JP2023545503A - メッセンジャーｒｎａの大規模合成 - Google Patents

Abstract

本発明は、とりわけ、二本鎖ＲＮＡを実質的に含まない全長メッセンジャーＲＮＡ産物を含む組成物の大規模生成のための方法、およびこのような方法を用いて生成される組成物およびそれらの使用を提供する。本発明は、一部には、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって生成されたｍＲＮＡ産物が二本鎖ＲＮＡを実質的に含まないという驚くべき発見に基づく。一態様では、本発明は、クロマトグラフィー工程を必要とせずに、ｍＲＮＡ療法のための大規模ｍＲＮＡ産物を生成する方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０９２，２７４号の利益を主張するものであり、その全開示を参照によって本明細書に組み入れる。

メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）療法は、種々の疾患を処置するためにますます重要なアプローチとなっている。ｍＲＮＡ療法は、療法を必要とする患者にインビトロ転写（ＩＶＴ）および高純度メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む製剤を投与し、患者の体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を生成することを伴う。

インビトロ転写によるｍＲＮＡの生成はまた二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を生成するが、これはｍＲＮＡ療法には適さないｍＲＮＡ産物の主要な混入物である。二本鎖ＲＮＡは、投与されたｍＲＮＡ産物の非効率的な翻訳をもたらし、サイトカインの誘導をもたらし、免疫応答を引き起こすため、望ましくない。

伝統的に、インビトロ転写から生成されたｍＲＮＡは、市販のクロマトグラフィーシステムを用いて、および／または有機混合物（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール）への抽出およびその後のエタノール沈殿により精製される。しかしながら、ｄｓＲＮＡ不純物は、塩化リチウムまたはアルコールベースの沈殿、サイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー、またはシリカマトリックスに基づく精製を含む標準的な精製方法によっては効率的に除去されない。

ｄｓＲＮＡ不純物は、特別な計装を必要とし、有害廃棄物を生成する手順によってのみ除去することができる。現在、イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、長いＩＶＴ ｍＲＮＡからｄｓＲＮＡ混入物を消失させるために使用される方法である。しかしながら、この方法は高価であり、スケーラブルではなく、毒性アセトニトリルを使用する。

ｍＲＮＡ療法に適した、混入している二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を欠く高純度ｍＲＮＡ産物を生成するための費用対効果の高い大規模合成方法が必要である。本発明は、とりわけ、混入しているｄｓＲＮＡを欠くかまたは実質的に含まないｍＲＮＡを生成する、大規模なインビトロ合成方法を提供する。本発明は、とりわけ、混入しているｄｓＲＮＡを除去するために、クロマトグラフィー法（例えば、イオン対逆相高速液体クロマトグラフィーまたはサイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー）などの合成後精製工程を必要とせずにＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用してｍＲＮＡ産物を生成する方法を提供する。

本発明は、一部には、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなどの他のＲＮＡポリメラーゼと比較して有意に減少したｄｓＲＮＡを有する全長ｍＲＮＡを合成するという驚くべき発見に基づく。以下に詳細に記載するように、実施例のセクションを含めて、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって合成されたｍＲＮＡ産物は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成されたｍＲＮＡ産物と比較して、高収率であり、実質的にｄｓＲＮＡを含まない。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによりＩＶＴを介して生成されたｍＲＮＡ産物は、実質的に減少した中断転写物を有する全長ｍＲＮＡに富化されるだけでなく、ｄｓＲＮＡを実質的に含まないという驚くべき予期せぬ特性を有する。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのこれらの独特で有利な特性は、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって生成されたｍＲＮＡ産物と比較して、ｍＲＮＡ療法に適した有意に高い品質のｍＲＮＡ産物を生じさせる。したがって、本発明は、一部には、ｄｓＲＮＡを除去するために、例えば、クロマトグラフィー法（例えば、上述のものおよび本発明の背景技術におけるもの）を含む、合成後精製方法を必要とせずに、インビトロでｍＲＮＡを合成する方法を提供する。

必要に応じて、本発明の方法によって生成されたインビトロで合成されたｍＲＮＡを精製して、インビトロでの合成反応から誘導される混入物（例えば、その反応において使用される１種またはそれ以上の酵素（複数可））を、例えば、１グラムまたはそれ以上のインビトロで合成されたｍＲＮＡのバッチで操作することができる沈殿およびろ過に基づくプロセスによって除去することができる。このようなプロセスは、例えば、接線流ろ過、深度ろ過、または遠心分離（例えば、ろ過遠心分離機を用いる）を含み得る。適切なプロセスは、例えば、ＷＯ２０１５／１６４７７３、ＷＯ２０１８／１５７１４１およびＷＯ２０２０／０４１７９３に記載される。

一態様では、本発明は、全長メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物の大規模生成方法であって、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、少なくとも１グラム（１ｇ）のｍＲＮＡが単一バッチで合成され、組成物が１重量％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含有する方法を提供する。

一部の実施形態では、本方法は、クロマトグラフィー工程を含まない。

一部の実施形態では、方法全体は、非変性条件下で行われる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、非変性条件で合成される。

一態様では、本発明は、全長メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物を生成する方法であって、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、組成物は１重量％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含有し、本方法は、クロマトグラフィー工程を含まない方法を提供する。

一態様では、本発明は、全長メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物を生成する方法であって、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、組成物は１重量％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含有し、ｍＲＮＡは非変性条件で合成される方法を提供する。

一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、少なくとも１ｇのｍＲＮＡが単一バッチで合成される。

一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、少なくとも１０ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、１ｋｇ、または１０ｋｇのｍＲＮＡが単一バッチで合成される。したがって、一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、少なくとも１０ｇのｍＲＮＡが合成される。一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、少なくとも１００ｇのｍＲＮＡが合成される。一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、少なくとも５００ｇのｍＲＮＡが合成される。一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、少なくとも１ｋｇのｍＲＮＡが合成される。一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、少なくとも１０ｋｇのｍＲＮＡが合成される。一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、１０ｋｇを超えるｍＲＮＡが単一バッチで合成される。例えば、一部の実施形態では、２５ｋｇ、５０ｋｇ、７５ｋｇ、１００ｋｇまたはそれ以上のインビトロで合成されたｍＲＮＡが単一バッチで合成される。

一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、組成物は０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１重量％未満のｄｓＲＮＡを含有する。

一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、組成物は実質的にｄｓＲＮＡを含まない。

一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、ｍＲＮＡのインビトロ合成は、約６～８．５、約６．５～８．０、または約７．０～７．５のｐＨで行われる。具体的な実施形態では、ｍＲＮＡのインビトロ合成は、ｐＨ７．５～７．７で行われる。一部の実施形態では、ｐＨは、６、６．２、６．４、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２または８．４である。一部の実施形態では、ｐＨは７．５である。一部の実施形態では、ｐＨは７．７である。

一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、ｍＲＮＡのインビトロ合成は、２５ｍＭトリスＨＣｌ、２ｍＭスペルミジン、２５ｍＭ ＭｇＣｌ、０．５ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中、およびｐＨ７．５で行われる。

一部の実施形態では、本方法は、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、本方法はカオトロピック剤を含まない。カオトロピック剤は、水素結合やファン・デル・ワールス力などの非共有結合力を妨害することにより、タンパク質および核酸などの高分子の構造を破壊する物質である。一部の実施形態では、カオトロピック剤には、例えば、尿素、チオ尿素、塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、グアニジニウムイソチオシアネート、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、ドデシル硫酸ナトリウム、過塩素酸リチウムおよびそれらの組み合わせが含まれる。

一態様では、本発明は、全長メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物の大規模生成方法であって、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、組成物は、１重量％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含み、少なくとも１００ｍｇのｍＲＮＡが単一バッチで合成される方法を提供する。

一部の実施形態では、組成物は、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１重量％未満のｄｓＲＮＡを含有する。

一部の実施形態では、組成物はｄｓＲＮＡを実質的に含まない。

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ドットブロットアッセイまたはＥＬＩＳＡによって検出される。

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、合成されたｍＲＮＡをキャッピングするかまたはテーリングする前に検出される。

一部の実施形態では、本方法は、合成されたｍＲＮＡをキャッピングおよび／またはテーリングする工程をさらに含む。

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、合成されたｍＲＮＡのキャッピングおよびテーリングの後に検出される。

一部の実施形態では、少なくとも２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、１５０ｇ、２００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、またはそれ以上のｍＲＮＡが、単一バッチで合成される。典型的な実施形態では、１ｇ～１００ｋｇのｍＲＮＡ（例えば、１００ｇ～１０ｋｇ、または２５０ｇ～５ｋｇ）が単一バッチで合成される。一部の実施形態では、１０ｋｇまたはそれ以上のｍＲＮＡが単一バッチで合成される。具体的な実施形態では、１０ｋｇ～１００ｋｇのｍＲＮＡが単一バッチで合成される。一部の実施形態では、１５ｋｇ、２０ｋｇ、２５ｋｇ、３０ｋｇ、３５ｋｇ、４０ｋｇ、４５ｋｇ、５０ｋｇ、７５ｋｇもしくは１００ｋｇ、またはそれ以上のｍＲＮＡが単一バッチで合成される。

一部の実施形態では、本方法は、ｄｓＲＮＡを特異的に除去する工程を含まない。

一部の実施形態では、本方法は、クロマトグラフィー工程を含まない。

一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、天然に存在するＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。

一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、組換えＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。

一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼはタグを含む。一部の実施形態では、タグはＨｉｓ－タグである。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型、例えば、合成されるｍＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたＳＰ６プロモーターを含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって合成される。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は最適化される。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列は、合成されたｍＲＮＡにおいてヘアピン構造を形成する機会を減少させるように最適化される。

一部の実施形態では、反応混合物中のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの重量は、ＤＮＡ鋳型の重量と等しいかまたはそれよりも大きい。具体的な実施形態では、ＤＮＡ鋳型対ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの重量比は、１：１～１：３である。一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの量は、所望の収率を達成するために、反応条件においてＤＮＡ鋳型の量に対して調整される。例えば、一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの量は、ＤＮＡ鋳型の量に対して増加される。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、各ＮＴＰについて１～１０ｍＭ（例えば、１～８ｍＭ、１～６ｍＭ、１～５ｍＭ、２～１０ｍＭ、２～８ｍＭ、２～６ｍＭ、および４～５ｍＭ）の範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．０５～０．４ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍＬ、および０．０５～０．１５ｍｇ／ｍＬ）の範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０１～０．１ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．０２～０．０８ｍｇ／ｍＬ、および０．０４～０．０６ｍｇ／ｍＬ）の範囲の濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物中で合成される。

一部の実施形態では、反応混合物は、各ＮＴＰについて５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、３７～４２℃の範囲の温度で合成される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、約３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃または４５℃の温度で合成される。

一部の実施形態では、ＮＴＰは、天然に存在するＮＴＰである。一部の実施形態では、ＮＴＰは、修飾されたＮＴＰを含む。一部の実施形態では、修飾されたＮＴＰは、プソイドウリジンを含む。より特定の実施形態では、プソイドウリジンはＮ－１－メチル－プソイドウリジンである。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡはヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードする。

一部の実施形態では、全長ｍＲＮＡ分子は、長さが少なくとも１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩基、８００塩基、９００塩基、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、８ｋｂ、１０ｋｂ、または１５ｋｂである。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡはコドン最適化される。

一部の実施形態では、本発明の方法によって生成されたｍＲＮＡを含む組成物が提供される。

一態様では、本発明は、クロマトグラフィー工程による精製を伴わずにＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて単一バッチで生成されたインビトロで合成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物を提供し、組成物は、１％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含有する。

一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、１５０ｇ、２００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、またはそれ以上のｍＲＮＡを含む。典型的な実施形態では、組成物は、１ｇ～１００ｋｇのｍＲＮＡ（例えば、１００ｇ～１０ｋｇ、または２５０ｇ～５ｋｇ）を含む。一部の実施形態では、組成物は、１０ｋｇのｍＲＮＡまたはそれ以上を含む。具体的な実施形態では、組成物は、１０ｋｇ～１００ｋｇのｍＲＮＡを含む。例えば、一部の実施形態では、組成物は、１５ｋｇ、２０ｋｇ、２５ｋｇ、３０ｋｇ、３５ｋｇ、４０ｋｇ、４５ｋｇ、５０ｋｇ、７５ｋｇもしくは１００ｋｇ、またはそれ以上のｍＲＮＡを含む。

一部の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡがＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成される組成物を提供する。

一部の実施形態では、組成物は、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。したがって、一部の実施形態では、組成物は、０．９重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．８重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．７重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．６重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．５重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．４重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．３重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．２重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．１重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．０５重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、０．０１重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。

一部の実施形態では、組成物は、ｄｓＲＮＡを実質的に含まない。一部の実施形態では、組成物は、ショートマー混入を実質的に含まない。さらなる実施形態では、組成物は、ｄｓＲＮＡおよびショートマー混入の両方を実質的に含まない。

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ドットブロットアッセイによって検出される。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡはヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードする。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡはコドン最適化される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは修飾されていない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは修飾されている。ある種の実施形態では、修飾されたｍＲＮＡは、プソイドウリジンを含む。より具体的な実施形態では、プソイドウリジンはＮ－１－メチル－プソイドウリジンである。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、長さが少なくとも１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩基、８００塩基、９００塩基、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、８ｋｂ、１０ｋｂ、または１５ｋｂである。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡはリポソーム内に封入される。

一部の実施形態では、リポソームは、１種またはそれ以上のカチオン性脂質、１種またはそれ以上の非カチオン性脂質、および１種またはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。

一部の実施形態では、リポソームは、コレステロールベースの脂質をさらに含む。

一態様では、本明細書に記載される組成物の使用を含む、疾患または障害を処置する方法が提供される。

本明細書に記載される任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。本開示は、その詳細な説明とともに記載されているが、前述の記載は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を例示することを意図しており、限定するものではない。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内である。

本明細書で言及される特許文献および科学文献は、当業者が利用できる知識を確立するものである。本明細書において引用される米国特許および公開または未公開の米国特許出願をすべて、参照によって組み入れる。本明細書に引用されるすべての公開された外国特許および特許出願を、参照によって本明細書に組み入れる。本明細書に引用される他のすべての公開された参考文献、文献、原稿および科学文献を、参照によって本明細書に組み入れる。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲から明らかになる。しかしながら、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示しているが、限定ではなく、例示としてのみ示されていることを理解されたい。本発明の範囲内の種々の変更および修飾は、当業者に明らかになる。

以下の図面は、例示のためのものに過ぎず、限定するものではない。

インビトロ転写中のｄｓＲＮＡ生成のプロセスを示す概略図である。（ａ）全長ＲＮＡは相補性の内部領域を有するループを形成することができる。（ｂ）ＩＶＴの開始期中に生成した中断ＲＮＡ断片、および全長ＲＮＡの３’末端は、ｄｓＲＮＡ混入物の生成を導く一次転写物からの相補的ＲＮＡ合成をプライミングすることができる。（ｃ）全長アンチセンスＲＮＡのプロモーター非依存性転写は、ｄｓＲＮＡ生成の別のメカニズムである。 ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（１および２と標識されたレーン）対Ｔ７ポリメラーゼ（３および４と標識されたレーン）を用いてインビトロ転写によって生成されたｍＲＮＡ産物中に存在するｄｓＲＮＡの量の比較を示すドットブロットである。存在するｄｓＲＮＡの量は、２ｎｇまたは２５ｎｇの標準ｄｓＲＮＡ対照に対して定量される。 ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ対Ｔ７ポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって生成された例示的ｍＲＮＡ産物中に存在するｄｓＲＮＡの量の比較を示すドットブロットである。ｍＲＮＡ産物の例としては、ｄｓＲＮＡ対照（レーン１）と比較した、ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡ（レーン２）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ（レーン３）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ｍＲＮＡ（レーン４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ｍＲＮＡ（レーン５）、またはヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡ（レーン６）が挙げられる。 図４Ａは、ｄｓＲＮＡ対照（レーン１）と比較した、旧プロセス（Ｔ７ポリメラーゼを使用する、レーン２）対新プロセス（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用する、レーン３）による嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡ産物のインビトロ転写によって生成されたｄｓＲＮＡの量の比較を示すドットブロットである。図４Ｂは、ｄｓＲＮＡ対照（レーン１）と比較した、旧プロセス（Ｔ７ポリメラーゼを使用する、レーン２）対新プロセス（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用する、レーン３）によるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ｍＲＮＡ産物のインビトロ転写によって生成されたｄｓＲＮＡの量の比較を示すドットブロットである。図４Ｃは、ｄｓＲＮＡ対照（レーン１）と比較した、旧プロセス（Ｔ７ポリメラーゼを使用する、レーン２）対新プロセス（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用する、レーン３）によるオルニチントランスカルバモイラーゼ（ＯＴＣ）ｍＲＮＡ産物のインビトロ転写により生成されたｄｓＲＮＡの量の比較を示すドットブロットである。図４Ｄは、ｄｓＲＮＡ対照（レーン１）と比較した、修飾されていないリボヌクレオチド（レーン３）対修飾されたリボヌクレオチド（レーン４）を含むＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたＨＡ ｍＲＮＡ産物のインビトロ転写により生成されたｄｓＲＮＡの量の比較を示すドットブロットである。ドットはまた、生成されたｍＲＮＡ産物（レーン２）を示す。 Ｔ７ポリメラーゼ（レーン２）対ＳＰ６ポリメラーゼ（レーン３）を用いた大規模インビトロ転写によって生成された、１００グラムのＣＦＴＲ ｍＲＮＡ産物中に存在するｄｓＲＮＡの量の比較を示すドットブロットである。ｄｓＲＮＡの量は、標準的なｄｓＲＮＡ対照（レーン１）と比較することによって定量される。 図６Ａは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて２５０ｍｇを生じさせる単一バッチで生成されたＯＴＣ ｍＲＮＡのテール長および完全性を示す一連のグラフである。図６Ｂは、２５０ｍｇを生じさせる単一バッチで生成されたＯＴＣ ｍＲＮＡのＵＰＬＣ－ＭＳによって評価した場合のキャップ分析を要約した表である。図６Ｃは、２５０ｍｇを生じさせる単一バッチで生成されたＳＰ６ ＯＴＣ ｍＲＮＡのアガロースゲルを示す図である。図６Ｄは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６のいずれかを用いて生成された二本鎖ＲＮＡの存在を評価するためのドットブロットである。二本鎖対照レーンもまた示される。図６Ｅは、２５０ｍｇを生じさせるＳＰ６ポリメラーゼを用いて単一バッチで生成されたＯＴＣ ｍＲＮＡの純度を評価するために使用された銀染色ゲルを示す図である。 図６－１の続き。 図６－２の続き。 ＳＰ６で生成されたＯＴＣ ｍＲＮＡの「条件Ａ」および「条件Ｂ」を比較する種々のデータを示す一連のグラフである。「条件Ａ」について、以下のインビトロｍＲＮＡ合成条件を使用した：ｐＤＮＡ＝２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ；ＳＰ６＝１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ。「条件Ｂ」について、以下のインビトロｍＲＮＡ合成条件を使用した：ｐＤＮＡ＝１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ；ＳＰ６＝２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ。図７Ａは、条件Ａまたは条件Ｂのいずれかを用いて生成されたＯＴＣ ｍＲＮＡの収率を示すグラフである。図７Ｂは、条件Ａまたは条件Ｂのいずれかとともに使用された試薬量を示すグラフである。図７Ｃは、ｍＲＮＡを合成するために条件Ａまたは条件Ｂのいずれかを用いた結果としての製造原価（ＣｏＧＳ）を示すグラフである。 ＳＰ６で生成されたＯＴＣ ｍＲＮＡの「条件Ａ」および「条件Ｂ」を比較する種々のデータを示す一連のグラフである。「条件Ａ」について、以下のインビトロｍＲＮＡ合成条件を使用した：ｐＤＮＡ＝２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ；ＳＰ６＝１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ。「条件Ｂ」について、以下のインビトロｍＲＮＡ合成条件を使用した：ｐＤＮＡ＝１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ；ＳＰ６＝２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ。図７Ａは、条件Ａまたは条件Ｂのいずれかを用いて生成されたＯＴＣ ｍＲＮＡの収率を示すグラフである。図７Ｂは、条件Ａまたは条件Ｂのいずれかとともに使用された試薬量を示すグラフである。図７Ｃは、ｍＲＮＡを合成するために条件Ａまたは条件Ｂのいずれかを用いた結果としての製造原価（ＣｏＧＳ）を示すグラフである。 ＳＰ６で生成されたＯＴＣ ｍＲＮＡの「条件Ａ」および「条件Ｂ」を比較する種々のデータを示す一連のグラフである。「条件Ａ」について、以下のインビトロｍＲＮＡ合成条件を使用した：ｐＤＮＡ＝２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ；ＳＰ６＝１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ。「条件Ｂ」について、以下のインビトロｍＲＮＡ合成条件を使用した：ｐＤＮＡ＝１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ；ＳＰ６＝２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ。図７Ａは、条件Ａまたは条件Ｂのいずれかを用いて生成されたＯＴＣ ｍＲＮＡの収率を示すグラフである。図７Ｂは、条件Ａまたは条件Ｂのいずれかとともに使用された試薬量を示すグラフである。図７Ｃは、ｍＲＮＡを合成するために条件Ａまたは条件Ｂのいずれかを用いた結果としての製造原価（ＣｏＧＳ）を示すグラフである。

定義
本発明をより容易に理解するために、まず、ある用語を以下に定義する。以下の用語およびその他の用語の追加の定義は、本明細書全体にわたって記載される。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、文脈が明確に別段の指示をしない限り、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、複数形の指示対象を含む。

本明細書で使用される場合、文脈から明確に記述されていないかまたは自明でない限り、用語「または」は包括的であると理解され、「または」と「および」の両方を包含する。

本明細書で使用される用語「例えば」および「すなわち」は、限定されるものではないが、単なる例示として使用され、本明細書中に明示的に列挙された項目のみを参照するものと解釈されるべきではない。

用語「またはそれ以上」、「少なくとも」、「より多い」など、例えば「少なくとも１つの」は、限定されないが、記述される値の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００またはそれ以上を含むことが理解される。また、その間には、任意のより多くの数または分数が含まれる。

逆に、「以下」という用語は、記述された値より小さい各値を含む。例えば、「１００ヌクレオチド以下」には、１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１、７０、６９、６８、６７、６６、６５、６４、６３、６２、６１、６０、５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、および０個のヌクレオチドが含まれる。また、その間には、任意のより少ない数または分数が含まれる。

用語「複数」、「少なくとも２つ」、「２つまたはそれ以上」、「少なくとも第２の」などは、限定されないが、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００またはそれ以上を含むことが理解される。また、その間には、任意のより多くの数または分数が含まれる。

明細書全体を通じて、単語「含んでいる」、または「含む」もしくは「含んでいる」などのバリエーションは、記述された要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程のグループを包含することを意味するが、任意の他の要素、整数もしくは工程、または要素、整数もしくは工程のグループを排除することは意味しないものと理解される。

本明細書で使用される場合、文脈から明確に記述されないかまたは明白でない限り、用語「約」は、当該技術分野における正常許容範囲内、例えば、平均の２標準偏差内であると理解される。「約」は、記述された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、または０．００１％内であることが理解される。文脈から別途明確でない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、当業者に理解される正常な変動を反映する。

本明細書で使用される場合、用語「中断転写物」または「中断前転写物」などは、その最も広い意味において、ＤＮＡ鋳型によりコードされる全長ｍＲＮＡ分子より短い任意の転写物である。一部の実施形態では、中断転写物は、標的ＤＮＡ分子から転写される全長ｍＲＮＡ分子の長さの９０％未満、例えば、全長ｍＲＮＡ分子の長さの８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％未満であり得る。

本明細書で使用される場合、用語「バッチ」とは、一度に合成されたｍＲＮＡの数量または量を指し、例えば、同じ製造サイクル中に単一の製造オーダーに従って製造される。バッチとは、１セットの条件下で連続的に合成するために、酵素の単一アリコートおよび／またはＤＮＡ鋳型の単一アリコートを介して起こる１つの反応において合成されるｍＲＮＡの量を指すことができる。一部の実施形態では、バッチは、反応が進行するにつれてすべての試薬および／または成分が補充および／または補充されるわけではない反応から生成されるｍＲＮＡを含む。用語「バッチ」は、所望の量を達成するために組み合わされる、異なる時間に合成されるｍＲＮＡを意味しない。

本明細書で使用される場合、用語「送達」は、局所送達および全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質が標的組織内で発現および保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも呼ばれる）、およびｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質が患者の循環系（例えば血清）に発現および分泌され、他の組織に体系的に分布および取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも呼ばれる）を包含する。

本明細書で使用される場合、用語「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」とは、互いに塩基対を形成したリボ核酸の２つの相補鎖を含むインビトロ転写中に生成されるＲＮＡを指す。ＩＶＴ中、ｄｓＲＮＡは、相補性の内部領域を有する全長ＲＮＡのループによりシス内で生成される。加えて、ＩＶＴの開始期中に生成された中断ＲＮＡ断片、および全長ＲＮＡの３’末端は、トランスにおける一次転写物からの相補的ＲＮＡ合成をプライミングすることができる。全長アンチセンスＲＮＡのプロモーター非依存性転写は、ｄｓＲＮＡ生成の別のメカニズムである。

本明細書で使用される場合、用語「薬物」、「医薬」、「治療薬」、「活性剤」、「治療化合物」、「組成物」または「化合物」は、互換的に使用され、身体機能の疾患、病気、状態もしくは障害を処置または予防するために使用することができる任意の化学的実体、薬品、薬物、生物製剤、植物製剤などを指す。薬物は、公知および潜在的な治療化合物の両方を含み得る。薬物は、当業者に公知であるスクリーニングを用いてスクリーニングすることによって治療的であると決定することができる。「公知の治療化合物」、「薬物」、または「医薬」とは、このような処置において有効であることが（例えば、動物試験またはヒトへの投与に関する以前の経験を通して）示された治療化合物を指す。「治療レジメン」とは、本明細書に開示される「薬物」、「医薬」、「治療薬」、「活性剤」、「治療化合物」、「組成物」、または「化合物」を含む処置、および／または対象による行動変性を含む処置、および／または外科手段を含む処置に関する。

本明細書で使用される場合、用語「封入」または文法的同等物は、ナノ粒子内にｍＲＮＡ分子を閉じ込めるプロセスを指す。所望のｍＲＮＡをナノ粒子に取り込むプロセスは、しばしば「装填」と呼ばれる。例示的な方法は、Ｌａｓｉｃら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、３１２巻：２５５～２５８頁、１９９２年に記載され、これを参照によって本明細書に組み入れる。ナノ粒子に取り込まれた核酸は、ナノ粒子の内部空間、二分子膜内（リポソームナノ粒子の場合）、またはナノ粒子の外表面と結合して、完全にまたは部分的に配置することができる。

本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」とは、以下の事象：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡ鋳型の生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成、および／または３’末端形成による）；（３）ＲＮＡのポリペプチドまたはタンパク質への翻訳；および／または（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾のうちの１つまたはそれ以上を指す。本出願において、「発現」および「生成」という用語、ならびに文法的同等物は、相互に変更可能に使用される。

本明細書で使用される場合、「全長ｍＲＮＡ」は、特異的アッセイ、例えば、ゲル電気泳動およびキャピラリー電気泳動による分離を伴うＵＶおよびＵＶ吸収分光法を用いる検出を用いる場合に特徴付けられる。全長ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子の長さは、標的ＤＮＡから転写される全長ｍＲＮＡ分子の長さの少なくとも５０％である。例えば、標的ＤＮＡから転写される全長ｍＲＮＡ分子の長さの少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．０１％、９９．０５％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％である。

本明細書で使用される場合、用語「改善する」、「増加する」もしくは「減少する」または文法的同等物は、本明細書中に記載される処置の開始前の同一個体における測定、または本明細書中に記載される処置の非存在下での対照である対象（または複数の対照である対象）における測定など、ベースライン測定に対して相対的な値を示す。「対照である対象」とは、処置される対象と同じ病態を患い、処置される対象とほぼ同じ年齢である対象である。

本明細書で使用される場合、用語「不純物」とは、限定された量の液体、気体、または固体の中にあり、標的材料または化合物の化学組成とは異なる物質を指す。不純物は、混入物とも呼ばれる。

本明細書で使用される場合、用語「インビトロ」とは、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養などにおいて起こる事象を指す。

本明細書で使用される場合、用語「インビボ」は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で起こる事象を指す。細胞ベースのシステムの文脈において、この用語は、（例えば、インビトロシステムとは対照的に）生細胞内で起こる事象を指すために使用することができる。

本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、（１）最初に生成されたときにそれと関連した成分の少なくとも一部から分離され（天然であるか実験環境であるかを問わず）、および／または（２）ヒトの手によって生成され、調製され、および／または製造された物質および／または実体を指す。

本明細書で使用される場合、用語「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾されたＲＮＡと修飾されていないＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上のコード領域および非コード領域を含み得る。ｍＲＮＡは、天然源から精製することができ、組換え発現系を用いて生成し、場合により精製し、インビトロ転写し、または化学的に合成することができる。

ｍＲＮＡは一般に、ＤＮＡからリボソームへ情報を運ぶＲＮＡの一種と考えられる。ｍＲＮＡの存在は通常非常に短く、プロセシングと翻訳、それに続く分解を含む。典型的には、真核生物においては、ｍＲＮＡプロセシングはＮ末端（５’）末端への「キャップ」の付加、およびＣ末端（３’）末端への「テール」の付加を含む。典型的なキャップは、７－メチルグアノシンキャップであり、これは、最初に転写されたヌクレオチドと５’－５’－三リン酸結合を介して連結されたグアノシンである。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を付与するのに重要である。テールは典型的にはポリアデニル化事象であり、それによってポリＡ部分がｍＲＮＡ分子の３’末端に付加される。この「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。メッセンジャーＲＮＡは、典型的には、リボソームによってタンパク質を構成する一連のアミノ酸に翻訳される。

本明細書で使用される場合、用語「非変性」は、カオトロピック剤、濃縮無機塩、または熱（熱変性条件）などのいくつかの外部ストレスまたは化合物の適用によって、その天然状態で存在する構造（例えば、三次構造または二次構造）を、核酸またはタンパク質などの生物学的材料または高分子を失わせない条件を指す。「変性条件」は、生物学的材料がこの構造を失う原因となる条件である。「部分的変性条件」とは、生物学的材料がこの構造の少なくとも一部を失う原因となる条件である。

本明細書で使用される場合、用語「核酸」とは、その最も広い意味において、ポリヌクレオチド鎖に取り込まれるかまたは取り込むことができる任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に取り込まれるかまたは取り込むことができる化合物および／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸アナログ、すなわち、ホスホジエステル主鎖以外を有するアナログを含む。

本明細書で使用される場合、用語「ショートマー」は、インビトロ転写反応中に不完全なｍＲＮＡ転写の産物である、短い中断ＲＮＡ転写物とも呼ばれる、早期に中断した短いｍＲＮＡオリゴヌクレオチドを具体的に指すために使用される。ショートマー、早期に中断したｍＲＮＡ、中断前のｍＲＮＡ、または短い中断ｍＲＮＡ転写物は、本明細書において互換的に使用される。

本明細書で使用される場合、用語「実質的に」とは、目的とする特徴または特性の全部またはほぼ全部の範囲または程度を示す質的条件を指す。生物学分野の当業者は、生物学的および化学的現象が、たとえ完成に進む、および／または完全性に進む、または絶対的結果を達成する、または回避するとしてもめったにないことを理解する。したがって、用語「実質的に」は、本明細書において、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捉えるために使用される。

別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本出願が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるもの、および本出願が属する技術分野において一般的に使用されるものと同じ意味を有する；このような技術は、その全体を参照によって組み入れる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が支配する。

発明の詳細な説明
本発明は、混入しているｄｓＲＮＡを実質的に含まないｍＲＮＡを生成する大規模なインビトロ合成方法を提供する。本発明は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いる大規模インビトロ合成方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、例えば、混入しているｄｓＲＮＡを除去するためのクロマトグラフィー工程を必要としない。

二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）混入物の減少
インビトロで合成されたｍＲＮＡ中にｄｓＲＮＡ混入物が存在することは望ましくない。ｄｓＲＮＡは免疫原性であり、オリゴアデニル酸シンテターゼ（ＯＡＳ）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、およびＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）などのｄｓＲＮＡ依存性酵素の活性化によって細胞応答を引き起こすことが公知であり、その結果、タンパク質合成が阻害され、ｍＲＮＡ療法の効率が減少する。ｄｓＲＮＡはまた、センサー、例えばＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、およびメラノーマ分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）を刺激し、Ｉ型インターフェロン、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、および腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）を含む異なるサイトカインの分泌を導く。したがって、例えば、サイトカイン誘導を制限するなどの多くの理由により、ＩＶＴ ｍＲＮＡからｄｓＲＮＡを消失またはその量を大幅に減少させることが望ましい。

さらに、ｄｓＲＮＡ混入物は、インビトロ転写（ＩＶＴ ｍＲＮＡ）から除去することが困難であり、ＬｉＣｌまたはアルコールベースの沈殿、サイズ排除およびイオン交換クロマトグラフィー、またはシリカマトリックスに基づく精製を含む標準的な精製方法中にＩＶＴ ｍＲＮＡから効率的に除去されないことが多い。イオン対逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ｄｓＲＮＡを除去するために使用される。しかしながら、これらの精製方法は一般に容易にスケーラブルではなく、アセトニトリルなどの毒性試薬を使用する。

したがって、インビトロ転写中に生成されるｄｓＲＮＡは、ｍＲＮＡ合成の望ましくない副産物である。ｄｓＲＮＡは高度に免疫原性であり、ｄｓＲＮＡ混入物を含有するｍＲＮＡの使用を妨げることが示されている。この限界を克服するために、研究者らは、インビトロで合成されたｍＲＮＡからｄｓＲＮＡ混入物を除去する試みにおいて、合成後の精製方法を使用した。合成後精製法に関連する潜在的な問題は、収率の減少およびインビトロで合成されたｍＲＮＡに対する潜在的損傷を含む。本発明の発明者らは驚くべきことに、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの使用が、インビトロで合成されたｍＲＮＡ中のｄｓＲＮＡの存在を減少または消失させることを発見した。したがって、本発明は、ｄｓＲＮＡを除去するためのさらなる精製後工程を必要とせずに使用することができ、これにより、インビトロで合成されたｍＲＮＡを高収率および高完全性で生成することができる。このようにして、インビトロで合成されたｍＲＮＡの合成後プロセシングは非常に単純化される。

一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを使用するが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用しないインビトロ転写によって生成されたｍＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ混入物を実質的に含まなかった。

本発明では、提供される方法は、ｄｓＲＮＡ混入物を除去するための精製工程を必要としない。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、さらなる精製なしに使用される。特に、一部の実施形態では、本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、ショートマーを除去する工程なしに使用される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ産物は、クロマトグラフィー工程なしに生成される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ産物は、カオトロピック剤なしに生成される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ産物は、非変性条件下で生成される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ産物は、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化グアニジウム、グアニジウムチオシアネート、グアニジウムイソチオシアネート、酢酸アンモニウム、およびそれらの組み合わせを使用することなしに生成される。一部の実施形態では、方法全体は、非変性条件下で行われる。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は、ｄｓＲＮＡを実質的に含まない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１重量％未満、例えば、０．５％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡ混入物は、９９．９５％、９９．９％、９９．８％、９９．７％、９９．６％、９９．５％、９９．４％、９９．３％、９９．２％、９９．１％または９９％を超えて、例えば、９９．９９％を超えて減少される。

一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＩＶＴによって生成されるｄｓＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを用いてＩＶＴによって生成されるｄｓＲＮＡの１０％、８％、５％、４％、３％、２％または１％未満である。具体的な実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＩＶＴによって生成されるｄｓＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを用いてＩＶＴによって生成されるｄｓＲＮＡの１％未満である。

一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてＩＶＴによって生成されるｄｓＲＮＡは、検出限界未満である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの重量は、ドットブロットによって決定した場合、インビトロで合成されたｍＲＮＡの２００ｎｇの試料における検出限界未満である。例えば、典型的な実施形態では、モノクローナル抗体Ｊ２を用いたドットブロットによって決定した場合、ｄｓＲＮＡの重量は、インビトロで合成されたｍＲＮＡの２００ｎｇの試料における検出限界未満である。

一部の実施形態では、天然または非修飾のリボヌクレオチドを含むｍＲＮＡ組成物は、実質的にｄｓＲＮＡを含まない。一部の実施形態では、天然または非修飾のリボヌクレオチドを含むｍＲＮＡ組成物は、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然または非修飾のリボヌクレオチドを含むｍＲＮＡ産物における検出限界未満である。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡの重量は、ドットブロットによって決定した場合、インビトロで合成されたｍＲＮＡの２００ｎｇの試料における検出限界未満である。典型的な実施形態では、ｄｓＲＮＡの重量は、モノクローナル抗体Ｊ２を用いたドットブロットによって決定した場合、天然または非修飾のリボヌクレオチドを含むインビトロで合成されたｍＲＮＡ産物の２００ｎｇ試料における検出限界未満である。

一部の実施形態では、修飾されたリボヌクレオチドを含むｍＲＮＡ組成物は、実質的にｄｓＲＮＡを含まない。一部の実施形態では、修飾されたリボヌクレオチドを含むｍＲＮＡ組成物は、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１重量％未満のｄｓＲＮＡを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、修飾されたリボヌクレオチドを含むｍＲＮＡ産物における検出限界未満である。

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、ＳＰ６プロモーター配列に対して高い配列特異性を有するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。典型的には、このポリメラーゼは、一本鎖ＤＮＡまたはそのプロモーターから下流の二本鎖ＤＮＡ上のＲＮＡのインビトロでの５’→３’合成を触媒し；それは、天然のリボヌクレオチドおよび／または修飾されたリボヌクレオチドを重合転写物に取り込む。

バクテリオファージＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの配列は、初期には、以下のアミノ酸配列を有するものとして記載された（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｙ００１０５．１）：
ＭＱＤＬＨＡＩＱＬＱＬＥＥＥＭＦＮＧＧＩＲＲＦＥＡＤＱＱＲＱＩＡＡＧＳＥＳＤＴＡＷＮＲＲＬＬＳＥＬＩＡＰＭＡＥＧＩＱＡＹＫＥＥＹＥＧＫＫＧＲＡＰＲＡＬＡＦＬＱＣＶＥＮＥＶＡＡＹＩＴＭＫＶＶＭＤＭＬＮＴＤＡＴＬＱＡＩＡＭＳＶＡＥＲＩＥＤＱＶＲＦＳＫＬＥＧＨＡＡＫＹＦＥＫＶＫＫＳＬＫＡＳＲＴＫＳＹＲＨＡＨＮＶＡＶＶＡＥＫＳＶＡＥＫＤＡＤＦＤＲＷＥＡＷＰＫＥＴＱＬＱＩＧＴＴＬＬＥＩＬＥＧＳＶＦＹＮＧＥＰＶＦＭＲＡＭＲＴＹＧＧＫＴＩＹＹＬＱＴＳＥＳＶＧＱＷＩＳＡＦＫＥＨＶＡＱＬＳＰＡＹＡＰＣＶＩＰＰＲＰＷＲＴＰＦＮＧＧＦＨＴＥＫＶＡＳＲＩＲＬＶＫＧＮＲＥＨＶＲＫＬＴＱＫＱＭＰＫＶＹＫＡＩＮＡＬＱＮＴＱＷＱＩＮＫＤＶＬＡＶＩＥＥＶＩＲＬＤＬＧＹＧＶＰＳＦＫＰＬＩＤＫＥＮＫＰＡＮＰＶＰＶＥＦＱＨＬＲＧＲＥＬＫＥＭＬＳＰＥＱＷＱＱＦＩＮＷＫＧＥＣＡＲＬＹＴＡＥＴＫＲＧＳＫＳＡＡＶＶＲＭＶＧＱＡＲＫＹＳＡＦＥＳＩＹＦＶＹＡＭＤＳＲＳＲＶＹＶＱＳＳＴＬＳＰＱＳＮＤＬＧＫＡＬＬＲＦＴＥＧＲＰＶＮＧＶＥＡＬＫＷＦＣＩＮＧＡＮＬＷＧＷＤＫＫＴＦＤＶＲＶＳＮＶＬＤＥＥＦＱＤＭＣＲＤＩＡＡＤＰＬＴＦＴＱＷＡＫＡＤＡＰＹＥＦＬＡＷＣＦＥＹＡＱＹＬＤＬＶＤＥＧＲＡＤＥＦＲＴＨＬＰＶＨＱＤＧＳＣＳＧＩＱＨＹＳＡＭＬＲＤＥＶＧＡＫＡＶＮＬＫＰＳＤＡＰＱＤＩＹＧＡＶＡＱＶＶＩＫＫＮＡＬＹＭＤＡＤＤＡＴＴＦＴＳＧＳＶＴＬＳＧＴＥＬＲＡＭＡＳＡＷＤＳＩＧＩＴＲＳＬＴＫＫＰＶＭＴＬＰＹＧＳＴＲＬＴＣＲＥＳＶＩＤＹＩＶＤＬＥＥＫＥＡＱＫＡＶＡＥＧＲＴＡＮＫＶＨＰＦＥＤＤＲＱＤＹＬＴＰＧＡＡＹＮＹＭＴＡＬＩＷＰＳＩＳＥＶＶＫＡＰＩＶＡＭＫＭＩＲＱＬＡＲＦＡＡＫＲＮＥＧＬＭＹＴＬＰＴＧＦＩＬＥＱＫＩＭＡＴＥＭＬＲＶＲＴＣＬＭＧＤＩＫＭＳＬＱＶＥＴＤＩＶＤＥＡＡＭＭＧＡＡＡＰＮＦＶＨＧＨＤＡＳＨＬＩＬＴＶＣＥＬＶＤＫＧＶＴＳＩＡＶＩＨＤＳＦＧＴＨＡＤＮＴＬＴＬＲＶＡＬＫＧＱＭＶＡＭＹＩＤＧＮＡＬＱＫＬＬＥＥＨＥＶＲＷＭＶＤＴＧＩＥＶＰＥＱＧＥＦＤＬＮＥＩＭＤＳＥＹＶＦＡ（配列番号１）

本発明に適したＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼと実質的に同じポリメラーゼ活性を有する任意の酵素であり得る。したがって、一部の実施形態では、本発明に適したＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１から修飾される。例えば、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含み得る。一部の実施形態では、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号１と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７５％、７０％、６５％、もしくは６０％同一であるかまたは相同であるアミノ酸配列を有する。一部の実施形態では、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、（Ｎ末端、Ｃ末端、または内部から）切断されたタンパク質であり得るが、ポリメラーゼ活性を保持し得る。一部の実施形態では、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは融合タンパク質である。

一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、以下のヌクレオチド配列を有する遺伝子によってコードされる：
ＡＴＧＣＡＡＧＡＴＴＴＡＣＡＣＧＣＴＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＴＴＴＡＡＴＧＧＴＧＧＣＡＴＴＣＧＴＣＧＣＴＴＣＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＣＡＧＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＣＧＡＣＡＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＣＴＴＡＴＴＧＣＡＣＣＴＡＴＧＧＣＴＧＡＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＡＧＧＴＡＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＴＧＣＡＣＣＴＣＧＣＧＣＡＴＴＧＧＣＴＴＴＣＴＴＡＣＡＡＴＧＴＧＴＡＧＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＡＣＡＴＣＡＣＴＡＴＧＡＡＡＧＴＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＡＴＧＣＴＧＡＡＴＡＣＧＧＡＴＧＣＴＡＣＣＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＡＧＴＧＴＡＧＣＡＧＡＡＣＧＣＡＴＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＧＴＧＣＧＣＴＴＴＴＣＴＡＡＧＣＴＡＧＡＡＧＧＴＣＡＣＧＣＣＧＣＴＡＡＡＴＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＧＴＴＡＡＧＡＡＧＴＣＡＣＴＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＣＧＴＡＣＴＡＡＧＴＣＡＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＣＴＣＡＴＡＡＣＧＴＡＧＣＴＧＴＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＧＴＴＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＣＣＡＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＡＡＴＴＧＣＡＧＡＴＴＧＧＴＡＣＴＡＣＣＴＴＧＣＴＴＧＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＴＡＴＴＴＡＴＧＣＧＴＧＣＴＡＴＧＣＧＣＡＣＴＴＡＴＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＴＡＣＴＡＣＴＴＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＧＡＡＡＧＴＧＴＡＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＴＡＧＣＧＣＡＴＴＣＡＡＡＧＡＧＣＡＣＧＴＡＧＣＧＣＡＡＴＴＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＴＡＴＧＣＣＣＣＴＴＧＣＧＴＡＡＴＣＣＣＴＣＣＴＣＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＡＣＴＣＣＡＴＴＴＡＡＴＧＧＡＧＧＧＴＴＣＣＡＴＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧＴＡＧＣＴＡＧＣＣＧＴＡＴＣＣＧＴＣＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＴＡＡＣＣＧＴＧＡＧＣＡＴＧＴＡＣＧＣＡＡＧＴＴＧＡＣＴＣＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＧＣＣＡＡＡＧＧＴＴＴＡＴＡＡＧＧＣＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＴＴＡＣＡＡＡＡＴＡＣＡＣＡＡＴＧＧＣＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＴＧＴＡＴＴＡＧＣＡＧＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＡＡＴＣＣＧＣＴＴＡＧＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＴＧＧＴＧＴＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＧＣＴＡＡＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＣＡＣＣＴＧＣＧＣＧＧＴＣＧＴＧＡＡＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＧＣＴＡＴＣＡＣＣＴＧＡＧＣＡＧＴＧＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＡＧＧＣＧＡＡＴＧＣＧＣＧＣＧＣＣＴＡＴＡＴＡＣＣＧＣＡＧＡＡＡＣＴＡＡＧＣＧＣＧＧＴＴＣＡＡＡＧＴＣＣＧＣＣＧＣＣＧＴＴＧＴＴＣＧＣＡＴＧＧＴＡＧＧＡＣＡＧＧＣＣＣＧＴＡＡＡＴＡＴＡＧＣＧＣＣＴＴＴＧＡＡＴＣＣＡＴＴＴＡＣＴＴＣＧＴＧＴＡＣＧＣＡＡＴＧＧＡＴＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＴＧＴＧＣＡＡＴＣＴＡＧＣＡＣＧＣＴＣＴＣＴＣＣＧＣＡＧＴＣＴＡＡＣＧＡＣＴＴＡＧＧＴＡＡＧＧＣＡＴＴＡＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＣＣＧＡＧＧＧＡＣＧＣＣＣＴＧＴＧＡＡＴＧＧＣＧＴＡＧＡＡＧＣＧＣＴＴＡＡＡＴＧＧＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＡＴＧＧＴＧＣＴＡＡＣＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＴＴＧＡＴＧＴＧＣＧＣＧＴＧＴＣＴＡＡＣＧＴＡＴＴＡＧＡＴＧＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴＧＴＧＴＣＧＡＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＣＡＧＡＣＣＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＴＧＧＧＣＴＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧＣＡＣＣＴＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＣＴＴＴＧＡＧＴＡＴＧＣＴＣＡＡＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＧＣＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣＣＡＧＴＡＣＡＴＣＡＧＧＡＣＧＧＧＴＣＴＴＧＴＴＣＡＧＧＣＡＴＴＣＡＧＣＡＣＴＡＴＡＧＴＧＣＴＡＴＧＣＴＴＣＧＣＧＡＣＧＡＡＧＴＡＧＧＧＧＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＴＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＣＴＣＣＧＡＴＧＣＡＣＣＧＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＡＴＧＧＧＧＣＧＧＴＧＧＣＧＣＡＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＡＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＣＧＧＡＣＧＡＴＧＣＡＡＣＣＡＣＧＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＧＴＡＧＣＧＴＣＡＣＧＣＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＡＡＣＴＧＣＧＡＧＣＡＡＴＧＧＣＴＡＧＣＧＣＡＴＧＧＧＡＴＡＧＴＡＴＴＧＧＴＡＴＴＡＣＣＣＧＴＡＧＣＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＴＡＴＧＧＴＴＣＴＡＣＴＣＧＣＴＴＡＡＣＴＴＧＣＣＧＴＧＡＡＴＣＴＧＴＧＡＴＴＧＡＴＴＡＣＡＴＣＧＴＡＧＡＣＴＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＡＧＴＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＧＡＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＧＧＴＡＣＡＴＣＣＴＴＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＴＣＧＴＣＡＡＧＡＴＴＡＣＴＴＧＡＣＴＣＣＧＧＧＣＧＣＡＧＣＴＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＧＡＣＧＧＣＡＣＴＡＡＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＡＧＴＴＡＡＧＧＣＡＣＣＧＡＴＡＧＴＡＧＣＴＡＴＧＡＡＧＡＴＧＡＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＴＧＣＡＣＧＣＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＡＡＣＧＴＡＡＴＧＡＡＧＧＣＣＴＧＡＴＧＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＴＴＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＧＣＡＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＴＡＣＧＣＧＴＧＣＧＴＡＣＣＴＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＧＡＴＡＴＣＡＡＧＡＴＧＴＣＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＧＡＡＡＣＧＧＡＴＡＴＣＧＴＡＧＡＴＧＡＡＧＣＣＧＣＴＡＴＧＡＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＡＡＴＴＴＣＧＴＡＣＡＣＧＧＴＣＡＴＧＡＣＧＣＡＡＧＴＣＡＣＣＴＴＡＴＣＣＴＴＡＣＣＧＴＡＴＧＴＧＡＡＴＴＧＧＴＡＧＡＣＡＡＧＧＧＣＧＴＡＡＣＴＡＧＴＡＴＣＧＣＴＧＴＡＡＴＣＣＡＣＧＡＣＴＣＴＴＴＴＧＧＴＡＣＴＣＡＴＧＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＴＡＧＡＧＴＧＧＣＡＣＴＴＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴＴＧＣＡＡＴＧＴＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＡＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＴＧＡＡＧＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＧＧＴＴＧＡＴＡＣＡＧＧＴＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＡＧＴＴＣＧＡＣＣＴＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣＡＴＧＧＡＴＴＣＴＧＡＡＴＡＣＧＴＡＴＴＴＧＣＣＴＡＡ（配列番号２）

本発明において適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼをコードする適切な遺伝子は、配列番号２と約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％同一であるかまたは相同であり得る。

本発明に適したＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、例えば、Ａｍｂｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）、ＰｒｏｍｅｇａおよびＲｏｃｈｅから市販されている製品であり得る。ＳＰ６は、本明細書に記載される配列番号１のアミノ酸配列、または配列番号１のバリアントに従って、商業的供給源または非商業的供給源から注文および／またはカスタム設計することができる。ＳＰ６は、標準忠実度ポリメラーゼであり得るか、またはＲＮＡポリメラーゼ活性、例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子における突然変異またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ自体の翻訳後修飾を促進するように修飾された高忠実度／高効率／高容量であり得る。このような修飾されたＳＰ６の例としては、ＡｍｂｉｏｎのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ－Ｐｌｕｓ（商標）、ＮＥＢのＨｉＳｃｒｉｂｅ ＳＰ６、およびＰｒｏｍｅｇａのＲｉｂｏＭＡＸ（商標）およびＲｉｂｏｐｒｏｂｅ（登録商標）システムが挙げられる。

一部の実施形態では、適切なＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは融合タンパク質である。例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、酵素の単離、精製、または溶解性を促進するために、１つまたはそれ以上のタグを含み得る。適切なタグは、Ｎ末端、Ｃ末端、および／または内部に位置することができる。適切なタグの非限定的な例としては、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）；ファシオラ肝蛭８－ｋＤａ抗原（Ｆｈ８）；ＦＬＡＧタグペプチド；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）；ヒスチジンタグ（例えば、ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６））；マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）；Ｎ－利用物質（ＮｕｓＡ）；小ユビキチン関連修飾因子（ＳＵＭＯ）融合タグ；ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＴＲＥＰ）；タンデム親和性精製（ＴＡＰ）；およびチオレドキシン（ＴｒｘＡ）が挙げられる。本発明において、他のタグを使用することができる。これらおよび他の融合タグは、例えば、Ｃｏｓｔａら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５巻（２０１４年）：６３頁、およびＰＣＴ／ＵＳ１６／５７０４４に記載され、それらの内容は、全体を参照によって本明細書に組み入れる。一部の実施形態では、Ｈｉｓタグは、ＳＰ６のＮ末端に位置する。

ＳＰ６プロモーター
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって認識することができる任意のプロモーターを本発明において使用することができる。典型的には、ＳＰ６プロモーターは、５’ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’（配列番号３）を含む。ＳＰ６プロモーターのバリアントは、ＳＰ６のそのプロモーターへの認識および／または結合を最適化するために発見および／または作製されている。非限定的なバリアントとしては、限定されないが：５’－ＡＴＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＧ－３’；５’－ＡＴＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧ－３’；５’－ＡＴＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧＧ－３’；５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ－３’；５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡ－３’；５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＡＧ－３’；５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧ－３’；５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧＧ－３’；５’－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＧＮＧ－３’；および５’－ＣＡＴＡＣＧＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧ－３’（配列番号４～配列番号１３）が挙げられる。

さらに、本発明のための適切なＳＰ６プロモーターは、配列番号３～配列番号１３のいずれか１つと約９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、または７０％同一であり得るかまたは相同であり得る。さらに、本発明に適したＳＰ６プロモーターは、本明細書に記載されるいずれかのプロモーター配列に対して、１つまたはそれ以上の追加のヌクレオチド５’および／または３’を含み得る。

ＳＰ６ポリメラーゼを用いた大規模ｍＲＮＡ合成
一部の実施形態では、本発明は、ｍＲＮＡの大規模生成に関する。一部の実施形態では、本発明による方法は、少なくとも１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、５０ｋｇ、１００ｋｇ、１０００ｋｇ、またはそれ以上のｍＲＮＡを単一バッチで合成する。典型的な実施形態では、１ｇ～１００ｋｇのｍＲＮＡ（例えば、１００ｇ～１０ｋｇ、または２５０ｇ～５ｋｇ）が単一バッチで合成される。一部の実施形態では、１０ｋｇまたはそれ以上のｍＲＮＡが単一バッチで合成される。具体的な実施形態では、１０ｋｇ～１００ｋｇのｍＲＮＡが単一バッチで合成される。

本明細書で使用される場合、用語「バッチ」とは、一度に合成されたｍＲＮＡ、例えば、単一の製造設定に従って製造されたｍＲＮＡの数量または量を指す。バッチとは、１セットの条件下で連続的に合成するために、酵素の単一アリコートおよび／またはＤＮＡ鋳型の単一アリコートを介して起こる１つの反応において合成されるｍＲＮＡの量を指すことができる。単一のバッチで合成されたｍＲＮＡは、所望の量を達成するために組み合わされる、異なる時間に合成されたｍＲＮＡを含まない。一般に、反応混合物は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、線状ＤＮＡ鋳型、およびＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（リボヌクレオチドを含むかまたはリボヌクレオチドの付加を必要とすることができる）を含む。

本発明の一部の実施形態では、１～１００ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、生成されるｍＲＮＡの１グラム（ｇ）あたり使用される。一部の実施形態では、約１～９０ｍｇ、１～８０ｍｇ、１～６０ｍｇ、１～５０ｍｇ、１～４０ｍｇ、１０～１００ｍｇ、１０～８０ｍｇ、１０～６０ｍｇ、１０～５０ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、生成されるｍＲＮＡの１ｇあたり使用される。一部の実施形態では、約５～２０ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、約１グラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、約０．５～２グラムのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、約１００グラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、約５～２０グラムのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、約１キログラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、少なくとも５ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、少なくとも１グラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、少なくとも５００ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、少なくとも１００グラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、少なくとも５グラムのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが、少なくとも１キログラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、約１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、または１００ｍｇのプラスミドＤＮＡが、生成されるｍＲＮＡの１グラムあたり使用される。一部の実施形態では、約１０～３０ｍｇのプラスミドＤＮＡが、約１グラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、約１～３グラムのプラスミドＤＮＡが、約１００グラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、約１０～３０グラムのプラスミドＤＮＡが、約１キログラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、少なくとも１０ｍｇのプラスミドＤＮＡが、少なくとも１グラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、少なくとも１グラムのプラスミドＤＮＡが、少なくとも１００グラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。一部の実施形態では、少なくとも１０グラムのプラスミドＤＮＡが、少なくとも１キログラムのｍＲＮＡを生成するために使用される。

一部の実施形態では、反応混合物中のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１～１００ｎＭ、１～９０ｎＭ、１～８０ｎＭ、１～７０ｎＭ、１～６０ｎＭ、１～５０ｎＭ、１～４０ｎＭ、１～３０ｎＭ、１～２０ｎＭ、または約１～１０ｎＭであり得る。ある種の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの濃度は、約１０～５０ｎＭ、２０～５０ｎＭ、または３０～５０ｎＭである。ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの１００～１００００単位／ｍＬの濃度を使用することができ、例えば、１００～９０００単位／ｍＬ、１００～８０００単位／ｍＬ、１００～７０００単位／ｍＬ、１００～６０００単位／ｍＬ、１００～５０００単位／ｍＬ、１００～１０００単位／ｍＬ、２００～２０００単位／ｍＬ、５００～１０００単位／ｍＬ、５００～２０００単位／ｍＬ、５００～３０００単位／ｍＬ、５００～４０００単位／ｍＬ、５００～５０００単位／ｍＬ、５００～６０００単位／ｍＬ、１０００～７５００単位／ｍＬ、および２５００～５０００単位／ｍＬを使用することができる。

インビトロ合成反応混合物のスケールアップ中に、本発明の発明者らは驚くべきことに、（安価な）ＳＰ６ポリメラーゼの量を増加させながら、（高価な）鋳型ＤＮＡの量を同じに維持することによって、同様のまたは改善された収率を達成することができることを発見した。したがって、一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの濃度は調整されるが、鋳型ＤＮＡの量は一定に維持される。例えば、一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの量は増加されるが、ＤＮＡ鋳型の量は一定に維持される。一部の実施形態では、反応混合物中のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、標的ＲＮＡ１ｇにつき約５ｍｇ～約４０ｍｇであるが、鋳型ＤＮＡ濃度は一定に維持される。例えば、一部の実施形態では、標的ＲＮＡ１ｇにつき約５ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物中にあるが、ＤＮＡ鋳型の量は一定に維持される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ１ｇにつき約１０ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物中にあるが、ＤＮＡ鋳型は一定に維持される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ１ｇにつき約１５ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物中にあるが、ＤＮＡ鋳型は一定に維持される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ１ｇにつき約２０ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物中にあるが、ＤＮＡ鋳型は一定に維持される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ１ｇにつき約２５ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物中にあるが、ＤＮＡ鋳型は一定に維持される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ１ｇにつき約３０ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物中にあるが、ＤＮＡ鋳型は一定に維持される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ１ｇにつき約３５ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物中にあるが、ＤＮＡ鋳型は一定に維持される。一部の実施形態では、標的ＲＮＡ１ｇにつき約４０ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、反応混合物中にあるが、ＤＮＡ鋳型は一定に維持される。

一部の実施形態では、本発明は、インビトロ合成によるｍＲＮＡの大規模生成の方法を提供し、インビトロ合成反応混合物中のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの重量は、ＤＮＡ鋳型の重量と等しいかまたはそれより大きい。例えば、一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型対ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの重量比は１：１～１：３である。具体的な実施形態では、ＤＮＡ鋳型対ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの重量比は１：１．５～１：２．５である。特定の実施形態では、ＤＮＡ鋳型対ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの重量比は約１：２である。例えば、１０ｍｇのＤＮＡ鋳型は、２０ｍｇのＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼとともに１ｇのインビトロで合成されたｍＲＮＡを得ることができる。

反応混合物中の各リボヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、およびＣＴＰ）の濃度は、約０．１ｍＭ～約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ～約１０ｍＭ、約２ｍＭ～約１０ｍＭ、約３ｍＭ～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約８ｍＭ、約１ｍＭ～約６ｍＭ、約３ｍＭ～約１０ｍＭ、約３ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約６ｍＭ、約４ｍＭ～約５ｍＭである。一部の実施形態では、各リボヌクレオチドは、反応混合物中で約５ｍＭである。一部の実施形態では、１ｍＭ～４０ｍＭの反応範囲で使用されるｒＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの組み合わせ）の総濃度。一部の実施形態では、反応範囲１ｍＭ～３０ｍＭ、または１ｍＭ～２８ｍＭ、または１ｍＭ～２５ｍＭ、または１ｍＭ～２０ｍＭの間で使用されるｒＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰの組み合わせ）の総濃度。一部の実施形態では、総ｒＮＴＰ濃度は３０ｍＭ未満である。一部の実施形態では、総ｒＮＴＰ濃度は２５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、総ｒＮＴＰ濃度は２０ｍＭ未満である。一部の実施形態では、総ｒＮＴＰ濃度は１５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、総ｒＮＴＰ濃度は１０ｍＭ未満である。

ＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液は、典型的には、塩／緩衝剤、例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および塩化マグネシウムを含む。

反応混合物のｐＨは、約６～８．５、６．５～８．０、７．０～７．５であり得、一部の実施形態では、ｐＨは７．５である。

線状のまたは線状化されたＤＮＡ鋳型（例えば、上述のように、所望の量のＲＮＡを提供するのに十分な量／濃度で）、ＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを組み合わせて反応混合物を形成する。反応混合物を約３７℃～約４２℃で３０分～６時間、例えば約６０～約９０分間インキュベートする。

一部の実施形態では、適切なＲＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（最終反応混合物ｐＨ約７．５）中の約５ｍＭ ＮＴＰ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、および約０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮＡ鋳型を約３７℃～約４２℃で６０～９０分間インキュベートする。

一部の実施形態では、反応混合物は、ＳＰ６ポリメラーゼ特異的プロモーター、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、２９ｍＭ ＮＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび反応緩衝液（１０×で８００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２０ｍＭスペルミジン、２５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、ｐＨ７．７の場合）およびＲＮａｓｅ不含水による所望の反応体積に十分な量（ＱＳ）を有する線状化された二本鎖ＤＮＡ鋳型を含有し；次に、この反応混合物を３７℃で６０分間インキュベートする。次に、ポリメラーゼ反応を、ＤＮａｓｅＩおよびＤＮａｓｅＩ緩衝液（１０×で１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．６の場合）の添加によってクエンチし、精製のための調製における二本鎖ＤＮＡ鋳型の消化を促進する。この実施形態は、１００グラムのｍＲＮＡを生成するのに十分であることが示されている。

一部の実施形態では、反応混合物は、１～１０ｍＭの範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０１～０．１ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含み、例えば、反応混合物は、５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む。

ＤＮＡ鋳型
種々の核酸鋳型を本発明において使用することができる。典型的には、完全に二本鎖であるか、または大部分が二本鎖ＳＰ６プロモーター配列を有する一本鎖であるＤＮＡ鋳型を使用することができる。

線状化されたプラスミドＤＮＡ（１つまたはそれ以上の制限酵素を介して線状化された）、線状化されたゲノムＤＮＡ断片（制限酵素および／または物理的手段を介して）、ＰＣＲ産物、および／または合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、それらが転写されるＤＮＡ配列の上流（および正しい方向）に二本鎖ＳＰ６プロモーターを含むことを条件として、ＳＰ６を用いたインビトロ転写のための鋳型として用いることができる。

一部の実施形態では、線状化されたＤＮＡ鋳型は平滑末端を有する。

一部の実施形態では、転写されるＤＮＡ配列は、より効率的な転写および／または翻訳を促進するために最適化される。例えば、ＤＮＡ配列は、シス調節エレメント（例えば、ＴＡＴＡボックス、終結シグナルおよびタンパク質結合部位）、人工組換え部位、カイ部位、ＣｐＧジヌクレオチド含量、陰性ＣｐＧアイランド、ＧＣ含量、ポリメラーゼスリップ部位、および／または転写に関連する他のエレメントに関して最適化される；ＤＮＡ配列は、潜在的スプライス部位、ｍＲＮＡ二次構造、ｍＲＮＡの安定な自由エネルギー、反復配列、ＲＮＡ不安定性モチーフ、および／またはｍＲＮＡプロセシングおよび安定性に関連する他のエレメントに関して最適化される；ＤＮＡ配列は、コドン使用バイアス、コドン適応性、内部カイ部位、リボソーム結合部位（例えば、ＩＲＥＳ）、未成熟ポリＡ部位、Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列、および／または翻訳に関連する他のエレメントに関して最適化される；および／またはＤＮＡ配列は、コドンコンテキスト、コドン－アンチコドン相互作用、翻訳休止部位、および／またはタンパク質フォールディングに関連する他のエレメントに関して最適化される。当該技術分野において公知である最適化方法、例えば、その内容は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、ＵＳ２０１１００８１７０８に記載される、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒおよびＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅ（商標）によるＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒを本発明において使用することができる。

一部の実施形態では、ＤＮＡ鋳型は、５’および／または３’非翻訳領域を含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響する１種またはそれ以上のエレメント、例えば、鉄応答性エレメントを含む。一部の実施形態では、５’非翻訳領域は、長さが約５０～５００ヌクレオチドであり得る。

一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナルの１つまたはそれ以上、細胞内での位置のｍＲＮＡの安定性に影響するタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの１つまたはそれ以上の結合部位を含む。一部の実施形態では、３’非翻訳領域は、長さが５０～５００ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。

例示的な３’および／または５’ＵＴＲ配列は、センスｍＲＮＡ分子の安定性を増加させるために安定であるｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、およびクエン酸サイクル酵素）から誘導することができる。例えば、５’ＵＴＲ配列は、ヌクレアーゼ耐性を改善し、および／またはポリヌクレオチドの半減期を改善するために、ＣＭＶ前初期１（ＩＥ１）遺伝子の部分配列またはその断片を含み得る。また、ポリヌクレオチドをさらに安定化するために、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列またはその断片をポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ）の３’末端または非翻訳領域に含めることも考えられる。一般に、これらの修飾は、修飾されていない対応物と比較して、ポリヌクレオチドの安定性および／または薬物動態特性（例えば、半減期）を改善し、例えば、インビボヌクレアーゼ消化に対するそのようなポリヌクレオチド耐性を改善するためになされた修飾を含む。

ヌクレオチド
種々の天然または修飾されたヌクレオシドを用いて、本発明によるｍＲＮＡを生成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、プソイドウリジン（例えば、Ｎ－１－メチル－プソイドウリジン）、２－チオウリジン、および２－チオシチジン）；化学的に修飾された塩基；生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレートされた塩基；修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト連結）であるかまたはそれを含む。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基（「修飾されたｍＲＮＡ」と称される）を含む。非標準ヌクレオチド残基は、例えば、５－メチル－シチジン（「５ｍＣ」）、プソイドウリジン（「ψＵ」）、より具体的には、１－Ｎ－メチル－プソイドウリジン、および／または２－チオ－ウリジン（「２ｓＵ」）を含み得る。このような残基およびそれらのｍＲＮＡへの取り込みの検討については、例えば、米国特許第８，２７８，０３６号またはＷＯ２０１１０１２３１６を参照されたい。ｍＲＮＡはＲＮＡであり得、Ｕ残基の２５％が２－チオ－ウリジンであり、Ｃ残基の２５％が５－メチルシチジンであるＲＮＡとして定義される。ＲＮＡの使用についての教示は、米国特許出願公開第２０１２０１９５９３６号および国際公開第２０１１０１２３１６号に開示され、いずれもそれらの全体を参照によって本明細書に組み入れる。非標準的なヌクレオチド残基の存在は、同じ配列を有するが標準的な残基のみを含有する対照ｍＲＮＡよりも、ｍＲＮＡをより安定にし、および／または免疫原性を低いものにすることができる。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンシトシンから選択される１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基、ならびにこれらの修飾および他の核酸塩基修飾の組み合わせを含み得る。一部の実施形態は、フラノース環または核酸塩基に対する追加の修飾をさらに含むことができる。追加の修飾は、例えば、糖修飾または置換（例えば、２’－Ｏ－アルキル修飾、ロックド核酸（ＬＮＡ）のうちの１つまたはそれ以上）を含み得る。一部の実施形態では、ＲＮＡは、追加のポリヌクレオチドおよび／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体化またはハイブリダイズすることができる。糖修飾が２’－Ｏ－アルキル修飾である一部の実施形態では、このような修飾は、限定されないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾および２’－デオキシ修飾を含み得る。一部の実施形態では、これらの修飾のいずれも、ヌクレオチドの０～１００％において、例えば、構成ヌクレオチドの０％、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または１００％より多く、個々にまたは組み合わせて存在し得る。

合成されたｍＲＮＡ
本発明は、高品質のインビトロで合成されたｍＲＮＡを提供する。例えば、本発明は、合成されたｍＲＮＡの均一性／均質性を提供する。特に、本発明の組成物は、実質的に全長である複数のｍＲＮＡ分子を含む。例えば、少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のｍＲＮＡ分子は、全長ｍＲＮＡ分子である。このような組成物は、全長ｍＲＮＡ分子に対して「富化された」と呼ばれる。一部の実施形態では、本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、実質的に全長である。本発明の組成物は、全長ｍＲＮＡ分子に対して富化されていない組成物よりも大きなパーセンテージの全長ｍＲＮＡ分子を有する。

本発明では、組成物またはバッチは、全長ｍＲＮＡ分子ではないｍＲＮＡ分子（すなわち、中断のまたは中断された転写物）を特異的に除去する工程なしに調製される。一部の実施形態では、クロマトグラフィー法（例えば、逆相高速（高圧）液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）など）などの合成後の精製方法は使用されない。

一部の実施形態では、本発明によって合成されるｍＲＮＡ分子は、長さが５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、１０，０００、またはそれ以上のヌクレオチドより長く、本発明には、その間に任意の長さを有するｍＲＮＡもまた含まれる。

合成後のプロセシング
典型的には、５’キャップおよび／または３’テールは合成後に添加することができる。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を付与するのに重要である。「テール」の存在はｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。

典型的には、５’キャップは、次のように付加される：まず、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを除去し、２つの末端リン酸を残す；次に、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）がグアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸結合を生成し；次に、グアニンの７－窒素がメチル基転移酵素によってメチル化される。キャップ構造の例としては、限定されないが、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡおよびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられる。追加のキャップ構造は、公開された米国特許出願第２０１６／００３２３５６号および米国仮出願第６２／４６４，３２７号（２０１７年２月２７日に出願）に記載され、これらを参照によって本明細書に組み入れる。

典型的には、テール構造は、ポリ（Ａ）および／またはポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡまたはポリＣテールは、典型的には、それぞれ、少なくとも５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシンもしくはシトシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡまたはポリＣテールは、それぞれ、約１０～８００個のアデノシンまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～２００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～４００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド）であり得る。一部の実施形態では、テール構造は、本明細書に記載される種々の長さを有するポリ（Ａ）およびポリ（Ｃ）テールの組み合わせを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。

本明細書に記載されるように、５’キャップおよび／または３’テールの添加は、キャッピングおよび／またはテーリングなしに、これらの早期に中断したｍＲＮＡ転写物のサイズを検出するには小さすぎる可能性があるため、インビトロ合成中に生成された中断転写物の検出を容易にする。したがって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡが純度（例えば、ｍＲＮＡ中に存在する中断転写物のレベル）について試験される前に、５’キャップおよび／または３’テールは合成されたｍＲＮＡに付加される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡが本明細書に記載されるように精製される前に、５’キャップおよび／または３’テールは合成されたｍＲＮＡに付加される。他の実施形態では、ｍＲＮＡが精製された後に、５’キャップおよび／または３’テールは合成されたｍＲＮＡに付加される。

合成後の精製
一部の実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡを沈殿させて、沈殿したｍＲＮＡを含む懸濁液を提供し、その結果、それが、例えば、接線流ろ過、深層ろ過または遠心分離（例えば、ろ過遠心分離機を使用する）によって、混入物から分離することができる。懸濁液は、インビトロ合成反応からの種々の混入物、例えばプラスミドＤＮＡおよび酵素を含む場合がある。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡを沈殿させることは、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１種またはそれ以上の薬物、例えばアルコール、両親媒性ポリマー、緩衝液、塩、および／または界面活性剤のうちの１種またはそれ以上を添加することを含む。具体的な実施形態では、ｍＲＮＡの沈殿を促進する１つまたはそれ以上の薬物は、（ｉ）塩（例えば、カオトロピック塩）および（ｉｉ）アルコールまたは両親媒性ポリマーである。

沈殿したｍＲＮＡは、典型的には、メンブレンまたはフィルターによって保持されるかまたは捕捉され、一方、混入物は除去される。保持された沈殿したｍＲＮＡは、沈殿工程に必要な塩を除去し、いずれの残った混入物も除去するために洗浄される。保持された沈殿したｍＲＮＡを洗浄することは、典型的には、洗浄緩衝液を用いた１つまたはそれ以上の洗浄工程を伴う。

一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、アルコールまたは両親媒性ポリマーを含む。一部の実施形態では、洗浄緩衝液は、アルコール（例えば、エタノール）を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％または９０重量／体積濃度で含む。他の実施形態では、洗浄緩衝液は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはトリエチレングリコールモノメチルエーテルＭＴＥＧなどの両親媒性ポリマーを含む。

洗浄された保持された沈殿したｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを可溶化して、インビトロ合成反応からの混入物を実質的に含まないｍＲＮＡの水溶液を提供することによって、メンブレンまたはフィルターから回収される。

したがって、一部の実施形態では、本発明は、クロマトグラフィー工程を含まない全長メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の大規模生成方法を提供し、該方法は：
ｉ）少なくとも１ｇのｍＲＮＡ（例えば、少なくとも２５０ｇまたは少なくとも５００ｇ）が単一バッチで合成される、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでｍＲＮＡを合成すること；
ｉｉ）インビトロで合成されたｍＲＮＡの単一バッチを沈殿させ、インビトロ合成反応に由来する混入物を除去すること；
ｉｉｉ）沈殿したｍＲＮＡをメンブレンまたはフィルターに捕捉すること；
ｉｖ）沈殿したｍＲＮＡをメンブレンまたはフィルター上で洗浄すること；および
ｖ）ｍＲＮＡを可溶化して、インビトロ合成反応からの混入物（例えば、ショートマー、酵素試薬、および二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））を実質的に含まないｍＲＮＡの水溶液を提供すること
を含む。

具体的な実施形態では、インビトロでｍＲＮＡを合成する工程は、ＤＮＡ鋳型の重量と等しいかまたはそれより大きい重量のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて行われる。例えば、典型的な実施形態では、ＤＮＡ鋳型対ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの重量比は１：１～１：３である。

具体的な実施形態では、ｍＲＮＡ中のｄｓＲＮＡの量は検出限界未満であり、例えば、モノクローナル抗体Ｊ２を用いたドットブロットにより決定される。さらなる具体的な実施形態では、ｍＲＮＡの９０％を超える部分は、例えばキャピラリー電気泳動における主ピークの分析によって決定した場合、全長である。特定の実施形態では、上記方法の工程ｖ）で得られたｍＲＮＡは、例えば銀染色で決定した場合、インビトロ合成反応において使用されるタンパク質または酵素の検出不能な量を含む。

ｍＲＮＡの特徴付け
インビトロで合成されたｍＲＮＡを特徴付けるための種々の方法が当該技術分野において認識されている。ｍＲＮＡの全長または中断転写物は、当該技術分野で利用可能な任意の方法を用いて、例えば、ブロッティング、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、銀染色、分光法、紫外線（ＵＶ）、またはＵＰＬＣ、キャピラリー電気泳動による分離を伴うＵＶ吸収分光法、またはそれらの任意の組み合わせを用いて検出および定量することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ゲル電気泳動（「グリオキサールゲル電気泳動」）の前に、最初にグリオキサール色素によって変性される。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、キャッピングまたはテーリングの前に特徴付けられる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング後に特徴付けられる。

一部の実施形態では、本明細書に開示される方法によって生成されるｍＲＮＡは、全長ｍＲＮＡ以外に、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満の不純物を含む。不純物には、ＩＶＴ混入物、例えば、タンパク質、酵素、遊離ヌクレオチド、ショートマーおよび／またはｄｓＲＮＡが含まれる。

一部の実施形態では、本発明に従って生成されるｍＲＮＡは、ショートマーまたは中断転写物を実質的に含まない。特に、本発明に従って生成されるｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動またはグリオキサールゲル電気泳動により検出不能なレベルのショートマーまたは中断転写物を含有する。本明細書で使用される場合、用語「ショートマー」または「中断転写物」は、全長未満である任意の転写物を指す。一部の実施形態では、「ショートマー」または「中断転写物」は、長さが１００ヌクレオチド未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、または１０未満のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ショートマーは、５’－キャップおよび／または３’－ポリＡテールを添加した後に検出または定量される。

タンパク質発現
本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、より効率的なタンパク質翻訳をもたらす。一部の実施形態では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて本発明に従って合成されるｍＲＮＡは、Ｔ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成される同量のｍＲＮＡと比較して、細胞にトランスフェクトされた場合、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上のタンパク質発現の増加をもたらす。

一部の実施形態では、本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、Ｔ７またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成される同量のｍＲＮＡと比較して、細胞にトランスフェクトされた場合、例えば、少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、またはそれ以上、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質活性の増大をもたらす。

任意のｍＲＮＡは、本発明を用いて合成することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１種またはそれ以上の天然に存在するペプチドをコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、１種またはそれ以上の修飾されたかまたは天然に存在しないペプチドをコードする。

一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞内タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞質タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、アクチン細胞骨格に関連したタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞膜に関連したタンパク質をコードする。一部の特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、膜貫通タンパク質をコードする。一部の特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、イオンチャネルタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、核周囲タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、核タンパク質をコードする。一部の特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、転写因子をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、シャペロンタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞内酵素をコードする（例えば、ｍＲＮＡは、尿素サイクルまたはリソソーム蓄積代謝障害に関連する酵素をコードする）。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞代謝、ＤＮＡ修復、転写および／または翻訳に関与するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞外タンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞外マトリックスに関連するタンパク質をコードする。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、分泌タンパク質をコードする。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法において使用されるｍＲＮＡを使用して、１種またはそれ以上の標的細胞によって周囲の細胞外液（例えば、ホルモンおよび／または神経伝達物質をコードするｍＲＮＡ）中に排出または分泌される機能性タンパク質または酵素を発現させることができる。

本発明は、対象、例えば、ヒト対象またはヒト対象の細胞、またはヒト対象を処置し、送達される細胞への送達または処置に使用する目的のペプチドまたはポリペプチドをコードする全長ｍＲＮＡ分子で富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

したがって、ある種の実施形態では、本発明は、対象の肺もしくは肺細胞への送達または処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸中間鎖１タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸重鎖５（ＤＮＡＨ５）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、１種またはそれ以上の界面活性物質タンパク質、例えば、１種またはそれ以上の界面活性物質Ａタンパク質、界面活性物質Ｂタンパク質、界面活性物質Ｃタンパク質、および界面活性物質Ｄタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、対象の肝臓もしくは肝細胞への送達または処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。このようなペプチドおよびポリペプチドは、尿素サイクル障害に関連するもの、リソソーム蓄積障害に関連するもの、グリコーゲン蓄積障害に関連するもの、アミノ酸代謝障害に関連するもの、脂質代謝または線維性障害に関連するもの、メチルマロン酸血症に関連するもの、またはｄｓＲＮＡを実質的に含まない富化された全長ｍＲＮＡによる肝臓もしくは肝細胞への送達または処置が治療上の利益を提供する任意の他の代謝障害に関連するものを含むことができる。

ある種の実施形態では、本発明は、尿素サイクル障害に関連するタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、アルギノコハク酸シンテターゼ１タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、カルバモイルリン酸シンテターゼＩタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、アルギノコハク酸リアーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、アルギナーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、リソソーム蓄積障害に関連するタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、アルファガラクトシダーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、イズロン酸－２－スルファターゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、イズロニダーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ヘパランＮ－スルファターゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ガラクトサミン－６スルファターゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、リソソームリパーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、アリールスルファターゼＢ（Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、ホタルルシフェラーゼ酵素（ＦＦＬ）をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、グリコーゲン蓄積障害に関連するタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、酸アルファ－グルコシダーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、筋ホスホグリセリン酸ムターゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、グリコーゲン脱分枝酵素をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、アミノ酸代謝に関連するタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）酵素をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、オキサラーゼアラニン－グリオキシラートアミノトランスフェラーゼ酵素をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、脂質代謝または線維性障害に関連するタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）タンパク質を輸送するＡＴＰａｓｅリン脂質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、Ｉ－カッパＢアルファ、インターフェロン関連発生調節因子１（ＩＦＲＤ１）、およびＳｉｒｔｕｉｎ１（ＳＩＲＴ１）の１つまたはそれ以上などの１つまたはそれ以上のＮＦ－カッパＢ阻害剤をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ＰＰＡＲ－ガンマタンパク質または活性バリアントをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、メチルマロン酸血症に関連するタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。例えば、ある種の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡムターゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、肝臓への送達または処置が治療上の利益を提供し得るために、実質的にｄｓＲＮＡを含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ウィルソン病タンパク質としても公知であるＡＴＰ７Ｂタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ酵素をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子などの１つまたはそれ以上の凝固酵素をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ヒトヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、対象の心血管系もしくは心血管細胞への送達または処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、血管内皮増殖因子Ａタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、レラキシンタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－９タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－２受容体タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、対象の筋肉もしくは筋細胞への送達または処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ジストロフィンタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、対象の心筋もしくは心筋細胞への送達または処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞においてカリウムチャネルおよびナトリウムチャネルの一方または両方を調節するタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞においてＫｖ７．１チャネルを調節するタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞においてＮａｖ１．５チャネルを調節するタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、対象の神経系もしくは神経系細胞への送達または処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。例えば、ある種の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン１タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。例えば、ある種の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン２タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ＣＬＮ３タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、対象の血液もしくは骨髄または血液細胞もしくは骨髄細胞への送達または処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ベータグロビンタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ブルトンのチロシンキナーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子などの１つまたはそれ以上の凝固酵素をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、対象の腎臓もしくは腎細胞への送達または処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ＩＶ型コラーゲンアルファ５鎖（ＣＯＬ４Ａ５）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、対象の眼もしくは眼細胞への送達または処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、レチノスカイシンタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａ（ＲＰＥ６５）タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、２９０ｋＤａ（ＣＥＰ２９０）の中心体タンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、対象または対象の細胞に対するワクチンの送達またはそれによる処置に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。例えば、ある種の実施形態では、本発明は、ウイルスなどの感染性因子由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、サイトメガロウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ロタウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ヒトパピローマウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、単純ヘルペスウイルス１または単純ヘルペスウイルス２などの単純ヘルペスウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型またはヒト免疫不全ウイルス２型などのヒト免疫不全ウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ヒトメタニューモウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、ヒトパラインフルエンザウイルス２型、またはヒトパラインフルエンザウイルス３型などのヒトパラインフルエンザウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、マラリアウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ジカウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、キクングニアウイルス由来の抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、対象のがんに関連するかまたは対象のがん細胞から同定される抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、対象自身のがん細胞から決定される抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供し、すなわち、パーソナライズされたがんワクチンを提供する。ある種の実施形態では、本発明は、突然変異ＫＲＡＳ遺伝子から発現される抗原をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、抗体をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体であり得る。ある種の実施形態では、抗体は、融合タンパク質の一部であり得る。ある種の実施形態では、本発明は、ＯＸ４０に対する抗体をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦに対する抗体をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、組織壊死因子アルファに対する抗体をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する抗体をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ＣＤ１９に対する抗体をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、免疫調節剤をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、インターロイキン１２をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、インターロイキン２３をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、インターロイキン３６ガンマをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、インターフェロン遺伝子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質の１種またはそれ以上の刺激因子の構成的に活性なバリアントをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

ある種の実施形態では、本発明は、エンドヌクレアーゼをコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、Ｃａｓ ９タンパク質などのＲＮＡ誘導ＤＮＡエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、メガヌクレアーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。ある種の実施形態では、本発明は、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質をコードするｄｓＲＮＡを実質的に含まない全長ｍＲＮＡで富化された治療組成物を生成する方法を提供する。

脂質ナノ粒子
本発明に従って合成されたｍＲＮＡは、任意の方法を用いてインビボでのタンパク質生成のために製剤化され、送達される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、ナノ粒子などの輸送ビヒクル中に封入される。とりわけ、このような封入の１つの目的は、しばしば、核酸の迅速な排出を引き起こす核酸および／またはシステムもしくは受容体を分解する酵素または化学物質を含有し得る環境から核酸を保護することである。したがって、一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは、その中に含有されるｍＲＮＡの安定性を高めることができ、および／または標的細胞もしくは組織へのｍＲＮＡの送達を促進することができる。一部の実施形態では、ナノ粒子は、脂質ベースのナノ粒子、例えば、リポソームまたはポリマーベースのナノ粒子を含むものであり得る。一部の実施形態では、ナノ粒子は、約４０～１００ｎｍ未満の直径を有することができる。ナノ粒子は、少なくとも１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、１００ｍｇ、１ｇ、またはそれ以上のｍＲＮＡを含み得る。

一部の実施形態では、輸送ビヒクルは、リポソーム小胞、または標的細胞および組織への核酸の輸送を容易にする他の手段である。適切な輸送ビヒクルには、限定されないが、リポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、ナノ粒子、カルシウム蛍光体－ケイ酸塩ナノ粒子、カルシウムリン酸塩ナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ－アルギニン）、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達システム、ミセル、乳濁液、ニオソーム、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチドおよび他のベクタータグが含まれる。また、適切な輸送ビヒクルとしてのバイオナノカプセルおよび他のウイルスカプシドタンパク質アセンブリの使用もまた企図される。（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８年９月；１９（９）：８８７～９５頁）。

リポソームは、１種またはそれ以上のカチオン性脂質、１種またはそれ以上の非カチオン性脂質、１種またはそれ以上のステロールベースの脂質、および／または１種またはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含み得る。リポソームは、脂質の３種またはそれ以上の異なる成分を含み得、脂質の１つの異なる成分は、ステロールベースのカチオン性脂質である。一部の実施形態では、ステロールベースのカチオン性脂質は、イミダゾールコレステロールエステルまたは「ＩＣＥ」脂質である（その全体を参照によって組み入れる、ＷＯ２０１１／０６８８１０を参照されたい）。一部の実施形態では、ステロールベースのカチオン性脂質は、脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム）中の総脂質の７０％以下（例えば、６５％および６０％以下）を構成する。

適切な脂質の例としては、例えば、ホスファチジル化合物（例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシド）が挙げられる。

カチオン性脂質の非限定的な例としては、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＩＣＥ（イミダゾールベース）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＯＦ－０２、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、およびＨＧＴ４００３、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

非カチオン性脂質の非限定的な例としては、セラミド；セファリン；セレブロシド；ジアシルグリセロール；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルグリセロールナトリウム塩（ＤＰＰＧ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）；１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）；１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）；１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）；１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）；１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）；および１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１－パルミトイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）；１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）；１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）；スフィンゴミエリン；またはそれらの組み合わせが挙げられる。

一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、長さがＣ_６－Ｃ_２０のアルキル鎖（複数可）を有する脂質に共有結合的に結合した長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖であり得る。ＰＥＧ修飾脂質の非限定的な例としては、ＤＭＧ－ＰＥＧ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ、Ｃ８－ＰＥＧ、ＤＯＧ ＰＥＧ、セラミドＰＥＧ、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

また、単独であるかまたは他の輸送ビヒクルと組み合わせるかどうかにかかわらず、輸送ビヒクルとしてのポリマーの使用もまた意図される。適切なポリマーとしては、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリンおよびポリエチレンイミンを挙げることができる。ポリマーベースのナノ粒子は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、例えば分枝ＰＥＩを含み得る。

本発明に関連する追加の教示は、ＷＯ２０１１／０６８８１０、ＷＯ２０１２／０７５０４０、ＵＳ６２／４２０，４２１、およびＵＳ６２／４２１，０２１、ならびに２０１７年２月２７日に出願人により出願された関連出願である、表題「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」、「ＮＯＶＥＬ ＣＯＤＯＮ－ＯＰＴＩＭＩＺＥＤ ＣＦＴＲ ＳＥＱＵＥＮＣＥ」、および「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＭＥＳＳＥＮＧＥＲ ＲＮＡ」のうちの１つまたはそれ以上に記載され、これらの各々はその全体を参照によって組み入れる。

本明細書に記載されたものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は、以下に記載される。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体を参照によって組み入れる。本明細書に引用される参考文献は、請求される発明に対する先行技術であるとは認められない。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示的であり、限定することを意図しない。

Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼではなく、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写は二本鎖ＲＮＡを実質的に含まないｍＲＮＡ産物を生成した
この実施例は、ドットブロットによって検出した場合、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写（ＩＶＴ）によって生成されたｍＲＮＡ産物中に存在する二本鎖ＲＮＡの量を示す。

インビトロ転写のプロセスは、同一鎖内または反対側の鎖上の相補的領域における塩基対形成を通じて二本鎖ＲＮＡを生じさせ、５’または３’オーバーハングを有するｄｓＲＮＡを生成した（図１）。ｄｓＲＮＡは、ｍＲＮＡ療法の適用のための望ましくない混入物である。

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写中に生成される二本鎖ＲＮＡの量を測定するために、ｍＲＮＡ合成を最初に行った。Ｔ７転写反応は、１×Ｔ７転写緩衝液（８０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８．０、２ｍＭスペルミジン、および２５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、最終ｐＨ７．７）、１０ｍＭ ＤＴＴ、７．２５ｍＭ各ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰ、ＲＮＡｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼからなった。ＳＰ６反応は、５ｍＭの各ＮＴＰ、約０．０５ｍｇ／ｍＬ ＳＰ６ポリメラーゼＤＮＡ、および約０．１ｍｇ／ｍＬ鋳型ＤＮＡを含み；転写緩衝液の他の成分は変化した。反応は３７℃で６０～９０分間（特に断らない限り）行われた。ＤＮＡｓｅＩを添加して、反応を停止させ、さらに１５分間、３７℃でインキュベートした。製造業者の推奨に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮＡ ｍａｘｉカラムを用いてインビトロ転写ｍＲＮＡを精製した。上記のインビトロ転写工程からの精製されたｍＲＮＡ産物は、ＧＴＰ（１．０ｍＭ）、Ｓ－アデノシルメチオニン、ＲＮＡｓｅ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼおよびグアニリルトランスフェラーゼの一部で処理し、反応緩衝液（１０×、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）とともに混合した。合わせた溶液を３７℃で３０～９０分間、一定時間インキュベートした。完了後、ＡＴＰ（２．０ｍＭ）、ポリＡポリメラーゼおよびテーリング反応緩衝液（１０×、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）のアリコートを添加し、全反応混合物を、２０～４５分間、一定時間３７℃でさらにインキュベートした。完了後、最終反応混合物をクエンチし、それに従って精製した。

簡単に説明すると、転写されたｍＲＮＡの各グラムについて、２０ｍｇの線状化二本鎖ＤＮＡプラスミドと、ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター、１０ｍｇのＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、５ｍＭ ＮＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴおよび反応緩衝液（１０×－２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭスペルミジン、５０ｍＭ ＮａＣｌ）とを含有する反応物を使用し、次に、ＲＮａｓｅ不含水による２００ｍＬまでの十分な量（ＱＳ）で３７℃にて６０分間インキュベートした。次に、ＤＮａｓｅ ＩおよびＤＮａｓｅ Ｉ緩衝液（１０×－１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２および２５ｍＭ ＣａＣｌ_２、ｐＨ７．６）を添加して反応をクエンチし、二本鎖ＤＮＡ鋳型の消化を促進した。

一部の実施形態では、精製されたインビトロで転写されたｍＲＮＡは、グアニレートトランスフェラーゼを用いた５’Ｎ^７－メチルグアニレートキャップ０構造の付加、およびＦｅｃｈｔｅｒ，Ｐ．；Ｂｒｏｗｎｌｅｅ、Ｇ．Ｇ．「Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｃａｐ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｖｉｒａｌ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００５年、８６巻、１２３９～１２４９頁に記載される２’Ｏ－メチルトランスフェラーゼを用いて、Ｃａｐ １構造をもたらす最後から２番目のヌクレオチドの２’Ｏ位置でのメチル基の付加によって酵素的に修飾された。Ｃａｐ １構造の添加後、ポリＡポリメラーゼを用いて酵素的にインビトロで転写されたｍＲＮＡの３’末端にポリアデニル酸テールを添加した。簡単に説明すると、２．５ｍＭ ＧＴＰ、２４６μＭ Ｓ－アデノシルメチオニン、ＲＮａｓｅ阻害剤、２’－Ｏメチルトランスフェラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、反応緩衝液（１０×－５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、６０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、およびＲＮａｓｅ不含Ｈ_２Ｏによる６５０ｍＬまでのＱＳを含有する精製ＩＶＴの各グラムについて、キャッピング反応を設定し、次に、３７℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、テーリング反応は、テーリング緩衝液（１０×－５００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、２．５Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ_２）、３．７ｍＭ ＡＴＰ、ポリＡポリメラーゼ、およびＲＮａｓｅ不含Ｈ_２Ｏによる８００ｍＬまでのＱＳを添加することによって開始した。テーリング反応を３７℃で３０分間行った後、１２．５ｍＭ ＥＤＴＡを添加してクエンチした。

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによるｍＲＮＡ合成中に生成された二本鎖ＲＮＡの量を検出するためにドットブロットを行った。ドットブロットは、転写されたＲＮＡをキャッピングおよびテーリングする前または後のいずれかで、ｍＲＮＡ産物について行われた。２μＬの試料体積中のＳＡＭ ＨＡ試料あたり２００ｎｇのＲＮＡをブロットした。一次抗体として抗ｄｓＲＮＡモノクローナル抗体Ｊ２を用い、二次抗体として抗マウスＩｇＧ ＨＲＰを用いた。Ｊ２抗体は、ヘリックスの長さが４０ｂｐを超えるかまたはそれに等しいという条件でｄｓＲＮＡを認識する。ｄｓＲＮＡ認識は、ｍＲＮＡの配列およびヌクレオチド組成とは無関係である。Ｊ２抗体は、ｄｓＲＮＡの検出のためのゴールドスタンダードである。

シグナルは、１分間の曝露後に検出され（図２）、対照として装填された２ｎｇまたは２５ｎｇの二本鎖ＲＮＡ標準から得られたシグナルと比較された。結果は、２５ｎｇを超える二本鎖ＲＮＡが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成されることを示した（図２、３および４と標識されたレーン）。対照的に、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いた反応で生成されたｄｓＲＮＡの量は、検出限界よりも低かった（図２、１および２と標識されたレーン）。

これらの結果は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたＩＶＴによるｍＲＮＡの合成が、下流への適用に適した二本鎖ＲＮＡを実質的に含まないｍＲＮＡを生成することを示した。実質的な量の二本鎖ＲＮＡなしにＩＶＴによりｍＲＮＡを生成する方法は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いることである。

例示的ＳＰ６ポリメラーゼ由来ｍＲＮＡ産物は、対応するＴ７ポリメラーゼ由来ｍＲＮＡ産物と比較して、二本鎖ＲＮＡを実質的に含まなかった
この実施例は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって合成された例示的なｍＲＮＡ産物は、Ｔ７ポリメラーゼによって合成された対応するｍＲＮＡ産物と比較して、二本鎖ＲＮＡを実質的に含まないことを実証する。

ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡ、ホタルルシフェラーゼ（ＦＦＬ）ｍＲＮＡ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ｍＲＮＡ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ｍＲＮＡ、またはヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）ｍＲＮＡを含む例示的なｍＲＮＡは、実施例１に記載の条件に基づいて、それぞれ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてまたはＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写された。

二本鎖ＲＮＡの量を測定するために、ＳＰ６ポリメラーゼまたはＴ７ポリメラーゼを用いて転写された２００ｎｇのｍＲＮＡについてドットブロットを行った。ブロットを抗ｄｓＲＮＡ Ｊ２モノクローナル抗体でプロービングし、次に二次抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体とともにインキュベートした。各試料から得られたシグナルを対照２５ｎｇ ｄｓＲＮＡマーカー（図３、レーン１）と比較した。

結果は、Ｔ７ポリメラーゼを用いて生成されたｍＲＮＡは、ブロットされた２００ｎｇのＲＮＡのうち最大約２５ｎｇ（すなわち、１２．５％）の検出可能なＣＦＴＲ二本鎖ＲＮＡを含むことが示された。対照的に、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成されたｍＲＮＡは、２５ｎｇ未満の検出可能な二本鎖ＣＦＴＲ ＲＮＡを含有した（図３、レーン２）。

同様に、Ｔ７ポリメラーゼで転写されたＦＦＬ、ＰＡＨ、ＯＴＣおよびＥＰＯのｍＲＮＡ産物は２５ｎｇ未満の二本鎖ＲＮＡを含有したが、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼで転写されたＦＦＬ、ＰＡＨ、ＯＴＣおよびＥＰＯのｍＲＮＡ産物における二本鎖ＲＮＡの量は検出限界未満であった（図３、レーン３～６）。

これらの結果は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたＩＶＴによるｍＲＮＡの合成が、下流への適用に適した、ｄｓＲＮＡを実質的に含まない種々の例示的なｍＲＮＡ産物を生成することを示した。実質的な量のｄｓＲＮＡなしでＩＶＴによりｍＲＮＡ産物を生成する広く適用可能な方法は、ＳＰ６ポリメラーゼを使用することである。

ＳＰ６ポリメラーゼを用いたｍＲＮＡのミリグラム量までのスケールアップは二本鎖ＲＮＡを実質的に含まないｍＲＮＡ産物を生成した
この実施例は、ミリグラム量のｍＲＮＡ産物を生じさせる大規模なインビトロ転写によって生成される二本鎖ＲＮＡの量を示す。例示的なｍＲＮＡは、実施例１に記載される条件に基づいて、それぞれ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成された。この手順をスケールアップして、単一バッチでミリグラム量のｍＲＮＡを生成した。

ヒト嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）ｍＲＮＡ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）ｍＲＮＡ、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）ｍＲＮＡ、またはＨＡ ｍＲＮＡを含む例示的なｍＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（旧プロセス）またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（新プロセス）を用いて転写された。

二本鎖ＲＮＡの量を測定するために、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（旧プロセス）またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ（新プロセス）を用いて転写されたミリグラム量のｍＲＮＡについてドットブロットを行った。ブロットを抗ｄｓＲＮＡ Ｊ２モノクローナル抗体でプロービングし、次に二次抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体とともにインキュベートした。１分間の曝露後に各試料から検出されたシグナルをｄｓＲＮＡ対照から得られたシグナルと比較した。

旧プロセスによって生成された例示的なＣＦＴＲ ｍＲＮＡ産物は、有意な量の二本鎖ＲＮＡを含有し、一方、新プロセスによって生成された対応するＣＦＴＲ ｍＲＮＡ産物は、検出限界未満の二本鎖ＲＮＡを含有した（図４Ａ）。

同様に、旧プロセスによって生成された例示的なＰＡＨ ｍＲＮＡ産物は、有意な量の二本鎖ＲＮＡを含有したが、新プロセスによって生成された対応するＰＡＨ ｍＲＮＡ産物における二本鎖ＲＮＡの量は、検出限界未満であった（図４Ｂ）。

加えて、旧プロセスによって生成された例示的なＯＴＣ ｍＲＮＡ産物は、有意な量の二本鎖ＲＮＡを含有した。対照的に、新プロセスによって生成された対応するＯＴＣ ｍＲＮＡ産物中の二本鎖ＲＮＡの量は、検出限界未満であった（図４Ｃ）。

この実施例は、ＳＰ６媒介ｍＲＮＡ合成（新プロセス）がミリグラム量までスケールアップされ、実質的にｄｓＲＮＡを含まないｍＲＮＡ産物を生じることを実証する。

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成されたミリグラム量の修飾と非修飾ｍＲＮＡ産物の両方は二本鎖ＲＮＡを実質的に含まなかった
この実施例では、ミリグラム量のＨＡ ｍＲＮＡが、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写により合成された。修飾リボヌクレオチドを含むＨＡ ｍＲＮＡ産物中に存在するｄｓＲＮＡの量を比較するために、修飾リボヌクレオチドを重合転写物中に取り込んだ単一バッチでｍＲＮＡを合成し、天然リボヌクレオチドを取り込んで合成したｍＲＮＡと比較した。

ｄｓＲＮＡの量を測定するために、ドットブロットを行った。ブロットを抗ｄｓＲＮＡ Ｊ２モノクローナル抗体でプロービングし、次に二次抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体とともにインキュベートした。１分間の曝露後に各試料から検出されたシグナルをｄｓＲＮＡ対照から得られたシグナルと比較した。

結果は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写によって生成された修飾型と非修飾型のＨＡ ｍＲＮＡ産物のいずれも、実質的な量のｄｓＲＮＡを欠いたことを示した（図４Ｄ）。

この実施例は、修飾または非修飾リボヌクレオチドを組み込んだＳＰ６媒介ｍＲＮＡ合成がミリグラム量までスケールアップされ、二本鎖ＲＮＡを実質的に含まないｍＲＮＡ産物を生じることを実証する。

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いる大規模ｍＲＮＡ合成は、二本鎖ＲＮＡを実質的に含まない１００グラムのｍＲＮＡ産物を生成した
この実施例は、大規模のグラム量で生成されたｍＲＮＡ産物中に存在する二本鎖ＲＮＡの量を示す。この実施例では、１００グラムのＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写により単一バッチで生成された。

二本鎖ＲＮＡの量を測定するために、ドットブロットが、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成されたｍＲＮＡ産物について行われた。ブロットは、抗ｄｓＲＮＡ Ｊ２モノクローナル抗体でプロービングされ、次に二次抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体とともにインキュベートした。１分間の曝露後に各試料から検出されたシグナルは、ｄｓＲＮＡ対照から得られたシグナルと比較された（図５、レーン１）。

結果は、Ｔ７ポリメラーゼ反応では有意な量の二本鎖ＲＮＡが生成されたが（図５、レーン２）、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ反応で生成された二本鎖ＲＮＡの量は検出限界未満であったことを示した（図５、レーン３）。

この実施例は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ合成が、実質的に二本鎖ＲＮＡを含まない高品質のｍＲＮＡ産物の商業的生成を満たすようにスケールアップし得ることを実証する。

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いた２５０ｍｇ ｍＲＮＡの単一バッチ合成は二本鎖ＲＮＡを実質的に含まなかった
この実施例は、大規模のグラム量で生成されたｍＲＮＡ産物中に存在する二本鎖ＲＮＡの量を示す。この実施例では、２５０グラムのＣＦＴＲ ｍＲＮＡは、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写により単一バッチで生成された。

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて単一バッチで生成された２５０ｍｇのインビトロで合成されたＯＴＣ ｍＲＮＡは、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、質量分析、アガロースゲル分析によって完全性について分析された（図６Ａ～６Ｃ）。インビトロで合成されたｍＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の存在について評価され（図６Ｄ）、銀染色によって純度についても評価された（図６Ｅ）。これらの研究からのデータは、ＳＰ６ ｍＲＮＡを用いて生成された大規模ｍＲＮＡ合成が高い完全性を有し、ドットブロットによって評価した場合、検出可能ないずれの二本鎖ＲＮＡも有さないことを示す（図６Ｄ）。ＳＰ６ポリメラーゼを用いて合成されたＯＴＣはまた、図６Ｂに示されるように、高いキャッピング量を示した。まとめると、これらのデータは、ｍＲＮＡ純度、検出可能な二本鎖ＲＮＡの減少または消失、およびＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて得られる高レベルのＲＮＡ完全性の点での改善を示す。

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたｍＲＮＡのインビトロ合成の最適化
インビトロのｍＲＮＡ合成条件を最適化するために、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてさらに研究を行った。これらの研究では、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの量を変化させ、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ－ＤＮＡ鋳型）もまた変化させて、インビトロで合成されたｍＲＮＡの収量に対するこれらの試薬の濃度の変動に続く結果としての効果を確認した。これらの試験において分析された結果および条件を以下の表１に要約する。

表１に示されるように、ｐＤＮＡの２つの濃度：１）２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ、および２）１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡを試験した。同様に、ＳＰ６の２つの濃度：１）１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡ；および２）２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡを試験した。結果は、１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡから２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡへ使用されるＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの量を増加させると、２８８グラムのｍＲＮＡ収量がもたらされることを示す。この結果はまた、ｐＤＮＡ濃度を１０ｍｇ／ｇ ＲＮＡから２０ｍｇ／ｇ ＲＮＡに増加させると、生成されるｍＲＮＡの収量が２５０グラム低くなることを示す。これらのデータは、反応におけるＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの濃度を増加させると、反応に使用されるｐＤＮＡの量を増加させることによって得られるものよりも多い収量が得られることを示す。特に、一定量のｐＤＮＡを維持しながらＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの濃度を増加させると、収量の増加がもたらされた。

これらの研究の結果は、図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃにグラフで示され、上記の２つの条件を使用するＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成され、表１に要約されるｍＲＮＡについて、収量、使用される臨界試薬量、および製造原価（ＣｏＧＳ）を示す。

ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いた修飾ｍＲＮＡのインビトロ合成
この実施例は、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロ転写（ＩＶＴ）によって生成される修飾されたｍＲＮＡ産物が、ｄｓＲＮＡおよびショートマー混入の両方を実質的に含まないことを示す。

ｍＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ特異的プロモーター、適量のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、およびウリジンの代わりに例えば１－Ｎ－メチル－プソイドウリジンを含むＮＴＰ、および適切な反応緩衝液を有する線状化二本鎖ＤＮＡプラスミドを用いて合成された。

２つの独立した実験において、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成された修飾ｍＲＮＡは、ｄｓＲＮＡおよびショートマーの両方を実質的に含まなかった。対照的に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成された修飾ｍＲＮＡは、微量のショートマーを含有した。

同等物
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を、日常的な実験のみを用いて認識するかまたは確認することができる。本発明の範囲は、上述の説明に限定されるものではなく、むしろ、以下の特許請求の範囲に記載されるものである。

Claims (59)

1. 全長メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物の大規模生成方法であって、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、少なくとも１ｇのｍＲＮＡが単一バッチで合成され、組成物は１重量％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含有する、方法。
2. クロマトグラフィー工程を含まない、請求項１に記載の方法。
3. ｍＲＮＡは非変性条件で合成される、請求項１または２に記載の方法。
4. 全長メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物を生成する方法であって、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、組成物は１重量％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含有し、方法はクロマトグラフィー工程を含まない、方法。
5. 全長メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物を生成する方法であって、インビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、組成物は１重量％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含有し、ｍＲＮＡは非変性条件で合成される、方法。
6. 少なくとも１ｇのｍＲＮＡが単一バッチで合成される、請求項４または５に記載の方法。
7. 少なくとも１０ｇ、１００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、１ｋｇ、または１０ｋｇのｍＲＮＡが単一バッチで合成される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 組成物は０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１重量％未満のｄｓＲＮＡを含有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 組成物はｄｓＲＮＡを実質的に含まない、請求項８に記載の方法。
10. ｍＲＮＡのインビトロ合成は、約６～８．５のｐＨで行われる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. ｍＲＮＡのインビトロ合成は、２５ｍＭトリスＨＣｌ、２ｍＭスペルミジン、２５ｍＭ ＭｇＣｌ、０．５ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中、およびｐＨ７．５で行われる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
12. カオトロピック剤を含まない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 全長メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物の大規模生成方法であって、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロでｍＲＮＡを合成することを含み、組成物は１重量％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含み、少なくとも１００ｍｇのｍＲＮＡが単一バッチで合成される、方法。
14. 組成物は、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１重量％未満のｄｓＲＮＡを含有する、請求項１３に記載の方法。
15. 組成物はｄｓＲＮＡを実質的に含まない、請求項１４に記載の方法。
16. ｄｓＲＮＡはドットブロットアッセイまたはＥＬＩＳＡによって検出される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
17. ｄｓＲＮＡは、合成されたｍＲＮＡをキャッピングするかまたはテーリングする前に検出される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 合成されたｍＲＮＡをキャッピングおよび／またはテーリングする工程をさらに含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
19. ｄｓＲＮＡは、合成されたｍＲＮＡのキャッピングおよびテーリングの後に検出される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
20. 少なくとも２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、１５０ｇ、２００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇもしくは１０ｋｇ、またはそれ以上のｍＲＮＡが単一バッチで合成される、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. ｄｓＲＮＡを特異的に除去する工程を含まない、請求項１３～２０のいずれか１項に記載の方法。
22. クロマトグラフィー工程を含まない、請求項１３～２１のいずれか１項に記載の方法。
23. ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、天然に存在するＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
24. ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、組換えＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼはタグを含む、請求項２４に記載の方法。
26. タグはＨｉｓタグである、請求項２５に記載の方法。
27. ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型に基づいてＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって合成される、請求項１～２６のいずれか１項に記載の方法。
28. 反応混合物中のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの重量は、ＤＮＡ鋳型の重量と等しいかまたはそれよりも大きい、請求項２７に記載の方法。
29. ＤＮＡ鋳型対ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼの重量比は１：１～１：３である、請求項２８に記載の方法。
30. ＤＮＡ鋳型は、合成されるｍＲＮＡ配列をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されたＳＰ６プロモーターを含む、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の方法。
31. ＤＮＡ配列は最適化される、請求項３０に記載の方法。
32. ＤＮＡ配列は、合成されたｍＲＮＡにおいてヘアピン構造を形成する機会を減少させるように最適化される、請求項３１に記載の方法。
33. ｍＲＮＡは、各ＮＴＰが１～１０ｍＭの範囲の濃度のＮＴＰ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０１～０．１ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む反応混合物中で合成される、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
34. 反応混合物は、各ＮＴＰが５ｍＭの濃度のＮＴＰ、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度のＤＮＡ鋳型、および０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む、請求項３３に記載の方法。
35. ｍＲＮＡは３７～４２℃の範囲の温度で合成される、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
36. ＮＴＰは天然に存在するＮＴＰである、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
37. ＮＴＰは修飾されたＮＴＰを含む、請求項３３～３５のいずれか１項に記載の方法。
38. 修飾されたＮＴＰは、プソイドウリジン（「ψＵ」）を含む、請求項３７に記載の方法。
39. プソイドウリジンは１－Ｎ－メチル－プソイドウリジンである、請求項３８に記載の方法。
40. 全長ｍＲＮＡ分子は、長さが少なくとも１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩基、８００塩基、９００塩基、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、８ｋｂ、１０ｋｂ、または１５ｋｂである、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
41. ｍＲＮＡはコドン最適化される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
42. 請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法によって生成されるｍＲＮＡを含む組成物。
43. クロマトグラフィー工程による精製を伴わずにＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いて単一バッチで生成されたインビトロで合成されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む組成物であって、１％未満の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含有する組成物。
44. 少なくとも１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ、１ｇ、５ｇ、１０ｇ、２５ｇ、５０ｇ、７５ｇ、１００ｇ、１５０ｇ、２００ｇ、２５０ｇ、５００ｇ、７５０ｇ、１ｋｇ、５ｋｇ、１０ｋｇ、またはそれ以上のｍＲＮＡを含む、請求項４３に記載の組成物。
45. ０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１重量％未満のｄｓＲＮＡを含む、請求項４３～４４のいずれか１項に記載の組成物。
46. ｄｓＲＮＡを実質的に含まない、請求項４５に記載の組成物。
47. ｄｓＲＮＡはドットブロットアッセイによって検出される、請求項４３～４６のいずれか１項に記載の組成物。
48. ｍＲＮＡはショートマー混入を実質的に含まない、請求項４３～４７のいずれか１項に記載の組成物。
49. ｍＲＮＡは、ｄｓＲＮＡおよびショートマー混入の両方を実質的に含まない、請求項４８に記載の組成物。
50. ｍＲＮＡはコドン最適化される、請求項４３～４９のいずれか１項に記載の組成物。
51. ｍＲＮＡは、長さが少なくとも１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、６００塩基、７００塩基、８００塩基、９００塩基、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、８ｋｂ、１０ｋｂ、または１５ｋｂである、請求項４３～５０のいずれか１項に記載の組成物。
52. ｍＲＮＡはリポソーム内に封入される、請求項４２～５１のいずれか１項に記載の組成物。
53. リポソームは、１種またはそれ以上のカチオン性脂質、１種またはそれ以上の非カチオン性脂質、および１種またはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む、請求項４２に記載の組成物。
54. リポソームはコレステロールベースの脂質をさらに含む、請求項５３に記載の組成物。
55. ｍＲＮＡは修飾されていない、請求項４３～５４のいずれか１項に記載の組成物。
56. ｍＲＮＡは修飾されている、請求項４３～５４のいずれか１項に記載の組成物。
57. 修飾されたｍＲＮＡはプソイドウリジン（「ψＵ」）を含む、請求項５６に記載の組成物。
58. プソイドウリジンは１－Ｎ－メチル－プソイドウリジンである、請求項５７に記載の組成物。
59. 疾患または障害を処置する方法であって、請求項４２～５４のいずれか１項に記載の組成物の使用を含む方法。

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