KR20210089648A

KR20210089648A - 메신저 rna 정제를 위한 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20210089648A
Application number: KR1020217011981A
Authority: KR
Inventors: 조나단 어비살; 조렐 이. 바르가스; 프랭크 데로사; 디아스 아누샤
Original assignee: 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드
Priority date: 2018-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-07-16
Also published as: WO2020097509A1; US20210388338A1; AU2019376004A1; CA3115119A1; CN113166790A; EP3877538A1

Abstract

본 발명은 특히, 시험관내 전사 공정 (IVT)-합성된 mRNA를 환원제와 함께 변성 염을 포함하는 완충액 중에서 침전시킨 후, 침전된 mRNA를 포획하고, 포획된 mRNA를 용액 내로 용해시켜 정제된 mRNA를 수득함으로써, 대규모 시험관내 전사 공정 (IVT)에 의해 합성된 메신저 RNA 제제로부터 불순물을 제거하는 것을 수반하는, mRNA의 정제 방법을 제공한다.

Description

메신저 RNA 정제를 위한 방법 및 조성물

<관련 출원>

본 출원은 2018년 11월 8일자로 출원된 미국 가출원 일련번호 62/757,612를 우선권 주장하며, 이의 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.

메신저 RNA 요법(messenger RNA therapy; MRT)은 다양한 질환을 치료하기 위한 유망한 새로운 접근법이다. MRT는 요법이 필요한 환자에게 메신저 RNA (mRNA)를 투여하는 것을 수반한다. 투여된 mRNA는 환자의 신체 내에서 mRNA에 의해 코딩된 단백질 또는 펩티드를 생성한다. mRNA는 전형적으로, RNA 폴리머라제에 의한 효소 반응을 수반하는 시험관내 전사 시스템 (IVT)을 사용하여 합성된다. IVT 합성 공정에 이어 통상, 5'-캡 (캡핑 반응) 및 3'-폴리 A 테일 (폴리아데닐화)의 첨가를 위한 반응(들)이 이어진다. 이들 반응은, 이와 같이 형성된 전장 mRNA뿐만 아니라, 생성된 반응 혼합물 중의 다양한 바람직하지 않은 오염물 (예를 들어, 반응에서 사용되었거나 생성된 단백질, 염, 완충액, 및 비(non)-mRNA 핵산)을 포함하는 조성물을 초래한다. 다양한 정제 방법을 사용하여 오염물들을 제거함으로써 정제된 mRNA를 제공할 수 있다. 그러나, 미량의 잔여 오염물 단백질 또는 효소가 환자에서 미지의 부작용을 초래할 수 있다. 대상체에서 투여에 적합한 정제된 mRNA를 달성하기 위해, 현재 여러 차례의 정제를 필요로 한다. 따라서, 통상의 정제 방법 및 조성물은, 비용이 많이 드는 다단계 정제 공정 없이 환자 투여에 적합하고 오염물이 없는 깨끗하고 균질한 mRNA를 제공하기에 부적절하다.

오염물, 특히, mRNA 합성 공정으로부터의 잔여 단백질 또는 효소가 없는 치료 용도를 위한 mRNA를 달성하기 위해 새로운 개선된 방법이 필요하다.

본 발명은 시험관내 합성된 mRNA를 위한 개선된 정제 방법을 제공한다. 본 발명은 부분적으로, 고농도의 구아니디늄 염 및 세제를 포함하는 완충액 중에서 mRNA를 침전시키면 mRNA 생성물로부터의 단백질 오염물의 제거가 크게 개선된다는 놀라운 발견에 기반한다. 구체적으로, 캡핑 및 테일링된 mRNA의 한 차례 침전에 이어 정제 단계가 이어지면, 시험관내 합성된 mRNA로부터 검출가능한 수준의 잔여 효소를 성공적으로 제거할 수 있다. 정제 단계 (예컨대, 반복적 침전 단계)의 수가 감소하면, 보다 용이하고 보다 비용 효과적인 제작 공정이 생성된다. 보다 유의하게는, 본원에 기재된 조성물 및 방법은 예상외로 높은 mRNA 회수율, 순도 및 완전성(integrity)을 생성한다. 따라서, 본 발명은 치료 용도를 위한 mRNA의 보다 효율적이고 비용 효과적인 제작을 가능하게 한다. 부가적으로, 본 발명의 방법은 다량의 mRNA를 정제하는데 유용하다.

한 측면에서, 본 발명은, 시험관내 전사 공정 (IVT)에 의해 대규모로 합성된 메신저 RNA (mRNA) 제제로부터 불순물을 제거하는 방법이며, IVT-합성된 mRNA를, 환원제와 함께 변성 염(denaturing salt)을 포함하는 완충액 중에서 침전시키는 단계; 침전된 mRNA를 포획하는 단계; 및 포획된 mRNA를 용액 내로 용해시켜 mRNA를 정제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, mRNA를 침전시키기 전에 mRNA를 캡핑 및 테일링하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대규모 IVT 공정에 의해 수득된 mRNA 제제 중의 불순물은 단백질 (IVT, 캡핑 및 테일링을 위해 사용된 효소 포함); 불완전한 RNA 전사체; 뉴클레오티드 및 염을 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 방법에 의해 수득된 정제된 mRNA는, 합성된 mRNA의 양의 적어도 90%를 초과한다.

일부 실시양태에서, 상기 방법에 의해 수득된 정제된 mRNA에는 어떠한 효소 불순물도 실질적으로 없다.

일부 실시양태에서, IVT 반응에서 적어도 약 1 mg의 mRNA가 합성된다. 일부 실시양태에서, IVT 반응에서 적어도 약 50 mg의 mRNA가 합성된다. 일부 실시양태에서, IVT 반응에서 적어도 약 1 그램 (G)의 mRNA가 합성된다. 일부 실시양태에서, IVT 반응에서 적어도 약 10 G의 mRNA가 합성된다. 일부 실시양태에서, IVT 반응에서 적어도 약 100 G의 mRNA가 합성된다. 일부 실시양태에서, IVT 반응에서 적어도 약 1 Kg의 mRNA가 합성된다.

일부 실시양태에서, 침전 단계를 위한 완충액은 알콜을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 침전 단계는, mRNA, 변성 완충액(denaturing buffer) 및 알콜이 1: (5): (3)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 침전 단계는, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (3.5): (2.1)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 침전 단계는, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (2.8): (1.9)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 침전 단계는, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (2.3): (1.7)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 침전 단계는, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (2.1): (1.5)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다.

일부 실시양태에서, 변성 염은 구아니디늄 티오시아네이트이다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 구아니딘 티오시아네이트-시트르산나트륨, N-라우릴 사르코신 (GSCN)을 포함한다.

일부 실시양태에서, 구아니디늄 티오시아네이트는 2 M 이상, 3 M 이상, 4 M 이상, 5 M 이상, 6 M 이상, 또는 7 M 이상의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 구아니디늄 티오시아네이트는 적어도 3 M 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 구아니디늄 티오시아네이트는 적어도 4 M 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 구아니디늄 티오시아네이트는 5 M의 최종 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 베타-메르캅토에탄올 (β-ME), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 트리스(3-히드록시프로필)포스핀 (THPP) 및 디티오부틸아민 (DTBA)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT)이다.

일부 실시양태에서, DTT는 1 mM 초과 및 최대 약 200 mM인 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 2.5 mM 내지 100 mM의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 5 mM 내지 50 mM의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT의 농도는 5 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM이다.

일부 실시양태에서, mRNA를 침전시키는 단계는 1회 초과로 수행된다. 일부 실시양태에서, mRNA를 침전시키는 단계는 1회만 수행된다.

일부 실시양태에서, mRNA를 포획하는 단계는, mRNA에 대해 여과, 원심분리, 고체 상에의 가역적 흡착, 또는 이들의 조합을 수행하는 것을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 여과는 접선 유동 여과(tangential flow filtration; TFF)이다.

일부 실시양태에서, 여과는 심층 여과(depth filtration; DF)이다.

일부 실시양태에서, 여과는 누체(Nutsche) 필터를 사용하여 수행된다.

일부 실시양태에서, 여과는 원심분리와 함께 수행된다.

일부 실시양태에서, 포획된 mRNA를 용해시키는 단계는 수용액 중에서 수행된다.

일부 실시양태에서, 포획된 mRNA의 단계에 대해, 보다 낮은 염 농도를 포함하는 적합한 완충액 중의 투석을 수행한다.

일부 실시양태에서, 정제된 조성물에는 어떠한 단백질 불순물도 실질적으로 없으며, 이는 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만의 단백질 불순물, 또는 0%의 단백질 불순물이다.

일부 실시양태에서, 정제된 mRNA에는 염이 실질적으로 없다.

일부 실시양태에서, 정제된 mRNA는 적어도 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 또는 약 100%의, 단백질을 코딩하는 전장 mRNA를 포함한다.

본원에 언급된 특허 및 과학 문헌은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 이용가능한 지식을 확립한다. 본원에 인용된 모든 미국 특허 및 공개 또는 비공개된 미국 특허 출원이 참조로 포함된다. 본원에 인용된 모든 공개된 외국 특허 및 특허 출원이 본원에 참조로 포함된다. 본원에 인용된 모든 다른 공개된 참고자료, 문서, 원고 및 과학 문헌이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 도면 및 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.

상기 및 추가 특징은 첨부된 도면과 함께 고려하는 경우 하기 상세한 설명으로부터 보다 명확하게 인지될 것이다. 그러나, 도면은 단지 예시 목적을 위한 것이며, 제한을 위한 것이 아니다.
도 1은, mRNA 제제 중의 잔여 단백질의 검출을 위한 정제되고 RNase 1 소화된 생성물의 은 염색 겔 분석을 도시한다. CFTR mRNA는 칼럼 여과에 의해 정제되었다. 겔 1 (좌측 이미지) 또는 겔 2 (우측 이미지)의 레인 1은 오염물 단백질들의 흐릿한 밴드를 보이는 양성 대조군 mRNA에 해당된다. 겔 1, 레인 5는 4 M 구아니딘 티오시아네이트-시트르산나트륨, N-라우릴 사르코신 (GSCN) 완충액을 사용하는 정제로부터의 샘플을 도시하고; 겔 2, 레인 5는 5 M GSCN-1% 라우릴 사르코신 완충액을 사용하는 정제로부터의 샘플을 도시하고; 겔 2, 레인 6은 5 M GSCN-0.1% 라우릴 사르코신 완충액을 사용하는 정제로부터의 샘플을 도시한다. 어느 한 겔의 레인 9-11은 각각, RNase 1, SP6 및 구아닐레이트 트랜스퍼라제에 대한 전기영동 이동 대조군을 도시한다. 본원에서 확인되지 않은 그 밖의 레인들은 그 문맥에 해당없음 (n/a)이다. 화살표는, 주요 오염물 밴드, SP6 폴리머라제/구아닐레이트 트랜스퍼라제의 이동에 대한 위치를 나타낸다.
도 2는, mRNA 제제 중의 잔여 단백질의 검출을 위한 정제되고 RNase 1 소화된 mRNA 생성물의 은 염색 겔 분석을 도시한다. CFTR mRNA는 구아니딘 티오시아네이트 완충액을 사용하여 24 웰 미량역가 플레이트에서 여과에 의해 정제되었다. 겔 1 (좌측 이미지) 또는 겔 2 (우측 이미지)의 레인 1은 오염물 단백질들의 흐릿한 밴드를 보이는 양성 대조군 mRNA에 해당된다. 겔 1, 레인 6은 DTT 없이 5 M 구아니딘 티오시아네이트 완충액을 사용하여 정제된 샘플을 도시하고; 겔 2, 레인 6은 DTT 없이 5 M 구아니딘 티오시아네이트 완충액을 사용하여 정제된 샘플을 도시하고; 어느 한 겔의 레인 10-12는 각각, RNase 1, SP6 및 구아닐레이트 트랜스퍼라제에 대한 전기영동 이동 대조군을 도시한다. 본원에서 확인되지 않은 그 밖의 레인들은 그 문맥에 해당없음 (n/a)이다. 화살표는, 주요 오염물 밴드, SP6 폴리머라제/구아닐레이트 트랜스퍼라제의 이동을 나타낸다.
도 3은, mRNA 제제 중의 잔여 단백질의 검출을 위한 그램-규모의 정제되고 RNase 1 소화된 생성물의 은 염색 겔 분석을 도시한다. 레인 1은 흐릿한 양성 대조군 샘플을 도시한다. 레인 5는 5 M GSCN w/ DTT 완충액을 사용하는 1 g의 CFTR mRNA 제제의 정제로부터의 샘플을 도시한다. 레인 6-10은 각각, RNase 1, SP6, 구아닐레이트 트랜스퍼라제, 폴리 A 폴리머라제 및 O-메틸 트랜스퍼라제에 대한 전기영동 이동 대조군을 도시한다. 본원에서 확인되지 않은 그 밖의 레인들은 그 문맥에 해당없음 (n/a)이다. 화살표는, 주요 오염물 밴드, SP6 폴리머라제/구아닐레이트 트랜스퍼라제의 이동에 대한 위치를 나타낸다.
도 4는, mRNA 제제 중의 잔여 단백질의 검출을 위한 10 그램 (10 G)-규모의 정제되고 RNase 1 소화된 생성물의 은 염색 겔 분석을 도시한다. 레인 5는 5 M GSCN w/ DTT 완충액을 사용하는 10 g의 CFTR mRNA 제제의 정제로부터의 샘플을 도시한다. 레인 7-11은 각각, RNase 1, SP6, 구아닐레이트 트랜스퍼라제, 폴리 A 폴리머라제 및 O-메틸 트랜스퍼라제에 대한 전기영동 이동 대조군을 도시한다. 화살표는, 주요 오염물 밴드, SP6 폴리머라제/구아닐레이트 트랜스퍼라제의 이동에 대한 위치를 나타낸다. 본원에서 확인되지 않은 그 밖의 레인들은 그 문맥에 해당없음 (n/a)이다.
도 5A-B는 10 G-규모의 정제된 mRNA 샘플의 모세관 전기영동을 도시한다. 도 5A, 테일링 없는 mRNA 생성물; 도 5B, 테일링 반응 후.
도 6은, mRNA 제제 중의 잔여 단백질의 검출을 위한 100 그램 (100 G)-규모의 정제되고 RNase 1 소화된 생성물의 은 염색 겔 분석을 도시한다. 레인 5 및 6은 정제된 생성물을 도시한다. 레인 1은 오염물 효소의 흐릿한 밴드를 보이는, 대조군 정제된 mRNA 샘플을 도시한다. 레인 8-10은 각각, 공정 효소 RNAse1, SP6, 구아닐레이트 트랜스퍼라제, 폴리 A 폴리머라제 및 2-O-메틸 트랜스퍼라제에 대한 전기영동 이동 대조군을 도시한다.
도 7은 100 G-규모의 정제된 mRNA 샘플의 모세관 전기영동을 도시한다. 곡선형 화살표로 도시된 피크는 본 발명의 방법에 의해 정제된 mRNA를 나타낸다. 직선형 화살표로 도시된 피크는 4 M GSCN 완충액을 사용하여 처리된 대조군 샘플을 나타낸다.
도 8은 다양한 환원제와 함께 정제된 은 염색 겔 분석 mRNA 생성물을 도시한다. 레인 2는 환원제 없이 5 M GSCN만을 사용하여 정제된 생성물을 도시한다. 레인 3-9는 여러가지 농도의 다양한 환원제와 함께 5 M GSCN을 사용하여 정제된 생성물을 도시한다. 레인 10-12는 각각, 공정 효소 RNase I, SP6 및 구아닐레이트 트랜스퍼라제에 대한 전기영동 이동 대조군을 도시한다.

<정의>

본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해, 먼저 특정 용어를 아래에 정의한다. 하기 용어들 및 기타 용어들에 대한 부가적인 정의는 명세서 전반에 걸쳐 기술된다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 표현은 문맥상 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 복수형 지시 대상을 포함한다.

구체적으로 진술되거나 문맥으로부터 자명하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "또는"은 총괄적인 것으로 이해되며, "또는" 및 "그리고" 둘 다를 커버한다.

본원에 사용되는 용어 "예를 들어" 및 "즉"은, 제한하려는 의도 없이, 단지 예로서 사용되며, 명세서에서 명백하게 열거된 항목들만을 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.

명세서 전반에 걸쳐 단어 "포함하는", 또는 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 진술된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함함을 의미하는 것으로 이해될 것이나, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제함은 아니다.

구체적으로 진술되거나 문맥으로부터 자명하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 관련 기술분야의 정상적인 용인도의 범위 내, 예를 들어 평균의 2 표준편차 내로서 이해된다. "약"은 진술된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% 또는 0.001% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥으로부터 달리 명확하지 않는 한, 본원에 제공된 모든 수치 값들은 용어 "약"에 의해 변형된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "뱃치(batch)"란, 한 번에 합성된 (예를 들어, 동일한 제작 사이클 동안에 단일 제작 순서에 따라 생성된) mRNA의 양 또는 분량을 지칭한다. 뱃치란, 한 세트의 조건 하의 연속 합성의 경우 단일 분취량의 효소 및/또는 단일 분취량의 DNA 주형을 통해 발생하는 하나의 반응에서 합성된 mRNA의 양을 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 뱃치는, 모든 시약 및/또는 성분이 반응이 진행됨에 따라 보충 및/또는 보급되지는 않는 것인 반응으로부터 생성된 mRNA를 포함할 것이다. 용어 "뱃치"는, 목적하는 양을 달성하기 위해 조합되는 여러 시간에 합성된 mRNA를 의미하지 않을 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "오염물"이란, 한정된 양의 액체, 기체 또는 고체 내부의 물질을 지칭하며, 이는 표적 재료 또는 화합물의 화학적 조성과 상이하다. 오염물은 불순물이라고도 지칭된다. 오염물 또는 불순물의 예는 완충액, 단백질 (예를 들어, 효소), 핵산, 염, 용매, 및/또는 세척 용액을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분산제"란, mRNA 침전물이 히드로겔을 형성 할 가능성을 감소시키는 고체 미립자를 지칭한다. 분산제의 예는 애쉬(ash), 점토, 규조토, 여과제, 유리 비드, 플라스틱 비드, 중합체, 폴리프로필렌 비드, 폴리스티렌 비드, 염 (예를 들어, 셀룰로스 염), 모래 및 당 중 1종 이상을 포함하고, 이에 제한되지는 않는다. 실시양태에서, 분산제는 중합체 미소구체 (예를 들어, 폴리(스티렌-코(co)-디비닐벤젠) 미소구체)이다.

본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"이란, 다음 사건들 중 하나 이상을 지칭한다: (1) DNA 서열로부터의 mRNA 주형의 생성 (예를 들어, 전사에 의해); (2) mRNA 전사체의 처리 (예를 들어, 스플라이싱(splicing), 교정(editing), 5' 캡 형성 및/또는 3' 단부 형성에 의해); (3) mRNA의 폴리펩티드 또는 단백질로의 번역; 및/또는 (4) 폴리펩티드 또는 단백질의 번역후 변형. 이 적용예에서, 용어 "발현" 및 "생성" 및 문법적 동의어는 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "전장 mRNA"는 특이적 검정, 예를 들어 겔 전기영동, 또는 모세관 전기영동에 의한 분리와 함께 UV 및 UV 흡수 분광법을 사용한 검출을 사용할 때 특징지워진다. 본원에 기재된 정제 방법들 중 임의의 것에 따라 수득된 바와 같고 전장 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 분자의 길이는, 표적 DNA로부터 전사되는 전장 mRNA 분자의 길이의 적어도 50%, 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방법에 따른 정제 전 및 표적 DNA로부터 전사되는 전장 mRNA 분자의 길이의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.01%, 99.05%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"이란, (1) 초기에 생성될 때 연관된 성분들 (천연적으로 및/또는 실험 셋팅으로) 중 적어도 일부로부터 분리되었고/거나 (2) 사람의 손으로 생성, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 실체에 관한 것이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "메신저 RNA (mRNA)"란, 적어도 하나의 폴리펩티드를 코딩하는 폴리리보뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 mRNA는 변형 및 비변형된 mRNA 둘 모두를 포괄한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 및 비-코딩 영역을 함유할 수 있다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있으며, 임의로 정제, 시험관내 전사, 또는 화학적 합성될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "mRNA 완전성"이란 일반적으로, mRNA의 품질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, mRNA 완전성이란, 정제 공정 (예를 들어, 본원에 기재된 방법) 후에 분해되지 않은 mRNA의 백분율을 지칭한다. mRNA 완전성은, 본원에 특별히 기재된 방법, 예컨대 TAE 아가로스 겔 전기영동을 사용하여, 또는 은 염색과 함께 SDS-PAGE에 의해, 또는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해, 예를 들어 RNA 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology]).

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "제약학상 허용되는"이란, 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합리적인 유익/위험 비와 조화를 이루는 물질에 관한 것이다.

"제약학상 허용되는 부형제"란, 일반적으로 안전하고 무독성이며 생물학적으로도 그 외로도 바람직하지 못한 것은 아닌 제약 조성물을 제조하기에 적합한 부형제를 의미하며, 이는 수의학적 용도뿐만 아니라 인간 제약 용도에 허용되는 부형제를 포함한다. 명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같은 "제약학상 허용되는 부형제"는 1종 및 1종 초과의 그러한 부형제 둘 모두를 포함한다.

전형적으로, 적합한 mRNA 용액은 또한 완충제 및/또는 염을 함유할 수 있다. 일반적으로, 완충제는 HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨 및 인산나트륨을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로"란, 관심 특징 또는 특성의 전체 또는 거의 전체 범위 또는 정도를 나타내는 정성적 조건을 지칭한다. 생물학 분야의 통상의 기술자라면, 생물학적 및 화학적 현상이 완전해지고/거나 완전함으로 진행되거나, 또는 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것은 (설사 있다 하더라도) 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는, 많은 생물학적 및 화학적 현상에서 고유한 완전함의 잠재적 부족을 담아내기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 화합물 'x'가 실질적으로 없는 조성물은 5% 미만의 화합물 'x', 또는 1% 미만 또는 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 화합물 'x'를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 보편적으로 이해되고 본 출원이 속하는 기술분야에서 보편적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 가지며; 그러한 학술지는 그 전문이 참조로 포함된다. 불일치하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.

<상세한 설명>

본 발명은 확장가능한 양의 순수한 및 고품질 mRNA를 제조하는 방법에 관한 것이다. mRNA는 전형적으로, 폴리머라제, 예컨대 SP6 또는 T7-폴리머라제를 사용하는 시험관내 전사 (IVT)에 의해 합성된 다음, 캡핑 및 테일링되어 전장 생체내 번역가능 mRNA를 생성한다. 그러나, mRNA 합성 및/또는 캡핑 및 테일링 반응과 연관된 단백질 ("공정 효소")은 통상의 정제 방법을 사용하여 mRNA 생성물로부터 제거하기가 어렵다. 그 결과, 정제 공정은 종종, 오염물 단백질로부터 mRNA를 단리하기 위한 다수의 침전 단계를 수반한다. mRNA는 구조적으로 불안정하고 교반-관련 분해 경향이 있기 때문에, 반복적 침전, 원심분리 및/또는 여과 단계가 mRNA 완전성에 영향을 미칠 우려가 있으며, 이는 하류 치료 용도에 바람직하지 않다.

본 발명은, 적어도 부분적으로, 통상의 농도보다 더 높은 농도의 구아니딘 염 (예컨대, 구아니딘 티오시아네이트)을 포함하는 완충액이 mRNA 침전 및 처리를 위해 이용되는 경우, 오염 단백질의 제거에서 유의한 개선이 관찰된다는 놀라운 예상치 못한 발견에 기반한다. 부가적으로, 일부 실시양태에서, 고농도 구아니딘 염을 포함하는 완충액이 본 발명에 기재된 바와 같은 세제를 추가로 포함하는 경우, 침전용 완충액은 mRNA 제제로부터의 단백질 오염물의 제거에서 무세제 침전용 완충액에 비해 더 높은 효율을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 완충액은 구아니딘 티오시아네이트-시트르산나트륨, N-라우릴 사르코신 (GSCN)을 포함한다. 구아니딘 티오시아네이트 및 GSCN은 종종 변성 완충액과 관련하여 적용예 전반에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다. 일부 실시양태에서, 기재된 바와 같은 본 발명의 완충액 및 방법을 사용하면, 단일 침전 단계 후 고품질의 정제된 mRNA가 생성된다. 일부 실시양태에서, 용어 "공정 효소"는 효소, 또는 단백질, 또는 이들의 단백질 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공정 효소는 폴리머라제, 또는 포스파타제, 또는 키나제, 또는 구아닐릴 트랜스퍼라제, 또는 기타 단백질, 또는 이들의 단편을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용되는 용어 단백질 오염물은 오염 효소, 단백질 또는 이들의 단백질 단편을 포함할 수 있으며, 이는 폴리펩티드 또는 올리고펩티드 (펩티드)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 완충액 및 방법은 뱃치에서 대량의 정제된 mRNA를 생성하도록 확장가능하다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 대규모 제작 공정에서의 단계의 수를 감소시키는데 있어서 이점을 제공한다.

일부 실시양태에서, 대규모 정제는, 1 그램 mRNA 이상, 예컨대 5 그램 이상, 10 그램 이상, 20 그램 이상, 50 그램 이상, 100 그램 이상, 150 그램 이상, 200 그램 이상, 500 그램 이상, 1000 그램 이상, 또는 10,000 그램 이상의 mRNA를 포함하는 조성물을 정제하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 대규모 mRNA 합성 공정은, 약 1 그램 초과의 mRNA, 또는 약 10 그램 초과의 mRNA, 또는 약 20 그램 초과, 또는 약 50 그램 초과, 또는 약 100 그램 초과, 또는 약 150 그램 초과, 또는 약 200 그램 초과, 또는 약 500 그램 초과, 또는 약 1000 그램 초과, 또는 약 10,000 그램 초과의 mRNA를 제공한다.

메신저 RNA

본원에 기재된 정제 방법은 임의의 mRNA의 정제에 적합하다. 본 발명은 다양한 단백질 (예를 들어, 폴리펩티드) 또는 펩티드를 코딩하는 mRNA를 정제하기 위해 사용될 수 있다.

다양한 실시양태에 따라, 본 발명은 다양한 길이의 시험관내 합성된 mRNA를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 길이가 약 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb 또는 20 kb 또는 그 초과인 시험관내 합성된 mRNA를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 길이가 약 1-20 kb, 약 1-15 kb, 약 1-10 kb, 약 5-20 kb, 약 5-15 kb, 약 5-12 kb, 약 5-10 kb, 약 8-20 kb, 또는 약 8-15 kb의 범위인 시험관내 합성된 mRNA를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 전형적인 mRNA는 길이가 약 1 kb 내지 약 5 kb일 수 있다. 보다 전형적으로, mRNA는 약 1 kb 내지 약 3 kb의 길이를 가질 것이다. 그러나, 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물 중의 mRNA는 훨씬 더 길다 (약 20 kb 초과).

특정 실시양태에서, mRNA 뉴클레오티드는 "변형된 mRNA"를 제공하도록 변형된다. 따라서, 본 발명에 따른 변형된 mRNA는, 예를 들어, 백본 변형물, 당 변형물 또는 염기 변형물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA를 코딩하는 항체 (예를 들어, mRNA를 코딩하는 중쇄 및 경쇄)는, 천연 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체 (변형된 뉴클레오티드), 예컨대 이에 제한되지는 않으나 퓨린 (아데닌 (A), 구아닌 (G)) 또는 피리미딘 (티민 (T), 시토신 (C), 우라실 (U))으로부터 합성될 수 있으며, 퓨린 및 피리미딘의 변형된 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체, 예컨대 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 슈도우라실 (5-우라실), 디히드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카르복시히드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카르보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산 (v), 1-메틸-슈도우라실, 큐에오신, 베타-D-만노실-큐에오신, 와이부톡소신, 포스포라미데이트, 포스포로티오에이트, 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신 및 이노신으로서 합성될 수 있다. 이러한 유사체들의 제법은 예를 들어 미국 특허 번호 4,373,071, 미국 특허 번호 4,401,796, 미국 특허 번호 4,415,732, 미국 특허 번호 4,458,066, 미국 특허 번호 4,500,707, 미국 특허 번호 4,668,777, 미국 특허 번호 4,973,679, 미국 특허 번호 5,047,524, 미국 특허 번호 5,132,418, 미국 특허 번호 5,153,319, 미국 특허 번호 5,262,530 및 5,700,642로부터 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 이들의 개시내용은 그의 전 범주가 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 변형되지 않은 시험관내 합성된 mRNA를 정제하기 위해 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, mRNA는 5' 및/또는 3' 비번역 영역(untranslated region; UTR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 비번역 영역은, mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어 철 응답성 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 5' 비번역 영역은 길이가 약 50 내지 500개의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 3' 비번역 영역은, 하나 이상의 폴리아데닐화 신호, 세포 내 mRNA의 위치 안정성에 영향을 미치는 단백질에 대한 결합 부위, 또는 miRNA를 위한 하나 이상의 결합 부위를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3' 비번역 영역은 길이가 50 내지 500개의 뉴클레오티드 또는 그 초과일 수 있다. 일부 실시양태에서, 5' 비번역 영역은, mRNA의 안정성 또는 번역에 영향을 미치는 하나 이상의 요소, 예를 들어 철 응답성 요소를 포함한다.

예시적인 3' 및/또는 5' UTR 서열은 센스 mRNA 분자의 안정성을 증가시키도록 안정한 mRNA 분자 (예를 들어, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤, 및 시트르산 사이클 효소)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 5' UTR 서열은, 뉴클레아제 내성을 개선시키고/거나 폴리뉴클레오티드의 반감기를 개선시키기 위해 CMV 즉각-조기(immediate-early) 1 (IE1) 유전자의 부분 서열, 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드를 추가로 안정화시키기 위해 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)의 3' 단부 또는 비번역 영역에, 인간 성장 호르몬 (hGH)을 코딩하는 서열, 또는 이들의 단편을 포함시키는 것이 고려된다. 일반적으로, 이들 특징부는 그러한 특징부가 없는 동일한 폴리뉴클레오티드에 비해 폴리뉴클레오티드의 안정성 및/또는 약동학적 특성 (예를 들어, 반감기)을 개선시키며, 이는 예를 들어, 생체내 뉴클레아제 소화에 대한 상기와 같은 폴리뉴클레오티드의 내성을 개선시키도록 만들어진 특징부를 포함한다.

mRNA 합성

mRNA는 다양한 공지된 방법들 중 임의의 것에 따라 합성될 수 있다. 예를 들어, mRNA는 시험관내 전사 (IVT)를 통해 합성될 수 있다. 본 발명은 시험관내 전사 반응에 의해 합성된 mRNA를 정제하는데 특히 유용하지만, 임의의 다른 방법에 의해 생성된 mRNA의 정제에서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 박테리아, 진균, 식물 및/또는 동물로부터 생성된 야생형 mRNA를 포함한 다른 공급원으로부터의 mRNA가 본 발명의 범주 내로서 고려된다.

시약 및 잔여 효소 및 단백질이 존재하면, 이전 섹션에 기재된 여러 실시양태에 따라 최종 mRNA 생성물에서 바람직하지 않으며, 이에 따라 불순물 또는 오염물이라 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 이들 불순물 또는 오염물 중 1종 이상을 함유하는 제제는 순수하지 않은 제제라 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관내 전사는 단일 뱃치에서 발생한다. 일부 실시양태에서, IVT 반응은 캡핑 및 테일링 반응 (C/T)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 캡핑 및 테일링 반응은 IVT 반응과 별도로 수행된다. 일부 실시양태에서, IVT 반응으로부터 mRNA가 회수된 후, 본 출원에 기재된 방법에 의한 mRNA의 제1 침전 및 정제가 이어지고; 회수 정제된 mRNA는 이어서 캡핑 및 테일링되고, 제2 침전 및 정제가 적용된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은, 적어도 10 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 5 g, 10 g, 25 g, 50 g, 75 g, 100 g, 250 g, 500 g, 750 g, 1 kg, 5 kg, 10 kg, 50 kg, 100 kg, 1000 kg 또는 그 초과의 mRNA를 함유하는 조성물 또는 뱃치를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA 분자는 길이가 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 10,000개 또는 그 초과의 뉴클레오티드보다 크며; 그 사이의 임의의 길이를 갖는 mRNA가 또한 본 발명에 포함된다.

IVT 반응

IVT는 전형적으로, 프로모터, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트들의 풀(pool), DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 폴리머라제 (예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제), DNAse I, 피로포스파타제, 및/또는 RNase 억제제를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 주형으로 수행된다. 정확한 조건은 특정 적용예에 따라 다양할 것이다. 적합한 DNA 주형은 전형적으로, 시험관내 전사를 위한 프로모터, 예를 들어 T3, T7 또는 SP6 프로모터에 이어, 목적하는 mRNA 및 종결 신호를 위한 목적하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 생성된 mRNA는 코돈 최적화된다.

일부 실시양태에서, 예시적인 IVT 반응 혼합물은, SP6 폴리머라제-특이적 프로모터를 갖는 선형화된 이중 가닥 DNA 주형, SP6 RNA 폴리머라제, RNase 억제제, 피로포스파타제, 29 mM NTP, 10 mM DTT 및 반응 완충액 (10x에서 800 mM HEPES, 20 mM 스페르미딘, 250 mM MgCl₂, pH 7.7인 경우), 및 목적하는 반응 부피까지의 충분량 (QS)으로 RNase-무함유 물을 함유하며; 이어서 이 반응 혼합물은 37℃에서 60분 동안 인큐베이션된다. 그런 다음, 정제를 위한 제제에서의 이중 가닥 DNA 주형의 소화를 용이하게 하기 위해 DNase I 및 DNase I 완충액 (10x에서 100 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂ 및 25 mM CaCl₂, pH 7.6인 경우)을 첨가하여 폴리머라제 반응을 켄칭한다. 이 실시양태는 100 그램의 mRNA를 생성하기에 충분한 것으로 나타났다.

기타 IVT 방법이 관련 기술분야에서 이용가능하며, 이를 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다.

캡핑 및 테일링 (C/T) 반응

전형적으로, 진핵 생물에서 mRNA 처리는, N-말단 (5') 단부 상의 "캡", 및 C-말단 (3') 단부 상의 "테일"의 첨가를 포함한다. 전형적인 캡은, 5'-5'-트리포스페이트 결합을 통해 제1 전사된 뉴클레오티드에 연결된 구아노신인 7-메틸구아노신 캡이다. 캡의 존재는 대부분의 진핵 세포에서 발견되는 뉴클레아제에 대한 내성을 제공하는데 있어서 중요하다. 일부 실시양태에서, 시험관내 전사된 mRNA는, 구아닐레이트 트랜스퍼라제를 사용하는 5' N⁷-메틸구아닐레이트 캡 0 구조의 첨가, 및 문헌 [Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249]에 기재된 바와 같은 2' O-메틸트랜스퍼라제를 사용하는 캡 1 구조를 생성하는 끝에서 두 번째 뉴클레오티드의 2' O 위치에서의 메틸 기의 첨가에 의해 효소처리로 변형된다.

일부 실시양태에서, 5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 첨가된다: 먼저, RNA 말단 포스파타제가 5' 뉴클레오티드로부터 말단 포스페이트 기들 중 1개를 제거하여 2개의 말단 포스페이트를 남기고; 이어서 구아노신 트리포스페이트 (GTP)가 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 말단 포스페이트에 첨가되어 5'-5' 트리포스페이트 연결부를 생성한 다음; 구아닌의 7-질소가 메틸트랜스퍼라제에 의해 메틸화됨. 캡 구조의 예는 m7G(5')ppp(5')G, G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 요컨대, 정제된 IVT mRNA는 전형적으로, Tris-HCl, MgCl₂, 및 RNase-무함유 H₂O를 포함하는 반응 완충액의 존재 하에, GTP, S-아데노실 메티오닌, RNase 억제제, 2'-O메틸 트랜스퍼라제, 구아닐릴 트랜스퍼라제와 혼합된 다음, 37℃에서 인큐베이션된다.

일부 실시양태에서, 캡 1 구조의 첨가 후, 시험관내 전사된 mRNA의 3' 단부에 폴리-A 폴리머라제를 사용하여 효소처리로 폴리-아데닐레이트 테일을 첨가한다. 테일은 전형적으로, mRNA 분자의 3' 단부에 폴리아데닐릴 모이어티가 첨가되는 폴리아데닐화 사건이다. 일부 실시양태에서, 캡핑 반응을 위한 인큐베이션 후, Tris-HCl, NaCl, MgCl₂, ATP, 폴리 A 폴리머라제 및 RNase-무함유 H₂O를 포함하는 테일링 완충액을 첨가함으로써 테일링 반응이 개시된다. 반응은 EDTA의 첨가에 의해 켄칭된다.

이 "테일"의 존재는 mRNA를 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하는 역할을 한다. 3' 테일은 5' 캡을 첨가하기 전에 또는 그 후에 또는 그와 동시에 첨가될 수 있다.

일부 실시양태에서, 폴리 A 테일은 길이가 25-5,000개의 뉴클레오티드이다. 전형적으로, 테일 구조는 폴리 A 및/또는 폴리 C 테일을 포함한다 (A, 아데노신; C, 시토신). 일부 실시양태에서, mRNA의 3' 말단 상의 폴리-A 또는 폴리-C 테일은 각각, 적어도 50개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 150개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 200개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 250개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 300개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 350개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 400개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 450개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 500개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 550개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 650개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 700개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 750개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 800개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 850개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 900개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 950개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 또는 적어도 1 kb의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리-A 또는 폴리-C 테일은 각각, 약 10 내지 800개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드 (예를 들어, 약 10 내지 200개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 300개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 400개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 500개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 550개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 50 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 100 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 150 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 200 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 250 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 300 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 350 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 400 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 450 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 500 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 150개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 60개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 테일 구조는 본원에 기재된 다양한 길이를 갖는 폴리 A 및 폴리 C 테일들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 테일 구조는 적어도 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 테일 구조는 적어도 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.

기타 캡핑 및/또는 테일링 방법이 관련 기술분야에서 이용가능하며, 이를 사용하여 본 발명을 실시할 수 있다.

시험관내 합성된 mRNA 중의 오염물

예를 들어 상기 기재된 바와 같은 합성 공정으로부터의 mRNA 생성물은, 다양한 오염물 (불순물라고도 지칭됨), 예컨대 잔여 주형 DNA, 미완성 생성물, 효소, 예컨대 폴리머라제, 예를 들어 SP6 또는 T7-폴리머라제, 캡핑 효소, 예를 들어 구아닐릴 트랜스퍼라제, 또는 메틸 구아닐릴 트랜스퍼라제, DNase 1, 다양한 염, 및 mRNA 합성 반응의 부산물인 조기 미완성 mRNA 올리고뉴클레오티드를 함유할 우려가 있다.

mRNA 정제

본 발명에 따른 정제 공정은 합성 동안에 또는 그에 후속하여 수행될 수 있다. 예를 들어, mRNA에 캡 및/또는 테일이 첨가되기 전에 본원에 기재된 바와 같이 mRNA를 정제할 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA에 캡 및/또는 테일이 첨가된 후에 mRNA를 정제한다. 일부 실시양태에서, 캡이 첨가된 후에 mRNA를 정제한다. 일부 실시양태에서, mRNA에 캡 및/또는 테일이 첨가된 후 및 그 전 모두에 mRNA를 정제한다. 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 정제 단계는 mRNA 합성의 각 단계 후에, 임의로 다른 정제 공정 (예컨대, 투석)과 함께 수행될 수 있다.

mRNA의 침전

본 발명에 따라, 시험관내 합성 반응 혼합물과 같은 순수하지 않은 제제 중의 mRNA는 본원에 기재된 완충액 및 적합한 조건을 사용하여 침전시킬 수 있고, 이에 이어 관련 기술분야에 공지된 다양한 정제 방법이 이어질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "침전" (또는 그의 임의의 문법적 동의어)이란, 용액 중에서의 불용해성 물질 (예를 들어, 고체)의 형성을 지칭한다. mRNA와 관련하여 사용되는 경우 용어 "침전"이란, 액체 중에서의 불용해성 또는 고체 형태의 mRNA의 형성을 지칭한다.

전형적으로, mRNA 침전은 변성 조건을 수반한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변성 조건"이란, mRNA의 고유 확인의 붕괴를 야기할 수 있는 임의의 화학적 또는 물리적 조건을 지칭한다. 분자의 고유 형태는 통상 가장 수용성이기 때문에, 분자의 2차 및 3차 구조를 붕괴시키는 것이 용해도의 변화를 야기할 수 있으며, 용액으로부터의 mRNA의 침전을 발생시킬 수 있다.

예를 들어, 순수하지 않은 제제로부터 mRNA를 침전시키는 적합한 방법은, 순수하지 않은 제제를 mRNA가 침전되도록 변성 시약(denaturing reagent)으로 처리하는 것을 수반한다. 본 발명에 적합한 예시적인 변성 시약은 염화리튬, 염화나트륨, 염화칼륨, 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 구아니디늄 이소티오시아네이트, 아세트산암모늄 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 적합한 시약은 고체 형태로 또는 용액으로 제공될 수 있다.

일부 실시양태에서, mRNA의 침전을 위한 변성 완충액에서 구아니디늄 염이 사용된다. 비제한적인 예로서, 구아니디늄 염은 구아니디늄 클로라이드, 구아니디늄 티오시아네이트, 또는 구아니디늄 이소티오시아네이트를 포함할 수 있다. 구아니디늄 티오시아네이트 (구아니딘 티오시아네이트라고도 함)는 mRNA를 침전시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은, mRNA 침전 시에, 구아니디늄 염 (예컨대, 구아니디늄 티오시아네이트)을 포함하는 완충액을 변성 반응에 전형적으로 사용되는 것보다 더 높은 농도로 사용하여, 단백질 오염물이 실질적으로 없는 mRNA를 생성할 수 있다는 놀라운 발견에 기반한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 구아니딘 티오시아네이트를 4 M 초과의 농도로 함유한다.

본 발명에 따라, 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 4 M 초과의 구아니딘 티오시아네이트를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 5 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 5.5 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 6 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 6.5 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 7 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 7.5 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 8 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 8.5 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 9 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 약 10 M의 GSCN을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 변성 시약을 포함하는 완충액은 10 M 초과의 GSCN을 포함한다.

변성 시약에 추가로, mRNA 침전에 적합한 용액은 추가의 염, 계면활성제 및/또는 완충제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 용액은 나트륨 라우릴 사르코실 및/또는 시트르산나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 5 mM의 시트르산나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 10 mM의 시트르산나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 20 mM의 시트르산나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 25 mM의 시트르산나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 30 mM의 시트르산나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 50 mM의 시트르산나트륨을 포함한다.

일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 N-라우릴 사르코신 (사르코실)과 같은 계면활성제를 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 0.01%의 N-라우릴 사르코신을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 0.05%의 N-라우릴 사르코신을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 0.1%의 N-라우릴 사르코신을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 0.5%의 N-라우릴 사르코신을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 1%의 N-라우릴 사르코신을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 1.5%의 N-라우릴 사르코신을 포함한다. 일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 완충액은 약 2%, 약 2.5% 또는 약 5%의 N-라우릴 사르코신을 포함한다.

일부 실시양태에서, mRNA 침전에 적합한 용액은 환원제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT), 베타-메르캅토에탄올 (b-ME), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 트리스(3-히드록시프로필)포스핀 (THPP), 디티오에리트리톨 (DTE) 및 디티오부틸아민 (DTBA)으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 환원제는 디티오트레이톨 (DTT)이다.

일부 실시양태에서, DTT는 1 mM 초과 및 최대 약 200 mM인 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 2.5 mM 내지 100 mM의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 5 mM 내지 50 mM의 최종 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, DTT는 1 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 2 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 3 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 4 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 5 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 6 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 7 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 8 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 9 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 10 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 11 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 12 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 13 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 14 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 15 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 16 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 17 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 18 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 19 mM 또는 그 초과의 최종 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, DTT는 약 20 mM의 최종 농도로 존재한다.

일부 실시양태에서, 변성 완충액은 2 M의 GSCN 또는 그 초과, 및 DTT를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 3 M의 GSCN 또는 그 초과, 및 DTT를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 4 M의 GSCN 또는 그 초과, 및 DTT를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 약 5 M의 GSCN 또는 그 초과, 및 DTT를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 약 6 M의 GSCN 또는 그 초과, 및 DTT를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 약 7 M의 GSCN 또는 그 초과, 및 DTT를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 약 8 M의 GSCN 또는 그 초과, 및 DTT를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 약 9 M의 GSCN 또는 그 초과, 및 DTT를 포함한다.

일부 실시양태에서, 변성 완충액은 1 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 2 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 3 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 4 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 5 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 6 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 7 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 8 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 9 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변성 완충액은 10 mM의 DTT 또는 그 초과, 및 약 5 M의 GSCN 농도를 포함한다.

단백질 변성은 환원제의 존재 또는 부재 시에 저농도의 변성 시약으로도 발생할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제공된 바와 같은 변성 용액 중의 고농도의 GSCN과 고농도의 DTT와의 조합은 놀랍고 예상치 못한 것인데, 그 이유는 예를 들면 그것이 고도의 무질서유발(chaotropic) 용액이기 때문이다. 예상외로, 본 발명의 방법에 따른 불순물 함유 mRNA의 침전을 위해 사용되는 경우 그러한 조합은, 놀랍게도 순수하고 단백질 오염물이 실질적으로 없는 mRNA를 제공한다. 본 발명의 방법에 따른 완충액 중에서 침전된 mRNA는 필터를 통해 처리될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 침전에 이어, 약 5 M의 GSCN 및 약 10 mM의 DTT를 포함하는 완충액을 사용하는 여과 후에 용리액은 놀랍게도, 검출가능한 단백질 불순물 없이 고품질이고 고순도를 갖는다. 부가적으로, 상기 방법은, 필터를 통과하는 유체의 유동에서 장애를 일으키지 않으면서, 폭넓은 범위의 mRNA의 처리량에서, 약 1 그램, 또는 약 10 그램, 또는 약 100 그램, 또는 약 500 그램, 또는 약 1000 그램의 mRNA 및 그 초과를 포함하는 규모로 재현가능하다.

일부 실시양태에서, 침전 단계를 위한 완충액은 알콜을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 침전은, mRNA, 변성 완충액 (GSCN 및 환원제, 예를 들어 DTT를 포함함) 및 알콜이 1: (5): (3)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 침전은, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (3.5): (2.1)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 침전은, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (4): (2)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 침전은, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (2.8): (1.9)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 침전은, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (2.3): (1.7)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다. 일부 실시양태에서, 침전은, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (2.1): (1.5)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행된다.

일부 실시양태에서, 상당량의 mRNA의 침전을 가능하게 하는 목적하는 온도에서 소정 기간 동안 본원에 기재된 1종 이상의 변성 시약과 함께 순수하지 않은 제제를 인큐베이션하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 순수하지 않은 제제와 변성제의 혼합물은 실온 또는 주위 온도에서 소정 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 인큐베이션 시간은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 60분 또는 그 초과의 기간이다. 일부 실시양태에서, 적합한 인큐베이션 시간은 약 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5분 또는 그 미만의 기간이다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 실온에서 약 5분 동안 인큐베이션된다. 전형적으로, "실온" 또는 "주위 온도"란, 약 20-25℃의 범위의 온도, 예를 들어 약 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃ 또는 25℃를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 순수하지 않은 제제와 변성제의 혼합물은 또한 실온 초과에서 (예를 들어, 약 30-37℃, 또는 특히 약 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃ 또는 37℃에서) 또는 실온 미만에서 (예를 들어, 약 15-20℃, 또는 특히 약 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃ 또는 20℃에서) 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 기간은 인큐베이션 온도에 기반하여 조절될 수 있다. 전형적으로, 보다 높은 인큐베이션 온도는 보다 짧은 인큐베이션 시간을 필요로 한다.

대안적으로 또는 부가적으로, mRNA 침전을 용이하게 하기 위해 용매가 사용될 수 있다. 적합한 예시적인 용매는 이소프로필 알콜, 아세톤, 메틸 에틸 케톤, 메틸 이소부틸 케톤, 에탄올, 메탄올, 데나토늄, 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 용매 (예를 들어, 무수 에탄올)는, mRNA 침전을 추가로 증진 및/또는 촉진시키기 위해 본원에 기재된 바와 같은 변성 시약의 첨가 및 인큐베이션 후에 또는 변성 시약과 함께 순수하지 않은 제제에 첨가될 수 있다. 전형적으로, 적합한 용매 (예를 들어, 무수 에탄올)의 첨가 후에, 혼합물은 실온에서 추가의 기간 동안 인큐베이션될 수 있다. 전형적으로, 적합한 기간의 인큐베이션 시간은 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 또는 60분 또는 그 초과이다. 일부 실시양태에서, 적합한 인큐베이션 기간은 약 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6 또는 5분 또는 그 미만의 기간이다. 전형적으로, 혼합물은 실온에서 약 5분 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션 시간의 적절한 조절과 함께 실온 초과 또는 그 미만의 온도가 사용될 수 있다. 대안적으로, 인큐베이션은 침전을 위해 4℃ 또는 -20℃에서 발생할 수 있다.

mRNA 회수

침전의 결과로서, 침전된 mRNA 및 다양한 오염물을 함유하는 현탁액이 형성된다. 일부 실시양태에서, 현탁 혼합물에 대해 mRNA의 분리 및 회수를 위한 여과를 수행한다. 일부 실시양태에서, 침전 후 오염물로부터의 mRNA의 분리를 위해 접선 유동 여과 (TFF)가 사용된다. mRNA 정제를 위한 TFF에 대한 추가의 교시내용은, 본 출원인에 의한 관련 출원인 2015년 9월 14일자로 출원된 USSN 14/775,915 (이는 2018년 5월 1일자로 미국 특허 9,957,499로서 허여됨, 발명의 명칭: "METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA"); 또는 2015년 4월 24일자로 출원된 USSN 14/696,140 (이는 2017년 12월 26일자로 미국 특허 9,850,269로서 허여됨, 발명의 명칭: "METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA"), 또는 USSN 14/696,140의 계속 출원으로서의 2017년 12월 4일자로 출원된 USSN 15/831,252로부터 수득될 수 있으며, 이들의 각각의 대상은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 침전된 mRNA 및 오염물에 대해 정상 유동 여과(normal flow filtration)를 수행한다. mRNA 정제를 위한 정상 유동 여과 (NFF)에 대한 추가의 교시내용은 본 출원인에 의한 관련 출원인 2018년 8월 24일자로 출원된 US 62/722,674로부터 수독될 수 있으며, 이는 그 전문이 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, mRNA는 원심분리에 의해 회수된다. 추가의 교시내용은 본 출원인에 의한 관련 출원인 2018년 2월 27일자로 출원된 USSN 15/907,086 (발명의 명칭: "METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA"); 2018년 2월 27일자로 출원된 USSN 15/906,864 (발명의 명칭: "METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA") (이는 누체 필터를 사용하는 정제 방법을 포괄함); 또는 2018년 2월 27일자로 출원된 USSN 15/907,163 (발명의 명칭: "LARGE SCALE SYNTHESIS OF MESSENGER RNA")로부터 수득될 수 있으며, 이들의 각각의 대상은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 일부 실시양태에서, 선행하는 섹션에 기재된 바와 같은 침전된 mRNA에 대해 크로마토그래피 분리, 또는 순수한 mRNA의 회수에 대한 관련 기술분야의 임의의 다른 공지된 방법을 수행한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 상당량의 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 적어도 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 적어도 80%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 90%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 91%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 92%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 93%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 94%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 95%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 96%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 97%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 98%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 99%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, 순수하지 않은 제제로부터의 실질적으로 100%의 총 mRNA의 침전 및 회수를 발생시킨다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 의해 정제된 mRNA는 본원에 기재된 및 관련 기술분야에 공지된 다양한 검출 방법 (예를 들어, 모세관 전기영동, 겔 전기영동, HPLC 또는 UPLC)에 의해 결정된 전장 mRNA 이외의 불순물을 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만 포함한다. 불순물은 IVT 오염물, 예를 들어 단백질, 효소, 자유 뉴클레오티드 및/또는 "짧은 미완성 전사체" (쇼트머(shortmer))를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "쇼트머"란, 전장 미만인 임의의 전사체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "쇼트머" 또는 "미완성 전사체"는 길이가 100개 미만의 뉴클레오티드, 길이가 90개 미만, 80개 미만, 70개 미만, 60개 미만, 50개 미만, 40개 미만, 30개 미만, 20개 미만, 또는 10개 미만의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 쇼트머는 5'-캡 및/또는 3'-폴리 A 테일을 첨가한 후에 검출 또는 정량화된다.

무엇보다도, 본원에 기재된 정제 방법은 치료 용도를 위한 mRNA를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 특징분석 기술에 의해 결정된 정제된 mRNA의 순도 및/또는 완전성은 뱃치 방출 기준으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제작 공정에서의 mRNA의 뱃치 생산의 방출 기준은 다음 중 하나 이상의 모세관 전기영동 결정을 포함한다: 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하거나, 또는 단백질 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 짧은 미완성 RNA 오염물을 포함하거나, 또는 짧은 미완성 RNA 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 염 오염물을 포함하거나, 또는 염 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 완전성을 포함함.

일부 실시양태에서, 제작 공정에서의 mRNA의 뱃치 생산의 방출 기준은 다음 중 하나 이상의 HPLC 결정을 포함한다: 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 단백질 오염물을 포함하거나, 또는 단백질 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 짧은 미완성 RNA 오염물을 포함하거나, 또는 짧은 미완성 RNA 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하의 염 오염물을 포함하거나, 또는 염 오염물이 실질적으로 없음; 정제된 mRNA는 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상의 완전성을 포함함.

부가적으로, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 고수율을 생성한다. 예를 들어, 총 정제된 mRNA는 적어도 약 70%, 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 수율을 생성하는 양으로 회수된다.

본 발명에 따라, mRNA는 대규모로 정제될 수 있다. 예를 들어, 적어도 0.5 그램, 1 그램, 5 그램, 10 그램, 15 그램, 20 그램, 35 그램, 40 그램, 45 그램, 50 그램, 60 그램, 70 그램, 80 그램, 90 그램, 100 그램, 200 그램, 300 그램, 400 그램, 500 그램, 1 킬로그램, 10 킬로그램, 50 킬로그램, 100 킬로그램의 mRNA가 단일 뱃치에서 정제될 수 있다.

mRNA 치료 조성물

본 발명에 따라 정제된 mRNA는 네이키드 mRNA (패키징되지 않음)로서 또는 운반 비히클을 통해 운반될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "운반 비히클", "전달 비히클", "나노입자" 또는 문법적 동의어는 상호교환적으로 사용된다.

운반 비히클은 1종 이상의 추가의 핵산, 담체, 표적화 리간드 또는 안정화 시약과 조합하여, 또는 약리학적 조성물로 (적합한 부형제와 혼합되는 경우) 제형화될 수 있다. 약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA.] 최신판에서 찾아볼 수 있다. 특정 운반 비히클은 표적 세포로의 핵산의 형질감염을 용이하게 하는 능력에 기반하여 선택된다.

다양한 실시양태에 따라, 적합한 운반 비히클은 중합체 기반 담체, 예컨대 폴리에틸렌이민 (PEI), 지질 나노입자 (LNP) 및 리포좀, 나노리포좀, 세라마이드-함유 나노리포좀, 프로테오리포좀, 천연 및 합성-유래의 엑소좀 둘 모두, 천연, 합성 및 반합성 층판체(lamellar body), 나노미립자, 칼슘 인광체-실리케이트 나노미립자, 인산칼슘 나노미립자, 이산화규소 나노미립자, 나노결정질 미립자, 반도체 나노미립자, 폴리(D-아르기닌), 졸-겔, 나노덴드리머, 전분-기반 운반 시스템, 미셀, 에멀젼, 니오좀, 다중-도메인-블록 중합체 (비닐 중합체, 폴리프로필 아크릴산 중합체, 동적 폴리컨쥬게이트(polyconjugate)), 건조 분말 제형, 플라스미드, 바이러스, 인산칼슘 뉴클레오티드, 아프타머(aptamer), 펩티드 및 기타 벡터 태그(vectorial tag)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 적합한 운반 비히클은 리포좀 운반 비히클, 예를 들어 지질 나노입자 (LNP) 또는 리포좀이다. 일부 실시양태에서, 리포좀은 1종 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리포좀은 1종 이상의 양이온성 지질, 1종 이상의 비-양이온성 지질, 및 1종 이상의 PEG-변형된 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포좀은 적어도 1종 이상의 PEG-변형된 지질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포좀은 4종 이하의 별개의 지질 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리포좀은 3종 이하의 별개의 지질 성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종의 별개의 지질 성분은 스테롤-기반 양이온성 지질이다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "양이온성 지질"이란, 선택된 pH, 예컨대 생리학적 pH에서 순(net) 양전하를 갖는 여러 지질 및 리피도이드 종 중 임의의 것을 지칭한다. 몇몇 양이온성 지질은 문헌에 기재되어 있으며, 이들 중 다수는 상업적으로 입수가능하다.

일부 실시양태에서 mRNA는 세포내 단백질 또는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 사이토졸 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 액틴 세포골격과 연관된 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 원형질막과 연관된 단백질을 코딩한다. 일부 특정 실시양태에서, mRNA는 막횡단 단백질을 코딩한다. 일부 특정 실시양태에서 mRNA는 이온 채널 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 핵주위 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 핵 단백질을 코딩한다. 일부 특정 실시양태에서, mRNA는 전사 인자를 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 샤페론 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 세포내 효소를 코딩한다 (예를 들어, 우레아 사이클 또는 리소좀 저장 대사 장애와 연관된 효소를 코딩하는 mRNA). 일부 실시양태에서, mRNA는 세포 대사, DNA 복구, 전사 및/또는 번역에 관여하는 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 세포외 단백질 또는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 세포외 매트릭스와 연관된 단백질 또는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서 mRNA는 분비 단백질 또는 펩티드를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용된 mRNA는, 1개 이상의 표적 세포에 의해 배설 또는 분비된 기능성 펩티드, 단백질 또는 효소를 주변의 세포외 유체로 발현하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 신경전달물질 및/또는 호르몬을 코딩하는 mRNA). 일부 실시양태에서 mRNA는 백신 목적을 위해 면역원성 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서 mRNA는 항체 또는 그의 단편을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 대사 단백질을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 효소를 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 수용체 단백질 또는 펩티드를 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 항원을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 암 연관 항원을 코딩한다. 일부 실시양태에서, mRNA는 백신을 코딩한다.

비제한적인 예로서, mRNA는 단백질 또는 펩티드, 예컨대 ABC7, ABCB3, ABCB7, ABCC7, ABCD1, AKT; AKT2, AKT3, ATF4, ALAS2, 알파 갈락토시다제, 알파-1 프로테아제 억제제, APA, APC; APOA1, APOA1-밀라노(Milano), APOE, 항-트립신 알파 1, 아르기노숙시네이트 신타제, ASAT; ATM; ATP7B, ATR; 아트로핀-1; ATX3; Atxn10; ATXN2; Atxn7; ATXNl; Bax; Bcl2; BRCA1; BRCA2; 카르바밀포스페이트 신타제, CASP8, CBP (Creb-BP); CDKN2a; CFTR, CREB1, CVAP, CYP1Bl, DBA, DMD, DMPK; EGFR, EIF2B1, EIF2BA, EIF2B2, EIF2B3, EIF2B5, EIF2B4; ERBB2; ERBB3; ERBB4; 에리트로포이에틴, 인자 IX, 인자 V; 인자 VII, 인자 VII; 인자 VIII; 인자 VIIIa 경쇄, 인자 X; 인자 XI (F11); 인자 XII 결핍 (F12, HAF); 인자 XIIIA (F13Al, F13A); 인자 XIIIB (F13B); FBN1, FGF 수용체 부류 구성원; FHL3; FKRP, FXN/X25; FXR1, G6PC, G6PT, GAA, 갈락토스-1-포스페이트 우리딜릴트랜스퍼라제, GLUT2, H1Fla; HBA1; HBB; HBA2, HBB, HBD, 헤파란 N-술파타제, HIF; HIF3a; HLH3, HPLH2, HPLH3, 헌팅틴(Huntingtin), IDH2; IDH1, IGF 수용체; IGF; IGF1R, Igf2 수용체; Igf2; Igfl 수용체; Igfl; ITGB2, KIAA1596; Kras; LCRB, 메틸말로닐-CoA 뮤타제, MRP7, MUNC13-4, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제, NOS3, NPC1, OTC (오르니틴 트랜스카르바밀라제), PAH, PKHD1, PKD1, PKD2, PKD4, PKLR, PKU1, PPAR 감마; PPAR알파; PRF1, PSEN2, PSF2, PTEN; RB, 레티노스키신(Retinoschisin); RING11, SBMA/SMAXl/AR; SEC63, SERPINA1, SERPINA2, SERPINA3, SERPINA5, SERPINA6, SFTPA1, SFTPB, SFTPC, SFTPD, SLC2A, SLC7A9, SMPD1, SPTB, TAP2, TAPBP, TPSN, UNC13D, VEGF-a, VEGF-b, VEGF-c, VLDLR; 및 WT1을 코딩한다.

따라서, 특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 폐 또는 폐 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체에서 결핍되거나 비-기능성일 수 있는 내재성 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체에서 결핍되거나 비-기능성일 수 있는 내재성 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 폐 또는 폐 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 낭포성 섬유증 막횡단 전도 조절인자 CFTR을 코딩하는 mRNA의 제작 방법에서 유용하다. CFTR mRNA는 낭포성 섬유증의 치료를 위한 치료 조성물이 필요한 대상체의 폐로 운반된다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 간 또는 간 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 이러한 펩티드 및 폴리펩티드는, 우레아 사이클 장애와 연관된 것들, 리소좀 저장 장애와 연관된 것들, 글리코겐 저장 장애와 연관된 것들, 아미노산 대사 장애와 연관된 것들, 지질 대사 또는 섬유증성 장애와 연관된 것들, 메틸말론산혈증과 연관된 것들, 또는 풍부화된 전장 mRNA를 사용한 간 또는 간 세포의 치료 또는 그로의 운반이 치료 유익을 제공하는 임의의 다른 대사 장애와 연관된 것들을 포함할 수 있다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 우레아 사이클 장애와 연관된 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 (OTC) 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 아르기노숙시네이트 신테타제 1 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 카르바모일 포스페이트 신테타제 I 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 아르기노숙시네이트 리아제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 아르기나제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 리소좀 저장 장애와 연관된 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 알파 갈락토시다제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 글루코세레브로시다제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 이두로네이트-2-술파타제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 이두로니다제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 헤파란 N-술파타제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 갈락토사민-6 술파타제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 베타-갈락토시다제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 리소좀 리파제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 아릴술파타제 B (N-아세틸갈락토사민-4-술파타제) 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 전사 인자 EB (TFEB)를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 글리코겐 저장 장애와 연관된 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 산 알파-글루코시다제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 글루코스-6-포스파타제 (G6PC) 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 간 글리코겐 포스포릴라제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 근육 포스포글리세레이트 뮤타제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 글리코겐 탈분지화(debranching) 효소를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 아미노산 대사와 연관된 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 페닐알라닌 히드록실라제 효소를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 글루타릴-CoA 데하이드로게나제 효소를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 프로피오닐-CoA 카복실라제 효소를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 옥살라제 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 효소를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 지질 대사 또는 섬유증성 장애와 연관된 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, mTOR 억제제를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, ATPase 인지질 수송 8B1 (ATP8B1) 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 1종 이상의 NF-카파 B 억제제, 예컨대 I-카파 B 알파, 인터페론-관련 발달 조절인자 1 (IFRD1), 및 시르투인 1 (SIRT1) 중 1종 이상을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, PPAR-감마 단백질 또는 활성 변이체를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 메틸말론산혈증과 연관된 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 본 발명은, 메틸말로닐 CoA 뮤타제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 메틸말로닐 CoA 에피머라제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 간의 치료 또는 그로의 운반이 치료 유익을 제공할 수 있는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, ATP7B 단백질 (윌슨병(Wilson disease) 단백질이라고도 공지됨)을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 포르포빌리노겐 데아미나제 효소를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 1종 이상의 응고 효소, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII 및 인자 X를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인간 혈색소침착증 (HFE) 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 심혈관 질환 또는 심혈관 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 혈관 내피 성장 인자 A 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 릴렉신 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 골 형성 단백질-9 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 골 형성 단백질-2 수용체 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 근육 또는 근육 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 디스트로핀 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 프라탁신 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 심장 근육 또는 심장 근육 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 근육 조직 또는 근육 세포 내의 칼륨 채널 및 나트륨 채널 중 하나 또는 둘 모두를 조정하는 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 근육 조직 또는 근육 세포 내의 Kv7.1 채널을 조정하는 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 근육 조직 또는 근육 세포 내의 Nav1.5 채널을 조정하는 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 신경계 또는 신경계 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 본 발명은, 생존 운동 신경 1 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 본 발명은, 생존 운동 신경 2 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 프라탁신 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, ATP 결합 카세트 하위부류 D 구성원 1 (ABCD1) 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, CLN3 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 혈액 또는 골수 또는 혈액 또는 골수 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 베타 글로빈 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 브루톤 티로신 키나제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 1종 이상의 응고 효소, 예컨대 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII 및 인자 X를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 신장 또는 신장 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 콜라겐 타입 IV 알파 5 쇄 (COL4A5) 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 눈 또는 눈 세포의 치료 또는 그로의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, ATP-결합 카세트 하위부류 A 구성원 4 (ABCA4) 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 레티노스키신 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 망막 색소 상피-특이적 65 kDa (RPE65) 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 290 kDa의 중심체 단백질 (CEP290)을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체 또는 대상체의 세포에 대한 백신을 사용한 치료 또는 그의 운반에서 사용되는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 본 발명은, 바이러스와 같은 감염제로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 호흡기 세포융합 바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 광견병 바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 사이토메갈로바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 로타바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 간염 바이러스, 예컨대 간염 A 바이러스, 간염 B 바이러스 또는 간염 C 바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인간 유두종바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 단순 포진 바이러스, 예컨대 단순 포진 바이러스 1 또는 단순 포진 바이러스 2로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인간 면역결핍 바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 타입 1 또는 인간 면역결핍 바이러스 타입 2로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인간 메타뉴모바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인간 파라인플루엔자 바이러스, 예컨대 인간 파라인플루엔자 바이러스 타입 1, 인간 파라인플루엔자 바이러스 타입 2, 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스 타입 3으로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 말라리아 바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 지카 바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 치쿤구니아 바이러스로부터의 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체의 암 세포로부터 식별되거나 또는 대상체의 암과 연관된 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 대상체 자신의 암 세포로부터 결정된 항원을 코딩하는 (즉, 개인 맞춤형 암 백신을 제공하기 위한) 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 돌연변이 KRAS 유전자로부터 발현된 항원을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 항체를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 융합 단백질의 일부일 수 있다. 특정 실시양태에서 본 발명은, OX40에 대한 항체를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, VEGF에 대한 항체를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 조직 괴사 인자 알파에 대한 항체를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, CD3에 대한 항체를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, CD19에 대한 항체를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 면역조정제를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인터루킨 12를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인터루킨 23을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인터루킨 36 감마를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 인터페론 유전자 (STING) 단백질의 1종 이상의 자극제의 구성적 활성 변이체를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 엔도뉴클레아제를 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 단백질, 예컨대 Cas 9 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 메가뉴클레아제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 전사 활성인자-유사 이펙터 뉴클레아제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서 본 발명은, 아연 핑거 뉴클레아제 단백질을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서 본 발명은, 안구 질환의 치료를 위해 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 상기 방법은, 레티노스키신을 코딩하는 정제된 mRNA를 포함하는 치료 조성물의 제조를 위해 사용된다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 기재된 측면 또는 실시양태에 의해 제조된 정제된 mRNA 조성물이다.

일부 실시양태에서 본 발명은, 상기 설명의 정제된 mRNA 및 적어도 1종의 제약학상 허용되는 부형제를 포함하는 용액을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

제약학상 허용되는 염은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 문헌 [J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19]에서 제약학상 허용되는 염들을 상세히 기재하고 있다. 본 발명의 화합물의 제약학상 허용되는 염은, 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 제약학상 허용되는 무독성 산 부가염의 예는, 무기 산 (예컨대, 염산, 브로민화수소산, 인산, 황산 및 과염소산)을 사용하거나 또는 유기 산 (예컨대, 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산 또는 말론산)을 사용하거나 또는 관련 기술분야에서 사용된 기타 방법 (예컨대, 이온 교환)을 사용함으로써 형성된 아미노 기의 염이다. 그 밖의 제약학상 허용되는 염은 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 바이술페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 히드로아이오다이드, 2-히드록시-에탄술포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 술페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 팔모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔술포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N⁺(C_1-4 알킬)₄ 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 제약학상 허용되는 염은, 적절한 경우, 반대이온, 예컨대 할라이드, 히드록시드, 카르복실레이트, 술페이트, 포스페이트, 니트레이트, 술포네이트 및 아릴 술포네이트를 사용하여 형성된 무독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다. 추가의 제약학상 허용되는 염은, 4급화된 알킬화 아미노 염을 형성하도록 적절한 친전자체 (예를 들어, 알킬 할라이드)를 사용하는 아민의 4급화로부터 형성된 염을 포함한다.

본 발명의 일 측면은, 질환 또는 장애의 치료가 필요한 대상체에게 상기 측면의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 질환 또는 장애의 치료 방법이다.

본 발명의 또 다른 측면은, 상기 기재된 측면 또는 실시양태에 의해 제조된 정제된 mRNA를 포함하는 용액이다.

본원에 기재된 임의의 측면 또는 실시양태는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 다른 측면 또는 실시양태와 조합될 수 있다. 개시내용은 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 설명은 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 개시내용의 범주를 예시하도록 의도되며 제한하도록 의도되지 않는다. 다른 측면, 이점 및 변형이 하기 청구범위의 범주 내에 있다.

본 발명에 관련된 추가의 교시내용은 WO 2010/053572; WO 2011/068810; WO 2012/075040; WO 2012/170889; WO 2012/170930; WO 2013/063468; WO 2013/149140; WO 2013/149141; WO 2013/185067; WO 2013/185069; WO 2014/089486; WO 2014/152513; WO 2014/152659; WO 2014/152673; WO 2014/152774; WO 2014/152966; WO 2014/153052; WO 2015/061461; WO 2015/061467; WO 2015/061491; WO 2015/061500; WO 2015/148247; WO 2015/164773; WO 2015/184256; WO 2015/200465; WO 2016/004318; WO 2016/149508; WO/2014/152940; PCT/US16/57044; US 62/320,073; US 62/349,331; US 62/420,413; US 62/420,421; US 62/420,428; US 62/420,435; US 62/421,007; US 62/421,021 중 하나 이상에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료를 하기에 기재한다. 본원에 언급된 모든 공개물, 특허 출원, 특허, 및 기타 참고자료는 그 전문이 참조로 포함된다. 본원에 인용된 참고자료는 청구된 발명에 대한 선행 기술인 것으로 인정되지 않는다. 또한, 재료, 방법 및 예는 단지 예시이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

<실시예>

실시예 1. 5 M GSCN 침전 완충액을 사용하는 개선된 mRNA 정제

본 실시예에서는, 5 M GSCN 침전 완충액을 칼럼 여과 포맷을 사용하여 밀리그램 규모에서 공정 효소를 제거하는 능력에 대해 4 M GSCN을 갖는 완충액과 비교하였다. 단일 침전 단계에 이어 여과 후 수득된 정제 생성물은, 은 염색 겔 분석에 의해 결정 시, 감소된 또는 검출불가능한 단백질 오염물을 갖는 것이 바람직하다.

재료 및 방법

CFTR mRNA를 다른 부분에 기재된 바와 같이 시험관내 전사에 의해 제조하였다. 요컨대, 코돈 최적화된 CFTR 서열을 포함하는 선형 또는 원형 DNA 주형으로 예시적인 IVT 반응을 수행하였으며, 상기 주형 DNA는 또한, 프로모터, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트들의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함하는 완충액 시스템, 및 적절한 RNA 폴리머라제 (예를 들어, T3, T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제), DNAse I, 피로포스파타제, 및/또는 RNAse 억제제를 함유한다.

5'-캡 및 3' 폴리 A 테일의 혼입을 수반하는 반응 (캡-테일 반응)을 정제 직전에 수행하였다. 5' 캡은 다음과 같이 첨가되었다: 먼저 반응에 말단 포스파타제를 첨가 (여기서, RNA 말단 포스파타제가 5' 뉴클레오티드로부터 말단 포스페이트 기들 중 1개를 제거하여 2개의 말단 포스페이트를 남김)한 다음; 말단 포스페이트에 구아닐릴 트랜스퍼라제를 통해 구아노신 트리포스페이트 (GTP)를 첨가하여 5'-5' 트리포스페이트 연결부를 생성하고; 이어서 메틸트랜스퍼라제에 의해 구아닌의 7-질소를 메틸화시켰음. 폴리 (A) 폴리머라제를 사용하여 폴리 (A) 테일을 혼입하기 위해 구축물을 추가로 처리하였다. 그런 다음, mRNA를 포함하는 반응 혼합물에 대해 하기 기재된 바와 같은 침전 및 후속 단계들을 수행하였다. 표 1에는, 본 실시예에 기재된 방법 단계들에서 사용된 재료들이 요약되어 있다.

표 1

침전: 2.5 mg의 CFTR mRNA 캡-테일 반응을 상기 열거된 침전 완충액들 (4 M GSCN 대조군, 5 M GSCN 1% 또는 5 M GSCN 0.1% N-라우릴 사르코신) 중 하나를 사용하여 다음 조건 하에 침전시켰다: 1 부피의 mRNA 반응을 2.3 부피의 침전 완충액과 혼합하고, 철저히 혼합하였음. 1 부피의 초기 캡 테일 반응마다 1.7 부피의 100% EtOH를 RNA:침전 완충액에 첨가하고, 철저히 혼합하여 침전시켰다.

여과: 침전된 혼합물을 맥시프렙(maxiprep) 여과 칼럼 (퀴아젠(Qiagen, 미국 메릴랜드주 제르맨타운)) 상으로 로딩하고, 원심분리하여 퀴아젠 필터 상으로 침전된 mRNA를 포획하였다 (모든 원심분리는 3,600 RPM에서 수행되었음). 이어서, 포획된 mRNA 침전물을, 제1 세척 후 2분의 원심분리 및 제2 세척 후 10분의 원심분리에 의해 80% EtOH로 2회 세척 (세척 당 RNA 1 mg에 대해 80% EtOH 1 mL)하였다. 막에 물을 첨가하여 용출을 수행한 후 실온에서의 인큐베이션 및 원심분리가 이어졌다. 이 공정을 2.0 mL의 총 용출 부피와 함께 총 5회 반복하였다. 260 nm에서의 흡광도를 측정하고, 각 샘플에 대한 농도를 결정하였다.

은 염색: 선행하는 실시예에 기재된 방법을 사용하여 은 염색 겔을 가동하였다. 1 mg/ml의 정제된 RNA 15.5 μl를 37℃에서 30분 동안 4 μl의 RNaseI (100 U/mL, 인비트로젠(Invitrogen))로 처리하였다. 환원 시약이 있는 인비트로젠 LDS 로딩 완충액 중에서 샘플을 제조하였고, 이를 10% Bis-Tris 겔 상에 로딩하였다. 200 V에서 35분 동안 전기영동을 수행하였다. 겔은 실버퀘스트(SilverQuest) 염색 키트를 사용하여 8분 동안 염색되었다.

결과

상기 기재된 바와 같은 CFTR mRNA 캡 테일 반응의 단일 정제 사이클 후, 각 샘플에 대한 수율을 나노-드롭(Nano-Drop)을 사용하여 계산하여 농도 (A260 nm)를 결정하였고, 이를 표 2 (하기)에 요약하였다. mRNA 수율 = 용출 농도 (mg/mL) * 용출 부피 (mL). 모든 조건으로부터의 수율이 허용가능하였으며, 반응 규모에 기반하여 목적하는 수율의 범위 내에 있었다.

표 2

샘플을 은 염색 겔 검정으로 분석하여 잔여 공정 효소를 검출하였다. 은 염색된 겔 이미지는 도 1에 제시되어 있다. 4 M GSCN 완충액 (도 1, 겔 1의 레인 5)을 사용하여 침전된 샘플과 비교할 때, 5 M GSCN-1% 라우릴 사르코신 완충액 (도 1, 겔 2의 레인 6), 또는 5 M GSCN-0.1% 라우릴 사르코신 완충액 (도 1, 겔 2의 레인 8)을 사용하여 침전된 샘플에 대해, 공정 효소 제거에서의 유의한 개선이 인지되었다. 이들 데이터로부터, GSCN 몰농도가 증가하면, 완충액 중의 계면활성제의 농도에 상관없이, 공정 효소 제거가 개선된 것으로 밝혀졌다.

실시예 2. DTT를 함유하는 5 M GSCN 침전 완충액을 사용하는 개선된 mRNA 정제

본 실시예에서는, 디티오트레이톨 (DTT)이 있는 침전 완충액과 디티오트레이톨 (DTT)이 없는 침전 완충액을, mRNA 제조/제작 공정과 연관된 잔여 효소 (즉, 공정 효소)를 제거하는 능력, 및 그의 적절한 제거를 보장하기 위해 필요한 침전의 수를 줄이는 능력에 대해 비교하였다. mRNA 정제는 다중-웰 마이크로플레이트 포맷을 사용하는 여과에 의해 밀리그램 규모로 수행되었다.

재료 및 방법

CFTR mRNA를 상기 기재된 바와 같이 시험관내 전사에 의해 제조하였다. mRNA 캡-테일 반응에 대해 하기 기재된 방법을 사용하는 정제를 수행하였다. 표 3에는, 본 실시예에 기재된 방법 단계들에서 사용된 재료들이 요약되어 있다.

표 3

침전: 24-웰 플레이트의 각 웰에 대해, 2.0 mg의 mRNA 캡-테일 (C/T) 반응을 상기 열거된 침전 완충액들 (5 M GSCN, 또는 10 mM DTT가 있는 5 M GSCN) 중 하나를 사용하여 다음 조건 하에 침전시켰다: 1 부피의 mRNA 반응을 2.3 부피의 침전 완충액에 첨가하고, 철저히 혼합하였음. 1 부피의 초기 캡-테일 반응마다, 1.7 부피의 100% EtOH를 RNA:침전 완충액에 첨가하고, 철저히 혼합하여 침전시켰다.

여과: 침전된 혼합물을 24-웰 필터 플레이트의 개별 웰 내로 로딩하였고, 플레이트에 약 5 PSI의 진공압을 가하여, 침전된 mRNA를 포획하였다. 이어서, 포획된 mRNA 침전물을 제1 및 제2 세척 후 5 PSI 진공 여과에 의해 80% EtOH를 사용하여 2회 세척하였다 (세척 당 RNA 1 mg에 대해 80% EtOH 1 mL). 막에 물을 첨가여 용출을 수행한 후 실온에서의 인큐베이션 및 진공 여과가 이어졌다. 이 공정을 웰 당 2.0 mL의 총 용출 부피로 총 5회 반복하였다. 260 nm에서의 흡광도를 측정하고, 각 샘플에 대한 농도를 결정하였다.

은 염색: 제조업자의 지침서에 따라 인비트로젠 키트 (인비트로젠 (미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 사용하여 다음의 사전-염색 샘플 제제들로 은 염색 겔을 가동하였다. 1 mg/ml의 정제된 RNA 15.5 μl를 37℃에서 30분 동안 4 μl의 RNaseI (100 U/mL, 인비트로젠)로 처리하였다. 환원 시약이 있는 인비트로젠 LDS 로딩 완충액 중에서 샘플을 제조하였고, 이를 10% Bis-Tris 겔 상에 로딩하였다. 200 V에서 35분 동안 전기영동을 수행하였다. 겔은 실버퀘스트 은 염색 키트 (인비트로젠 (미국 캘리포니아주 칼즈배드))를 사용하여 8분 동안 염색되었다.

결과

상기 기재된 바와 같은 CFTR mRNA 캡-테일 반응의 단일 정제 후, 각 샘플에 대한 총 수율을 나노-드롭 분광광도계 (나노 드롭 테크놀로지스(Nano Drop Technologies, 미국 델라웨어주 윌밍톤))를 사용하는 mRNA 용출의 광학 밀도를 측정한 후 계산하여 mRNA 농도 (A260 nm)를 결정하였다. mRNA 수율 = 용출 농도 (mg/mL) * 용출 부피 (mL). 결과는 하기 표 4에 요약되어 있다. 표 4에는, 반응 규모에 대해 DTT 완충액-기반 프로토콜로부터의 목적하는 수율이 명시되어 있다.

표 4

샘플을 선행하는 단락에 기재된 바와 같이 은 염색 검정으로 분석하여 은 잔여 공정 효소를 검출하였다. 은 염색된 겔 이미지는 도 2에 제시되어 있다. 겔 1의 레인 6 (도 2, 좌측 이미지)은, DTT가 없는 5 M GSCN을 사용하여 정제된 샘플에 해당된다. 겔 2의 레인 6 (도 2, 우측 이미지)은, 10 mM DTT가 있는 5 M GSCN을 사용하여 정제된 샘플에 해당된다. 단독의 5 M GSCN과 비교할 때, 10 mM DTT 완충액이 있는 5 M GSCN을 사용하여 침전된 샘플의 경우 (겔 1 레인 6과 겔 2 레인 6 비교), 공정 효소의 제거에서 유의한 개선이 인지되었다. 겔 1 또는 겔 2 내의 레인 1은 오염물 효소의 흐릿한 밴드를 보이는 대조군 샘플을 나타낸다. 각 겔 내의 레인 10-12는 각각, 공정 효소 RNAse1 (레인 10), SP6 (레인 11), 구아닐레이트 트랜스퍼라제 (레인 12)의 전기영동 이동 대조군을 나타낸다.

실시예 3. GSCN-DTT 침전 완충액을 사용하는, 1 그램의 캡핑 및 테일링된 mRNA의 정제

본 실시예에서는, 그램-규모의 mRNA 제작 공정으로부터 검출가능한 수준의 오염물 잔여 효소를 성공적으로 제거하기 위한 GSCN-DTT 완충액의 능력을 평가하였다.

재료 및 방법

mRNA를 1 그램의 뱃치 정제 규모로 처리하였다. CFTR mRNA를 상기에서 기재된 시험관내 전사 방법을 사용하여 합성하였다. 캡핑 및 테일링 반응을 정제 직전에 수행하였다. 표 5에는, 본 실시예에 기재된 공정에서 사용된 재료들이 요약되어 있다.

표 5

침전: 1 그램 (1G)의 CFTR mRNA 캡핑 및 테일링 반응 (캡-테일 반응)을 DTT가 있는 5 M GSCN을 사용하여 다음 조건 하에 침전시켰다. 1 부피의 mRNA 반응을 2.3 부피의 침전 완충액에 첨가하고, 철저히 혼합하였다. 1 부피의 초기 캡-테일 반응에 대해, 1.7 부피의 100% EtOH를 mRNA:침전 완충 용액에 첨가하고, 철저히 혼합하여 침전시켰다. 침전 후, 막 오손을 막고 최종 용출에 도움을 주는 여과제 (필터 보조제)로서 작용하도록 10 g의 솔카-플록(Solka-Floc) 100을 첨가하였다.

여과: 여과제가 있는 침전된 혼합물을 1 L의 진공 여과 플라스크 상으로 로딩하였고, 진공을 가하여 침전 완충액에서 침전물을 여과해 냈다. 이어서, 포획된 mRNA 침전물을 80% EtOH로 세척 (RNA 1 g 당 80% EtOH 1 L)한 후, 10분의 진공 건조 단계가 이어졌다. 침전된 mRNA 및 필터 보조제를 제거하고 물 250 mL 중에 현탁시켜 용출을 수행하였다. 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 신선한 0.22 μm PES 필터 플라스크에 통과시켜 필터 보조제를 제거하였다. 260 nm에서의 흡광도를 측정하고, 각 샘플에 대한 농도를 결정하였다.

은 염색: 인비트로젠 키트에 따라 다음의 사전-염색 샘플 제제들로 은 염색 겔을 가동하였다. 1 mg/ml의 RNA 15.5 μl를 37℃에서 30분 동안 4 μl의 RNaseI (100 U/mL, 인비트로젠)로 처리하였다. 환원 시약이 있는 인비트로젠 LDS 로딩 완충액 중에서 샘플을 제조하였고, 이를 궁극적으로 10% Bis-Tris 겔 상에 로딩하였다. 200 V에서 35분 동안 전기영동을 수행하였다. 겔은 실버퀘스트 염색 키트를 사용하여 염색되었고 8분 동안 전개되었다.

결과:

상기 기재된 바와 같은 CFTR mRNA 캡 테일 반응의 한 차례의 정제 후, 샘플 수율을 나노-드롭을 사용하여 계산하여 농도 (A260 nm)를 결정하였고, 이를 표 6 (하기)에 요약하였다. 1G 반응으로부터의 mRNA 수율은 허용가능하였고, 반응 규모에 기반하여 목적하는 수율의 범위 내에 있었다.

표 6

샘플을 은 염색 겔로 분석하여, 공정으로부터의 임의의 잔여 효소의 존재를 검출하였다. 은 염색 겔 이미지는 하기 도 3에 제시되어 있다. 정제된 CFTR mRNA 샘플 (도 3, 레인 5)에서 관찰가능한 잔여 효소가 검출되지 않았다. 공정 효소에 대한 전기영동 이동 대조군은 겔에서 다음과 같이 도시되어 있다: RNAse1 (레인 6), SP6 (레인 7), 구아닐레이트 트랜스퍼라제 (레인 8), 폴리 A 폴리머라제 (레인 9) 및 2-O-메틸 트랜스퍼라제 (레인 10). 이들 결과는, 그램-규모의 캡-테일 mRNA가, 필터 보조제 및 5 M GSCN-10 mM DTT가 있는 1 L 0.22 μm의 진공 필터 플라스크를 사용하여 성공적으로 침전, 포획, 세척 및 회수되었음을 증명한다. 놀랍게도, 단일 정제 단계로, 본 발명자들의 검출 방법의 감도에 기반하여 임의의 검출가능한 수준의 잔여 공정 효소가 제거될 수 있었다.

실시예 4. GSCN-DTT 침전 완충액을 사용하는, 10 그램의 캡핑 및 테일링된 mRNA의 정제

본 실시예에서는, 단일 침전 단계를 수반하고 10 그램의 뱃치 정제 규모로 처리된 mRNA로부터의 검출가능한 수준의 오염물 잔여 효소를 성공적으로 제거하기 위한 GSCN-DTT 완충액의 능력을 평가하였다.

재료 및 방법:

CFTR mRNA를 상기에서 기재된 시험관내 전사 방법을 사용하여 합성하였다. 캡핑 및 테일링 반응을 정제 직전에 수행하였다. 표 7에는, 하기 기재된 공정에서 사용된 재료들이 요약되어 있다.

표 7

침전: 10 그램 (10G)의 CFTR mRNA 캡핑 및 테일링 반응 (캡-테일 반응)을 5 M GSCN w/DTT를 사용하여 다음 조건 하에 침전시켰다. 1 부피의 mRNA 반응을 2.3 부피의 침전 완충액에 첨가하고, 철저히 혼합하였다. 1 부피의 초기 캡-테일 반응에 대해, 1.7 부피의 100% EtOH를 RNA:침전 완충 용액에 첨가하고, 철저히 혼합하여 침전시켰다. 침전 후, 막 오손을 막고 최종 용출에 도움을 주는 여과제로서 작용하도록 20 g의 솔카-플록 100을 첨가하였다.

여과: 여과제가 있는 침전된 혼합물을 1500 RPM에서 2.0 L/분으로 H300P 여과 원심분리기 (헤인켈 유에스에이(Heinkel USA, 미국 뉴저지주 스웨데스버러)) 상에 로딩하였다. 이어서, 포획된 RNA 침전물을 80% EtOH로 세척 (RNA 1 g 당 80% EtOH 5 L)한 후, 15분의 건조 단계가 이어졌다. 침전된 mRNA 및 필터 보조제를 제거하고 물 5 L 중에 현탁시켜 용출을 수행하였다. 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, H300P 여과 원심분리기에 통과시켜 필터 보조제를 제거하였다. 2회의 추가의 5 L 용출을 수행하여, 필터 보조제 케이크로부터 가능한 한 많은 재료를 회수하였다. 260 nm에서의 흡광도를 측정하고, 각 샘플에 대한 농도를 결정하였다.

은 염색: 인비트로젠 키트에 따라 다음의 사전-염색 샘플 제제들로 은 염색 아가로스 겔을 가동하였다. 1 mg/ml의 RNA 15.5 μl를 37℃에서 30분 동안 4 μl의 RNaseI (100 U/mL, 인비트로젠)로 처리하였다. 환원 시약이 있는 인비트로젠 LDS 로딩 완충액 중에서 샘플을 제조하였고, 이를 궁극적으로 10% Bis-Tris 겔 상에 로딩하였다. 200 V에서 35분 동안 전기영동을 수행하였다. 겔은 실버퀘스트 염색 키트를 사용하여 염색되었고 8분 동안 전개되었다.

모세관 전기영동 (CE): CE 단편 분석기 및 대형 RNA 검출 키트를 사용하여 RNA 완전성 및 테일 길이를 평가하였다. 테일 길이에 대한 크기 이동 및 완전성에 대한 피크 프로파일의 분석을 수행하였다.

결과:

상기 기재된 바와 같은 CFTR mRNA 캡 테일 반응의 단일 정제 후, 샘플 수율을 나노-드롭을 사용하여 계산하여 농도 (A260 nm)를 결정하였고, 이를 하기 표 8에 요약하였다. 10 G의 반응으로부터의 최종 mRNA 수율은 양호하였고, 반응 규모에 기반하여 목적하는 수율의 범위 내에 있었다.

표 8

샘플을 은 염색 겔 검정으로 분석하여 잔여 공정 효소를 검출하였다. 은 염색 겔 이미지는 도 4에 나타나 있으며, 이는 정제된 CFTR mRNA 샘플 (레인 4)에서 잔여 공정 효소가 관찰가능하지 않음을 도시한다. 레인 1은, 오염물 효소의 흐릿한 밴드를 보이는 대조군 정제된 mRNA 샘플을 나타낸다. 레인 7-11은 다음과 같은 공정 효소에 대한 전기영동 이동 대조군을 도시한다: RNAse1 (레인 7), SP6 (레인 8), 구아닐레이트 트랜스퍼라제 (레인 9), 폴리 A 폴리머라제 (레인 10) 및 2-O-메틸 트랜스퍼라제 (레인 11).

H300P 및 5 M GSCN w/10 mM DTT를 사용하는 단일 정제 후 RNA 완전성 및 테일 길이는 CE에 의해 평가되었다. 단일 정제 후의 mRNA의 완전성은 도 5A 및 도 5B에 증명되어 있다. 도 5A는 테일링 반응 전의 mRNA 피크를 나타낸다. 도 5B는 동일한 본래의 mRNA 제제의 테일링 반응 후의 mRNA 피크를 나타낸다. 도 5B 내의 CE 전기영동도에 대한 단일의 뚜렷한 피크는 과거 대조군 샘플 (나타내지 않음)과 일치한다. 534 nt의 폴리-A 테일 길이를, 미테일링(untailed) RNA와 비교하여 CE 겔 이동을 기초로 평가하였다 (도 5B 대 도 5A). 테일 길이는 테일링 반응 조건에 기반하여 예측된 테일 크기 이내였다.

실시예로부터, 10 G의 mRNA가, 침전 완충액으로서 5 M GSCN-10 mM DTT를 사용한 H300P 원심분리기를 사용하여 성공적으로 침전, 포획, 세척 및 회수된 것으로 나타났다. 5 M GSCN-10 mM DTT를 사용하는 단일 정제 공정으로, 본 발명자들의 검출 방법의 감도에 기반하여 임의의 검출가능한 수준의 잔여 공정 효소가 제거될 수 있다. 5 M GSCN-10 mM DTT를 사용한 필터 원심분리는 과거 샘플과 비교할 때 mRNA 완전성 또는 테일에 부정적인 영향을 미치지 않았다.

실시예 5. GSCN-DTT 침전 완충액을 사용하는, 100 그램의 캡핑 및 테일링된 mRNA 정제

본 실시예에서는, 단일 침전 단계를 수반하고 100 그램 (100 G)의 뱃치 정제 규모로 처리된 mRNA로부터의 검출가능한 수준의 오염물 잔여 효소를 성공적으로 제거하기 위한 GSCN-DTT 완충액의 능력을 평가하였다.

재료 및 방법:

CFTR mRNA를 상기에서 기재된 시험관내 전사 방법을 사용하여 합성하였다. 캡핑 및 테일링 반응을 정제 직전에 수행하였다. 표 9에는, 하기 기재된 공정에서 사용된 재료들이 요약되어 있다.

표 9

침전: 100 G의 CFTR mRNA 캡-테일 반응을 DTT가 있는 5 M GSCN을 사용하여 다음 조건 하에 침전시켰다. 1 부피의 mRNA 반응을 2.3 부피의 침전 완충액에 첨가하고, 철저히 혼합하였다. 1 부피의 초기 캡-테일 반응에 대해, 1.7 부피의 100% EtOH를 RNA:침전 완충 용액에 첨가하고, 철저히 혼합하여 침전시켰다. 침전 후, 막 오손을 막고 최종 용출에 도움을 주는 여과제로서 작용하도록 1200 g의 솔카-플록 100을 첨가하였다.

여과: 여과제가 있는 침전된 혼합물을 1000 RPM에서 6.0 L/분으로 EHBL503 여과 원심분리기 (루슬레 로바텔(Rousselet Robatel, 프랑스 아노네)) 상에 로딩하였다. 이어서, 포획된 RNA 침전물을 80% EtOH로 세척 (RNA 1 g 당 80% EtOH 1.5 L)한 후, 20분의 건조 단계가 이어졌다. 침전된 mRNA 및 필터 보조제를 제거하고 물 25 L 중에 현탁시켜 용출을 수행하였다. 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, EHBL503 여과 원심분리기에 통과시켜 필터 보조제를 제거하였다. 2회의 추가의 15 L 용출을 수행하여, 필터 보조제 케이크로부터 가능한 한 많은 재료를 회수하였다. 260 nm에서의 흡광도를 측정하고, 각 샘플에 대한 농도를 결정하였다.

CE: CE 단편 분석기 및 대형 RNA 검출 키트를 사용하여 RNA 완전성 및 테일 길이를 평가하였다. 테일 길이에 대한 크기 이동 및 완전성에 대한 피크 프로파일의 분석을 수행하였다.

캡 검정: 최종 정제된 mRNA 생성물 중에 존재하는 캡 종을 HPLC/MS 방법을 사용하여 결정하여, 미캡핑(uncapped), 캡G, 캡0 및 캡1 양을 정확하게 계산할 수 있었고, 이를 총 신호에 대한 백분율로서 기록하였다.

결과:

상기 기재된 바와 같은 CFTR mRNA 캡 테일 반응의 단일 정제 후, 샘플 수율을 나노-드롭을 사용하여 계산하여 농도 (A260 nm)를 결정하였고, 이를 하기 표 10에 요약하였다. 100 G 반응로부터의 최종 mRNA 수율은 반응 규모에 기반하여 목적하는 수율의 범위 내에 있었다.

표 10

은 염색 겔 이미지가 도 6에 나타나 있으며, 이로부터, 정제된 CFTR mRNA 샘플 중에 관찰가능한 잔여 공정 효소가 없는 것으로 밝혀졌다 (레인 5 및 6). 본 발명의 완충액을 사용한 단일 정제 단계가, 검출가능한 오염물 공정 효소(들)가 없는 고순도 mRNA를 생성할 수 있다는 것은 놀랍다. 상기 도면에서, 레인 8-12는 다음 레인 RNAse1 (레인 8), SP6 (레인 9), 구아닐레이트 트랜스퍼라제 (레인 10), 폴리 A 폴리머라제 (레인 11) 및 2-O-메틸 트랜스퍼라제 (레인 12)와 같은 공정 효소에 대한 전기영동 이동 대조군을 도시한다.

RNA의 CE 전기영동도는 대표적인 과거 대조군 샘플과 일치하는 단일의 뚜렷한 피크를 나타낸다 (도 7, 화살표로 표시됨). 300 nt의 폴리-A 테일 길이를 C/T mRNA에서의 CE 겔 이동 (도 7)에 기반하여 미캡핑 RNA (데이터는 나타내지 않음)와 비교하여 평가하였다. 테일 길이는 테일링 반응 조건에 기반하여 예측된 테일 크기 내에 있었다.

5 M GSCN w/10 mM DTT를 사용한 단일 정제 후 최종 mRNA 생성물 중의 캡1 종의 백분율은 (95%)였다. 나머지 종은 모두 미캡핑 (5%)이었다. 이들 결과는 상기 전사체에 대한 과거 캡1% (데이터는 나타내지 않음)와 일치하였다.

이들 데이터로부터, 100 g의 mRNA가 침전 완충액으로서의 5 M GSCN-10 mM DTT와 함께 EHBL503 원심분리기를 사용하여 성공적으로 침전, 포획, 세척 및 회수된 것으로 밝혀졌다. 5 M GSCN-10 mM DTT를 사용하는 단일 정제 공정으로, 본 발명자들의 검출 방법의 감도에 기반하여 임의의 검출가능한 수준의 잔여 공정 효소가 제거될 수 있다. 5 M GSCN-10 mM DTT와 함께 여과 원심분리기를 사용하는 것이 과거 샘플과 비교할 때 mRNA 완전성, 테일 길이, mRNA 캡핑 효율 또는 안정성에 대해 부정적인 영향을 미치지 않았다.

실시예 6. 다양한 환원제를 사용한, 캡핑 및 테일링된 mRNA의 정제

본 실시예에서는, 여러가지 환원 시약을 5 M GSCN 침전 완충액에 첨가될 때 공정 효소를 제거하기 위한 그의 능력에 대해 평가하였다.

재료 및 방법:

5 mg의 CFTR mRNA의 8개의 뱃치를 상기에서 기재된 시험관내 전사 방법을 사용하여 합성하였다. 침전을 위해, 1 부피의 IVT 반응 당 2.3 부피의, 표 11에 열거된 다양한 환원제가 있는 5 M GSCN 완충액 (최종 2.3 M GSCN)을 첨가하였다. 이어서, 혼합물에 1.7 부피의 100% EtOH (최종 34% EtOH)를 첨가하였다. 침전된 RNA 샘플을 퀴아젠 RNeasy 맥시 칼럼 상에 포획하였고, 80% 에탄올 10 mL로 2회 세척한 다음, RNase-무함유 H₂O 2 mL 중에 용해시켰다. 용해된 RNA 샘플의 농도를 나노-드롭 2000 분광광도계를 사용하여 260 nm에서의 흡광도를 사용하여 계산하였다.

표 11

이어서, 생성된 CFTR IVT mRNA 샘플을 8개의 5 mg의 캡 및 테일 반응을 위한 출발 재료로서 사용하였다. 캡핑 및 테일링 후, 1 부피의 IVT 반응 당 2.3 부피의, 표 11에 열거된 5 M GSCN 완충액 (최종 2.3 M GSCN)을 첨가함으로써 각각의 8개의 반응을 침전시켰다. 이어서, 혼합물에 1.7 부피의 100% EtOH (최종 34% EtOH)를 첨가하였다. 침전된 RNA 샘플을 퀴아젠 RNeasy 맥시 칼럼 상에 포획하였고, 80% 에탄올 10 mL로 2회 세척한 다음, RNase-무함유 H₂O 5 mL 중에 용해시켰다. 용해된 RNA 샘플의 농도를 나노-드롭 2000 분광광도계를 사용하여 260 nm에서의 흡광도를 사용하여 계산하였다.

각 샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같은 은 염색 방법을 사용하여 평가하여, 다양한 환원 시약과 함께 정제 후 존재하는 잔여 공정 효소의 양을 결정하였다.

결과:

도 8에 나타낸 바와 같이, 5 M GSCN 침전 완충액 중의 5 내지 15 mM의 농도로 시험된 환원제들 중 임의의 것을 사용하는 것은 모두, 검출가능한 수준의 RNA 공정 효소의 완전한 제거를 발생시켰다 (레인 3-9). 환원제가 전혀 없이 5 M GSCN만을 사용하여 정제된 CFTR 반응 (레인 2)은 흐릿하였고 분자량 범위의 RNA 폴리머라제 및 GuaT가 관찰되었으며, 이는 단독의 GSCN이 RNA 합성 공정 효소를 제거하는데 비효율적이라는 추가의 증거를 제공한다.

이들 결과는, GSCN을 무질서유발 염으로서 사용하는 경우, 적절한 공정 효소 제거를 보장하기 위해 RNA 침전 완충액 내에 환원제를 첨가하는 것이 필요함을 입증한다. 흥미롭게도, 다양한 농도의 여러 환원 시약이, 10 mM의 본래 평가된 DTT 시약과 유사하게 수행한다. 이론에 얽매이고자 하는 의도는 없지만, RNA를 침전시키기 위해 유기 용매의 첨가 전에 RNA 공정 효소를 환원시키는 것은 중요한 단계인데, 그 이유는 상기 환원 단계가 에탄올 염 유도 침전을 사용하여 RNA를 정제시키는 경우 공정 효소의 제거를 용이하게 하기 때문이다.

균등물

관련 기술분야의 통상의 기술자라면 거의 일상적인 실험만을 사용하여, 본원에 기재된 발명의 특정 실시양태에 대한 다수의 균등물을 인지하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 상기 설명으로 제한되도록 의도되지 않으며, 그보다는 하기 청구범위에 기술된 바와 같다.

Claims

대규모 시험관내 전사 공정 (IVT)에 의해 합성된 메신저 RNA (mRNA) 제제로부터 불순물을 제거하는 방법이며,
IVT-합성된 mRNA를, 환원제와 함께 변성 염을 포함하는 완충액 중에서 침전시키는 단계;
침전된 mRNA를 포획하는 단계; 및
포획된 mRNA를 용액 내로 용해시켜 mRNA를 정제하는 단계
를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, mRNA를 침전시키기 전에 mRNA를 캡핑 및 테일링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 대규모 IVT 공정에 의해 수득된 mRNA 제제 중의 불순물이 IVT, 캡핑 및 테일링을 위해 사용된 효소를 포함한 단백질; 불완전한 RNA 전사체; 뉴클레오티드 및 염을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 방법에 의해 수득된 정제된 mRNA가, 합성된 mRNA의 양의 적어도 90%를 초과하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 방법에 의해 수득된 정제된 mRNA에 어떠한 효소 불순물도 실질적으로 없는 것인 방법.
제1항에 있어서, IVT 반응에서 적어도 약 1 mg의 mRNA가 합성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, IVT 반응에서 적어도 약 10 G의 mRNA가 합성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, IVT 반응에서 적어도 약 100 G의 mRNA가 합성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, IVT 반응에서 적어도 약 1 Kg의 mRNA가 합성되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 침전 단계를 위한 완충액이 알콜을 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 침전이, mRNA, 변성 완충액(denaturing buffer) 및 알콜이 1: (5): (3)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 침전이, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (3.5): (2.1)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 침전이, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (2.8): (1.9)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 침전이, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (2.3): (1.7)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 침전이, mRNA, 변성 완충액 및 알콜이 1: (2.1): (1.5)의 부피비로 존재하는 조건 하에 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 변성 염이 구아니디늄 티오시아네이트인 방법.
제1항에 있어서, 구아니디늄 티오시아네이트가 2 M 이상, 3 M 이상, 4 M 이상, 5 M 이상, 6 M 이상, 또는 7 M 이상의 최종 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 구아니디늄 티오시아네이트가 적어도 3 M 초과의 최종 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 구아니디늄 티오시아네이트가 적어도 4 M 초과의 최종 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 구아니디늄 티오시아네이트가 5 M의 최종 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨 (DTT), 베타-메르캅토에탄올 (b-ME), 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), 트리스(3-히드록시프로필)포스핀 (THPP), 디티오에리트리톨 (DTE) 및 디티오부틸아민 (DTBA)으로부터 선택된 것인 방법.
제1항에 있어서, 환원제가 디티오트레이톨 (DTT)인 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, DTT가 1 mM 초과 및 최대 약 200 mM인 최종 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, DTT가 2.5 mM 내지 100 mM의 최종 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, DTT가 5 mM 내지 50 mM의 최종 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항에 있어서, DTT의 농도가 5 mM, 10 mM, 15 mM 또는 20 mM인 방법.
제1항에 있어서, mRNA를 침전시키는 단계가 1회 초과로 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, mRNA를 침전시키는 단계가 1회만 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, mRNA를 포획하는 단계가, mRNA에 대해 여과, 원심분리, 고체 상에의 가역적 흡착, 또는 이들의 조합을 수행하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 여과가 접선 유동 여과 (TFF)인 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 여과가 심층 여과 (DF)인 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 여과가 누체(Nutsche) 필터를 사용하여 수행되는 것인 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 여과가 원심분리와 조합하여 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 포획된 mRNA를 용해시키는 단계가 수용액 중에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 포획된 mRNA의 단계에 대해, 더 낮은 염 농도를 포함하는 적합한 완충액 중의 투석을 추가로 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 어떠한 단백질 불순물도 실질적으로 없는 것이 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만의 단백질 불순물, 또는 0%의 단백질 불순물인 방법.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA에 염이 실질적으로 없는 것인 방법.
제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 mRNA가 적어도 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 또는 약 100%의, 단백질을 코딩하는 전장 mRNA를 포함하는 것인 방법.