TW202231651A

TW202231651A - 大規模合成訊息ｒｎａ

Info

Publication number: TW202231651A
Application number: TW110138417A
Authority: TW
Inventors: 強納森阿碧莎爾; 安努沙迪阿斯; 都斯汀庫柏; 法蘭克迪羅沙; 裘瑞爾Ｅ巴格斯
Original assignee: 美商崔斯雷生物公司
Priority date: 2020-10-15
Filing date: 2021-10-15
Publication date: 2022-08-16
Also published as: US20220136022A1; JP2023545503A; EP4229191A1; CA3198726A1; AU2021361037A1; CN116438298A; WO2022082001A1

Abstract

本發明提供除其它事項外，用於大規模製造包括實質上不含雙股RNA之全長訊息RNA製成物之組成物的方法，以及使用此等方法及用途製造之組成物。本發明係部分基於驚人的發現，使用SP6 RNA聚合酶之 活體外轉錄製造的mRNA製成物實質上不含雙股RNA。在一態樣中，本發明提供針對mRNA療法生成大規模mRNA製成品之方法，無需色層分析步驟。

Description

大規模合成訊息RNA

訊息RNA (mRNA)療法逐漸成為治療各種疾病的重要方法。mRNA療法涉及將包括有 活體外轉錄(IVT)與高純度訊息RNA (mRNA)的藥物製成品施用於對該療法有需求的患者，並於患者體內製造由mRNA所編碼的蛋白質。

藉由 活體外轉錄製造之mRNA亦會生成雙股RNA (dsRNA)，其對mRNA療法來說為mRNA製成品中無法接受的主要污染物。雙股RNA是不良的，因為它會導致所施用mRNA製成物無效轉譯，並導致誘導細胞激素引發免疫反應。

傳統上，自 活體外轉錄生成的mRNA係使用市售色層分析系統純化，及/或藉由萃取成有機混合物（苯酚：氯仿：異戊基醇）以及隨後的乙醇沉澱。然而，dsRNA雜質並不藉由標準純化方法有效移除，包含氯化鋰或基於醇的沉澱、粒徑排除及離子交換層析法、或基於二氧化矽基質之純化。

dsRNA雜質僅可透過需要特殊儀器及生成危險廢棄物的流程去除。目前，離子對逆相高效液相層析法(HPLC)是用於從多個長IVT mRNA消除dsRNA污染物的方法。然而，該方法昂貴、不可擴展且使用有毒乙腈。

需要一種用於製造高純度mRNA製成品之具成本效益的大規模合成方法，其缺乏污染性雙股RNA (dsRNA)，適用於mRNA療法。本發明除其它事項外，提供一種大規模 活體外合成方法，其可製造缺乏或實質上不含污染性dsRNA的mRNA。本發明除其它事項外，提供一種使用SP6 RNA聚合酶生成mRNA製成品的方法，不需要合成後純化步驟，諸如層析方法（ 例如，離子對逆相高效液相層析法或粒徑排除及離子交換層析法），以移除污染性dsRNA。

本發明係部分基於驚人的發現，與其他RNA聚合酶（諸如T7 RNA聚合酶）相比，SP6 RNA聚合酶合成具顯著減少dsRNA的全長mRNA。如下文更詳細地描述，包含實例部分，與由T7 RNA聚合酶合成的mRNA製成品相比，由SP6 RNA聚合酶合成的mRNA製成品是高產量的且實質上不含dsRNA。經由IVT由SP6 RNA聚合酶生成的mRNA製成品不僅在全長mRNA中富集、具有實質上減少的退化轉錄體，且還具有令人驚訝和意想不到的特性，即實質上不含dsRNA。當與T7 RNA聚合酶生成的mRNA製成品相比，SP6 RNA聚合酶的這些獨特性及優點可產出顯著更高品質且適用於mRNA療法的mRNA製成品。因此，本發明部分提供一種於 活體外合成mRNA而不需要合成後純化方法的方法，包含例如，層析法（例如，在上文及在本發明背景中提及者）以移除dsRNA。

如有必要，本發明方法製造的 活體外合成mRNA可純化，以移除衍生自 活體外合成反應的污染物（諸如該反應中使用的一或多種酶）， 例如，藉由沉澱及基於過濾的程序，其可以藉由批次操作 活體外合成1克或更多的mRNA。此類製程可涉及例如切向流過濾、深度過濾、或離心（例如，使用過濾離心機）。合適製成描述於例如WO 2015/164773、WO 2018/157141及WO 2020/041793中。

在一態樣中，本發明提供一種大規模製造包括全長訊息RNA (mRNA)之組成物的方法，其包括使用SP6 RNA聚合酶於 活體外合成mRNA，其中至少1 g的mRNA在單批次中合成，且其中該組成物包含按重量計少於1%的雙股RNA (dsRNA)。

在一些實施例中，該方法不包含色層分析步驟。

在一些實施例中，在非變性條件下進行整個方法。在一些實施例中，mRNA在非變性條件下合成。

在一態樣中，本發明提供一種製造包括全長訊息RNA (mRNA)之組成物的方法，其包括於 活體外合成mRNA，其中該組成物含有按重量計少於1%的雙股RNA (dsRNA)，且其中該方法不包括色層分析步驟。

在一態樣中，本發明提供一種製造包括全長訊息RNA (mRNA)之組成物的方法，其包括於 活體外合成mRNA，其中該組成物含有按重量計少於1%的雙股RNA (dsRNA)，且其中mRNA係在非變性條件下合成。

在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中在單批次中合成至少1 g的mRNA。

在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中在單批次中合成至少10 g、100 g、250 g、500 g、1 kg或10 kg的mRNA。因此，在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中合成至少10 g的mRNA。在一些實施例中，在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中合成至少100 g的mRNA。在一些實施例中，在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中合成至少500 g的mRNA。在一些實施例中，在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中合成至少1 kg的mRNA。在一些實施例中，在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中合成至少10 kg的mRNA。在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中在單批次中合成超過10 kg的mRNA。例如，在一些實施例中，在單批次中合成25 kg、50 kg、75 kg、100 kg或更多於 活體外合成mRNA。

在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中該組成物按重量計含有少於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的dsRNA。

在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中該組成物實質上不含dsRNA。

在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中 活體外合成之mRNA係在pH介於約6至8.5之間、約6.5至8.0之間、或約7.0至7.5之間進行。於特定實施例中，mRNA之 活體外合成係在pH介於7.5與7.7之間進行。在一些實施例中，pH為6、6.2、6.4、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2或8.4。在一些實施例中，pH為7.5。在一些實施例中，pH為7.7。

在一些實施例中，該方法包含於 活體外合成mRNA，其中mRNA之 活體外合成係在包括25mM tris HCl、2mM 精胺酸、25mM MgCl、0.5 mM NaCl及pH 7.5之緩衝液中進行。

在一些實施例中，該方法包括於 活體外合成mRNA，其中該方法不包括離散劑。離散劑是藉由干擾非共價力（諸如氫鍵及凡得瓦力）而阻斷諸如蛋白質及核酸之大分子結構的物質。在一些實施例中，離散劑包含例如尿素、硫脲、氯化胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、乙酸鋰、氯化鎂、十二基硫酸鈉、過氯酸鋰及其組合。

在一態樣中，本發明提供一種大規模製造包括全長訊息RNA (mRNA)之組成物的方法，其包括使用SP6 RNA聚合酶於 活體外合成mRNA，其中該組成物含有按重量計少於1%的雙股RNA (dsRNA)，且其中在單批次中合成至少100 mg的mRNA。

在一些實施例中，該組成物含有按重量計少於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的dsRNA。

在一些實施例中，該組成物實質上不含dsRNA。

在一些實施例中，藉由斑點雜交分析或ELISA來檢測dsRNA。

在一些實施例中，在對合成mRNA加帽或加尾之前檢測dsRNA。

在一些實施例中，該方法進一步包括對合成mRNA加帽及/或加尾的步驟。

在一些實施例中，在對合成mRNA加帽及加尾之後檢測dsRNA。

在一些實施例中，在單批次中合成至少200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1 g、5 g、10 g、25 g、50 g、75 g、100 g、150 g、200 g、250 g、500 g、750 g、1 kg、5 kg、10 kg或更多的mRNA。在一典型實施例中，在單批次中合成1 g至100 kg的mRNA（例如，100 g至10 kg、或250 g至5 kg）。在一些實施例中，在單批次中合成10 kg或更多的mRNA。在特定實施例中，在單批次中合成10 kg與100 kg之間的mRNA。在一些實施例中，在單批次中合成15 kg、20 kg、25 kg、30 kg、35 kg、40 kg、45 kg、50 kg、75 kg或100 kg或更多的mRNA。

在一些實施例中，該方法不包含特異移除dsRNA之步驟。

在一些實施例中，該方法不包括色層分析步驟。

在一些實施例中，SP6 RNA聚合酶為天然存在的SP6 RNA聚合酶。

在一些實施例中，該SP6 RNA聚合酶為重組SP6 RNA聚合酶。

在一些實施例中，該SP6 RNA聚合酶包括一標籤。在一些實施例中，該標籤為his標籤。

在一些實施例中，該mRNA係基於DNA模板由SP6 RNA聚合酶合成的， 例如，DNA模板，其包含可操作地連接至編碼待合成mRNA序列之DNA序列的SP6啟動子。在一些實施例中，DNA序列經最佳化。在一些實施例中，DNA序列經最佳化以降低在合成mRNA中形成髮夾結構的機會。

在一些實施例中，反應混合物中SP6 RNA聚合酶的含量等於或大於按重量計之DNA模板的含量。在一特定實施例中，DNA模板對SP6 RNA聚合酶之重量比介於1：1與1：3之間。在一些實施例中，SP6 RNA聚合酶的含量相對於反應條件下之DNA模板的含量而調整，以達成理想的產量。舉例而言，在一些實施例中，SP6 RNA聚合酶的含量相對於DNA模板的含量是增加的。

在一些實施例中，mRNA是在反應混和物中合成的，其包括有多個NTP，每個NTP濃度範圍介於1 - 10 mM （例如，1-8 mM、1-6 mM、1-5 mM、2-10 mM、2-8 mM、2-6 mM及4-5 mM）、在濃度範圍為0.01 - 0.5 mg/mL（例如，0.05 mg-0.4 mg/mL、0.05 mg-0.3 mg/mL、0.05 mg-0.2 mg/mL及0.05 mg-0.15 mg/mL)的DNA模板、以及濃度範圍為0.01 – 0.1 mg/mL（例如，0.02-0.08 mg/mL及0.04-0.06 mg/mL）的SP6 RNA聚合酶。

在一些實施例中，該反應混合物包括多個每一者濃度為5 mM的NTP、濃度為0.1 mg/mL的DNA模板、及濃度為0.05 mg/mL的SP6 RNA聚合酶。

在一些實施例中，該mRNA係在溫度範圍為37至42 ^°C之間合成。在一些實施例中，mRNA在溫度約37 ^°C、38 ^°C、39 ^°C、40 ^°C、41 ^°C、42 ^°C或45 ^°C下合成。

在一些實施例中，該等NTP為天然存在的NTP。在一些實施例中，該等NTP包括經修飾的NTP。在一些實施例中，該等經修飾的NTP包括假尿苷。在更特定的實施例中，假尿苷為N-1-甲基-假尿苷。

在一些實施例中，該mRNA編碼人類囊腫纖化症跨膜傳導調節蛋白(CFTR)。

在一些實施例中，mRNA編碼人類鳥胺酸氨甲醯基轉移酶(OTC)。

在一些實施例中，全長mRNA分子的長度為至少100個鹼基、200個鹼基、300個鹼基、400個鹼基、500個鹼基、600個鹼基、700個鹼基、800個鹼基、900個鹼基、1 kb、1.5 kb、2 kb、2.5 kb、3 kb、3.5 kb、4 kb、4.5 kb、5 kb、8 kb、10 kb、或15 kb。

在一些實施例中，mRNA係經密碼子最佳化。

在一些實施例中，提供一種組成物，其包括藉由本發明方法製造的mRNA。

在一態樣中，本發明提供一種包括 活體外合成訊息RNA (mRNA)之組成物，其在單批次中使用SP6 RNA聚合酶而無需色層分析步驟來純化，其中該組成物含有少於1%的雙股RNA (dsRNA)。

在一些實施例中，組成物包括至少100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1 g、5 g、10 g、25 g、50 g、75 g、100 g、150 g、200 g、250 g、500 g、750 g、1 kg、5 kg、10 kg、或更多的mRNA。在一典型實施例中，該組成物包括1 g至100 kg的mRNA （例如，100 g至10 kg，或250 g至5 kg）。在一些實施例中，組成物包括10 kg或更多的mRNA。在特定實施例中，組成物包括介於10 kg及100 kg之間的mRNA。舉例而言，在一些實施例中，組成物包括15 kg、20 kg、25 kg、30 kg、35 kg、40 kg、45 kg、50 kg、75 kg或100 kg或更多的mRNA。

在一些實施例中，本發明提供一種組成物，其中該mRNA係使用SP6 RNA聚合酶來合成的。

在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%之dsRNA。因此，在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.9%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.8%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.7%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.6%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.5%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.4%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.3%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.2%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.1%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.05%之dsRNA。在一些實施例中，組成物包括按重量計少於0.01%之dsRNA。

在一些實施例中，該組成物實質上不含dsRNA。在一些實施例中，該組成物實質上不含短聚體污染物。在其他實施例中，組成物實質上不含dsRNA及短聚體污染物。

在一些實施例中，dsRNA藉由斑點雜交分析來檢測。

在一些實施例中，mRNA編碼人類鳥胺酸氨甲醯基轉移酶(OTC)。

在一些實施例中，mRNA係經密碼子最佳化。在一些實施例中，mRNA未經修飾。在一些實施例中，mRNA經修飾。在某些實施例中，經修飾的mRNA包括假尿苷。在更特定的實施例中，假尿苷為N-1-甲基-假尿苷。

在一些實施例中，mRNA的長度為至少100個鹼基、200個鹼基、300個鹼基、400個鹼基、500個鹼基、600個鹼基、700個鹼基、800個鹼基、900個鹼基、1 kb、1.5 kb、2 kb、2.5 kb、3 kb、3.5 kb、4 kb、4.5 kb、5 kb、8 kb、10 kb、或15 kb。

在一些實施例中，mRNA封裝於脂質體中。

在一些實施例中，脂質體包括一或多種陽離子脂質、一或多種非陽離子脂質及一或多種經PEG修飾的脂質。

在一些實施例中，該脂質體進一步包括基於膽固醇的脂質。

在一個態樣中，提供一種治療疾病或病症的方法，其包括使用如本文所描述之組成物。

本文所描述之任何態樣或實施例可與如本文所揭示之任何其它態樣或實施例組合。雖然本發明已結合其詳細敘述進行描述，但前述敘述旨在說明而非限制本發明的範圍，其係由所附申請專利範圍之範疇所界定。其他態樣、優點及修飾是屬於以下申請專利範圍之範疇。

本文中提及之專利及科學文獻建立了本領域技術人員可獲得之知識。本文引用的所有美國專利和已公開或未公開的美國專利申請，均作為參考文獻引述。本文提及的所有已發表外國專利和專利申請，在本文作為參考文獻引述。本文提及的所有其他已發表的參考文獻、文件、手稿和科學文獻，在本文作為參考文獻引述。

從隨後之詳細描述、圖式及申請專利範圍可以顯而易見本發明的其他特徵及優點。然而，應當理解，在指示本發明之實施例的同時，給出的詳細描述、圖式及申請專利範圍僅作為說明而非限制。本發明之範疇中之各種變化及修飾將對於熟悉本領域技術人員來說變得顯而易見。

定義

為使本發明更易於理解，首先在下文定義某些術語。下述術語及其它術語之額外定義散見於本說明書內記載。

除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附申請專利範圍中所使用，單數形式「一（a）」及「一（an）」包含複數個參考物。

除非上下文明確陳述或顯而易見，否則如本文所用，術語「或」應理解為包括且涵蓋「或」及「及」。

術語「例如，」及「亦即」如本文中所使用，僅以舉例方式使用，但不限於預期，且不應解釋為僅引用在說明書中明確列舉之項目。

術語「或更多」、「至少」、「多於」及其類似物， 例如，「至少一者」應理解為包含但不限於至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或多於所述標準值。還包括任何之間的較大數字或分數。

相反地，術語「不超過」包含小於所述值的每個值。例如，「不超過100個核苷酸」包含100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1以及0個核甘酸。也包含任何介於兩者之間的較小數字或分數。

術語「複數」、「至少兩個」、「兩個或更多」、「至少兩種」及其類似物應理解為包含但不限於至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。還包括任何之間的較大數字或分數。

在整個說明書中，「包括(comprising)」或如「包含(comprises)」或「包括(comprising)」之變體應理解為暗示包含所述元件、整數或步驟或元件群組、整數或步驟，但不排除任何其它元件、整數或步驟，或元件群組、整數或步驟。

除非上下文明確陳述或顯而易見，否則如本文所用，術語「約」理解為本技術領域中，例如在平均值之2個標準差中，具有正常耐受性範圍。「約」可理解為，在所述值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%或0.001%之間。除非上下文另有明確說明，否則本文提供的所有數值反映可由熟練技術人員理解的正常波動。

如本文中所用，術語「退化轉錄體」或「預退化轉錄體」或類似物，就其最廣義而言，是短於由DNA模板編碼之全長mRNA分子的任何轉錄體。在一些實施例中，退化轉錄體長度可小於自目標DNA分子轉錄之全長mRNA分子的90%， 例如，小於全長mRNA分子長度的80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%、1%。

如本文所用，術語「批次」係指一次合成mRNA之數量或含量，例如，在相同製造循環期間根據單一製造指令製造。批次可指經由單個等分的酶及/或單個等分的DNA模板在一組條件下用於連續合成之單個反應中合成mRNA的含量。在一些實施例中，批次將包含從一反應中製造的mRNA，其中並非所有試劑及/或組分在反應進行時補充及/或填補。術語「批次」不表示在不同時間合成之mRNA經組合以達到所需量。

如本文所用，術語「遞送」涵蓋局部及全身性遞送。例如，傳遞mRNA涵蓋將mRNA傳送至目標組織且編碼蛋白質表現及保留於目標組織中（亦稱為「局部分配」或「局部遞送」）之情形，以及將mRNA傳送至目標組織且編碼蛋白質表現及分泌至患者之循環系統（ 例如，血清）中並由其它組織分配和占用（亦稱為「系統分配」或「系統遞送」）之情形。

如本文所用，術語「雙股RNA」或「dsRNA」係指在 活體外轉錄期間所製造的RNA，其包括相互成對之兩個互補的核糖核酸鏈。在IVT期間，dsRNA藉由將全長RNA與互補性内部區環聯而在順式中生成。此外，在IVT起始階段期間生成的退化RNA片段及全長RNA的3'端可從反式初級轉錄體中引發合成互補性RNA。全長反義RNA的啟動子獨立轉錄是dsRNA生成的另一機轉。

如本文所用，術語「藥物」、「藥物」、「治療劑」、「活性劑」、「治療化合物」、「組成物」或「化合物」可互換使用且係指可用於治療或預防疾病、疾病、病症或身體功能之障礙的任何化學實體、醫藥品、藥物、生物、植物及類似物。藥物可包括已知及潛在治療性化合物。可使用本領域中具有通常知識者已知的篩選來判定藥物為治療性的。「已知的治療性化合物」、「藥物」或「藥物」係指已顯示（ 例如，經由動物試驗或先前對投與人類的經驗）有效於此類治療之治療化合物。「治療方案」係關於包括如本文所揭示之「藥物」、「藥物」、「治療劑」、「治療性」、「活性劑」、「治療化合物」、「組成物」或「化合物」之治療及/或包括由個體之行為修飾的治療及/或包括手術方法之治療。

如本文所用，術語「封裝」或語法等效物係指將mRNA分子封閉在奈米顆粒中的過程。將所需mRNA納入奈米顆粒中的過程通常稱為「裝載」。例示性方法描述於Lasic 等人，FEBS Let.，312: 255-258，1992，其在此作為參考文獻引述。結合奈米顆粒的核酸可完全或部分地位於奈米顆粒的内部空間中、在雙層膜中（對於脂質體奈米顆粒）、或與奈米顆粒的外表面相關。

如本文中所用，核酸序列之「表現」係指以下事件中之一或多者：(1)自DNA序列製造RNA模板（例如，藉由轉錄）；(2)RNA轉錄體之處理（例如，藉由剪接、編輯、5'帽形成及/或3'端形成）；(3)RNA轉譯成多肽或蛋白質；及/或(4)多肽或蛋白質之轉譯後修飾。在本申請中，術語「表現」及「製造」以及語法等效物可互換地使用。

如本文所用，當使用特定分析時，「全長mRNA」係表徵為，例如，凝膠電泳及使用紫外線和紫外線吸收光譜法進行檢測，通過毛細管電泳分離。編碼全長多肽之mRNA分子的長度為自目標DNA轉錄之全長mRNA分子的長度的至少50%， 例如，自目標DNA轉錄之全長mRNA分子的長度的至少60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.01%、99.05%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%。

如本文所使用之術語「改善」、「增加」或者「減少」或者文法等效物指示相對於諸如同一個體中在起始本文所描述之治療前之量測值或者對照個體(或者多個對照個體)中在不存在本文所描述之治療情況下之量測值的基線量測值而言的值。「對照個體」為罹患與所治療個體相同之疾病形式、年齡與所治療個體大約相同之個體。

如本文中所用，術語「雜質」係指在有限量之液體、氣體或固體內的物質，其不同於目標材料或化合物之化學組成物。雜質亦稱為污染物。

如本文所使用之術語「 活體外」係指事件發生在人工環境中( 例如在試管或者反應容器中)、在細胞培養物中等，而非多細胞生物體內。

如本文所使用之術語「 活體內」係指事件發生在諸如人類與非人類動物之多細胞生物體內。在基於細胞之系統之情形下，該術語可用於指事件發生在活細胞內(與例如 活體外系統相反)。

如本文所用，術語「經分離」係指物質及/或實體已(1)與最初產生時與其相關的至少一些組分分離(無論在自然界中及/或在實驗設置中)，及/或(2)藉由人工產生、製備及/或製造。

如本文所用，術語「傳訊RNA （mRNA）」係指編碼至少一個多肽之多核糖核苷酸。如本文所用之mRNA涵蓋經修飾及未經修飾之RNA兩者。mRNA可含有一或多個編碼及非編碼區域。mRNA可使用重組表現系統及選擇性純化、 活體外轉錄或化學合成自天然來源純化、製造。

mRNA一般被認為是將訊息從DNA輸送到核糖體的RNA類型。mRNA的存在通常非常簡短且包含處理和轉譯，隨後是降解。一般而言，在真核生物體中，mRNA處理包括在N端(5′)端添加「帽」，以及在C端(3′)端添加「尾部」。典型的帽為7-甲鳥苷帽，其為經由5'-5'-三磷酸鹽鍵連接至第一轉錄核苷酸的鳥苷。該帽的存在對大多數真核細胞中發現的核酸酶提供抗性很重要。該尾部通常係多腺苷酸化事件，其中將聚A部分添加至mRNA分子之3'端。這種「尾部」的存在用於保護mRNA 免受核酸外切酶降解。訊息RNA通常由核糖體轉譯成一系列組成蛋白質的胺基酸。

如本文所用，術語「非變性」係指藉由施加一些外部應力或化合物（諸如離散劑、濃縮無機鹽、或熱(熱變性條件)），以其自然狀態存在而不引起生物材料或大分子例如核酸或蛋白質失去結構（例如，三級結構或二級結構）之條件。「變性條件」為導致生物材料失去此結構之條件。「部分變性條件」為導致生物材料損失此結構之至少一部分之條件。

如本文中所用，術語「核酸」在最廣義上係指任何化合物及/或物質，其為或可納入多核苷酸鏈中。在一些實施例中，核酸為一化合物及/或物質，其為或可經由磷酸二酯鍵結至多核苷酸鏈中。在一些實施例中，「核酸」係指單個核酸殘基（例如核苷酸及/或核苷）。在一些實施例中，「核酸」係指包括單個核酸殘基之多核苷酸鏈。在一些實施例中，「核酸」涵蓋RNA以及單股及/或雙股DNA及/或cDNA。此外，術語「核酸」、「DNA」、「RNA」及/或類似術語包含核酸類似物，亦即具有除磷酸二酯骨架以外的類似物。

如本文所用，術語「短聚體」係用於專指提前退化的短mRNA寡核苷酸，亦稱為短退化RNA轉錄體，其為於 活體外轉錄反應期間不完全mRNA轉錄之製成品。短聚體、早熟退化的mRNA、預退化的mRNA、或短的退化mRNA轉錄體在說明書中可互換使用。

如本文所用，術語「實質上」係指展現所關注的特徵或性質之全部或接近全部範圍或程度的定性條件。生物學領域中具有通常技藝者將會理解，生物及化學現象很少(若有)達到完成及/或進行至完全或實現或避免絕對的結果。因此，術語「實質上」在本文中用於捕獲許多生物及化學現象中固有之潛在缺乏的完全性。

除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語之含義具有與本發明所屬領域中通常知識者通常所理解相同之含義，也與本發明所屬領域中通常使用之含義相同；其通過引用將該技藝併入本文。在衝突情形下，以現有說明書（包含定義）為準。實施方式

本發明提供大規模於 活體外合成方法，其可生成實質上不含污染性dsRNA的mRNA。本發明提供使用SP6 RNA聚合酶之大規模 活體外合成方法。在一些實施例中，該方法不需要色層分析步驟 ，例如，移除污染性dsRNA。雙股 RNA （ dsRNA ）污染物減少

於 活體外合成mRNA中存在dsRNA污染物是不理想的。dsRNA是免疫性的且已知藉由活化dsRNA依賴性酶（諸如寡腺苷酸合成酶(OAS)、RNA特異性腺苷去胺酶(ADAR)及RNA活化蛋白激酶(PKR)）而觸發細胞反應，導致抑制蛋白質合成，降低mRNA療法的效率。dsRNA亦刺激感測器，例如，類鐸受體3 (TLR3)、網膜酸誘導基因I (RIG-I)及黑色素瘤分化相關蛋白質5(MDA5)，導致分泌不同細胞激素，包含有第I型干擾素、介白素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。因此，由於許多原因，包含例如限制細胞激素誘導，期望消除或大量減少來自IVT mRNA中dsRNA之含量。

此外，dsRNA污染物難以自 活體外轉錄(IVT mRNA)移除，且在標準純化方法（包含LiCl或基於醇之沉澱、粒徑排除及離子交換層析法、或基於二氧化矽基質純化）中自IVT mRNA移除往往效率不高。離子對逆相高效液相層析法(HPLC)用於移除dsRNA。然而，這些純化方法通常不容易擴展，且使用諸如乙腈等有毒試劑。

因此， 活體外轉錄期間生成的dsRNA是mRNA合成時的不理想副產物。dsRNA已被顯示為高度免疫原性，其對使用含有dsRNA污染物的mRNA造成阻礙。為了克服此限制，研究人員已使用合成後純化方法，試圖從於 活體外合成mRNA中去除dsRNA污染物。與合成後純化方法相關的潛在問題包含減少產量和對於 活體外合成mRNA的潛在傷害。本發明的發明人已驚訝地發現，使用SP6 RNA聚合酶減少或消除 活體外合成mRNA中存在的dsRNA。因此，本發明可以不需要進一步的純化後步驟來移除dsRNA，從而允許在高產量及高完整性下生成於 活體外合成mRNA。以此方式，大幅簡化於 活體外合成mRNA之合成後處理。

在一些實施例中，藉由使用SP6 RNA聚合酶而不是T7 RNA聚合酶 之活體外轉錄生成的mRNA實質上不含dsRNA污染物。

在本發明中，所提供之方法不需要純化步驟以移除dsRNA污染物。在一些實施例中，不經進一步純化而使用合成mRNA。特定言之，在一些實施例中，不經移除短聚體之步驟而使用根據本發明合成之mRNA。在一些實施例中，mRNA製成品不具有色層分析步驟。在一些實施例中，該mRNA製成品係未經離散劑製造。在一些實施例中，該mRNA製成物在非變性條件下製造。在一些實施例中，mRNA製成品不使用氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化胍、硫氰酸胍、異硫氰酸胍、醋酸銨及其組合來製造。在一些實施例中，整個方法在非變性條件下進行。

在一些實施例中，mRNA組成物實質上不含dsRNA。在一些實施例中，mRNA組成物包含少於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%之dsRNA重量 ，例如低於0.5%。在一些實施例中，dsRNA污染物之減少超過99.95%、99.9%、99.8%、99.7%、99.6%、99.5%、99.4%、99.3%、99.2%、99.1%或99%，例如大於99.99%。

在一些實施例中，使用SP6 RNA聚合酶之IVT生成的dsRNA係少於使用T7聚合酶之IVT生成的dsRNA的10%、8%、5%、4%、3%、2%或1%。在特定實施例中，使用SP6 RNA聚合酶之IVT生成的dsRNA係少於使用T7聚合酶之IVT生成的dsRNA的1%。

在一些實施例中，使用SP6 RNA聚合酶之IVT生成的dsRNA係低於檢測極限。在一些實施例中，如斑點雜交所測定，在200 ng的於 活體外合成mRNA樣本中，dsRNA之重量含量係低於檢測極限。舉例而言，在一典型實施例中，如使用單株抗體J2斑點雜交法所測定，在 活體外合成mRNA之200 ng樣本中，dsRNA含量按重量計低於檢測極限。

在一些實施例中，包括天然或未經修飾之核糖核苷酸的mRNA組成物實質上不含dsRNA。在一些實施例中，包括天然或未修飾核糖核苷酸之mRNA組成物包括按重量計少於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2% 0.1%、0.05%、0.01%之dsRNA。在一些實施例中，dsRNA在包括天然或未修飾核糖核苷酸之mRNA製成品中係低於檢測極限。在一些實施例中，如斑點雜交所測定，在200 ng的於 活體外合成mRNA樣本中，dsRNA之重量含量係低於檢測極限。在一典型具體例中，如使用單株抗體J2斑點雜交法所測定，在包括天然或未經修飾之核糖核苷酸的 活體外合成mRNA製成品之200 ng樣本中，dsRNA含量按重量計低於檢測極限。

在一些實施例中，包括經修飾核糖核苷酸之mRNA組成物實質上不含dsRNA。在一些實施例中，包括經修飾核糖核苷酸之mRNA組成物包括按重量計少於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%之dsRNA。在一些實施例中，dsRNA在包括經修飾核糖核苷酸之mRNA製成品中係低於檢測極限。 SP6 RNA 聚合酶

SP6 RNA聚合酶是DNA依賴性RNA聚合酶，對SP6啟動子序列具高度序列專一性。通常，此聚合酶在單股DNA或雙股DNA上催化位於其啟動子下游之5'→3' 活體外合成RNA；其將天然核糖核苷酸及/或經修飾核糖核苷酸納入聚合轉錄體中。

噬菌體SP6 RNA聚合酶之序列最初被描述(GenBank: Y00105.1)為具有以下胺基酸序列： MQDLHAIQLQLEEEMFNGGIRRFEADQQRQIAAGSESDTAWNRRLLSELIAPMAEGIQAYKEEYEGKKGRAPRALAFLQCVENEVAAYITMKVVMDMLNTDATLQAIAMSVAERIEDQVRFSKLEGHAAKYFEKVKKSLKASRTKSYRHAHNVAVVAEKSVAEKDADFDRWEAWPKETQLQIGTTLLEILEGSVFYNGEPVFMRAMRTYGGKTIYYLQTSESVGQWISAFKEHVAQLSPAYAPCVIPPRPWRTPFNGGFHTEKVASRIRLVKGNREHVRKLTQKQMPKVYKAINALQNTQWQINKDVLAVIEEVIRLDLGYGVPSFKPLIDKENKPANPVPVEFQHLRGRELKEMLSPEQWQQFINWKGECARLYTAETKRGSKSAAVVRMVGQARKYSAFESIYFVYAMDSRSRVYVQSSTLSPQSNDLGKALLRFTEGRPVNGVEALKWFCINGANLWGWDKKTFDVRVSNVLDEEFQDMCRDIAADPLTFTQWAKADAPYEFLAWCFEYAQYLDLVDEGRADEFRTHLPVHQDGSCSGIQHYSAMLRDEVGAKAVNLKPSDAPQDIYGAVAQVVIKKNALYMDADDATTFTSGSVTLSGTELRAMASAWDSIGITRSLTKKPVMTLPYGSTRLTCRESVIDYIVDLEEKEAQKAVAEGRTANKVHPFEDDRQDYLTPGAAYNYMTALIWPSISEVVKAPIVAMKMIRQLARFAAKRNEGLMYTLPTGFILEQKIMATEMLRVRTCLMGDIKMSLQVETDIVDEAAMMGAAAPNFVHGHDASHLILTVCELVDKGVTSIAVIHDSFGTHADNTLTLRVALKGQMVAMYIDGNALQKLLEEHEVRWMVDTGIEVPEQGEFDLNEIMDSEYVFA (SEQ ID NO: 1)。

適合於本發明的SP6 RNA聚合酶可為具有與噬菌體SP6 RNA聚合酶實質上相同聚合酶活性的任何酶。因此，在一些實施例中，適合於本發明之SP6 RNA聚合酶可自SEQ ID NO: 1修飾。舉例而言，合適的SP6 RNA聚合酶可含有一或多個胺基酸取代、缺失或添加。在一些實施例中，合適的SP6 RNA聚合酶具有與SEQ ID NO:1約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、75%、70%、65%或60%相同或同源的胺基酸序列。在一些實施例中，合適的SP6 RNA聚合酶可為截斷蛋白質（自N端、C端或内部）但仍保持聚合酶活性。在一些實施例中，合適的SP6 RNA聚合酶為融合蛋白。

在一些實施例中，SP6 RNA聚合酶由具有以下核苷酸序列之基因編碼：ATGCAAGATTTACACGCTATCCAGCTTCAATTAGAAGAAGAGATGTTTAATGGTGGCATTCGTCGCTTCGAAGCAGATCAACAACGCCAGATTGCAGCAGGTAGCGAGAGCGACACAGCATGGAACCGCCGCCTGTTGTCAGAACTTATTGCACCTATGGCTGAAGGCATTCAGGCTTATAAAGAAGAGTACGAAGGTAAGAAAGGTCGTGCACCTCGCGCATTGGCTTTCTTACAATGTGTAGAAAATGAAGTTGCAGCATACATCACTATGAAAGTTGTTATGGATATGCTGAATACGGATGCTACCCTTCAGGCTATTGCAATGAGTGTAGCAGAACGCATTGAAGACCAAGTGCGCTTTTCTAAGCTAGAAGGTCACGCCGCTAAATACTTTGAGAAGGTTAAGAAGTCACTCAAGGCTAGCCGTACTAAGTCATATCGTCACGCTCATAACGTAGCTGTAGTTGCTGAAAAATCAGTTGCAGAAAAGGACGCGGACTTTGACCGTTGGGAGGCGTGGCCAAAAGAAACTCAATTGCAGATTGGTACTACCTTGCTTGAAATCTTAGAAGGTAGCGTTTTCTATAATGGTGAACCTGTATTTATGCGTGCTATGCGCACTTATGGCGGAAAGACTATTTACTACTTACAAACTTCTGAAAGTGTAGGCCAGTGGATTAGCGCATTCAAAGAGCACGTAGCGCAATTAAGCCCAGCTTATGCCCCTTGCGTAATCCCTCCTCGTCCTTGGAGAACTCCATTTAATGGAGGGTTCCATACTGAGAAGGTAGCTAGCCGTATCCGTCTTGTAAAAGGTAACCGTGAGCATGTACGCAAGTTGACTCAAAAGCAAATGCCAAAGGTTTATAAGGCTATCAACGCATTACAAAATACACAATGGCAAATCAACAAGGATGTATTAGCAGTTATTGAAGAAGTAATCCGCTTAGACCTTGGTTATGGTGTACCTTCCTTCAAGCCACTGATTGACAAGGAGAACAAGCCAGCTAACCCGGTACCTGTTGAATTCCAACACCTGCGCGGTCGTGAACTGAAAGAGATGCTATCACCTGAGCAGTGGCAACAATTCATTAACTGGAAAGGCGAATGCGCGCGCCTATATACCGCAGAAACTAAGCGCGGTTCAAAGTCCGCCGCCGTTGTTCGCATGGTAGGACAGGCCCGTAAATATAGCGCCTTTGAATCCATTTACTTCGTGTACGCAATGGATAGCCGCAGCCGTGTCTATGTGCAATCTAGCACGCTCTCTCCGCAGTCTAACGACTTAGGTAAGGCATTACTCCGCTTTACCGAGGGACGCCCTGTGAATGGCGTAGAAGCGCTTAAATGGTTCTGCATCAATGGTGCTAACCTTTGGGGATGGGACAAGAAAACTTTTGATGTGCGCGTGTCTAACGTATTAGATGAGGAATTCCAAGATATGTGTCGAGACATCGCCGCAGACCCTCTCACATTCACCCAATGGGCTAAAGCTGATGCACCTTATGAATTCCTCGCTTGGTGCTTTGAGTATGCTCAATACCTTGATTTGGTGGATGAAGGAAGGGCCGACGAATTCCGCACTCACCTACCAGTACATCAGGACGGGTCTTGTTCAGGCATTCAGCACTATAGTGCTATGCTTCGCGACGAAGTAGGGGCCAAAGCTGTTAACCTGAAACCCTCCGATGCACCGCAGGATATCTATGGGGCGGTGGCGCAAGTGGTTATCAAGAAGAATGCGCTATATATGGATGCGGACGATGCAACCACGTTTACTTCTGGTAGCGTCACGCTGTCCGGTACAGAACTGCGAGCAATGGCTAGCGCATGGGATAGTATTGGTATTACCCGTAGCTTAACCAAAAAGCCCGTGATGACCTTGCCATATGGTTCTACTCGCTTAACTTGCCGTGAATCTGTGATTGATTACATCGTAGACTTAGAGGAAAAAGAGGCGCAGAAGGCAGTAGCAGAAGGGCGGACGGCAAACAAGGTACATCCTTTTGAAGACGATCGTCAAGATTACTTGACTCCGGGCGCAGCTTACAACTACATGACGGCACTAATCTGGCCTTCTATTTCTGAAGTAGTTAAGGCACCGATAGTAGCTATGAAGATGATACGCCAGCTTGCACGCTTTGCAGCGAAACGTAATGAAGGCCTGATGTACACCCTGCCTACTGGCTTCATCTTAGAACAGAAGATCATGGCAACCGAGATGCTACGCGTGCGTACCTGTCTGATGGGTGATATCAAGATGTCCCTTCAGGTTGAAACGGATATCGTAGATGAAGCCGCTATGATGGGAGCAGCAGCACCTAATTTCGTACACGGTCATGACGCAAGTCACCTTATCCTTACCGTATGTGAATTGGTAGACAAGGGCGTAACTAGTATCGCTGTAATCCACGACTCTTTTGGTACTCATGCAGACAACACCCTCACTCTTAGAGTGGCACTTAAAGGGCAGATGGTTGCAATGTATATTGATGGTAATGCGCTTCAGAAACTACTGGAGGAGCATGAAGTGCGCTGGATGGTTGATACAGGTATCGAAGTACCTGAGCAAGGGGAGTTCGACCTTAACGAAATCATGGATTCTGAATACGTATTTGCCTAA (SEQ ID NO: 2)。

本發明中編碼SP6 RNA聚合酶之合適基因係與SEQ ID NO:2約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%相同或同源。

適合於本發明的SP6 RNA聚合酶可為市面上可得的製成品，例如來自Ambion、New England Biolabs (NEB)、Promega以及Roche。SP6可根據本文所述的SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或SEQ ID NO: 1之變體由商業來源或非商業來源來訂購及/或客制化設計。SP6可為標準保真聚合酶或可為高保真度/高效率/高容量的，其已經修飾以促進RNA聚合酶活性， 例如，SP6 RNA聚合酶基因中之突變或SP6 RNA聚合酶自身之轉譯後修飾。此類經修飾SP6的實例包含來自Ambion之SP6 RNA聚合酶-Plus™、來自NEB之HiScribe SP6、以及來自Promega之RiboMAX™及Riboprobe®系統。

在一些實施例中，合適的SP6 RNA聚合酶為融合蛋白。舉例而言，SP6 RNA聚合酶可包含一或多個標籤，以促進酶之分離、純化或溶解性。合適的標籤可位於N端、C端及/或内部。合適標籤之非限制性實例包含鈣調蛋白結合蛋白(CBP)；肝片吸蟲 8-kDa抗原(Fh8)；FLAG標籤肽；麩胱甘肽- S-轉移酶(GST)；組胺酸標籤（例如，六聚组氨酸標籤(His6)）；麥芽糖-結合蛋白麥芽糖；N-利用物質(NusA)；小泛素相關修飾物(SUMO)融合標籤；卵白素結合肽(STREP)；串聯親合純化(TAP)；以及硫氧還蛋白(TrxA)。本發明中可使用其他標籤。已描述此等及其它融合標籤，例如Costa等人，微生物學之邊界5 (2014): 63以及在PCT/US16/57044中，其全文通過引用併入本文。在一些實施例中，His標籤位於SP6的N端。 SP6 啟動子

SP6 RNA聚合酶可辨識的任何啟動子可用於本發明。通常，SP6啟動子包括5'ATTTAGGTGACACTATAG-3′(SEQ ID NO: 3)。已經發現及/或建立SP6啟動子的變體，以優化SP6對其啟動子的辨識及/或結合。非限制性變體包含但不限於：5′-ATTTAGGGGACACTATAGAAGAG-3′; 5′-ATTTAGGGGACACTATAGAAGG-3′; 5′-ATTTAGGGGACACTATAGAAGGG-3′; 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAA-3′; 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAGA-3′; 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3′; 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAGG-3′; 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAGGG-3′; 5′-ATTTAGGTGACACTATAGAAGNG-3′; and 5′-CATACGATTTAGGTGACACTATAG-3′ (SEQ ID NO: 4至SEQ ID NO: 13)。

此外，適用於本發明之SP6啟動子可與SEQ ID NO: 3至SEQ ID NO:13之任一者約95%、90%、85%、80%、75%、或70%相同或同源。此外，適用於本發明之SP6啟動子可包含位在如本文所述之任何啟動子序列5'及/或3'的一或多個額外核苷酸。使用 SP6 聚合酶大規模合成 mRNA

在一些實施例中，本發明係關於大規模製造mRNA。在一些實施例中，根據本發明方法在單批次中合成至少100 mg、150 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1 g、5 g、10 g、25 g、50 g、75 g、100 g、250 g、500 g、750 g、1 kg、5 g、10 kg、50 kg、100 kg、1000 kg或更多的mRNA。在一典型實施例中，在單批次中合成1 g至100 kg的mRNA（例如，100 g至10 kg，或250 g至5 kg）。在一些實施例中，在單批次中合成10 kg或更多的mRNA。在特定實施例中，在10 kg與100 kg之間的mRNA係以單批次合成。

如本文所用，術語「批次」係指一次合成mRNA之數量或含量，例如根據單一製程設定來製造。批次可指在一組條件下通過單份酶及/或單份DNA模板進行連續合成的一次反應中合成的mRNA量。在單批次中合成的mRNA將不包含在不同時間合成的mRNA，這些mRNA被組合以達到所需含量。一般而言，反應混合物包含SP6 RNA聚合酶、直鏈DNA模板及RNA聚合酶反應緩衝液（其可包含核糖核苷酸或可能需要添加核糖核苷酸）。

在本發明的一些實施例中，每克(g)製造的mRNA使用1-100 mg的SP6 RNA 聚合酶。在一些實施例中，所製造之mRNA係每克使用約1-90 mg、1-80 mg、1-60 mg、1-50 mg、1-40 mg、10-100 mg、10-80　mg、10-60 mg、10-50 mg的SP6 RNA聚合酶。在一些實施例中，使用約5-20 mg之SP6 RNA聚合酶來製造約1 g之mRNA。在一些實施例中，使用約0.5至2 g之SP6 RNA聚合酶來製造約100 g之mRNA。在一些實施例中，使用約5至20 g之SP6 RNA聚合酶來製造約1 kg之mRNA。在一些實施例中，使用至少5 mg之SP6 RNA聚合酶來製造至少1 g之mRNA。在一些實施例中，使用至少500 mg之SP6 RNA聚合酶來製造至少100 g之mRNA。在一些實施例中，使用至少5 g之SP6 RNA聚合酶來製造至少1 kg之mRNA。在一些實施例中，所製造之mRNA係每克使用約10 mg、20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg、80 mg、90 mg、或100 mg　的質體DNA。在一些實施例中，使用約10-30 mg之質體DNA來製造約1 g之mRNA。在一些實施例中，使用約1至3 g之質體DNA來製造約100 g之mRNA。在一些實施例中，使用約10至30 g之質體DNA來製造約1 kg之mRNA。在一些實施例中，使用至少10 mg之質體DNA來製造至少1 g之mRNA。在一些實施例中，使用至少1 g之質體DNA來製造至少100 g之mRNA。在一些實施例中，使用至少10 g之質體DNA來製造至少1 kg之mRNA。

在一些實施例中， SP6 RNA聚合酶在反應混合物中的濃度可為約1至100 nM、1至90 nM、1至80 nM、1至70 nM、1至60 nM、1至50 nM、1至40 nM、1至30 nM、1至20 nM、或約1至10 nM。在某些實施例中，SP6 RNA聚合酶的濃度為約10至50 nM、20至50 nM、或30至50 nM。可能使用濃度為100至10000單位/mL的SP6 RNA 聚合酶，例如，可使用濃度為100至9000 單位/mL、100至8000 單位/mL、100至7000 單位/mL、100至 6000 單位/mL、100至5000 單位/mL、100至1000 單位/mL、200至2000 單位/mL、500至1000 單位/mL、500至2000 單位/mL、500至3000 單位/mL、500至4000 單位/mL、500至5000單位/mL、500至6000 單位/mL、1000至7500 單位/mL，以及2500至5000 單位/mL。

在擴大 活體外合成反應混合物期間，本發明之發明人已驚訝地發現，可藉由將（昂貴）模板DNA保持相同含量的同時增加（便宜）SP6聚合酶含量來實現類似或改善的產量。因此，在一些實施例中，SP6 RNA聚合酶的濃度被調整，而模板DNA的含量保持不變。舉例而言，在一些實施例中，SP6 RNA聚合酶的含量增加，而DNA模板的含量保持不變。在一些實施例中，反應混合物中之SP6 RNA聚合酶介於每克目標RNA的約5 mg至約40 mg之間，而DNA模板濃度保持不變。舉例而言，在一些實施例中，每克目標RNA中之約5 mg SP6 RNA聚合酶處於反應混合物中，而DNA模板保持不變。在一些實施例中，每克目標RNA中之約10 mg SP6 RNA聚合酶處於反應混合物中，而DNA模板保持不變。在一些實施例中，每克目標RNA中之約15 mg SP6 RNA聚合酶處於反應混合物中，而DNA模板保持不變。在一些實施例中，每克目標RNA中之約20 mg SP6 RNA聚合酶處於反應混合物中，而DNA模板保持不變。在一些實施例中，每克目標RNA中之約25 mg SP6 RNA聚合酶處於反應混合物中，而DNA模板保持不變。在一些實施例中，每克目標RNA中之約30 mg SP6 RNA聚合酶處於反應混合物中，而DNA模板保持不變。在一些實施例中，每克目標RNA中之約35 mg SP6 RNA聚合酶處於反應混合物中，而DNA模板保持不變。在一些實施例中，每克目標RNA中之約40 mg SP6 RNA聚合酶處於反應混合物中，而DNA模板保持不變。

在一些實施例中，本發明提供藉由 活體外大規模合成製造mRNA的方法，其中於 活體外合成反應混合物中,按重量計SP6 RNA聚合酶的含量等於或大於DNA模板的含量。舉例而言，在一些實施例中，DNA模板對SP6 RNA聚合酶之重量比介於1：1與1：3之間。在特定實施例中，DNA模板對SP6 RNA聚合酶的重量比介於1：1.5與1：2.5。在一特定實施例中，DNA模板對SP6 RNA聚合酶的重量比為約1：2。例如，10 mg的DNA模板可使用20 mg的SP6 RNA聚合酶而產出1 g的於 活體外合成mRNA。

每個核糖核苷酸（ 例如，ATP、UTP、GTP及CTP）在反應混合物中之濃度係在約0.1 mM與約10 mM之間，例如在約1 mM與約10 mM之間、在約2 mM與約10 mM之間、在約3 mM與約10 mM之間、在約1 mM與約8 mM之間、在約1 mM與約6 mM之間、在約3 mM與約10 mM之間、在約3 mM與約8 mM之間、在約3 mM與約6 mM之間、在約4 mM與約5mM之間。在一些實施例中，在反應混合物中每個核糖核苷酸為約5 mM。在一些實施例中，在反應中所使用之rNTP總濃度（例如，ATP、GTP、CTP與UTP的組合）範圍介於1 mM及40 mM之間。在一些實施例中，在反應中所使用之rNTP總濃度（例如，ATP、GTP、CTP與UTP的組合）範圍介於1 mM及30 mM之間、或介於1 mM及28 mM之間、或介於1 mM及25 mM之間、或介於1 mM及20 mM之間。在一些實施例中，總rNTP濃度小於30 mM。在一些實施例中，總rNTP濃度小於25 mM。在一些實施例中，總rNTP濃度小於20 mM。在一些實施例中，總rNTP濃度小於15 mM。在一些實施例中，總rNTP濃度小於10 mM。

RNA聚合酶反應緩衝液通常包含鹽類/緩衝劑， 例如，Tris、HEPES、硫酸銨、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鉀磷酸鈉、氯化鈉及氯化鎂。

反應混合物的pH可介於約6至8.5、自6.5至8.0、自7.0至7.5，且在一些實施例中，該pH為7.5。

結合直鏈或直鏈化DNA模板（ 例如，如上文所描述且足以提供所欲含量RNA之含量/濃度）、RNA聚合酶緩衝液及SP6 RNA聚合酶以形成反應混合物。反應混合物係於約37°C與約42°C之間培育30分鐘至6小時，例如約六十至約九十分鐘。

在一些實施例中，約5 mM的多個NTP、約0.05 mg/mL的SP6 RNA聚合酶以及約0.1 mg/mL的DNA模板在合適之RNA聚合酶反應緩衝液（最終反應混合物pH為約7.5）中於約37°C至約42°C下培育60至90分鐘。

在一些實施例中，反應混合物含有直鏈化雙股DNA模板，其具有SP6聚合酶特異性啟動子、SP6 RNA聚合酶、核糖核酸酶抑制劑、焦磷酸酶、多個29 mM NTP、10 mM DTT及反應緩衝液（當在10x時為800 mM HEPES、20 mM 精胺酸、250 mM MgCl ₂，pH 7.7)以及足量(QS)至理想反應體積的不含核糖核酸酶的水；該反應混和物隨後在37°C下培育60分鐘。隨後藉由添加去氧核醣核酸酶I及去氧核醣核酸酶I緩衝液（當在10x時為100 mM Tris-HCl、5 mM MgCl ₂及25 mM CaCl ₂，pH 7.6）使聚合酶反應淬火，以促進雙股DNA模板之消化，以準備純化。此實施例已顯示其足以製造100克的mRNA。

在一些實施例中，反應混合物包含多個濃度範圍為1至10 mM之NTP、濃度範圍為0.01至0.5 mg/mL之DNA模板、及濃度為0.01至0.1 mg/mL之SP6 RNA聚合酶，例如，反應混合物包括多個濃度為5 mM之NTP、濃度為0.1 mg/ml之DNA模板及濃度為0.05 mg/mL之SP6 RNA聚合酶。 DNA 模板

各種核酸模板可用於本發明中。通常，可使用具有雙股SP6啟動子序列之完全雙股或部分單股的DNA模板。

直鏈質體DNA（經由一或多個限制酶直鏈化）、直鏈基因組DNA片段（經由限制酶及/或物理手段）、PCR製成物、及/或合成DNA寡核苷酸可用作與SP6進行 活體外轉錄之模板，其限制條件為，含有在待轉錄DNA序列上游（且以正確方向）的雙股SP6啟動子。

在一些實施例中，直鏈DNA模板具有鈍端。

在一些實施例中，待轉錄之DNA序列可經最佳化以促進更有效的轉錄及/或轉譯。例如，該DNA序列可以優化關於順式調節元件（ 例如，TATA盒、終止訊號及蛋白質結合位點）、人工重組位點、chi位點、CpG二核苷酸含量、負CpG島、GC含量、聚合酶滑動位點、及/或其他與轉錄相關的元件；該DNA序列可以優化關於隱蔽剪接位點、mRNA二級結構、mRNA的穩定自由能、重複序列、RNA不穩定性模體，及/或其它與mRNA處理及穩定性相關的元件；該DNA序列可以優化關於密碼子使用偏差、密碼子適應性、內部chi位點、核糖體結合位點（ 例如，IRES）、早熟聚A位點、夏因-達爾加諾(SD)序列、及/或其它與轉譯相關的緣件；及/或該DNA序列可以優化關於密碼子上下文、密碼子-反密碼子相互作用、轉譯暫停位點及/或其它與蛋白質摺疊相關的元件。本領域已知之最佳化方法可用於本發明中， 例如，ThermoFisher及OptimumGene™的GeneOptimizer，其描述於US 20110081708，其全部內容通過引用併入本文。

在一些實施例中，DNA模板包含5'及/或3'非轉譯區域。在一些實施例中，5'非轉譯區域包含影響mRNA穩定性或轉譯之一或多個元件，例如鐵反應性元件。在一些實施例中，5'非轉譯區域之長度可介於約50與500個核苷酸之間。

在一些實施例中，3'非轉譯區域包含一或多個多腺苷酸化訊號、影響mRNA在細胞中位置穩定性之蛋白質結合位點、或miRNA的一或多個結合位點。在一些實施例中，3'非轉譯區域的長度可介於50與500個核苷酸之間。

例示性3'及/或5' UTR序列可衍生自mRNA分子，其穩定（例如，球蛋白、肌動蛋白、GAPDH、微管蛋白、組蛋白及檸檬酸循環酶）以增加正義mRNA分子之穩定性。例如，5' UTR序列可包含CMV即刻早期基因1 (IE1)基因的部分序列或其片段，以改善該聚核苷酸之核酸酶抗性及/或半衰期。亦涵蓋包含編碼人類生長荷爾蒙(hGH)之序列、或多核苷酸（ 例如，mRNA）其3'端或未非轉譯區域片段，以進一步穩定多核苷酸。一般而言，這些修飾提高多核苷酸相對於其未修飾對應物之穩定性及/或藥物動力學特性（例如半衰期），且包含例如為改善此類多核苷酸對 活體內核酸酶消化中之抗性而做的修飾。 核苷酸

可使用各種天然存在或經修飾的核苷來製造根據本發明的mRNA。在一些實施例中，mRNA為或包括天然核苷（例如，腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷）；核苷類似物（例如，2-胺基腺嘌呤核苷、2-硫代胸苷、肌苷、吲-嘧啶、3-甲基腺苷， 5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺嘌呤核苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺嘌呤核苷、7-脱氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、O(6)-甲基鳥苷、假尿苷、（ 例如，N-1-甲基-假尿苷、2-硫代尿苷及2-硫代胞苷）；化學修飾鹼基；經生物修飾鹼基（例如，甲基化鹼基）；插在中間的鹼基；修飾糖類（例如， 2’-氟核糖、核糖、2’-去氧核糖、阿拉伯糖及己醣）；及/或經修飾的磷酸鹽基團（例如，硫代磷酸酯及5'- N-亞磷醯胺鍵）。

在一些實施例中，mRNA包括一或多個非標準核苷酸殘基（稱為「經修飾的mRNA」）。非標準核苷酸殘基可包含例如5-甲基-胞苷(“5mC”)、假尿苷(“ΨU”)及更具體地，1-N-甲基-假尿苷及/或2-硫代-尿苷(“2sU”)。 參見例如美國專利第8,278,036號或WO2011012316號討論此等殘基及其納入至mRNA中。mRNA可為RNA，其被定義為其中25%的U殘基為2-硫代-尿苷且25%的C殘基為5-甲基胞苷之RNA。教導使用RNA係揭露於美國專利公開案US20120195936及國際公開案WO2011012316，其兩者通過引用將其全部併入本文。非標準核苷酸殘基之存在可使得mRNA比具有相同序列但僅含有標準殘基之對照組mRNA更穩定及/或較不具免疫原性。在其他實施例中，mRNA可包括一或多個非標準核苷酸殘基，其選自異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-胺嘌呤、2-胺嘌呤、肌苷、二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤胞嘧啶，以及這些修飾及其它核鹼基修飾之組合。一些實施例可進一步包含對呋喃糖環或核鹼基的額外修飾。額外修飾可包含例如糖修飾或取代（ 例如，2'-O-烷基修飾、鎖核酸（LNA）中之一或多者）。在一些實施例中，該RNA可與額外的多核苷酸及/或肽多核苷酸(PNA)複合或雜交。在糖修飾為2'-O-烷基修飾的一些實施例中，此類修飾可包含但不限於2'-去氧-2'-氟修飾、2'-O-甲基修飾、2'-O-甲氧乙基修飾以及2'-去氧修飾。在一些實施例中，此等修飾中之任一者可呈現於0至100%的核苷酸中-例如，大於0%、1%、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、或100%的個別或組合的構成核苷酸。合成 mRNA

本發明提供高品質 活體外合成mRNA。舉例而言，本發明提供合成mRNA之一致性/同質性。尤其，本發明之組成物包含實質上為全長的複數個mRNA分子。舉例而言，至少81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%之mRNA分子為全長mRNA分子。對於全長mRNA分子，此類組成物被稱為「富集」。在一些實施例中，根據本發明之合成mRNA實質上為全長。本發明的組成物比未富集全長mRNA分子的組成物具有更高的全長mRNA分子百分比。

在本發明中，組成物或批次係無需特異性地除去非全長mRNA分子（即，退化或中止轉錄體）之mRNA分子的步驟來製備。在一些實施例中，不使用合成後純化方法，諸如色層分析方法（例如，逆相-高效能（高壓）液相層析(RP-HPLC)；粒徑排除層析(SEC)及類似物）。

在一些實施例中，本發明合成mRNA分子的長度為大於500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、10,000或更多個核苷酸；本發明還包含之間具有任何長度的mRNA。 合成後處理

通常，在合成之後可添加5'端帽及/或3'尾部。該帽的存在對於提供抗性給大多數真核細胞中所發現之核酸酶很重要。「尾部」的存在用於保護mRNA免於核酸外切酶降解。

5'帽通常如下添加：首先，RNA末端磷酸酶自5'核苷酸移除末端磷酸基團，留下二個末端磷酸鹽；鳥苷三磷酸(GTP)隨後經由鳥胺酸轉移酶添加至末端磷酸鹽，製造5'5'5三磷酸鹽鍵；且將鳥胺酸的7-氮藉由甲基轉移酶進行甲基化。帽結構之實例包含但不限於m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A及G(5')ppp(5')G。額外的帽結構描述於2017年2月27日申請之公開的美國申請案第US 2016/0032356號及美國臨時申請案62/464,327號中，在此作為參考文獻引述。

通常，尾部結構包含聚(A)及/或聚(C)尾部。mRNA之3'端上的聚A或聚C尾部通常包含分別至少50個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少150個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少200個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少250個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少300個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少350個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少400個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少450個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少500個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少550個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少650個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少700個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少750個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少800個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少850個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少900個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、至少950個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、或至少1 kb腺苷酸或胞嘧啶核苷酸。在一些實施例中，聚A或聚C尾部可為約10至800個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸（例如，分別為約10至200個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約10至300個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約10至400個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約10至500個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約10至550個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約10至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約50至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約100至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約150至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約200至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約250至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約300至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約350至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約400至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約450至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約500至600個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約10至150個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約10至100個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、約20至70個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸、或約20至60個腺苷酸或胞嘧啶核苷酸）。在一些實施例中，尾部結構包含具有如本文所描述之各種長度的聚(A)及聚(C)尾部之組合。在一些實施例中，尾部結構包含至少50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%腺苷核苷酸。在一些實施例中，尾部結構包含至少50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胞嘧啶核苷酸。

如本文中所述，添加5’帽及/或3’尾部有助於檢測 活體外合成期間生成的退化轉錄體，因為不加帽及/或尾部時這些提前退化的mRNA轉錄體的大小可能會太小而無法檢測。因此，在一些實施例中，在測試mRNA之純度（例如，存在於mRNA中之退化轉錄體的含量）之前先將5'帽及/或3'尾部添加至合成mRNA中。在一些實施例中，如本文所描述，在將mRNA純化之前將5'帽及/或3'尾部添加至合成mRNA上。在其他實施例中，在mRNA純化之後將5'帽及/或3'尾部添加至合成mRNA上。 合成後純化

在一些實施例中，於 活體外合成mRNA經沉澱以提供包括沉澱mRNA的懸浮液，使得其可自污染物分離，例如藉由切向流過濾、深度過濾或離心（例如，使用過濾離心機）。懸浮液可包括來自 活體外合成反應的各種污染物，例如質體DNA及酶。

在一些實施例中，沉澱mRNA包括添加一或多種促進mRNA沈澱之試劑，例如，醇、兩親聚合物、緩衝液、鹽及/或界面活性劑中之一或多者。在特定具體例中，促進mRNA沈澱的一或多種試劑為(i)鹽（例如，離散鹽）及(ii)醇或兩親聚合物。

沈澱的mRNA通常由膜或過濾器保留或捕獲，而污染物則被移除。所保留之沉澱mRNA經洗滌以移除沉澱步驟所需的鹽類，以及移除任何剩餘的污染物。沖洗所保留之沉澱mRNA通常涉及使用洗滌緩衝液的執行一或多個洗滌步驟。

在一些實施例中，洗滌緩衝液包括醇或親水聚合物。在一些實施例中，洗滌緩衝液包括醇（例如乙醇），其重量/體積濃度為約50%、60%、70%、80%或90%。在其他實施例中，洗滌緩衝液包括兩親聚合物，如聚乙二醇(PEG)或三乙二醇單甲醚MTEG。

經洗滌之保持沉澱的mRNA係通過溶解mRNA來從膜或過濾器中回收，以提供實質上不含來自 活體外合成反應的污染物的mRNA水溶液。

因此，在一些實施例中，本發明提供一種大規模製造全長訊息RNA (mRNA)之方法，其不包括色層分析步驟，所述方法包括： i. 使用SP6 RNA聚合酶於 活體外合成mRNA，其中在單批次中合成至少1 g的mRNA（例如，至少250 g或至少500 g）； ii. 沉澱單批次於 活體外合成mRNA，以去除衍生自 活體外合成反應之污染物物； iii. 在膜或過濾器上捕獲沉澱的mRNA； iv. 於該膜或過濾器上洗滌該沈澱之mRNA；及 v. 溶解該mRNA以提供mRNA水溶液，其實質上不含來自 活體外合成反應的污染物（例如短聚體、酶試劑及雙股RNA (dsRNA)）。

在特定實施例中，於 活體外合成mRNA之步驟係以等於或大於按重量計之DNA模板含量的SP6 RNA聚合酶含量進行。舉例而言，在一典型實施例中，DNA模板對SP6 RNA聚合酶之重量比介於1：1與1：3之間。

在特定實施例中，mRNA中之dsRNA的含量低於偵檢測極限，例如使用單株抗體J2藉斑點雜交判定。在另外特定實施例中，超過90%為全長mRNA ，例如，如藉由毛細管電泳中主峰之分析所判定。在一特定實施例中，在上述方法之步驟v)中獲得的mRNA包括 活體外合成反應中所使用之不可檢測含量的蛋白質或酶，例如，如藉由銀染所測定。 mRNA 的表徵

本領域認可各種用於表徵於 活體外合成mRNA的方法。mRNA的全長或退化轉錄體可使用本領域中中可用之任何方法檢測及定量，例如使用墨點法、毛細管電泳、色層分析法、螢光法、凝膠電泳法、HPLC、銀染法、光譜法、紫外光法(UV)、或UPLC、具有由毛細管電泳分離之UV吸收光譜、或其任何組合。在一些實施例中，mRNA在凝膠電泳（「Glyoxal 凝膠電泳」）之前首先藉由Glyoxal染料變性。在一些實施例中，在加帽及加尾之前表徵合成mRNA。在一些實施例中，在加帽及加尾之後表徵合成mRNA。

在一些實施例中，除了全長mRNA，藉由本文所揭示之方法生成的mRNA包括低於10%、低於9%、低於8%、低於7%、低於6%、低於5%、低於4%、低於3%、低於2%、低於1%、低於0.5%、低於0.1%的雜質。雜質包含IVT污染物， 例如，蛋白質、酶、游離核苷酸、短聚體及/或dsRNA。

在一些實施例中，根據本發明製造的mRNA實質上不含聚體或退化轉錄體。尤其，根據本發明製造的mRNA含有由毛細電泳或Glyoxal凝膠電泳無法檢測到含量的短聚體或退化轉錄體。如本文所用，術語「短聚體」或「退化轉錄體」係指小於全長的任何轉錄體。在一些實施例中，「短聚體」或「退化轉錄體」的長度小於100個核苷酸，長度小於90個、小於80個、小於70個、小於60個、小於50個、小於40個、小於30個、小於20個或小於10個核苷酸。在一些實施例中，在添加5'-帽及/或3'-聚A尾部之後，檢測或定量出短聚體。 蛋白質表現

根據本發明合成之mRNA導致更有效率之蛋白質轉譯。在一些實施例中，一旦轉染至細胞中，使用SP6 RNA聚合酶根據本發明合成的mRNA會導致蛋白質表現增加，例如與使用T7或T3 RNA聚合酶合成的相同含量的mRNA相比，至少增加2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多。

在一些實施例中，一旦轉染至細胞中，根據本發明合成的mRNA會導致由mRNA編碼的蛋白活性增加，例如與使用T7或T3 RNA聚合酶合成的相同含量的mRNA相比，至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、500倍、1000倍或更多。

使用本發明可合成任何mRNA。在一些實施例中，mRNA編碼一或多種天然存在的肽。在一些實施例中，mRNA編碼一或多種經修飾或非天然肽。

在一些實施例中，mRNA編碼細胞內蛋白。在一些實施例中，mRNA編碼胞質蛋白。在一些實施例中，mRNA編碼與肌動蛋白細胞骨架相關聯之蛋白質。在一些實施例中，mRNA編碼與該漿膜相關之蛋白質。在一些特定實施例中，mRNA編碼跨膜蛋白質。在一些特定實施例中，mRNA編碼離子通道蛋白質。在一些實施例中，mRNA編碼核周蛋白。在一些實施例中，mRNA編碼核蛋白質。在一些特定實施例中，mRNA編碼轉錄因子。在一些實施例中，mRNA編碼伴護蛋白。在一些實施例中，mRNA編碼胞內酶（例如編碼與尿素循環或溶酶體儲存代謝病症相關聯之酶的mRNA）。在一些實施例中，mRNA編碼涉及細胞代謝、DNA修復、轉錄及/或轉譯之蛋白質。在一些實施例中，mRNA編碼細胞外蛋白。在一些實施例中，mRNA編碼與該細胞外基質相關聯的蛋白質。在一些實施例中，mRNA編碼分泌蛋白。在具體實施例中，在本發明組成物及方法中使用的mRNA可用於表現由一或多個目標細胞排出或分泌至周圍細胞外流體中的功能性蛋白質或酶（例如，編碼荷爾蒙之mRNA及/或神經傳遞質）。

本發明提供一種製造富含編碼感興趣之肽或多肽之全長mRNA分子以用於向個體遞送或治療的治療性組成物的方法， 例如，人類個體或人類個體的細胞或經治療及遞送至人類個體的細胞。

因此，在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼用於遞送至或治療個體肺部或肺細胞的肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼囊腫纖化症跨膜傳導調節(CFTR)蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼ATP結合匣亞家族A成員3蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼動力蛋白軸突中間鏈1蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼動力蛋白軸突重鏈5(DNAH5)蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼α-1抗胰蛋白酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼叉頭框P3 (FOXP3)蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼一或多種界面活性劑蛋白質（ 例如，界面活性劑A蛋白質、界面活性劑B蛋白質、界面活性劑C蛋白質及界面活性劑D蛋白質中之一或多者)之富集全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼用於遞送至或治療個體肝臟或肝細胞的肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。此類肽及多肽可包含那些與尿素循環病症有關、與胞溶體貯積病症有關、與肝醣貯積病症有關、與胺基酸代謝失調有關、與脂質代謝有關或與纖維變性病症有關、與甲基丙二酸血症有關、或與任何其它代謝性病症有關，通過向肝臟或肝細胞遞送或治療實質上不含dsRNA之富集的全長mRNA以提供治療益處。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼與尿素循環病症相關蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼鳥胺酸氨甲醯基轉移酶(OTC)蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼精氨基琥珀酸合成酶1蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼胺甲醯基磷酸合成酶I蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼精胺琥珀水解蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼精胺酸酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼與溶酶體儲存病症相關蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼α半乳糖苷酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼葡萄糖腦苷酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼艾杜糖 2-硫酸酯酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼艾杜糖醛酸酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼N-乙醯基-α-D-葡萄糖苷酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼肝素N-硫酸酯酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼半乳胺糖-6硫酸酯酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼β-半乳糖苷酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼溶酶體脂肪酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼芳基硫酸酯酶B （N-乙醯半乳胺糖-4-硫酸酯酶）蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼轉錄因子EB(TFEB)之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼螢火蟲螢光素酶(FFL)之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼人類紅血球生成素(EPO)mRNA之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼與肝醣儲存病症相關蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼酸α-葡萄糖苷酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼肝醣磷酸化酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼肌肉磷酸甘油酸突變酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼肝醣去分支酶之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼與胺基酸代謝相關蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼苯丙胺酸羥化酶(PAH)之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼戊二醯基-CoA脫氫酶之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼丙醯基-CoA羧酶之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼草酸酯丙胺酸-乙醛酸轉胺酶之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼與脂質代謝或纖維病症相關蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼mTOR抑制劑之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼三磷酸腺苷酶磷脂運輸8B1(ATP8B1)蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼一或多種NF-κB抑制劑（諸如I-κB α、干擾素相關發育調節子1(IFRD1)及乙酰化酶1(SIRT1)中之一或多者)之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼PPAR-γ蛋白或活性變體之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼與甲基丙二酸血症相關蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。舉例而言，在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼甲基丙二酸單醯輔酶A變位酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼甲基丙二酸單醯輔酶A表異構酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且可遞送或治療肝臟以獲得治療益處之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼ATP7B蛋白質（亦稱為威爾森氏症蛋白質）之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼膽色素原脫胺酶之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼一種或凝血酶，諸如第八因子、第九因子、第七因子及第十因子。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼人類血色素沉著症(HFE)蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼用於向個體心血管或心血管細胞遞送或治療之肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼血管內皮生長因子A蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼鬆弛素蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼骨成形性蛋白質-9蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼骨成形性蛋白質-2受體蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼用於向個體肌肉或肌肉細胞遞送或治療之肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼肌肉萎縮蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼共濟蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼用於向個體或心肌細胞遞送或治療之肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼調節肌肉組織或肌肉細胞中鉀通道及鈉通道中之一者或兩者蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼調節肌肉組織或肌肉細胞中Kv7.1通道蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼調節肌肉組織中或肌肉細胞中Nav1.5通道蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼用於向個體或神經系統細胞遞送或治療神經系統之肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。舉例而言，在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼運動神經元存活因子1蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。舉例而言，在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼運動神經元存活因子2蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼共濟蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼ATP結合匣亞家族D成員1(ABCD1)蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼CLN3蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼用於向個體血液或骨髓或血液或骨髓細胞遞送或治療之肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼乙型球蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼布鲁頓酪胺酸激酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些具體例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼一種或凝血酶（諸如第八因子、第九因子、第七因子、及第十因子）之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼用於向個體腎臟或腎細胞遞送至或治療之肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼膠原蛋白第四型α5鏈(COL4A5)蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種用於製造實質上不含dsRNA且編碼用於向個體眼睛或眼睛細胞遞送或治療之肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼ATP結合匣亞家族A成員4 (ABCA4)蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼視網膜色素蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼網膜色素上皮特異性65 kDa(RPE65)蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼290 kDa (CEP290)中心體蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼用於向個體或個體的細胞遞送或以疫苗治療之肽或多肽之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。舉例而言，在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自感染原（諸如病毒）抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自流感病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自呼吸道融合細胞病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自狂犬病病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自細胞巨大病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自輪狀病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自肝炎病毒（諸如A型肝炎病毒、B型肝炎病毒或C型肝炎病毒）的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自人類乳突病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自單純疱疹病毒（諸如單純疱疹病毒1或單純疱疹病毒2）的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自人類免疫缺陷病毒（諸如人類免疫缺陷病毒第1型或人類免疫缺陷病毒第2型）的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自人類間質肺炎病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自人類副流感病毒（諸如人類副流感病毒第1型、人類副流感病毒第2型）、或人類副流感病毒第3型)抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自瘧疾病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自茲卡病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼來自屈公病毒的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼與個體癌症相關或自個體癌細胞辨識的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼自個體自身癌細胞測定之抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法，亦即以提供個人化癌症疫苗。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼自突變KRAS基因表現的抗原之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼抗體之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，抗體可為雙特異性抗體。在某些實施例中，抗體可為融合蛋白之一部分。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼OX40抗體之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼VEGF抗體之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼腫瘤壞死因子α抗體之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼CD3抗體之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼CD19抗體之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼免疫調節劑之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼介白素12之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼介白素23之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼介白素36γ之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼一種或多種干擾素基因(STING)蛋白質刺激物之組成活性變體之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。

在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼核酸內切酶之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼RNA引導之DNA核酸內切酶蛋白質（諸如Cas 9蛋白質）之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼巨核酸酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼轉錄激活子樣效應核酸酶蛋白之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。在某些實施例中，本發明提供一種製造實質上不含dsRNA且編碼鋅指核酸酶蛋白質之富含全長mRNA的治療性組成物的方法。 脂質奈米顆粒

根據本發明合成之mRNA可使用任何方法調配及遞送以供 活體內蛋白質製造。在一些實施例中，將mRNA封裝至轉移媒劑（諸如奈米顆粒）中。除此之外，此類封裝的一個目的通常係保護核酸，以避免可能含有使核酸及/或導致核酸快速排出之系統或受體降解之酶或化學物質的環境。因此，在一些實施例中，合適的遞送媒劑可提高其所含之mRNA的穩定性及/或促進mRNA遞送至目標細胞或組織。在一些實施例中，奈米顆粒可為基於脂質的奈米顆粒， 例如，包括脂質體或基於聚合物的奈米顆粒。在一些實施例中，奈米顆粒可具有小於約40-100 nm的直徑。奈米顆粒可包含至少1 µg、10 µg、100 µg、1 µg、10 µg、100 µg、1 g或更多的mRNA。

在一些實施例中，轉移媒劑為脂質體囊泡、或其他促進核酸轉移至目標細胞及組織的方法。適當的轉移媒劑包含但不限於脂質體、奈米脂質體、含腦醯胺的奈米脂質體、蛋白脂質體、奈米微粒、磷酸矽酸鈣奈米微粒、磷酸鈣奈米微粒、二氧化矽奈米微粒、奈米結晶微粒、半導體奈米微粒、聚（D-精胺酸）、奈米樹枝狀聚合物、基於澱粉的遞送系統、微胞、乳液、類脂質體、質體、病毒、磷酸鈣核苷酸、適配體、肽及其它向量標籤。亦涵蓋使用生物奈米膠囊及其它病毒衣殼蛋白組件作為合適的轉移媒劑。（Hum. Gene Ther，2008年9月；19(9):887-95）。

脂質體可包含一或多種陽離子脂質、一或多種非陽離子脂質、一或多種基於固醇的脂質，及/或一或多種經PEG修飾的脂質。脂質體可包含三種或更多種脂質的單獨成分，一種脂質的單獨成分為基於固醇的陽離子脂質。在一些實施例中，基於固醇的陽離子脂質為咪唑膽固醇酯或「ICE」脂質（參見WO 2011/068810，其全文通過引用併入）。在一些實施例中，基於固醇的陽離子脂質在脂質奈米顆粒（例如脂質體）中的構成不超過總脂質的70%（例如不超過65%及60%）。

合適的脂質實例包含，例如，磷脂醯化合物（ 例如，甘油磷脂、卵磷脂、磷脂醯絲胺酸、磷脂醯乙醇胺、神經脂質、腦苷脂及神經節苷脂）。

陽離子脂質之非限制性實例包含C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE（基於咪唑）、HGT5000、HGT5001、OF-02、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODPAP、DODMA及DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA及HGT4003、或其組合。

非陽離子脂質之非限制性實例包含腦醯胺；腦磷脂；腦苷脂；二酸甘油脂；1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸甘油酯鈉鹽(DPPG)；1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺(DSPE)；1,2-二硬脂醯基-sn-丙三基-3-磷酸膽鹼(DSPC)；1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DPPC)；1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺(DOPE)；1,2-二油醯基-sn-甘油-3-卵磷脂(DOPC)；1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺(DPPE)；1,2-肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂醯乙醇胺(DMPE)；以及1,2-二油醯基- sn-甘油-3-磷酸-(1'- rac-甘油)(DOPG)；1-棕櫚醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)；1-棕櫚醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)；1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)；鞘磷脂；或其組合。

在一些實施例中，PEG修飾脂質可為長達5 kDa的聚（乙烯）乙二醇鏈，其共價附接至具有C ₆-C ₂₀長度之烷基鏈的脂質。PEG修飾脂質之非限制性實例包含DMG-PEG、DMG-PEG2K、 C8-PEG、DOG PEG、神經醯胺PEG及DSPE-PEG或其組合。

亦涵蓋將聚合物用作轉移媒劑之用途，無論是單獨使用或與其他轉移媒劑組合使用。合適的聚合物可包含，例如，聚丙烯酸酯、聚烴基氰基丙烯酸酯、聚乳酸、聚乳酸-聚甘胺酸交酯共聚物、聚己內酯、聚葡萄醣、白蛋白、明膠、藻酸鹽、膠原蛋白、幾丁聚醣、環糊精及聚乙烯亞胺。基於聚合物的奈米顆粒可包含聚乙烯亞胺(PEI)，例如支鏈PEI。

與本發明相關的額外教示描述於以下之一或多者中：WO2011/068810、WO2012/075040、US 15/294,249、US62/420,421及US62/421,021，以及由申請人於2017年2月27日所提交的相關申請，其名為「純化訊息RNA的方法」、「新穎最佳化密碼子CFTR序列」、及「純化訊息RNA的方法」，每一者通過引用將其全部併入本文。

儘管與本文所描述之方法及材料類似或者等效之方法及材料可用於實踐或者測試本發明，但下方描述了合適的方法和材料。所有公開案、專利申請案、專利及本文所提及之其他參考文獻均以全文引用之方式併入。本文中引用之參考文獻不承認為所主張發明之先前技術。此外，材料、方法及實例僅為描述性的且非意欲為限制性的。實施例實例 1 ：使用 SP6 RNA 聚合酶而非 T7 RNA 聚合酶的活體外轉錄生成的 mRNA 製成品實質上不含雙股 RNA

此實例說明通過斑點雜交檢測，使用SP6 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶藉由 活體外轉錄(IVT)所生成mRNA製成品中存在之雙股RNA的含量。

活體外轉錄過程通過在相同股的互補性區域或者在產出5'或3'外緣突出dsRNA之相對股上藉由鹼基配對生成雙股RNA（圖1）。dsRNA是mRNA療法應用所不想得到的污染物。

為了測量SP6 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶於 活體外轉錄期間生成的雙股RNA的含量，首先進行合成mRNA。T7轉錄反應由1x T7轉錄緩衝液（80mM HEPES pH 8.0、2 mM精胺酸和25 mM MgCl ₂，最終pH為7.7）、10 mM DTT、7.25 mM之ATP、GTP、CTP和UTP每一者、核糖核酸酶抑制劑、焦磷酸酶以及T7 RNA聚合酶組成。SP6反應包含5 mM NTP之每一者、約0.05 mg/mL SP6聚合酶DNA和約0.1 mg/mL模板DNA；不同轉錄緩衝液的其他成分。反應係於37°C下進行60至90分鐘（除非另有指示）。將去氧核醣核酸酶I加入以停止反應，並在37°C下培育15分鐘。根據製造商建議，使用Qiagen RNA maxi管柱純化於 活體外轉錄mRNA。使用部分GTP (1.0 mM)、S-腺苷甲硫胺酸、核糖核酸酶抑制劑、2’-O-甲基轉移酶以及鳥苷酸轉移酶處理來自前述 活體外轉錄步驟之經純化mRNA製成品，並與反應緩衝液（10x、500 mM Tris-HCl （pH 8.0）、60 mM KCl、12.5 mM MgCl ₂）一起混和。將組合溶液在37°C下培育時間範圍30至90分鐘。完成後，添加ATP (2.0 mM)、聚A聚合酶及加尾反應緩衝液（10x、500 mM Tris-HCl (pH 8.0)、2.5 M NaCl、100 mM MgCl ₂）之等分試樣，且總反應混合物在37°C下進一步培育20至45分鐘之時間範圍。完成後，使最終反應混合物進行猝火且相應地純化。

簡言之，對於每克轉錄之mRNA，使用具有RNA聚合酶特異性啟動子之含20 mg直鏈雙股DNA質體、10 mg RNA聚合酶、核糖核酸酶抑制劑、焦磷酸酶、多個5 mM NTP、10 mM DTT及反應緩衝液（10x-250 mM Tris-HCl、pH 7.5、20 mM 精胺酸、50 mM NaCl）與足量(QS)至200 mL的不含核糖核酸酶的水，隨後在37 C下培育60分鐘。隨後藉由添加去氧核醣核酸酶I及去氧核醣核酸酶I緩衝液（10x - 100 mM Tris-HCl、5 mM MgCl ₂及25 mM CaCl ₂ _，pH 7.6）使該反應淬火，以便於雙股DNA模板之消化。

在一些實施例中，純化之 於活體外轉錄之mRNA之以酶促方式被修飾是藉由使用鳥苷酸轉移酶添加5′N ⁷-甲基化鳥苷酸帽0結構，以及使用2′O-甲基轉移酶在前末端基核苷酸之2′ O位置處添加甲基以得到Cap 1結構，如Fechter， P所描述者；Brownlee，G.G.「藉由病毒及細胞蛋白質辨識mRNA帽結構」 J. Gen. 病毒學2005, 86, 1239-1249。在添加帽1結構之後，使用聚A聚合酶以酶法將聚腺苷酸尾部添加至 活體外轉錄mRNA的3'端。簡言之，加帽反應設置為每克純化的IVT含有2.5 mM GTP、246 µM S-腺苷甲硫胺酸、核糖核酸酶抑制劑、2'-O-甲基轉移酶、鳥苷酸轉移酶、反應緩衝液（10x - 500 mM Tris-HCl pH 8.0，60 mM MgCl ₂及12.5 mM MgCl ₂，以及QS至650 mL不含核糖核酸酶的H ₂O中然後在37 C下培育60分鐘。在培育之後，藉由添加加尾緩衝液（10x-500 mM Tris-HCl pH 8.0，2.5 M NaCl，100 mM MgCl ₂）、3.7 mM ATP、聚A聚合酶以及QS至800 mL不含核糖核酸酶的H ₂O中引發加尾反應。在添加12.5 mM EDTA進行淬火之前，在37°C下進行30分鐘加尾反應。

進行斑點雜交以檢測藉由SP6 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶在mRNA合成期間所生成的雙股RNA含量。在對轉錄的RNA進行加帽及加尾之前或之後，對mRNA製成品進行斑點雜交。在2 μL樣品體積中，依每個SAM HA樣品之200 ng RNA進行雜交。抗dsRNA單株抗體J2用作初級抗體，而抗小鼠IgG HRP用作二級抗體。J2抗體辨識dsRNA，其限制條件為螺旋長度大於或等於40 bp。辨識dsRNA係獨立於mRNA之序列及核苷酸組成物。J2抗體為偵測dsRNA之黃金標準。

在暴露一分鐘後偵測到訊號（圖2），並與作為對照組之從2 ng或25 ng的雙股RNA標準載量所獲得的訊號進行比較。結果顯示，使用T7 RNA聚合酶生成超過25 ng的雙股RNA（圖2，標記為第3道和第4道）。相對的，使用SP6 RNA聚合酶之反應中所生成的dsRNA的含量係低於檢測極限（圖2，標記為第1道和第2道）。

這些結果顯示，使用SP6 RNA聚合酶藉由IVT合成mRNA所生成的mRNA實質上不含雙股RNA，適用於下游應用。使用SP6 RNA聚合酶是一種藉由IVT生成mRNA的方法，其無需大量的雙股RNA。實例 2 ：與相應 T7 聚合酶衍生的 mRNA 製成品相比，例示性 SP6 聚合酶衍生的 mRNA 製成品實質上不含雙股 RNA 。

此實例展現與由T7聚合酶合成的對應mRNA製成品相比，由SP6 RNA聚合酶合成的例示性mRNA製成品實質上不含雙股RNA。

基於實例1描述的條件，例示性mRNA包含人類囊腫纖維化跨膜傳導調節蛋白(CFTR) mRNA、螢火蟲螢光素酶(FFL) mRNA、苯丙胺酸羥化酶(PAH) mRNA、鳥胺酸氨甲醯基轉移酶(OTC) mRNA、或人類紅血球生成素(EPO) mRNA，其係分別使用SP6 RNA聚合酶或T7聚合酶在 活體外轉錄。

為了測量雙股RNA的含量，使用SP6聚合酶或T7聚合酶在200 ng的mRNA上進行斑點雜交。用抗dsRNA J2單株抗體探測墨點，且隨後用二級抗小鼠IgG辣根過氧化酶抗體培育。每個樣本獲得的訊號與對照組25 ng dsRNA標記（圖3，第1道）相比較。

結果顯示使用T7聚合酶生成的mRNA含有可檢測的CFTR雙股RNA，其在200 ng的雜交RNA中高達約25 ng（即12.5 %）。相比之下，使用SP6 RNA聚合酶之合成mRNA含有小於25 ng可檢測的雙股CFTR RNA（圖3，第2道）。

類似地，雖然T7聚合酶所轉錄之FFL、PAH、OTC及EPO mRNA製成品含有少於25 ng的雙股RNA，SP6 RNA聚合酶所轉錄之FFH、PAH、OTC及EPO mRNA製成品中的雙股RNA含量低於檢測極限（圖3，第3-6道)。

這些結果顯示，使用SP6 RNA聚合酶由IVT合成mRNA，生成各種實質上不含dsRNA的例示性mRNA製成品，適用於下游應用。使用SP6聚合酶是由IVT生成不含大量dsRNA之mRNA製成品的廣泛適用方法。實例 3 ：使用 SP6 聚合酶將 mRNA 擴大至毫克量所生成的 mRNA 製成品實質上不含雙股 RNA

此實例說明以大規模 活體外轉錄生成的毫克量mRNA製成品的雙股RNA含量。多個例示性mRNA係基於實例1中所描述之條件，分別使用SP6 RNA聚合酶及T7 RNA聚合酶合成的。該程序經擴大以在單批次中生成毫克量的mRNA。

使用T7 RNA聚合酶（舊流程）或SP6 RNA聚合酶（新流程）對多個例示性mRNA（包含人類囊腫纖化症跨膜傳導調節蛋白(CFTR) mRNA、苯丙胺酸羥化酶(PAH) mRNA、鳥胺酸氨甲醯基轉移酶(OTC) mRNA或HA mRNA）進行轉錄。

為了測量雙股RNA的含量，使用T7 RNA聚合酶（舊流程）或SP6 RNA聚合酶（新流程）在毫克量之轉錄mRNA上進行斑點雜交。用抗dsRNA J2單株抗體探測墨點，且隨後用二級抗小鼠IgG辣根過氧化酶抗體培育。將在暴露一分鐘後從每個樣品中檢測到的訊號與從dsRNA對照獲得的訊號作比較。

舊流程生成的例示性CFTR mRNA製成品含有大量雙股RNA，而新流程生成的對應CFTR mRNA製成品含有低於檢測極限的雙股RNA（圖4A）。

類似地，舊流程生成的例示性PAH mRNA製成品含有大量雙股RNA，而新流程生成的對應PAH mRNA製成品的雙股RNA含量低於檢測極限（圖4B）。

此外，由舊流程生成的例示性OTC mRNA製成品含有大量雙股RNA。相對的，新流程生成的對應OTC mRNA製成品的雙股RNA含量低於檢測極限（圖4C）。

此實例展現SP6介導之mRNA合成（新流程）可經擴大至毫克量且產出實質上不含dsRNA之mRNA製成品。實例 4 ：使用 SP6 RNA 聚合酶生成之毫克量經修飾及未經修飾之 mRNA 實質上不含雙股 RNA

在此實例中，使用SP6 RNA聚合酶於 活體外轉錄合成毫克量HA mRNA。為了比較包括有經修飾之核糖核苷酸之HA mRNA製成品中存在的dsRNA含量，在結合經修飾核糖核苷酸至聚合轉錄體之單批次中合成mRNA，以與結合天然核糖核苷酸所合成之mRNA進行比較。

為了測量dsRNA的含量，進行斑點雜交。用抗dsRNA J2單株抗體探測墨點，且隨後用二級抗小鼠IgG辣根過氧化酶抗體培育。將在暴露一分鐘後從每個樣品中檢測到的訊號與從dsRNA對照獲得的訊號作比較。

結果顯示，使用SP6 RNA聚合酶於 活體外轉錄生成的經修飾及未經修飾型式的HA mRNA製成品缺乏大量的dsRNA（圖4D）。

此實施例展現結合經修飾或未經修飾之核糖核苷酸由SP6介導合成的mRNA可擴大至毫克量且產出實質上不含雙股RNA之mRNA製成品。實例 5 ：使用 SP6 RNA 聚合酶進行大規模合成 mRNA ，以生成 100 克的 mRNA 製成品，其實質上不含雙股 RNA

此實例說明在大規模克量生成之mRNA製成品中存在之雙股RNA的含量。在此實例中，100克的CFTR mRNA係藉由使用SP6 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶於 活體外轉錄在單批次中製造。

為了測量雙股RNA的含量，在使用SP6 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶所生成之mRNA製成品上進行斑點雜交。用抗dsRNA J2單株抗體探測墨點，且隨後用二級抗小鼠IgG辣根過氧化酶抗體培育。將在暴露一分鐘後從每個樣品中檢測到的訊號與從dsRNA對照獲得的訊號作比較（圖5，第1道）。

結果顯示在T7聚合酶反應中製造大量雙股RNA（圖5，第2道），而SP6 RNA聚合酶反應中製造的雙股RNA的含量低於檢測極限（圖5，第3道）。

此實例展現SP6 RNA聚合酶合成可擴增，以符合高品質mRNA製成品的商業製造，其實質上不含雙股RNA。實例 6 ：使用 SP6 RNA 聚合酶單批次合成之 250 mg mRNA 實質上不含雙股 RNA

此實例說明以大規模克量生成之mRNA製成品中存在之雙股RNA的量。在此實例中，250克的CFTR mRNA係藉由使用SP6 RNA聚合酶於 活體外轉錄在單批次中製造。

使用SP6 RNA聚合酶在單批次中製造的250 mg 活體外合成OTC mRNA係藉由毛細管電泳(CE)、質譜、瓊脂糖凝膠分析來分析完整性（圖6A-6C）。評估於 活體外合成mRNA是否存在雙股RNA (dsRNA)（圖6D），且亦藉由銀染評估純度（圖6E）。來自這些研究之資料顯示，使用SP6 mRNA之大規模合成製造mRNA具有高完整性且如斑點雜交法評定不具有任何可檢測的雙股RNA（圖6D）。使用SP6聚合酶合成之OTC亦展示高加帽含量，如圖6B所示。整體而言，這些資料顯示，在mRNA純度方面有所改善、減少或消除可檢測的雙股RNA，以及使用SP6 RNA聚合酶獲得高度完整性的RNA。實例 7 ：使用 SP6 RNA 聚合酶優化 mRNA 的活體外合成

使用SP6 RNA聚合酶進行進一步研究，以最佳化 活體外mRNA之合成條件。對於這些研究而言，SP6 RNA聚合酶的含量改變，且質體DNA（pDNA – DNA模板）也改變，以確定這些試劑濃度變化后對 活體外合成mRNA產量的影響。這些研究中分析的結果和條件彙整於下方表1中。表1：使用SP6 RNA聚合酶測試之最佳條件

	條件 A	條件 B	單位
pDNA	20	10	mg/g RNA
SP6	10	20	mg/g RNA
	目標	實際值
產量	250	288	克

如表1中所述，測試了兩種pDNA濃度：1) 20 mg/g RNA，以及2) 10 mg/g RNA。同樣地，測試了兩種濃度的SP6：1) 10 mg/g RNA；及2) 20 mg/g RNA。結果顯示，將使用的SP6 RNA聚合酶含量從10 mg/g RNA增加至20 mg/g RNA會導致mRNA產量為288克。結果亦顯示將pDNA濃度自10 mg/g RNA增加至20 mg/g RNA，具有較低產量，製造出250克mRNA。此等資料顯示，提高反應中SP6 RNA聚合酶的濃度會導致大於藉由增加反應中所使用之pDNA之含量所得的產量。具體而言，增加SP6 RNA聚合酶的濃度同時保持持續的pDNA含量會導致產量增加。

來自這些研究之結果在圖7A、7B和7C中以圖形方式說明，其顯示產量、關鍵試劑用量、以及使用前述統整於表1中的條件A或條件B藉SP6 RNA聚合酶合成mRNA的銷售成本(CoGS)。實例 8 ：使用 SP6 RNA 聚合酶之經修飾 mRNA 的活體外合成

此實例說明使用SP6 RNA聚合酶之 活體外轉錄(IVT)生成的經修飾之mRNA製成品實質上不含dsRNA及短聚體污染物兩者。

mRNA係使用一具有RNA聚合酶特異啟動子的直鏈雙股DNA質體、適當含量之SP6 RNA聚合酶或T7 RNA聚合酶、RNase抑制劑、焦磷酸酶及包括例如1-N-甲基-假尿苷而非尿苷之多個NTP以及適當反應緩衝液來合成的。

在兩項獨立實驗中，使用SP6 RNA聚合酶生成的經修飾mRNA實質上不含dsRNA及短聚體兩者。相比之下，使用T7 RNA聚合酶生成的經修飾的mRNA含有微量短聚體。等效者

熟悉本技藝者將認識到或者能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明特定具體例之許多等效方案。本發明的範圍並不意欲受限於以上描述，而是如隨附申請專利範圍中所記載者。

無

以下圖式僅用於說明而非限制目的。

圖1是說明 活體外轉錄期間dsRNA生成過程的示意圖。(a)全長RNA可形成具有內部互補性區域的環。(b)在IVT起始期生成的退化RNA片段，及全長RNA的3'端可以自導致生成dsRNA污染物的初級轉錄體中引發互補RNA合成。(c)啟動子獨立轉錄全長反義RNA是dsRNA生成的另一機制。

圖2是斑點雜交，其顯示使用SP6 RNA聚合酶（第1道和第2道）與T7聚合酶（標記第3道和第4道）於 活體外轉錄生成的mRNA製成品中存在的dsRNA含量比較。存在的dsRNA含量係相對於2 ng或25 ng的標準dsRNA對照組定量。

圖3是斑點雜交，其顯示使用SP6 RNA聚合酶與T7聚合酶於 活體外轉錄生成的例示性mRNA製成品中存在的dsRNA含量比較。例示性mRNA製成品包含相對於dsRNA對照組（第1道）之人類囊腫纖化症跨膜傳導調節蛋白(CFTR) mRNA（第2道）、螢火蟲螢光素酶(FFL) mRNA（第3道）、苯丙胺酸羥化酶(PAH) mRNA（第4道）、鳥胺酸氨甲醯基轉移酶(OTC) mRNA（第5道）或人類紅血球生成素(EPO) mRNA（第6道）。

圖4A是斑點雜交，其顯示相對於dsRNA對照（第1道），藉由舊流程(使用T7聚合酶，第2道)與新流程(使用SP6 RNA聚合酶，第3道)之 活體外轉錄囊腫纖化症跨膜傳導調節蛋白 (CFTR) mRNA製成品所生成的dsRNA含量之比較。圖4B是斑點雜交，其顯示相對於dsRNA對照（第1道），藉由舊流程(使用T7聚合酶，第2道)與新流程(使用SP6 RNA聚合酶，第3道)之 活體外轉錄苯丙胺酸羥化酶(PAH)mRNA製成品所生成的dsRNA含量之比較。圖4C是斑點雜交，其顯示相對於dsRNA對照（第1道），藉由舊流程(使用T7聚合酶，第2道)與新流程(使用SP6 RNA聚合酶，第3道)之 活體外轉錄鳥胺酸氨甲基移轉酶 (OTC) mRNA製成品所生成的dsRNA含量之比較。圖4D是斑點雜交，其顯示相對於dsRNA對照（第1道），使用包括未經修飾（第3道）之SP6 RNA聚合酶與經修飾核糖核苷酸（第4道）之 活體外轉錄HA mRNA製成品所生成的dsRNA含量之比較。斑點也顯示生成的mRNA製成品（第2道）。

圖5是斑點雜交，其顯示使用T7聚合酶(第2道)與SP6聚合酶（第3道）大規模 活體外轉錄生成的100 g CFTR mRNA製成品中dsRNA含量之比較。dsRNA的含量係藉由與標準dsRNA對照（第1道）比較來定量。

圖6A是一系列圖表，其顯示使用SP6 RNA聚合酶在單批次中製造產出的250 mg OTC mRNA的尾部長度和完整性。圖6B是一份表格，其總結通過UPLC-MS對單批次中製造產出的250 mg OTC mRNA進行評估的帽分析。圖6C描繪在產出250 mg之單批次中製造之SP6 OTC mRNA之瓊脂糖凝膠。圖6D描繪斑點雜交，以評估使用T7 RNA聚合酶或SP6製造的雙股RNA的存在。其中亦顯示雙股對照組道。圖6E描繪一種銀染凝膠，其用以評估使用SP6聚合酶在產出250 mg之單批次中製造的OTC mRNA之純度。

圖7A至7C描繪一系列圖，其顯示比較SP6製造之OTC mRNA的「條件A」及「條件B」的各種數據。關於「條件A」，使用以下 活體外mRNA合成條件：pDNA = 20 mg/g RNA；SP6 = 10 mg/g RNA。關於「條件B」，使用以下 活體外mRNA合成條件：pDNA =10 mg/g RNA；以及SP6 = 20 mg/g RNA。圖7A是描繪使用條件A或條件B所製造之OTC mRNA的產量的圖。圖7B是描繪與條件A或條件B一起使用的試劑含量的圖。圖7C是說明使用條件A或條件B合成mRNA所得的銷售成本(CoGS)的圖。


          <![CDATA[<110>  美商崔斯雷生物公司(Translate Bio, Inc.)]]>
          <![CDATA[<120>  大規模合成訊息RNA]]>
          <![CDATA[<130>  MRT-2150WO]]>
          <![CDATA[<140>  TW 110138417]]>
          <![CDATA[<141>  2021-10-15]]>
          <![CDATA[<150>  63/092,274]]>
          <![CDATA[<151>  2020-10-15]]>
          <![CDATA[<160>  18    ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  874]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6 RNA聚合酶基因(GenBank：Y00105.1)]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Gln Asp Leu His Ala Ile Gln Leu Gln Leu Glu Glu Glu Met Phe 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Gly Ile Arg Arg Phe Glu Ala Asp Gln Gln Arg Gln Ile Ala 
                      20                  25                  30          
          Ala Gly Ser Glu Ser Asp Thr Ala Trp Asn Arg Arg Leu Leu Ser Glu 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Ala Pro Met Ala Glu Gly Ile Gln Ala Tyr Lys Glu Glu Tyr 
              50                  55                  60                  
          Glu Gly Lys Lys Gly Arg Ala Pro Arg Ala Leu Ala Phe Leu Gln Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Val Glu Asn Glu Val Ala Ala Tyr Ile Thr Met Lys Val Val Met Asp 
                          85                  90                  95      
          Met Leu Asn Thr Asp Ala Thr Leu Gln Ala Ile Ala Met Ser Val Ala 
                      100                 105                 110         
          Glu Arg Ile Glu Asp Gln Val Arg Phe Ser Lys Leu Glu Gly His Ala 
                  115                 120                 125             
          Ala Lys Tyr Phe Glu Lys Val Lys Lys Ser Leu Lys Ala Ser Arg Thr 
              130                 135                 140                 
          Lys Ser Tyr Arg His Ala His Asn Val Ala Val Val Ala Glu Lys Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ala Glu Lys Asp Ala Asp Phe Asp Arg Trp Glu Ala Trp Pro Lys 
                          165                 170                 175     
          Glu Thr Gln Leu Gln Ile Gly Thr Thr Leu Leu Glu Ile Leu Glu Gly 
                      180                 185                 190         
          Ser Val Phe Tyr Asn Gly Glu Pro Val Phe Met Arg Ala Met Arg Thr 
                  195                 200                 205             
          Tyr Gly Gly Lys Thr Ile Tyr Tyr Leu Gln Thr Ser Glu Ser Val Gly 
              210                 215                 220                 
          Gln Trp Ile Ser Ala Phe Lys Glu His Val Ala Gln Leu Ser Pro Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Tyr Ala Pro Cys Val Ile Pro Pro Arg Pro Trp Arg Thr Pro Phe Asn 
                          245                 250                 255     
          Gly Gly Phe His Thr Glu Lys Val Ala Ser Arg Ile Arg Leu Val Lys 
                      260                 265                 270         
          Gly Asn Arg Glu His Val Arg Lys Leu Thr Gln Lys Gln Met Pro Lys 
                  275                 280                 285             
          Val Tyr Lys Ala Ile Asn Ala Leu Gln Asn Thr Gln Trp Gln Ile Asn 
              290                 295                 300                 
          Lys Asp Val Leu Ala Val Ile Glu Glu Val Ile Arg Leu Asp Leu Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Gly Val Pro Ser Phe Lys Pro Leu Ile Asp Lys Glu Asn Lys Pro 
                          325                 330                 335     
          Ala Asn Pro Val Pro Val Glu Phe Gln His Leu Arg Gly Arg Glu Leu 
                      340                 345                 350         
          Lys Glu Met Leu Ser Pro Glu Gln Trp Gln Gln Phe Ile Asn Trp Lys 
                  355                 360                 365             
          Gly Glu Cys Ala Arg Leu Tyr Thr Ala Glu Thr Lys Arg Gly Ser Lys 
              370                 375                 380                 
          Ser Ala Ala Val Val Arg Met Val Gly Gln Ala Arg Lys Tyr Ser Ala 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Glu Ser Ile Tyr Phe Val Tyr Ala Met Asp Ser Arg Ser Arg Val 
                          405                 410                 415     
          Tyr Val Gln Ser Ser Thr Leu Ser Pro Gln Ser Asn Asp Leu Gly Lys 
                      420                 425                 430         
          Ala Leu Leu Arg Phe Thr Glu Gly Arg Pro Val Asn Gly Val Glu Ala 
                  435                 440                 445             
          Leu Lys Trp Phe Cys Ile Asn Gly Ala Asn Leu Trp Gly Trp Asp Lys 
              450                 455                 460                 
          Lys Thr Phe Asp Val Arg Val Ser Asn Val Leu Asp Glu Glu Phe Gln 
          465                 470                 475                 480 
          Asp Met Cys Arg Asp Ile Ala Ala Asp Pro Leu Thr Phe Thr Gln Trp 
                          485                 490                 495     
          Ala Lys Ala Asp Ala Pro Tyr Glu Phe Leu Ala Trp Cys Phe Glu Tyr 
                      500                 505                 510         
          Ala Gln Tyr Leu Asp Leu Val Asp Glu Gly Arg Ala Asp Glu Phe Arg 
                  515                 520                 525             
          Thr His Leu Pro Val His Gln Asp Gly Ser Cys Ser Gly Ile Gln His 
              530                 535                 540                 
          Tyr Ser Ala Met Leu Arg Asp Glu Val Gly Ala Lys Ala Val Asn Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Pro Ser Asp Ala Pro Gln Asp Ile Tyr Gly Ala Val Ala Gln Val 
                          565                 570                 575     
          Val Ile Lys Lys Asn Ala Leu Tyr Met Asp Ala Asp Asp Ala Thr Thr 
                      580                 585                 590         
          Phe Thr Ser Gly Ser Val Thr Leu Ser Gly Thr Glu Leu Arg Ala Met 
                  595                 600                 605             
          Ala Ser Ala Trp Asp Ser Ile Gly Ile Thr Arg Ser Leu Thr Lys Lys 
              610                 615                 620                 
          Pro Val Met Thr Leu Pro Tyr Gly Ser Thr Arg Leu Thr Cys Arg Glu 
          625                 630                 635                 640 
          Ser Val Ile Asp Tyr Ile Val Asp Leu Glu Glu Lys Glu Ala Gln Lys 
                          645                 650                 655     
          Ala Val Ala Glu Gly Arg Thr Ala Asn Lys Val His Pro Phe Glu Asp 
                      660                 665                 670         
          Asp Arg Gln Asp Tyr Leu Thr Pro Gly Ala Ala Tyr Asn Tyr Met Thr 
                  675                 680                 685             
          Ala Leu Ile Trp Pro Ser Ile Ser Glu Val Val Lys Ala Pro Ile Val 
              690                 695                 700                 
          Ala Met Lys Met Ile Arg Gln Leu Ala Arg Phe Ala Ala Lys Arg Asn 
          705                 710                 715                 720 
          Glu Gly Leu Met Tyr Thr Leu Pro Thr Gly Phe Ile Leu Glu Gln Lys 
                          725                 730                 735     
          Ile Met Ala Thr Glu Met Leu Arg Val Arg Thr Cys Leu Met Gly Asp 
                      740                 745                 750         
          Ile Lys Met Ser Leu Gln Val Glu Thr Asp Ile Val Asp Glu Ala Ala 
                  755                 760                 765             
          Met Met Gly Ala Ala Ala Pro Asn Phe Val His Gly His Asp Ala Ser 
              770                 775                 780                 
          His Leu Ile Leu Thr Val Cys Glu Leu Val Asp Lys Gly Val Thr Ser 
          785                 790                 795                 800 
          Ile Ala Val Ile His Asp Ser Phe Gly Thr His Ala Asp Asn Thr Leu 
                          805                 810                 815     
          Thr Leu Arg Val Ala Leu Lys Gly Gln Met Val Ala Met Tyr Ile Asp 
                      820                 825                 830         
          Gly Asn Ala Leu Gln Lys Leu Leu Glu Glu His Glu Val Arg Trp Met 
                  835                 840                 845             
          Val Asp Thr Gly Ile Glu Val Pro Glu Gln Gly Glu Phe Asp Leu Asn 
              850                 855                 860                 
          Glu Ile Met Asp Ser Glu Tyr Val Phe Ala 
          865                 870                 
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  2625]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6 RNA聚合酶基因]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          atgcaagatt tacacgctat ccagcttcaa ttagaagaag agatgtttaa tggtggcatt       60
          cgtcgcttcg aagcagatca acaacgccag attgcagcag gtagcgagag cgacacagca      120
          tggaaccgcc gcctgttgtc agaacttatt gcacctatgg ctgaaggcat tcaggcttat      180
          aaagaagagt acgaaggtaa gaaaggtcgt gcacctcgcg cattggcttt cttacaatgt      240
          gtagaaaatg aagttgcagc atacatcact atgaaagttg ttatggatat gctgaatacg      300
          gatgctaccc ttcaggctat tgcaatgagt gtagcagaac gcattgaaga ccaagtgcgc      360
          ttttctaagc tagaaggtca cgccgctaaa tactttgaga aggttaagaa gtcactcaag      420
          gctagccgta ctaagtcata tcgtcacgct cataacgtag ctgtagttgc tgaaaaatca      480
          gttgcagaaa aggacgcgga ctttgaccgt tgggaggcgt ggccaaaaga aactcaattg      540
          cagattggta ctaccttgct tgaaatctta gaaggtagcg ttttctataa tggtgaacct      600
          gtatttatgc gtgctatgcg cacttatggc ggaaagacta tttactactt acaaacttct      660
          gaaagtgtag gccagtggat tagcgcattc aaagagcacg tagcgcaatt aagcccagct      720
          tatgcccctt gcgtaatccc tcctcgtcct tggagaactc catttaatgg agggttccat      780
          actgagaagg tagctagccg tatccgtctt gtaaaaggta accgtgagca tgtacgcaag      840
          ttgactcaaa agcaaatgcc aaaggtttat aaggctatca acgcattaca aaatacacaa      900
          tggcaaatca acaaggatgt attagcagtt attgaagaag taatccgctt agaccttggt      960
          tatggtgtac cttccttcaa gccactgatt gacaaggaga acaagccagc taacccggta     1020
          cctgttgaat tccaacacct gcgcggtcgt gaactgaaag agatgctatc acctgagcag     1080
          tggcaacaat tcattaactg gaaaggcgaa tgcgcgcgcc tatataccgc agaaactaag     1140
          cgcggttcaa agtccgccgc cgttgttcgc atggtaggac aggcccgtaa atatagcgcc     1200
          tttgaatcca tttacttcgt gtacgcaatg gatagccgca gccgtgtcta tgtgcaatct     1260
          agcacgctct ctccgcagtc taacgactta ggtaaggcat tactccgctt taccgaggga     1320
          cgccctgtga atggcgtaga agcgcttaaa tggttctgca tcaatggtgc taacctttgg     1380
          ggatgggaca agaaaacttt tgatgtgcgc gtgtctaacg tattagatga ggaattccaa     1440
          gatatgtgtc gagacatcgc cgcagaccct ctcacattca cccaatgggc taaagctgat     1500
          gcaccttatg aattcctcgc ttggtgcttt gagtatgctc aataccttga tttggtggat     1560
          gaaggaaggg ccgacgaatt ccgcactcac ctaccagtac atcaggacgg gtcttgttca     1620
          ggcattcagc actatagtgc tatgcttcgc gacgaagtag gggccaaagc tgttaacctg     1680
          aaaccctccg atgcaccgca ggatatctat ggggcggtgg cgcaagtggt tatcaagaag     1740
          aatgcgctat atatggatgc ggacgatgca accacgttta cttctggtag cgtcacgctg     1800
          tccggtacag aactgcgagc aatggctagc gcatgggata gtattggtat tacccgtagc     1860
          ttaaccaaaa agcccgtgat gaccttgcca tatggttcta ctcgcttaac ttgccgtgaa     1920
          tctgtgattg attacatcgt agacttagag gaaaaagagg cgcagaaggc agtagcagaa     1980
          gggcggacgg caaacaaggt acatcctttt gaagacgatc gtcaagatta cttgactccg     2040
          ggcgcagctt acaactacat gacggcacta atctggcctt ctatttctga agtagttaag     2100
          gcaccgatag tagctatgaa gatgatacgc cagcttgcac gctttgcagc gaaacgtaat     2160
          gaaggcctga tgtacaccct gcctactggc ttcatcttag aacagaagat catggcaacc     2220
          gagatgctac gcgtgcgtac ctgtctgatg ggtgatatca agatgtccct tcaggttgaa     2280
          acggatatcg tagatgaagc cgctatgatg ggagcagcag cacctaattt cgtacacggt     2340
          catgacgcaa gtcaccttat ccttaccgta tgtgaattgg tagacaaggg cgtaactagt     2400
          atcgctgtaa tccacgactc ttttggtact catgcagaca acaccctcac tcttagagtg     2460
          gcacttaaag ggcagatggt tgcaatgtat attgatggta atgcgcttca gaaactactg     2520
          gaggagcatg aagtgcgctg gatggttgat acaggtatcg aagtacctga gcaaggggag     2580
          ttcgacctta acgaaatcat ggattctgaa tacgtatttg cctaa                     2625
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6啟動子1]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          atttaggtga cactatag                                                     18
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6啟動子2]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          atttagggga cactatagaa gag                                               23
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6啟動子3]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          atttagggga cactatagaa gg                                                22
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6啟動子5]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          atttagggga cactatagaa ggg                                               23
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6啟動子5]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          atttaggtga cactatagaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6啟動子6]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          atttaggtga cactatagaa ga                                                22
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6啟動子7]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          atttaggtga cactatagaa gag                                               23
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6啟動子8]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          atttaggtga cactatagaa gg                                                22
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  SP6啟動子9]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          atttaggtga cactatagaa ggg                                               23
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  23]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<223>  SP6啟動子10]]>
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          <![CDATA[<400>  12]]>
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          <![CDATA[<210>  13]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  14]]>
          guagagguga agauuua                                                      17
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  15]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  15]]>
          gcugacugua ucuuc                                                        15
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  16]]>
          guagagguga agauuua                                                      17
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  17]]>
          guagagguga guaccguacg                                                   20
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  dsRNA生成過程(c) 2]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
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Claims

一種大規模製造包括全長訊息RNA (mRNA)之組成物的方法，其包括使用SP6 RNA聚合酶於 活體外合成mRNA，其中至少1 g的mRNA在單批次中合成，且其中該組成物包含按重量計少於1%的雙股RNA (dsRNA)。
如請求項1之方法，其中該方法不包括色層分析步驟。
如請求項1或2之方法，其中該mRNA係在非變性條件下合成。
一種製造包括全長訊息RNA (mRNA)之組成物的方法，其包括於 活體外合成mRNA，其中該組成物含有按重量計少於1%的雙股RNA (dsRNA)，且其中該方法不包括色層分析步驟。
一種製造包括全長訊息RNA (mRNA)之組成物的方法，其包括於 活體外合成mRNA，其中該組成物含有按重量計少於1%的雙股RNA (dsRNA)，且其中該mRNA是在非變性條件下合成。
如請求項4或5之方法，其中至少1 g的mRNA在單批次中合成。
如前述請求項中任一項之方法，其中至少10 g、100 g、250 g、500 g、1 kg或10 kg的mRNA在該單批次中合成。
如前述請求項中任一項之方法，其中該組成物包含按重量計少於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%之該dsRNA。
如請求項8之方法，其中該組成物實質上不含該dsRNA。
如前述請求項中任一項之方法，其中該mRNA之 活體外合成係在pH為約6至8.5之間進行。
如前述請求項中任一項之方法，其中，mRNA之 活體外合成係在包括有25 mM tris HCl、2 mM精胺酸、25 mM MgCl、0.5 mM NaCl以及pH 7.5的緩衝液中進行。
如前述請求項中任一項之方法，其中該方法不包括離散劑。
一種大規模製造包括全長訊息RNA (mRNA)之組成物的方法，其包括使用SP6 RNA聚合酶於 活體外合成mRNA，其中該組成物包含按重量計少於1%的雙股RNA (dsRNA)，且其中至少100 mg的mRNA係在單批次中合成。
如請求項13之方法，其中該組成物包含按重量計少於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2% 0.1%、0.05%、0.01%之該dsRNA。
如請求項14之方法，其中該組成物實質上不含該dsRNA。
如前述請求項中任一項之方法，其中該dsRNA藉由斑點雜交分析或ELISA檢測。
如前述請求項中任一項之方法，其中在加帽或加尾該合成mRNA之前檢測到dsRNA。
如前述請求項中任一項之方法，其中該方法進一步包括加帽及/或加尾該合成mRNA的步驟。
如請求項1至16中任一項之方法，其中該dsRNA係在對該合成mRNA進行加帽及加尾之後檢測。
如請求項13至19中任一項之方法，其中至少200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1 g、5 g、10 g、25 g、50 g、75 g、100 g、150 g、200 g、250 g、500 g、750 g、1 kg、5 kg或10 kg、或更多的mRNA係以單批次合成。
如請求項13至20中任一項之方法，其中該方法不包含特異移除該dsRNA之步驟。
如請求項13至21中任一項之方法，其中該方法不包括色層分析步驟。
如前述請求項中任一項之方法，其中，該SP6 RNA聚合酶為天然存在之SP6 RNA聚合酶。
如前述請求項中任一項之方法，其中，該SP6 RNA聚合酶為重組SP6 RNA聚合酶。
如請求項24之方法，其中該SP6 RNA聚合酶包括標籤。
如請求項25所述之方法，其中該標籤是his標籤。
如前述請求項中任一項之方法，其中該mRNA由基於DNA模板之SP6 RNA聚合酶合成。
如請求項27之方法，其中反應混合物中之SP6 RNA聚合酶以重量計之量等於或大於該DNA模板以重量計之量。
如請求項28之方法，其中該DNA模板對SP6 RNA聚合酶之重量比介於1：1與1：3之間。
如請求項27至29中任一項之方法，其中該DNA模板包括SP6啟動子，其可操作地鏈接至編碼待合成之mRNA序列之DNA序列。
如請求項30之方法，其中該DNA序列係經最佳化。
如請求項31之方法，其中該DNA序列經最佳化以減小在合成mRNA中形成髮夾結構之機會。
如前述請求項中任一項之方法，其中該mRNA在多個NTP之反應混合物中合成，其中每個NTP濃度範圍介於1-10 mM，該DNA模板的濃度範圍介於0.01至0.5 mg/mL，以及SP6 RNA聚合酶的濃度範圍介於0.01至0.1 mg/mL。
如請求項33之方法，其中該反應混合物包括多個每一者濃度為5 mM的NTP、濃度為0.1 mg/mL的DNA模板，以及濃度為0.05 mg/mL的SP6 RNA聚合酶。
如前述請求項中任一項之方法，其中該mRNA係在溫度範圍37至42 ^°C合成。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該等NTP為天然存在的NTP。
如請求項33至35中任一項之方法，其中該等NTP包括經修飾的NTP。
如請求項37之方法，其中，該等經修飾的NTP包括假尿苷(“ΨU”)。
如請求項38之方法，其中，該假尿苷為1-N-甲基-假尿苷。
如前述請求項中任一項之方法，其中該全長mRNA分子的長度為至少100個鹼基、200個鹼基、300個鹼基、400個鹼基、500個鹼基、600個鹼基、700個鹼基、800個鹼基、900個鹼基、1 kb、1.5 kb、2 kb、2.5 kb、3 kb、3.5 kb、4 kb、4.5 kb、5 kb、8 kb、10 kb、或15 kb。
如前述請求項中任一項之方法，其中該mRNA係經密碼子最佳化。
一種組成物，其包括藉由前述請求項中任一項之方法製備之mRNA。
一種包括 活體外合成訊息RNA (mRNA)的組成物，其使用不經色層分析步驟純化的SP6 RNA聚合酶在單批次中製造，其中該組成物含有少於1%的雙股RNA (dsRNA)。
如請求項43之組成物，其中該組成物包括至少100 mg、200 mg、300 mg、400 mg、500 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、1 g、5 g、10 g、25 g、50 g、75 g、100 g、150 g、200 g、250 g、500 g、750 g、1 kg、5 kg、10 kg、或更多mRNA。
如請求項43至44中任一項之組成物，其中該組成物包括按重量計少於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%、0.4%、0.3%、0.2%、0.1%、0.05%、0.01%的dsRNA。
如請求項45之組成物，其中該組成物實質上不含該dsRNA。
如請求項43至46中任一項之組成物，其中該dsRNA係藉由斑點雜交分析檢測。
如請求項43至47中任一項之組成物，其中該mRNA實質上不含短聚體污染物。
如請求項48之組成物，其中該mRNA實質上不含dsRNA與短聚體污染物。
如請求項43至49中任一項之組成物，其中該mRNA係經密碼子最佳化。
如請求項43至50中任一項之組成物，其中該mRNA的長度為至少100個鹼基、200個鹼基、300個鹼基、400個鹼基、500個鹼基、600個鹼基、700個鹼基、800個鹼基、900個鹼基、1 kb、1.5 kb、2 kb、2.5 kb、3 kb、3.5 kb、4 kb、4.5 kb、5 kb、8 kb、10 kb或15 kb。
如請求項42至51中任一項之組成物，其中該mRNA係封裝於脂質體中。
如請求項42之組成物，其中該脂質體包括一或多種陽離子脂質、一或多種非陽離子脂質及一或多種PEG修飾脂質。
如請求項53之組成物，其中，該脂質體進一步包括基於膽固醇的脂質。
如請求項43至54中任一項之組成物，其中該mRNA未經修飾。
如請求項43至54中任一項之組成物，其中該mRNA經修飾。
如請求項56之組成物，其中該經修飾之mRNA包括假尿苷(“ΨU”)。
如請求項57之組成物，其中該假尿苷為1-N-甲基-假尿苷。
一種治療疾病或病症之方法，其包括使用請求項42至54中任一項之組成物。