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の存在は、Ｋａｒｉｋｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１１年．３９、Ｎｏ．２１により以前記載されたＪ２抗ｄｓＲＮＡドットブロットを使用して測定された。手短に言えば、２００ｎｇのＲＮＡまたは２５ｎｇのｄｓＲＮＡ対照を、スーパー荷電Ｎｙｔｒａｎ上にブロットした。ブロットは乾燥させ、５％の脱脂粉乳でブロッキングし、次に、ブロット当たり１μｇのＪ２抗体でプロービングした。ブロットを洗浄し、再び洗浄する前に、ＨＲＰコンジュゲートロバ抗マウスでプロービングした。ブロットはＥＣＬプラスウェスタンブロット検出試薬で検出し、画像をフィルム上に捕らえた。精製されたｍＲＮＡを含む試料は、いかなるｄｓＤＮＡも欠く対照と比べた場合、それぞれのブロットが目に見えるほどのより黒い着色を全く示さない場合はｄｓＲＮＡが実質的にないと見なされた。

減少させた遠心分離速度を使用する遠心分離によるｍＲＮＡの精製
本実施例は、濾過遠心分離機を使用する沈殿したｍＲＮＡの精製が、精製されたｍＲＮＡの非常に高い回収率を達成できることを実証する。特に、本実施例は、沈殿したｍＲＮＡの投入および洗浄が同一の低速度で実施される場合、同一の高遠心分離速度で投入および洗浄を実施する方法と比べて、驚くべきことに必要な洗浄バッファーが少なくて済むことを実証する。

ｍＲＮＡは、上の実施例１に記載されるＩＶＴ反応ならびにキャッピングおよびテーリング（Ｃ／Ｔ）反応に従って、ＳＰ６ポリメラーゼを使用して合成した。ｍＲＮＡの異なるバッチサイズがこの実験に使用された。最大のバッチサイズ（５００グラム）は、複数のＩＶＴ合成反応由来のｍＲＮＡをプールすることにより達成した。

本実施例では、ｍＲＮＡは、カオトロピック塩チオシアン酸グアニジン（ＧＳＣＮ（５ＭのＧＳＣＮ－１０ｍＭのＤＴＴバッファー））およびアルコールエタノール（ＥｔＯＨ）をｍＲＮＡ：ＧＳＣＮ：１００％のＥｔＯＨの比１：２．３：１．７での組合せを使用して沈殿させた。沈殿したｍＲＮＡ懸濁液は濾過助剤（Ｓｏｌｋａ－Ｆｌｏｃ）と、ｍＲＮＡ：濾過助剤比１：１０で混合させ、次に、試料供給ポートを通してｍＲＮＡのバッチのサイズに応じて、Ｈ３００ＰまたはＥＨＢＬ５０３の濾過遠心分離機上に懸濁液として投入した。次に、ｍＲＮＡ懸濁液は、遠心分離により濾過遠心分離機のフィルター上に保持され、精製されたｍＲＮＡが溶出され定量化される前に、特定容量の８０％のＥｔＯＨを用いた洗浄に供された。手順条件および％回収率は下の表Ｂに提供されている。

表Ｂのデータは、投入と洗浄の両方の工程での同一の低速度の使用は、低容量の洗浄バッファーを使用しつつ、精製されたｍＲＮＡの高い％回収率を達成することを実証する。表に提供される洗浄バッファーの容量は、精製方法において（すなわち、（ｉ）ＩＶＴ合成工程ならびに（ｉｉ）５’－キャッピングおよび３’－テーリング工程後にｍＲＮＡを精製するために）使用される洗浄バッファーの総容量を表す。したがって、ｍＲＮＡの最大試験バッチを精製するため、１サイクルの精製方法を使用するそれぞれの製造工程後にｍＲＮＡを精製するのにｍＲＮＡ １ｇにつき０．５Ｌだけの洗浄容量が必要である。ｍＲＮＡ １ｇにつき少なくとも４Ｌの洗浄バッファーの総容量を必要とする深層濾過と比べて、本発明の方法が必要とするのは４分の１（すなわち、７５％減少）の洗浄バッファー容量である。精製されたｍＲＮＡの品質は、低速遠心分離がより大きな量の沈殿したｍＲＮＡに適用される場合でも一貫しており、純度を失わずにキログラム量のｍＲＮＡの精製のために方法をスケールアップできることが示唆される。

より低速度の遠心分離はより大きなバッチサイズでも精製されたｍＲＮＡの完全性および純度を維持する
本実施例は、より低速度の遠心分離を使用して大規模バッチのｍＲＮＡを二度精製する（ＩＶＴとキャッピングおよびテーリング（Ｃ／Ｔ）反応の両方の後で）場合でもｍＲＮＡの完全性および純度を維持できることを実証する。

実施例２に記載される通りに２５０ｇバッチのＯＴＣ ｍＲＮＡを合成して精製し、濾過遠心分離機上での精製はＩＶＴとＣ／Ｔ反応の両方の後で実施した。精製方法では、ＥＨＢＬ５０３濾過遠心分離機を表Ｂに提供される２５０ｇバッチについての条件に従って運転した。精製されたＯＴＣ ｍＲＮＡの完全性は、ＣＥスミア分析を使用して評価され、ｍＲＮＡ純度は、残留プロセス酵素を検出する銀染色分析を使用して評価した。

際立ったことに、これらのより低い遠心分離速度を使用して得られる精製されたｍＲＮＡの完全性は、ＩＶＴ工程後は約９４％であり、キャッピングおよびテーリング工程後は約９１％であった（テール長は１７２ヌクレオチド）。さらに、精製されたＯＴＣ ｍＲＮＡの銀染色分析は、ＩＶＴ工程からもキャッピングおよびテーリング（Ｃ／Ｔ）工程からも夾雑物を示さなかった。

したがって、精製プロトコルでより低い遠心分離速度を使用すれば、より大きなバッチサイズを用いてもｍＲＮＡ完全性および純度は維持される。それゆえに、本発明の方法は、より低い遠心分離速度を使用すれば、臨床使用に適した精製されたｍＲＮＡの純度および完全性を維持しつつ、より大量のｍＲＮＡを収容するようスケールを変更することができる。

より低速度の遠心分離はエタノールなしの精製プロトコルに適用可能である
本実施例は、濾過遠心分離機で沈殿したｍＲＮＡを投入し洗浄するために同一の低遠心分離速度を使用する利点（すなわち、少ない洗浄バッファー使用でのｍＲＮＡの良好な回収率）は、エタノールのような揮発性有機溶媒を避ける精製手順において達成できることを実証する。

ＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、実施例１に記載される通りに、ＩＶＴ合成により合成し、５’キャップおよび３’ポリＡテールを付加した。ｍＲＮＡは、ＧＳＣＮおよび両親媒性ポリマーを使用して沈殿させた。両親媒性ポリマー（ＰＥＧまたはＭＴＥＧ）を１００％エタノールの代わりに使用した。沈殿反応でのｍＲＮＡ、ＧＳＣＮ（５ＭのＧＳＣＮ－１０ｍＭのＤＴＴバッファー）とＰＥＧまたはＭＴＥＧ（１００％重量／容量）の容量比は、１：２．３：１であった。セルロース濾過助剤は、１：１０のｍＲＮＡ：濾過助剤質量比で添加した。懸濁液は、着床式インペラー付きの６０Ｌ Ｌｅｅ容器中６０Ｈｚで混合させた。懸濁液は濾過遠心分離機（Ｈ３００Ｐ）中に投入し、下の表Ｃにまとめられる容量および遠心分離速度で９５％ＰＥＧまたはＭＴＥＧを用いて洗浄した。最終ｍＲＮＡ収量は、２８０ｎｍで吸光度を測定するＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計で定量化した。ＲＮＡの％回収率は表Ｃに示されている。さらに、精製されたｍＲＮＡの完全性はＣＥスミア分析を使用して評価し、ｍＲＮＡ純度は、残留プロセス酵素を検出する銀染色分析を使用して評価した。

沈殿ポリマーおよび洗浄バッファー成分としてのＰＥＧまたはＭＴＥＧの使用により、実施例３でのエタノールベースの精製方法で観察された回収パーセンテージに匹敵するｍＲＮＡの回収パーセンテージが得られた。投入および洗浄中の低遠心分離速度を使用して、本実施例で試験された精製方法は、実施例３で観察された結果に匹敵する、低容量の洗浄バッファーを必要とした。

表に提供される洗浄バッファーの容量は、精製方法において（すなわち、（ｉ）ＩＶＴ合成工程ならびに（ｉｉ）５’－キャッピングおよび３’－テーリング工程後にｍＲＮＡを精製するために）使用される洗浄バッファーの総容量を表す。したがって、沈殿したｍＲＮＡ １ｇにつき１Ｌの洗浄バッファーの容量がそれぞれの精製サイクルについて使用された。ＭＴＥＧを用いた精製プロトコルでの減少した遠心分離速度の使用により、ｍＲＮＡ完全性および純度が維持された。ｍＲＮＡの完全性は約８２％であり、達成されたｍＲＮＡの純度は約９９．９％であった。

それゆえに、濾過遠心分離機を使用する精製方法でより低い遠心分離速度を使用すれば、臨床使用に適した完全性および純度を有するｍＲＮＡの効率的な精製が保証され、この結果は、使用されるのが揮発性有機溶媒なのか両親媒性ポリマーなのかとは無関係に、観察される。

濾過遠心分離機サイズに基づくスケーリング投入時間および洗浄時間
下の表Ｄは、サイズ（すなわち、ローターサイズまたはバスケット直径）に応じて分類された特定の濾過遠心分離機上での沈殿したｍＲＮＡの特定のバッチサイズの予想される投入時間および洗浄時間の概要を述べる。値は、一定のシステム流速約１５Ｌ／分／ｍ^２、沈殿したｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌの洗浄容量、および沈殿バッファーの容量に対する沈殿したｍＲＮＡの質量の１：１比に基づいて計算される。値は、システム流速のようなパラメータの変更を説明するように調整できる。例えば、流速は、沈殿したｍＲＮＡを含有する懸濁液の投入と濾過遠心分離機のフィルター上に保持された沈殿したｍＲＮＡの洗浄の間で変動しうる。

等価物と範囲
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識する、またはルーチンな実験だけを使用してこれを確かめることができる。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることを意図されておらず、むしろ、以下の特許請求の範囲で言明される通りである。

Claims (151)

1. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を精製するための方法であって：
   Ｉ．１つまたはそれ以上のタンパク質および／またはｍＲＮＡの製造に由来する短い不全型の転写夾雑物を含む溶液からｍＲＮＡを沈殿させて、沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を提供する工程と；
   ＩＩ．沈殿したｍＲＮＡを保持するフィルターを含む濾過遠心分離機に沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を投入する工程と；
   ＩＩＩ．洗浄バッファーを濾過遠心分離機に加えることによって保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄する工程と；
   ＩＶ．保持された沈殿したｍＲＮＡをフィルターから回収する工程と
   を含み；
   濾過遠心分離機は投入工程（ｂ）および洗浄工程（ｃ）の間１３００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する遠心分離速度で運転される、方法。
2. 遠心分離速度は約３００ｇから約１３００ｇの間、例えば約４００ｇから約１１００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する、請求項１に記載の方法。
3. 遠心分離速度は約５００ｇから約９００ｇの間、例えば約７００ｇから約９００ｇの間、例えば約７５０ｇから８５０ｇの間（例えば約８００ｇ）の重力（ｇ）を発揮する、請求項２に記載の方法。
4. 遠心分離速度は約５５０ｇから約７５０ｇの間、例えば約６５０ｇから約７５０ｇの間の重力（ｇ）を発揮する、請求項２に記載の方法。
5. 濾過遠心分離機は投入工程（ｂ）および洗浄工程（ｃ）の間同じ遠心分離速度で運転される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 保持された沈殿したｍＲＮＡをフィルターから回収することは：
   ｉ．保持された沈殿したｍＲＮＡを可溶化する工程と；
   ｉｉ．可溶化されたｍＲＮＡを収集する工程と
   を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤、例えばアルコール、両親媒性ポリマー、バッファー、塩および／または界面活性剤の１つまたはそれ以上を加えることを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬剤は：
   ｉ．塩、および
   ｉｉ．アルコールまたは両親媒性ポリマー
   である、請求項７に記載の方法。
9. アルコールはエタノールである、請求項７または８に記載の方法。
10. 塩はカオトロピック塩である、請求項７～９のいずれか１項に記載の方法。
11. 塩は２～４Ｍ、例えば２．５～３Ｍの最終濃度である、請求項１０に記載の方法。
12. 塩は約２．７Ｍの最終濃度である、請求項１１に記載の方法。
13. カオトロピック塩はグアニジニウムチオシアネート（ＧＳＣＮ）である、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 両親媒性ポリマーは、プルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）またはその組合せから選択される、請求項７、８または１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
15. ＰＥＧの分子量は約２００～約４０，０００ｇ／ｍｏｌである、請求項１４に記載の方法。
16. ＰＥＧの分子量は約２００～６００ｇ／ｍｏｌ、約２０００～１００００ｇ／ｍｏｌまたは約４０００～８０００ｇ／ｍｏｌである、請求項１５に記載の方法。
17. ＰＥＧの分子量は約６０００ｇ／ｍｏｌ（例えば、ＰＥＧ－６０００）である、請求項１６に記載の方法。
18. ＰＥＧは約１０％～約１００％重量／容量の最終濃度である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. ＰＥＧは約５０％重量／容量の最終濃度である、請求項１８に記載の方法。
20. ＰＥＧは２５％重量／容量未満の最終濃度である、請求項１９に記載の方法。
21. ＰＥＧは約５％～２０％重量／容量の最終濃度である、請求項２０に記載の方法。
22. ＰＥＧは約１０％～１５％重量／容量の最終濃度である、請求項２１に記載の方法。
23. 両親媒性ポリマーはＭＴＥＧである、請求項７、８または１０～１４のいずれか１項に記載の方法。
24. ＭＴＥＧは約１０％～約１００％重量／容量の濃度の最終濃度である、請求項２３に記載の方法。
25. ＭＴＥＧは約１５％～約４５％重量／容量、例えば約２０％～約４０％重量／容量の最終濃度である、請求項２４に記載の方法。
26. ＭＴＥＧは約２０％、約２５％、約３０％または約３５％重量／容量の最終濃度である、請求項２５に記載の方法。
27. ＭＴＥＧは約２５％重量／容量の最終濃度である、請求項２６に記載の方法。
28. 懸濁液は沈殿したｍＲＮＡ、塩およびＭＴＥＧを含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 塩はグアニジニウムチオシアネート（ＧＳＣＮ）である、請求項２６に記載の方法。
30. 懸濁液はアルコール、例えばエタノールを含まない、請求項１～８および１０～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 工程（ａ）は少なくとも１つの濾過助剤を、沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液に加えることをさらに含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 沈殿したｍＲＮＡおよび少なくとも１つの濾過助剤は約１：２；約１：５；約１：１０または約１：１５の質量比である、請求項３１に記載の方法。
33. 沈殿したｍＲＮＡおよび少なくとも１つの濾過助剤は約１：１０の質量比である、請求項３２に記載の方法。
34. 濾過助剤は分散剤である、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
35. 分散剤は灰、粘土、珪藻土、ガラスビーズ、プラスチックビーズ、ポリマー、ポリマービーズ（例えば、ポリプロピレンビーズ、ポリスチレンビーズ）、塩（例えば、セルロース塩）、砂および糖の１つまたはそれ以上である、請求項３４に記載の方法。
36. ポリマーは天然に存在するポリマー、例えばセルロース（例えば、粉末セルロース繊維）である、請求項３５に記載の方法。
37. 懸濁液は、少なくとも１００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、１ｋｇ、１０ｋｇ、１００ｋｇ、１メートルトンまたは１０メートルトンのｍＲＮＡ、またはその間の任意の量を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
38. 懸濁液は１ｋｇより多くのｍＲＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
39. フィルターは多孔性基質を含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
40. 多孔性基質はフィルター布、フィルター紙、スクリーンおよびワイヤメッシュである、請求項３９に記載の方法。
41. フィルターは微量濾過膜または限外濾過膜である、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
42. フィルターは約０．５ミクロンもしくはそれ以上、約０．７５ミクロンもしくはそれ以上、約１ミクロンもしくはそれ以上、約２ミクロンもしくはそれ以上、約３ミクロンもしくはそれ以上、約４ミクロンもしくはそれ以上、または約５ミクロンもしくはそれ以上の平均孔径を有する、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
43. フィルターは約０．０１ミクロン～約２００ミクロン、約１ミクロン～約２０００ミクロン、約０．２ミクロン～約５ミクロン、または約１ミクロン～約３ミクロン、例えば約１ミクロンの平均孔径を有する、請求項４２に記載の方法。
44. フィルター布は約１ミクロンの平均孔径を有するポリプロピレン布である、請求項４０、４２および４３のいずれか１項に記載の方法。
45. 保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量はｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約８Ｌの間である、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
46. 保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量はｍＲＮＡ １ｇにつき２Ｌ未満である、請求項４５に記載の方法。
47. 保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量はｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５Ｌの間である、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
48. 保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量はｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５Ｌである、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。
49. 洗浄バッファーは約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度で、例えば約１０リットル／分／ｍ^２～約２０リットル／分／ｍ^２の速度で、例えば約１５リットル／分／ｍ^２の速度で濾過遠心分離機に投入される、請求項４５～４８のいずれか１項に記載の方法。
50. 洗浄バッファーの総容量は約０．５時間から約４時間の間に、例えば約９０分未満に濾過遠心分離機に投入される、請求項４９に記載の方法。
51. 保持された沈殿したｍＲＮＡは約０．５時間から約４時間の間に約５０％から約１００％の間の純度まで洗浄される、請求項５０に記載の方法。
52. 保持された沈殿したｍＲＮＡは約９０分未満に少なくとも９５％、例えば約９９％の純度まで洗浄される、請求項５１に記載の方法。
53. 洗浄バッファーはアルコール、両親媒性ポリマー、バッファー、塩および／または界面活性剤の１つまたはそれ以上を含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。
54. 洗浄バッファーはアルコールまたは両親媒性ポリマーを含む、請求項５３に記載の方法。
55. 洗浄バッファーはエタノールを含み、場合によりエタノールは約８０％重量／容量の濃度である、請求項５３または５４に記載の方法。
56. 洗浄バッファーはプルロニック、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トリエチレングリコールモノメチルエーテル（ＭＴＥＧ）またはその組合せから選択される両親媒性ポリマーを含む、請求項５３または５４に記載の方法。
57. 両親媒性ポリマーはＰＥＧである、請求項５６に記載の方法。
58. ＰＥＧは約１０％～約１００％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する、請求項５７に記載の方法。
59. ＰＥＧは約５０％～約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する、請求項５８に記載の方法。
60. ＰＥＧは約９０％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する、請求項５９に記載の方法。
61. ＰＥＧの分子量は約１００～約１，０００ｇ／ｍｏｌである、請求項５７～６０のいずれか１項に記載の方法。
62. ＰＥＧの分子量は約２００～６００ｇ／ｍｏｌである、請求項６１に記載の方法。
63. ＰＥＧの分子量は約４００ｇ／ｍｏｌ（例えばＰＥＧ－４００）である、請求項６２に記載の方法。
64. 両親媒性ポリマーはＭＴＥＧである、請求項５６に記載の方法。
65. ＭＴＥＧは約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する、請求項６４に記載の方法。
66. ＭＴＥＧは約９０％重量／容量の濃度または約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する、請求項６５に記載の方法。
67. ＭＴＥＧは約９５％重量／容量の濃度で洗浄溶液中に存在する、請求項６６に記載の方法。
68. 洗浄バッファーはアルコール、例えばエタノールを含まない、請求項５３、５４および５６～６７のいずれか１項に記載の方法。
69. 保持されたｍＲＮＡを回収することは、濾過遠心分離機が運転中である間に生じる、請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法。
70. 保持されたｍＲＮＡを回収することは、保持された沈殿したｍＲＮＡを濾過遠心分離機のフィルターから除去する刃を通して生じる、請求項６９に記載の方法。
71. 保持されたｍＲＮＡを回収することは、濾過遠心分離機が運転中でない間に生じる、請求項１～７０のいずれか１項に記載の方法。
72. アルコール、例えばエタノールを含まない、請求項１～６、１０～２９、３１～５２および５６～７１のいずれか１項に記載の方法。
73. 保持されたｍＲＮＡを可溶化することは水性媒体にｍＲＮＡを溶解することを含む、請求項３～７２のいずれか１項に記載の方法。
74. 水性媒体は水、バッファー（例えば、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）バッファーまたはクエン酸ナトリウムバッファー）、糖溶液（例えば、スクロースまたはトレハロース溶液）またはその組合せを含む、請求項７３に記載の方法。
75. 水性媒体は注射用水である、請求項７４に記載の方法。
76. 水性媒体はＴＥバッファーである、請求項７４に記載の方法。
77. 水性媒体は１０％トレハロース溶液である、請求項７４に記載の方法。
78. 可溶化することは濾過遠心分離機内で生じる、請求項７３～７７のいずれか１項に記載の方法。
79. 可溶化することは濾過遠心分離機の外側で生じる、請求項７３～７７のいずれか１項に記載の方法。
80. 可溶化されたｍＲＮＡを収集することは、可溶化されたｍＲＮＡから濾過助剤を分離する１つまたはそれ以上の工程を含む、請求項３１～７９のいずれか１項に記載の方法。
81. 可溶化されたｍＲＮＡから濾過助剤を分離する１つまたはそれ以上の工程は、可溶化されたｍＲＮＡおよび濾過助剤を含む溶液をフィルターに適用することを含み、濾過助剤はフィルターによって保持され、精製されたｍＲＮＡの溶液をもたらす、請求項８０に記載の方法。
82. 可溶化されたｍＲＮＡおよび濾過助剤を含む溶液は遠心分離によって濾過遠心分離機のフィルターに適用される、請求項８１に記載の方法。
83. 遠心分離速度は３１００ｇ未満、例えば約１０００ｇから約３０００ｇの間の重力（ｇ）を発揮する、請求項８２に記載の方法。
84. 濾過遠心分離機は連続遠心分離機であり、および／または濾過遠心分離機は垂直もしくは水平に配向されるか、または遠心分離機は反転水平遠心分離機である、請求項１～８３のいずれか１項に記載の方法。
85. 濾過遠心分離機は試料供給ポートおよび／または試料排出ポートを含む、請求項１～８４のいずれか１項に記載の方法。
86. ｍＲＮＡ懸濁液は約１リットル／分～約６０リットル／分の速度で、例えば約５リットル／分～約４５リットル／分の速度で濾過遠心分離機に投入される、請求項１～８５のいずれか１項に記載の方法。
87. 全ｍＲＮＡ懸濁液は約０．５時間から約８時間の間に、例えば約２時間から約６時間の間に濾過遠心分離機に投入される、請求項８６に記載の方法。
88. ｍＲＮＡを製造することはｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）合成を含む、請求項１～８７のいずれか１項に記載の方法。
89. ｍＲＮＡを製造することはｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程を含む、請求項８８に記載の方法。
90. ｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程はｍＲＮＡの５’キャッピングをさらに含む、請求項８９に記載の方法。
91. ｍＲＮＡのＩＶＴ合成はｍＲＮＡの５’－キャッピングおよび場合により３’－テーリングを含む、請求項８８に記載の方法。
92. 工程（ａ）～（ｄ）はｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後に実行される、請求項８８～９１のいずれか１項に記載の方法。
93. ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量はｍＲＮＡ １ｇにつき８Ｌ未満、例えばｍＲＮＡ １ｇにつき６Ｌ未満またはｍＲＮＡ １ｇにつき５Ｌ未満である、請求項９２に記載の方法。
94. ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量はｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約４Ｌの間である、請求項９３に記載の方法。
95. ＩＶＴ合成の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの容量はｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５Ｌの間である、請求項９４に記載の方法。
96. 工程（ａ）～（ｄ）はｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後に、そしてｍＲＮＡの３’－テーリングの別個の工程の後に再び実行される、請求項８７～９１のいずれか１項に記載の方法。
97. ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後および／または３’－テーリングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき８Ｌ未満、例えばｍＲＮＡ １ｇにつき６Ｌ未満またはｍＲＮＡ １ｇにつき５Ｌ未満である、請求項９６に記載の方法。
98. ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後および／または３’－テーリングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約４Ｌの間である、請求項９７に記載の方法。
99. ｍＲＮＡのＩＶＴ合成の後および／または３’－テーリングの別個の工程の後の保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄するための洗浄バッファーの全容量は、ｍＲＮＡ １ｇにつき約０．５ＬからｍＲＮＡ １ｇにつき約１．５Ｌの間、例えばｍＲＮＡ １ｇにつき約１Ｌである、請求項９８に記載の方法。
100. ｍＲＮＡは、長さが約１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂまたは２０ｋｂであるかまたはそれ以上である、請求項１～９９のいずれか１項に記載の方法。
101. ｍＲＮＡは１つまたはそれ以上のヌクレオチド修飾を含む、請求項１～１００のいずれか１項に記載の方法。
102. １つまたはそれ以上のヌクレオチド修飾は修飾された糖、修飾された塩基および／または修飾された糖リン酸骨格を含む、請求項１０１に記載の方法。
103. ｍＲＮＡはヌクレオチド修飾を含まない、請求項１～１００のいずれか１項に記載の方法。
104. 精製されたｍＲＮＡの回収は単一のバッチにつき少なくとも１０ｇ、２０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇまたは１００ｋｇである、請求項１～１０３のいずれか１項に記載の方法。
105. 全精製ｍＲＮＡは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または約１００％の収率をもたらす量で回収される、請求項１～１０４のいずれか１項に記載の方法。
106. 全精製ｍＲＮＡは約８０％～約１００％の収率をもたらす量で回収される、請求項１０５に記載の方法。
107. 全精製ｍＲＮＡは約９０％～約９９％の収率をもたらす量で回収される、請求項１０６に記載の方法。
108. 全精製ｍＲＮＡは少なくとも約９０％の収率をもたらす量で回収される、請求項１０７に記載の方法。
109. 精製されたｍＲＮＡの純度は約６０％から約１００％の間である、請求項１～１０８のいずれか１項に記載の方法。
110. 精製されたｍＲＮＡの純度は約８０％から９９％の間である、請求項１０９に記載の方法。
111. 精製されたｍＲＮＡの純度は約９０％から約９９％の間である、請求項１１０に記載の方法。
112. 精製されたｍＲＮＡは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の完全性を有する、請求項１～１１１のいずれか１項に記載の方法。
113. 精製されたｍＲＮＡは約９５％またはそれ以上の完全性を有する、請求項１１２に記載の方法。
114. 精製されたｍＲＮＡは約９８％またはそれ以上の完全性を有する、請求項１１３に記載の方法。
115. 精製されたｍＲＮＡは約９９％またはそれ以上の完全性を有する、請求項１１４に記載の方法。
116. 精製されたｍＲＮＡはさらなる精製なしで臨床グレードの純度を有する、請求項１～１１５のいずれか１項に記載の方法。
117. 精製されたｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動によって決定されるように、５％もしくはそれ以下、４％もしくはそれ以下、３％もしくはそれ以下、２％もしくはそれ以下、１％もしくはそれ以下のタンパク質夾雑物を含むか、またはタンパク質夾雑物を実質的に含まない、請求項１１６に記載の方法。
118. 精製されたｍＲＮＡは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定される、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の塩夾雑物を含むか、または塩夾雑物を実質的に含まない、請求項１１６または１１７に記載の方法。
119. 精製されたｍＲＮＡは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって決定される、５％もしくはそれ以下、４％もしくはそれ以下、３％もしくはそれ以下、２％もしくはそれ以下、１％もしくはそれ以下の短い不全型の転写夾雑物を含むか、または短い不全型の転写夾雑物を実質的に含まない、請求項１１６～１１８のいずれか１項に記載の方法。
120. 精製されたｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動によって決定されるように、９５％もしくはそれ以上、９６％もしくはそれ以上、９７％もしくはそれ以上、９８％もしくはそれ以上、または９９％もしくはそれ以上の完全性を有する、請求項１～１１９のいずれか１項に記載の方法。
121. 臨床グレードの純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製、リガンドもしくは結合をベースとした精製、接線流濾過（ＴＦＦ）精製および／またはイオン交換クロマトグラフィーから選択されるさらなる精製なしで達成される、請求項１１６～１２０のいずれか１項に記載の方法。
122. １つまたはそれ以上のタンパク質および／または短い不全型の転写夾雑物は、ＩＶＴ ｍＲＮＡ合成で使用される酵素試薬を含む、請求項１～１２１のいずれか１項に記載の方法。
123. 酵素試薬はポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ピロホスファターゼおよびキャッピング酵素を含む、請求項１２２に記載の方法。
124. 長い不全型のＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ残留溶媒および／または残留塩も除去する、請求項１～１２３のいずれか１項に記載の方法。
125. 短い不全型の転写夾雑物は１５未満の塩基を含む、請求項１～１２４のいずれか１項に記載の方法。
126. 短い不全型の転写夾雑物は約８～１２塩基を含む、請求項１～１２５のいずれか１項に記載の方法。
127. ＲＮアーゼ阻害剤も除去する、請求項１～１２６のいずれか１項に記載の方法。
128. 請求項１～１２７のいずれか１項に記載の方法によって得られる精製されたｍＲＮＡ。
129. 請求項１２８に記載の精製されたｍＲＮＡを含む組成物。
130. 少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１２９に記載の組成物。
131. 疾患または障害を処置するための方法であって、それを必要とする対象に請求項１２８に記載の精製されたｍＲＮＡまたは請求項１２９もしくは１３０に記載の組成物を投与することを含む方法。
132. 療法で使用するための、請求項１２８に記載の精製されたｍＲＮＡまたは請求項１２９もしくは１３０に記載の組成物。
133. ｍＲＮＡを精製するための方法であって：
     Ｉ．１つまたはそれ以上のタンパク質および／またはｍＲＮＡの製造に由来する短い不全型の転写夾雑物を含む沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を第１の容器で提供する工程と；
     ＩＩ．第２の容器で洗浄バッファーを提供する工程と；
     ＩＩＩ．フィルターを含む濾過遠心分離機に第１の容器の内容物を移す工程であって、移すことは、沈殿したｍＲＮＡが前記濾過遠心分離機のフィルターの上で保持されるように、濾過遠心分離機が第１の遠心分離速度で運転中である間に約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度で生じる、工程と；
     ＩＶ．濾過遠心分離機に第２の容器の内容物を移す工程であって、移すことは、濾過遠心分離機が第１の遠心分離速度でそのまま運転中である間に約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して）の速度で生じ、それによって前記濾過遠心分離機のフィルターの上で保持される沈殿したｍＲＮＡを洗浄バッファーで洗浄する、工程と；
     Ｖ．洗浄された沈殿したｍＲＮＡを前記濾過遠心分離機のフィルターから回収する工程と
     を含む方法。
134. 工程（ＩＩＩ）および（ＩＶ）において移すことはポンピングによる、請求項１３３に記載の方法。
135. 工程（ＩＩＩ）および（ＩＶ）におけるポンピングは第１および第２の容器に作動可能に連結される単一のポンプによる、請求項１３４に記載の方法。
136. １つまたはそれ以上の弁が第１の容器および第２の容器から移すことを制御する、請求項１３５に記載の方法。
137. 第１の容器の内容物および第２の容器の内容物は試料供給ポートを通して濾過遠心分離機に移される、請求項１３３～１３６のいずれか１項に記載の方法。
138. 工程（Ｖ）の後に濾過遠心分離機のフィルターは１％の１０Ｎ ＮａＯＨを含む注射用水ですすがれる、請求項１３３に記載の方法。
139. 沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液は濾過助剤を含む、請求項１３３～１３８のいずれか１項に記載の方法。
140. ｉ．工程（Ｖ）で回収された濾過助剤を含む洗浄された沈殿したｍＲＮＡを可溶化することと；
     ｉｉ．工程（ｉ）からの可溶化されたｍＲＮＡを、濾過助剤を保持するためのフィルターを含む濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（例えば約１５リットル／分／ｍ^２）の速度で、濾過遠心分離機または前記濾過遠心分離機に移すことと；
     ｉｉｉ．可溶化された精製されたｍＲＮＡを遠心分離によって濾過遠心分離機から収集することと
     をさらに含む、請求項１３９に記載の方法。
141. 移すことは濾過遠心分離機の試料供給ポートを通して行われる、請求項１４０に記載の方法。
142. 工程（ｉｉｉ）は濾過遠心分離機の試料排出ポートを通して可溶化された精製されたｍＲＮＡを収集することを含む、請求項１４０または１４１に記載の方法。
143. ｍＲＮＡを精製するためのシステムであって：
     Ｉ．沈殿したｍＲＮＡを受けるための第１の容器；
     ＩＩ．洗浄バッファーを受けるための第２の容器；
     ＩＩＩ．洗浄された沈殿したｍＲＮＡおよび／または沈殿したｍＲＮＡを可溶化するための水性媒体を受けるための第３の容器；
     ＩＶ．以下を含む濾過遠心分離機：
     ｉ．沈殿したｍＲＮＡおよび／または濾過助剤を保持し、可溶化したｍＲＮＡを通過させるように配置され、寸法を合わせたフィルター；
     ｉｉ．試料供給ポート；および
     ｉｉｉ．試料排出ポート；
     Ｖ．濾過遠心分離機の試料排出ポートに連結される、精製されたｍＲＮＡを受けるための第４の容器；
     ＶＩ．濾過遠心分離機のフィルターの表面積に対して約５リットル／分／ｍ^２～約２５リットル／分／ｍ^２（例えば約１５リットル／分／ｍ^２）の速度でシステムの中を通して流れを導くように構成されるポンプであって；第１の容器、第２の容器および第３の容器はポンプのインプットに作動可能に連結され、濾過遠心分離機の試料供給ポートはポンプのアウトプットに連結される、ポンプ；ならびに
     ＶＩＩ．第１、第２および第３の容器からの同時の流れを妨げるように構成される１つまたはそれ以上の弁
     を含むシステム。
144. 第１の遠心分離速度は１３００ｇ未満の重力（ｇ）を発揮する、請求項１４３に記載のシステム。
145. 請求項１３７に記載の方法を実行するようにシステムを制御する手段を含むデータ処理装置をさらに含む、請求項１４４に記載のシステム。
146. データ処理装置は（ａ）命令を含むコンピュータプログラムまたは（ｂ）命令を含むコンピュータ可読記憶媒体である、請求項１４５に記載のシステム。
147. 無菌のＲＮアーゼ不含容器にｍＲＮＡ、両親媒性ポリマーおよび濾過助剤を約１：１：１０の相対濃度で含む組成物。
148. １０ｇ、５０ｇ、１００ｇ、２００ｇ、３００ｇ、４００ｇ、５００ｇ、６００ｇ、７００ｇ、８００ｇ、９００ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１メートルトン、１０メートルトンまたはそれ以上のｍＲＮＡを含む、請求項１４７に記載の組成物。
149. 両親媒性ポリマーは約２０００～１００００ｇ／ｍｏｌ；４０００～８０００ｇ／ｍｏｌまたは約６０００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するＰＥＧ（例えばＰＥＧ－６０００）を含む、請求項１４７または１４８に記載の組成物。
150. 両親媒性ポリマーはＭＴＥＧを含む、請求項１４７または１４８に記載の組成物。
151. 濾過助剤はセルロースをベースとしている、請求項１４７～１５０のいずれか１項に記載の組成物。

Images