TW202237147A - 穩定液體脂質奈米粒子調配物 - Google Patents

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阿喜許 沙羅德
娜塔莉亞 巴格斯 蒙朵雅
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Abstract

本發明尤其提供囊封編碼肽或多肽之mRNA的液體脂質奈米粒子(LNP)調配物，其在進行多輪的-20℃下冷凍及再解凍後對聚集及mRNA降解具有抗性。

Description

穩定液體脂質奈米粒子調配物
本申請案主張2020年11月25日申請之美國臨時申請案第63/118,243號之優先權及權益，其內容特此以全文引用之方式併入。
基於核酸之技術對於各種治療應用愈來愈重要，包括但不限於信使RNA療法。遞送核酸之努力已包括產生經調配以在活體內遞送時保護核酸免於降解的組合物。一種用於核酸之遞送媒劑為脂質奈米粒子。為了成功使用脂質奈米粒子作為遞送媒劑，需考慮之重要參數包括脂質奈米粒子形成、脂質組分之物理特性、核酸囊封效率、活體內核酸釋放潛力及脂質奈米粒子毒性。
產生對冷凍/解凍循環具有抗性之穩定脂質奈米粒子在此項技術中仍為一種挑戰。
本發明尤其提供囊封編碼肽或多肽之mRNA的液體脂質奈米粒子(LNP)調配物，其在進行多輪的-20℃下冷凍及再解凍後對聚集及/或mRNA降解具有抗性。本發明人出人意料地發現，具有高離子強度之LNP調配物在多輪冷凍及解凍後防止LNP之聚集及/或mRNA降解。本發明人出人意料地發現，穩定且對聚集及/或mRNA降解具有抗性之高離子強度LNP調配物可藉由在LNP調配物中使用較高緩衝強度或高鹽濃度來達成。
在一些態樣中，提供一種囊封編碼肽或多肽之mRNA的液體脂質 奈米粒子(LNP)調配物，其對聚集及mRNA降解具有抗性，該LNP調配物包含：a.一或多個LNP，其具有包含陽離子脂質、非陽離子脂質、經PEG修飾之脂質及視情況選用之膽固醇或由其組成的脂質組分；b.囊封於該一或多個脂質奈米粒子內且編碼肽或多肽之mRNA；c.糖或糖醇；d.LNP調配物pH為6.0至8.0；e.pH緩衝液，其以最小緩衝離子強度提供LNP調配物pH；f.視情況選用之一或多種額外試劑，其為LNP調配物提供離子強度；其中來自(e.)之pH緩衝液及視情況選用之一或多種來自(f.)之額外試劑的總濃度提供比該最小緩衝離子強度大至少兩倍的該LNP調配物之離子強度；其中在進行三輪的-20℃下冷凍及再解凍後，與在LNP調配物中僅具有該最小緩衝離子強度而非比該最小緩衝離子強度大至少兩倍之離子強度的相同LNP調配物相比，該LNP調配物展現(i)較少聚集，(ii)所囊封mRNA之較少降解，或(iii)(i)及(ii)兩者。
在一些實施例中，LNP調配物包含一或多種冷凍保護劑。冷凍保護劑可為穿透性的或非穿透性的。例如，在一些實施例中，穿透性冷凍保護劑包含甘油、乙二醇、三乙二醇、丙二醇或四乙二醇。因此，在一些實施例中，穿透性冷凍保護劑包含甘油。在一些實施例中，穿透性冷凍保護劑包含乙二醇。在一些實施例中，穿透性冷凍保護劑包含三乙二醇。在一些實施例中，穿透性冷凍保護劑包含丙二醇。在一些實施例中，穿透性冷凍保護劑包含四乙二醇。
在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑係選自糖及/或聚合物。例如，在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑係選自以下糖中之一或多者：右旋糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、葡聚糖或菊糖。因此，在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑包含右旋糖。在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑包含山梨糖醇。在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑包含海藻糖。在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑包含蔗糖。在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑包含棉子糖。在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑包含葡聚糖。在一些實施例中，非穿 透性冷凍保護劑包含菊糖。
在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑係選自以下聚合物中之一或多者：PVP、PVA、泊洛沙姆(Poloxamer)或PEG。因此，在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑係選自PVP。在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑係選自泊洛沙姆。在一些實施例中，非穿透性冷凍保護劑係選自PEG。
在一些實施例中，提供一種在LNP中製造mRNA之穩定液體溶液的方法。例如，在一些實施例中，囊封於LNP中之mRNA係由活體外轉錄(IVT)產生。在一些實施例中，mRNA使用適合的RNA聚合酶，諸如SP6 RNA聚合酶合成。因此，在一些實施例中，mRNA使用SP6 RNA聚合酶合成。LNP包含例如陽離子脂質、非陽離子脂質、經PEG修飾之脂質及視情況選用之膽固醇
在一些實施例中，非陽離子脂質係選自1,2-二芥醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯基-乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE或1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)。
在一些實施例中，非陽離子脂質之莫耳比大於10%。例如，在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、 43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%。在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為約15%。在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為約20%。在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為約25%。在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為約30%。在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為約35%。在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為約40%。在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為約45%。在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為約50%。
在一些實施例中，非陽離子脂質為二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)。
在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比大於10%。例如，在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比為11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%。在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比為約15%。在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比為約20%。在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比為約25%。在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比為約30%。在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比為約35%。在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比為約40%。在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比為約45%。在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比為約50%。在一些實施例中，DOPE之脂質莫耳比在約10%與30%之間。
在一些實施例中，陽離子脂質為類脂質。在一些實施例中，類脂質之莫耳比為約，例如40%-60%。在一些實施例中，類脂質之莫耳比為約50%-60%。在一些實施例中，類脂質之莫耳比為約40%。在一些實施例中，類脂質之莫耳比為約50%。在一些實施例中，類脂質之莫耳比為約60%。
在一些實施例中，mRNA編碼個體中缺乏之蛋白質。例如，在一些實施例中，個體中缺乏之蛋白質為CFTR。
在一些實施例中，mRNA編碼疫苗抗原。例如，在一些實施例中，疫苗抗原為SARS-CoV-2抗原。
在一些實施例中，糖為雙醣。在一些實施例中，雙醣為海藻糖。
在一些實施例中，糖或糖醇係選自由以下組成之群：右旋糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、葡聚糖及菊糖。因此，在一些實施例中，糖或糖醇為右旋糖。在一些實施例中，糖或糖醇為山梨糖醇。在一些實施例中，糖或糖醇為海藻糖。在一些實施例中，糖或糖醇為蔗糖。在一些實施例中，糖或糖醇為棉子糖。在一些實施例中，糖或糖醇為葡聚糖。在一些實施例中，糖或糖醇為菊糖。
在一些實施例中，海藻糖之濃度在約1%-20%之間。在一些實施例中，海藻糖之濃度在約2.5%-3.0%之間。在一些實施例中，海藻糖之濃度在約5.0%-15%之間。在一些實施例中，海藻糖之濃度在約10%-20%之間。
在一些實施例中，pH在約6.0與約8.0之間。例如，在一些實施例中，pH為約6.0-7.0、6.5-7.5或7.0-8.0之間。因此，在一些實施例中，pH在約6.0-7.0之間。在一些實施例中，pH在約6.5-7.5之間。在一些實施例中，pH在約7.0-8.0之間。在一些實施例中，pH為約7.4。在一些實施例中，pH為7.4。
在一些實施例中，pH緩衝液之pKa在6.0與8.2之間。因此，在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0或8.2。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約6.2。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約6.4。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約6.6。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約6.8。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約7.0。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約7.2。在一些實施例中，pH緩衝 液之pKa為約7.4。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約7.6。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約7.8。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約8.0。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約8.2。
在一些實施例中，緩衝液係選自由以下組成之群：磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、咪唑緩衝液、組胺酸緩衝液及Good's緩衝液。因此，在一些實施例中，緩衝液為磷酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為檸檬酸鹽緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為咪唑緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為組胺酸緩衝液。在一些實施例中，緩衝液為Good's緩衝液。在一些實施例中，Good's緩衝液為Tris緩衝液或HEPES緩衝液。
在一些實施例中，pH緩衝液為磷酸鹽緩衝液(例如檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液)、Tris緩衝液或咪唑緩衝液。
在一些實施例中，最小緩衝離子強度為至少75mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM或至少200mM。因此，在一些實施例中，最小緩衝離子強度為至少75mM。在一些實施例中，最小緩衝離子強度為至少100mM。在一些實施例中，最小緩衝離子強度為至少125mM。在一些實施例中，最小緩衝離子強度為至少150mM。在一些實施例中，最小緩衝離子強度為至少200mM。
在一些實施例中，最小緩衝離子強度在約75mM-200mM、75mM-150mM、75mM-100mM或100mM-200mM之間。因此，在一些實施例中，最小緩衝離子強度在約75mM-200mM之間。在一些實施例中，最小緩衝離子強度在約75mM-150mM之間。在一些實施例中，最小緩衝離子強度在約75mM-100mM之間。在一些實施例中，最小緩衝離子強度在約100mM-200mM之間。
在一些實施例中，藉由增加調配物中之緩衝液濃度及/或增加調配物中之鹽濃度來獲得最小緩衝離子強度。因此，在一些實施例中，藉由增加緩衝 液濃度來獲得最小緩衝離子強度。在一些實施例中，藉由增加調配物之鹽濃度來獲得最小緩衝離子強度。在一些實施例中，藉由增加調配物中之緩衝液濃度且藉由增加調配物中之鹽濃度來獲得最小緩衝離子強度。
在一些實施例中，雙醣與緩衝液比率在0.1-0.9之間。在一些實施例中，雙醣與緩衝液比率在0.1-0.7之間。在一些實施例中，雙醣與緩衝液比率在0.2-0.7之間。在一些實施例中，雙醣與緩衝液比率在0.2-0.5之間。
在一些實施例中，提供離子強度之一或多種試劑包含鹽。在一些實施例中，鹽選自由NaCl、KCl及CaCl2組成之群。因此，在一些實施例中，鹽為NaCl。在一些實施例中，鹽為KCl。在一些實施例中，鹽為CaCl2。
在一些實施例中，提供離子強度之一或多種額外藥劑之總濃度在約50-500mM、100-400mM或200-300mM之間。因此，在一些實施例中，一或多種試劑之總濃度在約50-500mM之間。在一些實施例中，一或多種試劑之總濃度在約100-400mM之間。在一些實施例中，一或多種試劑之總濃度在約200-300mM之間。在一些實施例中，提供離子強度之一或多種試劑之總濃度在約50-300mM、50-150mM或75-125mM之間。在一些實施例中，提供離子強度之一或多種試劑之總濃度在約50-300mM之間。在一些實施例中，提供離子強度之一或多種試劑之總濃度在約50-150mM之間。在一些實施例中，提供離子強度之一或多種試劑之總濃度在約75-125mM之間。
在一些實施例中，pH緩衝液之總濃度在約100-300mM、200-300mM或250-300mM之間。因此，在一些實施例中，pH緩衝液之總濃度在約100-300mM之間。在一些實施例中，pH緩衝液之總濃度在200-300mM之間。在一些實施例中，pH緩衝液之總濃度在250-300mM之間。在一些實施例中，pH緩衝液之總濃度在約15-250mM、30-150mM或40-50mM之間。因此，在一些實施例中，pH緩衝液之總濃度在約15-250mM之間。在一些實施例中，pH緩衝 液之總濃度在約30-150mM之間。在一些實施例中，pH緩衝液之總濃度在約40-50mM之間。
在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度係選自約40mM Tris緩衝液及約75mM-200mM NaCl、約50mM Tris緩衝液及約75mM-200mM NaCl、約100mM Tris緩衝液及約75mM-200mM NaCl、約40mM咪唑及約75mM-200mM NaCl、約50mM咪唑及75mM-200mM NaCl、及約100mM咪唑及75mM-200mM NaCl、約40mM磷酸鹽及75mM-200mM NaCl、約50mM磷酸鹽及75mM-200mM NaCl及約100mM磷酸鹽及75mM-200mM NaCl。因此，在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度為約40mM Tris緩衝液及約75-200mM NaCl。在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度為約50mM Tris緩衝液及約75mM-200mM NaCl。在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度為約100mM Tris緩衝液及約75mM-200mM NaCl。在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度為約40mM咪唑及約75mM-200mM NaCl。在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度為50mM咪唑及75mM-200mM NaCl。在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度為100mM咪唑及75mM-200mM NaCl。在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度為約40mM咪唑、約75mM-200mM NaCl及2.5-10%海藻糖。在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度為50mM咪唑、約75mM-200mM NaCl及2.5-10%海藻糖。在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度為100mM咪唑、約75mM-200mM NaCl及2.5-10%海藻糖。
在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大 至少2.25倍、大至少2.5倍、大至少2.75倍、大至少3倍、大至少3.5倍、大至少4倍、大至少4.5倍、大至少5倍。因此，在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少2.25倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少2.5倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少2.75倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少3.0倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少3.5倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少4.0倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少4.5倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少5.0倍。
在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於20倍、小於19倍、小於18倍、小於17倍、小於16倍、小於15倍、小於14倍、小於13倍、小於12倍、小於11倍、小於10倍、小於9倍、小於8倍、小於7倍、小於6倍、小於5倍、小於4倍之最小緩衝離子強度。因此，在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之20倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之19倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之18倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之17倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之16倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之15倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之14倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之13倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之12倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之11倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之10倍。在一 些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之9倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之8倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之7倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之6倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之5倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於最小緩衝離子強度之4倍。
在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少兩倍且比最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中LNP調配物之離子強度在約150mM-750mM、150mM-500mM、150mM-400mM、150mM-300mM、150mM及200mM之間。因此，在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少兩倍且比最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中LNP調配物之離子強度在約150mM-750mM之間。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少兩倍且比最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中LNP調配物之離子強度在約150mM-500mM之間。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少兩倍且比最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中LNP調配物之離子強度在約150mM-400mM之間。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少兩倍且比最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中LNP調配物之離子強度在約150mM-300mM之間。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少兩倍且比最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中LNP調配物之離子強度在約150mM與200mM之間。
在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少兩倍且比最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中LNP調配物之離子強度為或大於150mM。
在一些實施例中，較少聚集藉由濁度分析來測定。在一些實施例中，囊封mRNA之較少降解藉由濁度分析來測定。可使用量測濁度之各種方式，包括例如使用視覺分析及/或使用光譜法。
在一些實施例中，在進行超過三輪的-20℃下冷凍及再解凍後，與在LNP調配物中僅具有最小緩衝離子強度而非比最小緩衝離子強度大至少兩倍之離子強度的相同LNP調配物相比，LNP調配物展現(i)較少聚集，(ii)所囊封mRNA之較少降解，或(iii)(i)及(ii)兩者。
在一些實施例中，LNP之直徑小於約100nm。在一些實施例中，LNP之直徑在約70nm-90nm之間。例如，在一些實施例中，LNP之直徑在約70nm-85nm之間。在一些實施例中，LNP之直徑在約70nm-80nm之間。在一些實施例中，LNP之直徑在約70nm-75nm之間。在一些實施例中，LNP之直徑在約80nm-90nm之間。在一些實施例中，LNP之直徑在約85nm-90nm之間。在一些實施例中，LNP之直徑在約75nm-90nm之間。在一些實施例中，LNP之直徑在約75nm-85nm之間。在一些實施例中，LNP之直徑在約75nm-80nm之間。在一些實施例中，LNP之直徑小於約70nm。
在一些實施例中，脂質組分包含DMG-PEG-2000、cKK-E10、膽固醇及DOPE或由其組成。因此，在一些實施例中，脂質組分包含DMG-PEG-2000、cKK-E10、膽固醇及DOPE。在一些實施例中，脂質組分由DMG-PEG-2000、cKK-E10、膽固醇及DOPE組成。
在一些實施例中，N/P比在約3-5之間。例如，在一些實施例中，N/P比為約3。在一些實施例中，N/P比為約4。在一些實施例中，N/P比為約5。
在一些實施例中，mRNA之最終濃度在約0.05mg/mL與1.0mg/mL之間。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.05mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.1mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約 0.1mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.2mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.3mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.4mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.5mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.6mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.7mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.8mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約0.9mg/mL。在一些實施例中，mRNA之最終濃度為約1.0mg/mL。
在一些實施例中，mRNA之濃度在約0.2mg/mL與0.5mg/mL之間。
在一些實施例中，LNP在-20℃下穩定至少3個月、6個月、12個月或超過12個月。因此，在一些實施例中，LNP在-20℃下穩定至少3個月。在一些實施例中，LNP在-20℃下穩定至少6個月。在一些實施例中，LNP在-20℃下穩定至少12個月。在一些實施例中，LNP在-20℃下穩定超過12個月。
在一些實施例中，LNP調配物在稀釋後穩定。
在一些實施例中，與不包含濃度為300mM或低於300mM且pH在約7.0與7.5之間的緩衝液之調配物相比，調配物之皮下或肌肉內遞送伴隨有減輕之疼痛。
在一些實施例中，減輕之疼痛藉由10-cm視覺類比量表(VAS)或六項口頭評定量表(VRS)評估。因此，在一些實施例中，減輕之疼痛藉由10-cm視覺類比量表(VAS)評估。在一些實施例中，減輕之疼痛藉由六項口頭評定量表(VRS)評估。
在一些態樣中，提供一種減少LNP降解及/或聚集之方法，該方法包含將LNP儲存於如本文所描述之調配物中。
在本申請案中，除非另有說明，否則「或」之使用意謂「及/或」。 如本揭示案中所使用，術語「包含(comprise)」及該術語之變化形式，諸如「包含(comprising)」及「包含(comprises)」不意欲排除其他添加劑、組分、整體或步驟。如本申請案中所使用，術語「約」及「大致」等效使用。兩個術語意欲涵蓋相關領域中一般熟習此項技術者所瞭解之任何正常波動。
本發明之其他特徵、目標及優點將自實施方式及圖式及自申請專利範圍顯而易知。然而，應理解，實施方式、圖式及申請專利範圍儘管指示本發明之實施例，但僅藉助於說明而非限制給出。本發明之範疇中之各種變化及修改將對於熟習此項技術者將變得顯而易見。
圖式僅出於說明的目的，而非限制。
圖1A為一圖示，其顯示LNP在pH為7.5時之穩定性作為增加LNP調配物中海藻糖之濃度的函數及作為在pH為7.5時維持LNP穩定性所需之最小緩衝強度的函數。圖1B為一圖示，其顯示具有在LNP調配物中以恆定百分比(亦即，2.7%)之海藻糖的LNP調配物作為pH波動的函數及作為維持LNP調配物穩定性所需之最小緩衝強度的函數。
圖2為顯示經測試之LNP調配物之脂質pKa依賴行為的圖示。對於此等研究，LNP調配物包含2.7%之海藻糖。
圖3A描繪經測試之LNP調配物的各種條件。該表描繪pH為7.5時脂質之莫耳濃度及Tris緩衝液之濃度。表中之對號表示穩定之LNP調配物。「X」表示不穩定之LNP調配物。圖3B為顯示在動物模型中投與之後6小時或24小時囊封人類EPO mRNA之LNP衍生的人類EPO蛋白之表現的圖示。顯示各種LNP構成脂質。
圖4A描繪顯示經測試之LNP調配物之各種組合物的一系列表。本表描繪經測試之緩衝液(亦即，Tris或咪唑)之莫耳濃度及在各種經評估之LNP 調配物中測試的對應鹽濃度(亦即，NaCl)。表中之對號表示穩定之LNP調配物。「X」表示不穩定之LNP調配物。圖4B描繪評估各種LNP調配物之表。LNP調配物相對於Tris或磷酸鹽緩衝液之濃度而改變。評估LNP稀釋後穩定性。穩定之LNP會以勾號表示，而非穩定之LNP調配物則以「X」表示。
圖5A描繪在4℃下包含不同海藻糖與PBS比率(例如約0.2-0.5)之LNP調配物的囊封效率百分比圖。圖5B描繪在25℃下包含不同海藻糖與PBS比率(例如約0.2-0.5)之LNP調配物的囊封效率百分比圖。
圖6A描繪在4℃下包含不同海藻糖與PBS比率(例如約0.2-0.5)之LNP調配物的LNP尺寸(以奈米計)的圖。圖6B描繪在25℃下包含不同海藻糖與PBS比率(例如約0.2-0.5)之LNP調配物的LNP尺寸(以奈米計)的圖。
定義
為使本發明更易於理解，首先在下文定義某些術語。隨附術語及其他術語之額外定義貫穿本說明書記載。本文引用之描述本發明背景且提供關於其實踐之額外細節之出版物及其他參考材料以引用之方式併入本文中。
大致或約：如本文所使用，如應用於所關注之一或多個值之術語「大致」或者「約」係指類似於所陳述參考值之值。在某些實施例中，除非另外說明或者另外自上下文顯而易見，否則術語「大致」或者「約」係指在任一方向(大於或者小於)上處於所陳述參考值之25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或者更小百分比之內之一系列值(但該等數值將超出可能性值之100%的情況除外)。
如本文中所使用，術語「批次」係指例如在相同製造循環期間根 據單一製造次序產生之一次合成的mRNA之數量或量。一批次可指在一組條件下經由單個等分的酶及/或單個等分的DNA模板進行連續合成之一個反應中合成的mRNA的量。在一些實施例中，一批次將包括從反應中產生的mRNA，其中並非所有的試劑及/或組分在反應過程中經補充及/或備足。術語「不在單一批次中」不意謂在不同時間合成的mRNA經組合以達成所需之量。
遞送：如本文所用，術語「遞送」涵蓋局部及全身性遞送兩者。例如，mRNA之傳遞涵蓋mRNA遞送至目標組織且編碼蛋白質表現且保留於目標組織中(亦稱為「局部分佈」或「局部遞送」)之情形，以及將mRNA遞送至目標組織且編碼蛋白質表現且分泌至患者循環系統(例如，血清)，且由其他組織全身性分佈及吸收(亦稱為「全身性分佈」或「全身性遞送」)之情形。在一些實施例中，遞送為肺部遞送，例如，包含霧化。
囊封：如本文所用，術語「囊封」或文法等效物係指將mRNA分子限制在奈米粒子內之過程。
經工程改造或突變型：如本文所用，術語「經工程改造」或「突變型」或文法等效物係指與其天然存在之序列相比包含一或多個修飾之核苷酸或蛋白質序列，包括(但不限於)缺失、異源核酸或胺基酸之插入、反轉、取代或其組合。
表現：如本文所用，核酸序列之「表現」係指將mRNA轉譯成多肽，將多個多肽(例如抗體之重鏈或輕鏈)組裝成完整蛋白質(例如抗體)及/或對多肽或完全組裝之蛋白質(例如抗體)進行轉譯後修飾。在本申請案中，術語「表現」及「生產」及文法等效物可互換使用。
功能性：如本文所用，「功能性」生物分子為展現出其特性及/或活性之生物分子之形式，其特徵在於該特性及/或活性。
半衰期：如本文所用，術語「半衰期」為如在一定時間段開始時 所量測之一定數量(諸如核酸或蛋白質濃度或活性)降至其值之一半所需的時間。
改善、增加或減少：如本文所用，術語「改善」、「增加」或者「減少」或者文法等效物指示相對於諸如同一個體中在起始本文所描述之治療前之量測值或者對照個體(或者多個對照個體)中在不存在本文所描述之治療情況下之量測值的基線量測值而言的值。「對照個體」為罹患與所治療個體相同之疾病形式、年齡與所治療個體大約相同之個體。
雜質：如本文中所用，術語「雜質」係指處於限制量之液體、氣體或固體中的物質，其不同於目標材料或化合物之化學組成。雜質亦稱為污染物。
活體外：如本文所使用，術語「活體外」係指事件在人工環境中(例如在試管或反應器皿中)、在細胞培養物中等而非在多細胞生物體內發生。
活體內：如本文所使用，術語「活體內」係指事件發生在諸如人類及非人類動物之多細胞生物體內。在基於細胞之系統之情形下，該術語可用於指事件發生在活細胞內(相反於例如活體外系統)。
經分離：如本文所用，術語「經分離」係指物質及/或實體已(1)與最初產生時與其相關的至少一些組分分離(無論在自然界中及/或在實驗設置中)，及/或(2)藉由人工產生、製備及/或製造。經分離之物質及/或實體可與約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%之最初與其相關之其他組分分離。在一些實施例中，經分離之藥劑為約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或大於約99%純。如本文所用，若物質實質上不含其他組分，則其為「純」的物質。如本文所用，經分離之物質及/或實體 的純度百分比計算不應包括賦形劑(例如，緩衝液、溶劑、水等)。
信使RNA(mRNA)：如本文所用，術語「信使RNA(mRNA)」係指編碼至少一種多肽之多核苷酸。如本文所用之mRNA涵蓋經修飾及未經修飾之RNA兩者。mRNA可含有一或多個編碼及非編碼區域。mRNA可自天然來源純化，使用重組表現系統產生，且視情況經純化、化學合成等。適當時，例如，就化學合成分子而言，mRNA可包含核苷類似物，諸如具有經化學修飾之鹼基或糖、主鏈修飾等的類似物。除非另有指示，否則mRNA序列以5'至3'方向呈現。
核酸：如本文中所用，術語「核酸」在其最廣泛意義上係指任何化合物及/或物質，其作為多核苷酸鏈或可併入多核苷酸鏈中。在一些實施例中，核酸為化合物及/或物質，其作為多核苷酸鏈或可經由磷酸二酯鍵併入多核苷酸鏈中。在一些實施例中，「核酸」係指單個核酸殘基(例如核苷酸及/或核苷)。在一些實施例中，「核酸」係指包含單個核酸殘基之多核苷酸鏈。在一些實施例中，「核酸」涵蓋RNA以及單股及/或雙股DNA及/或cDNA。此外，術語「核酸」、「DNA」、「RNA」及/或類似術語包括核酸類似物，亦即，具有除磷酸二酯主鏈以外之類似物。例如，此項技術中已知且在主鏈中具有肽鍵而非磷酸二酯鍵之所謂的「肽核酸」視為處於本發明之範疇中。術語「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併型式及/或編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。編碼蛋白質及/或RNA之核苷酸序列可包括內含子。核酸可自天然來源純化，使用重組表現系統產生，且視情況經純化、化學合成等。適當時，例如，就化學合成分子而言，核酸可包含核苷類似物，諸如具有經化學修飾之鹼基或糖、主鏈修飾等的類似物。除非另有指示，否則核酸序列以5'至3'方向呈現。在一些實施例中，核酸為或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷及去氧胞苷)；核苷類似物(例如，2-胺基腺苷、2-硫代胸 苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤及2-硫代胞苷)；經化學修飾之鹼基；經生物修飾之鹼基(例如甲基化之鹼基)；插層鹼基；經修飾之糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖及己醣)；及/或經修飾之磷酸鹽基團(例如，硫代磷酸鹽及5'-N-亞磷醯胺鍵)。於一些實施例中，本發明係專門關於「未經修飾之核酸」，其意謂尚未經化學修飾以便於或達成遞送之核酸(例如，多核苷酸及殘基，包括核苷酸及/或核苷)。在一些實施例中，核苷酸T及U在序列描述中可互換使用。
患者：如本文所用，術語「患者」或「個體」係指可以投與經提供之組合物的任何生物體，以用於例如實驗、診斷、預防、化妝、及/或治療目的。典型的患者包括動物(例如，哺乳動物，諸如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動物及/或人類)。在一些實施例中，患者為人類。人類包括出生前及出生後的形式。
醫藥學上可接受的：如本文所用之術語「醫藥學上可接受」係指在合理醫學判斷範疇內適用於與人類及動物組織接觸而無過量毒性、刺激、過敏性反應或其他問題或併發症，與合理效益/風險比率相稱之物質。
穩定：如本文所用，術語「穩定」蛋白質或其文法等效物係指保持其物理穩定性及/或生物活性之蛋白質。在一個實施例中，蛋白質穩定性係基於溶液中單體蛋白質之百分比測定，在低百分比之降解(例如片段化)及/或聚集蛋白質下。在一個實施例中，與野生型蛋白質相比，穩定經工程改造之蛋白質保持或展現出增強的半衰期。在一個實施例中，與野生型蛋白質相比，穩定經工程改造之蛋白質較不易引起導致蛋白溶解的泛素化。
個體：如本文所用，術語「個體」係指人類或任何非人類動物(例 如，小鼠、大鼠、兔、犬、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物)。人類包括出生前及出生後的形式。在許多實施例中，個體為人類。個體可以是患者，此係指前往醫療服務提供者為診斷或治療疾病的人類。術語「個體」在本文中可與「個人」或「患者」互換使用。個體可罹患或易患疾病或病症，但可能顯示或可能不顯示該疾病或病症之症狀。
實質上：如本文所用，術語「實質上」係指展現所關注的特徵或性質之全部或接近全部範圍或程度的定性條件。生物學領域中具有通常技藝者將會理解，生物及化學現象很少(若有)達到完成及/或進行至完全或實現或避免絕對的結果。因此，術語「實質上」在本文中用於包羅許多生物及化學現象中固有之潛在缺乏的完全性。
治療：如本文所用，術語「治療(treat/treatment/treating)」係指用於部分或完全地減輕、改善、緩和、抑制、預防特定疾病、病症及/或病狀之一或多個症狀或特徵、延遲其發作、降低其嚴重性及/或降低其發生率的任何方法。治療可投與未展現疾病之體徵及/或僅展現疾病之早期體徵的受試者以便降低患上與疾病相關之病狀的風險。
實施方式
本發明尤其提供改良方法及組合物，其使得產生對多個冷凍/解凍循環具有抗性之囊封mRNA的穩定LNP調配物。對多個冷凍/解凍循環之此類抗性至少表現為1)在一或多個冷凍/解凍循環之後LNP的低聚集；及2)囊封mRNA之低降解。
穩定脂質奈米粒子調配物
本文提供用於囊封編碼肽或多肽之mRNA的穩定液體脂質奈米粒子(LNP)的調配物。此類穩定LNP在一或多個冷凍解凍循環之後對聚集及mRNA降解具有抗性。例如，穩定LNP對一個、兩個、三個、四個、五個或超 過5個冷凍解凍循環具有抗性，其中囊封mRNA之LNP在-20℃下儲存。在一些實施例中，穩定LNP對一個、兩個、三個、四個、五個或超過5個冷凍解凍循環具有抗性，其中囊封mRNA之LNP在-80℃下或以下儲存。
此外，當向有需要之個體投與本文所描述之囊封mRNA的穩定LNP調配物時伴隨有減輕的疼痛。例如，相比於如本文所描述之不具有某些離子強度之LNP調配物，所描述之LNP調配物在投與後，諸如藉由肌肉內或皮下投與後引起減輕的疼痛。
在一些實施例中，此類穩定LNP調配物包含：a)一或多個LNP，其具有包含陽離子脂質、非陽離子脂質、經PEG修飾之脂質及視情況選用之膽固醇的脂質組分；b)囊封於該一或多個脂質奈米粒子內且編碼肽或多肽之mRNA；c)糖或糖醇；d)LNP調配物pH為6.0至8.0；e)pH緩衝液，其以最小緩衝離子強度提供LNP調配物pH；及視情況f)一或多種額外試劑，其為LNP調配物提供離子強度。穩定LNP調配物具有來自(e)之pH緩衝液及視情況選用之一或多種來自(f)之額外試劑的總濃度，該總濃度提供比最小緩衝離子強度大至少兩倍的LNP調配物之離子強度。在一輪、兩輪、三輪或超過三輪冷凍及解凍之後，與在LNP調配物中僅具有最小緩衝離子強度而非比最小緩衝離子強度大至少兩倍之離子強度的相同LNP調配物相比，所描述之LNP調配物具有(i)較少聚集，(ii)所囊封mRNA之較少降解，或(iii)(i)及(ii)兩者。
上述(f)中之一或多種額外試劑可為鹽、緩衝液或鹽與緩衝液之組合。例如，(f)中之一或多種額外試劑可包括例如NaCl、KCl、及CaCl2。緩衝液包括例如磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、咪唑緩衝液、組胺酸緩衝液或Good's緩衝液。各種Good's緩衝液為此項技術已知的，且包括例如MES、Bis-tris甲烷、ADA、Bis-tris丙烷、PIPES、ACES、POPSO、氯化膽胺(Cholamine chloride)、MOPS、BES、AMPB、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、乙醯胺基甘胺酸 (Acetamidoglycine)、TAPSO、TEA、POPSO、HEPPSO、EPS、HEPPS、Tricine、Tris、甘胺醯胺(Glycinamide)、甘胺醯甘胺酸(Glycylglycine)、HEPBS、Bicine、TAPS、AMPB、CHES、CAPSO、AMP、CAPS及CABS。在一些實施例中，Good's緩衝液為Tris緩衝液或HEPES緩衝液。
在一些實施例中，一或多種額外藥劑之濃度在約50-500mM、100-400mM或200-300mM之間。本文所描述之LNP調配物之緩衝液pH的濃度在約100-300mM、200-300mM或250-300mM之間。
如本文所描述之封裝mRNA之穩定LNP調配物的最小緩衝離子強度為例如至少15mM、至少25mM、至少50mM、至少75mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM或至少200mM。在實施例中，如本文所描述之囊封mRNA之穩定LNP調配物，例如在約15mM-200mM、50mM-200mM、75mM-200mM、15mM-150mM、50mM-150mM、75mM-150mM、15mM-100mM、50mM-100mM、75mM-100mM或100mM-200mM之間。最小緩衝離子強度可以各種方式獲得。例如，在一些實施例中，藉由增加緩衝液濃度來獲得最小緩衝離子強度。替代地，藉由增加鹽濃度來獲得最小緩衝離子強度。在一些實施例中，藉由增加緩衝液濃度及鹽濃度兩者來獲得最小緩衝離子強度。例如，在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度係選自約40mM Tris緩衝液及約75mM-200mM NaCl、約50mM Tris緩衝液及約75mM-200mM NaCl、約100mM Tris緩衝液及約75mM-200mM NaCl、約40mM咪唑及約75mM-200mM NaCl、約50mM咪唑及75mM-200mM NaCl、及約100mM咪唑及75mM-200mM NaCl、約40mM磷酸鹽及75mM-200mM NaCl、約50mM磷酸鹽及75mM-200mM NaCl及約100mM磷酸鹽及75mM-200mM NaCl。在一些實施例中，pH緩衝液及提供離子強度之一或多種額外試劑之總濃度係選自40mM Tris緩衝液、約75mM-200mM NaCl及約2.5-10%海藻糖、約 50mM Tris緩衝液、約75mM-200mM NaCl及約2.5-10%海藻糖、約100mM Tris緩衝液、約75mM-200mM NaCl及約2.5-10%海藻糖、約40mM咪唑、約75mM-200mM NaCl及約2.5-10%海藻糖、約50mM咪唑、75mM-200mM NaCl及約2.5-10%海藻糖、及約100mM咪唑、75mM-200mM NaCl及約2.5-10%海藻糖、約40mM磷酸鹽、約75mM-200mM NaCl及約2.5-10%海藻糖、約50mM磷酸鹽、75mM-200mM NaCl及約2.5-10%海藻糖、約100mM磷酸鹽、75mM-200mM NaCl及約2.5-10%海藻糖。
在一些實施例中，緩衝液可互換使用。在一些實施例中，Tris緩衝液經咪唑緩衝液或磷酸鹽緩衝液取代。在一些實施例中，Tris緩衝液經咪唑緩衝液取代。在一些實施例中，Tris緩衝液經磷酸鹽緩衝液取代。在一些實施例中，咪唑緩衝液經磷酸鹽緩衝液或Tris緩衝液取代。在一些實施例中，咪唑緩衝液經磷酸鹽緩衝液取代。在一些實施例中，咪唑緩衝液經Tris緩衝液取代。在一些實施例中，磷酸鹽緩衝液經Tris緩衝液或咪唑緩衝液取代。在一些實施例中，磷酸鹽緩衝液經Tris緩衝液取代。在一些實施例中，磷酸鹽緩衝液經咪唑緩衝液取代。
在一些實施例中，Tris緩衝液、咪唑緩衝液或磷酸鹽緩衝液具有高緩衝液濃度(例如，100mM或更大)。在一些實施例中，以低緩衝強度(例如15-20mM)之Tris緩衝液、磷酸鹽緩衝液或咪唑緩衝液與高鹽濃度(例如，200mM或更大NaCl)使用。在一些實施例中，以中等緩衝強度(例如40-50mM)之Tris緩衝液、磷酸鹽緩衝液或咪唑緩衝液與中等鹽濃度(例如，50-100mM NaCl)使用。
在一些實施例中，Tris緩衝液、磷酸鹽緩衝液或咪唑緩衝液與低海藻糖濃度(例如，50-100mM NaCl)使用。在一些實施例中，在低糖與緩衝液比率下，LNP調配物穩定性較大。在一些實施例中，LNP調配物之較低海藻糖與 緩衝液比率有利於防止囊封降低。在一些實施例中，較低海藻糖與緩衝液比率防止LNP尺寸增加。
在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少2.25倍、大至少2.5倍、大至少2.75倍、大至少3倍、大至少3.5倍、大至少4倍、大至少4.5倍、大至少5倍。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度小於20倍、小於19倍、小於18倍、小於17倍、小於16倍、小於15倍、小於14倍、小於13倍、小於12倍、小於11倍、小於10倍、小於9倍、小於8倍、小於7倍、小於6倍、小於5倍、小於4倍之最小緩衝離子強度。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少兩倍且比最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中LNP調配物之離子強度在約150mM-750mM、150mM-500mM、150mM-400mM、150mM-300mM、150mM及200mM之間。在一些實施例中，LNP調配物之離子強度比最小緩衝離子強度大至少兩倍且比最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中LNP調配物之離子強度為或大於150mM。通篇參考之最小緩衝離子強度為至少75mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM或至少200mM。
在一些實施例中，本文所描述之穩定LNP調配物進一步包含一種或冷凍保護劑。冷凍保護劑可表徵為「穿透性」冷凍保護劑或「非穿透性」冷凍保護劑。本文所描述之LNP調配物的適合冷凍保護劑可選自穿透性冷凍保護劑及/或非穿透性冷凍保護劑。例示性非穿透性冷凍保護劑包括例如糖類，諸如右旋糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、葡聚糖及菊糖。另一類非穿透性冷凍保護劑包括例如聚合物，諸如PVP、PVA、泊洛沙姆及PEG。例示性穿透性冷凍保護劑包括例如甘油、乙二醇、三乙二醇、丙二醇、四乙二醇。所描述之冷凍保護劑中之任何一或多者適用於包括於本文所描述之穩定LNP調配物中。在一些實施例中，LNP調配物中之冷凍保護劑包含濃度在1%與20%之間的海藻糖。在 一些實施例中，LNP調配物中之冷凍保護劑包含濃度在約2.5%-3.0%之間的海藻糖。在一些實施例中，LNP調配物中之冷凍保護劑包含濃度為約2.5%的海藻糖。在一些實施例中，LNP調配物中之冷凍保護劑包含濃度為約2.6%的海藻糖。在一些實施例中，LNP調配物中之冷凍保護劑包含濃度為約2.7%的海藻糖。在一些實施例中，LNP調配物中之冷凍保護劑包含濃度為約2.8%的海藻糖。在一些實施例中，LNP調配物中之冷凍保護劑包含濃度為約2.9%的海藻糖。在一些實施例中，LNP調配物中之冷凍保護劑包含濃度為約3.0%的海藻糖。
各種非陽離子脂質可用於本文所描述之LNP調配物中。在一些實施例中，適用於本文中所描述之LNP調配物的陽離子脂質可選自1,2-二芥醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯基-乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE或1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)。在一些實施例中，非陽離子脂質為DOPE。
LNP調配物中之非陽離子脂質之脂質莫耳比可大於10%。例如，在一些實施例中，非陽離子脂質之脂質莫耳比為11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%。
在一些實施例中，陽離子脂質係選自類脂質。各種類脂質為此項 技術中已知的。例如，類脂質描述於Goldberg M.(2013)Lipidoids：A Combinatorial Approach to siRNA Delivery.In：Howard K.(eds)RNA Interference from Biology to Therapeutics.Advances in Delivery Science and Technology.Springer,Boston,MA.，其內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，類脂質為陽離子性。在一些實施例中，類脂質含有至多七個尾部。七個尾部可例如自胺主鏈伸出。在一些實施例中，當與天然脂質(諸如三酸甘油酯)相比時，類脂質相對於脂肪族鏈具有其酯鍵的反轉。在一些實施例中，當與天然脂質(諸如三酸甘油酯)相比時，類脂質相對於脂肪族鏈不具有其酯鍵的反轉。
在一些實施例中，類脂質包括例如胺基醇類脂質。在一些實施例中，類脂質係選自cKK-E10、OF-02或C12-200。因此，在一些實施例中，類脂質為cKK-E-10。在一些實施例中，類脂質為OF-02。在一些實施例中，類脂質為C12-200。
本發明之LNP調配物可具有約6.0與8.0之間的pH。例如，在一些實施例中，LNP調配物可具有約6.0至7.0之間的pH。在一些實施例中，LNP調配物可具有約6.5-7.5之間的pH。在一些實施例中，LNP調配物可具有約7.0-8.0之間的pH。在一些實施例中，LNP調配物之pH為約7.4。在一些實施例中，LNP調配物之pH等效於生理pH。
LNP調配物之pH緩衝液可具有約6.0與8.2之間的pKa。例如，LNP調配物之pH緩衝液的pKa為約6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0或8.2。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約6.2。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約6.4。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約6.6。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約6.8。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約7.0。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約7.2。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約7.4。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約7.6。在一些實施例 中，pH緩衝液之pKa為約7.8。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約8.0。在一些實施例中，pH緩衝液之pKa為約8.2。
如上文所描述，本文所描述之LNP調配物在一或多個冷凍解凍循環之後具有較少聚集。此項技術中存在各種方式包括例如藉由以下中之任一者來測定LNP聚集：動態光散射(DLS)、奈米粒子追蹤分析(NTA)、濁度分析、流動顯微術分析、流動式細胞量測術、FTIR顯微術、共振質量量測(RMM)、拉曼顯微術(Raman microscopy)、過濾、雷射繞射、電子顯微術、原子力顯微術(AFM)、靜態光散射(SLS)、多角度靜態光散射(MALS)、場流分離(FFF)或分析超速離心法(AUC)。此等方法中之任何一或多者均可用於評估LNP聚集。
本文所描述之LNP調配物在一或多個冷凍解凍循環之後亦具有較少mRNA降解。此項技術中存在各種方式來測定mRNA降解，例如動態光散射(DLS)、奈米粒子追蹤分析(NTA)、濁度分析、流動顯微術分析、流動式細胞量測術、FTIR顯微術、共振質量量測(RMM)、拉曼顯微術、過濾、雷射繞射、電子顯微術、原子力顯微術(AFM)、靜態光散射(SLS)、多角度靜態光散射(MALS)、場流分離(FFF)或分析超速離心法(AUC)。此等方法中之任何一或多者可用於評估mRNA降解。
本文所描述之LNP調配物的直徑小於100nm。例如，在一些實施例中，LNP之直徑在70nm-90nm之間。在一些實施例中，LNP之直徑小於70nm。
如通篇所描述，各種類型之脂質組分適用於本文所描述之LNP。在一些實施例中，LNP調配物具有包含DMG-PEG-2000、cKK-E10、膽固醇及DOPE之脂質組分。在一些實施例中，LNP調配物具有由DMG-PEG-2000、cKK-E10、膽固醇及DOPE組成之脂質組分。
LNP調配物可具有約3-5之N/P比範圍。在一些實施例中，N/P比為約3。在一些實施例中，N/P比為約4。在一些實施例中，N/P比為約5。
LNP調配物囊封mRNA。任何mRNA均可由本文所描述之LNP調配物囊封。囊封於LNP內之mRNA的最終濃度可在約0.05mg/mL與1.0mg/mL之間的範圍內。在一些實施例中，囊封於LNP內之mRNA在約0.2mg/mL至約0.5mg/mL範圍內。
本文所描述之LNP調配物當在-20℃、-80℃或低於-80℃下儲存時穩定。因此，在一些實施例中，當本文所描述之LNP調配物在-20℃下儲存時穩定。在一些實施例中，當本文所描述之LNP調配物在-80℃下儲存時穩定。在一些實施例中，當本文所描述之LNP調配物在低於-80℃下儲存時穩定。例如，當儲存於-20℃下時，LNP調配物穩定至少3個月、6個月、12個月或超過12個月。此外，LNP調配物在稀釋後穩定。
mRNA之合成
可根據各種已知方法中之任一種來合成根據本發明之mRNA。例如，根據本發明之mRNA可經由活體外轉錄(IVT)合成。簡言之，IVT通常用線形或環形DNA模板進行，該模板含有啟動子、核糖核苷酸三磷酸酯之池、可包括DTT及鎂離子之緩衝液系統及適當RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶及/或RNA酶抑制劑。具體條件將根據具體應用而變化。
在一些實施例中，為製備根據本發明之mRNA，在活體外轉錄DNA模板。適合之DNA模板通常具有用於活體外轉錄的啟動子，例如T3、T7或SP6啟動子，隨後為用於所需mRNA的所需核苷酸序列及終止信號。
使用SP6 RNA聚合酶合成mRNA
在一些實施例中，mRNA係使用SP6 RNA聚合酶產生。SP6 RNA 聚合酶為一種對SP6啟動子序列具有高序列特異性之DNA依賴性RNA聚合酶。SP6聚合酶在其啟動子下游的單股DNA或雙股DNA上催化RNA之5'→3'活體外合成；其將天然核糖核苷酸及/或經修飾之核糖核苷酸及/或經標記之核糖核苷酸併入至聚合轉錄物中。此類經標記之核糖核苷酸之實例包括經生物素、經螢光素、經地高辛(digoxigenin)、經胺基烯丙基及經同位素標記之核苷酸。
噬菌體SP6 RNA聚合酶之序列最初描述(GenBank：Y00105.1)為具有以下胺基酸序列：
Figure 110143961-A0202-12-0028-1
適用於本發明之SP6 RNA聚合酶可為具有與噬菌體SP6 RNA聚合酶實質上相同之聚合酶活性的任何酶。因此，在一些實施例中，適用於本發明之SP6 RNA聚合酶可自SEQ ID NO：16修飾。例如，適合之SP6 RNA聚合酶可含有一或多個胺基酸取代、缺失或添加。在一些實施例中，適合之SP6 RNA聚合酶具有與SEQ ID NO：16約99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、75%、70%、65%或60%一致或同源之胺基酸序列。在一些實施例中，適合之SP6 RNA聚合酶可為截短蛋白質(來自N端、C端或內部)，但保持聚合酶活性。在一些實施例中，適合之SP6 RNA聚合酶為融合蛋白。
適用於本發明之SP6 RNA聚合酶可為市售的，例如來自Aldevron、Ambion、New England Biolabs(NEB)、Promega及Roche。SP6可根據如本文所描述之SEQ ID NO：16之胺基酸序列或SEQ ID NO：16之變異體，由商業來源或非商業來源來訂購及/或定製設計。SP6可為標準保真度聚合酶，或可為經修飾以促進RNA聚合酶活性的高保真度/高效率/高容量聚合酶，例如SP6 RNA聚合酶基因的突變或SP6 RNA聚合酶本身的轉譯後修飾。此類經修飾之SP6的實例包括來自Ambion之SP6 RNA聚合酶-PlusTM、來自NEB之HiScribe SP6及來自Promega之RiboMAXTM及Riboprobe®系統。
在一些實施例中，適合之SP6 RNA聚合酶為融合蛋白。例如，SP6 RNA聚合酶可包括一或多個標籤以促進酶之分離、純化或溶解度。適合之標籤可位於N端、C端及/或內部。適合標籤之非限制性實例包括鈣調蛋白結合蛋白(CBP)；肝片吸蟲(Fasciola hepatica)8-kDa抗原(Fh8)；FLAG標籤肽；麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)；組胺酸標籤(例如六聚組胺酸標籤(His6))；麥芽糖結合蛋白(MBP)；氮利用物質(NusA)；小泛素相關修飾物(SUMO)融合標籤；鏈黴抗生物素蛋白結合肽(STREP)；串聯親和純化(TAP)；及硫氧還原蛋白 (TrxA)。在本發明中可使用其他標籤。已描述此等及其他融合標籤，例如，Costa等人《微生物學前沿(Frontiers in Microbiology)》5(2014)：63及於PCT/US16/57044中，其中之內容以全文引用之方式併入本文中。在某些實施例中，His標籤位於SP6的N端。
DNA模板
通常，DNA模板為完全雙股的或具有雙股SP6啟動子序列的大部分單股。
線性化質體DNA(經由一或多種限制酶線性化)、線性化基因體DNA片段(經由限制酶及/或物理方法)、PCR產物及/或合成DNA寡核苷酸可以用作與SP6活體外轉錄的模板，其限制條件為它們在待轉錄之DNA序列上游(及在正確方向)含有雙股SP6啟動子。
在一些實施例中，線性化DNA模板具有鈍端。
在一些實施例中，待轉錄之DNA序列可經最佳化以促進更高效轉錄及/或轉譯。例如，可針對順式調控元件(例如，TATA盒、終止信號及蛋白質結合位點)、人工重組位點、chi位點、CpG二核苷酸含量、負CpG島、GC含量、聚合酶滑脫位點及/或其他與轉錄相關之元件最佳化DNA序列；可針對隱蔽剪接位點、mRNA二級結構、mRNA之穩定自由能、重複序列、RNA不穩定性模體及/或其他與mRNA加工及穩定性相關之元件最佳化DNA序列；可針對密碼子使用偏好、密碼子適應性、內部chi位點、核糖體結合位點(例如IRES)、早熟聚A位點、Shine-Dalgarno(SD)序列及/或其他與轉譯相關之元件最佳化DNA序列；及/或可針對密碼子上下文、密碼子-反密碼子交互作用、轉譯暫停位點及/或其他與蛋白質摺疊相關之元件最佳化DNA序列。此項技術中已知之最佳化方法可用於本發明中，例如，ThermoFisher及OptimumGeneTM之GeneOptimizer，其描述於US 20110081708中，其內容以全文引用之方式併入本 文中。
在一些實施例中，DNA模板包括5'及/或3'非轉譯區。在一些實施例中，5'非轉譯區包括一或多個影響mRNA穩定性或轉譯之元件，例如鐵反應元件。在一些實施例中，5'非轉譯區之長度可在約50與500個核苷酸之間。
在一些實施例中，3'非轉譯區包括以下中之一或多者：聚腺苷酸化信號、影響細胞中之位置之mRNA穩定性的蛋白質結合位點、或miRNA之一或多個結合位點。在一些實施例中，3'非轉譯區之長度可在約50與500個核苷酸之間或更長。
例示性3'及/或5' UTR序列可衍生自穩定之mRNA分子(例如，血球蛋白、肌蛋白、GAPDH、微管蛋白、組蛋白或檸檬酸循環酶)以增加有義mRNA分子之穩定性。例如，5' UTR序列可包括CMV立即早期1(IE1)基因之部分序列或其片段，以改良核酸酶抗性及/或改良多核苷酸之半衰期。亦考慮將編碼人類生長激素(hGH)的序列或其片段包括至多核苷酸(例如mRNA)的3'端或非轉譯區以進一步穩定多核苷酸。一般而言，此等修飾改善多核苷酸相對於其未經修飾之對應物之穩定性及/或藥物動力學特性(例如半衰期)，且包括例如改善此類多核苷酸對活體內核酸酶消化之抗性的修飾。
大規模mRNA合成
在一些實施例中，本發明可用於大規模生產穩定LNP囊封之mRNA。在一些實施例中，根據本發明之方法以單批次合成至少100mg、150mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、250g、500g、750g、1kg、5kg、10kg、50kg、100kg、1000kg或更多之mRNA。如本文所用，術語「批次」係指例如根據單一製造環境產生之一次合成的mRNA之數量或量。一批次可指在一組條件下經由單個等分的酶及/或單個等分的DNA模板進行連續合成之一個反應中 合成的mRNA的量。單一批次合成之mRNA不包括在不同時間合成的mRNA經組合以達成所需之量。一般而言，反應混合物包括SP6 RNA聚合酶、線形DNA模板及RNA聚合酶反應緩衝液(其可包括核糖核苷酸或可能需要添加核糖核苷酸)。
根據本發明，每公克(g)所產生之mRNA通常使用1-100mg SP6聚合酶。在一些實施例中，每公克所產生之mRNA使用約1-90mg、1-80mg、1-60mg、1-50mg、1-40mg、10-100mg、10-80mg、10-60mg、10-50mg SP6聚合酶。在一些實施例中，約5-20mg SP6聚合酶用於產生約1公克mRNA。在一些實施例中，約0.5至2公克SP6聚合酶用於產生約100公克mRNA。在一些實施例中，約5至20公克SP6聚合酶用於產生約1公斤mRNA。在一些實施例中，至少5mg SP6聚合酶用於產生至少1公克mRNA。在一些實施例中，至少500mg SP6聚合酶用於產生至少100公克mRNA。在一些實施例中，至少5公克SP6聚合酶用於產生至少1公斤mRNA。在一些實施例中，每公克所產生之mRNA使用約10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg質體DNA。在一些實施例中，約10-30mg質體DNA用於產生約1公克mRNA。在一些實施例中，約1至3公克質體DNA用於產生約100公克mRNA。在一些實施例中，約10至30公克質體DNA用於約1公斤mRNA。在一些實施例中，至少10mg質體DNA用於產生至少1公克mRNA。在一些實施例中，至少1公克質體DNA用於產生至少100公克mRNA。在一些實施例中，至少10公克質體DNA用於產生至少1公斤mRNA。
在一些實施例中，反應混合物中SP6 RNA聚合酶之濃度可為約1至100nM、1至90nM、1至80nM、1至70nM、1至60nM、1至50nM、1至40nM、1至30nM、1至20nM或約1至10nM。在某些實施例中，SP6 RNA聚合酶之濃度為約10至50nM、20至50nM或30至50nM。可使用濃度為100至 10000單位/毫升的SP6 RNA聚合酶，例如可使用的濃度為100至9000單位/毫升、100至8000單位/毫升、100至7000單位/毫升、100至6000單位/毫升、100至5000單位/毫升、100至1000單位/毫升、200至2000單位/毫升、500至1000單位/毫升、500至2000單位/毫升、500至3000單位/毫升、500至4000單位/毫升、500至5000單位/毫升、500至6000單位/毫升、1000至7500單位/毫升及2500至5000單位/毫升。
反應混合物中各核糖核苷酸(例如，ATP、UTP、GTP及CTP)的濃度在約0.1mM與約10mM之間，例如在約1mM與約10mM之間、在約2mM與約10mM之間、在約3mM與約10mM之間、在約1mM與約8mM之間、在約1mM與約6mM之間、在約3mM與約10mM之間、在約3mM與約8mM之間、在約3mM與約6mM之間、在約4mM與約5mM之間。在一些實施例中，在反應混合物中各核糖核苷酸為約5mM。在一些實施例中，用於反應中之rNTP(例如組合之ATP、GTP、CTP及UTP)的總濃度介於1mM與40mM之間。在一些實施例中，用於反應中之rNTP(例如組合之ATP、GTP、CTP及UTP)的總濃度介於1mM與30mM之間、或1mM與28mM之間、或1mM至25mM之間或1mM與20mM之間。在一些實施例中，總rNTP濃度小於30mM。在一些實施例中，總rNTP濃度小於25mM。在一些實施例中，總rNTP濃度小於20mM。在一些實施例中，總rNTP濃度小於15mM。在一些實施例中，總rNTP濃度小於10mM。
RNA聚合酶反應緩衝液通常包括鹽/緩衝劑，例如Tris、HEPES、硫酸銨、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鉀、磷酸鈉、氯化鈉及氯化鎂。
反應混合物之pH可在約6至8.5、約6.5至8.0、約7.0至7.5之間，且在一些實施例中，pH為7.5。
線性或線性化DNA模板(例如，如上文所描述且以足以提供所需 量之RNA之量/濃度)、RNA聚合酶反應緩衝液及SP6 RNA聚合酶經組合以形成反應混合物。反應混合物在約37℃與約42℃之間培育三十分鐘至六小時，例如約六十至約九十分鐘。
在一些實施例中，在約37℃至約42℃下在適合RNA聚合酶反應緩衝液(最終反應混合物pH為約7.5)中培育約5mM NTP、約0.05mg/mL SP6聚合酶及約0.1mg/ml DNA模板持續六十至九十分鐘。
在一些實施例中，反應混合物含有線性化雙股DNA模板，該模板具有SP6聚合酶特異性啟動子、SP6 RNA聚合酶、RNase抑制劑、焦磷酸酶、29mM NTP、10mM DTT及反應緩衝液(當在10x時係800mM HEPES、20mM亞精胺、250mM MgCl2，pH為7.7)，且數量足夠(QS)(用無RNA酶之水達到所需反應體積)；此反應混合物隨後在37℃下培育60分鐘。隨後藉由添加DNA酶I及DNA酶I緩衝液(當在10x時係100mM Tris-HCl、5mM MgCl2及25mM CaCl2，pH為7.6)使聚合酶反應淬滅，以促進雙股DNA模板消化，以準備用於純化。此實施例已顯示足以產生100公克mRNA。
在一些實施例中，反應混合物包括濃度在1-10mM範圍內之NTP、濃度在0.01-0.5mg/ml範圍內之DNA模板及濃度在0.01-0.1mg/ml範圍內之SP6 RNA聚合酶，例如反應混合物包含濃度為5mM之NTP、濃度為0.1mg/ml之DNA模板及濃度為0.05mg/ml之SP6 RNA聚合酶。
核苷酸
各種天然存在或經修飾之核苷可用於產生根據本發明之mRNA。在一些實施例中，mRNA為或包含天然核苷(例如，腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷)；核苷類似物(例如，2-胺基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基 腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷、O(6)-甲基鳥嘌呤、假尿苷(例如N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷及2-硫代胞苷)；經化學修飾之鹼基；經生物修飾之鹼基(例如甲基化之鹼基)；插層鹼基；經修飾之糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖及己醣)；及/或經修飾之磷酸鹽基團(例如，硫代磷酸鹽及5'-N-亞磷醯胺鍵)。
在一些實施例中，mRNA包含一或多個非標準核苷酸殘基。非標準核苷酸殘基可包括例如5-甲基-胞苷(「5mC」)、假尿苷(「ψU」)及/或2-硫代-尿苷(「2sU」)。參見例如，美國專利第8,278,036號或WO2011012316號關於此等殘基及其併入至mRNA中的論述。mRNA可為RNA，其定義為RNA，其中25%之U殘基為2-硫代-尿苷且25%之C殘基為5-甲基胞苷。使用RNA之教學係所揭示之美國專利公開案US20120195936及國際公開案WO2011012316，兩者特此以全文引用之方式併入。非標準核苷酸殘基之存在可使mRNA比具有相同序列但僅含有標準殘基之對照mRNA更穩定及/或免疫原性較低。在其他實施例中，mRNA可包含一或多種選自以下之非標準核苷酸殘基：異胞嘧啶、假異胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-胺基嘌呤、2-胺基嘌呤、肌苷、二胺基嘌呤及2-氯-6-胺基嘌呤胞嘧啶以及此等修飾及其他核鹼基修飾之組合。一些實施例可進一步包括對呋喃醣環或核鹼基之額外修飾。額外修飾可包括例如糖修飾或取代(例如，2'-O-烷基修飾、鎖核酸(LNA)中之一或多者)。在一些實施例中，RNA可經額外多核苷酸及/或肽多核苷酸(PNA)複合或雜交。在糖修飾為2'-O-烷基修飾之一些實施例中，此類修飾可包括但不限於2'-去氧-2'-氟修飾、2'-O-甲基修飾、2'-O-甲氧基乙基修飾及2'-去氧基修飾。在一些實施例中，此等修飾中之任一者可單獨或組合存在於0-100%的核苷酸中，例如，超過0%、1%、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%或100%的組成核苷酸。
合成後處理
通常，在合成之後可添5'端部及/或3'尾部。端部之存在對在大部分真核細胞中發現之核酸酶提供抗性至關重要。「尾部」之存在用於保護mRNA免於核酸外切酶降解。
典型地如下添加5'端部：首先，RNA末端磷酸酶自5'核苷酸中移除末端磷酸酯基團中之一者，留下兩種末端磷酸酯；接著經由鳥苷醯基轉移酶將鳥苷三磷酸酯(GTP)添加至末端磷酸酯中，產生5'5'5三磷酸酯鍵聯；且鳥嘌呤之7-氮接著藉由甲基轉移酶甲基化。端部結構之實例包括但不限於m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A及G(5')ppp(5')G。額外端部結構描述於公開之美國專利申請公開案第2016/0032356號及於2017年2月27日提交之美國臨時專利申請案第62/464,327號中，其以引用之方式併入本文中。
通常，尾部結構包括聚(A)及/或聚(C)尾部。mRNA之3'端上的聚A或聚C尾部通常分別包括至少50個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少150個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少200個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少250個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少300個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少350個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少400個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少450個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少500個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少550個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少650個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少700個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少750個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少800個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少850個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少900個腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少950個腺苷或胞嘧啶核苷酸、或至少1kb腺苷或胞嘧啶核苷酸。在一些實施例中，聚A或聚C尾部可分別為約10至800個腺苷或胞嘧啶核苷酸(例如，約10至200個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約10至300個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約10至400個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約10至500個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約10至550個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約10至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約50至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約 100至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約150至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約200至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約250至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約300至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約350至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約400至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約450至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約500至600個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約10至150個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約10至100個腺苷或胞嘧啶核苷酸、約20至70個腺苷或胞嘧啶核苷酸、或約20至60個腺苷或胞嘧啶核苷酸)。在一些實施例中，尾部結構包括具有本文所描述之各種長度的聚(A)及聚(C)尾部之組合。在一些實施例中，尾部結構包括至少50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%腺苷核苷酸。在一些實施例中，尾部結構包括至少50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%胞嘧啶核苷酸。
如本文中所描述，添加5'端部及/或3'尾部有助於偵測在活體外合成期間產生之中止轉錄物，因為在無端部及/或尾部之情況下，彼等過早地中止之mRNA轉錄物的尺寸可能太小而無法偵測。因此，在一些實施例中，在測試mRNA純度(例如，mRNA中存在之中止轉錄物的含量)之前，向合成mRNA中添加5'端部及/或3'尾部。在一些實施例中，在如本文所描述純化mRNA之前，將5'端部及/或3'尾部添加至合成mRNA。在其他實施例中，在如本文所描述純化mRNA之後，將5'端部及/或3'尾部添加至合成mRNA。
根據本發明合成之mRNA可不經進一步純化即使用。特定言之，根據本發明合成之mRNA可在不存在移除縮短子之步驟的情況下使用。在一些實施例中，根據本發明合成之mRNA可經進一步純化。可使用各種方法純化根據本發明合成之mRNA。例如，可使用離心、過濾及/或層析方法進行mRNA之純化。在一些實施例中，藉由乙醇沈澱或過濾或層析、或凝膠純化或任何其他適 合手段來純化合成之mRNA。在一些實施例中，mRNA藉由HPLC純化。在一些實施例中，mRNA在熟習此項技術者熟知之標準苯酚：氯仿：異戊醇溶液中萃取。在一些實施例中，使用切向流過濾來純化mRNA。適合純化方法包括描述於以下中之彼等方法：美國專利申請公開案第2016/0040154號、美國專利申請公開案第2015/0376220號、於2018年2月27日申請之標題為「信使RNA之純化方法(METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA)」的國際專利申請案PCT/US18/19954，及於2018年2月27日申請之標題為「信使RNA之純化方法(METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA)」的國際專利申請案PCT/US18/19978，其全部以引用之方式併入本文中且可用於實踐本發明。
在一些實施例中，mRNA在封端及加尾之前經純化。在一些實施例中，mRNA在封端及加尾後純化。在一些實施例中，mRNA在封端及加尾之前及之後經純化。
在一些實施例中，mRNA在封端及加尾之前或之後或之前及之後藉由離心純化。
在一些實施例中，mRNA在封端及加尾之前或之後或之前及之後藉由過濾純化。
在一些實施例中，mRNA在封端及拖尾之前或之後或之前及之後藉由切向流過濾(TFF)純化。
在一些實施例中，mRNA在封端及加尾之前或之後或之前及之後藉由層析純化。
mRNA之表徵
可使用此項技術中可利用之任何方法偵測及定量mRNA之全長或中止轉錄物。在一些實施例中，使用墨點法、毛細電泳法、層析、螢光、凝膠電泳、HPLC、銀染色、光譜法、紫外線(UV)或UPLC或其組合偵測經合成之 mRNA分子。此項技術中已知之其他偵測方法包括於本發明中。在一些實施例中，使用UV吸收光譜法藉由毛細電泳法來偵測經合成之mRNA分子。在一些實施例中，mRNA在凝膠電泳之前首先藉由乙二醛染料變性(「乙二醛凝膠電泳」)。在一些實施例中，合成之mRNA在封端或加尾之前表徵。在一些實施例中，合成之mRNA在封端及加尾之後表徵。
在一些實施例中，藉由本文所揭示之方法產生的mRNA包含小於10%、小於9%、小於8%、小於7%、小於6%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%、小於1%、小於0.5%、小於0.1%的除全長mRNA以外的雜質。雜質包括IVT污染物，例如，蛋白質、酶、游離核苷酸及/或縮短子。
在一些實施例中，根據本發明產生之mRNA實質上不含縮短子或中止轉錄物。特定言之，根據本發明產生之mRNA含有藉由毛細電泳法或乙二醛凝膠電泳不可偵測到含量之縮短子或中止轉錄物。如本文所用，術語「縮短子」或「中止轉錄物」係指小於全長的任何轉錄物。在一些實施例中，「縮短子」或「中止轉錄物」之長度小於100個核苷酸、小於90、小於80、小於70、小於60、小於50、小於40、小於30、小於20或小於10個核苷酸長度。在一些實施例中，在添加5'-端部及/或3'-聚A尾部之後偵測或定量縮短子。
mRNA溶液
在一些實施例中，mRNA可提供於待與脂質溶液混合之溶液中，使得mRNA可囊封於脂質奈米粒子中。適合mRNA溶液可為含有以各種濃度囊封之mRNA的任何水溶液。例如，適合mRNA溶液可含有濃度為或大於約0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml之mRNA。在一些實施例中，適合之mRNA溶液可含有濃度介於約0.01-1.0mg/ml、0.01-0.9mg/ml、0.01-0.8mg/ml、0.01-0.7 mg/ml、0.01-0.6mg/ml、0.01-0.5mg/ml、0.01-0.4mg/ml、0.01-0.3mg/ml、0.01-0.2mg/ml、0.01-0.1mg/ml、0.05-1.0mg/ml、0.05-0.9mg/ml、0.05-0.8mg/ml、0.05-0.7mg/ml、0.05-0.6mg/ml、0.05-0.5mg/ml、0.05-0.4mg/ml、0.05-0.3mg/ml、0.05-0.2mg/ml、0.05-0.1mg/ml、0.1-1.0mg/ml、0.2-0.9mg/ml、0.3-0.8mg/ml、0.4-0.7mg/ml、或0.5-0.6mg/ml的mRNA。在一些實施例中，適合之mRNA溶液可含有濃度為至多約5.0mg/ml、4.0mg/ml、3.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.09mg/ml、0.08mg/ml、0.07mg/ml、0.06mg/ml或0.05mg/ml之mRNA。
通常，適合之mRNA溶液亦可含有緩衝劑及/或鹽。一般而言，緩衝劑可包括HEPES、硫酸銨、碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、乙酸鈉、磷酸鉀及磷酸鈉。在一些實施例中，緩衝劑之適當濃度可介於約0.1mM至100mM、0.5mM至90mM、1.0mM至80mM、2mM至70mM、3mM至60mM、4mM至50mM、5mM至40mM、6mM至30mM、7mM至20mM、8mM至15mM或9mM至12mM。在一些實施例中，適合濃度之緩衝劑為或大於約0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。
例示性鹽可包括氯化鈉、氯化鎂及氯化鉀。在一些實施例中，mRNA溶液中的鹽之適合濃度可介於約1mM至500mM、5mM至400mM、10mM至350mM、15mM至300mM、20mM至250mM、30mM至200mM、40mM至190mM、50mM至180mM、50mM至170mM、50mM至160mM、50mM至150mM或50mM至100mM。適合mRNA溶液中之鹽濃度為或大於約1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM。
在一些實施例中，適合mRNA溶液之pH範圍可為約3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0- 4.6或4.0-4.5。在一些實施例中，適合mRNA溶液之pH可為或不超過約3.5、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.3及6.5。
可使用各種方法製備適用於本發明之mRNA溶液。在一些實施例中，mRNA可直接溶解於本文所描述之緩衝液溶液中。在一些實施例中，可在與用於囊封之脂質溶液混合之前，藉由將mRNA儲備溶液與緩衝液溶液混合來生成mRNA溶液。在一些實施例中，可在即將與用於囊封之脂質溶液混合之前，藉由將mRNA儲備溶液與緩衝液溶液混合來生成mRNA溶液。在一些實施例中，適合mRNA儲備溶液可含有濃度為或大於約0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml或1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml或5.0mg/ml之水中的mRNA。
在一些實施例中，使用泵將mRNA儲備溶液與緩衝液溶液混合。例示性泵包括但不限於齒輪泵、蠕動泵及離心泵。
通常，以大於mRNA儲備溶液之速率混合緩衝液溶液。例如，緩衝液溶液可以比mRNA儲備溶液之速率大至少1×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、15×或20×的速率混合。在一些實施例中，緩衝液溶液以介於約100-6000ml/分鐘之間(例如，約100-300ml/分鐘、300-600ml/分鐘、600-1200ml/分鐘、1200-2400ml/分鐘、2400-3600ml/分鐘、3600-4800ml/分鐘、4800-6000ml/分鐘或60-420ml/分鐘)之流速混合。在一些實施例中，緩衝液溶液以或大於約60ml/分鐘、100ml/分鐘、140ml/分鐘、180ml/分鐘、220ml/分鐘、260ml/分鐘、300ml/分鐘、340ml/分鐘、380ml/分鐘、420ml/分鐘、480ml/分鐘、540ml/分鐘、600ml/分鐘、1200ml/分鐘、2400ml/分鐘、3600ml/分鐘、4800ml/分鐘或6000ml/分鐘之流速混合。
在一些實施例中，mRNA儲備溶液以介於約10-600ml/分鐘之間(例如，約5-50ml/分鐘、約10-30ml/分鐘、約30-60ml/分鐘、約60-120ml/分鐘、約120-240ml/分鐘、約240-360ml/分鐘、約360-480ml/分鐘或約480-600ml/分鐘)之流速混合。在一些實施例中，mRNA儲備溶液以或大於約5ml/分鐘、10ml/分鐘、15ml/分鐘、20ml/分鐘、25ml/分鐘、30ml/分鐘、35ml/分鐘、40ml/分鐘、45ml/分鐘、50ml/分鐘、60ml/分鐘、80ml/分鐘、100ml/分鐘、200ml/分鐘、300ml/分鐘、400ml/分鐘、500ml/分鐘或600ml/分鐘之流速混合。
遞送媒劑
本文所描述之穩定脂質奈米粒子調配物適用作mRNA之遞送媒劑。
如本文所用，術語「遞送媒劑」、「轉移媒劑」、「奈米粒子」或文法等效物之可互換使用。
遞送媒劑可與一或多種額外核酸、載劑、靶向配位體或穩定試劑組合調配，或在其與適合賦形劑混合之藥理學組合物中調配。用於調配及投與藥物之技術可見於「Remington's Pharmaceutical Sciences」Mack Publishing Co.,Easton,Pa.，最新版本中。基於促進核酸轉染至目標細胞之能力選擇特定遞送媒劑。
脂質體遞送媒劑
在一些實施例中，適合遞送媒劑為脂質體遞送媒劑，例如脂質奈米粒子。如本文所用，脂質體遞送媒劑，例如脂質奈米粒子，通常表徵為具有內部水空間的微觀囊泡，其藉由一或多個雙層膜與外部介質隔離。脂質體之雙層膜通常由兩親媒性分子形成，諸如合成或天然來源之脂質，其包含空間分離之親水性及疏水性結構域(Lasic,《生物技術趨勢(Trends Biotechnol.)》,16：307-321,1998)。脂質體之雙層膜亦可藉由兩親媒性聚合物及界面活性劑(例如聚合物囊 泡、非離子界面活性劑囊泡等)形成。在本發明之上下文中，脂質體遞送媒劑典型地用以將所需mRNA轉運至目標細胞或組織。在一些實施例中，奈米粒子遞送媒劑為脂質體。在一些實施例中，脂質體包含一或多種陽離子脂質、一或多種非陽離子脂質、一或多種基於膽固醇之脂質及一或多種經PEG修飾之脂質。在一些實施例中，脂質體包含不超過三種不同脂質組分。在一些實施例中，一種不同脂質組分為基於固醇之陽離子脂質。
陽離子脂質
如本文所用，片語「陽離子脂質」係指在所選pH值諸如生理pH下具有淨正電荷之多種脂質物種中之任一者。
適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2010/144740中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括陽離子脂質，即具有以下之化合物結構的4-(二甲基胺基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基酯：
Figure 110143961-A0202-12-0043-2
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2013/149140中所描述之可離子化陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括下式中之一者的陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0043-3
或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1及R2各自獨立地選自由以下組成之群： 氫、視情況經取代之可變飽和或不飽和的C1-C20烷基及視情況經取代之可變飽和或不飽和的C6-C20醯基；其中L1及L2各自獨立地選自由以下組成之群：氫、視情況經取代之C1-C30烷基、視情況經取代之可變不飽和的C1-C30烯基、及視情況經取代之C1-C30炔基；其中m及o各自獨立地選自由零及任何正整數(例如，其中m為三)組成之群；且其中n為零或任何正整數(例如，其中n為一)。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括陽離子脂質(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(「HGT5000」)，其具有以下化合物結構：
Figure 110143961-A0202-12-0044-4
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括陽離子脂質(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-4,15,18-三烯-1-胺(「HGT5001」)，其具有以下化合物結構：
Figure 110143961-A0202-12-0044-5
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括陽離子脂質及(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(「HGT5002」)，其具有以下化合物結構：
Figure 110143961-A0202-12-0044-6
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2010/053572中所描述之胺基醇類脂質的陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0045-7
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2016/118725中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0045-8
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2016/118724中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0045-9
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括具有式14,25-雙十三基15,18,21,24-四氮雜-三十八烷之陽離子脂質及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2013/063468及WO 2016/205691中所描述之陽離子脂質，其中之每一者以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括下式之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0046-10
或其醫藥學上可接受之鹽，其中RL之每種情況獨立地為視情況經取代之C6-C40烯基。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0046-11
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0047-12
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0047-13
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0048-14
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2015/184256中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括下式之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0048-15
或其醫藥學上可接受之鹽，其中各X獨立地為O或S；各Y獨立地為O或S；各m獨立地為0至20；各n獨立地為1至6；各RA獨立地為氫、視情況經取代之C1-50烷基、視情況經取代之C2-50烯基、視情況經取代之C2-50炔基、視情況經取代之C3-10碳環基、視情況經取代之3-14員雜環基、視情況經取代 之C6-14芳基、視情況經取代之5-14員雜芳基或鹵素；且各RB獨立地為氫、視情況經取代之C1-50烷基、視情況經取代之C2-50烯基、視情況經取代之C2-50炔基、視情況經取代之C3-10碳環基、視情況經取代之3-14員雜環基、視情況經取代之C6-14芳基、視情況經取代之5-14員雜芳基或鹵素。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質「目標23」：
Figure 110143961-A0202-12-0049-16
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2016/004202中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0049-17
Figure 110143961-A0202-12-0049-18
或其醫藥學上可接受之鹽，在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0050-19
或其醫藥學上可接受之鹽，在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0050-20
或其醫藥學上可接受之鹽，
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如美國臨時專利申請案第62/758,179號中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括下式之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0050-21
或其醫藥上可接受之鹽，其中各R1及R2獨立地為H或C1-C6脂族；各m獨立地為1至4之整數；各A獨立地為共價鍵或伸芳基；各L1獨立地為酯、硫酯、二硫化物、或酸酐基團；各L2獨立地為C2-C10脂族；各X1獨立地為H或OH；且各R3獨立地為C6-C20脂族。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括下式之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0051-22
或其醫藥學上可接受之鹽，在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括下式之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0051-23
或其醫藥學上可接受之鹽，在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括下式之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0051-24
或其醫藥學上可接受之鹽，
用於本發明之組合物及方法中之其他適合陽離子脂質包括如J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217及Whitehead等人，《自然通訊(Nature Communications)》(2014)5：4277中所描述之陽離子脂質，其以引用之方式併入本文中。在某些實施例中，本發明之組合物及方法的陽離子脂質包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0052-25
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2015/199952中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0052-26
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0052-111
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0053-28
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0053-29
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0053-30
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0053-32
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0054-33
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0054-34
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0054-35
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0054-36
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0055-37
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0055-38
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0055-39
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2017/004143中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0055-40
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0056-41
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0056-42
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0056-43
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0056-44
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0057-45
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0057-46
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0057-48
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0057-49
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0058-50
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0058-51
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0058-52
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0058-112
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0059-54
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0059-55
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0059-56
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0059-57
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2017/075531中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括下式之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0060-58
或其醫藥學上可接受之鹽，其中L1或L2中之一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(=O)S-、-SC(=O)-、-NRaC(=O)-、-C(=O)NRa-、NRaC(=O)NRa-、-OC(=O)NRa-或-NRaC(=O)O-；且L1或L2中之另一者為-O(C=O)-、-(C=O)O-、-C(=O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(=O)S-、SC(=O)-、-NRaC(=O)-、-C(=O)NRa-、-NRaC(=O)NRa-、-OC(=O)NRa-或-NRaC(=O)O-或直接鍵；G1及G2各自獨立為未經取代之C1-C12伸烷基或C1-C12伸烯基；G3為C1-C24伸烷基、C1-C24伸烯基、C3-C8環伸烷基、C3-C8環伸烯基；Ra為H或C1-C12烷基；R1及R2各自獨立為C6-C24烷基或C6-C24烯基；R3為H、OR5、CN、-C(=O)OR4、-OC(=O)R4或-NR5C(=O)R4；R4為C1-C12烷基；R5為H或C1-C6烷基；且x為0、1或2。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2017/117528中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0060-59
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0061-60
及其醫藥學上可接受之鹽。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0061-61
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2017/049245中所描述之陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括下式中之一者的化合物：
Figure 110143961-A0202-12-0061-62
Figure 110143961-A0202-12-0061-63
Figure 110143961-A0202-12-0061-64
及
Figure 110143961-A0202-12-0062-65
及其醫藥學上可接受之鹽。對於此等四個式中之任一者，R4係獨立地選自-(CH2)nQ及-(CH2)nCHQR；Q係選自由以下組成之群：-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)及雜環；且n為1、2或3。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0062-67
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0062-68
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0062-69
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0063-70
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2017/173054及WO 2015/095340中所描述之陽離子脂質，其中之每一者以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0063-71
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0063-72
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0063-73
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具 有以下化合物結構之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0064-74
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如國際專利公開案WO 2012/170889中所描述之可離子化陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括下式之陽離子脂質：
Figure 110143961-A0202-12-0064-75
其中R1係選自由以下組成之群：咪唑、鈲、胺基、亞胺、烯胺、視情況經取代之烷基胺基(例如，烷基胺基，諸如二甲胺基)及吡啶基；其中R2係選自由以下兩個式中之一者組成之群：
Figure 110143961-A0202-12-0064-76
及
Figure 110143961-A0202-12-0064-77
且其中R3及R4各自獨立地選自由以下組成之群：視情況經取代之可變飽和或不飽和C6-C20烷基及視情況經取代之可變飽和或不飽和C6-C20醯基；且其中n為零或任何正整數(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或以上)。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質「HGT4001」：
Figure 110143961-A0202-12-0065-78
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質「HGT4002」(在本文中亦稱為「Guan-SS-Chol」)：
Figure 110143961-A0202-12-0065-79
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質「HGT4003」：
Figure 110143961-A0202-12-0065-80
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質「HGT4004」：
Figure 110143961-A0202-12-0065-81
及其醫藥學上可接受之鹽。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之陽離子脂質「HGT4005」：
Figure 110143961-A0202-12-0066-82
及其醫藥學上可接受之鹽。
其他適用於本發明之組合物及方法之陽離子脂質包括如於2018年5月16日申請之美國臨時專利申請案第62/672,194號中所描述之可裂解陽離子脂質，其以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括陽離子脂質，其為通式中之任一者或美國臨時專利申請案第62/672,194號中所描述之結構(1a)-(21a)及(1b)-(21b)及(22)-(237)中之任一者。在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有根據式(I')之結構的陽離子脂質，
Figure 110143961-A0202-12-0066-83
其中：
RX獨立地為-H、-L1-R1或-L5A-L5B-B'；
L1、L2及L3中之每一者獨立地為共價鍵、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-或-C(O)NRL-；
各L4A及L5A獨立地為-C(O)-、-C(O)O-或-C(O)NRL-；
各L4B及L5B獨立地為C1-C20伸烷基；C2-C20伸烯基；或C2-C20伸炔基；
各B及B'為NR4R5或5員至10員含氮雜芳基；
各R1、R2及R3獨立地為C6-C30烷基、C6-C30烯基或C6-C30炔基；
各R4及R5獨立地為氫、C1-C10烷基；C2-C10烯基；或C2-C10炔基；且
各RL獨立地為氫、C1-C20烷基、C2-C20烯基或C2-C20炔基。
在某些實施例中，本發明之組合物及方法包括具有以下化合物結構之來自62/672,194的陽離子脂質，即化合物(139)：
Figure 110143961-A0202-12-0067-84
在一些實施例中，本發明之組合物及方法包括陽離子脂質，N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(「DOTMA」)。(Feigner等人(《美國國家科學院院刊(Proc.Nat'l Acad.Sci.)》84,7413(1987)；美國專利第4,897,355號，其以引用之方式併入本文中)。適用於本發明之組合物及方法之其他陽離子脂質包括例如5-羧基精胺基甘胺酸雙十八烷基醯胺(「DOGS」)；2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲醯胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙胺鎓(「DOSPA」)(Behr等人，《美國國家科學院院刊》86,6982(1989)、美國專利第5,171,678號；美國專利第5,334,761號)；1,2-二油醯基-3-二甲基-丙烷(「DODAP」)；1,2-二油醯基-3-三甲基-丙烷(「DOTAP」)。
適用於本發明之組合物及方法的其他例示性陽離子脂質亦包括：1,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(「DSDMA」)；1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(「DODMA」)；1,2-二亞油氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(「DLinDMA」)；1,2-二次亞麻氧基-N,N-二甲基-3-胺基丙烷(「DLenDMA」)；N-二油基-N,N-二甲基氯化銨(「DODAC」)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化銨(「DDAB」)；N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羥基乙基溴化銨(「DMRIE」)；3-二甲基胺基-2-(膽甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(cis,cis-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(「CLinDMA」)；2-[5'-(膽甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧雜戊烯氧基)-3- 二甲基1-1-(cis,cis-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(「CpLinDMA」)；N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苯甲基胺(「DMOBA」)；1,2-N,N'-二油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(「DOcarbDAP」)；2,3-二亞油氧基-N,N-二甲基丙胺(「DLinDAP」)；1,2-N,N'-二亞油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(「DLincarbDAP」)；1,2-二亞油基胺甲醯基-3-二甲基胺基丙烷(「DLinCDAP」)；2,2-二亞油基-4-二甲基胺基甲基-[1,3]-二氧雜環戊烷(「DLin-K-DMA」)；2-((8-[(3P)-膽甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(「Octyl-CLinDMA」)；(2R)-2-((8-[(3β)-膽甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(「Octyl-CLinDMA(2R)」)；(2S)-2-((8-[(3P)-膽甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,fsl-二甲基3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(「Octyl-CLinDMA(2S)」)；2,2-二亞油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(「DLin-K-XTC2-DMA」)；及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧雜環戊烷-4-基)-N,N-二甲基乙胺(「DLin-KC2-DMA」)(參見WO 2010/042877，其以引用的方式併入本文中；Semple等人，《自然生物技術(Nature Biotech.)》28：172-176(2010))。(Heyes,J.等人，《控制釋放雜誌(J Controlled Release)》107：276-287(2005)；Morrissey,DV.等人，《自然生物技術(Nat.Biotechnol.)》23(8)：1003-1007(2005)；國際專利公開案WO 2005/121348)。在一些實施例中，陽離子脂質中之一或多者包含咪唑、二烷基胺基或鈲部分中之至少一者。在一些實施例中，適用於本發明之組合物及方法的一或多種陽離子脂質包括2,2-二亞油基-4-二甲基胺基乙基-[1,3]-二氧雜環戊烷(「XTC」)；(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氫-3aH-環戊[d][1,3]二氧雜環戊烯-5-胺(「ALNY-100」)及/或4,7,13-三(3-側氧基-3-(十一烷基胺基)丙基)-N1,N16-雙十一烷基-4,7,10,13-四氮雜十六烷-1,16-二醯胺(「NC98-5」)。
在一些實施例中，適用於本發明之組合物及方法之一或多種陽離 子脂質包括具有以下化合物結構之陽離子脂質，即TL1-04D-DMA：
Figure 110143961-A0202-12-0069-86
在一些實施例中，適用於本發明之組合物及方法之一或多種陽離子脂質包括具有以下化合物結構之陽離子脂質，即GL-TES-SA-DME-E18-2：
Figure 110143961-A0202-12-0069-87
在一些實施例中，適用於本發明之組合物及方法之一或多種陽離子脂質包括具有以下化合物結構之陽離子脂質，即SY-3-E14-DMAPr：
Figure 110143961-A0202-12-0069-88
在一些實施例中，適用於本發明之組合物及方法之一或多種陽離子脂質包括具有以下化合物結構之陽離子脂質，即TL1-01D-DMA：
Figure 110143961-A0202-12-0069-89
在一些實施例中，適用於本發明之組合物及方法之一或多種陽離子脂質包括具有以下化合物結構之陽離子脂質，即TL1-10D-DMA：
Figure 110143961-A0202-12-0070-90
在一些實施例中，適用於本發明之組合物及方法之一或多種陽離子脂質包括具有以下化合物結構之陽離子脂質，即GL-TES-SA-DMP-E18-2：
Figure 110143961-A0202-12-0070-91
在一些實施例中，適用於本發明之組合物及方法之一或多種陽離子脂質包括具有以下化合物結構之陽離子脂質，即HEP-E4-E10：
Figure 110143961-A0202-12-0070-92
在一些實施例中，適用於本發明之組合物及方法之一或多種陽離子脂質包括具有以下化合物結構之陽離子脂質，即HEP-E3-E10：
Figure 110143961-A0202-12-0070-94
在一些實施例中，本發明之組合物包括一或多種陽離子脂質，其構成以組合物(例如脂質奈米粒子)中之總脂質含量之重量計所量測之至少約 5%、10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%。在一些實施例中，本發明之組合物包括一或多種陽離子脂質，其構成以組合物(例如脂質奈米粒子)中之總脂質含量之莫耳%計所量測之至少約5%、10%、20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%。在一些實施例中，本發明之組合物包括一或多種陽離子脂質，其構成以組合物(例如脂質奈米粒子)中之總脂質含量之重量計所量測之約30-70%(例如，約30-65%、約30-60%、約30-55%、約30-50%、約30-45%、約30-40%、約35-50%、約35-45%或約35-40%)。在一些實施例中，本發明之組合物包括一或多種陽離子脂質，其構成以組合物(例如脂質奈米粒子)中之總脂質含量之莫耳%計所量測之約30-70%(例如，約30-65%、約30-60%、約30-55%、約30-50%、約30-45%、約30-40%、約35-50%、約35-45%或約35-40%)。
非陽離子/輔助脂質
在一些實施例中，所提供之脂質體含有一或多種非陽離子(「輔助」)脂質。如本文所用，片語「非陽離子脂質」係指任何中性、兩性離子或陰離子脂質。如本文所用，片語「陰離子脂質」係指在所選pH，諸如生理pH下攜帶淨負電荷之多種脂質物種中之任一者。非陽離子脂質包括但不限於二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯基-乙醇胺(DSPE)、磷脂醯絲胺酸、鞘脂、腦苷脂、神經節苷脂、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)或其混合物。
在一些實施例中，此類非陽離子脂質可單獨使用，但較佳與其他脂質(例如陽離子脂質)組合使用。在一些實施例中，非陽離子脂質可包含脂質體中存在之總脂質的約5%至約90%或約10%至約70%之莫耳比。在一些實施例中，非陽離子脂質為中性脂質，亦即，一種在調配及/或投與組合物之條件下不攜帶淨電荷之脂質。在一些實施例中，脂質體中之非陽離子脂質的百分比可大於5%、大於10%、大於20%、大於30%或大於40%。
基於膽固醇之脂質
在一些實施例中，所提供之脂質體包含一或多種基於膽固醇之脂質。例如，適合之基於膽固醇之陽離子脂質包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基羧醯胺基膽固醇)、1,4-雙(3-N-油基胺基-丙基))哌口井(Gao等人，《生物化學與生物物理研究通訊(Biochem.Biophys.Res.Comm.)》179,280(1991)；Wolf等人，《生物技術(BioTechniques)》23,139(1997)；美國專利第5,744,335號)或ICE。在一些實施例中，基於膽固醇之脂質可包含脂質體中存在之總脂質的約2%至約30%或約5%至約20%之莫耳比。在一些實施例中，脂質奈米粒子中之基於膽固醇之脂質的百分比可大於5%、大於10%、大於20%、大於30%或大於40%。
經PEG修飾之脂質
本發明亦涵蓋經聚乙二醇(PEG)修飾之磷脂及衍生脂質，諸如衍生神經醯胺(PEG-CER)，包括N-辛醯基-神經鞘胺醇-1-[丁二醯基(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神經醯胺)之用途，其單獨或較佳與包含轉移媒劑(例如脂質奈米粒子)之其他脂質調配物組合使用。所涵蓋之經PEG修飾之脂質包括但不限於長度為至多5kDa之聚乙二醇鏈，其與具有C6-C20長度之烷基鏈的脂質共價連接。添加此類組分可防止複雜聚集，且亦可提供用於增加循環壽命且增加將脂質-核酸組合物遞送至目標組織之方式(Klibanov等人，(1990)《FEBS 通訊(FEBS Letters)》,268(1)：235-237)或其可經選擇以快速交換出活體內調配物(參見美國專利第5,885,613號)。尤其適用的可交換脂質為具有較短醯基鏈(例如，C14或C18)之PEG-神經醯胺。本發明之經PEG修飾之磷脂及衍生脂質可包含脂質體轉移媒劑中存在之總脂質的約0%至約20%、約0.5%至約20%、約1%至約15%、約4%至約10%或約2%之莫耳比。
根據各種實施例，陽離子脂質、非陽離子脂質及/或包含脂質奈米粒子之經PEG修飾之脂質的選擇以及此類脂質相對於彼此之莫耳比係基於所選脂質之特徵、預期目標細胞之性質、待遞送之MCNA之特徵。其他考量包括例如烷基鏈之飽和度，以及所選脂質之尺寸、電荷、pH、pKa、致融性及毒性。因此，可相應地調整莫耳比。
聚合物
在一些實施例中，適合遞送媒劑使用聚合物作為載劑單獨或與包括本文所描述之各種脂質的其他載劑組合調配。因此，在一些實施例中，如本文所用之脂質體遞送媒劑亦涵蓋包含聚合物之奈米粒子。適合聚合物可包括例如聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己內酯、葡聚糖、白蛋白、明膠、海藻酸鹽、膠原蛋白、聚葡萄胺糖、環糊精、魚精蛋白、聚乙二醇化魚精蛋白、PLL、聚乙二醇化PLL及聚乙烯亞胺(PEI)。當PEI存在時，其可為分子量在10至40kDa範圍內，例如25kDa分支鏈PEI(Sigma#408727)之分支鏈PEI。
適合與本發明一起使用之脂質體
適用於本發明之脂質體可包括本文中以各種比率描述之陽離子脂質、非陽離子脂質、膽固醇脂質、經PEG修飾之脂質及/或聚合物中任一者之一或多者。作為非限制性實例，適合的脂質體調配物可包括選自以下之組合：cKK-E12、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K；C12-200、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K； HGT4003、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K；ICE、DOPE、膽固醇及DMG-PEG2K；或ICE、DOPE及DMG-PEG2K。
在各種實施例中，陽離子脂質(例如，cKK-E12、C12-200、ICE及/或HGT4003)構成按莫耳比計之脂質體的約30-60%(例如，約30-55%、約30-50%、約30-45%、約30-40%、約35-50%、約35-45%或約35-40%)。在一些實施例中，陽離子脂質(例如，cKK-E12、C12-200、ICE及/或HGT4003)之百分比以莫耳比計為或大於約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%或約60%的脂質體。
在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與基於膽固醇之脂質與經PEG修飾之脂質的比率可分別在約30-60：25-35：20-30：1-15之間。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與基於膽固醇之脂質與經PEG修飾之脂質的比率分別大致為40：30：20：10。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與基於膽固醇之脂質與經PEG修飾之脂質的比率分別大致為40：30：25：5。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與基於膽固醇之脂質與經PEG修飾之脂質的比率分別大致為40：32：25：3。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與基於膽固醇之脂質與經PEG修飾之脂質的比率大致為50：25：20：5。
在特定實施例中，與本發明一起使用之脂質體包含由陽離子脂質、非陽離子脂質(例如DOPE或DEPE)、經PEG修飾之脂質(例如DMG-PEG2K)及視情況選用之膽固醇組成之脂質組分。尤其適用於包括於此類脂質體中之陽離子脂質包括GL-TES-SA-DME-E18-2、TL1-01D-DMA、SY-3-E14-DMAPr、TL1-10D-DMA、HGT4002(在本文中亦稱為Guan-SS-Chol)、GL-TES-SA-DMP-E18-2、HEP-E4-E10、HEP-E3-E10及TL1-04D-DMA。已發現此等陽離子脂質尤其適用於經由霧化進行肺部遞送投與之脂質體。其中，HEP-E4-E10、HEP-E3-E10、GL-TES-SA-DME-E18-2、GL-TES-SA-DMP-E18-2、TL1-01D-DMA及TL1-04D- DMA尤其執行良好。
例示性脂質體包括以下中之一者：GL-TES-SA-DME-E18-2、TL1-01D-DMA、SY-3-E14-DMAPr、TL1-10D-DMA、GL-TES-SA-DMP-E18-2、HEP-E4-E10、HEP-E3-E10及TL1-04D-DMA作為陽離子脂質組分、DOPE作為非陽離子脂質組分、膽固醇作為輔助脂質組分及DMG-PEG2K作為經PEG修飾之脂質組分。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與膽固醇與經PEG修飾之脂質的莫耳比可分別在約30-60：25-35：20-30：1-15之間。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與膽固醇與經PEG修飾之脂質的莫耳比分別大致為40：30：20：10。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與膽固醇與經PEG修飾之脂質的莫耳比分別大致為40：30：25：5。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與膽固醇與經PEG修飾之脂質的莫耳比分別大致為40：32：25：3。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與膽固醇與經PEG修飾之脂質的莫耳比大致為50：25：20：5。
在一些實施例中，尤其適用於肺部遞送之脂質體之脂質組分由HGT4002(在本文中亦稱為Guan-SS-Chol)、DOPE及DMG-PEG2K組成。在一些實施例中，陽離子脂質與非陽離子脂質與經PEG修飾之脂質的莫耳比大致為60：35：5。
不同脂質組分之比率
在脂質奈米粒子包含三種且不超過三種不同脂質組分之實施例中，總脂質含量之比率(亦即，脂質組分(1)：脂質組分(2)：脂質組分(3)之比率)可表示為x：y：z，其中
(y+z)=100-x。
在一些實施例中，「x」、「y」及「z」中之每一者表示脂質之三種不同組分之莫耳百分比，且比率為莫耳比。
在一些實施例中，「x」、「y」及「z」中之每一者表示脂質之三種不同組分之重量百分比，且比率為重量比。
在一些實施例中，由變數「x」表示之脂質組分(1)為基於固醇之陽離子脂質。
在一些實施例中，由變數「y」表示之脂質組分(2)為輔助脂質。
在一些實施例中，由變數「z」表示之脂質組分(3)為PEG脂質。
在一些實施例中，表示脂質組分(1)(例如，基於固醇之陽離子脂質)之莫耳百分比的變數「x」為至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%或約95%。
在一些實施例中，表示脂質組分(1)(例如，基於固醇之陽離子脂質)之莫耳百分比的變數「x」為不超過約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約40%、約30%、約20%或約10%。在實施例中，可變「x」不超過約65%、約60%、約55%、約50%、約40%。
在一些實施例中，表示脂質組分(1)(例如，基於固醇之陽離子脂質)之莫耳百分比的變數「x」為：至少約50%但小於約95%；至少約50%但小於約90%；至少約50%但小於約85%；至少約50%但小於約80%；至少約50%但小於約75%；至少約50%但小於約70%；至少約50%但小於約65%；或至少約50%但小於約60%。在實施例中，變數「x」為至少約50%但小於約70%；至少約50%但小於約65%；或至少約50%但小於約60%。
在一些實施例中，表示脂質組分(1)(例如，基於固醇之陽離子脂質)之重量百分比的變數「x」為至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90% 或約95%。
在一些實施例中，表示脂質組分(1)(例如，基於固醇之陽離子脂質)之重量百分比的變數「x」為不超過約95%、約90%、約85%、約80%、約75%、約70%、約65%、約60%、約55%、約50%、約40%、約30%、約20%或約10%。在實施例中，可變「x」不超過約65%、約60%、約55%、約50%、約40%。
在一些實施例中，表示脂質組分(1)(例如，基於固醇之陽離子脂質)之重量百分比的變數「x」為：至少約50%但小於約95%；至少約50%但小於約90%；至少約50%但小於約85%；至少約50%但小於約80%；至少約50%但小於約75%；至少約50%但小於約70%；至少約50%但小於約65%；或至少約50%但小於約60%。在實施例中，變數「x」為至少約50%但小於約70%；至少約50%但小於約65%；或至少約50%但小於約60%。
在一些實施例中，表示脂質組分(3)(例如，PEG脂質)之莫耳百分比的變數「z」為不超過約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%或25%。在一些實施例中，表示脂質組分(3)(例如，PEG脂質)之莫耳百分比的變數「z」為約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%。在實施例中，表示脂質組分(3)(例如，PEG脂質)之莫耳百分比的變數「z」為約1%至約10%、約2%至約10%、約3%至約10%、約4%至約10%、約1%至約7.5%、約2.5%至約10%、約2.5%至約7.5%、約2.5%至約5%、約5%至約7.5%或約5%至約10%。
在一些實施例中，表示脂質組分(3)(例如，PEG脂質)之莫耳百分比的變數「z」不超過約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%或25%。在一些實施例中，表示脂質組分(3)(例如，PEG脂質)之重量百分比的變數「z」為約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%。 在實施例中，表示脂質組分(3)(例如，PEG脂質)之重量百分比的變數「z」為約1%至約10%、約2%至約10%、約3%至約10%、約4%至約10%、約1%至約7.5%、約2.5%至約10%、約2.5%至約7.5%、約2.5%至約5%、約5%至約7.5%或約5%至約10%。
對於具有三種且僅三種不同脂質組分之組合物，變數「x」、「y」及「z」可呈任何組合，只要三種變數之總和為總脂質含量的100%。
形成囊封mRNA之脂質體
用於本發明之組合物中之脂質體轉移媒劑可藉由此項技術中當前已知之各種技術製備。用於所提供組合物之脂質體可藉由當前此項技術中已知之各種技術製備。舉例而言，多層囊泡(MLV)可根據習知技術製備，諸如藉由將所選脂質溶解於適當溶劑中，且隨後蒸發溶劑以在器皿內部留下薄膜，或藉由噴霧乾燥，從而將該脂質沈積於適合容器或器皿之內壁。接著可藉由渦流運動將水相添加至器皿中，從而引起MLV形成。可隨後藉由均質化、音波處理或擠壓多層囊泡來形成單層囊泡(ULV)。另外，單層囊泡可藉由清潔劑移除技術形成。
在某些實施例中，所提供之組合物包含脂質體，其中mRNA締合在脂質體之表面上且囊封於同一脂質體內。例如，在製備本發明之組合物期間，陽離子脂質體可經由靜電交互作用與mRNA締合。例如，在製備本發明之組合物期間，陽離子脂質體可經由靜電交互作用與mRNA締合。
在一些實施例中，本發明之組合物及方法包含囊封於脂質體中之mRNA。在一些實施例中，一或多種mRNA物種可囊封於相同脂質體中。在一些實施例中，一或多種mRNA物種可囊封於不同脂質體中。在一些實施例中，mRNA囊封於一或多種脂質體中，該等脂質體在其脂質組成、脂質組分之莫耳比、尺寸、電荷(ζ電位)、靶向配位體及/或其組合方面有所不同。在一些實施例中，一或多種脂質體可具有基於固醇之陽離子脂質、中性脂質、經PEG修飾 之脂質及/或其組合之不同的組成。在一些實施例中，一或多種脂質體可具有用於產生脂質體之基於膽固醇之陽離子脂質、中性脂質及經PEG修飾之脂質的不同莫耳比。
將所需mRNA併入脂質體中之過程通常稱為「裝載」。例示性方法描述於Lasic等人，《FEBS通訊(FEBS Lett.)》,312：255-258,1992中，其以引用的方式併入本文中。脂質體併入之核酸可完全或部分位於脂質體之內部空間中、脂質體之雙層膜內或與脂質體膜之外部表面締合。將核酸併入脂質體中在本文中亦稱為「囊封」，其中核酸完全容納於脂質體之內部空間內。將mRNA併入至轉移媒劑(諸如脂質體)中之目的通常係為了保護核酸免受環境影響，該環境可能含有降解核酸之酶或化學物質及/或引起核酸快速分泌之系統或受體。因此，在一些實施例中，適合的遞送媒劑能夠增強其中所含之mRNA之穩定性及/或有助於將mRNA遞送至目標細胞或組織。
根據本發明之適合的脂質體可以各種尺寸製得。在一些實施例中，所提供之脂質體可製成小於先前已知的mRNA囊封脂質體。在一些實施例中，脂質體尺寸的減小與更高效的mRNA遞送相關。對適當脂質體尺寸的選擇可考慮目標細胞或組織的部位，且在一定程度上考慮脂質體的應用。
在一些實施例中，選擇適當尺寸之脂質體以促進由mRNA編碼之抗體的全身性分佈。在一些實施例中，可能需要限制mRNA轉染至某些細胞或組織中。例如，為靶向肝細胞，脂質體可經尺寸設定以使得其尺寸小於肝臟中內皮層襯裡肝竇狀隙之窗孔；在此類情況下，脂質體可容易穿透此類內皮窗孔以到達目標肝細胞。
替代地或另外，脂質體可經尺寸設定以使得脂質體之尺寸具有足夠直徑以限制或明確地避免分佈至某些細胞或組織中。
此項技術中已知之多種替代方法可用於調整脂質體群體之尺寸。 一種此類調整尺寸的方法描述於美國專利第4,737,323號，其以引用的方式併入本文中。藉由浴液或探針音波處理對脂質體懸浮液進行音波處理會產生尺寸逐漸縮小至直徑小於約0.05微米的小型ULV。均質化為依賴於剪切能量將大型脂質體片段化成較小脂質體的另一種方法。在典型均質化程序中，MLV經由標準乳液均質器再循環，直至觀測到所選脂質體尺寸，典型地在約0.1與0.5微米之間。脂質體之尺寸可藉由準電光散射(QELS)測定，如描述於Bloomfield,《生物物理學及生物工程年度評論(Ann.Rev.Biophys.Bioeng.)》,10：421-150(1981)中，其以引用之方式併入本文中。平均脂質體直徑可藉由對所形成之脂質體進行音波處理來減小。間歇性音波處理循環可與QELS評估交替進行以導引高效脂質體合成。
組合物之治療用途
在一個態樣中，本發明尤其提供適用於治療目的之囊封mRNA的LNP調配物。例如，在一些實施例中，經LNP囊封之mRNA編碼個體缺乏之蛋白質。例如，mRNA可編碼CFTR用於治療膀胱炎纖維化。編碼CFTR之適合mRNA描述於例如WO 2020/106946及PCT/US20/44158中，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。作為另一實例，mRNA可編碼OTC以用於治療鳥胺酸胺基甲醯轉移酶缺陷症，描述於例如WO 2017/218524中，其內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，經NLP囊封之mRNA編碼蛋白質，該蛋白質編碼疫苗抗原(諸如SARS-CoV-2抗原)。此類SARS-CoV-2抗原描述於U.S.63/021,319中，其內容以引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，mRNA經密碼子最佳化。各種密碼子最佳化方法為此項技術中已知的。
基因療法
在一些實施例中，本文所描述之LNP調配物適用於包含經密碼子最佳化之核酸之醫藥組合物，該核酸編碼用於治療有需要之個體的蛋白質。在一些實施例中，將包含本文所描述之rAAV載體的醫藥組合物用於治療有需要個體。含有本發明之rAAV載體或粒子的醫藥組合物含有醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。適合醫藥載劑之實例在此項技術中為吾人所熟知且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑(諸如油狀/水乳劑)、各種類型的潤濕劑、無菌溶液及類似載劑。醫藥組合物可呈凍乾形式。此類載劑可藉由習知方法調配且以治療有效量向個體投與。
經由適合途徑向有需要之個體投與rAAV載體。在一些實施例中，藉由靜脈內、腹膜內、皮下或皮內途徑來投與rAAV載體。在一個實施例中，rAAV載體係靜脈內投與。在實施例中，皮內投與包含藉由使用「基因槍(gene gun/biolistic)」粒子遞送系統投與。在一些實施例中，rAAV載體經由非病毒脂質奈米粒子投與。例如，包含rAAV載體之組合物可包含一或多種稀釋劑、緩衝液、脂質體、脂質、脂質錯合物。在一些實施例中，rAAV載體包含於微球體或奈米粒子(諸如脂質奈米粒子或無機奈米粒子)內。
在一些實施例中，rAAV為假型的。假型rAAV為包含AAV衣殼蛋白及rAAV基因體之任何組合之感染性病毒。假型rAAV可用於改變rAAV之組織或細胞特異性，且可單獨使用或與非假型rAAV結合使用來將一或多個基因轉移至細胞，例如哺乳動物細胞。例如，假型rAAV可在向哺乳動物投與非假型rAAV之後使用，其已發展針對非假型rAAV之免疫反應。來自任何AAV血清型之衣殼蛋白質可與rAAV基因體一起使用，rAAV基因體源自或可自不同血清型之野生型AAV基因體獲得，或其為亦即由來自兩種或更多種不同血清型之AAV DNA形成的嵌合基因體，例如，具有2個ITR嵌合基因體，各ITR來自不同血清型或嵌合ITR。使用嵌合基因體，諸如包含來自兩種AAV血清型或嵌合ITR 之ITR的彼等嵌合基因體，可導致定向重組，其可進一步提高轉錄活性分子間多聯體之產生。因此，本發明之rAAV載體中之5'及3'ITR可同源，亦即來自相同血清型；異源，亦即來自不同血清型；或嵌合，亦即具有來自超過一種AAV血清型之ITR序列的ITR。
在一些實施例中，rAAV載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11載體。在一些實施例中，rAAV載體為AAV1。在一些實施例中，rAAV載體為AAV2。在一些實施例中，rAAV載體為AAV3。在一些實施例中，rAAV載體為AAV4。在一些實施例中，rAAV載體為AAV5。在一些實施例中，rAAV載體為AAV6。在一些實施例中，rAAV載體為AAV7。在一些實施例中，rAAV載體為AAV8。在一些實施例中，rAAV載體為AAV9。在一些實施例中，rAAV載體為AAV10。在一些實施例中，rAAV載體為AAV11。在一些實施例中，rAAV載體經序列最佳化。在一些實施例中，rAAV衣殼經修飾。例如，在一些實施例中，rAAV8衣殼經修飾。
實例
儘管已根據某些實施例具體描述本發明所描述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於說明本發明之化合物且不意欲限制該等化合物。
實例1. 糖、緩衝液比率及pH對LNP穩定性之影響
進行分析，以評估LNP在不同量之糖(此處為海藻糖)、不同緩衝強度及/或不同pH水準的存在下之穩定性。總體而言，來自此等研究之資料展示在較低pH水準下，需要較高最小緩衝強度來維持穩定性。此外，結果亦顯示，當在調配物中將糖(海藻糖)維持在恆定百分比時，當調配物之pH上升時，維持LNP穩定性之所需最小緩衝強度降低。
圖1A為一圖示，其指示在pH為7.5時，增加LNP調配物中之糖(海藻糖)百分比，引起LNP調配物中所需之最小緩衝強度同時增加。圖1B為 一圖示，其顯示當海藻糖以恆定百分比(亦即2.7%)維持時，隨著pH水準增加，最小緩衝強度降低。
此等資料顯示，在某些pH值下需要較低的糖/緩衝液比率。此外，資料亦顯示LNP調配物中之pH愈低，在某些糖濃度下穩定LNP所需之緩衝強度愈高。例如，在糖濃度維持穩定時，pH值愈低，維持LNP穩定性所需之緩衝強度愈高。
實例2. 降低緩衝強度產生在低於脂質pKa下之更高穩定性
進行研究以評估脂質pKa依賴性行為。對於此等研究，分析LNP調配物，其調配成包含2.7%海藻糖且使用檸檬酸鹽緩衝液將pH調整為4.5。此等分析顯示，降低緩衝強度會使LNP在低於脂質pKa下之穩定性更高。特定言之，觀測到LNP穩定性隨著所測試之緩衝強度，亦即1、10、20、50、75至100mM增加而降低。此在圖2中以圖形格式加以說明。
此等資料指示緩衝強度在稀釋樣品後更好地穩定LNP調配物。例如，在以下情形中目測觀測穩定性：1)2.7%海藻糖+100mM Tris pH 7.5(觀測溶液-透明)；2)2.7%海藻糖+20mM Tris pH 7.5+100mM NaCl(觀測溶液-崩潰/渾濁)；3)2.7%海藻糖+16mM Tris pH 7.5+220mM(觀測溶液-澄清)。
總體而言，自此等資料中得出以下結論：需要維持較高離子強度以防止LNP聚集，及由此產生mRNA穩定性。推斷此可以各種方式達成，例如藉由1)具有高緩衝強度(例如100mM或更大)；2)組合低緩衝強度(例如15-20mM)與高鹽濃度(例如200mM或更大)；或組合中等緩衝強度(例如40-50mM)與中等鹽濃度(例如50-100mM)。
實例3. 效力與穩定性
先前已觀察到，高效力LNP與較高量之LNP聚集及後續mRNA降解相關。研究本文所描述之LNP調配物，以確定此等調配物是否對獲得抗聚 集及抗後續mRNA降解之經LNP囊封之mRNA的能力造成任何影響。
在6小時及25小時測試囊封人類紅血球生成素(EPO)mRNA之各種LNP調配物的穩定性。先前已發現經測試之LNP調配物易於聚集。如圖3A及3B中所示，使用本文所描述之LNP調配物，可允許成功調配對聚集具有抗性的所需高效力LNP。
所測試之不同LNP調配物描繪於圖3A及圖3B中。圖3B之資料係來自活體內研究，在該等研究中，在小鼠給藥6小時或24小時之後，分析所描述之LNP調配物。資料顯示當使用高效力脂質，包括例如具有高濃度DOPE之類脂質時，人類EPO蛋白質在6小時及24小時之時的表現。
圖4A顯示在LNP調配物中測試之緩衝液及鹽濃度之各種組合及與各種LNP調配物相關之所得稀釋後穩定性。資料與實例2中呈現之結果一致，亦即需要較高離子強度以防止LNP聚集及由此產生mRNA穩定性。詳言之，此等資料證實，將中等緩衝強度(例如，40-50mM)與中等鹽濃度(例如，50-125mM)組合產生在稀釋後穩定的LNP調配物。
圖4B顯示一表，其概述稀釋後LNP調配物之穩定性。對於此等分析，LNP僅相對於Tris或磷酸鹽緩衝液濃度而變化。此研究中之LNP均於Tris或磷酸鹽緩衝液及2.7%海藻糖中調配。如資料所示，在20mM緩衝強度下達到調配物pH，然而此等LNP調配物不穩定。LNP調配物在緩衝液濃度達100mM或更大時穩定。資料與實例2中呈現之結果一致，亦即需要較高離子強度以防止LNP聚集及由此產生mRNA穩定性。
實例4. 糖與緩衝液之比率對囊封效率及脂質奈米粒子之尺寸的影響
進行研究以評定糖與緩衝液之比率對調配物在-20℃下之穩定性的影響。對於此等研究，分析LNP調配物，其以0.9mg/ml至1.6mg/ml之間的起始mRNA濃度調配且包含0.19與0.47之間的例示性海藻糖與PBS比率(表 1)。在4℃及25℃下，在LNP調配物之不同海藻糖與PBS比率下評估囊封效率(圖5A及圖5B)及脂質奈米粒子之尺寸(圖6A及圖6B)。此等分析顯示，LNP調配物之較低海藻糖與PBS的比率有利於防止囊封減少及LNP尺寸增加，由此產生LNP調配物之較高穩定性。整體而言，在低糖與緩衝液比率下，LNP調配物穩定性較大。此以圖形格式繪示，顯示糖與緩衝液比率對囊封效率(圖5A及圖5B)及LNP尺寸(圖6A及6B)之影響。
表1. 不同海藻糖與PBS比率之LNP調配物
Figure 110143961-A0202-12-0085-95
在各個例示性時間點(0小時、1小時、3小時、6小時及24小時)評估囊封效率且以圖形方式描繪在4℃(圖5A)及25℃(圖5B)下所觀測到的囊封效率百分比。結果顯示，在具有增加的海藻糖與PBS比率之LNP調配物中，觀測到囊封減少，指示穩定性降低。結果在4℃時相當顯著，但在25℃時亦觀測到類似趨勢。
在各個例示性時間點(0小時、1小時、3小時、6小時及24小時)量測LNP尺寸，且以圖形方式描繪在4℃(圖6A)及25℃(圖6B)下所觀測到的LNP尺寸(以奈米計)。結果顯示，在具有增加的海藻糖與PBS比率之LNP調配物中，觀測到囊封減少，指示穩定性降低。結果在25℃時相當顯著，但在4℃時亦觀測到類似趨勢。
總體而言，此等研究之結果表明，對應於LNP之較高穩定性，低海藻糖與PBS比率有利於囊封增加以及LNP尺寸降低。
所有公開案、專利申請案、專利及本文所提及之其他參考文獻均以全文引用之方式併入。另外，材料、方法及實施例僅為例示性的且不意欲為限制性的。除非另外定義，否則本文所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技藝人員通常所理解之含義相同之含義。儘管與本文所描述之方法及材料類似或者等效之方法及材料可用於實踐或者測試本發明，但本文描述合適方法及材料。
等效物
熟悉本技藝者將認識到或者能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明特定實施例之許多等效方案。本發明之範疇並不意欲限於以上描述，而是如以下申請專利範圍中所闡述：
<110> 美商崔斯雷生物公司(TRANSLATE BIO,INC.)
<120> 穩定液體脂質奈米粒子調配物
<130> MRT-2200WO
<140> TW 110143961
<141> 2021-11-25
<150> 63/118,243
<151> 2020-11-25
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 874
<212> PRT
<213> 噬菌體
<400> 1
Figure 110143961-A0202-12-0087-96
Figure 110143961-A0202-12-0088-97
Figure 110143961-A0202-12-0089-98
Figure 110143961-A0202-12-0090-99

Claims (47)

  1. 一種囊封編碼肽或多肽之mRNA的液體脂質奈米粒子(LNP)調配物，其對聚集及mRNA降解具有抗性，該LNP調配物包含：
    a.一或多個LNP，其具有包含陽離子脂質、非陽離子脂質、經PEG修飾之脂質及視情況選用之膽固醇或由其組成的脂質組分；
    b.囊封於該一或多個脂質奈米粒子內且編碼肽或多肽之mRNA；
    c.糖或糖醇；
    d. LNP調配物pH為6.0至8.0；
    e. pH緩衝液，其以最小緩衝離子強度提供該LNP調配物pH；
    f.視情況選用之一或多種額外試劑，其為該LNP調配物提供離子強度；
    其中來自(e.)之pH緩衝液及視情況選用之一或多種來自(f.)之額外試劑的總濃度提供比該最小緩衝離子強度大至少兩倍的該LNP調配物之離子強度。
  2. 如請求項1之LNP調配物，其中在進行三輪的-20℃下冷凍及再解凍後，與在該LNP調配物中僅具有該最小緩衝離子強度而非比該最小緩衝離子強度大至少兩倍之離子強度的相同LNP調配物相比，該LNP調配物展現(i)較少聚集，(ii)所囊封mRNA之較少降解，或(iii)(i)及(ii)兩者。
  3. 如請求項1之LNP調配物，其中該非陽離子脂質係選自1,2-二芥醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二棕櫚醯基磷脂醯甘油(DPPG)、二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)、棕櫚醯油醯基磷脂醯膽鹼(POPC)、棕櫚醯油醯基-磷脂醯乙醇胺(POPE)、二油醯基-磷脂醯乙醇胺4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)-環己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻醯基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂醯基-磷脂醯基-乙醇胺(DSPE)、16-O-單甲基PE、16-O-二甲基PE、18- 1-反式PE或1-硬脂醯基-2-油醯基-磷脂醯乙醇胺(SOPE)。
  4. 如請求項3之LNP調配物，其中該非陽離子脂質為二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)。
  5. 如請求項4之LNP調配物，其中該DOPE之脂質莫耳比為10%或更大，例如10%至30%。
  6. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該陽離子脂質為類脂質，視情況其中該類脂質之脂質莫耳比為40%至60%，例如40%至50%。
  7. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該mRNA編碼個體中缺乏之蛋白質。
  8. 如請求項1至6中任一項之LNP調配物，其中該mRNA編碼疫苗抗原。
  9. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該糖或糖醇係選自由以下組成之群：右旋糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、葡聚糖及菊糖。
  10. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該糖為雙醣。
  11. 如請求項10之LNP調配物，其中該雙醣之濃度為約1%至20%。
  12. 如請求項11之LNP調配物，其中該雙醣之濃度為約2.5%至3.0%。
  13. 如請求項12之LNP調配物，其中該雙醣與緩衝液之比率為0.2至0.5之間。
  14. 如請求項10至13中任一項之LNP調配物，其中該雙醣為海藻糖。
  15. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該pH在約6.0與約8.0，例如6.0至7.0、6.5至7.5或7.0至8.0之間。
  16. 如請求項1之LNP調配物，其中該pH為7.4。
  17. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該pH緩衝液之pKa在6.0與8.2之間。
  18. 如請求項17之LNP調配物，其中該緩衝液係選自由以下組成之群：磷酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、咪唑緩衝液、組胺酸緩衝液及Good's緩衝液。
  19. 如請求項18之LPN調配物，其中該Good's緩衝液為Tris緩衝液或HEPES緩衝液。
  20. 如請求項18或19之LPN調配物，其中該pH緩衝液為磷酸鹽緩衝液(例如，檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液)、Tris緩衝液或咪唑緩衝液。
  21. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該最小緩衝離子強度為至少75mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM或至少200mM。
  22. 如請求項21之LNP調配物，其中該最小緩衝離子強度為約75mM至200mM、75mM至150mM、75mM至100mM或100mM至200mM。
  23. 如請求項22之LNP調配物，其中該最小緩衝離子強度在100mM至200mM之間。
  24. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中提供離子強度之該一或多種試劑包含鹽或糖。
  25. 如請求項24之LNP調配物，其中該鹽係選自由以下組成之群：NaCl、KCl及CaCl2，且其中該糖為海藻糖。
  26. 如請求項1至22中任一項之LNP調配物，其中提供離子強度之該一或多種額外試劑的總濃度在約50至300mM、50至150mM或75至125mM之間。
  27. 如請求項26之LNP調配物，其中pH緩衝液之總濃度在約15至250mM、30至150mM或40至50mM之間。
  28. 如請求項26之LNP調配物，其中該pH緩衝液及提供離子強度之該一或多種額外試劑之總濃度係選自約40mM Tris緩衝液及約50mM至200mM NaCl、約50mM Tris緩衝液及約50mM至200mM NaCl、約100mM Tris緩衝液及約50mM至200mM NaCl、約40mM咪唑及約50mM至200mM NaCl、約50mM咪唑及50mM至200mM NaCl、約100mM咪唑及50mM至200mM NaCl、約40mM磷酸鹽及50mM至200mM NaCl、約50mM磷酸鹽及50mM至200mM NaCl、約100mM磷酸鹽及50mM至200mM NaCl。
  29. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該LNP調配物之該離子強度比該最小緩衝離子強度大至少2.25倍、大至少2.5倍、大至少2.75倍、大至少3倍、大至少3.5倍、大至少4倍、大至少4.5倍、大至少5倍。
  30. 如請求項1至28中任一項之LNP調配物，其中該LNP調配物之該離子強度小於20倍、小於19倍、小於18倍、小於17倍、小於16倍、小於15倍、小於14倍、小於13倍、小於12倍、小於11倍、小於10倍、小於9倍、小於8倍、小於7倍、小於6倍、小於5倍、小於4倍之該最小緩衝離子強度。
  31. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該LNP調配物之該離子強度比該最小緩衝離子強度大至少兩倍且比該最小緩衝離子強度大小於20倍，且其中該LNP調配物之該離子強度在約150mM至750mM、150mM至500mM、150mM至400mM、150mM至300mM、150mM及200mM之間。
  32. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該LNP調配物之該離子強度比該最小緩衝離子強度大至少兩倍且比該最小緩衝離子強度大小 於20倍，且其中該LNP調配物之該離子強度為或大於150mM。
  33. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中較少聚集藉由濁度分析來測定。
  34. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該所囊封mRNA之較少降解藉由濁度分析來測定。
  35. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中在進行超過三輪的-20℃下冷凍及再解凍後，與在該LNP調配物中僅具有該最小緩衝離子強度而非比該最小緩衝離子強度大至少兩倍之離子強度的相同LNP調配物相比，該LNP調配物展現(i)較少聚集，(ii)所囊封mRNA之較少降解，或(iii)(i)及(ii)兩者。
  36. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該等LNP之直徑小於約100nm。
  37. 如請求項32之LNP調配物，其中該等LNP之直徑在約70nm至90nm之間。
  38. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該脂質組分包含DMG-PEG-2000、cKK-E10、膽固醇及DOPE或由其組成。
  39. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中N/P比在約3至5之間。
  40. 如請求項39之LNP調配物，其中N/P比為約4。
  41. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該mRNA之最終濃度在約0.05mg/mL與1.0mg/mL之間。
  42. 如請求項41之LNP調配物，其中該mRNA之濃度在約0.2mg/mL與0.5mg/mL之間。
  43. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該等LNP在-20℃ 下穩定至少3個月、6個月、12個月或超過12個月。
  44. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中該LNP調配物在稀釋後穩定。
  45. 如前述請求項中任一項之LNP調配物，其中與不包含濃度為300mM或低於300mM且pH在約7.0與7.5之間的緩衝液之調配物相比，該調配物之皮下或肌肉內遞送伴隨有減輕之疼痛。
  46. 如請求項45之LNP調配物，其中該減輕之疼痛藉由10-cm視覺類比量表(VAS)或六項口頭評定量表(VRS)評估。
  47. 一種減少LNP降解及/或聚集之方法，該方法包含將該LNP儲存於如前述請求項中任一項之調配物中。
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