ES2899323T3 - Métodos de purificación de ARN mensajero - Google Patents

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Abstract

Un método para purificar al menos aproximadamente 1 gramo de ARNm transcrito in vitro, que comprende las etapas de: proporcionar una solución que comprende el ARNm transcrito in vitro; añadir uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm transcrito in vitro, para obtener de esta manera una suspensión; agitar la suspensión antes y/o mientras se proporciona presión a la suspensión y/o un vacío a la suspensión suficiente para dirigir el licor madre de la suspensión a través de un filtro, para obtener de esta manera una composición que contiene precipitado; y lavar la composición que contiene precipitado, para producir de esta manera un precipitado de ARNm purificado.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de purificación de ARN mensajero
Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 62/463,998, presentada el 27 de febrero de 2017
Antecedentes de la invención
Los de ARN mensajero (ARNm) terapéuticos son agentes terapéuticos nuevos y prometedores; por ejemplo, las terapias de reemplazo de ARNm pueden ser alternativas a las terapias tradicionales de reemplazo de proteínas. En una terapia de reemplazo de ARNm, un ARNm intacto que codifica una secuencia de proteína específica se entrega a una célula diana y se traduce en una proteína intacta por la maquinaria de traducción nativa de la célula. El ARNm para tales terapias se sintetiza típicamente mediante el uso de sistemas de transcripción in vitro con enzimas tales como las ARN polimerasas que transcriben ARNm a partir de ADN plasmídico molde, junto con o seguido de la adición de la caperuza 5' y la poliadenilación 3'. El resultado de tales reacciones es una composición que incluye ARNm de longitud completa y varios contaminantes indeseables, por ejemplo, enzimas, proteínas, sales, tampones y ácidos nucleicos que no son ARNm, que típicamente se omiten para proporcionar un ARNm limpio y homogéneo que se puede usar en una terapia de reemplazo de ARNm.
Tradicionalmente, el ARNm se purifica a partir de reacciones de transcripción in vitro ya sea mediante sistemas de columna basados en sílice disponibles comercialmente, como el kit Qiagen RNeasy®, o mediante extracción de proteínas en una mezcla orgánica (fenol: cloroformo: alcohol isoamílico) y la subsecuente precipitación con etanol. Estos métodos tienen una escala limitada, ya que pueden proporcionar un máximo de cinco a diez mg de ARNm limpio y homogéneo; por tanto, son inadecuados para las necesidades de los usos clínicos y los usos comerciales del ARNm. Se han modificado métodos novedosos recientes, como la filtración de flujo tangencial (TFF), para purificar el ARNm precipitado de reacciones de transcripción in vitro; esto ha aumentado enormemente la escala de purificación. Sin embargo, los métodos adicionales adecuados para la purificación de ARNm a gran escala pueden ser útiles para el desarrollo clínico y comercial continuo de terapias de ARNm.
En consecuencia, existe la necesidad de un método que produzca composiciones de ARNm limpias y homogéneas, por ejemplo, que se puede usar para purificar un ARNm terapéutico tal como un ARNm terapéutico de reemplazo. El método descrito en la presente invención es además ventajoso porque aborda esta necesidad y en cantidades a gran escala, pero de una manera rentable.
Resumen de la invención
La presente invención se refiere a métodos para purificar ARN mensajero, incluye los métodos mediante el uso de una celda de agitación o un dispositivo de filtración Nutsche agitado para preparar cantidades, incluidas cantidades a gran escala, de composiciones de ARNm limpias y homogéneas, por ejemplo, que se pueden usar en una terapia de reemplazo de ARNm.
Generalmente, los métodos permiten la filtración de una suspensión que contiene ARNm en un recipiente cerrado mediante el uso de presión o vacío que separa el licor madre de la suspensión a través de una pantalla o membrana de filtrado.
En las modalidades del método, se agrega una solución de sal de alta concentración (por ejemplo, una sal caotrópica como tiocianato de guanidina) a una composición inicial que contiene ARNm para desnaturalizar y solubilizar las proteínas contaminantes (por ejemplo, ARNm polimerasa y ADNasa I, que se añade después de la transcripción para eliminar los ADN moldes) seguido de la adición de un alcohol (por ejemplo, etanol) para precipitar selectivamente el ARNm.
Después de la precipitación del ARNm, la suspensión resultante se agita continuamente dentro del dispositivo de filtrado mientras se aplica presión a la suspensión para empujar el licor madre a través del filtro o se aplica vacío para extraer el licor madre a través del filtro. Más tarde, el precipitado dentro de la suspensión se lava o diafiltra mediante el uso de una mezcla de sal/alcohol seguido de un lavado con alto porcentaje de alcohol para producir un precipitado libre de contaminación, por ejemplo, proteínas, sales, tampón y ácidos nucleicos que no son ARNm. La subsecuente disolución del ARNm precipitado con agua produce una composición de ARNm purificada. En algunas modalidades, se agrega un soporte sólido, como perlas de poliestireno de un tamaño conocido, para aumentar la capacidad de purificación dentro de un volumen de filtración dado. En consecuencia, la presente invención es superior a los métodos usados actualmente para producir composiciones de ARNm purificado, por ejemplo, para su uso en terapias de reemplazo de ARNm. En resumen, la presente invención representa un avance significativo en el campo terapéutico basado en ARNm.
En un aspecto, la presente invención presenta un método para purificar ARNm que incluye etapas de proporcionar una solución que comprende ARNm; añadir uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm, obtener así una suspensión; agitar la suspensión antes y/o mientras se proporciona presión a la suspensión y/o un vacío a la suspensión suficiente para dirigir el licor madre de la suspensión a través de un filtro, para obtener así una composición que contiene precipitado; y lavar la composición que contiene precipitado, para producir así un precipitado de ARNm purificado. En las modalidades, un lavado es un diafiltrado, ultrafiltrado o dializado.
En otro aspecto, la presente invención presenta un método para purificar al menos aproximadamente 1, 2,5, 5 o 10 gramos de ARNm que incluye las etapas de proporcionar una solución que comprende ARNm; añadir uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm, para obtener así una suspensión; agitar la suspensión antes y/o mientras se proporciona presión a la suspensión y/o un vacío a la suspensión suficiente para dirigir el licor madre de la suspensión a través de un filtro, para obtener así una composición que contiene precipitado; y lavar la composición que contiene precipitado, para producir así un precipitado de ARNm purificado, y en donde el ARNm purificado total se recupera en una cantidad que da como resultado un rendimiento de al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %; y/o el ARNm purificado total está sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro. En las modalidades, un lavado es un diafiltrado, ultrafiltrado o dializado.
En otro aspecto más, la presente invención presenta un método para purificar al menos aproximadamente 25, 50, 100 o 1000 gramos de ARNm que incluye las etapas de proporcionar una solución que comprende ARNm; añadir uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm, para obtener así una suspensión; agitar la suspensión antes y/o mientras se proporciona presión a la suspensión y/o un vacío a la suspensión suficiente para dirigir el licor madre de la suspensión a través de un filtro, para obtener así una composición que contiene precipitado; y lavar la composición que contiene precipitado, para producir así un precipitado de ARNm purificado, y en donde el ARNm purificado total se recupera en una cantidad que da como resultado un rendimiento de al menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % o 95 %; y/o el ARNm purificado total está sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro. En las modalidades, un lavado es un diafiltrado, ultrafiltrado o dializado.
En las modalidades, se produce una etapa de agitación en una celda de agitación o en un filtro Nutsche.
En las modalidades, se produce una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm en la celda de agitación o en el filtro Nutsche.
En las modalidades, una etapa de añadir uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm no se produce en la celda de agitación o en el Filtro Nutsche.
En las modalidades, la agitación se produce a una velocidad entre aproximadamente 50 RPM y aproximadamente 500 RPM. En las modalidades, la agitación se produce a una velocidad de aproximadamente 200 r Pm .
En las modalidades, la presión está entre aproximadamente 5 PSI y aproximadamente 100 PSI.
En las modalidades, la presión es de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 40 PSI.
En las modalidades, se produce al menos una etapa de lavado en una celda de agitación o en un filtro Nutsche. En las modalidades, uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm comprenden un alcohol. En las modalidades, un alcohol es etanol.
En las modalidades, un método comprende además la adición de uno o más agentes que desnaturalizan las proteínas y/o mantienen las proteínas solubles en un medio acuoso.
En las modalidades, uno o más agentes que desnaturalizan las proteínas y/o mantienen las proteínas solubles en un medio acuoso comprenden una sal.
En las modalidades, una sal es una sal caotrópica.
En las modalidades, se produce una etapa de añadir uno o más agentes que desnaturalizan las proteínas y/o mantienen las proteínas solubles en un medio acuoso en la celda de agitación o en el filtro Nutsche.
En las modalidades, una etapa de añadir uno o más agentes que desnaturalizan las proteínas y/o mantienen las proteínas solubles en un medio acuoso no se produce en la celda de agitación o en el Filtro Nutsche.
En las modalidades, un método comprende además una etapa de secado del precipitado de ARNm purificado. En las modalidades, un precipitado de ARNm purificado se seca al proporcionar de forma continua presión y/o vacío de manera que el ARNm precipitado se obtenga como una masa de precipitado.
En las modalidades, un método comprende además una etapa de solubilización del precipitado de ARNm purificado en un medio acuoso, para obtener así una solución que comprende ARNm purificado.
En las modalidades, una etapa de solubilización del precipitado de ARNm purificado comprende la adición de un medio acuoso. En las modalidades, un medio acuoso es agua.
En las modalidades, una suspensión comprende al menos un dispersante. En las modalidades, un dispersante es uno o más de ceniza, arcilla, tierra de diatomeas, agente filtrante, perlas de vidrio, perlas de plástico, polímeros, perlas de polipropileno, perlas de poliestireno, sales (por ejemplo, sales de celulosa), arena y azúcares.
En las modalidades, un método comprende además una o más etapas para separar el dispersante del precipitado de ARNm purificado.
En las modalidades, una o más etapas para separar el dispersante del precipitado de ARNm purificado comprende lavar y secar la masa.
En las modalidades, un método comprende además solubilizar y eluir el ARNm purificado de la masa mediante el uso de un medio acuoso mientras se filtra el dispersante.
En las modalidades, un medio acuoso es agua.
En las modalidades, una solución proporcionada de ARNm comprende de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 100 g de ARNm, de aproximadamente 100 g de ARNm a aproximadamente 1 kg de ARNm, de aproximadamente 500 g de ARNm a aproximadamente 5 kg de ARNm, o de aproximadamente 500 g de ARNm a aproximadamente 2,5 kg de ARNm.
En las modalidades, uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm son una sal caotrópica y un alcohol. En las modalidades, una sal caotrópica es el tiocianato de guanidina y un alcohol es el etanol.
En las modalidades, el ARNm se pone en contacto con el uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm durante una cantidad total de aproximadamente un minuto a aproximadamente una hora, de aproximadamente un minuto a aproximadamente treinta minutos, de aproximadamente un minuto a aproximadamente quince minutos, o aproximadamente un minuto a aproximadamente diez minutos.
En las modalidades, se produce una etapa de agitación en una celda de agitación y la presión es de aproximadamente 20 PSI a aproximadamente 50 PSI.
En las modalidades, cada etapa de agitación se produce en una celda de agitación.
En las modalidades, una etapa de lavado comprende poner en contacto la composición que contiene precipitado con una primera solución que comprende una sal caotrópica y un alcohol. En las modalidades, una sal caotrópica es el tiocianato de guanidina y un alcohol es el etanol.
En las modalidades, una composición que contiene precipitado se pone en contacto con dicha primera solución de 1-5 veces.
En las modalidades, un método comprende además una etapa de lavado que comprende poner en contacto la composición que contiene precipitado con una segunda solución que es un alcohol acuoso.
En las modalidades, una segunda solución es etanol acuoso.
En las modalidades, una composición que contiene precipitado se pone en contacto con dicha segunda solución de 1-10 veces.
En las modalidades, se produce una etapa de lavado en una celda de agitación y la presión es de aproximadamente 20 PSI a aproximadamente 50 PSI.
En las modalidades, cada etapa de lavado se produce en una celda de agitación.
En las modalidades, un método comprende además una etapa de solubilización del precipitado de ARNm purificado en un medio acuoso, para obtener así una solución que comprende ARNm purificado.
En las modalidades, una solución proporcionada de ARNm comprende un dispersante.
En las modalidades, un dispersante son microesferas de polímero.
En las modalidades, se produce una etapa de agitación en un filtro Nutsche y la presión es de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 25 PSI.
En las modalidades, cada etapa de agitación se produce en un filtro Nutsche.
En las modalidades, una etapa de lavado comprende poner en contacto la composición que contiene precipitado con una primera solución que comprende una sal caotrópica y un alcohol. En las modalidades, una sal caotrópica es el tiocianato de guanidina y un alcohol es el etanol.
En las modalidades, una composición que contiene precipitado se pone en contacto con dicha primera solución de 1-5 veces.
En las modalidades, un método comprende además una etapa de lavado que comprende poner en contacto la composición que contiene precipitado con una segunda solución que es un alcohol acuoso.
En las modalidades, una segunda solución es etanol acuoso.
En las modalidades, una composición que contiene precipitado se pone en contacto con dicha segunda solución de 1-10 veces.
En las modalidades, se produce una etapa de lavado en un filtro Nutsche y la presión es de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 25 PSI.
En las modalidades, cada etapa de lavado se produce en un filtro Nutsche.
En las modalidades, una etapa de secado sigue al menos a una etapa de lavado. En las modalidades, una etapa de secado sigue a cada etapa de lavado. En las modalidades, una etapa de secado es una etapa final de un método de purificación descrito en la presente descripción.
En las modalidades, un método comprende además una etapa de solubilización del precipitado de ARNm purificado en un medio acuoso, para obtener así una solución que comprende ARNm purificado.
En otro aspecto, la invención presenta una composición que comprende ARNm purificado seco, en donde dicho ARNm se obtiene mediante un método descrito en la presente invención.
En las modalidades, la invención presenta una composición que comprende ARNm purificado seco, en donde dicho ARNm se obtiene mediante un método que comprende: proporcionar una solución que comprende ARNm; añadir uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm, para obtener así una suspensión; agitar la suspensión antes y/o mientras se proporciona presión a la suspensión y/o un vacío a la suspensión suficiente para dirigir el licor madre de la suspensión a través de un filtro, para obtener así una composición que contiene precipitado; y lavar la composición que contiene precipitado, para producir así un precipitado de ARNm purificado. En las modalidades, un lavado es un diafiltrado, ultrafiltrado o dializado.
En las modalidades, el ARNm purificado seco comprende un dispersante. En las modalidades, el ARNm purificado seco está sustancialmente libre de cualquier dispersante (por ejemplo, cualquier dispersante usado en un método de purificación descrito en la presente descripción).
En algunas modalidades, el ARNm purificado seco se almacena a una temperatura de aproximadamente 0 °C a aproximadamente -40 °C durante un período de al menos aproximadamente una semana a aproximadamente dos años, un período de hasta aproximadamente dos años, o un período de hasta aproximadamente un año.
En algunas modalidades, el ARNm purificado seco se reconstituye después del almacenamiento.
En algunas modalidades, el ARNm purificado seco tiene sustancialmente la misma integridad que antes del almacenamiento.
En algunas modalidades, el ARNm es ARNm transcrito in vitro.
En algunas modalidades, el ARNm es ARNm de caperuza y cola (C/T).
En algunas modalidades, el ARNm es el ARNm final.
En las modalidades, el ARNm codifica para la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR).
En las modalidades, el ARNm codifica para la ornitina transcarbamilasa (OTC).
Otro aspecto de la presente invención es una composición que incluye un precipitado de ARNm purificado preparado mediante el método anterior.
Otro aspecto más de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende una composición de la presente invención y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto más de los presentes inventores es un método para tratar una enfermedad o trastorno que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición farmacéutica de la presente invención.
Cualquier aspecto o modalidad descritos en la presente descripción se puede combinar con cualquier otro aspecto o modalidad como se describe en la presente descripción. Aunque la invención se describe junto con la descripción detallada de esta, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la descripción, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas, y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Las características anteriores y siguientes se harán más claramente apreciables a partir de la siguiente descripción detallada cuando se toma en relación con los dibujos acompañantes. Sin embargo, las figuras son solamente con propósitos de ilustración; no de limitación.
La Figura 1 es una imagen digital de un gel de agarosa/TAE al 1% que muestra: carril 1: marcador de referencia de ARNm; carril 2: ARNm de CFTR transcrito purificado con la celda de agitación; carril 3: ARNm de CFTR transcrito purificado con filtro Nutsche mediante el uso de perlas de poliestireno; y carril 4: ARNm de CFTR transcrito purificado con Qiagen RNeasy®.
La Figura 2 es una imagen digital de una SDS-PAGE al 10% teñida con la tinción de plata que detecta enzimas residuales en las muestras de ARNm degradado por la ARNasa I. La imagen muestra: carril 1: Lote de ingeniería representativo de ARNm ARNasa I de CFTR; carril 2: transcrito de ARNm de CFTR purificado con celdas de agitación ARNasa I; carril 3: ARNm de CFTR transcrito purificado con el filtro Nutsche mediante el uso de perlas de poliestireno ARNasa I; y carriles 4 a 8: Enzimas componentes como se indica en la etiqueta.
Definiciones
Para que la presente invención se entienda con mayor facilidad, primero se definen ciertos términos a continuación. Las definiciones adicionales de los siguientes términos y otros términos se exponen a lo largo de la descripción. Como se usa en esta descripción y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto dicte claramente de cualquier otra manera.
A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, como se usa en la presente descripción, se entiende que el término "o" es inclusivo y cubre tanto "o" e "y".
Los términos "por ejemplo" y "es decir" como se usa en la presente descripción, se usan simplemente a manera de ejemplo, sin limitación intencionada, y no debe interpretarse como una referencia solo a los elementos enumerados explícitamente en la especificación.
Se entiende que los términos "o más", "al menos", "más de" y similares, por ejemplo, "al menos uno" incluyen, pero no están limitados a, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más que el valor indicado. También se incluye cualquier número mayor o fracción intermedia.
Por el contrario, el término "no más de" incluye cada valor menor que el valor indicado. Por ejemplo, "no más de 100 nucleótidos" incluye 100, 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 89, 88, 87, 86, 85, 84, 83, 82, 81, 80, 79, 78, 77, 76, 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 y 0 nucleótidos. También se incluye cualquier número menor o fracción intermedia.
Se entiende que los términos "pluralidad", "al menos dos", "dos o más", "al menos un segundo" y similares incluyen, pero no están limitados a, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 o 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 o más. También se incluye cualquier número mayor o fracción intermedia.
A través de toda la descripción la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se entiende que implican la inclusión de un elemento declarado, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas.
A menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" se entiende dentro de un intervalo de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. "Aproximadamente" puede entenderse dentro del 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05%, 0,01% o 0,001% del valor indicado. A menos que quede claro del contexto de cualquier otra manera, todos los valores numéricos proporcionados en la presente descripción se modifican con el término "aproximadamente".
Como se usa en la presente descripción, el término "lote" se refiere a una cantidad o cantidades de ARNm sintetizado de una vez, por ejemplo, producido de acuerdo con una única orden de fabricación durante el mismo ciclo de fabricación. Un lote puede referirse a una cantidad de ARNm sintetizado en una reacción que se produce mediante una única alícuota de enzima y/o una única alícuota de ADN molde para la síntesis continua en un conjunto de condiciones. En algunas modalidades, un lote incluiría el ARNm producido a partir de una reacción en la que no todos los reactivos y/o componentes se complementan y/o reponen a medida que avanza la reacción. El término "lote" no significaría ARNm sintetizado en diferentes momentos que se combinan para lograr la cantidad deseada.
Como se usa en la presente descripción, el término "contaminantes" se refiere a sustancias dentro de una cantidad confinada de líquido, gas o sólido, que difieren de la composición química del material o compuesto diana. Los contaminantes también se denominan impurezas. Los ejemplos de contaminantes o impurezas incluyen tampones, proteínas (por ejemplo, enzimas), ácidos nucleicos, sales, disolventes y/o soluciones de lavado.
Como se usa en la presente descripción, el término "dispersante" se refiere a un particulado sólido que reduce la posibilidad de que un precipitado de ARNm forme un hidrogel. Los ejemplos de dispersantes incluyen, pero no se limitan a, uno o más de ceniza, arcilla, tierra de diatomeas, agente filtrante, perlas de vidrio, perlas de plástico, polímeros, perlas de polipropileno, perlas de poliestireno, sales (por ejemplo, sales de celulosa), arena y azúcares. En las modalidades, un dispersante son microesferas de polímero (por ejemplo, microesferas de poli(estireno-codivinilbeneceno)).
Como se usa en la presente descripción, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de un molde de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de a Rn (por ejemplo, mediante empalme, edición, formación de la caperuza en el extremo 5', y/o formación en el extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; y/o (4) modificación postraduccional de un polipéptido o proteína. En esta solicitud, los términos "expresión" y "producción" y su equivalente gramatical, se usan indistintamente.
Como se usa en la presente descripción, un "ARNm de longitud completa" se caracteriza cuando se usa un ensayo específico, por ejemplo, electroforesis en gel o detección mediante el uso de UV o de espectroscopía de absorción uV con separación por electroforesis capilar. La longitud de una molécula de ARNm que codifica para un polipéptido de longitud completa y según se obtiene al seguir cualquiera de los métodos de purificación descritos en la presente descripción es al menos el 50% de la longitud de una molécula de ARNm de longitud completa que se transcribe del ADN diana, por ejemplo, al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,01%, 99,05%, 99,1%, 99,2 %, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8%, 99,9% de la longitud de una molécula de ARNm de longitud completa que se transcribe a partir del ADN diana y antes de la purificación de acuerdo con cualquier método descrito en la presente descripción.
Como se usa en la presente descripción, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la que exhibe una propiedad y/o actividad por la que se caracteriza.
Como se usa en la presente descripción, el término "hidrogel" se refiere a una red de cadenas de polímeros hidrófilos, por ejemplo, ARNm, que forman un gel coloidal en el que el agua es el medio de dispersión. Mediante el uso del ARNm como ejemplo, es más difícil extraer o purificar el ARNm de un hidrogel que de una masa seca.
Como se usa en la presente descripción, el término "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que (1) se ha separado de al menos algunos de los componentes con los que se asociaba cuando se produjo inicialmente (en la naturaleza y/o en un entorno experimental), y/o (2) se ha producido, preparado, y/o fabricado por la acción del hombre.
Como se usa en la presente descripción, el término "ARN mensajero (ARNm)" se refiere a un polirribonucleótido que codifica al menos un polipéptido. El ARNm, como se usa en la presente descripción, abarca ambos ARNm modificado y no modificado. El ARNm puede contener una o más regiones codificantes y no codificantes. El ARNm puede purificarse a partir de fuentes naturales, producirse mediante el uso de sistemas de expresión recombinantes y, opcionalmente, purificarse, transcribirse in vitro o sintetizarse químicamente.
Por lo general, se piensa que el ARNm es el tipo de ARN que transporta información desde el ADN hasta el ribosoma. La existencia del ARNm suele ser muy breve e incluye el procesamiento y traducción, seguidos de la degradación. Típicamente, el ARNm incluye una secuencia de nucleótidos que tiene una región codificante que codifica para un polipéptido, una región 5' no traducida (5' UTR) aguas arriba de la región codificante, una región 3' no traducida (3' Ut R) aguas abajo de la región codificante, una caperuza en el extremo 5' y una región de poli A o poliadenilación aguas abajo de la 3' UTR. Típicamente, en los organismos eucariotas, el procesamiento del ARNm comprende la transcripción del ARNm a partir del ADN y la adición de una "caperuza" en el extremo N-terminal (5') y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). Una caperuza típica es una caperuza de 7-metilguanosina, que es una guanosina que está unida a través de un enlace 5'-5'-trifosfato al primer nucleótido transcrito. La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La cola es típicamente un evento de poliadenilación en donde se agrega un resto poliadenililo al extremo 3' de la molécula de ARNm. La presencia de esta "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por una exonucleasa. Típicamente, los ribosomas traducen el ARN mensajero en una serie de aminoácidos que forman una proteína.
En algunas modalidades, un ARNm de la presente invención carece de uno o ambos de una caperuza y/o una cola. Por lo tanto, un ARNm puede tener una caperuza y no tener una cola, un ARNm puede tener una cola y no tener una caperuza, y un ARNm puede no tener una caperuza y no tener una cola.
Se contempla dentro del alcance de la presente invención cualquier ARNm capaz de traducirse en uno o más péptidos (por ejemplo, proteínas) o fragmentos de péptidos. En algunas modalidades, un ARNm codifica para uno o más péptidos naturales. En algunas modalidades, un ARNm codifica para uno o más péptidos modificados o no naturales.
Como se usa en la presente descripción, el término "integridad del ARNm" generalmente se refiere a la calidad del ARNm. En algunas modalidades, la integridad del ARNm se refiere al porcentaje de ARNm que no se degrada después de un proceso de purificación (por ejemplo, un método descrito en la presente descripción). La integridad del ARNm se puede determinar mediante el uso de métodos particularmente descritos en este documento, tales como electroforesis en gel de agarosa/TAE o por SDS-PAGE con tinción de plata, o por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por electroforesis en gel de agarosa por ARN (por ejemplo, Ausubel y otros, John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology).
El término “farmacéuticamente aceptable”, como se usa en la presente descripción, se refiere a sustancias que, dentro del alcance del criterio médico competente, son adecuadas para el uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y los animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica, u otro problema o complicación excesivos, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente que es adecuado en la preparación de una composición farmacéutica que generalmente es seguro, no tóxico ni biológicamente ni de cualquier otra manera indeseable, e incluye un excipiente que es aceptable tanto para uso veterinario, así como también para uso farmacéutico humano. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" como se usa en la descripción y en las reivindicaciones incluye tanto uno como más de uno de tales excipientes.
Típicamente, una solución de ARNm adecuada también puede contener un agente tampón y/o una sal. Generalmente, los agentes tamponadores pueden incluir HEPES, sulfato de amonio, bicarbonato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, fosfato de potasio y fosfato de sodio.
Las sales farmacéuticamente aceptables se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, S. M. Berge y otros, describen en detalle las sales farmacéuticamente aceptables en J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66: 1-19. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen las derivadas de las bases y ácidos orgánicos e inorgánicos adecuados. Los ejemplos de sales de adición ácida no tóxicas farmacéuticamente aceptables son las sales de un grupo amino formado con ácidos inorgánicos, tales como el ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico o con ácidos orgánicos tales como el ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico, o mediante el uso de otros métodos usados en la técnica tal como el intercambio iónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, bencenosulfonato, benzoato, bisulfato, borato, butirato, alcanforato, alcanforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicerofosfato, gluconato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, hidroyoduro, 2-hidroxietanosulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluenosulfonato, undecanoato, sales de valerato y similares. Las sales derivadas de las bases apropiadas incluyen las sales de metales alcalinos, metales alcalinotérreos, amonio y sales de N+(alquilo C-m )4. Las sales metálicas alcalinas o alcalinotérreas representativas incluyen al sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, y similares. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen, cuando sea apropiado, al amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes de amina formados mediante el uso de contraiones tales como haluro, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato y sulfonato de arilo. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales formadas a partir de la cuaternización de una amina mediante el uso de un electrófilo apropiado, por ejemplo, un haluro de alquilo, para formar una sal de amino alquilada cuaternizada.
Como se usa en la presente descripción, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una medida o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas entenderá que los fenómenos biológicos y químicos casi nunca, si alguna vez, llegan a completarse y/o avanzar hasta su completamiento o alcanzan o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en la presente descripción para capturar la posible falta de completitud inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos. A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica, al que pertenece esta aplicación y como se usa comúnmente en la técnica a la que pertenece esta aplicación; en caso de conflicto, prevalecerá la presente descripción, incluidas las definiciones.
Descripción detallada de la invención
El ARNm puede presentar desafíos tanto en la síntesis como en la purificación, particularmente en las preparaciones a gran escala. La presente invención se refiere a métodos, mediante el uso de una celda de agitación o un dispositivo de filtración Nutsche agitado, para preparar cantidades de composiciones de ARNm limpias y homogéneas, por ejemplo, que se puede usar en una terapia de reemplazo de ARNm.
Por tanto, los métodos descritos en la presente descripción pueden ser ventajosos para la purificación de ARNm, incluidas cantidades de ARNm a gran escala (por ejemplo, cualquier tamaño de lote o volumen de carga descrito en la presente descripción). Por ejemplo, los métodos de purificación como se describió en la presente descripción pueden proporcionar un porcentaje aumentado de ARNm de longitud completa que se recupera de la purificación con relación a la cantidad de ARNm de longitud completa antes de la purificación, por ejemplo, en comparación con los métodos de purificación convencionales. Los métodos de purificación como se describió en la presente descripción pueden proporcionar un porcentaje aumentado de ARNm de longitud completa con relación a la mezcla de ARNm de longitud completa y los contaminantes, por ejemplo, en comparación con los métodos de purificación convencionales. Los métodos de purificación como se describió en la presente descripción pueden proporcionar ARNm que tiene un alto nivel de integridad aceptable para fines terapéuticos, con una pérdida mínima de ARNm de longitud completa debido a la purificación, por ejemplo, en comparación con los métodos de purificación convencionales. Adicionalmente, el ARNm purificado (incluidas las composiciones o lotes del mismo) preparado de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción puede tener características beneficiosas. Por ejemplo, una composición o lote de ARNm purificado como se describe en la presente descripción puede: comprender un porcentaje aumentado de moléculas de ARNm de longitud completa; comprender una mayor cantidad de ARNm de longitud completa; y/o proporcionar una actividad aumentada (por ejemplo, expresión de proteínas mejorada o aumentada). Estas características pueden resultar beneficiosas para usos terapéuticos.
Generalmente, los métodos permiten la filtración de una suspensión que contiene ARNm en un recipiente cerrado mediante el uso de presión o vacío que separa el licor madre de la suspensión a través de una pantalla o membrana de filtrado. En consecuencia, la presente invención puede ser superior a los métodos utilizados actualmente para producir composiciones de ARNm purificado a gran escala, por ejemplo, escalas adecuadas para su uso en la producción comercial de productos terapéuticos de ARNm. En resumen, la presente invención representa un avance significativo en el campo terapéutico basado en ARNm.
Métodos de purificación
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para purificar ARN mensajero. En las modalidades, un método de purificación incluye las etapas de: proporcionar una solución que comprende ARNm; añadir uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm, para obtener de esta manera una suspensión ("una etapa de precipitación"); agitar la suspensión antes y/o mientras se aplica presión a la suspensión y/o un vacío a la suspensión suficiente para dirigir el licor madre de la suspensión a través de un filtro, para obtener de esta manera una composición que contiene precipitado ("una etapa de agitación"); y lavar la composición que contiene precipitado, para producir de esta manera un rendimiento de precipitado de ARNm purificado ("una etapa de lavado"). En las modalidades, un lavado es un diafiltrado, ultrafiltrado o dializado.
En algunas modalidades, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que es al menos 250 mg de ARNm. En una modalidad, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que es aproximadamente 250 mg de ARNm, aproximadamente 500 mg de ARNm, aproximadamente 750 mg de ARNm, aproximadamente 1000 mg de ARNm, aproximadamente 1500 mg de ARNm, aproximadamente 2000 mg de ARNm. o aproximadamente 2500 mg de ARNm. En las modalidades, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que está entre 250 mg de ARNm y 1000 g de ARNm. En las modalidades, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que está entre 500 mg de ARNm y 1000 g de ARNm. En las modalidades, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que es de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 1000 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 500 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 250 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg ARNm a aproximadamente 100 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 50 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 25 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 10 g de ARNm, o de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 5 g de ARNm. En las modalidades, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que es al menos de aproximadamente 100 mg de ARNm a aproximadamente 10 g de ARNm, de aproximadamente 100 mg de ARNm a aproximadamente 5 g de ARNm, o de aproximadamente 100 mg de ARNm a aproximadamente 1 g de ARNm.
En algunas modalidades, un método descrito en la presente descripción proporciona un rendimiento de ARNm purificado que es al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 55%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente el 90%, o aproximadamente el 95%. En algunas modalidades, un método descrito en la presente descripción proporciona un rendimiento de ARNm purificado que es al menos aproximadamente 70% (por ejemplo, al menos aproximadamente 70%, 75%, 80% u 85%). En algunas modalidades, un método descrito en la presente descripción proporciona un rendimiento de ARNm purificado que es al menos aproximadamente del 85%.
En algunas modalidades, un método descrito en la presente descripción proporciona ARNm purificado que está sustancialmente libre de enzimas o reactivos en la solución usada para preparar el ARNm. En algunas modalidades, la solución usada para preparar el ARNm comprende reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro, que incluye ARN polimerasas (por ejemplo, ARN polimerasa T7 ("T7") y/o ARN polimerasa SP6 ("SP6")), ADNasa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa, o cualquier combinación de los mismos. En algunas modalidades, el método descrito en la presente descripción proporciona ARNm purificado que está sustancialmente libre de ARN polimerasa de T7 ("T7"). En algunas modalidades, el método descrito en la presente descripción proporciona ARNm purificado que está sustancialmente libre de ARN polimerasa SP6 ("SP6"). En algunas modalidades, el método descrito en la presente descripción proporciona ARNm purificado que está sustancialmente libre de ADNasa I. En algunas modalidades, el método descrito en la presente descripción proporciona ARNm purificado que está sustancialmente libre de pirofosfatasa. En algunas modalidades, el método descrito en la presente descripción proporciona ARNm purificado que está sustancialmente libre de inhibidor de ARNasa. En algunas modalidades, la determinación de estar sustancialmente libre de cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente o los reactivos usados prepara el ARNm se lleva a cabo mediante electroforesis en gel de agarosa/TAE. En algunas modalidades, la determinación de estar sustancialmente libre de cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente o los reactivos usados prepara el ARNm se lleva a cabo mediante SDS-PAGE con tinción de plata.
En algunas modalidades, se usa uno o más agentes desnaturalizantes en una condición desnaturalizante para promover la precipitación de ARNm. Como se usa en la presente descripción, el término "condición desnaturalizante" se refiere a cualquier condición química o física que pueda causar desnaturalización. Las condiciones de desnaturalización ejemplares incluyen, pero no se limitan a, el uso de reactivos químicos, altas temperaturas, pH extremo, etc. En algunas modalidades, se logra una condición desnaturalizante mediante la adición de uno o más agentes desnaturalizantes a una preparación impura que contiene ARNm a purificar. En algunas modalidades, un agente desnaturalizante adecuado para la presente invención es un agente desnaturalizante de proteínas y/o ADN. En algunas modalidades, un agente desnaturalizante puede ser: 1) una enzima (como una serina proteinasa o una ADNasa), 2) un ácido, 3) un disolvente, 4) un agente de reticulación, 5) un agente caotrópico, 6) un agente reductor y/o 7) alta fuerza iónica a través de altas concentraciones de sal. En algunas modalidades, un agente particular puede pertenecer a más de una de estas categorías.
En algunas modalidades, pueden usarse una o más enzimas como agentes desnaturalizantes para degradar las proteínas y los ADN moldes usados en la síntesis de ARNm. En algunas modalidades, las enzimas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, serina proteasas tales como la quimotripsina y serina proteasas similares a la quimotripsina, tripsina y serina proteasas similares a la tripsina, elastasa y serina proteasas similares a la elastasa, subtilisina y serina proteasas similares a la subtilisina, y sus combinaciones, desoxirribonucleasas (ADNasas) tales como la desoxirribonucleasa I, II y/o IV, enzimas de restricción tales como EcoRI, EcoRII, BamHI, HindIII, SpeI, SphI, StuI, Xbal y sus combinaciones.
En algunas modalidades, puede usarse un ácido como agente desnaturalizante. En algunas modalidades, un ácido adecuado puede ser el ácido acético, ácido fórmico, ácido oxálico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cloroacético, ácido dicloroacético, ácido tricloroacético, ácido ascórbico, ácido sulfosalicílico y sus combinaciones.
En algunas modalidades, puede usarse un solvente como agente desnaturalizante. En algunas modalidades, un solvente puede ser alcohol isopropílico, acetona, metiletilcetona, metilisobutilcetona, etanol, metanol, denatonio y sus combinaciones. En las modalidades, un solvente es un solvente alcohólico (por ejemplo, metanol, etanol o isopropanol). En las modalidades, un solvente es un solvente de cetona (por ejemplo, acetona, metiletilcetona o metilisobutilcetona)
En algunas modalidades, puede usarse un agente caotrópico como agente desnaturalizante. Los agentes caotrópicos son sustancias que alteran la estructura de las macromoléculas tales como las proteínas y ácidos nucleicos al interferir con las fuerzas no covalentes como los puentes de hidrógeno y las fuerzas de van der Waals. En algunas modalidades, un agente caotrópico puede ser urea, tiourea, cloruro de guanidinio, tiocianato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio, acetato de litio, cloruro de magnesio, dodecilsulfato de sodio, perclorato de litio y sus combinaciones.
En algunas modalidades, puede usarse un agente reductor como agente desnaturalizante. Los agentes reductores son compuestos que donan un electrón a otra especie, con lo cual se oxida a sí mismo. En algunas modalidades, un agente reductor puede ser hidruro de litio y aluminio, amalgama de sodio, diborano, borohidruro de sodio, sulfitos, hidruro de diisobutilaluminio, fosfitos, monóxido de carbono, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol o tris(2-carboxietil) fosfina y sus combinaciones.
En algunas modalidades, uno o más de pH, calor y/o metales pesados (tales como plomo, mercurio o cadmio) pueden servir como agentes desnaturalizantes para proporcionar una condición desnaturalizante. Se sabe que los pH extremos provocan la desnaturalización de una proteína. Aunque la cadena principal de una cadena proteica es neutra, los residuos de aminoácidos que comprenden la proteína a menudo contienen grupos ácidos y básicos. Estos grupos suelen estar cargados y pueden formar puentes salinos con un grupo de carga opuesta. En consecuencia, los pH extremos pueden cambiar las cargas de estos grupos ácidos y básicos, por lo que alteran los puentes salinos.
En algunas modalidades, los cambios menos drásticos en el pH también pueden afectar la actividad y solubilidad de una proteína. Como los aminoácidos individuales, las proteínas tienen un punto isoeléctrico en el que el número de cargas negativas es igual al número de cargas positivas. Este es con frecuencia el punto de mínima solubilidad en agua. En el pH isoeléctrico, no hay carga neta en la molécula. Las moléculas individuales tienen una tendencia a acercarse entre sí, coagularse y precipitarse fuera de la solución. A un pH por encima o por debajo del pH isoeléctrico, las moléculas tienen una carga neta negativa o positiva, respectivamente. Por lo tanto, cuando las moléculas de proteínas se acercan entre sí, tienen la misma carga general y se repelen entre sí.
En algunas modalidades, puede usarse el calor como agente desnaturalizante. El calor puede suministrar energía cinética a las moléculas de proteínas, lo que causa que sus átomos vibren más rápidamente. En algunas modalidades, esto romperá las fuerzas relativamente débiles tales como los puentes de hidrógeno y las interacciones hidrófobas. El calor también se usa en la esterilización para desnaturalizar y, por tanto, destruir las enzimas de las bacterias.
En algunas modalidades, las sales de iones metálicos tales como mercurio (II), plomo (II) y plata pueden usarse como agentes desnaturalizantes debido a su capacidad para formar enlaces fuertes con los grupos disulfuro y con los iones carboxilato de los aminoácidos ácidos. Por lo tanto, interrumpen tanto los puentes disulfuro como los enlaces salinos y causan que la proteína se precipite de la solución como una sal de metal-proteína insoluble.
En algunas modalidades, también pueden usarse altas concentraciones de sal (alta salinidad) como agente desnaturalizante. Se sabe que las altas concentraciones de sales hacen que tanto las proteínas como los ácidos nucleicos precipiten de una solución acuosa. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede estar entre 1 M y 10 M, inclusivo. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede estar entre 2 M y 9 M, inclusivo. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede estar entre 2 M y 8 M, inclusivo. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede estar entre 2 M y 5 M, inclusivo. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede ser mayor que una concentración de 1M . En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede ser mayor que una concentración de 2 M. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede ser mayor que una concentración de 3 M. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede ser mayor que una concentración de 4 M. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede ser mayor que una concentración de 5 M. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede ser mayor que una concentración de 6 M. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede ser mayor que una concentración de 7 M. En algunas modalidades, una alta concentración de sal puede ser mayor que una concentración de 8 M. En algunas modalidades, se usa una sola sal como agente desnaturalizante. En algunas modalidades, se usa más de una sal como agente desnaturalizante.
En algunas modalidades, una sal usada como agente desnaturalizante puede ser una sal de calcio, una sal de hierro, una sal de magnesio, una sal de potasio, una sal de sodio o sus combinaciones. Las sales específicas ejemplares adecuadas para su uso como agentes desnaturalizantes en algunas modalidades incluyen, pero no se limitan a, cloruro de potasio (KCl), cloruro de sodio (NaCl), cloruro de litio (LiCl), cloruro de calcio (CaCh), bromuro de potasio (KBr), bromuro de sodio (NaBr), bromuro de litio (LiBr). En algunas modalidades, el agente desnaturalizante al que se somete la preparación impura es cloruro de potasio (KCl). En algunas modalidades, se añade KCl de manera que la concentración de KCl resultante sea aproximadamente 1 M o mayor. En algunas modalidades, se añade KCl de manera que la concentración de KCl resultante sea aproximadamente 2 M o mayor, 3 M o mayor, 4 M o mayor, o 5 M o mayor.
En una modalidad, se agrega una solución de sal de alta concentración (por ejemplo, una sal caotrópica como el tiocianato de guanidina) a una composición inicial que contiene ARNm para desnaturalizar y solubilizar las proteínas contaminantes, seguido de la adición de un alcohol (por ejemplo, etanol) para precipitar el ARNm selectivamente. Después de la precipitación del ARNm, la suspensión resultante se agita continuamente dentro del dispositivo de filtrado mientras se aplica presión a la suspensión para empujar el licor madre a través del filtro o se aplica vacío para extraer el licor madre a través del filtro. Posteriormente, el precipitado dentro de la suspensión se lava o diafiltra mediante el uso de una mezcla de sal/alcohol seguido de un lavado con alto porcentaje de alcohol para producir un precipitado libre de contaminación, por ejemplo, proteína, sal, tampón y ácido nucleico sin ARN. La subsecuente disolución del ARNm precipitado con agua produce una composición de ARNm purificada. En algunas modalidades, se agrega un soporte sólido, como perlas de poliestireno de un tamaño conocido, para aumentar la capacidad de purificación dentro de un volumen de filtración dado.
En las modalidades de los métodos, una etapa de precipitación comprende el uso de una sal caotrópica (por ejemplo, tiocianato de guanidina) y/o un disolvente alcohólico (por ejemplo, una solución acuosa de alcohol tal como una solución acuosa de etanol). En las modalidades de los métodos, una etapa de precipitación comprende el uso de una sal caotrópica (por ejemplo, tiocianato de guanidina) y un solvente alcohólico (por ejemplo, una solución acuosa de alcohol tal como una solución acuosa de etanol).
En las modalidades, uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm comprenden al tiocianato de guanidina (por ejemplo, una solución que comprende aproximadamente tiocianato de guanidina 1-5 M). En las modalidades, un agente que promueve la precipitación de ARNm es un tampón GSCN (por ejemplo, una solución acuosa que comprende tiocianato de guanidina 4 M, citrato de sodio 25 mM pH 6,5, sal sódica de N-lauroilsarcosina al 0,5%).
En las modalidades, uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm incluyen un solvente alcohólico (por ejemplo, etanol). En las modalidades, uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm es una solución acuosa de un alcohol (por ejemplo, etanol acuoso).
En las modalidades, se usan dos agentes para promover la precipitación de ARNm, en donde un agente comprende al tiocianato de guanidina (por ejemplo, una solución acuosa de tiocianato de guanidina tal como un tampón GSCN) y un segundo agente comprende un solvente alcohólico (por ejemplo, etanol). En las modalidades, los dos agentes se usan de forma secuencial o simultánea. En las modalidades, el método incluye el uso de una solución que comprende al tiocianato de guanidina (por ejemplo, un tampón GSCN) y un alcohol (por ejemplo, una solución acuosa de un alcohol tal como etanol acuoso).
En las modalidades, se realiza una vez una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm. En las modalidades, se realiza una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm dos o más veces (por ejemplo, 2-10 veces o 2-5 veces). En las modalidades, la etapa de añadir uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm se realiza dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez veces.
En algunas modalidades, se usa un coadyuvante de filtración en un método descrito en la presente descripción. En las modalidades, un coadyuvante de filtración es un dispersante.
En algunas modalidades, se realiza una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm en ausencia de dispersantes. En las modalidades del método en donde se produce al menos una etapa en una celda de agitación, se realiza una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm en ausencia de dispersantes.
En algunas modalidades, se realiza una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm en presencia de al menos un dispersante. En las modalidades del método en donde se produce al menos una etapa en un filtro Nutsche, se realiza una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm en presencia de al menos un dispersante.
En algunas modalidades, se agrega un dispersante a la suspensión obtenida después de la adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm.
Los ejemplos de dispersantes incluyen, pero no se limitan a, uno o más de ceniza, arcilla, tierra de diatomeas, agente filtrante, perlas de vidrio, perlas de plástico, polímeros, perlas de polipropileno, perlas de poliestireno, sales (por ejemplo, sales de celulosa), arena y azúcares.
El método puede incluir además una etapa de secado del precipitado de ARNm purificado que se incluye en una masa junto con el dispersante. El desarrollo de métodos de purificación en los que un ARNm purificado puede secarse hasta obtener una masa puede ser un desafío debido a consideraciones de, por ejemplo, el ensuciamiento de un filtro. No obstante, los métodos de purificación que comprenden secar el ARNm hasta obtener una masa sólida pueden ser ventajosos ya que dichos métodos permiten la eliminación de contaminantes residuales en solución a niveles que no se alcanzarían con la filtración de la solución sin grandes intercambios de volumen. En las modalidades, el secado de un ARNm purificado se mantiene mediante las presiones descritas en la presente descripción de modo que sustancialmente todo el líquido se elimine de una composición de ARNm y de esta manera de como resultado una masa que comprende un precipitado de ARNm purificado y un dispersante.
Por tanto, en las modalidades, un método de purificación puede incluir además una o más etapas para separar el dispersante del precipitado de ARNm purificado, por ejemplo, lavar y secar la masa. El método puede incluir además una etapa de solubilización y elución del ARNm purificado de la masa mediante el uso de un medio acuoso, por ejemplo, agua, mientras se filtra el dispersante. En las modalidades, pueden realizarse simultáneamente una etapa de precipitación y una etapa de secado.
En las modalidades, una etapa de secado tiene una duración de manera que la masa obtenida está sustancialmente seca. En las modalidades, una etapa de secado tiene una duración de aproximadamente cinco segundos a aproximadamente quince minutos, de aproximadamente cinco segundos a aproximadamente diez minutos, de aproximadamente un minuto a aproximadamente quince minutos, de aproximadamente un minuto a aproximadamente diez minutos, de aproximadamente un minuto a aproximadamente siete minutos, o de aproximadamente un minuto a aproximadamente cinco minutos.
En algunas modalidades, una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm tiene una duración de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos. En algunas modalidades, una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación tiene una duración de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 180 segundos (por ejemplo, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 150 segundos). En algunas modalidades, una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación tiene una duración de aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 segundos.
En algunas modalidades, una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm tiene una duración de aproximadamente uno a aproximadamente diez minutos. En algunas modalidades, una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm tiene una duración de aproximadamente 120 segundos a aproximadamente 500 segundos o de aproximadamente 120 segundos a aproximadamente 240 segundos.
En algunas modalidades, el ARNm se agita con el uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm durante una duración total de aproximadamente un minuto a aproximadamente una hora, de aproximadamente un minuto a aproximadamente treinta minutos, de aproximadamente un minuto a aproximadamente quince minutos, o de aproximadamente un minuto a aproximadamente diez minutos. En las modalidades, el ARNm se agita con un agente caotrópico (por ejemplo, tiocianato de guanidina) y/o un alcohol (por ejemplo, etanol).
En algunas modalidades, se produce una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm en una celda de agitación o en un filtro Nutsche.
En algunas modalidades, se produce una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm en una celda de agitación. En las modalidades, la presión está entre aproximadamente 5 PSI y aproximadamente 100 PSI, por ejemplo, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 40 PSI o de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 50 PSI.
En algunas modalidades, se produce una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm en un filtro Nutsche, y la presión está entre aproximadamente 5 PSI y aproximadamente 100 PSI, por ejemplo, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 40 PSI, de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 30 PSI, o de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 25 PSI. En las modalidades, está presente un dispersante durante la etapa de precipitación.
En las modalidades, una etapa de adición de uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm no se produce en la celda de agitación o en el Filtro Nutsche.
En algunas modalidades, se produce al menos una etapa de agitación en una celda de agitación o un filtro Nutsche. En algunas modalidades, se produce al menos una etapa de agitación en una celda de agitación. En algunas modalidades, se produce al menos una etapa de agitación en un filtro Nutsche.
En algunas modalidades, la agitación se produce a una velocidad de aproximadamente 50 RPM y aproximadamente 500 RPM, por ejemplo, aproximadamente 200 RPM. En las modalidades, la agitación se produce a una velocidad de aproximadamente 100 RPM a aproximadamente 500 RPM, de aproximadamente 100 RPM a aproximadamente 400 RPM, de aproximadamente 100 RPM a aproximadamente 300 RPM o de aproximadamente 150 RPM a aproximadamente 450 RPM. En las modalidades, la agitación se produce a una velocidad de aproximadamente: 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 o 500 RPM.
En algunas modalidades, la presión está entre aproximadamente 5 PSI y aproximadamente 100 PSI, por ejemplo, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 40 PSI o de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 50 PSI. En algunas modalidades, la presión está entre aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 90 PSI, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 80 pSi, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 70 PSI, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 60 PSI, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 50 PSI, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 40 PSI, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 30 PSI, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 20 PSI, de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 30 PSI, de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 25 PSI, o de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 20 PSI. En las modalidades, la presión es de aproximadamente 5 PSI, aproximadamente 10 PSI, aproximadamente 15 PSI, aproximadamente 20 PSI, aproximadamente 25 PSI, aproximadamente 30 PSI, aproximadamente 35 PSI, aproximadamente 40 PSI, aproximadamente 45 PSI o aproximadamente 50 PSI.
En las modalidades, se produce al menos una etapa de agitación en una celda de agitación, y la presión está entre aproximadamente 5 PSI y aproximadamente 100 PSI, por ejemplo, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 40 PSI o de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 50 PSI.
En las modalidades, se produce al menos una etapa de agitación en un filtro Nutsche, y la presión está entre aproximadamente 5 PSI y aproximadamente 100 PSI, por ejemplo, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 40 PSI, de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 30 PSI, o de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 25 PSI.
En las modalidades, una etapa de agitación comprende agitar con al menos una solución que comprende un agente desnaturalizante. En las modalidades, una etapa de agitación comprende agitar con al menos una solución que comprende al tiocianato de guanidina (por ejemplo, un tampón GSCN) y/o al menos una solución que comprende un solvente alcohólico (por ejemplo, etanol). En las modalidades, una etapa de agitación comprende agitar con una solución que comprende tiocianato de guanidina (por ejemplo, un tampón GSCN) y un solvente alcohólico (por ejemplo, etanol).
En las modalidades, se realiza una etapa de agitación de 1-20, de 1-15, de 1-10 o de 1-5 veces. En las modalidades, se realiza una etapa de agitación una vez. En las modalidades, se realiza una etapa de agitación dos o más veces (por ejemplo, 2-20 veces, 2-15 veces, 2-10 veces o 2-5 veces). En las modalidades, se realiza una etapa de agitación de 1-10 o de 1-5 veces. En las modalidades, se realiza una etapa de agitación una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez veces.
En algunas modalidades, una etapa de agitación tiene una duración de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos. En algunas modalidades, una etapa de agitación tiene una duración de aproximadamente 60 segundos a aproximadamente 180 segundos (por ejemplo, de aproximadamente 60 segundos a aproximadamente 150 segundos o de aproximadamente 60 segundos a aproximadamente 120 segundos). En algunas modalidades, una etapa de agitación tiene una duración de aproximadamente 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 segundos.
En algunas modalidades, una etapa de agitación tiene una duración de aproximadamente uno a aproximadamente diez minutos. En algunas modalidades, una etapa de agitación tiene una duración de aproximadamente 120 segundos a aproximadamente 500 segundos o de aproximadamente 240 segundos a aproximadamente 300 segundos.
En algunas modalidades, una etapa de lavado comprende lavar una composición que contiene precipitado con una solución que comprende un alcohol (por ejemplo, una solución acuosa que comprende un alcohol). En las modalidades, una solución es una solución acuosa que tiene aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90% de alcohol (por ejemplo, etanol). En las modalidades, una solución acuosa es una solución de etanol aproximadamente al 80 %. En las modalidades, un lavado es un diafiltrado, ultrafiltrado o dializado.
En algunas modalidades, se produce al menos una etapa de lavado en una celda de agitación o en un filtro Nutsche.
En algunas modalidades, se produce al menos una etapa de lavado en una celda de agitación, y la presión está entre aproximadamente 5 PSI y aproximadamente 100 PSI, por ejemplo, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 40 PSI o de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 50 PSI.
En las modalidades, al menos se produce una etapa de lavado en un filtro Nutsche, y la presión está entre aproximadamente 5 PSI y aproximadamente 100 PSI, por ejemplo, de aproximadamente 10 PSI a aproximadamente 40 PSI, de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 30 PSI, o de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 25 PSI.
En las modalidades, se realiza una etapa de lavado de 1-20, de 1-15, de 1-10 o de 1-5 veces. En las modalidades, una etapa de lavado se realiza una vez. En las modalidades, una etapa de lavado se realiza dos o más veces (por ejemplo, 2-20 veces, 2-15 veces, 2-10 veces o 2-5 veces). En las modalidades, se realiza una etapa de lavado de 1­ 10 o de 1-5 veces. En las modalidades, se realiza una etapa de agitación una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez veces.
En algunas modalidades, una etapa de lavado tiene una duración de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos. En algunas modalidades, una etapa de lavado tiene una duración de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 120 segundos (por ejemplo, de aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 80 segundos). En algunas modalidades, una etapa de lavado tiene una duración de aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 segundos.
En algunas modalidades, una etapa de lavado tiene una duración de aproximadamente uno a aproximadamente diez minutos. En algunas modalidades, una etapa de lavado tiene una duración de aproximadamente 120 segundos a aproximadamente 500 segundos, o de aproximadamente 150 segundos a aproximadamente 450 segundos.
En las modalidades, un método comprende 1-5 etapas de precipitación; 1-5 etapas de agitación y 1-10 etapas de lavado. En las modalidades, cada etapa tiene una duración de aproximadamente 15 segundos a aproximadamente 180 segundos. En las modalidades, un método comprende al menos una etapa de secado (por ejemplo, 1-20, 1-15, 1-10 o 1-5 etapas de secado). En las modalidades, una etapa de secado sigue a una etapa de lavado de cualquier método descrito en la presente descripción. En las modalidades, una etapa de secado es una etapa final de un método descrito en la presente descripción. Una etapa de secado final da como resultado una masa seca que comprende al ARNm purificado y opcionalmente un dispersante cuando se usa en un método como se describe en la presente descripción. Una masa seca que comprende al ARNm purificado puede tener una estabilidad inesperadamente aumentada (por ejemplo, en comparación con ARNm purificado de acuerdo con otros métodos). En las modalidades, al menos una etapa de un método se realiza en una celda de agitación. En las modalidades, al menos una etapa de precipitación, al menos una etapa de agitación y al menos una etapa de lavado se realizan en una celda de agitación. En las modalidades, cada etapa de un método (por ejemplo, cada etapa de precipitación, cada etapa de agitación y cada etapa de lavado) se realiza en una celda de agitación.
En las modalidades, al menos una etapa de un método se realiza en un filtro Nutsche. En las modalidades, al menos una etapa de precipitación, al menos una etapa de agitación y al menos una etapa de lavado se realizan en un filtro Nutsche. En las modalidades, cada etapa de un método (por ejemplo, cada etapa de precipitación, cada etapa de agitación y cada etapa de lavado) se realiza en un filtro Nutsche.
Caracterización del ARNm purificado
En varias modalidades, la presente invención puede usarse para purificar ARNm sintetizado in vitro a partir de una preparación impura que contiene una mezcla de reacción de síntesis de ARNm in vitro. En algunas modalidades, la preparación impura comprende secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro.
En algunas modalidades, las moléculas de ARNm purificadas se detectan mediante el uso de la transferencia, electroforesis capilar, cromatografía, fluorescencia, electroforesis en gel, HPLC, tinción de plata, espectroscopía, ultravioleta (UV) o UPLC, o sus combinaciones. En la presente invención se incluyen otros métodos de detección conocidos en la técnica.
En diversas modalidades, el ARNm purificado en consecuencia con un método descrito en la presente descripción está sustancialmente libre de impurezas del proceso de síntesis de ARNm que incluye, pero no se limita a, secuencias de ARNm abortadas prematuramente, ADN moldes y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro.
En algunas modalidades, un método descrito en la presente descripción puede eliminar un alto grado de reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro que incluye, pero no se limita a, ARN polimerasas (por ejemplo, ARN polimerasa T7 o ARN polimerasa SP6), ADNasa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. En algunas modalidades, la presente invención es particularmente efectiva para eliminar la ARN polimerasa de T7. En algunas modalidades, la presente invención es particularmente efectiva para eliminar la ARN polimerasa de SP6. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o sustancialmente todos los reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención está sustancialmente libre de reactivos enzimáticos usos en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 5 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 4 %, 3 %, 2 % o 1 %) de reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 1 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 %) de reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene reactivos enzimáticos indetectables usados en la síntesis in vitro que incluye la determinada por, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio y/o tinción de Coomassie. Los porcentajes de reactivos enzimáticos como se describió anteriormente pueden determinarse mediante cuantificación densitométrica de electroforesis en gel de agarosa. Alternativamente, los porcentajes de reactivos enzimáticos como se describió anteriormente pueden determinarse mediante técnicas conocidas, tales como mediante métodos conocidos de separación y cuantificación cromatográfica.
En algunas modalidades, las moléculas de ARNm purificadas se detectan mediante el uso de espectroscopía de absorción UV con separación por electroforesis capilar. En esta modalidad, una composición o un lote proporciona un número menor de picos, picos con una base más estrecha y/o picos más altos cuando se detecta mediante el uso de electroforesis capilar con relación a una composición o un lote que tiene un porcentaje más bajo de moléculas de ARNm de longitud completa. Por ejemplo, la composición o el lote proporciona un número menor de picos, picos con una base más estrecha y/o picos más altos cuando se detecta mediante el uso de electroforesis capilar con relación a una composición o un lote que incluye ARNm transcrito mediante el uso de T7 o SP6 como se describió en la presente descripción.
En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 90 % de la ARN polimerasa de T7 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 95 % de la ARN polimerasa de T7 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 98 % de la ARN polimerasa de T7 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 99 % de la ARN polimerasa de T7 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina sustancialmente toda la ARN polimerasa de T7 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 5 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 4 %, 3 %, 2 % o 1 %) de la polimerasa T7 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 1 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 %) de la polimerasa T7 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene polimerasa T7 indetectable usada en la síntesis in vitro que incluye la determinada por, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio y/o tinción de Coomassie. Los porcentajes de polimerasa T7 como se describió anteriormente pueden determinarse mediante cuantificación densitométrica de electroforesis en gel de agarosa. Alternativamente, los porcentajes de polimerasa T7 como se describió anteriormente pueden determinarse mediante técnicas conocidas, tales como mediante métodos conocidos de separación y cuantificación cromatográfica.
En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 90 % de la ARN polimerasa SP6 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 95 % de la ARN polimerasa SP6 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 98 % de la ARN polimerasa SP6 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 99 % de la ARN polimerasa SP6 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina sustancialmente toda la ARN polimerasa SP6 utilizada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 5 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 4 %, 3 %, 2 % o 1 %) de la polimerasa SP6 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 1 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 %) de la polimerasa SP6 usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene polimerasa SP6 indetectable usada en la síntesis in vitro que incluye la determinada por, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio y/o tinción de Coomassie. Los porcentajes de polimerasa SP6 como se describió anteriormente pueden determinarse mediante cuantificación densitométrica de electroforesis en gel de agarosa. Alternativamente, los porcentajes de polimerasa SP6 como se describió anteriormente pueden determinarse mediante técnicas conocidas, tales como mediante métodos conocidos de separación y cuantificación cromatográfica.
En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 90 % de la ADNasa I usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 95 % de la ADNasa I usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 98 % de la ADNasa I usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 99 % de la ADNasa I usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina sustancialmente toda la ADNasa I usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 5 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 4 %, 3 %, 2 % o 1 %) de ADNasa I usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 1 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 %) de ADNasa usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene ADNasa I indetectable usada en la síntesis in vitro que incluye la determinada por, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio y/o tinción de Coomassie. Los porcentajes de ADNasa I como se describió anteriormente pueden determinarse mediante cuantificación densitométrica de electroforesis en gel de agarosa. Alternativamente, los porcentajes de ADNasa I como se describió anteriormente pueden determinarse mediante técnicas conocidas, tales como mediante métodos conocidos de separación y cuantificación cromatográfica.
En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 90 % de la pirofosfatasa usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 95 % de la pirofosfatasa usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 98 % de la pirofosfatasa usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 99 % de la pirofosfatasa usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina sustancialmente toda la pirofosfatasa usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina sustancialmente toda la pirofosfatasa usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 5 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 4 %, 3 %, 2 % o 1 %) de la pirofosfatasa usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 1 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 %) de la pirofosfatasa usada en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene pirofosfatasa indetectable usada en la síntesis in vitro que incluye la determinada por, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio y/o tinción de Coomassie. Los porcentajes de pirofosfatasa como se describió anteriormente pueden determinarse mediante cuantificación densitométrica de electroforesis en gel de agarosa. Alternativamente, los porcentajes de pirofosfatasa como se describió anteriormente pueden determinarse mediante técnicas conocidas, tales como mediante métodos conocidos de separación y cuantificación cromatográfica.
En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 90 % del inhibidor de ARNasa usado en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 95 % del inhibidor de ARNasa usado en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 98 % del inhibidor de ARNasa usado en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente el 99 % del inhibidor de ARNasa usado en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina sustancialmente todo el inhibidor de ARNasa usado en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 5 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 4 %, 3 %, 2 % o 1 %) de inhibidor de ARNasa usado en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 1 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 %) del inhibidor de ARNasa usado en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene un inhibidor de ARNasa indetectable usado en la síntesis in vitro que incluye la determinada por, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio y/o tinción de Coomassie. Los porcentajes de inhibidor de ARNasa como se describió anteriormente pueden determinarse mediante cuantificación densitométrica de electroforesis en gel de agarosa. Alternativamente, los porcentajes de inhibidor de ARNasa como se describió anteriormente pueden determinarse mediante técnicas conocidas, tales como mediante métodos conocidos de separación y cuantificación cromatográfica.
Por ejemplo, un método descrito en la presente descripción puede remover o eliminar un alto grado de secuencias de ARNm abortadas prematuramente (también conocidas como "abreviados"). En algunas modalidades, un método de acuerdo con la invención elimina más de aproximadamente 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o sustancialmente todas las secuencias de ARNm abortadas prematuramente. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención está sustancialmente libre de secuencias de ARNm abortadas prematuramente. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 5 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 4 %, 3 %, 2 % o 1 %) de secuencias de ARNm abortadas prematuramente. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene menos de aproximadamente 1 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 %, 0,5 %, 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 %) de secuencias de ARNm abortadas prematuramente. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención contiene secuencias de ARNm indetectables abortadas prematuramente según se determina mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa con bromuro de etidio y/o tinción de Coomassie. En algunas modalidades, las secuencias de ARNm abortadas prematuramente comprenden menos de 15 bases (por ejemplo, menos de 14, 13, 12, 11, 10, 9 u 8 bases). En algunas modalidades, las secuencias de ARNm abortadas prematuramente comprenden aproximadamente 8-12 bases. En algunas modalidades, un método descrito en la presente descripción proporciona una composición que tiene una cantidad aumentada, por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco o más, de polipéptidos de longitud completa con relación a una composición que tiene un menor porcentaje de moléculas de ARNm de longitud completa.
En algunas modalidades, una solución de ARNm purificada contiene menos de aproximadamente 5 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 4,5 %, 4 %, 3,5 %, 3 %, 2,5 %, 2 %, 1,5 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %) de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro. En ciertas modalidades, la solución de ARNm purificado contiene menos de aproximadamente 1 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,9 %, 0,8 %, 0,7 %, 0,6 % o 0,5 %) de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro. En ciertas modalidades, una solución de ARNm purificado contiene menos de aproximadamente 0,5 % (por ejemplo, menos de aproximadamente 0,4 %, 0,3 %, 0,2 % o 0,1 %) de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, una solución de ARNm purificada contiene menos de aproximadamente 0,1 % de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro. En algunas modalidades, una solución de ARNm purificada está sustancialmente libre de secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro.
En algunas modalidades, las secuencias de ARN abortadas prematuramente y/o reactivos enzimáticos usados en la síntesis in vitro se mide mediante tinción de plata, electroforesis en gel, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) y/o electroforesis capilar.
En algunas modalidades, las secuencias de ARN abortadas prematuramente contienen menos de 15 bases (por ejemplo, menos de 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 o 3 bases). En algunas modalidades, las secuencias de ARN abortadas prematuramente contienen aproximadamente 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11 u 8-10 bases.
En algunas modalidades, el ARNm purificado mediante el uso de un método descrito en la presente descripción mantiene un alto grado de integridad. La integridad del ARNm se puede determinar mediante el uso de métodos particularmente descritos en la presente descripción, tales como electroforesis en gel de agarosa/TAE o por SDS-PAGE con tinción de plata, o por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por electroforesis en gel de agarosa de ARN. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención tiene una integridad mayor de aproximadamente 95 % (por ejemplo, mayor de aproximadamente 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más). En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención tiene una integridad superior al 98 %. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención tiene una integridad superior al 99 %. En algunas modalidades, el ARNm purificado de acuerdo con la presente invención tiene una integridad de aproximadamente el 100 %. En algunas modalidades, un método descrito en la presente descripción proporciona una composición que tiene una actividad aumentada, por ejemplo, al menos dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o más, de polipéptidos traducidos con relación a una composición que tiene un porcentaje más bajo de moléculas de ARNm de longitud completa.
Una ventaja particular proporcionada por la presente invención es la capacidad de purificar ARNm, en particular, ARNm sintetizado in vitro, a gran escala o a escala comercial. Por ejemplo, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de o mayor que aproximadamente 1 gramo, 10 gramos, 50 gramos, 100 gramos, 200 gramos, 300 gramos, 400 gramos, 500 gramos, 600 gramos, 700 gramos, 800 gramos, 900 gramos, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg, 100 kg, 1000 kg o 10000 kg por lote. En las modalidades, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de o mayor que aproximadamente 1 kg.
En una modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 10 gramos por lote. En una modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 20 gramos por lote. En una modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 25 gramos por lote. En una modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 50 gramos por lote. En otra modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 100 gramos por lote. En otra modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 1 kg por lote. En otra modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 10 kg por lote. En otra modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 100 kg por lote. En otra modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 1000 kg por lote. En otra modalidad particular, el ARNm sintetizado in vitro se puede purificar a una escala de 10000 kg por lote.
Como se muestra en los ejemplos más abajo, un lote que comprende el ARNm purificado en una cantidad de 10 gramos o mayor (por ejemplo, 25 gramos, 50 gramos o 100 gramos, o más) se puede lograr fácilmente con los métodos de la invención.
En algunas modalidades, el ARNm se purifica a una escala de o mayor de 1 gramo, 5 gramos, 10 gramos, 15 gramos, 20 gramos, 25 gramos, 30 gramos, 35 gramos, 40 gramos, 45 gramos, 50 gramos, 75 gramos, 100 gramos, 150 gramos, 200 gramos, 250 gramos, 300 gramos, 350 gramos, 400 gramos, 450 gramos, 500 gramos, 550 gramos, 600 gramos, 650 gramos, 700 gramos, 750 gramos, 800 gramos, 850 gramos, 900 gramos, 950 gramos, 1 kg, 2,5 kg, 5 kg, 7,5 kg, 10 kg, 25 kg, 50 kg, 75 kg o 100 kg por lote.
En algunas modalidades, la solución que comprende el ARNm incluye al menos un gramo, diez gramos, cien gramos, un kilogramo, diez kilogramos, cien kilogramos, una tonelada métrica, diez toneladas métricas o más ARNm, o cualquier cantidad entre ellas. En algunas modalidades, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que es al menos aproximadamente 250 mg de ARNm. En una modalidad, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que es al menos aproximadamente 250 mg de ARNm, aproximadamente 500 mg de ARNm, aproximadamente 750 mg de ARNm, aproximadamente 1000 mg de ARNm, aproximadamente 1500 mg de ARNm, aproximadamente 2000 mg de ARNm o aproximadamente 2500 mg de ARNm. En las modalidades, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que es de al menos aproximadamente 250 mg de ARNm a aproximadamente 500 g de ARNm. En las modalidades, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm que es de al menos aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 250 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 100 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 50 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 25 g de ARNm, de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 10 g de ARNm, o de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 5 g de ARNm. En las modalidades, se usa un método descrito en la presente descripción para purificar una cantidad de ARNm de al menos aproximadamente 100 mg de ARNm a aproximadamente 10 g de ARNm, de aproximadamente 100 mg de ARNm a aproximadamente 5 g de ARNm, o de aproximadamente 100 mg de ARNm a aproximadamente 1 g de ARNm.
En algunas modalidades, un método descrito en la presente descripción proporciona una cantidad recuperada de ARNm purificado que es al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 % o aproximadamente 95 %. En algunas modalidades, un método descrito en la presente descripción proporciona una cantidad recuperada de ARNm purificado que es al menos aproximadamente 70 % (por ejemplo, al menos aproximadamente 70 %, 75 %, 80 % u 85 %).
Por tanto, en algunas modalidades, un método para purificar ARNm mediante el uso de un filtro Nutsche o una celda de agitación, en donde el método comprende las etapas de:
proporcionar una solución que comprende ARNm, en donde dicha solución comprende opcionalmente un dispersante;
añadir uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm, para obtener de esta manera una suspensión (por ejemplo, el uno o más agentes que promueven la precipitación de ARNm comprenden un alcohol como etanol y/o una sal caotrópica como el tioisocianato de guanidina), en donde dicha adición opcionalmente se produce en un filtro Nutsche o en una celda de agitación y en donde se añade opcionalmente un dispersante;
agitar una suspensión antes y/o mientras se proporciona presión a una suspensión y/o un vacío a la suspensión suficiente para dirigir el licor madre de la suspensión a través de un filtro, para obtener de esta manera una composición que contiene precipitado;
opcionalmente secar la composición que contiene precipitado (por ejemplo, mediante la continuación para proporcionar presión y/o vacío de manera que el ARNm precipitado se obtenga como una masa;
opcionalmente solubilizar un precipitado de ARNm purificado (por ejemplo, una composición que contiene precipitado o una masa seca) en un medio acuoso, para obtener de esta manera una solución que comprende ARNm purificado.
Por tanto, en algunas modalidades, la suspensión comprende al menos un dispersante. Los ejemplos de dispersantes incluyen, pero no se limitan a, uno o más de ceniza, arcilla, tierra de diatomeas, agente filtrante, perlas de vidrio, perlas de plástico, polímeros, perlas de polipropileno, perlas de poliestireno, sales (por ejemplo, sales de celulosa), arena y azúcares. El método puede incluir además una etapa de secado del precipitado de ARNm purificado que se incluye en una masa junto con el dispersante. El método puede incluir además una o más etapas para separar el dispersante del precipitado de ARNm purificado, por ejemplo, lavar y secar la masa. El método puede incluir además una etapa de solubilización y elución del ARNm purificado de la masa mediante el uso de un medio acuoso, por ejemplo, agua, mientras se filtra el dispersante.
Aparatos de agitación que incluyen los filtros Nutsche y las celdas de agitación
En la presente invención puede usarse cualquier aparato que proporcione agitación (por ejemplo, un agitador) de un líquido o suspensión que contiene y pueda proporcionar presión y/o vacío al líquido o suspensión que contiene. Un ejemplo de un aparato adecuado en la presente invención es un filtro Nutsche, por ejemplo, un secador de filtro Nutsche agitado (ANFD). Dichos filtros Nutsche son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, el documento DE19917558A1, el documento EP828978A4, el documento JP03930616B2, el documento JP2004167345A, el documento KR1693166B1, el documento US20090065435A1, el documento US20090148384A1, el documento US20090292109A1, el documento US20110195166A1, el documento US20120165500A1, el documento US5139667A, el documento US5544425A, el documento US5659971A, el documento US7494794B2, el documento US7709240B2, el documento US7871805B2, el documento WO2002092642A1, el documento WO2003002230A1, y el documento WO2008078646A1,
Un filtro Nutsche usado en cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción puede presentar una variedad de tamaños y tipos de poros de filtro. Por ejemplo, un filtro Nutsche puede tener un tamaño promedio de los poros de aproximadamente 0,01 micras a aproximadamente 200 micras, de aproximadamente 1 micra a aproximadamente 2000 micras, de aproximadamente 0,2 micras a aproximadamente 5 micras o de aproximadamente una micra a aproximadamente 3 micras. En las modalidades, un tamaño promedio de los poros es de aproximadamente 0,5 micras o más, aproximadamente 0,75 micras o más, aproximadamente 1 micra o más, aproximadamente 2 micras o más, aproximadamente 3 micras o más, aproximadamente 4 micras o más, o aproximadamente 5 micras o más. Los métodos en la presente descripción pueden acomodar una variedad de tamaños de los poros de filtro mientras aún retienen el ARNm y sin ensuciar un filtro.
Otro aparato adecuado en la presente invención es una celda de agitación Amicon®.
Otros aparatos, por ejemplo, recipientes, celdas y contenedores, que incluyen, al menos, un medio de agitación, un medio para proporcionar presión y/o vacío a una composición y/o suspensión, y un medio para filtrar una composición y/o suspensión. puede usarse en la presente invención.
Las características/ventajas de los aparatos usados en la presente descripción incluyen y no se limitan a: filtración al vacío y/o presión; contaminación mínima de la masa; el contenido de la suspensión se puede mantener fluidizado hasta que se filtre la mayor parte del licor madre; el agitador del filtro puede usarse para mantener una masa suave y uniforme; la masa (por ejemplo, una masa seca) puede lavarse después de la filtración para resuspender la masa; después del lavado, el licor madre pueden volverse a filtrar y la masa se puede descargar al bajar el agitador y girarlo de tal manera que lleve toda la masa hacia el puerto de descarga; permite la descarga y el muestreo del contenedor; puede mantenerse una atmósfera de gas inerte; muy alta recuperación de solventes; los solventes se encuentran en sistemas cerrados, por lo que no se liberan vapores tóxicos a la atmósfera; se mantiene la seguridad personal y pueden proporcionarse superficies de transferencia de calor para mantener la temperatura de filtración; calentamiento y enfriamiento controlados por un componente integrado o un componente externo (por ejemplo, una chaqueta); y un considerable ahorro de mano de obra. Un aparato utilizado en la presente descripción permite que tengan lugar muchas operaciones o etapas requeridos en la purificación de grandes cantidades de ARNm para usos terapéuticos dentro de un solo aparato.
Un aparato descrito anteriormente puede usarse en los métodos descritos a continuación y para producir las composiciones descritas a continuación.
Composiciones y métodos para su producción.
La presente invención proporciona métodos para producir una composición enriquecida con moléculas de ARNm de longitud completa que tienen más de 500 nucleótidos de longitud y que codifican un péptido o polipéptido de interés. La presente invención también proporciona métodos para producir una composición terapéutica enriquecida con moléculas de ARNm de longitud completa que codifican para un péptido o polipéptido de interés para su uso en la administración o el tratamiento de un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano o una célula de un sujeto humano o una célula que se trata y se entrega a un sujeto humano.
Por consiguiente, en determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración o el tratamiento del pulmón de un sujeto o una célula pulmonar. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína del miembro 3 de la subfamilia A del casete de unión a ATP. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína de cadena 1 intermedia axonemal dineína. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína dineína axonemal de cadena pesada 5 (ADNH5). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína alfa-1-antitripsina. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína P3 de la caja de la cabeza del tenedor (FOXP3). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica una o más proteínas surfactantes, por ejemplo, una o más de la proteína surfactante A, la proteína surfactante B, la proteína surfactante C y la proteína surfactante D.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un péptido o polipéptido para su uso en la administración o el tratamiento del hígado de un sujeto o una célula hepática. Dichos péptidos y polipéptidos pueden incluir aquellos asociados con un trastorno del ciclo de la urea, asociado con un trastorno del almacenamiento lisosómico, con un trastorno del almacenamiento de glucógeno, asociado con un trastorno del metabolismo de aminoácidos, asociado con un trastorno del metabolismo de los lípidos o fibrótico, asociado con la acidemia metilmalónica, o asociado con cualquier otro trastorno metabólico para el cual la administración o el tratamiento del hígado o una célula hepática con ARNm enriquecido de longitud completa proporciona un beneficio terapéutico.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína asociada con un trastorno del ciclo de la urea. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína ornitina transcarbamilasa (OTC). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína arginosuccinato sintetasa 1. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína carbamoil fosfato sintetasa I. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína arginosuccinato liasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína arginasa.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína asociada con un trastorno de almacenamiento lisosómico. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína alfa galactosidasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína glucocerebrosidasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína iduronato-2-sulfatasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína iduronidasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína N-acetil-alfa-D-glucosaminidasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína heparán N-sulfatasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína galactosamina-6 sulfatasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína beta-galactosidasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína lipasa lisosómica. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína arilsulfatasa B (N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para el factor de transcripción EB (TFEB).
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína asociada con un trastorno del almacenamiento de glucógeno. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína alfa-glucosidasa ácida. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína glucosa-6-fosfatasa (G6PC). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína glucógeno fosforilasa hepática. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína fosfoglicerato mutasa muscular. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la enzima desramificante de glucógeno.
En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína asociada con el metabolismo de los aminoácidos. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la enzima fenilalanina hidroxilasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la enzima glutaril-CoA deshidrogenasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la enzima propionil-CoA caboxilasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la enzima oxalasa alanina-glioxilato aminotransferasa.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína asociada con un trastorno del metabolismo de lípidos o fibrótico. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un inhibidor de mTOR. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína transportadora de fosfolípidos ATPasa 8B1 (ATP8B1). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para uno o más inhibidores de NF-kappa B, tal como uno o más de I-kappa B alfa, regulador del desarrollo relacionado con interferón 1 (IFRD1) y Sirtuin 1 (SIRT1). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína PPAR-gamma o una variante activa.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína asociada con la acidemia metilmalónica. Por ejemplo, en determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína metilmalonil-CoA mutasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína metilmalonil-CoA epimerasa.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa para el que la administración o el tratamiento del hígado puede proporcionar un beneficio terapéutico. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína ATP7B, también conocida como proteína de la enfermedad de Wilson. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la enzima porfobilinógeno desaminasa. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una o enzimas de coagulación, como el factor VIII, el factor IX, el factor VII y el factor X. En ciertas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína de hemocromatosis humana (HFE).
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica un péptido o polipéptido para su uso en la administración o tratamiento de la cardiovasculatura de un sujeto o una célula cardiovascular. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína A del factor de crecimiento endotelial vascular. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína relaxina. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína 9 morfogenética ósea. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína receptora de la proteína 2 morfogenética ósea.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un péptido o polipéptido para su uso en la administración o el tratamiento del músculo de un sujeto o una célula muscular. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína distrofina. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína frataxina. En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un péptido o polipéptido para su uso en la administración o el tratamiento del músculo cardíaco de un sujeto o una célula del músculo cardíaco. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína que modula uno o ambos de un canal de potasio y un canal de sodio en el tejido muscular o en una célula muscular. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína que modula un canal Kv7.1 en el tejido muscular o en una célula muscular. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína que modula un canal Nav1.5 en el tejido muscular o en una célula muscular.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un péptido o polipéptido para su uso en la administración o el tratamiento del sistema nervioso de un sujeto o una célula del sistema nervioso. Por ejemplo, en determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína de la neurona motora 1 de supervivencia. Por ejemplo, en determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína de la neurona motora 2 de supervivencia. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína frataxina. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína del miembro 1 de la subfamilia D del casete de unión de ATP (ABCD1). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína CLN3.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un péptido o polipéptido para su uso en la administración o el tratamiento de la sangre o la médula ósea de un sujeto o una célula sanguínea o de la médula ósea. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína beta-globina. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína tirosina quinasa de Bruton. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una o enzimas de coagulación, como el factor VIII, el factor IX, el factor VII y el factor X.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un péptido o polipéptido para su uso en la administración o el tratamiento del riñón de un sujeto o una célula renal. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína de colágeno tipo IV de cadena alfa 5 (COL4A5).
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un péptido o polipéptido para su uso en la administración o el tratamiento del ojo de un sujeto o de una célula ocular. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína miembro 4 de la subfamilia A del casete de unión a ATP (ABCA4). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína retinosquisina. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE65). En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la proteína centrosomal de 290 kDa (CEP290).
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un péptido o polipéptido para su uso en la administración o tratamiento con una vacuna para un sujeto o una célula de un sujeto. Por ejemplo, en determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno de un agente infeccioso, tal como un virus. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno del virus de la influenza. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno del virus sincitial respiratorio. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno del virus de la rabia. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno de citomegalovirus. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno de rotavirus. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno de un virus de la hepatitis, como el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B o el virus de la hepatitis C. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno del virus del papiloma humano. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno de un virus del herpes simple, como el virus 1 del herpes simple o el virus 2 del herpes simple. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno de un virus de inmunodeficiencia humana, como el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 o el virus de inmunodeficiencia humana tipo 2. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno de un metaneumovirus humano. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno de un virus de la parainfluenza humana, como el virus de la parainfluenza humana tipo 1, el virus de la parainfluenza humana tipo 2 o el virus de la parainfluenza humana tipo. 3. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno del virus de la malaria. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno del virus del zika. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno del virus del chikungunya.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno asociado con un cáncer de un sujeto o identificado a partir de una célula cancerosa de un sujeto. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno determinado a partir de la propia célula cancerosa del sujeto, es decir, para proporcionar una vacuna contra el cáncer personalizada. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un antígeno expresado a partir de un gen KRAS mutante.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un anticuerpo. En determinadas modalidades, el anticuerpo puede ser un anticuerpo biespecífico. En determinadas modalidades, el anticuerpo puede ser parte de una proteína de fusión. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un anticuerpo contra OX40. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un anticuerpo contra VEGF. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un anticuerpo contra el factor alfa de necrosis tisular. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un anticuerpo contra CD3. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un anticuerpo contra CD19.
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para un inmunomodulador. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la interleucina 12. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la interleucina 23. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para la interleucina 36 gamma. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una variante constitutivamente activa de una o más proteínas estimulantes de genes de interferón (STING).
En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una endonucleasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína endonucleasa de ADN guiada por ARN, como la proteína Cas 9. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína meganucleasa. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína nucleasa efectora de tipo activador de la transcripción. En determinadas modalidades, la presente invención proporciona un método para producir una composición terapéutica enriquecida con ARNm de longitud completa que codifica para una proteína nucleasa con dedos de zinc.
Síntesis, incluida la síntesis a gran escala de ARNm
Los ARNm de acuerdo con la presente invención se pueden sintetizar de acuerdo con cualquiera de una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, los ARNm de acuerdo con la presente invención se pueden sintetizar mediante la transcripción in vitro (IVT). Brevemente, la IVT se realiza típicamente con un ADN molde lineal o circular que contiene un promotor, un grupo de ribonucleótidos trifosfatados, un sistema tampón que puede incluir DTT e iones de magnesio y una ARN polimerasa apropiada (por ejemplo, ARN polimerasa T3, T7 o SP6), ADNasa I, pirofosfatasa y/o inhibidor de ARNasa. Las condiciones exactas variarán de acuerdo con la aplicación específica. La presencia de estos reactivos es indeseable en el producto final de acuerdo con varias modalidades y, por lo tanto, puede denominarse impurezas y una preparación que contiene una o más de estas impurezas puede denominarse como una preparación impura. En algunas modalidades, la transcripción in vitro se produce en un solo lote.
En un aspecto, el método incluye una etapa de transcripción in vitro, a partir de una o más moléculas de ADN diana con enzimas que incluyen ARN polimerasas (por ejemplo, SP6 o T7), moléculas de ARNm purificadas en las que al menos el 80 % de las moléculas de ARNm purificadas son moléculas de ARNm de longitud completa. El método produce una composición que incluye al menos 100 mg de ARNm enriquecido con ARNm de longitud completa. En otro aspecto de la presente invención es un método para la producción a gran escala de moléculas de ARNm de longitud completa. El método incluye una etapa de transcripción in vitro, a partir de un solo lote de una o más moléculas de ADN diana con enzimas que incluyen ARN polimerasas (por ejemplo, SP6 o T7), moléculas de ARNm purificadas que tienen más de 500 nucleótidos de longitud. Al menos el 80 % de las moléculas de ARNm purificadas son moléculas de ARNm de longitud completa. La producción a gran escala produce al menos 100 mg de ARNm en un solo lote.
En otro aspecto de la presente invención es un método para la producción a gran escala de moléculas de ARNm de longitud completa. El método incluye una etapa de transcripción in vitro, de un solo lote de una o más moléculas de ADN diana con enzimas que incluyen ARN polimerasas (por ejemplo, SP6 o T7), moléculas de ARNm purificadas enriquecidas con moléculas de ARNm de longitud completa que codifican para un péptido o polipéptido de interés para su uso en la administración o el tratamiento de un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano o una célula de un sujeto humano o una célula que se trata y se administra a un sujeto humano, siendo al menos el 80 % de las moléculas de ARNm purificadas moléculas de ARNm de longitud completa. La producción a gran escala produce al menos 100 mg de ARNm en un solo lote. En las modalidades, al menos el 90 % de las moléculas de ARNm purificadas son moléculas de ARNm de longitud completa. En las modalidades, las moléculas de ARNm purificadas codifican para un péptido o polipéptido como se describió anteriormente.
Otro aspecto más de la presente invención es un método para producir una composición enriquecida con polipéptidos de longitud completa. En las modalidades, un método incluye una etapa de transcripción in vitro en un solo lote, al menos una molécula de ADN diana con una ARN polimerasa (por ejemplo, SP6 o T7) para producir al menos 100 mg de moléculas de ARNm que tienen más de 500 nucleótidos de longitud; al menos el 80 % de las moléculas de ARNm son moléculas de ARNm de longitud completa. El método incluye además una etapa de traducción de las moléculas de ARNm para producir una composición enriquecida con polipéptidos de longitud completa.
En algunas modalidades, al menos el 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,01 %, 99,05 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, 99,9 % de las moléculas de ARNm purificadas son moléculas de ARNm de longitud completa. En algunas modalidades, una composición o un lote incluye al menos 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 5 g, 10 g, 25 g, 50 g, 75 g, 100 g, 250 g, 500 g, 750 g, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg, 100 kg, 1000 kg o más de ARNm
En algunas modalidades, las moléculas de ARNm tienen más de 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10 000 o más nucleótidos de longitud; también se incluye en la presente invención el ARNm que tiene cualquier longitud intermedia.
En algunas modalidades, una composición proporciona una cantidad aumentada, por ejemplo, al menos dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o más, de polipéptidos de longitud completa con relación a una composición que tiene un porcentaje menor de moléculas de ARNm de longitud completa.
En algunas modalidades, una composición proporciona una actividad aumentada, por ejemplo, al menos dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces o más polipéptidos traducidos con relación a una composición que tiene un porcentaje menor de moléculas de ARNm de longitud completa.
En algunas modalidades, se prepara una composición o un lote sin una etapa de retirar específicamente las moléculas de ARNm que no son moléculas de ARNm de longitud completa.
En algunas modalidades, la secuencia de ADN a transcribir puede optimizarse para facilitar una transcripción y/o traducción más eficiente. Por ejemplo, la secuencia de ADN puede optimizarse con respecto a elementos reguladores cis (por ejemplo, la caja TATA, señales de terminación y sitios de unión a proteínas), sitios de recombinación artificial, sitios chi, contenido de dinucleótidos CpG, islas CpG negativas, contenido de GC, sitios de deslizamiento de polimerasa y/u otros elementos relevantes para la transcripción; la secuencia de ADN puede optimizarse con respecto a los sitios de corte y empalme crípticos, o para proporcionar una estructura secundaria de ARNm, energía libre estable de ARNm, secuencias repetitivas, un motivo de estabilidad de ARNm y/u otros elementos relevantes para el procesamiento y la estabilidad del ARNm; la secuencia de ADN puede optimizarse con respecto al sesgo de uso de codones, adaptabilidad de codones, sitios chi internos, sitios de unión ribosómica (por ejemplo, IRES), sitios poliA prematuros, secuencias de Shine-Dalgamo (SD) y/u otros elementos relevantes para la traducción; y/o la secuencia de ADN puede optimizarse con respecto al contexto del codón, la interacción codónanticodón, los sitios de pausa de la traducción y/u otros elementos relevantes para el plegamiento de proteínas. Los métodos de optimización conocidos en la técnica pueden usarse en la presente invención, por ejemplo, GeneOptimizer de ThermoFisher y OptimumGene™, que se describe en el documento US 20110081708,
En algunas modalidades, el ADN molde incluye una región no traducida 5' y/o 3'. En algunas modalidades, una región no traducida 5' incluye uno o más elementos que afectan la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas modalidades, una región 5' no traducida puede tener una longitud de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos. En algunas modalidades, una región 3' no traducida incluye uno o más de una señal de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan la estabilidad de ubicación de un ARNm en una célula, o uno o más sitios de unión para miARN. En algunas modalidades, una región 3' no traducida puede tener entre 50 y 500 nucleótidos de longitud o más.
En algunas modalidades, el ARNm purificado incluye una región no traducida 5'. En algunas modalidades, el ARNm purificado incluye una región no traducida 3'. En algunas modalidades, el ARNm purificado incluye una región no traducida 5' y una región no traducida 3'. En algunas modalidades, una región no traducida 5' incluye uno o más elementos que afectan la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas modalidades, una región 5' no traducida puede tener una longitud de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos. En algunas modalidades, una región 5' no traducida puede tener una longitud de entre aproximadamente 10 y 50 nucleótidos. En algunas modalidades, una región 3' no traducida incluye uno o más de una señal de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan la estabilidad de ubicación de un ARNm en una célula, o uno o más sitios de unión para miARN. En algunas modalidades, una región 3' sin traducir puede tener una longitud de entre 50 y 500 nucleótidos. En algunas modalidades, una región 5' no traducida puede tener una longitud de entre aproximadamente 10 y 50 nucleótidos.
Las secuencias de UTR 3' y/o 5' ejemplares pueden derivarse de moléculas de ARNm que son estables (por ejemplo, globina, actina, GAPDH, tubulina, histona y enzimas del ciclo del ácido cítrico) para aumentar la estabilidad de la molécula de ARNm sentido. Por ejemplo, una secuencia 5' UTR puede incluir una secuencia parcial de un gen 1 (IE1) inmediato temprano de CMV, o un fragmento del mismo para mejorar la resistencia a nucleasa y/o mejorar la vida media del polinucleótido. También se contempla la inclusión de una secuencia que codifica para la hormona del crecimiento humana (hGH), o un fragmento de la misma en el extremo 3' o región no traducida del polinucleótido (por ejemplo, ARNm) para estabilizar además el polinucleótido. Generalmente, estas modificaciones mejoran la estabilidad y/o las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo, la vida media) del polinucleótido con relación a sus contrapartes no modificadas, e incluyen, por ejemplo, modificaciones realizadas para mejorar la resistencia de dichos polinucleótidos a la digestión de nucleasas in vivo.
En algunas modalidades, el ARNm purificado incluye una cola de poli A. En algunas modalidades, el ARNm purificado incluye una región no traducida 5', una región no traducida 3' y una cola de poli A. En algunas modalidades, la cola de poli A tiene entre 50 y 200 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la cola de poli A tiene 200 nucleótidos o más de longitud.
En algunas modalidades, las moléculas de ARNm purificadas se detectan mediante el uso de la transferencia, electroforesis capilar, cromatografía, fluorescencia, electroforesis en gel, HPLC, tinción de plata, espectroscopía, ultravioleta (UV) o UPLC, o sus combinaciones. En la presente invención se incluyen otros métodos de detección conocidos en la técnica.
En algunas modalidades, las moléculas de ARNm purificadas se detectan mediante el uso de espectroscopía de absorción UV con separación por electroforesis capilar. En esta modalidad, una composición o un lote proporciona un número menor de picos, picos con una base más estrecha y/o picos más altos cuando se detecta mediante el uso de electroforesis capilar con relación a una composición o un lote que tiene un porcentaje más bajo de moléculas de ARNm de longitud completa. Por ejemplo, la composición o el lote proporciona un número menor de picos, picos con una base más estrecha y/o picos más altos cuando se detecta mediante el uso de electroforesis capilar con relación a una composición o un lote purificado mediante el uso de métodos alternativos.
En algunas modalidades, un método incluye además una etapa de añadir una caperuza y/o añadir una cola poli A al ARNm purificado o al ARNm de longitud completa.
En algunas modalidades, la transcripción in vitro se produce en un solo lote.
Longitud del ARNm
De acuerdo con diversas modalidades, la presente invención se puede usarse para purificar el ARNm sintetizado in vitro de una variedad de longitudes. En algunas modalidades, la presente invención puede usarse para purificar el ARNm sintetizado in vitro de al menos 500 bases de longitud, o igual o superior a aproximadamente 1 kb, 1,5 kb, 2 kb, 2,5 kb, 3 kb, 3,5 kb, 4 kb, 4,5 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb o 20 kb de longitud. En algunas modalidades, la presente invención puede usarse para purificar el ARNm sintetizado in vitro que varía desde aproximadamente 0,5-20 kb, aproximadamente 1-15 kb, aproximadamente 1-10 kb, aproximadamente 5-20 kb, aproximadamente 5-15 kb, aproximadamente 5-12 kb, aproximadamente 5-10 kb, aproximadamente 8-20 kb, o alrededor de 8-15 kb de longitud. Por ejemplo, los ARNm típicos pueden tener una longitud de aproximadamente 1 kb a aproximadamente 5 kb. Más típicamente, el ARNm tendrá una longitud de aproximadamente 1 kb a aproximadamente 3 kb. Sin embargo, en algunas modalidades, el ARNm en la composición de la invención es mucho más largo (mayor de aproximadamente 20 kb). En algunas modalidades, se seleccionan una o más modificaciones de uno o más nucleótidos modificados o cadenas principales de fosfato de azúcar modificadas. En algunas modalidades, la presente invención puede usarse para purificar el ARNm sintetizado in vitro que no está modificado.
Nucleótidos de ARNm modificado
En determinadas modalidades, los nucleótidos de ARNm se modifican para proporcionar "ARNm modificado". Por tanto, un ARNm modificado de acuerdo con la invención puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la cadena principal, modificaciones de azúcares o modificaciones de bases. En algunas modalidades, el ARNm incluye un análogo de nucleótido modificado que se selecciona del grupo que consiste en 1-metil-adenina, 2-metil-adenina, 2-metiltio-N-6-isopentenil-adenina, N6-metil-adenina, N6-isopentenil-adenina, 2-tio-citosina, 3-metil-citosina, 4-acetilcitosina, 5-metil-citosina, 2,6-diaminopurina, 1-metil-guanina, 2-metil-guanina, 2,2-dimetil-guanina, 7-metil-guanina, inosina, 1-metil-inosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidro-uracilo, 2-tio-uracilo, 4-tio-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tio-uracilo, 5-(carboxihidroximetil)-uracilo, 5-fluoro-uracilo, 5-bromo-uracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tio-uracilo, 5-metil-uracilo, N-uracil-5-éster metílico del ácido oxiacético, éster metílico del ácido 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxi-uracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 1-metil-pseudouracilo, queosina, beta-D-manosil-queosina, wybutoxosina y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-deazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. La preparación de tales análogos es conocida por un experto en la técnica, por ejemplo, del documento patente de los Estados Unidos Núm. 4,373,071, patente de los Estados Unidos Núm. 4,401,796, patente de los Estados Unidos Núm. 4,415,732, patente de los Estados Unidos Núm. 4,458,066, patente de los Estados Unidos Núm. 4,500,707, patente de los Estados Unidos Núm. 4,668,777, patente de los Estados Unidos Núm. 4,973,679, patente de los Estados Unidos Núm. 5,047,524, patente de los Estados Unidos Núm. 5,132,418, patente de los Estados Unidos Núm. 5,153,319, patente de los Estados Unidos Núms. 5,262,530 y 5,700,642,
Típicamente, la síntesis de ARNm incluye la adición de una "caperuza" en el extremo N-terminal (5') y una "cola" en el extremo C-terminal (3'). La presencia de la caperuza es importante para proporcionar resistencia a las nucleasas que se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. La presencia de una "cola" sirve para proteger el ARNm de la degradación por exonucleasa.
En algunas modalidades, un método incluye además una etapa de añadir una caperuza y/o añadir una cola poli A al ARNm purificado o al ARNm de longitud completa. Por tanto, en algunas modalidades, los ARNm incluyen una estructura de caperuza 5'. Típicamente, se añade una caperuza 5' como sigue: primero, una fosfatasa terminal de ARN elimina uno de los grupos fosfato terminales del nucleótido 5', se dejan dos fosfatos terminales; a continuación, se añade trifosfato de guanosina (GTP) a los fosfatos terminales mediante una guanilil transferasa, que produce un enlace trifosfato 5'5'5; y luego el nitrógeno 7 de la guanina es metilado por una metiltransferasa. Los ejemplos de estructuras de caperuza incluyen, pero no se limitan a, m7G (5') ppp (5'(A, G (5') ppp (5') A y G (5') ppp (5') G.
Mientras que el ARNm proporcionado de las reacciones de transcripción in vitro puede ser convenientes en algunas modalidades, se contemplan otras fuentes de ARNm dentro del alcance de la invención, incluido el ARNm de tipo salvaje producido a partir de bacterias, hongos, plantas y/o animales.
En algunas modalidades, los ARNm incluyen una región no traducida 5' y/o 3'. En algunas modalidades, una región no traducida 5' incluye uno o más elementos que afectan la estabilidad o traducción de un ARNm, por ejemplo, un elemento sensible al hierro. En algunas modalidades, una región 5' no traducida puede tener entre aproximadamente 10 y 50 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, una región 5' no traducida puede tener entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, una región 3' no traducida incluye uno o más de una señal de poliadenilación, un sitio de unión para proteínas que afectan la estabilidad de ubicación de un ARNm en una célula, o uno o más sitios de unión para miARN. En algunas modalidades, una región 3' no traducida puede tener entre 10 y 50 nucleótidos de longitud o más. En algunas modalidades, una región 3' no traducida puede tener entre 50 y 500 nucleótidos de longitud o más.
La presente invención incluye además una composición que incluye un precipitado de ARNm purificado producido por un aspecto y/o modalidad anterior.
La presente invención incluye además una composición farmacéutica que incluye un precipitado de ARNm purificado producido por un aspecto y/o modalidad anterior y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención incluye además un método para tratar una enfermedad o trastorno que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una composición farmacéutica del aspecto y/o modalidad anterior.
Cualquier aspecto o modalidad descritos en la presente descripción se puede combinar con cualquier otro aspecto o modalidad como se describe en la presente descripción. Mientras que la descripción se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior pretende ilustrar y no limitar el alcance de la descripción, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas, y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
La enseñanza adicional relevante para la presente invención se describe en uno o más de los siguientes: El documento WO 2010/053572; el documento WO 2011/068810; el documento WO 2012/075040;
El documento WO 2012/170889; el documento WO 2012/170930; el documento WO 2013/063468; el documento WO 2013/149140;
El documento WO 2013/149141; el documento WO 2013/185067; el documento WO 2013/185069; el documento WO 2014/089486;
El documento WO 2014/152513; el documento WO 2014/152659; el documento WO 2014/152673; el documento WO 2014/152774;
El documento WO 2014/152966; el documento WO 2014/153052; el documento WO 2015/061461; el documento WO 2015/061467;
El documento WO 2015/061491; el documento WO 2015/061500; el documento WO 2015/148247; el documento WO 2015/164773;
El documento WO 2015/184256; el documento WO 2015/200465; el documento WO 2016/004318; el documento WO 2016/149508;
El documento WO/2014/152940; el documento PCT/US16/57044; el documento US 62/320,073; el documento US 62/349,331; el documento US 62/420,413;
El documento US 62/420,421; el documento US 62/420,428; el documento US 62/420,435; el documento US 62/421,007; el documento US 62/421,021 y las solicitudes relacionadas presentadas el 27 de febrero de 2017 por el solicitante titulado "SÍNTESIS A GRAN ESCALA DEL ARN MENSAJERO" (el documento US 62/464,043), "MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DEL ARN MENSAJERO" (el documento US 62/463,981) y "NOVEDOSO ARNm CFTR OPTIMIZADO POR CODÓN" (el documento US 62/464,215),
Aunque los métodos y los materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción pueden usarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y los materiales adecuados se describen más abajo. Además, los materiales, métodos y ejemplos solo son ilustrativos y no están destinados a ser limitantes. EJEMPLOS
Ejemplo 1: La presente invención, mediante el uso de una celda de agitación, puede purificar 1 gramo de ARNm intacto que está sustancialmente libre de contaminantes.
En este ejemplo, el ARNm transcrito in vitro se purificó mediante un método de filtración novedoso mediante el uso de una celda de agitación Amicon®, que opera mediante la separación de una suspensión de su licor madre a través de una pantalla o membrana de filtrado en un sistema cerrado mediante el uso de presión y/o vacío.
1 gramo de ARNm que codifica para la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) fue transcrito in vitro (IVT) mediante el uso de procedimientos estándar. Ver las solicitudes relacionadas presentadas el 27 de febrero de 2017 por las solicitantes tituladas "SÍNTESIS A GRAN ESCALA DEL ARN MENSAJERO" (el documento US 62/464,043) y "NOVEDOSO ARNm CFTR OPTIMIZADO POR CODÓN" (US 62/464,215),
Brevemente, por cada gramo de ARNm transcrito, una reacción que contiene 8 mg de un plásmido de ADN bicatenario linealizado con un promotor específico de ARN polimerasa, ARN polimerasa, inhibidor de ARNasa, pirofosfatasa, NTP 29 mM, DTT 10 mM y un tampón de reacción (10x - 800 HEPES mM, espirmidina 20 mM, MgCl 250 mM, pH 7,7) se preparó y se incubó una cantidad suficiente (QS) hasta 179 ml con agua libre de ARNasa a 37 °C durante 60 min. Luego, la reacción se detuvo mediante la adición de ADNasa I y un tampón de ADNasa I (10x - Tris-HCl 100 mM, MgCh 5 mM y CaCh 25 mM, pH 7,6) para facilitar la digestión del ADN molde bicatenario en preparación para la purificación. El volumen de reacción final fue 204 ml.
El ARNm producido en la reacción de transcripción se precipitó al añadir primero 2,3 volúmenes de tampón GSCN (tiocianato de guanidina 4 M, citrato sódico 25 mM pH 6,5, sal sódica de N-lauroilsarcosina al 0,5 %) con agitación durante cinco minutos mediante una barra de agitación magnética, seguido de la adición de 1,7 volúmenes de etanol con agitación durante otros cinco minutos para producir 1200 ml de suspensión de ARNm.
En la etapa #1 de la Tabla 1, a una celda de agitación Amicon® de 400 ml, equipada con una membrana de PVDF de 0,45 |jM de 75 mm de diámetro, se le adicionó 400 ml de suspensión de ARNm, con agitación a 200 RPM. La celda se presurizó a 40 PSI y se pasaron 350 ml a través del filtro.
Las etapas #2 a #4 de la Tabla 1 se realizaron de manera similar hasta que se cargaron y filtraron todos los 1200 ml de suspensión de ARNm. El precipitado de ARNm se llevó hasta un volumen de aproximadamente 50 ml con GSCN: etanol 2,3: 1,7.
El precipitado de ARNm se lavó cuatro veces (etapas #5 a #8) con GSCN: etanol 2,3: 1,7 con agitación y bajo presión (como se muestra) para filtrar la solución de lavado de GSCN: etanol. El precipitado de ARNm lavado se llevó hasta un volumen de 50 ml con etanol al 80 %.
A continuación, el producto se lavó ocho veces (etapas #9 a #16) con etanol al 80 % con agitación y bajo presión.
Tabla 1: eta as secuenciales de car a lavado ara la celda de a itación Amicon®
Figure imgf000029_0001
El precipitado lavado con etanol, es decir, ARNm purificado, contenido dentro de la celda de agitación se disolvió y eluyó mediante la adición de 350 ml de agua, para producir 750 mg de ARNm.
Se añadieron y eluyeron 350 ml adicionales de agua, para producir 100 mg más de ARNm. El ARNm resultante se dializó subsecuentemente en agua para producir una solución de ARNm puro.
Se analizó la integridad del ARNm puro mediante el uso de electroforesis en gel de agarosa/TAE (Fig. 1, carril 2) y la pureza mediante el uso de SDS-PAGE con tinción de plata (Fig. 2, carril 2). Estos geles muestran productos de ARNm de longitud completa intactos que están libres de proteínas contaminantes (detectables) usadas en el proceso de IVT.
El ARNm puro resultante de la presente invención se puede comparar con el ARNm purificado mediante el uso de filtración de flujo tangencial (TFF) (Fig. 2, carril 1). El ARNm purificado mediante el uso de TFF muestra niveles traza de enzimas residuales (marcadas con *). La integridad del ARNm puro resultante de la presente invención se compara favorablemente con el ARNm purificado mediante el uso de una columna Qiagen® (Fig. 1, carril 4).
Estos datos muestran que la presente invención es capaz de producir ARNm puro, intacto y de longitud completa que sustancialmente no tiene enzimas contaminantes detectables usadas en el proceso IVT para producir el ARNm, como se ve por electroforesis en gel de agarosa/TAE o por SDS-PAGE con tinción de plata.
Ejemplo 2: Escalar hasta 2,5 gramos de ARNm y usar un filtro Nutsche da como resultado una purificación ineficiente
En este ejemplo, la cantidad de ARNm transcrito in vitro escalado y filtrado mediante el uso de un filtro Nutsche, que tiene un volumen mayor que la celda de agitación Amicon® usada en el Ejemplo 1. El filtro Nutsche también opera mediante a separación de una suspensión de su licor madre a través de una pantalla de filtrado y una membrana en un sistema cerrado mediante el uso de presión y/o vacío.
En este ejemplo, se utilizó un filtro Nutsche de cinco litros, que estaba equipado con un impulsor accionado por motor y una pantalla de acero inoxidable de 10 pm fritada y una membrana de PVDF de 150 mm y 0,22 pm, para purificar 2,5 gramos de ARNm de CFTR previamente purificado. El ARNm se precipitó mediante la agregación primero de un volumen de 1/10 de NaCl 5 M y 3 volúmenes de etanol mientras se agita durante 5 min con una barra de agitación magnética para formar una suspensión.
En la etapa #1 de la Tabla 2, se añadieron 4000 ml de la suspensión al filtro, mientras se agitaba. El filtro se presurizó a 10 PSI con N2 y se recogió tampón transparente a través de la salida del filtro.
Las etapas #2 y #3 se realizaron de manera similar (excepto que la presión se elevó a 40 PSI) hasta que se cargaron y filtraron los ocho litros completos de suspensión de ARNm.
T l 2: n i l r l v r fil r N h
Figure imgf000030_0001
Desafortunadamente, la tasa de flujo del licor madre disminuyó hasta el punto que fue demasiado lento para continuar con el experimento.
Este ejemplo muestra que puede ser ineficiente simplemente aumentar el volumen de la solución precipitante de ARNm (es decir, la suspensión) ya que la mayor cantidad de precipitante de ARNm ralentiza la velocidad de filtración.
Ejemplo 3: La presente invención, mediante el uso de un filtro Nutsche y la adición de un dispersante, puede purificar eficientemente 2,5 gramos de una mezcla de ARNm para proporcionar un ARNm intacto que está sustancialmente libre de contaminantes.
En este ejemplo, el ARNm transcrito in vitro preparado como se describió anteriormente se purificó a través de un método de filtración novedoso mediante el uso de un filtro Nutsche, que opera mediante la separación de una suspensión de su licor madre a través de una pantalla de filtrado y una membrana en un sistema cerrado mediante el uso de la presión y/o vacío. Sin embargo, a diferencia del método descrito en el Ejemplo 2, se añadió un dispersante, que evitó que el ARNm precipitado bloqueara el filtro, lo que ralentizó significativamente la velocidad de filtración.
La Tabla 3 más abajo proporciona una modalidad ejemplar de este método.
En este ejemplo, se usó un filtro Nutsche de cinco litros, que estaba equipado con un impulsor accionado por motor y una pantalla SS de 1 pm fritada, para purificar 2,5 gramos de ARNm de CFTR previamente purificado como se describió previamente en el documento US 2015/0376220 A1 y/o el documento US 2016/0040154 A1, se añadieron 500 g de perlas de microesferas de poli(estireno-co-divinilbenceno) (tamaño medio de partícula de 8,0-9,0 pm) como dispersante a los 2,5 gramos de ARNm.
El ARNm se precipitó mediante la agregación primero de 2,3 volúmenes de tampón GSCN (tiocianato de guanidina 4 M, citrato de sodio 25 mM pH 6,5, sal sódica de N-lauroilsarcosina al 0,5 %) con agitación durante cinco minutos mediante una barra de agitación magnética, seguido de la adición de 1,7 volúmenes de etanol con agitación durante otros cinco minutos para producir 2900 ml de suspensión de microesferas de ARNm precipitado. La suspensión se añadió al filtro Nutsche de cinco litros. El filtro se presurizó a 10 PSI con N2 y se recogieron 2000 ml de tampón transparente a través de la salida del filtro (etapa #1 de la Tabla 3) dando como resultado una masa de microesferas de ARNm precipitado.
La masa de microesferas de ARNm precipitado se lavó cuatro veces (etapas #2 a #5) con GSCN: etanol 2,3: 1,7 con agitación y bajo presión (como se muestra) para filtrar la solución de lavado de GSCN: etanol. La masa de microesferas de ARNm precipitado lavado se llevó hasta un volumen de aproximadamente 900 ml con etanol al 80 %.
A continuación, la masa de microesferas de ARNm precipitado se lavó seis veces con etanol al 80 % mientras se agitaba y bajo presión (como se muestra en las etapas #6 a #11). La masa lavada con etanol se llevó hasta un volumen de aproximadamente 900 ml con etanol al 80 %. En el lavado final, se aplicó presión hasta que todo el etanol se eliminó de la masa, de manera que la masa estaba sustancialmente seca.
Figure imgf000031_0001
La masa de microesferas de ARNm precipitado lavado con etanol contenido dentro de la celda de agitación se disolvió y eluyó mediante la adición de 500 ml de agua, para producir 1,2 g de ARNm. Se añadieron y eluyeron 500 ml adicionales de agua, para producir 450 mg más de ARNm. Una tercera elución produjo 100 mg más de ARNm.
Dado que las perlas facilitaron el secado del etanol del ARNm precipitado (en la masa), no fue necesaria una etapa de diálisis adicional para producir una solución acuosa del ARNm.
Se analizó la integridad del ARNm purificado mediante el uso de electroforesis en gel de agarosa/TAE (Fig. 1, carril 3) y la pureza mediante el uso de SDS-PAGE con tinción de plata (Fig. 2, carril 4). Estos geles muestran productos de ARNm de longitud completa intactos que están libres de proteínas contaminantes (detectables) usadas en el proceso de IVT.
El ARNm purificado resultante de la presente invención puede compararse con el ARNm purificado mediante el uso de TFF (Fig. 2, carril 1). El ARNm purificado mediante el uso de TFF muestra niveles traza de enzimas residuales (marcadas con *). La integridad del ARNm puro resultante de la presente invención se compara favorablemente con el ARNm purificado mediante el uso de una columna Qiagen® (Fig. 1, carril 4).
Estos datos muestran que la presente invención, cuando se usa un filtro Nutsche y se agrega un dispersante, es particularmente adecuada para la purificación a gran escala de ARNm, ya que la invención es capaz de producir ARNm puro, intacto y de longitud completa a gran escala que sustancialmente no tiene enzimas contaminantes detectables usadas en el proceso IVT para producir el ARNm, según se ve por electroforesis en gel de agarosa/TAE o por SDS-PAGE con tinción de plata.

Claims (17)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un método para purificar al menos aproximadamente 1 gramo de ARNm transcrito in vitro, que comprende las etapas de:
    proporcionar una solución que comprende el ARNm transcrito in vitro;
    añadir uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm transcrito in vitro, para obtener de esta manera una suspensión;
    agitar la suspensión antes y/o mientras se proporciona presión a la suspensión y/o un vacío a la suspensión suficiente para dirigir el licor madre de la suspensión a través de un filtro, para obtener de esta manera una composición que contiene precipitado; y
    lavar la composición que contiene precipitado, para producir de esta manera un precipitado de ARNm purificado.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde:
    a) al menos la etapa de agitación y/o la etapa de añadir uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm transcrito in vitro se produce en la celda de agitación o en el filtro Nutsche, o
    b) la etapa de añadir uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm transcrito in vitro no se produce en la celda de agitación o en el filtro Nutsche.
  3. 3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
    a) la agitación se produce a una velocidad entre aproximadamente 50 RPM y aproximadamente 500 RPM, opcionalmente en donde la agitación se produce a una velocidad de aproximadamente 200 RPM, y/o b) la presión está entre aproximadamente 5 PSI y aproximadamente 100 PSI, opcionalmente en donde la presión es aproximadamente de 10 PSI a aproximadamente 40 PSI.
  4. 4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
    a) una etapa de lavado es diafiltrar, ultrafiltrar o dializar;
    b) al menos la etapa de lavado se produce en una celda de agitación o un filtro Nutsche; y/o
    c) el uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm transcrito in vitro comprenden un alcohol, opcionalmente en donde el alcohol es etanol.
  5. 5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además añadir uno o más agentes que desnaturalizan las proteínas y/o mantienen las proteínas solubles en un medio acuoso, opcionalmente en donde el uno o más agentes que desnaturalizan las proteínas y/o mantienen las proteínas solubles en un medio acuoso comprende una sal, por ejemplo, una sal caotrópica, opcionalmente en donde: a) la etapa de añadir uno o más agentes que desnaturalizan las proteínas y/o mantienen las proteínas solubles en un medio acuoso se produce en la celda de agitación o en el filtro Nutsche, o
    b) la etapa de añadir uno o más agentes que desnaturalizan las proteínas y/o mantienen las proteínas solubles en un medio acuoso no se produce en la celda de agitación o en el filtro Nutsche.
  6. 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de secado del precipitado de ARNm purificado, opcionalmente en donde el precipitado de ARNm purificado se seca al proporcionar continuamente presión y/o vacío de manera que el ARNm precipitado se obtiene como una masa de precipitado.
  7. 7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de solubilización del precipitado de ARNm purificado en un medio acuoso, para obtener de esta manera una solución que comprende ARNm purificado, opcionalmente en donde la etapa de solubilización del precipitado de ARNm purificado comprende añadir un medio acuoso, por ejemplo, agua.
  8. 8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la suspensión comprende al menos un dispersante, opcionalmente en donde el dispersante es uno o más de ceniza, arcilla, tierra de diatomeas, agente filtrante, perlas de vidrio, perlas de plástico, polímeros, perlas de polipropileno, perlas de poliestireno, sales de celulosa, arena y azúcares, dicho método opcionalmente comprende, además:
    a) una etapa de secado del precipitado de ARNm purificado que se incluye en una masa junto con el dispersante, y/o
    b) una o más etapas para separar el dispersante del precipitado de ARNm purificado, opcionalmente en donde la una o más etapas para separar el dispersante del precipitado de ARNm purificado comprende lavar y secar la masa, y opcionalmente comprende además solubilizar y eluir el ARNm purificado de la masa mediante el uso de un medio acuoso, por ejemplo, agua, mientras se filtra el dispersante.
  9. 9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución proporcionada del ARNm transcrito in vitro comprende de aproximadamente 500 mg de ARNm a aproximadamente 100 g de ARNm, de aproximadamente 100 g de ARNm a aproximadamente 1 kg de ARNm, de aproximadamente 500 g de ARNm a aproximadamente 5 kg de ARNm, o de aproximadamente 500 g de ARNm a aproximadamente 2,5 kg de ARNm, opcionalmente en donde el uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm transcrito in vitro son una sal caotrópica y un alcohol, por ejemplo, tiocianato de guanidina y etanol.
  10. 10. El método de la reivindicación 9, en donde:
    a) el ARNm transcrito in vitro se pone en contacto con el uno o más agentes que promueven la precipitación del ARNm transcrito in vitro durante una cantidad total de aproximadamente un minuto a aproximadamente una hora, de aproximadamente un minuto a aproximadamente treinta minutos, de aproximadamente un minuto a aproximadamente quince minutos, o de aproximadamente un minuto a aproximadamente diez minutos, y/o
    b) se produce una etapa de agitación en una celda de agitación, y la presión es de aproximadamente 20 PSI a aproximadamente 50 PSI, opcionalmente en donde cada etapa de agitación se produce en una celda de agitación.
  11. 11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en donde:
    a) una etapa de lavado comprende poner en contacto la composición que contiene precipitado con una primera solución que comprende una sal caotrópica y un alcohol, por ejemplo, tiocianato de guanidina y etanol, opcionalmente en donde la composición que contiene precipitado se pone en contacto con dicha primera solución 1-5 veces, y/o,
    b) dicho método comprende además una etapa de lavado que comprende poner en contacto la composición que contiene precipitado con una segunda solución que es alcohol acuoso, por ejemplo, etanol acuoso, opcionalmente en donde la composición que contiene precipitado se pone en contacto con dicha segunda solución 1-10 veces.
    opcionalmente en donde:
    i) una etapa de lavado es diafiltrar, ultrafiltrar o dializar y/o
    ii) en donde se produce una etapa de lavado en una celda de agitación, y la presión es de aproximadamente 20 PSI a aproximadamente 50 PSI, opcionalmente en donde cada etapa de lavado se produce en una celda de agitación.
  12. 12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende además una etapa de solubilización del precipitado de ARNm purificado en un medio acuoso, para obtener de esta manera una solución que comprende el ARNm purificado.
  13. 13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde la solución proporcionada del ARNm transcrito in vitro comprende un dispersante, por ejemplo, microesferas de polímero.
  14. 14. El método de la reivindicación 13, en donde se produce una etapa de agitación en un filtro Nutsche y la presión es de aproximadamente 5 PSI a aproximadamente 25 PSI, opcionalmente en donde cada etapa de agitación se produce en un filtro Nutsche.
  15. 15. El método de la reivindicación 14, en donde una etapa de secado sigue al menos a una etapa de lavado, opcionalmente en donde una etapa de secado sigue a cada etapa de lavado.
  16. 16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13-15, que comprende además una etapa de solubilización del precipitado de ARNm purificado en un medio acuoso, para obtener de esta manera una solución que comprende el ARNm purificado.
  17. 17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:
    a) el ARNm es ARNm de caperuza y cola (C/T), y/o
    b) el ARNm es ARNm final.
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