CN105051213A - 信使rna加帽效率的定量评估 - Google Patents

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CN105051213A CN201480013628.3A CN201480013628A CN105051213A CN 105051213 A CN105051213 A CN 105051213A CN 201480013628 A CN201480013628 A CN 201480013628A CN 105051213 A CN105051213 A CN 105051213A
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F·德罗莎
A·迪亚斯
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Abstract

本发明尤其提供了定量mRNA加帽效率的方法，特别是体外合成的mRNA。在一些实施方案中，所述方法包括定量加帽效率和帽的甲基化状态的色谱方法。

Description

信使RNA加帽效率的定量评估
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请序号61/784,337的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。
背景
信使RNA(“mRNA”)疗法正成为用于治疗多种疾病的日益重要的方法。有效的mRNA疗法需要将mRNA有效递送至患者以及在患者体内有效生成由该mRNA编码的蛋白。为了优化mRNA递送和体内蛋白生成，通常在构建体的5'端需要适当的帽，其防止mRNA降解并促进成功的蛋白翻译。因此，加帽效率的准确表征对于确定mRNA治疗应用的质量是特别重要的。
发明概述
本发明提供了用于准确且定量测定mRNA加帽效率的改良方法，特别是体外合成的mRNA。如上讨论的，适当的加帽对于成功的体内蛋白生成是重要的。然而，在本发明之前，大多数帽测定是定性的，这不足以评估基于mRNA的治疗产品质量和相关的体内使用安全性和效力。事实上，在本发明之前，还没有可用的允许在不永久改变样品中mRNA的条件下定量加帽效率的方法。
如下详细描述的，本发明部分基于通过色谱产生和定量加帽片段和未加帽片段。因此，本发明提供了用于评估mRNA加帽效率的简单、可靠且有效的定量方法。本发明特别用于mRNA生产期间的质量控制以及mRNA作为最终治疗产品中活性药物成分(API)的表征。
一方面，本发明提供了定量mRNA加帽效率的方法，包括以下步骤：(1)提供包含加帽mRNA和未加帽mRNA的mRNA样品；(2)在允许与邻近加帽或未加帽的mRNA的倒数第二个碱基的所述mRNA的5'未翻译区中的序列互补的DNA寡核苷酸与所述序列复性的条件下使所述mRNA样品与所述DNA寡核苷酸接触；(3)提供选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性mRNA的一种或多种核酸酶，得到加帽片段和未加帽片段；(4)通过色谱分离所述加帽片段和未加帽片段；和(5)测定所述加帽片段和未加帽片段的相对量，从而定量mRNA加帽效率。
在一些实施方案中，本发明的发明方法可用于定量具有式I结构的帽：
其中,
B是核碱基；
R1选自卤素、OH和OCH3；
R2选自H、OH和OCH3；
R3是CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3或不存在；
R4是NH2；
R5选自OH、OCH3和卤素；
n是1、2或3；并且
M是该mRNA的核苷酸。
在一些实施方案中，该核碱基是鸟嘌呤。
在一些实施方案中，本发明的发明方法可用于定量具有式II结构的m7G帽或具有式III结构的未甲基化帽：
其中，
R2是H或CH3；
R4是NH2；
R5是OH或OCH3；
R6是H或CH3；并且
M是该mRNA的核苷酸。
其中M是所述mRNA的核苷酸。
在一些实施方案中，步骤(4)进一步分离甲基化加帽RNA和未甲基化加帽RNA。在一些实施方案中，甲基化的帽包括在如式I所示R3和/或R5位置的甲基化。在一些实施方案中，根据本发明的发明方法还包括定量测定所述加帽RNA的甲基化百分比的步骤。
在一些实施方案中，适合的DNA寡核苷酸长度大约10-80个核苷酸(例如，长度约10-75、10-70、10-65、10-60、10-55、10-50、10-45、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、或10-15个核苷酸)。在一些实施方案中，适合的DNA寡核苷酸长度是或大于约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80个核苷酸。在一些实施方案中，适合的DNA寡核苷酸的一侧或两侧具有一个或多个RNA核苷酸(例如，1、2、3、4、5或更多个RNA核苷酸)。
在一些实施方案中，适合的DNA寡核苷酸与在从加帽或未加帽的mRNA倒数第二个碱基的1、2、3、4或5个碱基内的所述mRNA的5'未翻译区中的序列互补。
在一些实施方案中，选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性RNA的一种或多种核酸酶包括RNA酶H。在一些实施方案中，选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性RNA的一种或多种核酸酶包括产生平端加帽片段和未加帽片段的核酸酶。在一些实施方案中，所述一种或多种核酸酶包括核酸酶S1和/或RNA酶H、或另一种5'核酸外切酶。
在一些实施方案中，来自步骤(3)的加帽片段和未加帽片段包括所述mRNA的不超过5个碱基(例如，不超过4、3、2或1个)。在一些实施方案中，来自步骤(3)的加帽片段和未加帽片段包括所述mRNA的不超过2个碱基。
在一些实施方案中，本文描述的发明方法的步骤(4)包括将所述加帽片段和未加帽片段施加至色谱柱的步骤。在一些实施方案中，适合的色谱柱选自由以下组成的组：阴离子交换HPLC柱、阳离子交换HPLC柱、反相HPLC柱、疏水相互作用柱、高效液相色谱柱或尺寸排阻柱。
在一些实施方案中，本文描述的发明方法的步骤(5)包括测定所述加帽片段和未加帽片段的相对峰面积。
在一些实施方案中，根据本发明的发明方法用于定量体外合成的mRNA样品的mRNA加帽效率。
本发明还尤其提供了用于进行本文描述的发明方法的组合物和试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供了定量mRNA加帽效率的试剂盒，包括以下一种或多种：(1)与邻近加帽或未加帽的mRNA的倒数第二个碱基的待定量的mRNA的5'未翻译区中的序列互补的DNA寡核苷酸；(2)用于DNA与RNA之间复性的一种或多种试剂；(3)选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性mRNA的一种或多种核酸酶(例如，RNA酶H和/或核酸酶S1)；和(4)用于进行色谱(例如色谱柱)的一种或多种试剂。
而在另一方面，本发明提供了生产mRNA的方法，包括根据本文描述的方法定量mRNA加帽效率的步骤。在一些实施方案中，根据本发明的生产方法包括基于定量mRNA加帽效率结果来调整生产条件的步骤。在一些实施方案中，定量步骤在释放mRNA批次之前进行。
本发明还尤其提供了根据本文描述的方法生产的mRNA。
如本申请中使用的，术语“约”和“大约”作为等同物使用。本申请中有或没有约/大约而使用的任何数值意思涵盖相关领域普通技术人员理解的任何正常波动。
本发明的其他特征、目的和优点在随后详述中是明显的。但应理解，详述表明本发明的实施方案，仅作为示例而非限制给出。对于本领域技术人员而言，本发明范围内的各种变化和调整将根据详述而变得显而易见。
附图简述
附图为了示例说明目的而绝非限制。
图1描绘了在色谱分离之前包括mRNA的酶操作的示例性实施方案。使用DNA寡核苷酸引物复性邻近可能存在的帽0或帽1结构的mRNA。提供核酸酶以消化DNA:RNA杂合体中的RNA，从而产生加帽或未加帽的分析物。
图2是本发明各个实施方案中存在的示例性mRNA加帽结构和未加帽结构的图。
图3是说明如通过ELISA测量的、分泌的人类α-半乳糖苷酶(GLA)蛋白水平的定量的条线图。检测到的蛋白是其从经由单剂量脂质纳米颗粒(30ug包封的GLAmRNA)静脉内递送的GLAmRNA在施用后6小时生成的结果。
定义
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。说明书通篇给出了以下术语和其他术语的额外定义。
亲和力：如本领域已知的，“亲和力”是特定配体结合(例如，非共价结合)紧密度的量度和/或特定配体与其配偶体解离的速率或频率。如本领域已知的，许多技术的任何一个可用于测定亲和力。在许多实施方案中，亲和力代表特异性结合的量度。
退火或杂交：如本文使用的，术语“退火”、“杂交”和语法等同物指足够互补以经由瓦特生-克里克(Watson-Crick)碱基配对或非正则碱基配对形成复合物的核苷酸序列之间形成复合物(还称为双链体或杂交体)。还要理解，退火或杂交序列不需要具有提供给稳定杂交体的完美互补性。在许多情况下，稳定杂交体会在少于约10％碱基错配时形成。因此，如本文使用的，术语“互补的”指在特定条件下与其互补体形成稳定双链体的核酸分子，一般情况是存在约90％或更大同源性(例如，约95％或更大、约98％或更大、或约99％或更大同源性)。本领域技术人员理解如何估计和调节杂交条件的严格性，使得至少具有所需水平互补性的序列会稳定杂交，而具有较低互补性的那些则不会。有关杂交条件和参数的实例，参见例如Sambrook等人,“MolecularCloning：ALaboratoryManual”,1989,第二版,ColdSpringHarborPress：Plainview,NYandAusubel,“CurrentProtocolsinMolecularBiology”,1994,JohnWiley&Sons：Secaucus,NJ。如果所有核酸碱基匹配，则两个核酸分子之间的互补性称为“完全”、“全部”或“完美”，否则称为“部分”。
大约：如本文使用的，应用至一个或多个关注值的术语“大约”或“约”指与参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另外说明或者根据上下文明显的，术语“大约”或“约”指在任一方向(大于或小于)落入该参考值25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值范围(除了此类数字会超出可能值的100％的情况)。
色谱：如本文使用的，术语“色谱”指分离混合物的技术。通常，将混合物溶解于称为“流动相”的流体中，流动相携带混合物通过容纳称为“固定相”的另一种物质的结构。柱色谱是其中固定床在管(即，柱)内的分离技术。
化合物和剂：术语“化合物”和“剂”在本文可互换使用。它们指任何天然存在或非天然存在的(即，合成的或重组的)分子，例如生物大分子(例如，核酸、多肽或蛋白)，有机或无机分子，或从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物，包括人)细胞或组织制成的提取物。化合物可以是单一分子或者至少两个分子的混合物或复合物。
对照：如本文使用的，术语“对照”具有其本领域理解的含义，作为结果对比的标准。通常，对照通过分离变量以得出有关此类变量的结论而用于增加实验完整性。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供对比者的反应或测定。在一个实验中，应用“测试”(即，变量被测试)。在第二个实验“对照”中，不应用测试的变量。在一些实施方案中，对照是历史对照(即，之前进行的测试或测定，或者之前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是或包括印刷或以其他方式保留的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。
试剂盒：如本文使用的，术语“试剂盒”指用于递送材料的任何递送系统。此类递送系统可以包括允许储存、运输或递送各种诊断或治疗试剂(例如，在适当容器中的寡核苷酸、抗体、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲剂，用于进行测定的书写说明书，等)从一个地方至另一个地方的系统。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个外壳(例如，盒子)。如本文使用的，术语“片段化试剂盒”指包括两个或多个单独容器的递送系统，该容器各自包含总体试剂盒组分的子部分。容器可以一起或单独递送至预期接受者。例如，第一容器可以包含用于测定的酶，而第二容器包含寡核苷酸。术语“片段化试剂盒”预期涵盖包含美国联邦食品、药品和化妆品法案的第520(e)章下管理的分析物特异性试剂(ASR)的试剂盒，但不限于此。实际上，术语“片段化试剂盒”包括包含各自包含总体试剂盒组分的子部分的两个或多个单独容器的任何递送系统。相反，“组合试剂盒”指在单一容器(例如，在容纳所需组分每一个的单一盒子)中包含所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括片段化试剂盒和组合试剂盒。
核苷：如本文使用的，术语“核苷”或“核碱基”指与糖类例如D-核糖(RNA中)或2'-脱氧-D-核糖(DNA中)通过糖类的异头碳(糖类的1'-碳原子)与核碱基之间的N-糖苷键连接的腺嘌呤(“A”)、鸟嘌呤(“G”)、胞嘧啶(“C”)、尿嘧啶(“U”)、胸腺嘧啶(“T”)及其类似物。当核碱基是嘌呤例如A或G时，核糖一般连接至嘌呤杂环的N9-位。当核碱基是嘧啶例如C、T或U时，糖一般连接至杂环的N1-位。糖类可以是取代或未取代的。取代的核糖包括但不限于其中碳原子的一个或多个(例如2'-碳原子)经相同或不同Cl、F、--R、--OR、--NR2或卤素基团的一个或多个取代的那些，其中每个R独立为H、C1-C6烷基或C5-C14芳基。核糖实例包括核糖、2'-脱氧核糖、2',3'-二脱氧核糖、2'-卤代核糖、2'-氟代核糖、2'-氯代核糖和2'-烷基核糖，例如2'-O-甲基、4'-α-异头核苷酸、1'-α-异头核苷酸(Asseline等人,NUCL.ACIDSRES.,19：4067-74[1991])、2'-4'-和3'-4'-连接的和其他“锁定的”或“LNA”双环糖修饰(WO98/22489；WO98/39352；WO99/14226)。
核苷酸：如本文使用的术语“核苷酸”表示磷酸化形式的核苷(核苷的磷酸酯)，作为单体单元或者多核苷酸多聚物内。“核苷酸5'-三磷酸”指在5'位置具有三磷酸基团的核苷酸，有时表示为“NTP”或“dNTP”和“ddNTP”，以特别指出核糖的结构特征。三磷酸基团可以包括各种氧部分的硫取代，例如α-硫代-核苷酸5'-三磷酸。核苷酸可以单-、二-或三-磷酸化形式存在。核苷酸中存在的核糖的碳原子用上撇号(')指定，以使其区别于碱基中的骨架编号。关于多核苷酸和核酸化学的综述，参见Shabarova,Z.和Bogdanov,A.AdvancedOrganicChemistryofNucleicAcids,VCH,NewYork,1994。
核酸：术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”或“寡核苷酸”在本文可互换使用。它们指核苷酸单体或其类似物的聚合物，例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)及其组合。核苷酸来源可以是基因组的、合成的或半合成的。除非另外说明，这些术语涵盖具有合成骨架的核酸样结构以及扩增产物。如本领域技术人员理解的，这些聚合物的长度(即，其含有的核苷酸的数目)可以广泛变化，通常取决于其预期功能或用途。多核苷酸可以是线性的、分支线性或环状分子。多核苷酸还具有结合的反离子，例如H+、NH4 +、三烷基铵、Mg+、Na+等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸、完全由核糖核苷酸或其嵌合混合物构成。多核苷酸可以由核苷酸间核碱基和糖类似物构成。
在一些实施方案中，术语“寡核苷酸”在本文用于指包括约5至约150个核苷酸，例如约10至约100个核苷酸、约15至约75个核苷酸、或约15至约50个核苷酸的多核苷酸。贯穿本说明书，无论何时寡核苷酸由字母(例如，选自四碱基字母：A、C、G和T，其分别指腺苷、胞苷、鸟苷和胸苷)序列表示时，核苷酸以从左到右5'至3'顺序表示。“多核苷酸序列”指核苷酸单体沿聚合物的序列。除非另外指明，无论何时表示多核苷酸序列，要理解核苷酸从左到右为5'至3'取向。
核酸、多核苷酸和寡核苷酸可以包括标准核苷酸碱基或经核苷酸同种型类似物取代，包括但不限于iso-C和iso-G碱基，其可以比标准碱基或多或少允许杂交，并且优先与互补同种型类似物碱基杂交。例如，Benner等人,(1987)ColdSpringHarb.Symp.Quant.Biol.52,53-63描述了许多此类同种型碱基。天然存在的核苷酸单体的类似物包括例如7-去氮杂腺嘌呤、7-去氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂鸟嘌呤、7-去氮杂-8-氮杂腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、肌苷、水粉蕈素、硝基吡咯(Bergstrom,J.Amer.Chem.Soc.,117：1201-1209[1995])、硝基吲哚、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯代嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤(Seela，美国专利号6,147,199)、7-去氮杂鸟嘌呤(Seela，美国专利号5,990,303)、2-氮杂嘌呤(Seela,WO01/16149)、2-硫代嘧啶,6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、0-6-甲基鸟嘌呤、N-6-甲基腺嘌呤、O-4-甲基胸腺嘧啶、5,6-二氢胸腺嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶、4-甲基吲哚、吡唑并[3,4-D]嘧啶、“PPG”(Meyer，美国专利号6,143,877和6,127,121；Gall,WO01/38584)和亚乙烯基腺嘌呤(Fasman(1989)于PracticalHandbookofBiochemistryandMolecularBiology,第385-394页,CRCPress,BocaRaton,Fla.)。
术语“3'”指来自相同多核苷酸或寡核苷酸的另一区域或位置的多核苷酸或寡核苷酸3'(即，下游)中的区域或位置。术语“5'”指来自相同多核苷酸或寡核苷酸的另一区域或位置的多核苷酸或寡核苷酸5'(即，上游)中的区域或位置。如本文涉及核酸分子使用的，术语“3'末端”和“3'端”指包含与末端戊糖的3’碳连接的游离羟基的核酸末端。如本文涉及核酸分子使用的，术语“5'末端”和“5'端”指包含与末端戊糖的5’碳连接的游离羟基或磷酸基团的核酸分子末端。在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸引物包含在其5'端的多聚腺苷片段。
靶：如本文使用的，术语“靶”指关注的分子。
详述
本发明尤其提供了用于定量mRNA加帽效率的改良方法。在一些实施方案中，本发明提供了基于以下而定量mRNA加帽效率的方法：产生加帽片段和未加帽片段，通过色谱分离所述加帽片段和未加帽片段，并且测定所述加帽片段和未加帽片段的相对量。在一些实施方案中，可以通过以下来产生加帽和未加帽的mRNA：在允许与邻近加帽或未加帽的mRNA的倒数第二个碱基的mRNA的5'未翻译区中的序列互补的DNA寡核苷酸与所述序列复性的条件下使所述mRNA样品与所述DNA寡核苷酸接触；并通过一种或多种核酸酶(例如，核酸酶S1、RNA酶H、和/或其他5'外切核酸酶)选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性mRNA。在一些实施方案中，基于色谱的方法可以进一步分离甲基化加帽mRNA和未甲基化加帽mRNA并测定甲基化状态和加帽mRNA的百分比。
本发明的各个实施方案用于定量体外mRNA合成期间的加帽效率。因此，本发明提供了用于生产mRNA和特别是用于评估具有治疗应用的mRNA的安全性、效力和商业可行性的重要的质量控制方法。
本发明的各个方面详细描述于以下章节。章节的用途不是要限制本发明。每个章节可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外说明，“或”的使用表示“和/或”。
mRNA加帽和/或甲基化
通常，真核mRNA在其5'-端具有“帽”结构，其在翻译中起重要作用。例如，帽在mRNA代谢中起关键作用，并且需要达到不同程度用于细胞核中RNA转录物的加工和成熟、mRNA从细胞核转运至细胞质、mRNA稳定性、和mRNA有效翻译成蛋白。5'帽结构参与真核细胞和真核病毒mRNA的蛋白合成的起始以及mRNA加工和体内稳定性(参见例如，Shatkin,A.J.,CELL,9：645-653(1976)；Furuichi,等人,NATURE,266：235(1977)；FEDERATIONOFEXPERIMENTALBIOLOGISTSSOCIETYLETTER96：1-11(1978)；Sonenberg,N.,PROG.NUC.ACIDRESMOLBIOL,35：173-207(1988))。存在作为mRNA翻译起始所需机器组分的特异性帽结合蛋白(参见例如，Shatkin,A.J.,CELL,40：223-24(1985)；Sonenberg,N.,PROG.NUC.ACIDRESMOLBIOL,35：173-207(1988))。mRNA的帽由翻译起始因子eIF4E识别(Gingras,等人,ANN.REV.BIOCHEM.68：913-963(1999)；Rhoads,R.E.,J.BIOL.CHEM.274：30337-3040,(1999))。5'帽结构还提供对5'-外切核酸酶活性的抗性，并且其缺乏导致mRNA的快速降解(参见例如，Ross,J.,MOL.BIOL.MED.5：1-14(1988)；Green,M.R.等人,CELL,32：681-694(1983))。因为许多真核细胞基因和真核病毒基因的初级转录物需要加工以去除这些转录物编码区内的插入序列(内含子)，帽的益处还扩展至这种前mRNA的稳定化。
在体外，已经报道在许多体外翻译系统例如兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽翻译系统中，加帽RNA比未加帽转录物更有效地翻译(参见例如，Shimotohno,K.,等人,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA,74：2734-2738(1977)；PatersonandRosenberg,NATURE,279：692(1979))。还认为该效果部分由于保护RNA免受体外翻译系统中存在的核糖核酸外切酶以及其他因子。
天然存在的帽结构包括经由三磷酸桥连接至第一转录核苷酸5'-末端的7-甲基鸟苷，得到m7G(5')ppp(5')N的二核苷酸帽，其中N是任何核苷。在体内，帽经酶促添加。帽在细胞核中添加，并且由酶鸟苷酰基转移酶催化。帽至RNA的5'末端的添加发生在转录起始刚刚开始之后。末端核苷通常是鸟苷，并且与所有其他核苷酸成反向，即G(5')ppp(5')GpNpNp。
通过体外转录生成的mRNA的常见帽是m7G(5')ppp(5')G，其已经在体外用T7或SP6RNA聚合酶转录中用作二核苷酸帽，以获得在其5'端具有帽结构的RNA。体外合成加帽mRNA的流行方法采用形式m7G(5')ppp(5')G(“m7GpppG”)的预先形成的二核苷酸作为转录起始子。使用伪对称二核苷酸m7G(5')ppp(5')G的缺点是G或m7G部分的3'-OH倾向作用为转录延长的起始亲核体。换言之，m7G和G部分两者上3'-OH的存在导致达一半mRNA以不适当取向加入帽。这导致大致相等比例的形式m7G(5')pppG(pN)n和G(5')pppm7G(pN)n的两种异构体RNA的合成，取决于转录反应的离子条件。异构体形式的变化可以不利地影响体外翻译，并且是同质治疗产品所不希望的。
迄今为止，体外翻译实验中使用的合成的二核苷酸帽的通常形式是抗反向帽类似物(“ARCA”)，其一般是修饰的帽类似物，其中2'或3'OH基团被-OCH3替代。ARCA和三-甲基化帽类似物以正向加入。在核糖环的2'或3'OH基团处m7G的化学修饰导致帽仅以正向加入，即使2'OH基团不参与硫酸二酯键(Jemielity,J.等人,“Novel‘anti-reverse’capanalogswithsuperiortranslationalproperties”,RNA,9：1108-1122(2003))。已经建立了鸟苷在N7处的甲基化以及3'O-甲基化和5'二磷酸合成的选择性程序(Kore,A.和Parmar,G.NUCLEOSIDES,NUCLEOTIDES,ANDNUCLEICACIDS,25：337-340,(2006)和Kore,A.R.,等人NUCLEOSIDES,NUCLEOTIDES,ANDNUCLEICACIDS25(3)：307-14,(2006)。
RNA转录通常开始于核苷三磷酸(通常是嘌呤，A或G)。体外转录通常包括噬菌体RNA聚合酶例如T7、T3或SP6，包含噬菌体聚合酶启动子的DNA模板，核苷酸(ATP、GTP、CTP和UTP)，以及包含镁盐的缓冲液。加帽RNA的合成包括转录反应中帽类似物(例如，m7GpppG)的加入，其在一些实施方案中通过添加重组鸟苷酰基转移酶而加入。过量的m7GpppG比GTP(4：1)增加了每个转录物具有5'帽的机会。用于体外转录的mRNA加帽的试剂盒是商业途径可获得的，包括mMESSAGE试剂盒(Ambion,Inc.,Austin,Tex.)。这些试剂盒通常产生80％加帽RNA至20％未加帽RNA，但是总RNA产率较低，因为GTP浓度变成限速的，因为GTP是转录物延长所需要的。然而，目前没有允许在不永久改变样品中mRNA的条件下定量加帽效率的可用技术/方法。
估计加帽效率的方法是本领域已知的。例如，T7RNA聚合酶可以与帽二核苷酸、所有四种核糖核苷酸三磷酸、[α-32P]GTP和短DNA模板一起孵育，其中G是在启动子之后指定的第一核糖核苷酸(参见Grudzien,E.等人“NovelcapanalogsforinvitrosynthesisofmRNAwithhightranslationefficiency”,RNA,10：1479-1487(2004))。G残基5′侧上任何核苷酸通过最近邻转移在RNA酶T2降解之后获得32P-标记的3′-磷酸基团。然后使用离子交换色谱拆分标记的核苷3′-单磷酸，源自RNA内部位置，来自5′-端产物。5′-端产物具有两个类型。未加帽的RNA产生标记的鸟苷5′-三磷酸3′-单磷酸(p3Gp*；其中*指示标记的磷酸基团)。加帽RNA产生各种5′-端结构，取决于使用的帽类似物的性质(当帽类似物是m7Gp3G时，m7Gp3Gp*和Gp3m7Gp*)。
然而，这些方法的主要缺点是整个样品被赋予放射性或者以其他方式被破坏，并因此不能用于随后的治疗应用。尽管在理论上，单独的定量反应可以与治疗合成反应同时进行，但是这种安排是不够的。由于操作者自身失误和反应条件的微小变化，同时但分开的样品本身是可变的。这对于使用标准曲线的定量尤其如此，其中标准曲线上一个给定日的点的值可能与下一日不同。为了在计算加帽效率中获得准确结果，希望使用从治疗合成反应获得的代表性样品，其是可以相对于对照评价加帽效率并且代表治疗性合成反应中加帽效率的样品。
因此，本发明提供了直接定量样品(例如，来自体外合成反应的代表性小份样品)中mRNA加帽效率的改良方法。本发明的一些实施方案包括定量mRNA加帽效率的色谱方法。这些方法部分基于以下发现：酶操作的多样性可用于增加多核苷酸色谱分离的分离度(图1)。因此，通过经由酶操作放大色谱分离的能力，本发明实施方案增加了定量的效率、质量和通量。例如，本文描述的色谱方法不仅可以定量加帽效率，它们还可以提供有关帽修饰的信息(例如，在特定帽位置的甲基化状态)。因此，本发明实施方案可以同时定量加帽效率和帽修饰效率(例如，甲基化效率)。该定量提供了对蛋白生成具有显著影响的mRNA药物产品的重要表征。
本发明的色谱实施方案可用于定量本文所述帽结构和帽类似物的任何一个以及帽内的各种修饰。特定实施方案利用特定核酸酶的天然生物活性以提供加帽效率和帽鸟嘌呤碱基(例如，N-7位置)的甲基化效率的定量信息。其他实施方案还可以同时定量倒数第二个碱基的核糖环的2'-O位置的甲基化(帽1结构，参见图2)。本发明实施方案可用于定量许多RNA物类的加帽效率，包括体外转录的mRNA、分离的真核mRNA和病毒RNA。
通过使用与邻近加帽或未加帽的mRNA的倒数第二个碱基的mRNA的5'未翻译区中的序列互补的DNA寡核苷酸而促进酶操作(图1)。在允许所述DNA寡核苷酸与未翻译区中指定序列复性的条件下向包含加帽mRNA和未加帽mRNA的mRNA样品添加所述DNA寡核苷酸。然后提供选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性mRNA的核酸酶，得到加帽和未加帽的5'片段(图1)。在一些实施方案中，至少一部分片段是双链的。在一些实施方案中，双链部分至少部分是RNA:RNA杂合体。在一些实施方案中，双链部分至少部分是DNA:RNA杂合体。由核酸酶处理得到的片段可以是平端或交错切口。在一些实施方案中，片段是2-20个核苷酸(包括可能存在的帽核苷酸)；即，由核酸酶处理得到的片段可以是20个核苷酸、19个核苷酸、18个核苷酸、17个核苷酸、16个核苷酸、15个核苷酸、14个核苷酸、13个核苷酸、12个核苷酸、11个核苷酸、10个核苷酸、9个核苷酸、8个核苷酸、7个核苷酸、6个核苷酸、5个核苷酸、4个核苷酸、3个核苷酸或2个核苷酸。在一些实施方案中，加帽片段和未加帽片段包括mRNA的不超过5个碱基。在一些实施方案中，加帽片段和未加帽片段包括mRNA的不超过2个碱基。
然后通过色谱拆分(即，相互分离)加帽片段和未加帽片段。然后可以通过标准定量色谱技术，例如HPLC峰积分定量加帽片段和未加帽片段的量。
本发明实施方案不受DNA寡核苷酸类型或大小的限制。在一些实施方案中，寡核苷酸包括10-80个核苷酸；例如10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸或更多。可以选择DNA寡核苷酸的大小以产生所需长度的加帽片段(如果存在)。还可以设计DNA寡核苷酸与5'未翻译区的任何区域杂交，取决于希望在哪裂解；即，可以将DNA寡核苷酸置于5'未翻译区内以产生任何大小的加帽片段(如果存在)。特别地，包含在每一侧具有RNA碱基(例如，1-15)(即，“gapmer”)的小段DNA碱基(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸)的适当设计的寡核苷酸可以与mRNA分析物复性。设计这样的结合mRNA的5'未翻译区的互补碱基的寡核苷酸允许通过RNA酶H的DNA/RNA杂合体识别而选择裂解。相似地，适当设计的寡核苷酸可以包含仅在一端(例如，5'端或3'端)具有RNA碱基(例如，1-15)的小段DNA碱基(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20个核苷酸)。
在优选实施方案中，设计寡核苷酸邻近mRNA构建体的帽和/或倒数第二个碱基直接结合，允许得到的裂解碱基由mRNA构建体的最初两个(或几个)碱基组成。不希望受任何特定理论束缚，认为希望产生小的加帽片段和未加帽片段以提高色谱分离度；即，提高加帽片段和未加帽片段的分离并定量相对量。一般而言，片段越小，分离和定量越好。在一些实施方案中，DNA寡核苷酸的第一个碱基在mRNA的倒数第二个碱基结合。在一些实施方案中，DNA寡核苷酸的第一个碱基邻近mRNA的倒数第二个碱基结合(即，在式1的M处)。在一些实施方案中，DNA寡核苷酸的第一个碱基从mRNA的倒数第二个碱基结合至少2个核苷酸、至少3个核苷酸、至少4个核苷酸、至少5个核苷酸、至少6个核苷酸、至少7个核苷酸、至少8个核苷酸、至少9个核苷酸或至少10个核苷酸。
本发明实施方案不受核酸酶身份的限制。可以使用能够裂解或消化DNA:RNA杂合体的至少一个链的任何核酸酶。如上所述，可以在单个反应中使用多个核酸酶以实现加帽片段的生成或产生加帽片段(如果存在)和平端加帽片段。在一些实施方案中，适当的核酸酶是RNA酶H或具有RNA酶H样生物活性的酶。RNA酶H是普遍存在酶家族，分成两个不同的系统发育亚型，1型和2型，其任何一个可用于特定实施方案。RNA酶H统一具有如下常见能力：结合与互补DNA单链杂交的单链(ss)RNA，然后降解RNA:DNA杂合体的RNA部分。虽然RNA酶H已经参与DNA复制和识别以及修复，但是其生理作用还没有完全被理解。在体外，酶还会结合双链(ds)DNA、ssDNA、ssRNA和dsRNA，即使具有比它们结合RNA:DNA杂合体更低的亲和力。由于酶的普遍存在，有几种文献已知的RNA酶H的序列，其每一个的氨基酸序列在一定程度上变化。如美国专利号5,500,370，美国专利号5,268,289公开了热稳定的RNA酶H。美国专利号6,376,661公开了人类RNA酶H及其组合物和用途。美国专利号6,001,652公开了人类2型RNA酶H。美国专利号6,071,734公开了来自HBV聚合酶的RNA酶H。所有这些RNA酶H可用于本发明的一个或多个实施方案。
在一些实施方案中，适当的核酸酶是S1核酸酶.在一些实施方案中，使用了多个核酸酶；例如RNA酶H和S1核酸酶。可以单独或组合用于本发明实施方案的其他核酸酶包括核酸酶P1、磷酸二酯酶II、RNA酶A和RNA酶T1。一些实施方案还包括添加单链DNA核酸酶以最终产生或修饰片段。在一些实施方案中，可以希望加热样品(例如，至约60℃)或将样品应用至加热的色谱柱以实现加帽片段的生成。
然后将核酸酶处理的样品施加至色谱柱以分离加帽片段和未加帽片段。除了分离加帽片段和未加帽片段，色谱可以拆分并定量甲基化帽和未甲基化鸟嘌呤帽。在一些实施方案中，甲基化的倒数第二个碱基(2'-O-甲基化碱基)可以与在该位置未甲基化的帽分离(拆分)并定量。目前的色谱方案可以区分可以从体外合成过程产生的物类的任何组合。色谱实施方案的各个方面在下文更详细讨论。
mRNA帽
本文所述的本发明方法一般适于定量任何类型的mRNA帽。在一些实施方案中，帽具有式I结构：
其中B是核碱基，R1选自卤素、OH和OCH3，R2选自H、OH和OCH3，R3是CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3或不存在，R4是NH2，R5选自OH、OCH3和卤素，n是1、2或3，并且M是核苷酸，即，mRNA的第三碱基。在特定实施方案中，B是鸟嘌呤，但可以是任何核碱基。在一些实施方案中，帽是m7G(5')ppp(5')G，其中2'-O-甲基残基存在于碱基1的核糖环的2'OH基团(即，在式1的R5位置)。
帽类似物可以是或者包括任何修饰的“G”碱基(例如，一种或多种修饰的鸟嘌呤核苷酸)。适合的帽类似物包括但不限于选自由以下组成的组的化学结构：m7GpppG、m7GpppA、m7GpppC；未甲基化的帽类似物(例如，GpppG)；二甲基化的帽类似物(例如，m2,7GpppG)、三甲基化的帽类似物(例如，m2,2,7GpppG)、二甲基化的对称帽类似物(例如，m7Gpppm7G)或抗反向帽类似物(例如，ARCA；m7,2'OmeGpppG、m7,2'dGpppG、m7,3'OmeGpppG、m7,3'dGpppG及其四磷酸衍生物)(参见例如，Jemielity,J.等人,“Novel‘anti-reverse’capanalogswithsuperiortranslationalproperties”,RNA,9：1108-1122(2003))。
在一个优选实施方案中，帽是经由三磷酸桥连接至第一转录的核苷酸的5'-末端的7-甲基鸟苷酸(“m7G”)，得到m7G(5')ppp(5')N，其中N是任何核苷。本发明实施方案中使用的m7G帽的一个优选实施方案是m7G(5')ppp(5')G。
在一些实施方案中，mRNA是未加帽的(图2A)。未加帽的mRNA可以存在于样品中(即，作为体外转录反应中不完全加帽的结果)和/或可用作定量样品中未加帽物类水平的对照。在一些实施方案中，帽是帽0结构(图2B)。帽0结构缺少与碱基1和2连接的核糖的2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，帽是帽1结构(图2C)。帽1结构具有在碱基1处的2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，帽是帽2结构。帽2结构具有与碱基1和2两者连接的2'-O-甲基残基。
许多m7G帽类似物是本领域已知的，其许多是商业途径可获得的。这些包括上述m7GpppG以及ARCA3'-OCH3和2'-OCH3帽类似物(Jemielity,J.等人,RNA,9：1108-1122(2003))。用于本发明实施方案的其他帽类似物包括N7-苄基化的二核苷四磷酸类似物(描述于Grudzien,E.等人,RNA,10：1479-1487(2004))、硫代磷酸帽类似物(描述于Grudzien-Nogalska,E.,等人,RNA,13：1745-1755(2007))和通过引用并入本文的美国专利号8,093,367和8,304,529中描述的帽类似物(包括生物素酰化的帽类似物)。
加帽mRNA的生成
适合本文公开的定量方法的加帽mRNA可以通过本领域已知的任何方法生成。
在一些实施方案中，加帽mRNA通过体外转录生成，最初由Krieg和Melton(METHODSENZYMOL.,1987,155：397-415)开发用于使用RNA噬菌体聚合酶合成RNA。通常，这些反应至少包括噬菌体RNA聚合酶(T7、T3或SP6)、包含噬菌体聚合酶启动子的DNA模板、核苷酸(ATP、CTP、GTP和UTP)和包含镁盐的缓冲液。可以通过增加核苷酸浓度、调节镁浓度并通过包括无机焦磷酸酶而优化RNA合成产率(美国专利号5,256,555；Gurevich,等人,ANAL.BIOCHEM.195：207-213(1991)；Sampson,J.R.和Uhlenbeck,O.C.,PROC.NATL.ACAD.SCI.USA.85,1033-1037(1988)；Wyatt,J.R.,等人,BIOTECHNIQUES,11：764-769(1991))。一些实施方案利用用于体外转录物大规模合成的商业试剂盒(例如，Ambion)。这些反应中合成的RNA通常由在核糖5'位置具有三磷酸的5'端核苷酸表征。通常，根据使用的RNA聚合酶和启动子组合，该核苷酸是鸟苷，尽管其可以是腺苷(参见例如，Coleman,T.M.,等人,NUCLEICACIDSRES.,32：e14(2004))。在这些反应中，所有四种核苷酸通常以等摩尔浓度包括，并且它们中没有一个是限制性的。
本发明的一些实施方案是浴反应—即，所有组分被组合，然后在约37℃孵育以促进RNA聚合，直至反应终止。通常，浴反应为了便利而使用，并且为获得从此类反应为其实验所需的大量RNA。在一些实施方案中，"分批补料"系统(参见例如，JEFFREYA.KERN,BATCHANDFED-BATCHSTRATEGIESFORLARGE-SCALEPRODUCTIONOFRNABYINVITROTRANSACTION(UniversityofColorado)(1997))用于增加体外转录反应的效率。组合所有组分，但是然后将额外量的一些试剂随时间添加，例如核苷酸和镁，以试图维持恒定的反应条件。此外，在一些实施方案中，可以通过随时间监测并按需要添加KOH而将反应pH维持在7.4。
为了通过体外转录而合成加帽RNA，将帽类似物(例如，N-7甲基GpppG；即，m7GpppG)加入转录反应中。在一些实施方案中，RNA聚合酶将如任何其他核苷酸一样容易地加入帽类似物；即，对于帽类似物没有偏见。在一些实施方案中，通过酶鸟苷酰基转移酶在5'端加入帽类似物。在一些实施方案中，仅在5'端加入帽类似物，因为其不具有5'三磷酸。在一些实施方案中，使用T7、T3和SP6RNA聚合酶，其各自启动子的+1核苷酸通常是G残基，并且如果GTP和m7GpppG两者以相等浓度存在于转录反应中，则它们各自具有在+1位置加入的相等机会。在一些实施方案中，m7GpppG以比GTP高几倍的浓度存在于这些反应中，以增加转录物具有5'帽的机会。在一些实施方案中，mMESSAGE试剂盒(目录号1344,Ambion,Inc.)根据生产商说明书使用，其中推荐帽比GTP比率为4：1(6mM：1.5mM)。在一些实施方案中，随着反应中帽类似物比GTP比率增加，加帽RNA比未加帽RNA的比率成比例增加。加帽效率的考虑必须与产率考虑相平衡。增加转录反应中帽类似物比GTP的比率产生了总RNA的较低产率，因为当帽和GTP总浓度维持恒定时GTP浓度变为限制性的。因此，最终RNA产率取决于GTP浓度，这是延长转录物所必需的。其他核苷酸(ATP、CTP、UTP)过量存在。
在特定实施方案中，通过体外转录从编码选择基因的质粒DNA模板合成mRNA。在一些实施方案中，体外转录包括通过经由鸟苷酰基转移酶的GTP酶促轭合添加5'帽结构，帽1(图2C)，其在碱基1的核糖环的2'OH基团具有2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，体外转录包括通过经由鸟苷酰基转移酶的GTP酶促轭合添加5'帽结构，帽0(图2B)，其缺少2'-O-甲基残基。在一些实施方案中，体外转录包括通过经由鸟苷酰基转移酶的GTP酶促轭合添加本文公开的任何帽结构的5'帽。在一些实施方案中，通过添加与多聚A聚合酶轭合的ATP而加入长度大约200个核苷酸(如通过凝胶电泳测定的)的3'多聚(A)尾。在一些实施方案中，多聚(A)尾长度大约100-250个核苷酸。在一些实施方案中，多聚(A)尾长度约50-300个核苷酸。在一些实施方案中，体外转录产物包括5'和3'未翻译区。
色谱分离
本发明实施方案利用色谱提供高度拆分的(例如，单碱基分离度)加帽片段和未加帽片段。可以通过薄层色谱(“TLC”)或高效液相色谱(“HPLC”)有效拆分片段。在本发明上下文中，术语“HPLC”包括各种HPLC方法以及低压或常压液相色谱方法，其可以用于实施本发明的一些实施方案。在一些实施方案中，可以通过尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)和/或反相高效液相色谱(RP-HPLC)(例如，使用十八烷基(C18)-键合的二氧化硅的柱，并在酸性pH下进行，使用TFA作为反离子)的一种或多种来拆分片段。在本发明的一些实施方案中，色谱图上的主要峰是加帽mRNA片段。可以改变或优化以提高分离度的参数包括梯度条件、有机修饰剂、反离子、温度、柱孔径和粒度、溶剂组成和流速。
本文描述的定量方法可以包括离子交换色谱-HPLC(例如，阴离子交换-HPLC和/或阳离子交换-HPLC)的一个或多个步骤。如本领域技术人员已知的，离子交换剂(例如，阴离子交换剂和/或阳离子交换剂)可以基于涉及基质和连接的荷电基团的各种材料。例如，可以使用以下基质，其中所提到的材料可以或多或少的交联：基于琼脂糖(例如SepharoseTMCL-6B、SepharoseTMFastFlow和SepharoseTMHighPerformance)、基于纤维素(例如)、基于右旋糖(例如)、基于二氧化硅和基于合成聚合物。
可以根据已知方法制备离子交换树脂。通常，允许树脂结合其反离子的平衡缓冲液可以在加载包含多核苷酸和一种或多种污染物的样品或组合物至树脂之前穿过离子交换树脂。方便地，平衡缓冲液可以与加载缓冲液相同，但这不是必须的。在本发明的一个任选实施方案中，可以在洗脱多核苷酸之后用再生缓冲液再生离子交换树脂，使得柱可以被再利用。一般，再生缓冲液的盐浓度和/或pH可以使得基本上所有的污染物和感兴趣的多核苷酸从离子交换树脂洗脱。一般，再生缓冲液具有非常高的盐浓度，以从离子交换树脂洗脱污染物和片段。
例如，本发明的一些实施方案包括使样品经受阴离子交换色谱。可以如通过引用并入本文的Ausser,W.A.等人,“High-resolutionanalysisandpurificationofsyntheticoligonucleotideswithstronganion-exchangeHPLC”,BIOTECHNIQUES,19:136-139(1995)所述进行核苷酸片段的高分离度分析。对于阴离子交换树脂，共价连接至基质的荷电基团可以是例如二乙基氨基乙基(DEAE)、季氨基乙基(QAE)和/或季铵(Q)。在一些实施方案中，采用的阴离子交换树脂是QSepharose柱。例如，可以使用例如QSepharoseTMFastFlow、QSepharoseTMHighPerformance、QSepharoseTMXL、CaptoTMQ、DEAE、TOYOPEARLQ、TMAE(trimethylaminoethyl、aquarternaryammoniaresin)、EshmunoTMQ、NuviaTMQ或UNOsphereTMQ进行阴离子交换色谱。可以在本发明范围内使用其他阴离子交换剂，包括但不限于季胺树脂或“Q–树脂”(例如，CaptoT M-Q、QAE)；二乙基氨基乙烷树脂(例如，DEAE苯甲酰化萘甲酰化DEAE、二乙基氨基乙基)；树脂；树脂； 树脂(例如，IRA–67、强碱性、 弱碱性)、消胆胺树脂、树脂(例如，SAX–10、 WAX–10、WCX–10)；树脂(例如，TSKgelDEAE–NPR；TSKgelDEAE–5PW)；和树脂。
阴离子交换色谱的典型流动相包括相对极性溶液，例如水，乙腈，有机醇例如甲醇、乙醇和异丙醇，或含有2-(N-吗啉代)-乙磺酸(MES)的溶液。因此，在某些实施方案中，流动相包括约0％、1％、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或约100％极性溶液。在某些实施方案中，在分离过程期间任何给定时间，流动相包括约1％至约100％、约5％至约95％、约10％至约90％、约20％至约80％、约30％至约70％或约40％至约60％极性溶液。
在一些实施方案中，使样品经受阳离子交换色谱，例如磺丙基(SP)阳离子交换色谱。在一个典型实施方案中，阳离子交换色谱包括磺丙基(SP)阳离子交换色谱，但是可以使用其他阳离子色谱膜或树脂，例如MUSTANGTMS膜、S-SepharoseTM树脂或BlueSepharoseTM树脂。可以在优化的温度下进行阳离子交换色谱以增强靶结合和/或减少杂质结合。
在一些实施方案中，使样品经受疏水相互作用色谱(HIC)。疏水相互作用色谱利用给定分子对极性或非极性环境的吸引，就核酸而言，该倾向由核苷酸及其上修饰的疏水性或亲水性决定。因此，基于其对疏水基质的不同程度吸引而分级分离核酸，所述疏水基质通常是具有链长为2–18个碳的烷基连接体臂的惰性支持体。固定相由连接至亲水聚合物骨架(例如，交联SepharoseTM、右旋糖或琼脂糖)的小的非极性基团(丁基、辛基或苯基)组成。在一些实施方案中，疏水相互作用色谱包括苯基色谱。在其他实施方案中，疏水相互作用色谱包括丁基色谱或辛基色谱。
在一些实施方案中，通过反相HPLC拆分片段。反相HPLC由非极性固定相和中等极性流动相组成。在一些实施方案中，固定相是用例如RMe2SiCl处理过的二氧化硅，其中R是直链烷基例如C18H37或C8H17。因此对于性质上更非极性的分子而言保留时间更长，允许极性分子更容易洗脱。保留时间通过向流动相添加极性溶剂而增加，并且通过添加更疏水的溶剂而减少。特定RNA分子作为分析物的特征可以在其保留特征中发挥重要作用。一般而言，具有更非极性官能团(例如，甲基)的分析物导致更长的保留时间，因为其增加了分子的疏水性。可适用于本发明实施方案的、使用反相HPLC高度分离RNA物类的方案是本领域已知的(参见例如，美国授权前公开2010/0048883；Gilar,M.,“Analysisandpurificationofsyntheticoligonucleotidesbyreversed-phasehigh-performanceliquidchromatographywithphotodiodearrayandmassspectrometrydetection”,ANAL.BIOCHEM.,298:196-206(2001))。
本发明的特定实施方案利用本文公开的各种色谱分离的组合。例如，本发明的特定实施方案可以利用反相离子对色谱，由此分离基于疏水性和与分子结合的阴离子的数目，其可用于以单个HPLC步骤纯化片段。基质可以是基于二氧化硅的(例如，Murray等人,ANAL.BIOCHEM.,218:177-184(1994))。可以在特定实施方案中使用非极性惰性聚合物树脂(参见例如，Huber,C.G.,“High-resolutionliquidchromatographyofoligonucleotidesonnonporousalkylatedstyrene-divinylbenzenecopolymers”,ANAL.BIOCHEM.,212:351-358(1993))。其他组合可能是等效的，并且必须就片段尺寸和待拆分的修饰来评价。
在一些实施方案中，可以使用HPLC系统通过强阴离子交换色谱确定加帽效率概况和/或甲基化概况。一般而言，未加帽mRNA吸附至强阴离子交换柱的固定正电荷，使用预定流速流动相的递增离子强度梯度以其与正电荷柱离子相互作用强度成比例地从柱洗脱加帽物类(携带正电荷的帽)。更多负电荷(更多酸性)未加帽物类比更少负电荷(更少酸性)加帽物类更晚洗脱。
在某些实施方案中，通过与片段相关的甲基化概况来表征加帽片段。通常，甲基化概况反映并定量帽鸟嘌呤碱基(N-7位置)的甲基化效率。其他实施方案还可以同时定量倒数第二个碱基(帽1结构)核糖环2'-O位置的甲基化。在一些实施方案中，可以通过进行单独或与离子交换色谱组合的反相HPLC来确定甲基化概况。在一些实施方案中，“甲基化概况”指一组值，代表在向柱添加流动相之后的时间点从柱洗脱的甲基化加帽片段的量。如上所述，性质上更非极性的甲基化帽和倒数第二个核苷酸的保留时间相对于更容易洗脱的极性分子是增加的。保留时间可以通过向流动相添加极性溶剂而增加，并且通过添加更疏水溶剂而减少。
在一些实施方案中，使用高效液相色谱(“UPLC”)拆分加帽片段和未加帽片段，并任选提供有关甲基化状态的其他定量信息。UPLC一般指使用小于2.5μm树脂粒径的HPLC技术，其甚至以降低的流速和线性速度提供了显著的效率增益。通过使用小颗粒，可以拓展速度和峰容量(每单位时间拆分的峰数目)。此类技术利用色谱原理运行分离，使用填充了更小颗粒的柱和/或更高流速以增加速度，具有更好的分离度和灵敏度(参见例如，Swartz,M.E.,“UltraPerformanceLiquidChromatography(UPLC):anintroduction”,SEPARATIONSCIENCEREDEFINED(2005))。
在某些实施方案中，色谱分离(例如，HPLC)可以与质谱(“MS”)结合。LC-MS方法在本领域已知用于寡核苷酸分离和鉴别，使用与MS检测相容的水性三乙基铵-六氟异丙基醇(TEAHFIP)缓冲液(Apffel,A.等人,“NewprocedurefortheuseofHPLC-ESIMSfortheanalysisofnucleotidesandoligonucleotides”,J.CHROMATOGR.A,777:3-21(1997))。可选地，三乙基碳酸氢铵流动相可用于寡核苷酸分离，柱后向洗脱剂添加乙腈。可以选择离子配对缓冲液以产生最佳的MS检测灵敏度。
如Gilar,M.,ANAL.BiOCHEM.,298:196-206(2001)所述，还可以使用2.5μm全孔C18吸收剂填充的反相HPLC柱进行加帽片段的定量分析。可以优化以增强固定相中寡核苷酸质量转移的参数包括升高的温度、小的吸收剂粒径和缓慢流动相流速。用UV检测的三乙基乙酸铵(TEAA)缓冲液和优化的TEA–HFIP流动相可用于加帽片段的LC-MS分离和表征。
在一些实施方案中，通过在HPLC色谱图中各自峰面积的自动积分而实现加帽片段及其甲基化状态的定量。数据可以表示为面积百分比值，其指特定物类积分峰面积相对于整个色谱图总积分峰面积的百分比。
在一些实施方案中，可以通过其他适当方法，例如基于质谱(MS)的检测来实现加帽片段和未加帽片段的定量。认为本领域技术人员可以识别定量如本文所述加帽片段和未加帽片段的其他可适用方法。
试剂盒
本发明还提供了包括用于进行根据本发明的发明方法的各种试剂和材料的试剂盒。本文描述的定量程序可以由诊断实验室、试验实验室或商业实验室进行。本发明提供了可用于这些不同环境的试剂盒。
例如，用于通过酶操作和色谱分离而定量mRNA样品中mRNA加帽效率的材料和试剂可以在一个试剂盒中组装在一起。在某些实施方案中，本发明试剂盒包括色谱柱和任选地用于在柱上分离加帽mRNA片段的剂，以及根据本发明方法使用该试剂盒的说明书。
每个试剂盒可以优选包括赋予程序特异性的试剂。因此，为了检测/定量mRNA加帽效率，试剂盒可以包括在目标mRNA帽邻近特异性复性的设计序列的核酸试剂。试剂盒还可以包括用于产生加帽片段的核酸酶；例如RNA酶H和/或S1核酸酶。试剂盒还可以包括体外转录和加帽试剂、酶及其使用说明书。
根据本发明的试剂盒或其他产品可以包括一个或多个容纳各种试剂的容器。适合的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器(例如，预填充注射器)、安瓿瓶。该容器可以由多种材料例如玻璃或塑料制成。
在一些实施方案中，本发明试剂盒可以包括适当的对照水平或用于测定如本文所述的对照水平的对照样品。在一些实施方案中，本发明试剂盒可以包括用于根据本发明的一种或多种方法使用该试剂盒的说明书，并且可以包括体外转录和加帽的说明书。
实施例
实施例1：mRNA的合成
通过体外转录从编码每个基因的质粒DNA模板合成萤火虫荧光素酶(FFL)和人类促红细胞生成素(EPO)mRNA。体外转录包括通过经由鸟苷酰基转移酶的酶促轭合GTP而添加5′帽结构帽1，其在碱基1的核糖环的2′OH基团具有2′-O-甲基残基。通过添加与多聚A多聚酶结合的ATP而加入长度大约200个核苷酸(如通过凝胶电泳测定的)的3′多聚(A)尾(参见以下详细的反应条件)。体外转录产物包括5′和3′未翻译区，其在以下序列中分别表示为X和Y：
人类促红细胞生成素(EPO)mRNA(SEQIDNO：1)
X1AUGGGGGUGCACGAAUGUCCUGCCUGGCUGUGGCUUCUCCUGUCCCUGCUGUCGCUCCCUCUGGGCCUCCCAGUCCUGGGCGCCCCACCACGCCUCAUCUGUGACAGCCGAGUCCUGGAGAGGUACCUCUUGGAGGCCAAGGAGGCCGAGAAUAUCACGACGGGCUGUGCUGAACACUGCAGCUUGAAUGAGAAUAUCACUGUCCCAGACACCAAAGUUAAUUUCUAUGCCUGGAAGAGGAUGGAGGUCGGGCAGCAGGCCGUAGAAGUCUGGCAGGGCCUGGCCCUGCUGUCGGAAGCUGUCCUGCGGGGCCAGGCCCUGUUGGUCAACUCUUCCCAGCCGUGGGAGCCCCUGCAGCUGCAUGUGGAUAAAGCCGUCAGUGGCCUUCGCAGCCUCACCACUCUGCUUCGGGCUCUGGGAGCCCAGAAGGAAGCCAUCUCCCCUCCAGAUGCGGCCUCAGCUGCUCCACUCCGAACAAUCACUGCUGACACUUUCCGCAAACUCUUCCGAGUCUACUCCAAUUUCCUCCGGGGAAAGCUGAAGCUGUACACAGGGGAGGCCUGCAGGACAGGGGACAGAUGAY1
密码子优化的萤火虫荧光素酶(FFL)mRNA(SEQIDNO：2)
X2AUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAY2
X1/Y1和X2/Y2的5′和3′UTR序列如下：
X1＝
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG(SEQIDNO：3)
X2＝GGGAUCCUACC(SEQIDNO：4)
Y1＝
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCC
ACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC(SEQIDNO：5)
Y2＝UUUGAAUU(SEQIDNO：6)
mRNA的合成在完全无RNA酶的条件下进行。所有管、管形瓶、吸液管头、吸液管、缓冲液等都要求无核酸酶。从线性化DNA模板合成信使RNA。为了生成所需的mRNA前体(IVT)构建体，用无RNA酶的水制备～100ug线性化DNA、rNTP(3.33mM)、DTT(10mM)、T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶和反应缓冲液(10x、800mMHepes(pH8.0)、20mM亚精胺、250mMMgCl2、pH7.7)的混合物至终体积2.24ml。反应混合物在37℃孵育20-120分钟。完成之后，相应地用DNA酶I处理混合物另外15分钟并猝灭。
来自前述IVT步骤的纯化的mRNA产物在65℃变性10分钟。单独地，部分GTP(20mM)、S-腺苷基蛋氨酸、RNA酶抑制剂、2'-O-甲基转移酶和鸟苷酰基转移酶与反应缓冲液(10x、500mMTris-HCl(pH8.0)、60mMKCl、12.5mMMgCl2)混合在一起至终体积8.3ml。变性后，冰上冷却mRNA，然后添加至反应混合物。组合的溶液在37℃孵育20-90分钟。完成之后，添加小份ATP(20mM)、多聚A聚合酶和加尾反应缓冲液(10x、500mMTris-HCl(pH8.0)、2.5MNaCl、100mMMgCl2)，将总反应混合物在37℃进一步孵育约20-45分钟。完成后，最终反应混合物被相应地猝灭和纯化。
实施例2：色谱定量加帽效率
本实施例说明加帽以及甲基化的色谱定量。具体地，20碱基DNA寡核苷酸被设计并合成与体外合成的加帽mRNA的5'UTR互补，特别结合在从5'帽1或2个碱基内，并且优选结合在邻近mRNA倒数第二个(即，从5'端第三个核苷酸，作为帽核苷酸的最后两个核苷酸。DNA寡核苷酸与帽相邻5'UTR的结合确立了对RNA酶H介导的裂解敏感的DNA:RNA杂合体的明确区域。在一些实施方案中，DNA寡核苷酸任一端具有1-15个RNA核苷酸。在一些实施方案中，DNA寡核苷酸在3’端具有1-15个RNA核苷酸。
向包含杂交的体外合成mRNA的样品RNA溶液添加RNA酶H。RNA酶H在DNA:RNA杂合体区域裂解体外合成的加帽mRNA，从而产生加帽片段。在某些实施方案中，使用S1核酸酶和其他核酸酶实现该裂解以产生通过选择的帽分析物在5'端标记的平端片段。该片段优选长度为2-10个核苷酸，包括帽核苷酸。总体上，该过程以帽存在和帽修饰的增加的分离度提供更小的分子。
裂解之后，将RNA溶液加载至适当的色谱柱以定量分析加帽mRNA和未加帽mRNA。在一个示例性实施方案中，柱是阴离子交换HPLC柱，并且通过改编本领域技术人员已知的方法纯化片段(参见例如，Wincott,F.等人,“Synthesis,deprotection,analysisandpurificationofRNAandribozymes),NUCLEICACIDSRES23:2677-2684(1995)；Anderson,A.C.等人,“HPLCpurificationofRNAforcrystallographyandNMR”,RNA,2:110-117,(1996))。通过积分对应于加帽物类和未加帽物类的色谱峰来测定样品中加帽片段的量。数据可以峰面积或加帽峰面积与未加帽峰面积比率的形式提供。
同时，使用相同的分析方法，评估了N-7位置鸟嘌呤帽的百分比甲基化。而且，当合成“帽1”结构基序时，可以分离在倒数第二个碱基的核糖环的2'-O位置甲基化的物类(图2)。可以通过许多方法实现通过HPLC对甲基化核苷酸的测量，包括并入电化学检测的方法；参见例如，ParkandAmes(PROC.NATL.ACAD.SCI.USA,85:7467-7470(1988))，其通过引用并入本文。该方法提供了定量帽评估以及定量甲基化评估的强大组合。
实施例3：mRNA5’加帽对体内蛋白生成的评价
在本实施例中，我们评价了mRNA5’加帽对体内蛋白生成的影响及其对基于mRNA疗法效力的潜在影响。具体地，我们评价了5’加帽对α-半乳糖苷酶A(α-GalA)的体内生成的影响，α-半乳糖苷酶A(α-GalA)在Fabry病中是缺陷的。Fabry病是X连锁的遗传性溶酶体贮积病，特征为严重肾损伤、血管角质瘤和心血管异常，包括心室扩大和二尖瓣闭锁不全。Fabry病还影响外周神经系统，引起四肢令人痛苦的灼痛发作。Fabry病由酶α-半乳糖苷酶A(α-GalA)缺陷引起。α-GalA是切割各种糖轭合物的末端α-半乳糖基部分的溶酶体羰基水解酶。Fabry病导致中性鞘糖脂、三己糖酰基鞘氨醇(CTH)的代谢阻断以及该酶底物在细胞内和血流中的累积。
已经分离并测序了编码人类α-GalA,GLA的cDNA和基因。人类α-GalA表达为429-氨基酸多肽，其N端31个氨基酸是信号肽。已经在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Desnick等人,美国专利号5,356,804；Ioannou等人,J.CELLBIOL.119：1137(1992))；和昆虫细胞(Calhoun等人,WO90/11353)中表达了人类酶。
罹患Fabry病的个体可以通过用人类α-GalA的酶替代疗法来治疗(参见例如，美国专利号6,458,574，通过引用并入本文)。调节或补充α-GalA缺陷表达并由此缓解潜在缺陷的其他方法将用于开发相关疾患的适当疗法。此类方法包括能够校正现有基因缺陷和/或给一个或多个靶细胞提供有益功能的细胞内递送核酸(例如，GLAmRNA)的方法。在成功递送至靶组织和细胞之后，组合物和核酸转染靶细胞，并且可以将核酸(例如，GLAmRNA)翻译成关注的基因产物(例如，α-GALA)或可以其他方式调节/调整关注基因产物的存在或表达。之前已经描述了此类方法；参见例如美国授权前公开2011/0244026，通过引用并入本文。
在本实施例中，我们评价了5’加帽对体内蛋白生成的影响。通过体外转录从编码基因的质粒DNA模板合成人类GLAmRNA，随后添加5'帽结构，帽0或帽1(Fechter,P.等人,J.GEN.VIROLOGY,86：1239-1249(2005))。还添加了如通过凝胶电泳测定的长度大约200个核苷酸的3′多聚(A)尾。GLAmRNA中存在的5′和3′未翻译区表示为SEQIDNO：7中的X和Y，如下所示：
α-半乳糖苷酶(GLA)mRNA(SEQIDNO：7)：
XAUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGCGCUUCAUGUGCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAAGAGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGGAGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUUUCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCCUGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUUGUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGCAACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGACCCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY
X＝GGGAUCCUACC(SEQIDNO：4)
Y＝UUUGAAUU(SEQIDNO：6)
一些实施方案中还使用了具有多聚A插入物(CO-GLA-多聚A)的密码子优化的α-半乳糖苷酶(SEQIDNO：8)：
X1AUGCAGCUGAGGAACCCAGAGCUCCAUCUCGGAUGUGCACUGGCACUUAGAUUUCUCGCGCUUGUGUCGUGGGACAUCCCCGGAGCCAGGGCGCUGGAUAAUGGGCUCGCCCGGACUCCCACAAUGGGUUGGCUGCACUGGGAGCGCUUUAUGUGCAAUCUGGACUGCCAGGAAGAGCCCGAUAGCUGUAUUUCGGAGAAGCUCUUCAUGGAAAUGGCGGAGUUGAUGGUGUCCGAAGGGUGGAAGGAUGCGGGAUAUGAGUAUCUGUGUAUCGAUGACUGCUGGAUGGCACCGCAGCGAGAUUCGGAGGGGCGAUUGCAGGCCGACCCUCAGCGCUUCCCUCAUGGAAUUCGGCAGCUGGCCAACUACGUACACUCAAAAGGACUUAAGUUGGGGAUCUACGCGGACGUCGGUAAUAAGACAUGCGCUGGGUUCCCGGGGAGCUUCGGAUACUAUGAUAUUGAUGCCCAGACCUUCGCGGACUGGGGAGUGGACUUGCUUAAGUUUGAUGGUUGUUACUGUGACUCAUUGGAAAACUUGGCGGAUGGGUAUAAACAUAUGUCCUUGGCCUUGAAUCGGACAGGGCGGUCGAUCGUCUACAGCUGCGAAUGGCCUUUGUAUAUGUGGCCGUUCCAGAAACCCAACUACACCGAAAUUCGCCAGUAUUGCAAUCACUGGAGAAACUUCGCCGAUAUCGACGAUUCGUGGAAAUCAAUCAAGUCCAUCCUCGACUGGACGUCCUUCAACCAAGAGAGAAUCGUAGAUGUGGCCGGACCGGGAGGAUGGAACGACCCUGAUAUGCUUGUAAUUGGCAACUUUGGACUCUCGUGGAACCAGCAAGUAACGCAAAUGGCACUCUGGGCUAUCAUGGCUGCGCCCCUGUUCAUGUCAAACGACCUCAGGCACAUCUCGCCGCAGGCGAAAGCCUUGCUUCAAGAUAAGGACGUCAUCGCGAUUAAUCAGGACCCGCUGGGGAAGCAGGGCUAUCAGCUUAGACAGGGCGACAAUUUUGAGGUCUGGGAGCGACCCCUGAGCGGACUCGCAUGGGCGGUGGCAAUGAUCAAUAGGCAGGAAAUUGGUGGGCCGAGGUCGUACACUAUCGCCGUCGCGUCGUUGGGAAAGGGUGUGGCGUGUAAUCCAGCGUGCUUUAUCACCCAACUGCUGCCCGUCAAGCGCAAACUGGGUUUUUACGAAUGGACGAGCAGACUUCGCUCACACAUUAACCCAACGGGUACGGUGUUGCUCCAGCUCGAGAAUACAAUGCAAAUGUCACUUAAAGAUUUGCUCUGACGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
将GLAmRNA以1mg/mL的终浓度在-80℃储存直至使用时。经由吸收(γmax260nm)测定所有mRNA浓度。
适合体内递送GLA帽0mRNA、GLA帽1mRNA、GLAmRNA和其他对照的制剂包括采用一种或多种阳离子脂质、辅助脂质和PEG化脂质的各种比率的多组分脂质混合物。阳离子脂质可以包括(但不排他地)DOTAP(1，2-二油烯基-3-三甲基铵丙烷)、DODAP(1，2-二油烯基-3-二甲基铵丙烷)、DOTMA(1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷)、DLinDMA(Heyes，J.；Palmer，L.；Bremner，K.；MacLachlan，I.，“Cationiclipidsaturationinfluencesintracellulardeliveryofencapsulatednucleicacids”J.CONTR.REL.，107：276-287(2005))、DLin-KC2-DMA(Semple，S.C.等人“RationalDesignofCationicLipidsforsiRNADelivery”，NATUREBIOTECH.，28：172-176(2010))、C12-200(Love，K.T.等人“Lipid-likematerialsforlow-doseinvivogenesilencing”，PROCNATLACADSCI.USA，107：1864-1869(2010))、HGT4003、ICE、基于二烷基氨基、基于咪唑、基于胍盐等。阳离子脂质可以包括(但不排他地)DSPC(1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DPPC(1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DOPE(1，2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DMPE(1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、DOPG(,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))、胆固醇等。PEG化脂质可以包括(但不排他地)与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价连接的长度达5kDa的聚乙二醇链。通过在0.1％Triton-X100存在和不存在下进行Ribogreen测定来计算mRNA的脂质包封。使用MalvernZetasizer仪器分别在1xPBS和1mMKCl溶液中测定颗粒尺寸(动态光散射(DLS))和ζ电势。
C12-200、DOPE、Chol和DMG-PEG2K的50mg/mL乙醇溶液小份混合并用乙醇稀释至3mL终体积。单独地，从1mg/mL储液制备CO-GLAmRNA(帽0或帽1)的水缓冲溶液(10mM柠檬酸盐/150mMNaCl，pH4.5)。将脂质溶液快速注射进入mRNA水溶液并振摇以产生20％乙醇中的最终悬液。过滤得到的纳米颗粒悬液，用1xPBS(pH7.4)透滤，浓缩并在2-8℃储存。终浓度＝0.72mg/mLGLAmRNA(包封的)。Zave＝85.5nm(Dv(50)＝61.9nm；Dv(90)＝113nm)。
为了确定当mRNA包封进入基于C12-200的脂质时加入GLAmRNA的帽类型是否影响蛋白生成，进行了实验，其中野生型(CD-1)小鼠用加帽GLAmRNA物类注射并随后监测人类GLA蛋白生成。加帽mRNA物类包括帽0(在2'–O位置未甲基化)和帽1(2'-O甲基化)。
在每次实验开始时使用大约6-8周大的雄性CD-1小鼠进行前述研究。通过相等总剂量的30微克包封的GLA、EPO、FIX或AIATmRNA的尾静脉单次快速浓注而引入样品。以六小时测定GLA蛋白的血清浓度。在剂量施用后6小时(±5％)通过CO2窒息而处死所有动物，随后进行胸廓切开术和末端心脏血液收集。经由对处死动物心脏穿刺收集全血(最大可获得的体积)进入血清分离管，允许在室温下凝结至少30分钟，以9300g在22℃±5℃离心10分钟，并萃取血清。对于以六小时的中间血液收集，经由面部静脉穿刺或剪尾来收集大约40-50μL全血。从非治疗动物收集的样品用作与研究动物对比的基线GLA水平。收获每个小鼠的肝和脾，分成三部分并储存在10％中性缓冲福尔马林或快速冷冻并储存在80℃。
通过酶联免疫吸附测定(“ELISA”)测量人类GLA蛋白生成。采用绵羊抗ReplagalG-188IgG作为捕获抗体，兔抗ReplagalIgG作为第二(检测)抗体来进行标准ELISA程序。辣根过氧化物酶(HRP)轭合的山羊抗兔IgG用于活化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液。在20分钟之后使用2NH2SO4猝灭反应。经由在MolecularDeviceFlexStation仪器上的吸收(450nm)而监测检测。未处理的小鼠血清和人类蛋白分别用作阴性和阳性对照。
如图3所示，在静脉内注射以基于C12-200的脂质纳米颗粒加载的CO-GLAmRNA的加帽物类后，可以在6小时内在小鼠血清中检测人类GLA蛋白的实质水平。值得注意的是，相对于帽0结构的mRNA，当采用具有帽1结构的mRNA时，蛋白生成存在明显且统计学上显著的增加。这些结果说明具有表征和定量mRNA合成过程的加帽和甲基化效率的能力的重要性。
等同替代和范围
使用不超过常规实验，本领域技术人员会发现或能够确认本文描述的本发明具体实施方案的许多等同替代。本发明范围不是要限于上述说明书，而是以所附权利要求提出。
在权利要求书中，除非相反指示或者以其他方式从上下文明显指示，冠词例如“一个”、“一种”和“所述”可以表示一个或多于一个。因此，例如，对“一个抗体”的提及包括多个这种抗体，并且对“细胞”的体积包括对本领域技术人员已知的一个或多个细胞的体积，诸如此类。除非相反指示或者以其他方式从上下文明显指示，认为在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明满足该组成员的一个、多于一个或全部存在、用于或以其他方式与给定产品或方法相关的情况。本发明包括其中该组的确切一个成员存在、用于或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方案。本发明包括其中该组成员的多于一个或全部存在、用于或以其他方式与给定产品或方法相关的实施方案。而且，要理解，本发明涵盖其中来自所列权利要求的一个或多个的一个或多个限定、要素、条款、描述性术语等被引入另一个权利要求的所有变化、组合和变换。例如，从属于另一权利要求的任何权利要求可以被调整以包括从属于相同基础权利要求的任何其他权利要求中存在的一个或多个限定。而且，除非另外指明或者除非这对于本领域普通技术人员而言明显会产生矛盾或不一致，当权利要求引述组合物时，要理解包括为本文公开的任何目的使用该组合物的方法，并且包括根据本文公开的制备方法或本领域已知的其他方法的任何一个制备该组合物的方法。
当要素以清单、例如以马库什组形式提出时，要理解，也公开了要素的每个亚组，并且任何要素可以从该组去除。应该理解，一般而言，当本发明或本发明的方面被称为包括特定要素、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的方面由或基本上由此类要素、特征等组成。为了简单的目的，那些实施方案在本文没有以这些语言具体提出。要注意，术语“包括”预期是开放性的，并且允许加入其他要素或步骤。
当给定范围时，包括端点。而且，要理解，除非另外指明或以其他方式从上下文明显并为本领域普通技术人员所理解，以范围表示的值可以在本发明的不通过实施方案中采取该范围内的任何具体值或子范围，至该范围下限值单位的十分之一，除非上下文清楚地另外指明。
此外，要理解，落入现有技术的本发明的任何特定实施方案可以从权利要求的任何一个或多个明确排除。因为认为此类实施方案是本领域普通技术人员已知的，它们可以被排除，即使排除没有在本文明确提出。本发明组合物的任何特定实施方案可以为任何原因而从任何一个或多个权利要求排除，无论是否涉及现有技术的存在。
上述讨论并贯穿本文的出版物仅仅为其在本申请申请日之前公开而提供。在这里没有什么被解释为承认本发明人无权借助在先公开而先于此类公开。
其他实施方案
本领域普通技术人员将容易理解，前文仅代表本发明的某些优选实施方案。可以在不背离本发明精神或范围的情况下对上述方法和组合物做出各种变化和调整，如所附权利要求书中所提出的。

Claims (23)

1.一种定量mRNA加帽效率的方法，所述方法包括：
(1)提供包含加帽mRNA和未加帽mRNA的mRNA样品；
(2)在允许与邻近加帽或未加帽的mRNA的倒数第二个碱基的所述mRNA的5'未翻译区中的序列互补的DNA寡核苷酸与所述序列复性的条件下使所述mRNA样品与所述DNA寡核苷酸接触；
(3)提供选择性降解DNA/RNA杂合体和/或未复性mRNA的一种或多种核酸酶，得到加帽片段和未加帽片段；
(4)通过色谱分离所述加帽片段和未加帽片段；和
(5)测定所述加帽片段和未加帽片段的相对量，从而定量mRNA加帽效率。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述帽具有式I结构：
其中，
B是核碱基；
R1选自卤素、OH和OCH3；
R2选自H、OH和OCH3；
R3是CH3、CH2CH3、CH2CH2CH3或不存在；
R4是NH2；
R5选自OH、OCH3和卤素；
n是1、2或3；并且
M是所述mRNA的核苷酸。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述核碱基是鸟嘌呤。
4.如前述权利要求任一项所述的方法，其中所述帽是具有式II结构的m7G帽或具有式III结构的未甲基化帽：
其中，
R2是H或CH3；
R4是NH2；
R5是OH或OCH3；
R6是H或CH3；并且
M是所述mRNA的核苷酸；或
其中M是所述mRNA的核苷酸。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中步骤(4)进一步分离甲基化加帽RNA和未甲基化加帽RNA。
6.如权利要求5所述的方法，其中甲基化帽包括在R3和/或R5位置的甲基化。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述方法还包括定量测定所述加帽RNA的甲基化百分比的步骤。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸长度为10-80个核苷酸。
9.如权利要求1-8任一项所述的方法，其中所述DNA寡核苷酸两侧都具有一个或多个RNA核苷酸。
10.如权利要求1-9任一项所述的方法，其中所述mRNA的5'未翻译区中的序列在从加帽或未加帽的mRNA倒数第二个碱基的1或2个碱基内。
11.如权利要求1-10任一项所述的方法，其中所述一种或多种核酸酶包括RNA酶H。
12.如权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述一种或多种核酸酶包括产生平端加帽片段和未加帽片段的核酸酶。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述核酸酶是核酸酶S1、RNA酶H、或另一种5'核酸外切酶。
14.如权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述加帽片段和未加帽片段包括所述mRNA的不超过5个碱基。
15.如权利要求1-13任一项所述的方法，其中所述加帽片段和未加帽片段包括所述mRNA的不超过2个碱基。
16.如权利要求1-15任一项所述的方法，其中步骤(4)包括将所述加帽片段和未加帽片段施加至色谱柱的步骤。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述色谱柱选自由以下组成的组：阴离子交换HPLC柱、阳离子交换HPLC柱、反相HPLC柱、疏水相互作用柱、高效液相色谱柱或尺寸排阻柱。
18.如权利要求1-17任一项所述的方法，其中步骤(5)包括测定所述加帽片段和未加帽片段的相对峰面积。
19.如权利要求1-18任一项所述的方法，其中所述mRNA样品是体外合成的。
20.一种生产mRNA的方法，包括根据权利要求1-19任一项的方法定量mRNA加帽效率的步骤。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述方法包括基于定量mRNA加帽效率结果而调节生产条件的步骤。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述定量步骤在释放mRNA批次之前进行。
23.根据权利要求20-22任一项的方法生产的mRNA。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112111558A (zh) * 2020-08-19 2020-12-22 翌圣生物科技（上海）有限公司 一种测定牛痘病毒加帽酶活性的方法
CN114250268A (zh) * 2021-12-23 2022-03-29 北京毅新博创生物科技有限公司 检测mRNA样品的加帽效率的产品及用途
CN114574466A (zh) * 2022-05-09 2022-06-03 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用
WO2023115495A1 (zh) * 2021-12-23 2023-06-29 北京毅新博创生物科技有限公司 质谱法检测mRNA加帽效率的方法
CN116426610A (zh) * 2023-06-08 2023-07-14 启辰生生物科技(珠海)有限公司 一种LC-MS法准确定量mRNA加帽效率的方法
CN116590382A (zh) * 2023-07-12 2023-08-15 上海奥浦迈生物科技股份有限公司 检测mRNA样品加帽率的探针、试剂盒及其使用方法
WO2023185947A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种检测rna加帽效率的方法

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ733634A (en) 2009-12-01 2022-10-28 Translate Bio Inc Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
DK3336082T3 (da) 2011-06-08 2020-04-27 Translate Bio Inc Spaltelige lipider
RS59037B1 (sr) 2011-06-08 2019-08-30 Translate Bio Inc Kompozicije lipidnih nanočestica i postupci za isporuku irnk
EP3536787A1 (en) 2012-06-08 2019-09-11 Translate Bio, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
DK2971098T3 (en) 2013-03-14 2019-02-18 Translate Bio Inc QUANTITATIVE ASSESSMENT FOR CAPE EFFECTIVENESS OF MESSENGER RNA
DK2970955T3 (en) 2013-03-14 2019-02-11 Translate Bio Inc METHODS FOR CLEANING MESSENGER RNA
KR20210122917A (ko) 2013-03-14 2021-10-12 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Cftr mrna 조성물 및 관련 방법 및 사용
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
EP2971161B1 (en) 2013-03-15 2018-12-26 ModernaTX, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014152027A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
EP2971165A4 (en) 2013-03-15 2016-11-23 Moderna Therapeutics Inc DISSOLUTION OF DNA FRAGMENTS IN MRNA MANUFACTURING METHODS
WO2015051169A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
CN106413811A (zh) 2013-10-22 2017-02-15 夏尔人类遗传性治疗公司 精氨基琥珀酸合成酶缺乏症的mrna疗法
AU2014340083B2 (en) 2013-10-22 2019-08-15 Translate Bio, Inc. mRNA therapy for phenylketonuria
WO2015101416A1 (en) * 2013-12-30 2015-07-09 Curevac Gmbh Methods for rna analysis
EP3540060A1 (en) * 2013-12-30 2019-09-18 CureVac AG Methods for rna analysis
EP3134506B1 (en) 2014-04-25 2019-08-07 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
EP3157573A4 (en) 2014-06-19 2018-02-21 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
AU2015289656A1 (en) 2014-07-16 2017-02-16 Modernatx, Inc. Circular polynucleotides
EP3317424B1 (en) * 2015-07-01 2023-09-06 CureVac Manufacturing GmbH Method for analysis of an rna molecule
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
EP3362555B1 (en) 2015-10-14 2021-01-13 Translate Bio, Inc. Modification of rna-related enzymes for enhanced production
EP3656872A1 (en) 2015-12-09 2020-05-27 Novartis AG Label-free analysis of rna capping efficiency using rnase h, probes and liquid chromatography/mass spectrometry
EP3405579A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
WO2017149139A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-08 Curevac Ag Rna analysis by total hydrolysis
WO2017180917A2 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
JP7246930B2 (ja) 2016-05-18 2023-03-28 モデルナティエックス インコーポレイテッド インターロイキン－１２（ｉｌ１２）をコードするポリヌクレオチドおよびその使用
US10471153B2 (en) 2016-11-10 2019-11-12 Translate Bio, Inc. Ice-based lipid nanoparticle formulation for delivery of mRNA
EP3585886B1 (en) 2017-02-27 2023-11-22 Translate Bio, Inc. Large scale synthesis of messenger rna
HUE059025T2 (hu) 2017-02-27 2022-10-28 Translate Bio Inc Módszerek a hírvívõ RNS tisztítására
ES2925083T3 (es) 2017-02-27 2022-10-13 Translate Bio Inc Métodos de purificación de ARN mensajero
EA201991747A1 (ru) 2017-02-27 2020-06-04 Транслейт Био, Инк. НОВАЯ КОДОН-ОПТИМИЗИРОВАННАЯ мРНК CFTR
WO2018213476A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
WO2018231990A2 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US11174500B2 (en) 2018-08-24 2021-11-16 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger RNA
WO2020097509A1 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for messenger rna purification
MX2021005969A (es) 2018-11-21 2021-09-14 Translate Bio Inc Tratamiento de la fibrosis quística mediante el suministro de arnm que codifica cftr nebulizado.
US20220040281A1 (en) 2018-12-21 2022-02-10 Curevac Ag Rna for malaria vaccines
SG11202106666UA (en) 2018-12-21 2021-07-29 Curevac Ag Methods for rna analysis
WO2020168466A1 (en) 2019-02-19 2020-08-27 Stemirna Therapeutics Co., Ltd. Modified nucleoside and synthetic methods thereof
WO2020214946A1 (en) 2019-04-18 2020-10-22 Translate Bio, Inc. Cystine cationic lipids
WO2020219427A1 (en) 2019-04-22 2020-10-29 Translate Bio, Inc. Thioester cationic lipids
EP3962902A1 (en) 2019-05-03 2022-03-09 Translate Bio, Inc. Di-thioester cationic lipids
MX2021013954A (es) 2019-05-15 2022-03-11 Translate Bio Inc Métodos de purificación de arn mensajero.
WO2020254535A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Curevac Ag Rotavirus mrna vaccine
WO2020257716A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Translate Bio, Inc. Tricine and citric acid lipids
WO2020257611A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Translate Bio, Inc. Cationic lipids comprising an hydroxy moiety
US20220323542A1 (en) 2019-07-30 2022-10-13 Translate Bio, Inc. TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS BY DELIVERY OF NEBULIZED mRNA ENCODING CFTR
KR20220047319A (ko) 2019-08-14 2022-04-15 큐어백 아게 감소된 면역자극 특성을 갖는 rna 조합물 및 조성물
EP4022068A1 (en) * 2019-08-29 2022-07-06 Universität Zürich Minimal messenger rnas and uses thereof
MX2022003394A (es) 2019-09-20 2022-06-22 Translate Bio Inc Arnm que codifica cftr manipulado.
EP4041400A1 (en) 2019-10-09 2022-08-17 Translate Bio, Inc. Compositions, methods and uses of messenger rna
CN115279418A (zh) 2019-10-21 2022-11-01 川斯勒佰尔公司 信使rna的组合物、方法和用途
AU2020405214A1 (en) 2019-12-20 2022-08-11 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mRNA-loaded lipid nanoparticles
US20230051811A1 (en) 2019-12-20 2023-02-16 Translate Bio, Inc Rectal delivery of messenger rna
WO2021156267A1 (en) 2020-02-04 2021-08-12 Curevac Ag Coronavirus vaccine
EP4103712A1 (en) 2020-02-10 2022-12-21 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for messenger rna purification
BR112022016258A2 (pt) 2020-02-18 2022-10-18 Translate Bio Inc Processos melhorados para transcrição in vitro de rna mensageiro
JP2023514450A (ja) 2020-02-25 2023-04-05 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド Ｍｒｎａ担持脂質ナノ粒子を調製する改善された方法
WO2021213924A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2021226468A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Translate Bio, Inc. Improved compositions for cftr mrna therapy
BR112022022508A2 (pt) 2020-05-07 2023-01-10 Translate Bio Inc Geração de sequências nucleotídicas otimizadas
EP4146680A1 (en) 2020-05-07 2023-03-15 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
AU2021269042A1 (en) 2020-05-07 2023-02-02 Translate Bio, Inc. Optimized nucleotide sequences encoding SARS-CoV-2 antigens
CA3183399A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Translate Bio, Inc. Lipid nanoparticle formulations for mrna delivery
EP3993828A1 (en) 2020-05-29 2022-05-11 CureVac AG Nucleic acid based combination vaccines
EP4172194A1 (en) 2020-07-31 2023-05-03 CureVac SE Nucleic acid encoded antibody mixtures
EP4157344A2 (en) 2020-08-31 2023-04-05 CureVac SE Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines
US20230357751A1 (en) 2020-10-01 2023-11-09 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
EP4225268A1 (en) 2020-10-06 2023-08-16 Translate Bio, Inc. Improved process and formulation of lipid nanoparticles
AU2021361986A1 (en) 2020-10-12 2023-06-15 Translate Bio, Inc. Improved process of preparing mrna-loaded lipid nanoparticles
US20220133631A1 (en) 2020-10-12 2022-05-05 Translate Bio, Inc. Process of preparing ice-based lipid nanoparticles
TW202231651A (zh) 2020-10-15 2022-08-16 美商崔斯雷生物公司 大規模合成訊息ｒｎａ
WO2022099003A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Sanofi Lipid nanoparticles for delivering mrna vaccines
WO2022099194A1 (en) 2020-11-09 2022-05-12 Translate Bio, Inc. Improved compositions for delivery of codon-optimized mrna
IL303165A (en) 2020-11-25 2023-07-01 Translate Bio Inc Stable liquid formulations of lipid nanoparticles
CA3171051A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration
WO2022137133A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Rna vaccine against sars-cov-2 variants
WO2022155404A1 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies
US20240102065A1 (en) 2021-01-27 2024-03-28 CureVac SE Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
WO2022204549A1 (en) 2021-03-25 2022-09-29 Translate Bio, Inc. Optimized nucleotide sequences encoding the extracellular domain of human ace2 protein or a portion thereof
CA3212653A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
AU2022264425A1 (en) 2021-04-29 2023-12-14 Translate Bio, Inc. Methods for measuring poly a tail length
CA3171589A1 (en) 2021-05-03 2022-11-03 Moritz THRAN Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression
AU2022284878A1 (en) * 2021-06-04 2024-01-18 Translate Bio, Inc. Assay for quantitative assessment of mrna capping efficiency
US20230043128A1 (en) 2021-06-18 2023-02-09 Sanofi Multivalent influenza vaccines
WO2023023487A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Translate Bio, Inc. Screening codon-optimized nucleotide sequences
WO2023031392A2 (en) 2021-09-03 2023-03-09 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine
WO2023079507A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Respiratory syncytial virus rna vaccine
WO2023086893A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of primary ciliary dyskinesia
WO2023102373A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Sanofi Pasteur Inc. Human metapneumovirus vaccines
WO2023111262A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Sanofi Lyme disease rna vaccine
CN117730157A (zh) * 2022-04-15 2024-03-19 萨默费尼根有限公司 用于定量监测mRNA加帽效率的方法
WO2023214082A2 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Sanofi Signal sequences for nucleic acid vaccines
JP2023181989A (ja) 2022-06-13 2023-12-25 上海臻上医薬科技有限公司 マイクロニードル注射製剤およびその使用
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
GB202209732D0 (en) * 2022-07-01 2022-08-17 Sintef Tto As Method of analysing rna
WO2024023335A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Sanofi Methods for ethanol-free mrna purification
WO2024044108A1 (en) 2022-08-22 2024-02-29 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Vaccines against coronaviruses
WO2024064732A2 (en) 2022-09-20 2024-03-28 Visterra, Inc. Treatment of complement mediated diseases and disorders with c3b-antibodies

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102076847A (zh) * 2008-05-02 2011-05-25 Epi中心科技公司 Rna多磷酸酶组合物、试剂盒及其应用

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3529478A1 (de) 1985-08-16 1987-02-19 Boehringer Mannheim Gmbh 7-desaza-2'desoxyguanosin-nukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur nukleinsaeure-sequenzierung
EP0463109A4 (en) 1989-03-24 1992-11-19 Research Corporation Technologies, Inc. Recombinant alpha-galactosidase, a therapy for fabry disease
US5356804A (en) 1990-10-24 1994-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of The City Of New York Cloning and expression of biologically active human α-galactosidase A
DE4140463A1 (de) 1991-12-09 1993-06-17 Boehringer Mannheim Gmbh 2'-desoxy-isoguanosin, dessen isostere analoge sowie anwendung derselben
US5256555A (en) 1991-12-20 1993-10-26 Ambion, Inc. Compositions and methods for increasing the yields of in vitro RNA transcription and other polynucleotide synthetic reactions
US5459055A (en) 1991-12-27 1995-10-17 Epicentre Technologies Corporation Thermostable ribonuclease H isolated from Thermus flavus
US5268289A (en) 1991-12-27 1993-12-07 Epicentre Technologies Corp. Thermostable ribonuclease H
CN1231695A (zh) 1996-08-16 1999-10-13 同和药品工业株式会社 HBV聚合酶,起源于HBV聚合酶的RNaseH,其制备过程和在筛选抗病毒剂中的应用
US6458574B1 (en) 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
US6043060A (en) 1996-11-18 2000-03-28 Imanishi; Takeshi Nucleotide analogues
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6143877A (en) 1997-04-30 2000-11-07 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides including pyrazolo[3,4-D]pyrimidine bases, bound in double stranded nucleic acids
WO1999014226A2 (en) 1997-09-12 1999-03-25 Exiqon A/S Bi- and tri-cyclic nucleoside, nucleotide and oligonucleotide analogues
JP2001525166A (ja) 1997-12-04 2001-12-11 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヒトｒｎａｓｅｈおよびその組成物および使用
US6127121A (en) 1998-04-03 2000-10-03 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-D]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination
US6001652A (en) 1998-09-18 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of cREL expression
DE60031282T2 (de) 1999-08-30 2007-05-03 Roche Diagnostics Gmbh 2-azapurine verbindungen und ihre verwendung
US6660845B1 (en) 1999-11-23 2003-12-09 Epoch Biosciences, Inc. Non-aggregating, non-quenching oligomers comprising nucleotide analogues; methods of synthesis and use thereof
EP1373874A4 (en) * 2001-01-31 2004-03-31 Univ Texas METHOD AND DEVICE FOR CONFINING MATERIALS IN A MICROWORKED CHEMICAL SENSOR ARRAY
EP2049665A2 (en) 2006-07-28 2009-04-22 Applera Corporation Dinucleotide mrna cap analogs
DE102006061015A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Curevac Gmbh Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC
WO2009058911A2 (en) 2007-10-31 2009-05-07 Applied Biosystems Inc. Preparation and isolation of 5' capped mrna
US20100035249A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
DK2971098T3 (en) 2013-03-14 2019-02-18 Translate Bio Inc QUANTITATIVE ASSESSMENT FOR CAPE EFFECTIVENESS OF MESSENGER RNA
WO2017149139A1 (en) 2016-03-03 2017-09-08 Curevac Ag Rna analysis by total hydrolysis

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102076847A (zh) * 2008-05-02 2011-05-25 Epi中心科技公司 Rna多磷酸酶组合物、试剂盒及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANILKUMAR R. KORE, IRUDAYA CHARLES: "Synthesis and evaluation of 20-O-allyl substituted dinucleotide cap analog for mRNA translation", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *
IRINA Y TCHEREPANOVA，ET AL: "Ectopic expression of a truncated CD40L protein from synthetic post-transcriptionally capped RNA in dendritic cells induces high levels of IL-12 secretion", 《 BMC MOLECULAR BIOLOGY》 *
JEEN-WOO PARK AND BRUCE N. AMES: "7-Methylguanine adducts in DNA are normally present at high levels and increase on aging: Analysis by HPLC with electrochemical detection", 《PROC. NATL. ACAD. SCI. USA》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112111558A (zh) * 2020-08-19 2020-12-22 翌圣生物科技（上海）有限公司 一种测定牛痘病毒加帽酶活性的方法
CN114250268A (zh) * 2021-12-23 2022-03-29 北京毅新博创生物科技有限公司 检测mRNA样品的加帽效率的产品及用途
WO2023115495A1 (zh) * 2021-12-23 2023-06-29 北京毅新博创生物科技有限公司 质谱法检测mRNA加帽效率的方法
WO2023185947A1 (zh) * 2022-04-02 2023-10-05 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种检测rna加帽效率的方法
CN114574466A (zh) * 2022-05-09 2022-06-03 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种嵌合加帽酶及其制备方法与应用
CN116426610A (zh) * 2023-06-08 2023-07-14 启辰生生物科技(珠海)有限公司 一种LC-MS法准确定量mRNA加帽效率的方法
CN116426610B (zh) * 2023-06-08 2024-01-05 启辰生生物科技(珠海)有限公司 一种LC-MS法准确定量mRNA加帽效率的方法
CN116590382A (zh) * 2023-07-12 2023-08-15 上海奥浦迈生物科技股份有限公司 检测mRNA样品加帽率的探针、试剂盒及其使用方法
CN116590382B (zh) * 2023-07-12 2023-11-10 上海奥浦迈生物科技股份有限公司 检测mRNA样品加帽率的探针、试剂盒及其使用方法

Also Published As

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