CN116723829A

CN116723829A - 稳定的液体脂质纳米颗粒配制品

Info

Publication number: CN116723829A
Application number: CN202180091146.XA
Authority: CN
Inventors: S·卡尔维; A·萨罗德; N·巴尔加斯蒙托亚; P·帕特尔; F·德罗萨
Original assignee: Translation Bio Co
Current assignee: Translation Bio Co
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2021-11-24
Publication date: 2023-09-08
Also published as: IL303165A; MX2023006133A; TW202237147A; US20220287966A1; WO2022115547A1; EP4251129A1; AU2021386737A1; CA3199895A1; KR20230113580A; JP2023550644A

Abstract

本发明尤其提供了一种包封编码肽或多肽的mRNA的液体脂质纳米颗粒(LNP)配制品，所述液体脂质纳米颗粒(LNP)配制品在‑20℃下冷冻并再解冻多轮后对聚集和mRNA降解具有抗性。

Description

稳定的液体脂质纳米颗粒配制品

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年11月25日提交的美国临时申请号63/118,243的优先权和权益，将所述临时申请的内容通过引用以其整体特此并入。

背景技术

基于核酸的技术对于各种治疗应用(包括但不限于信使RNA疗法)越来越重要。递送核酸的努力包括产生配制成保护核酸在体内递送时免于被降解的组合物。核酸的一类递送媒介物是脂质纳米颗粒。成功使用脂质纳米颗粒作为递送媒介物需要考虑的重要参数包括脂质纳米颗粒形成、脂质组分的物理特性、核酸包封效率、体内核酸释放潜力和脂质纳米颗粒毒性。

产生对冷冻/解冻循环具有抗性的稳定脂质纳米颗粒仍然是本领域的一个挑战。

发明内容

本发明尤其提供了一种包封编码肽或多肽的mRNA的液体脂质纳米颗粒(LNP)配制品，所述液体脂质纳米颗粒(LNP)配制品在-20℃下冷冻并再解冻多轮后对聚集和/或mRNA降解具有抗性。诸位发明人惊奇地发现，具有高离子强度的LNP配制品在冷冻和解冻多轮后防止LNP的聚集和/或mRNA降解。诸位发明人惊奇地发现，通过在LNP配制品中使用较高的缓冲液强度或高盐浓度可以获得稳定并且对聚集和/或mRNA降解具有抗性的高离子强度LNP配制品。

在一些方面，提供了一种包封编码肽或多肽的mRNA的对聚集和mRNA降解具有抗性的液体脂质纳米颗粒(LNP)配制品，所述LNP配制品包含：a.具有脂质组分的一个或多个LNP，所述脂质组分包含阳离子脂质、非阳离子脂质、经PEG修饰的脂质和任选的胆固醇或由其组成；b.包封在所述一个或多个脂质纳米颗粒内并且编码肽或多肽的mRNA；c.糖或糖醇；d.6.0至8.0的LNP配制品pH；e.在最小缓冲离子强度下提供所述LNP配制品pH的pH缓冲液；f.为所述LNP配制品提供离子强度的任选的一种或多种另外的试剂；其中来自(e.)的pH缓冲液和来自(f.)的任选的一种或多种另外的试剂的总浓度为所述LNP配制品提供至少两倍于所述最小缓冲离子强度的离子强度；其中在-20℃下冷冻并再解冻三轮后，与在所述LNP配制品中仅具有所述最小缓冲离子强度而不是至少两倍于所述最小缓冲离子强度的离子强度的相同LNP配制品相比，所述LNP配制品展现出(i)更少的聚集、(ii)经包封的mRNA的更少的降解、或(iii)(i)和(ii)两者。

在一些实施方案中，所述LNP配制品包含一种或多种冷冻保护剂。所述冷冻保护剂可以是渗透性的或非渗透性的。例如，在一些实施方案中，所述渗透性冷冻保护剂包括甘油、乙二醇、三乙二醇、丙二醇或四乙二醇。因此，在一些实施方案中，所述渗透性冷冻保护剂包括甘油。在一些实施方案中，所述渗透性冷冻保护剂包括乙二醇。在一些实施方案中，所述渗透性冷冻保护剂包括三乙二醇。在一些实施方案中，所述渗透性冷冻保护剂包括丙二醇。在一些实施方案中，所述渗透性冷冻保护剂包括四乙二醇。

在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂选自糖和/或聚合物。例如，在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂选自以下糖中的一种或多种：右旋糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、右旋糖酐或菊粉。因此，在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂包括右旋糖。在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂包括山梨糖醇。在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂包括海藻糖。在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖。在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂包括棉子糖。在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂包括右旋糖酐。在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂包括菊粉。

在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂选自以下聚合物中的一种或多种：PVP、PVA、泊洛沙姆或PEG。因此，在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂选自PVP。在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂选自泊洛沙姆。在一些实施方案中，所述非渗透性冷冻保护剂选自PEG。

在一些实施方案中，提供了一种制备mRNA在LNP中的稳定的液体溶液的方法。例如，在一些实施方案中，通过体外转录(IVT)产生包封在所述LNP中的所述mRNA。在一些实施方案中，使用合适的RNA聚合酶(如SP6 RNA聚合酶)合成所述mRNA。因此，在一些实施方案中，使用SP6 RNA聚合酶合成所述mRNA。所述LNP包含例如阳离子脂质、非阳离子脂质、经PEG修饰的脂质和任选的胆固醇。

在一些实施方案中，所述非阳离子脂质选自1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE或1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。

在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的摩尔比大于10％。例如，在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的脂质摩尔比为11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的脂质摩尔比为约15％。在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的脂质摩尔比为约20％。在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的脂质摩尔比为约25％。在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的脂质摩尔比为约30％。在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的脂质摩尔比为约35％。在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的脂质摩尔比为约40％。在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的脂质摩尔比为约45％。在一些实施方案中，所述非阳离子脂质的脂质摩尔比为约50％。

在一些实施方案中，所述非阳离子脂质是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比大于10％。例如，在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比为11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比为约15％。在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比为约20％。在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比为约25％。在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比为约30％。在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比为约35％。在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比为约40％。在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比为约45％。在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比为约50％。在一些实施方案中，所述DOPE的脂质摩尔比在约10％与30％之间。

在一些实施方案中，所述阳离子脂质是类脂质(lipidoid)。在一些实施方案中，所述类脂质的摩尔比为约例如40％-60％。在一些实施方案中，所述类脂质的摩尔比为约50％-60％。在一些实施方案中，所述类脂质的摩尔比为约40％。在一些实施方案中，所述类脂质的摩尔比为约50％。在一些实施方案中，所述类脂质的摩尔比为约60％。

在一些实施方案中，所述mRNA编码受试者体内缺乏的蛋白质。例如，在一些实施方案中，受试者体内缺乏的所述蛋白质是CFTR。

在一些实施方案中，所述mRNA编码疫苗抗原。例如，在一些实施方案中，所述疫苗抗原是SARS-CoV-2抗原。

在一些实施方案中，所述糖是二糖。在一些实施方案中，所述二糖是海藻糖。

在一些实施方案中，所述糖或糖醇选自右旋糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、右旋糖酐和菊粉。因此，在一些实施方案中，所述糖或糖醇是右旋糖。在一些实施方案中，所述糖或糖醇是山梨糖醇。在一些实施方案中，所述糖或糖醇是海藻糖。在一些实施方案中，所述糖或糖醇是蔗糖。在一些实施方案中，所述糖或糖醇是棉子糖。在一些实施方案中，所述糖或糖醇是右旋糖酐。在一些实施方案中，所述糖或糖醇是菊粉。

在一些实施方案中，所述海藻糖的浓度在约1％-20％之间。在一些实施方案中，所述海藻糖的浓度在约2.5％-3.0％之间。在一些实施方案中，所述海藻糖的浓度在约5.0％-15％之间。在一些实施方案中，所述海藻糖的浓度在约10％-20％之间。

在一些实施方案中，所述pH在约6.0与约8.0之间。例如，在一些实施方案中，所述pH在约6.0-7.0、6.5-7.5或7.0-8.0之间。因此，在一些实施方案中，所述pH在约6.0-7.0之间。在一些实施方案中，所述pH在约6.5-7.5之间。在一些实施方案中，所述pH在约7.0-8.0之间。在一些实施方案中，所述pH是约7.4。在一些实施方案中，所述pH是7.4。

在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa在6.0与8.2之间。因此，在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0或8.2。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约6.2。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约6.4。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约6.6。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约6.8。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约7.0。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约7.2。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约7.4。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约7.6。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约7.8。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约8.0。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的pKa为约8.2。

在一些实施方案中，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、组氨酸缓冲液和Good's缓冲液。因此，在一些实施方案中，所述缓冲液是磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液是咪唑缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液是组氨酸缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液是Good's缓冲液。在一些实施方案中，所述Good's缓冲液是Tris缓冲液或HEPES缓冲液。

在一些实施方案中，所述pH缓冲液是磷酸盐缓冲液(例如，柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液)、Tris缓冲液或咪唑缓冲液。

在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度是至少75mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM或至少200mM。因此，在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度是至少75mM。在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度是至少100mM。在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度是至少125mM。在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度是至少150mM。在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度是至少200mM。

在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度在约75mM-200mM、75mM-150mM、75mM-100mM或100mM-200mM之间。因此，在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度在约75mM-200mM之间。在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度在约75mM-150mM之间。在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度在约75mM-100mM mM之间。在一些实施方案中，所述最小缓冲离子强度在约100mM-200mM之间。

在一些实施方案中，通过增加所述配制品中的缓冲液浓度和/或增加所述配制品中的盐浓度来获得所述最小缓冲离子强度。因此，在一些实施方案中，通过增加缓冲液浓度来获得所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，通过增加所述配制品的盐浓度来获得所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，通过增加所述配制品中的缓冲液浓度和通过增加所述配制品中的盐浓度来获得所述最小缓冲离子强度。

在一些实施方案中，二糖与缓冲液的比率在0.1-0.9之间。在一些实施方案中，二糖与缓冲液的比率在0.1-0.7之间。在一些实施方案中，二糖与缓冲液的比率在0.2-0.7之间。在一些实施方案中，二糖与缓冲液的比率在0.2-0.5之间。

在一些实施方案中，提供离子强度的所述一种或多种试剂包括盐。在一些实施方案中，所述盐选自NaCl、KCl和CaCl₂。因此，在一些实施方案中，所述盐是NaCl。在一些实施方案中，所述盐是KCl。在一些实施方案中，所述盐是CaCl₂。

在一些实施方案中，提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度在约50-500mM、100-400mM或200-300mM之间。因此，在一些实施方案中，所述一种或多种试剂的总浓度在约50-500mM之间。在一些实施方案中，所述一种或多种试剂的总浓度在约100-400mM之间。在一些实施方案中，所述一种或多种试剂的总浓度在约200-300mM之间。在一些实施方案中，提供离子强度的所述一种或多种试剂的总浓度在约50-300mM、50-150mM或75-125mM之间。在一些实施方案中，提供离子强度的所述一种或多种试剂的总浓度在约50-300mM之间。在一些实施方案中，提供离子强度的所述一种或多种试剂的总浓度在约50-150mM之间。在一些实施方案中，提供离子强度的所述一种或多种试剂的总浓度在约75-125mM之间。

在一些实施方案中，pH缓冲液的总浓度在约100-300mM、200-300mM或250-300mM之间。因此，在一些实施方案中，所述pH缓冲液的总浓度在约100-300mM之间。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的总浓度在200-300mM之间。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的总浓度在250-300mM之间。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的总浓度在约15-250mM、30-150mM或40-50mM之间。因此，在一些实施方案中，所述pH缓冲液的总浓度在约15-250mM之间。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的总浓度在约30-150mM之间。在一些实施方案中，所述pH缓冲液的总浓度在约40-50mM之间。

在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度选自约40mM Tris缓冲液和约75-200mM NaCl、约50mM Tris缓冲液和约75mM-200mM NaCl、约100mM Tris缓冲液和约75mM-200mM NaCl，约40mM咪唑和约75mM-200mMNaCl、约50mM咪唑和75mM-200mM NaCl以及约100mM咪唑和75mM-200mM，约40mM磷酸盐和约75-200mM NaCl、约50mM磷酸盐和约75-200mM NaCl以及约100mM磷酸盐和75-200mM NaCl。因此，在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度是约40mM Tris缓冲液和约75-200mM NaCl。在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度是约50mM Tris缓冲液和约75mM-200mMNaCl。在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度是约100mM Tris缓冲液和约75mM-200mM NaCl。在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度是约40mM咪唑和约75mM-200mMNaCl。在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度是50mM咪唑和75mM-200mM NaCl。在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度是100mM咪唑和75mM-200mM NaCl。在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度是约40mM咪唑、约75mM-200mM NaCl和2.5％-10％海藻糖。在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度是50mM咪唑、约75mM-200mM NaCl和2.5％-10％海藻糖。在一些实施方案中，所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度是100mM咪唑、约75mM-200mM NaCl和2.5％-10％海藻糖。

在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少2.25倍于、至少2.5倍于、至少2.75倍于、至少3倍于、至少3.5倍于、至少4倍于、至少4.5倍于、至少5倍于所述最小缓冲离子强度。因此，在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少2.25倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少2.5倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少2.75倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少3.0倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少3.5倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少4.0倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少4.5倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少5.0倍于所述最小缓冲离子强度。

在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到20倍于、不到19倍于、不到18倍于、不到17倍于、不到16倍于、不到15倍于、不到14倍于、不到13倍于、不到12倍于、不到11倍于、不到10倍于、不到9倍于、不到8倍于、不到7倍于、不到6倍于、不到5倍于、不到4倍于所述最小缓冲离子强度。因此，在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到20倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到19倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到18倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到17倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到16倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到15倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到14倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到13倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到12倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到11倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到10倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到9倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到8倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到7倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到6倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到5倍于所述最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度不到4倍于所述最小缓冲离子强度。

在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于所述最小缓冲离子强度，并且其中所述LNP配制品的离子强度在约150mM-750mM、150mM-500mM、150mM-400mM、150mM-300mM、150mM与200mM之间。因此，在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于所述最小缓冲离子强度，并且其中所述LNP配制品的离子强度在约150mM-750mM之间。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于所述最小缓冲离子强度，并且其中所述LNP配制品的离子强度在约150mM-500mM之间。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于所述最小缓冲离子强度，并且其中所述LNP配制品的离子强度在约150mM-400mM之间。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于所述最小缓冲离子强度，并且其中所述LNP配制品的离子强度在约150mM-300mM之间。在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于所述最小缓冲离子强度，并且其中所述LNP配制品的离子强度在约150mM与200mM之间。

在一些实施方案中，所述LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于所述最小缓冲离子强度，并且其中所述LNP配制品的离子强度是或大于150mM。

在一些实施方案中，通过浊度分析来确定更少的聚集。在一些实施方案中，通过浊度分析来确定经包封的mRNA的更少的降解。可以使用各种测量浊度的方式，包括例如使用视觉分析和/或使用光谱法。

在一些实施方案中，在-20℃下冷冻并再解冻超过三轮后，与在所述LNP配制品中仅具有所述最小缓冲离子强度而不是至少两倍于所述最小缓冲离子强度的离子强度的相同LNP配制品相比，所述LNP配制品展现出(i)更少的聚集、(ii)经包封的mRNA的更少的降解、或(iii)(i)和(ii)两者。

在一些实施方案中，所述LNP的直径小于约100nm。在一些实施方案中，所述LNP的直径在约70nm-90nm之间。例如，在一些实施方案中，所述LNP的直径在约70nm-85nm之间。在一些实施方案中，所述LNP的直径在约70nm-80nm之间。在一些实施方案中，所述LNP的直径在约70nm-75nm之间。在一些实施方案中，所述LNP的直径在约80nm-90nm之间。在一些实施方案中，所述LNP的直径在约85nm-90nm之间。在一些实施方案中，所述LNP的直径在约75nm-90nm之间。在一些实施方案中，所述LNP的直径在约75nm-85nm之间。在一些实施方案中，所述LNP的直径在约75nm-80nm之间。在一些实施方案中，所述LNP的直径小于约70nm。

在一些实施方案中，所述脂质组分包含DMG-PEG-2000、cKK-E10、胆固醇和DOPE或由其组成。因此，在一些实施方案中，所述脂质组分包含DMG-PEG-2000、cKK-E10、胆固醇和DOPE。在一些实施方案中，所述脂质组分由DMG-PEG-2000、cKK-E10、胆固醇和DOPE组成。

在一些实施方案中，N/P比在约3-5之间。例如，在一些实施方案中，N/P比是约3。在一些实施方案中，N/P比是约4。在一些实施方案中，N/P比是约5。

在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度在约0.05mg/mL与1.0mg/mL之间。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.05mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.1mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.1mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.2mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.3mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.4mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.5mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.6mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.7mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.8mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约0.9mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA的最终浓度为约1.0mg/mL。

在一些实施方案中，所述mRNA的浓度在约0.2mg/mL与0.5mg/mL之间。

在一些实施方案中，所述LNP在-20℃下稳定至少3个月、6个月、12个月或超过12个月。因此，在一些实施方案中，所述LNP在-20℃下稳定至少3个月。在一些实施方案中，所述LNP在-20℃下稳定至少6个月。在一些实施方案中，所述LNP在-20℃下稳定至少12个月。在一些实施方案中，所述LNP在-20℃下稳定超过12个月。

在一些实施方案中，所述LNP配制品在稀释后是稳定的。

在一些实施方案中，与不包含浓度为或低于300mM且pH在约7.0与7.5之间的缓冲液的配制品相比，所述配制品的皮下或肌内递送伴随着减轻的疼痛。

在一些实施方案中，通过10cm视觉模拟量表(VAS)或六项语言评定量表(VRS)评估经减轻的疼痛。因此，在一些实施方案中，通过10cm视觉模拟量表(VAS)评估经减轻的疼痛。在一些实施方案中，通过六项语言评定量表(VRS)评估经减轻的疼痛。

在一些方面，提供了一种减少LNP降解和/或聚集的方法，所述方法包括将所述LNP储存在如本文所述的配制品中。

在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。如本公开文本中所用，术语“包含(comprise)”和所述术语的变体如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”不旨在排除其他添加物、组分、整数或步骤。如本申请中所用，术语“约”和“大约”作为等效物而使用。这两个术语都意在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。

本发明的其他特征、目的和优势在下文的具体实施方式、附图说明和权利要求中是清楚的。然而，应当理解，虽然具体实施方式、附图说明和权利要求陈述了本发明的实施方案，但它们是仅以说明而非限制的方式给出的。在本发明范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员而言将变得清楚。

附图说明

附图仅用于说明目的而非用于限制。

图1A是示出LNP在pH 7.5下的随LNP配制品中海藻糖浓度的增加变化的以及随在pH 7.5下维持LNP稳定性所需的最小缓冲液强度变化的稳定性的图。图1B是示出具有占LNP配制品的恒定百分比(即，2.7％)的海藻糖的LNP配制品的随pH波动变化的以及随维持LNP配制品稳定性所需的最小缓冲液强度变化的稳定性的图。

图2是示出所测试的LNP配制品的脂质pKa依赖性行为的图。对于这些研究，LNP配制品包含2.7％的海藻糖。

图3A描绘了所测试的LNP配制品的各种条件。表格描绘了脂质的摩尔浓度和pH7.5的Tris缓冲液的浓度。表格中的选中标记表示稳定的LNP配制品。“X”表示不稳定的LNP配制品。图3B是示出在动物模型中施用后6小时或24小时源自包封人EPO mRNA的LNP的人EPO蛋白的表达的图。示出了各种LNP组成脂质。

图4A描绘了示出所测试的LNP配制品的各种组成的一系列表格。表格描绘了在所评估的各种LNP配制品中所测试的缓冲液(即，Tris或咪唑)的摩尔浓度和所测试的对应盐(即，NaCl)浓度。表格中的选中标记表示稳定的LNP配制品。“X”表示不稳定的LNP配制品。图4B描绘了评估各种LNP配制品的表格。LNP配制品根据Tris或磷酸盐缓冲液的浓度而变化。评估LNP的稀释后稳定性。稳定的LNP用选中标记指示，而不稳定的LNP配制品用“X”指示。

图5A描绘了在4℃下包含不同的海藻糖与PBS比率(例如，约0.2-0.5)的LNP配制品的包封效率百分比的图。图5B描绘了在25℃下包含不同的海藻糖与PBS比率(例如，约0.2-0.5)的LNP配制品的包封效率百分比的图。

图6A描绘了在4℃下包含不同的海藻糖与PBS比率(例如，约0.2-0.5)的LNP配制品的LNP尺寸(以纳米计)的图。图6B描绘了在25℃下包含不同的海藻糖与PBS比率(例如，约0.2-0.5)的LNP配制品的LNP尺寸(以纳米计)的图。

定义

为了更容易地理解本发明，下文首先定义某些术语。以下术语和其他术语的另外的定义在整个说明书中都有阐述。将本文引用的用于描述本发明的背景和提供关于本发明实践的另外的细节的出版物和其他参考材料通过引用特此并入。

大约或约：如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与所陈述参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另外陈述或从上下文中另外可以明显看出，否则术语“大约”或“约”是指落在所陈述参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的一系列值(这个数字会超过可能值的100％的情况除外)。

如本文所用，术语“批次”是指同时合成(例如，在同一制造周期期间根据单个制造指令产生)的mRNA的数量或量。一批可以指代在一个反应中合成的mRNA的量，所述反应经由单个等份的酶和/或单个等份的DNA模板在一组条件下进行连续合成而发生。在一些实施方案中，一批将包括由反应产生的mRNA，在所述反应中随着反应的进行不是所有试剂和/或组分都被补充和/或补足。术语“不在单个批次”将不意指在不同时间合成的mRNA，将它们合并以达到所需量。

递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部和全身递送两者。例如，mRNA的递送涵盖这样的情况，其中将mRNA递送至靶组织并且所编码的蛋白质被表达并保留于靶组织内(也称为“局部分布”或“局部递送”)；以及这样的情况，其中将mRNA递送至靶组织并且所编码的蛋白质被表达并分泌至患者的循环系统(例如，血清)中，并且全身分布且由其他组织吸收(也称为“全身分布”或“全身递送”)。在一些实施方案中，递送是肺递送，例如包括雾化。

包封：如本文所用，术语“包封”或语法等效物是指将mRNA分子限制在纳米颗粒内的过程。

工程化或突变型：如本文所用，术语“工程化”或“突变型”或语法等效物是指与其天然存在的序列相比包含一个或多个修饰的核苷酸或蛋白质序列，所述修饰包括但不限于缺失、异源核酸或氨基酸的插入、倒位、取代或其组合。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指将mRNA翻译为多肽、将多个多肽(例如，抗体的重链或轻链)组装为完整蛋白质(例如，抗体)和/或对多肽或完全组装的蛋白质(例如，抗体)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”及语法等效物可互换使用。

功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是呈这样的形式的生物分子，在所述形式下，它展现出其特征性的特性和/或活性。

半衰期：如本文所用，术语“半衰期”是诸如核酸或蛋白质浓度或活性等量降至一段时间开始时其测量值的一半所需的时间。

改进、增加或减少：如本文所用，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等效物指示相对于基线测量值的值，所述基线测量值诸如在开始本文所述的治疗之前在同一个体中的测量值，或者在不存在本文所述的治疗的情况下在对照受试者(或多名对照受试者)中的测量值。“对照受试者”是受与所治疗受试者所患疾病相同的疾病形式折磨的受试者，其年龄与所治疗受试者大致相同。

杂质：如本文所用，术语“杂质”是指限制量的液体、气体或固体内部与目标材料或化合物的化学组成不同的物质。杂质也被称为污染物。

体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中(例如，在试管或反应容器中、在细胞培养中等)，而不是在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体(如人和非人动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，所述术语可以用于指代在活细胞(与例如体外系统形成对照)内发生的事件。

分离的：如本文所用，术语“分离的”是指这样的物质和/或实体，其已经(1)与最初产生时(在自然界中和/或在实验环境中)与其相关的至少一些组分分开，和/或(2)被人工地产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的最初与其相关的其他组分分开。在一些实施方案中，分离的药剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则它是“纯的”。如本文所用，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应当包括赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)。

信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用的mRNA涵盖经修饰的和未经修饰的RNA两者。mRNA可以含有一个或多个编码区和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在适当的情况下，例如在经化学合成的分子的情况下，mRNA可以包含核苷类似物(如具有经化学修饰的碱基或糖的类似物)、骨架修饰等。除非另外指示，否则mRNA序列以5'至3'方向呈现。

核酸：如本文所用，术语“核酸”以其最广泛的含义指代被掺入或可以被掺入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯连接被掺入或可以被掺入多核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指单独的核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含单独的核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有除磷酸二酯骨架之外的类似物。例如，本领域已知且在骨架中用肽键代替磷酸二酯键的所谓的“肽核酸”被认为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可以包括内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在适当的情况下，例如在经化学合成的分子的情况下，核酸可以包含核苷类似物(如具有经化学修饰的碱基或糖的类似物)、骨架修饰等。除非另外指示，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；嵌入的碱基；经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。在一些实施方案中，本发明具体涉及“未经修饰的核酸”，意指尚未进行化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，核苷酸T和U在序列描述中可互换使用。

患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以被施用所提供的组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防、化妆和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施方案中，患者是人。人包括出生前和出生后形式。

药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指这样的物质，其在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。

稳定：如本文所用，术语“稳定”蛋白质或其语法等效物是指保留其物理稳定性和/或生物活性的蛋白质。在一个实施方案中，在低百分比的降解(例如，片段化)和/或聚集的蛋白质下基于溶液中单体蛋白质的百分比来确定蛋白质稳定性。在一个实施方案中，与野生型蛋白质相比，稳定的工程化蛋白质保留或展现出增强的半衰期。在一个实施方案中，与野生型蛋白质相比，稳定的工程化蛋白质不易发生导致蛋白水解的泛素化。

受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，受试者是人。受试者可以是患者，其是指呈现给医疗提供者以供诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可能受疾病或障碍折磨或者易患疾病或障碍，但是可能展示或可能不展示疾病或障碍的症状。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现目的特征或特性的总体或接近总体范围或程度的定性情况。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有过的话)完成和/或进行至完成或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕捉在许多生物和化学现象中固有的潜在完整性缺乏。

治疗：如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。可以将治疗施用至未展现出疾病体征和/或仅展现出疾病早期体征的受试者，用于降低发生与疾病相关的病状的风险的目的。

具体实施方式

本发明尤其提供了改进的方法和组合物，所述改进的方法和组合物导致产生包封mRNA的对多个冷冻/解冻循环具有抗性的稳定的LNP配制品。这种对多个冷冻/解冻循环的抗性至少表现为1)在一个或多个冷冻/解冻循环后LNP的低聚集；和2)经包封的mRNA的低降解。

稳定的脂质纳米颗粒配制品

本文提供了包封编码肽或多肽的mRNA的稳定的液体脂质纳米颗粒(LNP)的配制品。此类稳定的LNP在一个或多个冷冻解冻循环后对聚集和mRNA降解具有抗性。例如，稳定的LNP对一个、两个、三个、四个、五个或超过5个冷冻解冻循环具有抗性，其中将包封mRNA的LNP储存在-20℃下。在一些实施方案中，稳定的LNP对一个、两个、三个、四个、五个或超过5个冷冻解冻循环具有抗性，其中将包封mRNA的LNP储存在-80℃下或以下。

此外，本文所述的包封mRNA的稳定的LNP配制品在向有需要的受试者施用时伴随着减轻的疼痛。例如，与不具有如本文所述的离子强度的特定离子强度的LNP配制品相比，所描述的LNP配制品在施用(如通过肌内或皮下施用)后导致疼痛减轻。

在一些实施方案中，此类稳定的LNP配制品包含：a)具有脂质组分的一个或多个LNP，所述脂质组分包含阳离子脂质、非阳离子脂质、经PEG修饰的脂质和任选的胆固醇；b)包封在一个或多个脂质纳米颗粒内并且编码肽或多肽的mRNA；c)糖或糖醇；d)6.0至8.0的LNP配制品pH；e)在最小缓冲离子强度下提供LNP配制品pH的pH缓冲液；和任选地f)为LNP配制品提供离子强度的一种或多种另外的试剂。稳定的LNP配制品具有这样的来自(e)的pH缓冲液和来自(f)的任选的一种或多种另外的试剂的总浓度，其为LNP配制品提供至少两倍于最小缓冲离子强度的离子强度。在一轮、两轮、三轮或超过三轮的冷冻和解冻后，与在LNP配制品中仅具有最小缓冲离子强度而不是至少两倍于最小缓冲离子强度的离子强度的相同LNP配制品相比，所描述的LNP配制品具有(i)更少的聚集、(ii)经包封的mRNA的更少的降解、或(iii)(i)和(ii)两者。

上述(f)中的一种或多种另外的试剂可以是盐、缓冲液或盐和缓冲液的组合。例如，(f)中的一种或多种另外的试剂可以包括例如NaCl、KCl和CaCl₂。缓冲液包括例如磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、组氨酸缓冲液或Good's缓冲液。各种Good's缓冲液是本领域已知的，并且包括例如MES、Bis-tris甲烷、ADA、Bis-tris丙烷、PIPES、ACES、POPSO、氯化胆胺、MOPS、BES、AMPB、TES、HEPES、DIPSO、MOBS、乙酰胺基甘氨酸、TAPSO、TEA、POPSO、HEPPSO、EPS、HEPPS、Tricine、Tris、甘氨酰胺、双甘氨肽、HEPBS、Bicine、TAPS、AMPB、CHES、CAPSO、AMP、CAPS和CABS。在一些实施方案中，Good's缓冲液是Tris缓冲液或HEPES缓冲液。

在一些实施方案中，一种或多种另外的试剂的浓度在约50-500mM、100-400mM或200-300mM之间。本文所述的LNP配制品的缓冲液pH的浓度在约100-300mM、200-300mM或250-300mM之间。

如本文所述的包封mRNA的稳定的LNP配制品的最小缓冲离子强度是例如至少15mM、至少25mM、至少50mM、至少75mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM或至少200mM。在实施方案中，如本文所述的包封mRNA的稳定的LNP配制品例如在约15mM-200mM、50mM-200mM、75mM-200mM、15mM-150mM、50mM-150mM、75mM-150mM、15mM-100mM、50mM-100mM、75mM-100mM或100mM-200mM之间。可以以各种方式获得最小缓冲离子强度。例如，在一些实施方案中，通过增加缓冲液浓度来获得最小缓冲离子强度。可替代地，通过增加盐浓度来获得最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，通过增加缓冲液浓度和盐浓度两者来获得最小缓冲离子强度。例如，在一些实施方案中，pH缓冲液和提供离子强度的一种或多种另外的试剂的总浓度选自约40mM Tris缓冲液和约75-200mM NaCl、约50mM Tris缓冲液和约75mM-200mM NaCl、约100mM Tris缓冲液和约75mM-200mM NaCl，约40mM咪唑和约75mM-200mM NaCl、约50mM咪唑和75mM-200mM NaCl以及约100mM咪唑和75mM-200mM NaCl，约40mM磷酸盐和约75mM-200mM NaCl、约50mM磷酸盐和75mM-200mM NaCl以及约100mM磷酸盐和75mM-200mM NaCl。在一些实施方案中，pH缓冲液和提供离子强度的一种或多种另外的试剂的总浓度选自40mMTris缓冲液、约75-200mM NaCl和约2.5％-10％海藻糖，约50mM Tris缓冲液、约75mM-200mMNaCl和约2.5％-10％海藻糖，约100mM Tris缓冲液、约75mM-200mM NaCl和约2.5％-10％海藻糖；约40mM咪唑、约75mM-200mM NaCl和约2.5％-10％海藻糖，约50mM咪唑、75mM-200mMNaCl和约2.5％-10％海藻糖以及约100mM咪唑、75mM-200mM NaCl和约2.5％-10％海藻糖；约40mM磷酸盐、约75mM-200mM NaCl和约2.5％-10％海藻糖，约50mM磷酸盐、75mM-200mMNaCl和约2.5％-10％海藻糖，约100mM磷酸盐、75mM-200mM NaCl和约2.5％-10％海藻糖。

在一些实施方案中，缓冲液可互换使用。在一些实施方案中，用咪唑缓冲液或磷酸盐缓冲液代替Tris缓冲液。在一些实施方案中，用咪唑缓冲液代替Tris缓冲液。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲液代替Tris缓冲液。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液代替咪唑缓冲液。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲液代替咪唑缓冲液。在一些实施方案中，用Tris缓冲液代替咪唑缓冲液。在一些实施方案中，用Tris缓冲液或咪唑缓冲液代替磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，用Tris缓冲液代替磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，用咪唑缓冲液代替磷酸盐缓冲液。

在一些实施方案中，Tris缓冲液、咪唑缓冲液或磷酸盐缓冲液具有高缓冲液强度(例如，100mM或更高)。在一些实施方案中，将低缓冲液强度(例如，15-20mM)的Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液或咪唑缓冲液与高盐浓度(例如，200mM或更高的NaCl)一起使用。在一些实施方案中，将中等缓冲液强度(例如，40-50mM)的Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液或咪唑缓冲液与中等盐浓度(例如，50-100mM NaCl)一起使用。

在一些实施方案中，将Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液或咪唑缓冲液与低海藻糖浓度(例如，50-100mM NaCl)一起使用。在一些实施方案中，LNP配制品稳定性在低的糖与缓冲液比率下更高。在一些实施方案中，LNP配制品的较低的海藻糖与缓冲液比率有利于防止包封的减少。在一些实施方案中，较低的海藻糖与缓冲液比率防止LNP尺寸的增加。

在一些实施方案中，LNP配制品的离子强度至少2.25倍于、至少2.5倍于、至少2.75倍于、至少3倍于、至少3.5倍于、至少4倍于、至少4.5倍于、至少5倍于最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，LNP配制品的离子强度不到20倍于、不到19倍于、不到18倍于、不到17倍于、不到16倍于、不到15倍于、不到14倍于、不到13倍于、不到12倍于、不到11倍于、不到10倍于、不到9倍于、不到8倍于、不到7倍于、不到6倍于、不到5倍于、不到4倍于最小缓冲离子强度。在一些实施方案中，LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于最小缓冲离子强度，并且其中LNP配制品的离子强度在约150mM-750mM、150mM-500mM、150mM-400mM、150mM-300mM、150mM与200mM之间。在一些实施方案中，LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于最小缓冲离子强度，并且其中LNP配制品的离子强度是或大于150mM。通篇引用的最小缓冲离子强度是至少75mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM或至少200mM。

在一些实施方案中，本文所述的稳定的LNP配制品进一步包含一种或冷冻保护剂。冷冻保护剂可以被表征为“渗透性”冷冻保护剂或“非渗透性”冷冻保护剂。用于本文所述的LNP配制品的合适冷冻保护剂可以选自渗透性冷冻保护剂和/或非渗透性冷冻保护剂。示例性的非渗透性冷冻保护剂包括例如糖，如右旋糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、右旋糖酐和菊粉。另一类非渗透性冷冻保护剂包括例如聚合物，如PVP、PVA、泊洛沙姆和PEG。示例性的渗透性冷冻保护剂包括例如甘油、乙二醇、三乙二醇、丙二醇、四乙二醇。所描述的冷冻保护剂中的任何一种或多种都适合包含在本文所述的稳定的LNP配制品中。在一些实施方案中，LNP配制品中的冷冻保护剂包括浓度在1％与20％之间的海藻糖。在一些实施方案中，LNP配制品中的冷冻保护剂包括浓度在约2.5％-3.0％之间的海藻糖。在一些实施方案中，LNP配制品中的冷冻保护剂包括浓度为约2.5％的海藻糖。在一些实施方案中，LNP配制品中的冷冻保护剂包括浓度为约2.6％的海藻糖。在一些实施方案中，LNP配制品中的冷冻保护剂包括浓度为约2.7％的海藻糖。在一些实施方案中，LNP配制品中的冷冻保护剂包括浓度为约2.8％的海藻糖。在一些实施方案中，LNP配制品中的冷冻保护剂包括浓度为约2.9％的海藻糖。在一些实施方案中，LNP配制品中的冷冻保护剂包括浓度为约3.0％的海藻糖。

各种非阳离子脂质可以用于本文所述的LNP配制品中。例如，用于本文所述的LNP配制品的合适阳离子脂质可以选自1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE或1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。在一些实施方案中，非阳离子脂质是DOPE。

LNP配制品中的非阳离子脂质的脂质摩尔比可以大于10％。例如，在一些实施方案中，非阳离子脂质的脂质摩尔比为11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％。

在一些实施方案中，阳离子脂质选自类脂质。各种类脂质是本领域已知的。例如，类脂质描述于Goldberg M.(2013)Lipidoids:A Combinatorial Approach to siRNADelivery.在:Howard K.(编辑)RNA Interference from Biology toTherapeutics.Advances in Delivery Science and Technology.Springer,Boston,MA.中，将所述文献的内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，类脂质是阳离子的。在一些实施方案中，类脂质含有多达七个尾。例如，这七个尾可以从胺骨架发出。在一些实施方案中，当与天然脂质(如甘油三酯)相比时，类脂质的酯连接相对于脂族链倒反。在一些实施方案中，当与天然脂质(如甘油三酯)相比时，类脂质的酯连接相对于脂族链不倒反。

在一些实施方案中，类脂质包括例如氨基醇类脂质。在一些实施方案中，类脂质选自cKK-E10、OF-02或C12-200。因此，在一些实施方案中，类脂质是cKK-E-10。在一些实施方案中，类脂质是OF-02。在一些实施方案中，类脂质是C12-200。

本发明的LNP配制品的pH可以在约6.0与8.0之间。例如，在一些实施方案中，LNP配制品的pH可以在约6.0-7.0之间。在一些实施方案中，LNP配制品的pH可以在约6.5-7.5之间。在一些实施方案中，LNP配制品的pH可以在约7.0-8.0之间。在一些实施方案中，LNP配制品的pH为约7.4。在一些实施方案中，LNP配制品的pH等于生理pH。

LNP配制品的pH缓冲液的pKa可以在约6.0与8.2之间。例如，LNP配制品的pH缓冲液的pKa为约6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0或8.2。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约6.2。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约6.4。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约6.6。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约6.8。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约7.0。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约7.2。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约7.4。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约7.6。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约7.8。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约8.0。在一些实施方案中，pH缓冲液的pKa为约8.2。

如上所述，本文所述的LNP配制品在一个或多个冷冻解冻循环后具有更少的聚集。本领域有各种方式来确定LNP聚集，包括例如通过以下中的任一种确定：动态光散射(DLS)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)、浊度分析、流式显微术分析、流式细胞术、FTIR显微术、共振质量测量(RMM)、拉曼显微术、过滤、激光衍射、电子显微术、原子力显微术(AFM)、静态光散射(SLS)、多角度静态光散射(MALS)、场流分级法(FFF)或分析超离心(AUC)。可以使用这些方法中的任何一种或多种来评估LNP聚集。

本文所述的LNP配制品在多个冷冻解冻循环中的一个后也具有更少的mRNA降解。本领域有各种方式来确定mRNA降解，例如像动态光散射(DLS)、纳米颗粒跟踪分析(NTA)、浊度分析、流式显微术分析、流式细胞术、FTIR显微术、共振质量测量(RMM)、拉曼显微术、过滤、激光衍射、电子显微术、原子力显微术(AFM)、静态光散射(SLS)、多角度静态光散射(MALS)、场流分级法(FFF)和分析超离心(AUC)。可以使用这些方法中的任何一种或多种来评估mRNA降解。

本文所述的LNP配制品的直径小于100nm。例如，在一些实施方案中，LNP的直径在70nm-90nm之间。在一些实施方案中，LNP的直径小于70nm。

如通篇所述，各种脂质组分适合于本文所述的LNP。在一些实施方案中，LNP配制品具有包含DMG-PEG-2000、cKK-E10、胆固醇和DOPE的脂质组分。在一些实施方案中，LNP配制品具有由DMG-PEG-2000、cKK-E10、胆固醇和DOPE组成的脂质组分。

LNP配制品的N/P比的范围可以为约3-5。在一些实施方案中，N/P比是约3。在一些实施方案中，N/P比是约4。在一些实施方案中，N/P比是约5。

LNP配制品包封mRNA。任何mRNA都可以被本文所述的LNP配制品包封。包封在LNP内的mRNA的最终浓度的范围可以在约0.05mg/mL与1.0mg/mL之间。在一些实施方案中，包封在LNP内的mRNA的范围为约0.2mg/mL至约0.5mg/mL。

本文所述的LNP配制品当在-20℃、-80℃或低于-80℃下储存时是稳定的。因此，在一些实施方案中，本文所述的LNP配制品当在-20℃下储存时是稳定的。在一些实施方案中，本文所述的LNP配制品当在-80℃下储存时是稳定的。在一些实施方案中，本文所述的LNP配制品当在-80℃以下储存时是稳定的。例如，LNP配制品当在-20℃下储存时稳定至少3个月、6个月、12个月或超过12个月。此外，LNP配制品在稀释后是稳定的。

mRNA的合成

可以根据多种已知方法中的任一种合成根据本发明的mRNA。例如，可以经由体外转录(IVT)合成根据本发明的mRNA。简言之，通常用以下进行IVT：含有启动子的线性或环状DNA模板、一池核糖核苷三磷酸、可以包括DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切条件将根据具体应用而变化。

在一些实施方案中，为了制备根据本发明的mRNA，在体外转录DNA模板。合适的DNA模板通常具有用于体外转录的启动子(例如，T3、T7或SP6启动子)，之后为所需mRNA的所需核苷酸序列以及终止信号。

使用SP6 RNA聚合酶合成mRNA

在一些实施方案中，使用SP6 RNA聚合酶产生mRNA。SP6 RNA聚合酶是对SP6启动子序列具有高序列特异性的DNA依赖性RNA聚合酶。SP6聚合酶在其启动子下游的单链DNA或双链DNA上催化5'→3'体外合成RNA；它将天然核糖核苷酸和/或经修饰的核糖核苷酸和/或经标记的核糖核苷酸掺入聚合的转录物中。此类经标记的核糖核苷酸的例子包括生物素、荧光素、地高辛、氨基烯丙基和同位素标记的核苷酸。

噬菌体SP6 RNA聚合酶的序列最初被描述(GenBank：Y00105.1)为具有以下氨基酸序列：

MQDLHAIQLQLEEEMFNGGIRRFEADQQRQIAAGSESDTAWNRRLLSELIAPMAEGIQ

AYKEEYEGKKGRAPRALAFLQCVENEVAAYITMKVVMDMLNTDATLQAIAMSVAER

IEDQVRFSKLEGHAAKYFEKVKKSLKASRTKSYRHAHNVAVVAEKSVAEKDADFDR

WEAWPKETQLQIGTTLLEILEGSVFYNGEPVFMRAMRTYGGKTIYYLQTSESVGQWIS

AFKEHVAQLSPAYAPCVIPPRPWRTPFNGGFHTEKVASRIRLVKGNREHVRKLTQKQ

MPKVYKAINALQNTQWQINKDVLAVIEEVIRLDLGYGVPSFKPLIDKENKPANPVPVE

FQHLRGRELKEMLSPEQWQQFINWKGECARLYTAETKRGSKSAAVVRMVGQARKYS

AFESIYFVYAMDSRSRVYVQSSTLSPQSNDLGKALLRFTEGRPVNGVEALKWFCINGA

NLWGWDKKTFDVRVSNVLDEEFQDMCRDIAADPLTFTQWAKADAPYEFLAWCFEY

AQYLDLVDEGRADEFRTHLPVHQDGSCSGIQHYSAMLRDEVGAKAVNLKPSDAPQDI

YGAVAQVVIKKNALYMDADDATTFTSGSVTLSGTELRAMASAWDSIGITRSLTKKPV

MTLPYGSTRLTCRESVIDYIVDLEEKEAQKAVAEGRTANKVHPFEDDRQDYLTPGAA

YNYMTALIWPSISEVVKAPIVAMKMIRQLARFAAKRNEGLMYTLPTGFILEQKIMATE

MLRVRTCLMGDIKMSLQVETDIVDEAAMMGAAAPNFVHGHDASHLILTVCELVDKG

VTSIAVIHDSFGTHADNTLTLRVALKGQMVAMYIDGNALQKLLEEHEVRWMVDTGIEVPEQGEFDLNEIMDSEYVFA。

适合于本发明的SP6 RNA聚合酶可以是具有与噬菌体SP6 RNA聚合酶基本上相同的聚合酶活性的任何酶。因此，在一些实施方案中，适合于本发明的SP6 RNA聚合酶可以从SEQ ID NO:16修饰而来。例如，合适的SP6 RNA聚合酶可以含有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。在一些实施方案中，合适的SP6 RNA聚合酶具有与SEQ ID NO:16约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、75％、70％、65％或60％相同或同源的氨基酸序列。在一些实施方案中，合适的SP6 RNA聚合酶可以是(从N末端、C末端或内部)截短的蛋白质，但是保留聚合酶活性。在一些实施方案中，合适的SP6 RNA聚合酶是融合蛋白。

适合于本发明的SP6 RNA聚合酶可以是可商购的产品，例如来自Aldevron、Ambion、New England Biolabs(NEB)、Promega和Roche。可以根据如本文所述的SEQ ID NO:16的氨基酸序列或SEQ ID NO:16的变体从商业来源或非商业来源订购和/或定制设计SP6。SP6可以是标准保真度聚合酶，或者可以是高保真度/高效率/高容量的，其已经被修饰以促进RNA聚合酶活性，例如SP6 RNA聚合酶基因中的突变或SP6 RNA聚合酶本身的翻译后修饰。此类经修饰的SP6的例子包括来自Ambion的SP6 RNA Polymerase-Plus^TM、来自NEB的HiScribe SP6以及来自Promega的RiboMAX^TM和系统。

在一些实施方案中，合适的SP6 RNA聚合酶是融合蛋白。例如，SP6 RNA聚合酶可以包括一种或多种标签以促进酶的分离、纯化或溶解性。合适的标签可以位于N末端、C末端和/或内部。合适的标签的非限制性例子包括钙调蛋白结合蛋白(CBP)；肝片吸虫8kDa抗原(Fh8)；FLAG标签肽；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)；组氨酸标签(例如，六组氨酸标签(His6))；麦芽糖结合蛋白(MBP)；氮利用物质(NusA)；小泛素相关修饰物(SUMO)融合标签；链霉亲和素结合肽(STREP)；串联亲和纯化(Tandem affinity purification，TAP)；和硫氧还蛋白(TrxA)。在本发明中可以使用其他标签。这些和其他融合标签已经描述于例如Costa等人Frontiers in Microbiology 5(2014):63以及PCT/US16/57044中，将所述文献的内容通过引用以其整体并入本文。在某些实施方案中，His标签位于SP6的N末端。

DNA模板

通常，DNA模板是具有双链SP6启动子序列的完全双链或大部分单链的。

线性化质粒DNA(经由一种或多种限制性内切酶线性化)、线性化基因组DNA片段(经由限制性内切酶和/或物理手段)、PCR产物和/或合成DNA寡核苷酸可以用作用SP6进行体外转录的模板，条件是它们在待转录的DNA序列的上游(且在正确的方向上)含有双链SP6启动子。

在一些实施方案中，线性化DNA模板具有平端。

在一些实施方案中，待转录的DNA序列可以经优化以促进更有效的转录和/或翻译。例如，可以关于顺式调节元件(例如，TATA盒、终止信号和蛋白质结合位点)、人工重组位点、chi位点、CpG二核苷酸含量、阴性CpG岛、GC含量、聚合酶滑动位点和/或与转录相关的其他元件对DNA序列进行优化；可以关于隐蔽剪接位点、mRNA二级结构、mRNA的稳定自由能、重复序列、RNA不稳定基序和/或与mRNA加工和稳定性相关的其他元件对DNA序列进行优化；可以关于密码子使用偏好性、密码子适应性、内部chi位点、核糖体结合位点(例如，IRES)、早熟的聚A位点、Shine-Dalgarno(SD)序列和/或与翻译相关的其他元件对DNA序列进行优化；和/或可以关于密码子背景、密码子-反密码子相互作用、翻译暂停位点和/或与蛋白质折叠相关的其他元件对DNA序列进行优化。本领域已知的优化方法可以用于本发明中，例如ThermoFisher的GeneOptimizer以及OptimumGene^TM，其描述于US 20110081708中，将所述专利的内容通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，DNA模板包括5'和/或3'非翻译区。在一些实施方案中，5'非翻译区包括一种或多种影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5'非翻译区的长度可以在约50与500个核苷酸之间。

在一些实施方案中，3'非翻译区包括以下中的一种或多种：多腺苷酸化信号、影响mRNA在细胞中的位置的稳定性的蛋白质的结合位点、或miRNA的一个或多个结合位点。在一些实施方案中，3'非翻译区的长度可以在50与500个核苷酸之间或更长。

示例性3'和/或5'UTR序列可以源自稳定的mRNA分子(例如，珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)，以增加有义mRNA分子的稳定性。例如，5'UTR序列可以包括CMV即刻早期1(IE1)基因或其片段的部分序列，以改进多核苷酸的核酸酶抗性和/或改进多核苷酸的半衰期。还考虑了将编码人生长激素(hGH)的序列或其片段包含到多核苷酸(例如，mRNA)的3'末端或非翻译区以进一步稳定多核苷酸。通常，相对于其未经修饰的对应物，这些修饰改进了多核苷酸的稳定性和/或药代动力学特性(例如，半衰期)，并且包括例如为改进多核苷酸对体内核酸酶消化的这种抗性而进行的修饰。

大规模mRNA合成

在一些实施方案中，本发明可以用于大规模产生稳定的LNP包封的mRNA。在一些实施方案中，根据本发明的方法以单个批次合成至少100mg、150mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、5g、10g、25g、50g、75g、100g、250g、500g、750g、1kg、5kg、10kg、50kg、100kg、1000kg或更多的mRNA。如本文所用，术语“批次”是指同时合成(例如，根据单一制造设置产生)的mRNA的数量或量。一批可以指代在一个反应中合成的mRNA的量，所述反应经由单个等份的酶和/或单个等份的DNA模板在一组条件下进行连续合成而发生。以单个批次合成的mRNA将不包括在不同时间合成的mRNA，将它们合并以达到所需量。通常，反应混合物包括SP6 RNA聚合酶、线性DNA模板和RNA聚合酶反应缓冲液(其可以包括核糖核苷酸或者可能需要添加核糖核苷酸)。

根据本发明，通常每克(g)所产生的mRNA使用1-100mg SP6聚合酶。在一些实施方案中，每克所产生的mRNA使用约1-90mg、1-80mg、1-60mg、1-50mg、1-40mg、10-100mg、10-80mg、10-60mg、10-50mg SP6聚合酶。在一些实施方案中，使用约5-20mg SP6聚合酶来产生约1克mRNA。在一些实施方案中，使用约0.5至2克SP6聚合酶来产生约100克mRNA。在一些实施方案中，对于约1千克mRNA，使用约5至20克SP6聚合酶。在一些实施方案中，使用至少5mgSP6聚合酶来产生至少1克mRNA。在一些实施方案中，使用至少500mg SP6聚合酶来产生至少100克mRNA。在一些实施方案中，使用至少5克SP6聚合酶来产生至少1千克mRNA。在一些实施方案中，每克所产生的mRNA使用约10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg质粒DNA。在一些实施方案中，使用约10-30mg质粒DNA来产生约1克mRNA。在一些实施方案中，使用约1至3克质粒DNA来产生约100克mRNA。在一些实施方案中，对于约1千克mRNA，使用约10至30克质粒DNA。在一些实施方案中，使用至少10mg质粒DNA来产生至少1克mRNA。在一些实施方案中，使用至少1克质粒DNA来产生至少100克mRNA。在一些实施方案中，使用至少10克质粒DNA来产生至少1千克mRNA。

在一些实施方案中，反应混合物中SP6 RNA聚合酶的浓度可以是约1至100nM、1至90nM、1至80nM、1至70nM、1至60nM、1至50nM、1至40nM、1至30nM、1至20nM或约1至10nM。在某些实施方案中，SP6 RNA聚合酶的浓度是约10至50nM、20至50nM或30至50nM。可以使用100至10000个单位/ml的SP6 RNA聚合酶浓度，例如可以使用100至9000个单位/ml、100至8000个单位/ml、100至7000个单位/ml、100至6000个单位/ml、100至5000个单位/ml、100至1000个单位/ml、200至2000个单位/ml、500至1000个单位/ml、500至2000个单位/ml、500至3000个单位/ml、500至4000个单位/ml、500至5000个单位/ml、500至6000个单位/ml、1000至7500个单位/ml和2500至5000个单位/ml的浓度。

反应混合物中每种核糖核苷酸(例如，ATP、UTP、GTP和CTP)的浓度在约0.1mM与约10mM之间，例如在约1mM与约10mM之间、在约2mM与约10mM之间、在约3mM与约10mM之间、在约1mM与约8mM之间、在约1mM与约6mM之间、在约3mM与约10mM之间、在约3mM与约8mM之间、在约3mM与约6mM之间、在约4mM与约5mM之间。在一些实施方案中，在反应混合物中每种核糖核苷酸为约5mM。在一些实施方案中，在反应中使用的rNTP(例如，ATP、GTP、CTP和UTP组合)的总浓度的范围在1mM与40mM之间。在一些实施方案中，在反应中使用的rNTP(例如，ATP、GTP、CTP和UTP组合)的总浓度的范围在1mM与30mM之间、或在1mM与28mM之间、或在1mM至25mM之间、或在1mM与20mM之间。在一些实施方案中，总rNTP浓度小于30mM。在一些实施方案中，总rNTP浓度小于25mM。在一些实施方案中，总rNTP浓度小于20mM。在一些实施方案中，总rNTP浓度小于15mM。在一些实施方案中，总rNTP浓度小于10mM。

RNA聚合酶反应缓冲液通常包括盐/缓冲剂，例如Tris、HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、磷酸钠、氯化钠和氯化镁。

反应混合物的pH可以在约6至8.5、约6.5至8.0、约7.0至7.5之间，并且在一些实施方案中，pH是7.5。

将线性或线性化DNA模板(例如，如上所述并且以足以提供所需量的RNA的量/浓度)、RNA聚合酶反应缓冲液和SP6 RNA聚合酶组合以形成反应混合物。将反应混合物在约37℃与约42℃之间孵育三十分钟至六小时，例如约六十分钟至约九十分钟。

在一些实施方案中，将在合适的RNA聚合酶反应缓冲液(约7.5的最终反应混合物pH)中的约5mM NTP、约0.05mg/mL SP6聚合酶和约0.1mg/ml DNA模板在约37℃至约42℃下孵育六十分钟至九十分钟。

在一些实施方案中，反应混合物含有具有SP6聚合酶特异性启动子的线性化双链DNA模板、SP6 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、焦磷酸酶、29mM NTP、10mM DTT和反应缓冲液(当在10x下时，为800mM HEPES、20mM亚精胺、250mM MgCl₂(pH 7.7))并添加足量(QS)的无RNA酶水达到所需反应体积；然后将此反应混合物在37℃下孵育60分钟。然后通过添加DNA酶I和DNA酶I缓冲液(当在10x下时，为100mM Tris-HCl、5mM MgCl₂和25mM CaCl₂(pH 7.6))以促进双链DNA模板的消化来淬灭聚合酶反应，以准备用于纯化。此实施方案已经显示足以产生100克mRNA。

在一些实施方案中，反应混合物包括在范围为1-10mM的浓度下的NTP、在范围为0.01-0.5mg/ml的浓度下的DNA模板和在范围为0.01-0.1mg/ml的浓度下的SP6 RNA聚合酶，例如，反应混合物包含浓度为5mM的NTP、浓度为0.1mg/ml的DNA模板和浓度为0.05mg/ml的SP6 RNA聚合酶。

核苷酸

可以使用各种天然存在的或经修饰的核苷来产生根据本发明的mRNA。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然的核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷(例如，N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；嵌入的碱基；经修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。

在一些实施方案中，mRNA包含一个或多个非标准核苷酸残基。非标准核苷酸残基可以包括例如5-甲基-胞苷(“5mC”)、假尿苷(“ψU”)和/或2-硫代尿苷(“2sU”)。关于此类残基及其掺入mRNA的讨论，参见例如美国专利号8,278,036或WO 2011012316。mRNA可以是这样的RNA，其被定义为25％的U残基是2-硫代-尿苷并且25％的C残基是5-甲基胞苷的RNA。关于使用RNA的教导披露于美国专利公开案US20120195936和国际公开案WO 2011012316中，将这两个公开案都通过引用以其整体特此并入。非标准核苷酸残基的存在可能使mRNA比具有相同序列但仅含有标准残基的对照mRNA更稳定和/或免疫原性更低。在其他实施方案中，mRNA可以包含一个或多个选自以下的非标准核苷酸残基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶以及这些修饰和其他核碱基修饰的组合。一些实施方案可以进一步包括对呋喃糖环或核碱基的另外的修饰。另外的修饰可以包括例如糖修饰或取代(例如，2'-O-烷基修饰、锁核酸(LNA)中的一种或多种)。在一些实施方案中，RNA可以与另外的多核苷酸和/或肽多核苷酸(PNA)复合或杂交。在糖修饰为2'-O-烷基修饰的一些实施方案中，这样的修饰可以包括但不限于2'-脱氧-2'-氟修饰、2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧基乙基修饰和2'-脱氧修饰。在一些实施方案中，这些修饰中的任一种可以单独或组合存在于0-100％的核苷酸中，例如超过0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或100％的组成核苷酸中。

合成后加工

通常，可以在合成后添加5'帽和/或3'尾。帽的存在在提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性方面是重要的。“尾”的存在用于保护mRNA免受外切核酸酶降解。

通常如下添加5'帽：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸去除末端磷酸基团中的一个，留下两个末端磷酸；然后经由鸟苷酰转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)添加至末端磷酸，产生5'5'5三磷酸连接；然后鸟嘌呤的7-氮被甲基转移酶甲基化。帽结构的例子包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。另外的帽结构描述于公开的美国专利申请公开号2016/0032356和2017年2月27日提交的美国临时专利申请号62/464,327中，将所述专利申请通过引用并入本文。

通常，尾结构包括聚(A)和/或聚(C)尾。mRNA的3'末端上的聚A或聚C尾通常分别包括至少50个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少250个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少350个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少450个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少650个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少700个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少750个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少800个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少850个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少900个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少950个腺苷或胞嘧啶核苷酸或者至少1kb腺苷或胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，聚A或聚C尾可以分别为约10至800个腺苷或胞嘧啶核苷酸(例如，约10至200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约50至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约100至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约150至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约200至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约250至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约300至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约350至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约400至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约450至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约500至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至100个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约20至70个腺苷或胞嘧啶核苷酸或者约20至60个腺苷或胞嘧啶核苷酸)。在一些实施方案中，尾结构包括本文所述的具有各种长度的聚(A)尾与聚(C)尾的组合。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的腺苷核苷酸。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的胞嘧啶核苷酸。

如本文所述，5'帽和/或3'尾的添加有助于检测在体外合成期间产生的流产性转录物，因为在没有加帽和/或加尾的情况下，那些过早流产的mRNA转录物的尺寸可能太小而无法被检测到。因此，在一些实施方案中，在测试mRNA的纯度(例如，mRNA中存在的流产性转录物的水平)之前，将5'帽和/或3'尾添加至所合成的mRNA。在一些实施方案中，在如本文所述纯化mRNA之前，将5'帽和/或3'尾添加至所合成的mRNA。在其他实施方案中，在如本文所述纯化mRNA之后，将5'帽和/或3'尾添加至所合成的mRNA。

根据本发明合成的mRNA可以在没有进一步纯化的情况下使用。特别地，根据本发明合成的mRNA可以在没有去除短体(shortmer)的步骤的情况下使用。在一些实施方案中，可以进一步纯化根据本发明合成的mRNA。可以使用各种方法来纯化根据本发明合成的mRNA。例如，可以使用离心、过滤和/或色谱方法进行mRNA的纯化。在一些实施方案中，通过乙醇沉淀或过滤或色谱法或者凝胶纯化或任何其他合适的手段来纯化所合成的mRNA。在一些实施方案中，通过HPLC纯化mRNA。在一些实施方案中，在本领域技术人员熟知的标准苯酚:氯仿:异戊醇溶液中提取mRNA。在一些实施方案中，使用切向流过滤纯化mRNA。合适的纯化方法包括美国专利申请公开号2016/0040154、美国专利申请公开号2015/0376220、2018年2月27日提交的标题为“用于纯化信使RNA的方法(METHODS FOR PURIFICATION OFMESSENGER RNA)”的国际专利申请PCT/US18/19954以及2018年2月27日提交的标题为“用于纯化信使RNA的方法(METHODS FOR PURIFICATION OF MESSENGER RNA)”的国际专利申请PCT/US18/19978中所述的纯化方法，将所有这些专利申请都通过引用并入本文；并且可以用于实践本发明。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前纯化mRNA。在一些实施方案中，在加帽和加尾之后纯化mRNA。在一些实施方案中，既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后纯化mRNA。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过离心纯化mRNA。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过过滤纯化mRNA。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过切向流过滤(TFF)纯化mRNA。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过色谱法纯化mRNA。

mRNA的表征

可以使用本领域可用的任何方法检测和定量mRNA的全长或流产性转录物。在一些实施方案中，使用印迹、毛细管电泳、色谱法、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染色、光谱法、紫外线(UV)或UPLC或其组合检测所合成的mRNA分子。本领域已知的其他检测方法被包括在本发明中。在一些实施方案中，使用UV吸收光谱法检测所合成的mRNA分子，并通过毛细管电泳进行分离。在一些实施方案中，首先通过乙二醛染料使mRNA变性，然后进行凝胶电泳(“乙二醛凝胶电泳”)。在一些实施方案中，在加帽或加尾之前对所合成的mRNA进行表征。在一些实施方案中，在加帽和加尾之后对所合成的mRNA进行表征。

在一些实施方案中，通过本文公开的方法产生的mRNA包含小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％的除全长mRNA之外的杂质。杂质包括IVT污染物，例如蛋白质、酶、游离核苷酸和/或短体。

在一些实施方案中，根据本发明产生的mRNA基本上不含短体或流产性转录物。特别地，根据本发明产生的mRNA含有通过毛细管电泳或乙二醛凝胶电泳不可检测水平的短体或流产性转录物。如本文所用，术语“短体”或“流产性转录物”是指小于全长的任何转录物。在一些实施方案中，“短体”或“流产性转录物”的长度小于100个核苷酸，长度小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20或小于10个核苷酸。在一些实施方案中，在添加5'帽和/或3'聚A尾之后对短体进行检测或定量。

mRNA溶液

在一些实施方案中，可以在待与脂质溶液混合的溶液中提供mRNA，使得mRNA可以被包封在脂质纳米颗粒中。合适的mRNA溶液可以是含有待以不同浓度包封的mRNA的任何水溶液。例如，合适的mRNA溶液可以含有浓度为或大于约0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml的mRNA。在一些实施方案中，合适的mRNA溶液可以含有在范围为约0.01-1.0mg/ml、0.01-0.9mg/ml、0.01-0.8mg/ml、0.01-0.7mg/ml、0.01-0.6mg/ml、0.01-0.5mg/ml、0.01-0.4mg/ml、0.01-0.3mg/ml、0.01-0.2mg/ml、0.01-0.1mg/ml、0.05-1.0mg/ml、0.05-0.9mg/ml、0.05-0.8mg/ml、0.05-0.7mg/ml、0.05-0.6mg/ml、0.05-0.5mg/ml、0.05-0.4mg/ml、0.05-0.3mg/ml、0.05-0.2mg/ml、0.05-0.1mg/ml、0.1-1.0mg/ml、0.2-0.9mg/ml、0.3-0.8mg/ml、0.4-0.7mg/ml或0.5-0.6mg/ml的浓度下的mRNA。在一些实施方案中，合适的mRNA溶液可以含有浓度为至多约5.0mg/ml、4.0mg/ml、3.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、0.09mg/ml、0.08mg/ml、0.07mg/ml、0.06mg/ml或0.05mg/ml的mRNA。

通常，合适的mRNA溶液还可以含有缓冲剂和/或盐。通常，缓冲剂可以包括HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾和磷酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂的合适浓度的范围可以为约0.1mM至100mM、0.5mM至90mM、1.0mM至80mM、2mM至70mM、3mM至60mM、4mM至50mM、5mM至40mM、6mM至30mM、7mM至20mM、8mM至15mM或9mM至12mM。在一些实施方案中，缓冲剂的合适浓度是或大于约0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM。

示例性盐可以包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。在一些实施方案中，mRNA溶液中盐的合适浓度的范围可以为约1mM至500mM、5mM至400mM、10mM至350mM、15mM至300mM、20mM至250mM、30mM至200mM、40mM至190mM、50mM至180mM、50mM至170mM、50mM至160mM、50mM至150mM或50mM至100mM。合适的mRNA溶液中的盐浓度为或大于约1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM。

在一些实施方案中，合适的mRNA溶液的pH的范围可以为约3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6或4.0-4.5。在一些实施方案中，合适的mRNA溶液的pH可以为或不大于约3.5、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.3和6.5。

可以使用各种方法来制备适合于本发明的mRNA溶液。在一些实施方案中，可以将mRNA直接溶解于本文所述的缓冲溶液中。在一些实施方案中，可以通过将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生mRNA溶液，然后与脂质溶液混合以供包封。在一些实施方案中，可以通过将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生mRNA溶液，然后立即与脂质溶液混合以供包封。在一些实施方案中，合适的mRNA储备溶液可以含有在水中的浓度为或大于约0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、或1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml或5.0mg/ml的mRNA。

在一些实施方案中，使用泵将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合。示例性泵包括但不限于齿轮泵、蠕动泵和离心泵。

通常，将缓冲溶液以大于mRNA储备溶液的速率的速率混合。例如，可以将缓冲溶液以mRNA储备溶液的速率的至少1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x或20x的速率混合。在一些实施方案中，将缓冲溶液以范围在约100-6000ml/min之间(例如，约100-300ml/min、300-600ml/min、600-1200ml/min、1200-2400ml/min、2400-3600ml/min、3600-4800ml/min、4800-6000ml/min或60-420ml/min)的流速混合。在一些实施方案中，将缓冲溶液以为或大于约60ml/min、100ml/min、140ml/min、180ml/min、220ml/min、260ml/min、300ml/min、340ml/min、380ml/min、420ml/min、480ml/min、540ml/min、600ml/min、1200ml/min、2400ml/min、3600ml/min、4800ml/min或6000ml/min的流速混合。

在一些实施方案中，将mRNA储备溶液以范围在约10-600ml/min之间(例如，约5-50ml/min、约10-30ml/min、约30-60ml/min、约60-120ml/min、约120-240ml/min、约240-360ml/min、约360-480ml/min或约480-600ml/min)的流速混合。在一些实施方案中，将mRNA储备溶液以为或大于约5ml/min、10ml/min、15ml/min、20ml/min、25ml/min、30ml/min、35ml/min、40ml/min、45ml/min、50ml/min、60ml/min、80ml/min、100ml/min、200ml/min、300ml/min、400ml/min、500ml/min或600ml/min的流速混合。

递送媒介物

此处所述的稳定的脂质纳米颗粒配制品适合作为mRNA的递送媒介物。

如本文所用，术语“递送媒介物”、“转移媒介物”、“纳米颗粒”或语法等效物可互换使用。

递送媒介物可以与一种或多种另外的核酸、载体、靶向配体或稳定试剂组合配制，或者配制于药物组合物(其中将它与合适的赋形剂混合)中。用于配制和施用药物的技术可见于“Remington's Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,最新版。基于促进将核酸转染到靶细胞中的能力来选择特定的递送媒介物。

脂质体递送媒介物

在一些实施方案中，合适的递送媒介物是脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒。如本文所用，脂质体递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)通常被表征为微型囊泡，其具有通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离的内部水空间。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，所述两亲性分子如合成或天然来源的脂质，其包含空间上分开的亲水结构域和疏水结构域(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性剂形成(例如，聚合物体(polymerosome)、类脂囊泡等)。在本发明的上下文中，脂质体递送媒介物通常用于将所需mRNA运输至靶细胞或靶组织。在一些实施方案中，纳米颗粒递送媒介物是脂质体。在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质和一种或多种经PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质体包含不超过三种不同的脂质组分。在一些实施方案中，一种不同的脂质组分是基于固醇的阳离子脂质。

阳离子脂质

如本文所用，短语“阳离子脂质”是指在所选pH(如生理pH)下具有净正电荷的多种脂质种类中的任一种。

用于本发明的组合物和方法中的合适阳离子脂质包括如国际专利公开案WO2010/144740中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2013/149140中所述的可电离的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式中的一个的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中R₁和R₂各自独立地选自氢，任选地经取代的、可变地饱和或不饱和的C₁-C₂₀烷基以及任选地经取代的、可变地饱和或不饱和的C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂各自独立地选自氢、任选地经取代的C₁-C₃₀烷基、任选地经取代的可变地不饱和的C₁-C₃₀烯基以及任选地经取代的C₁-C₃₀炔基；其中m和o各自独立地选自零和任何正整数(例如，其中m为三)；并且其中n为零或任何正整数(例如，其中n为一)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-l-基)二十四烷-15,18-二烯-1-胺(“HGT5000”)，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基)二十四烷-4,15,18-三烯-l-胺(“HGT5001”)，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基)二十四烷-5,15,18-三烯-1-胺(“HGT5002”)，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括在国际专利公开案WO 2010/053572中描述为氨基醇类脂质的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2016/118725中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2016/118724中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括具有式14,25-双十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的阳离子脂质及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2013/063468和WO 2016/205691中所述的阳离子脂质，将所述专利各自通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中R^L的每种情况独立地为任选地经取代的C₆-C₄₀烯基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2015/184256中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地为O或S；每个Y独立地为O或S；每个m独立地为0至20；每个n独立地为1至6；每个R_A独立地为氢、任选地经取代的C1-50烷基、任选地经取代的C2-50烯基、任选地经取代的C2-50炔基、任选地经取代的C3-10碳环基、任选地经取代的3-14元杂环基、任选地经取代的C6-14芳基、任选地经取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个R_B独立地为氢、任选地经取代的C1-50烷基、任选地经取代的C2-50烯基、任选地经取代的C2-50炔基、任选地经取代的C3-10碳环基、任选地经取代的3-14元杂环基、任选地经取代的C6-14芳基、任选地经取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“靶标23”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2016/004202中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如美国临时专利申请号62/758,179中所述的阳离子脂质，将所述临时专利申请通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中每个R¹和R²独立地为H或C₁-C₆脂肪族基团；每个m独立地为具有1至4的值的整数；每个A独立地为共价键或亚芳基；每个L¹独立地为酯、硫酯、二硫化物或酸酐基团；每个L²独立地为C₂-C₁₀脂肪族基团；每个X¹独立地为H或OH；并且每个R³独立地为C₆-C₂₀脂肪族基团。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217和Whitehead等人,Nature Communications(2014)5:4277中所述的阳离子脂质，将所述文献通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2015/199952中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/004143中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/075531中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中L¹或L²中的一个为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-；并且L¹或L²中的另一个为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、-NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-或直接键；G¹和G²各自独立地为未经取代的C₁-C₁₂亚烷基或C₁-C₁₂亚烯基；G³为C₁-C₂₄亚烷基、C₁-C₂₄亚烯基、C₃-C₈亚环烷基、C₃-C₈亚环烯基；R^a为H或C₁-C₁₂烷基；R¹和R²各自独立地为C₆-C₂₄烷基或C₆-C₂₄烯基；R³为H、OR⁵、CN、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或-NR⁵C(＝O)R⁴；R⁴为C₁-C₁₂烷基；R⁵为H或C₁-C₆烷基；并且x为0、1或2。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/117528中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/049245中所述的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括下式中的一个的化合物：

及其药学上可接受的盐。对于这四个式中的任一个，R₄独立地选自-(CH₂)_nQ和-(CH₂)_nCHQR；Q选自-OR、-OH、-O(CH₂)_nN(R)₂、-OC(O)R、-CX₃、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(H)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环；并且n为1、2或3。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/173054和WO 2015/095340中所述的阳离子脂质，将所述专利各自通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2012/170889中所述的可切割的阳离子脂质，将所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

其中R₁选自咪唑、胍基、氨基、亚胺、烯胺、任选地经取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，如二甲氨基)和吡啶基；其中R₂选自以下两个式中的一个：

并且其中R₃和R₄各自独立地选自任选地经取代的、可变地饱和或不饱和的C₆-C₂₀烷基以及任选地经取代的、可变地饱和或不饱和的C₆-C₂₀酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更大)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4001”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4002”(在本文中也称为“Guan-SS-Chol”)，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4003”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4004”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4005”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如2018年5月16日提交的美国临时专利申请号62/672,194中所述的可切割阳离子脂质，并且将所述临时专利申请通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有美国临时专利申请号62/672,194中所述的通式中的任一个或结构(1a)-(21a)和(1b)-(21b)和(22)-(237)中的任一个的阳离子脂质。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有根据式(I')的结构的阳离子脂质，

其中：

R^X独立地为-H、-L¹-R¹或-L^5A-L^5B-B'；

L¹、L²和L³中的每一个独立地为共价键、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-或-C(O)NR^L-；

每个L^4A和L^5A独立地为-C(O)-、-C(O)O-或-C(O)NR^L-；

每个L^4B和L^5B独立地为C₁-C₂₀亚烷基；C₂-C₂₀亚烯基；或C₂-C₂₀亚炔基；

每个B和B'为NR⁴R⁵或5至10元含氮杂芳基；

每个R¹、R²和R³独立地为C₆-C₃₀烷基、C₆-C₃₀烯基或C₆-C₃₀炔基；

每个R⁴和R⁵独立地为氢；C₁-C₁₀烷基；C₂-C₁₀烯基；或C₂-C₁₀炔基；并且

每个R^L独立地为氢、C₁-C₂₀烷基、C₂-C₂₀烯基或C₂-C₂₀炔基。

在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括作为62/672,194的化合物(139)的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

(“18:1碳尾-核糖脂质”)。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质N-[l-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)。(Feigner等人Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，将其通过引用并入本文)。适合于本发明的组合物和方法的其他阳离子脂质包括例如5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基酰胺(“DOGS”)；2,3-二油烯基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙烷铵(“DOSPA”)(Behr等人Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)；美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；l,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(“DODAP”)；l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(“DOTAP”)。

适合于本发明的组合物和方法的另外的示例性阳离子脂质还包括：l,2-二硬脂酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DSDMA”)；1,2-二油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DODMA”)；1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLinDMA”)；l,2-二亚麻烯基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLenDMA”)；N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-l-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“CLinDMA”)；2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-l-(顺,顺-9',l-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(“CpLinDMA”)；N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苄胺(“DMOBA”)；1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲氨基丙烷(“DOcarbDAP”)；2,3-二亚油酰氧基-Ν,Ν-二甲基丙胺(“DLinDAP”)；l,2-N,N'-二亚油烯基氨甲酰基-3-二甲氨基丙烷(“DLincarbDAP”)；l,2-二亚油酰氨甲酰基-3-二甲氨基丙烷(“DLinCDAP”)；2,2-二亚油烯基-4-二甲氨基甲基-[l,3]-二氧戊烷(“DLin-K-DMA”)；2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA”)；(2R)-2-((8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(“辛基-CLinDMA(2R)”)；(2S)-2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,fsl-二甲基3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(“辛基-CLinDMA(2S)”)；2,2-二亚油烯基-4-二甲氨基乙基-[l,3]-二氧戊烷(“DLin-K-XTC2-DMA”)；以及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,l2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊烷-4-基)-N,N-二甲基乙胺(“DLin-KC2-DMA”)(参见，WO 2010/042877，将其通过引用并入本文；Semple等人,Nature Biotech.28:172-176(2010))。(Heyes,J.等人,JControlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开案WO 2005/121348)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍基部分中的至少一种。在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油烯基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊烷(“XTC”)；(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(“ALNY-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“NC98-5”)。

在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为TL1-04D-DMA的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为GL-TES-SA-DME-E18-2的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为SY-3-E14-DMAPr的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为TL1-01D-DMA的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为TL1-10D-DMA的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为GL-TES-SA-DMP-E18-2的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为HEP-E4-E10的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括作为HEP-E3-E10的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按重量测量，其构成组合物(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按mol％测量，其构成组合物(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按重量测量，其构成组合物(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质含量的约30％-70％(例如，约30％-65％、约30％-60％、约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按mol％测量，其构成组合物(例如，脂质纳米颗粒)中总脂质含量的约30％-70％(例如，约30％-65％、约30％-60％、约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。

非阳离子/辅助脂质

在一些实施方案中，所提供的脂质体含有一种或多种非阳离子(“辅助”)脂质。如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”是指在所选pH(如生理pH)下携带净负电荷的多种脂质种类中的任一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其混合物。

在一些实施方案中，此类非阳离子脂质可以单独使用，但是优选地与其他脂质(例如，阳离子脂质)组合使用。在一些实施方案中，非阳离子脂质可以构成脂质体中存在的总脂质的约5％至约90％或约10％至约70％的摩尔比。在一些实施方案中，非阳离子脂质是中性脂质，即在配制和/或施用组合物的条件下不携带净电荷的脂质。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可以大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。

基于胆固醇的脂质

在一些实施方案中，所提供的脂质体包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、l,4-双(3-N-油烯基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或ICE。在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可以构成脂质体中存在的总脂质的约2％至约30％或约5％至约20％的摩尔比。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以大于5％、大于10％、大于20％、大于30％或大于40％。

经PEG修饰的脂质

本发明还考虑使用经聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生脂质如衍生神经酰胺(PEG-CER)(包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺))，单独地或优选地与其他脂质配制品(与其一起构成转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒))组合。所考虑的经PEG修饰的脂质包括但不限于共价附接至具有一条或多条C₆-C₂₀长度的烷基链的脂质的长度长达5kDa的聚乙二醇链。此类组分的添加可以防止复合物聚集，并且还可以提供用于增加脂质-核酸药物组合物的循环寿命并增加其至靶组织的递送的手段(Klibanov等人(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或者可以选择此类组分以在体内快速交换出配制品(参见美国专利号5,885,613)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的经PEG修饰的磷脂和衍生脂质可以构成脂质体转移媒介物中存在的总脂质的约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％或约2％的摩尔比。

根据各种实施方案，构成脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质和/或经PEG修饰的脂质以及此类脂质相对于彼此的相对摩尔比的选择是基于一种或多种所选脂质的特征、既定靶细胞的性质、待被递送的MCNA的特征。另外的考虑因素包括例如烷基链的饱和，以及一种或多种所选脂质的尺寸、电荷、pH、pKa、融合原性(fusogenicity)和毒性。因此，可以相应地调整摩尔比。

聚合物

在一些实施方案中，使用聚合物作为载体单独地或与包括本文所述的各种脂质在内的其他载体组合配制合适的递送媒介物。因此，在一些实施方案中，如本文所用的脂质体递送媒介物还涵盖包含聚合物的纳米颗粒。合适的聚合物可以包括例如聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、右旋糖酐、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原蛋白、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、PEG化鱼精蛋白、PLL、PEG化PLL和聚乙烯亚胺(PEI)。当PEI存在时，它可以是分子量的范围为10至40kDa的支链PEI，例如25kDa支链PEI(Sigma#408727)。

适用于本发明的脂质体

用于本发明的合适脂质体可以以不同比率包括任何本文所述的阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇脂质、经PEG修饰的脂质和/或聚合物中的一种或多种。作为非限制性例子，合适的脂质体配制品可以包括选自以下的组合：cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；C12-200、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；HGT4003、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；ICE、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；或ICE、DOPE和DMG-PEG2K。

在各种实施方案中，按摩尔比，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)构成脂质体的约30％-60％(例如，约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％或约35％-40％)。在一些实施方案中，按摩尔比，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)的百分比是脂质体的为或大于约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％。

在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种经PEG修饰的脂质的比率可以在约分别30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种经PEG修饰的脂质的比率为大约分别40:30:20:10。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种经PEG修饰的脂质的比率为大约分别40:30:25:5。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种经PEG修饰的脂质的比率为大约分别40:32:25:3。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种经PEG修饰的脂质的比率为大约50:25:20:5。

在特定实施方案中，用于本发明的脂质体包含由阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，DOPE或DEPE)、经PEG修饰的脂质(例如，DMG-PEG2K)和任选的胆固醇组成的脂质组分。特别适合包含在这样的脂质体中的阳离子脂质包括GL-TES-SA-DME-E18-2、TL1-01D-DMA、SY-3-E14-DMAPr、TL1-10D-DMA、HGT4002(在本文中也称为Guan-SS-Chol)、GL-TES-SA-DMP-E18-2、HEP-E4-E10、HEP-E3-E10和TL1-04D-DMA。已经发现这些阳离子脂质特别适用于通过经由雾化进行肺部递送而施用的脂质体。其中，HEP-E4-E10、HEP-E3-E10、GL-TES-SA-DME-E18-2、GL-TES-SA-DMP-E18-2、TL1-01D-DMA和TL1-04D-DMA表现特别好。

示例性脂质体包括GL-TES-SA-DME-E18-2、TL1-01D-DMA、SY-3-E14-DMAPr、TL1-10D-DMA、GL-TES-SA-DMP-E18-2、HEP-E4-E10、HEP-E3-E10和TL1-04D-DMA中的一种作为阳离子脂质组分，DOPE作为非阳离子脂质组分，胆固醇作为辅助脂质组分，以及DMG-PEG2K作为经PEG修饰的脂质组分。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与经PEG修饰的脂质的摩尔比可以在约分别30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与经PEG修饰的脂质的摩尔比为大约分别40:30:20:10。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与经PEG修饰的脂质的摩尔比为大约分别40:30:25:5。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与经PEG修饰的脂质的摩尔比为大约分别40:32:25:3。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与胆固醇与经PEG修饰的脂质的摩尔比为大约50:25:20:5。

在一些实施方案中，特别适合肺部递送的脂质体的脂质组分由HGT4002(在本文中也称为Guan-SS-Chol)、DOPE和DMG-PEG2K组成。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与经PEG修饰的脂质的摩尔比为大约60:35:5。

不同脂质组分的比率

在脂质纳米颗粒包含三种且不超过三种不同的脂质组分的实施方案中，总脂质含量的比率(即，脂质组分(1):脂质组分(2):脂质组分(3)的比率)可以表示为x:y:z，其中

(y+z)＝100–x。

在一些实施方案中，“x”、“y”和“z”中的每一个表示三种不同的脂质组分的摩尔百分比，并且所述比率是摩尔比。

在一些实施方案中，“x”、“y”和“z”中的每一个表示三种不同的脂质组分的重量百分比，并且所述比率是重量比。

在一些实施方案中，由变量“x”表示的脂质组分(1)是基于固醇的阳离子脂质。

在一些实施方案中，由变量“y”表示的脂质组分(2)是辅助脂质。

在一些实施方案中，由变量“z”表示的脂质组分(3)是PEG脂质。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在实施方案中，变量“x”不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。在实施方案中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在实施方案中，变量“x”不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。在实施方案中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％或约5％至约10％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％或约5％至约10％。

对于具有三种且仅三种不同的脂质组分的组合物，变量“x”、“y”和“z”可以呈任何组合，只要这三个变量的总和相加为总脂质含量的100％即可。

包封mRNA的脂质体的形成

用于本发明的组合物的脂质体转移媒介物可以通过本领域目前已知的各种技术来制备。用于所提供的组合物的脂质体可以通过本领域目前已知的各种技术来制备。例如，可以根据常规技术制备多层囊泡(MLV)，如通过使所选脂质沉积在合适的容器或器皿的内壁上(通过将脂质溶解在适当的溶剂中，然后蒸发溶剂以在器皿内部留下薄膜)或通过喷雾干燥来制备。然后可以伴随涡旋运动向器皿中添加水相，这导致MLV的形成。然后可以通过均质化、超声处理或挤出多层囊泡来形成单层囊泡(ULV)。另外，可以通过洗涤剂去除技术形成单层囊泡。

在某些实施方案中，所提供的组合物包含脂质体，其中mRNA既缔合于脂质体的表面上，也包封在相同的脂质体内。例如，在制备本发明的组合物期间，阳离子脂质体可以经由静电相互作用与mRNA缔合。例如，在制备本发明的组合物期间，阳离子脂质体可以经由静电相互作用与mRNA缔合。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括包封在脂质体中的mRNA。在一些实施方案中，可以将一种或多种mRNA种类包封在相同的脂质体中。在一些实施方案中，可以将一种或多种mRNA种类包封在不同的脂质体中。在一些实施方案中，将mRNA包封在一种或多种脂质体中，所述脂质体在其脂质组成、脂质组分的摩尔比、尺寸、电荷(ζ电位)、靶向配体和/或其组合的方面是不同的。在一些实施方案中，一种或多种脂质体可以具有不同组成的基于固醇的阳离子脂质、中性脂质、经PEG修饰的脂质和/或其组合。在一些实施方案中，一种或多种脂质体可以具有不同摩尔比的用于产生脂质体的基于胆固醇的阳离子脂质、中性脂质和经PEG修饰的脂质。

将所需mRNA掺入脂质体中的过程通常被称为“加样”。示例性方法描述于Lasic等人,FEBS Lett.,312:255-258,1992中，将所述文献通过引用并入本文。掺入脂质体的核酸可以完全或部分位于脂质体的内部空间中，脂质体的双层膜内，或与脂质体膜的外表面相关。将核酸掺入脂质体中在本文中也被称为“包封”，其中核酸完全包含在脂质体的内部空间内。将mRNA掺入转移媒介物(如脂质体)中的目的通常是保护核酸免受可能含有降解核酸的酶或化学品和/或导致核酸快速排泄的系统或受体的环境的影响。因此，在一些实施方案中，合适的递送媒介物能够增强其中所含的mRNA的稳定性和/或促进mRNA向靶细胞或组织的递送。

根据本发明的合适脂质体可以制备成各种尺寸。在一些实施方案中，所提供的脂质体可以制备成比先前已知的mRNA包封脂质体更小。在一些实施方案中，减小的脂质体尺寸与mRNA的更有效递送相关。选择适当的脂质体尺寸可以考虑靶细胞或组织的位点以及在某种程度上脂质体将用于的应用。

在一些实施方案中，选择适当尺寸的脂质体以促进由mRNA编码的抗体的全身分布。在一些实施方案中，可能需要限制mRNA向某些细胞或组织的转染。例如，为了靶向肝细胞，脂质体的大小可以被确定成使得其尺寸小于肝脏中肝窦内衬的内皮层的窗孔；在这样的情况下，脂质体可以容易地穿透此类内皮窗孔以到达靶肝细胞。

可替代地或另外地，脂质体的大小可以被确定成使得脂质体的尺寸具有足够的直径以限制或明确避免分布到某些细胞或组织中。

本领域已知的多种替代方法可用于确定脂质体群体的尺寸。一种这样的确定尺寸的方法描述于美国专利号4,737,323(通过引用并入本文)中。通过浴或探针超声处理对脂质体悬浮液进行超声处理产生逐渐的尺寸减小，减小到直径小于约0.05微米的小ULV。均质化是另一种依靠剪切能将大的脂质体片段化成小的脂质体的方法。在典型的均质化程序中，通过标准乳液匀浆器使MLV再循环，直到观察到所选脂质体尺寸，通常在约0.1与0.5微米之间。可以通过准电光散射(quasi-electric light scattering，QELS)确定脂质体的尺寸，如Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,10:421-150(1981)(通过引用并入本文)中所述。可以通过对所形成的脂质体进行超声处理来减小平均脂质体直径。间歇超声处理循环可以与QELS评估交替，以指导有效的脂质体合成。

组合物的治疗用途

在一个方面，本发明尤其提供了包封可用于治疗目的的mRNA的LNP配制品。例如，在一些实施方案中，LNP包封的mRNA编码受试者体内缺乏的蛋白质。例如，mRNA可以编码用于治疗膀胱炎纤维化的CFTR。编码CFTR的合适mRNA描述于例如WO 2020/106946和PCT/US20/44158中，将所述专利各自通过引用以其整体并入本文。作为另一个例子，mRNA可以编码用于治疗鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症的OTC，描述于例如WO 2017/218524中，将所述专利的内容以其整体并入本文。

在一些实施方案中，LNP包封的mRNA编码编码疫苗抗原(如SARS-CoV-2抗原)的蛋白质。此类SARS-CoV-2抗原描述于U.S.63/021,319中，将所述专利的内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，mRNA是经密码子优化的。各种密码子优化的方法是本领域已知的。

基因疗法

在一些实施方案中，本文所述的LNP配制品适合于包含经密码子优化的核酸的药物组合物，所述经密码子优化的核酸编码用于治疗有需要的受试者的蛋白质。在一些实施方案中，使用本文所述的包含rAAV载体的药物组合物来治疗有需要的受试者。本发明的含有rAAV载体或颗粒的药物组合物含有药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。合适的药物载体的例子是本领域熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。药物组合物可以呈冻干形式。此类载体可以通过常规方法配制，并且以治疗有效量施用至受试者。

将rAAV载体经由合适的途径施用至有需要的受试者。在一些实施方案中，通过静脉内、腹膜内、皮下或皮内途径施用rAAV载体。在一个实施方案中，静脉内施用rAAV载体。在实施方案中，皮内施用包括通过使用“基因枪”或生物弹道颗粒递送系统施用。在一些实施方案中，经由非病毒脂质纳米颗粒施用rAAV载体。例如，包含rAAV载体的组合物可以包含一种或多种稀释剂、缓冲液、脂质体、脂质、脂质复合物。在一些实施方案中，rAAV载体被包含在微球体或纳米颗粒(如脂质纳米颗粒或无机纳米颗粒)内。

在一些实施方案中，rAAV是假型化的。假型化rAAV是包含AAV衣壳蛋白和rAAV基因组的任何组合的感染性病毒。假型化rAAV可用于改变rAAV的组织或细胞特异性，并且可以单独使用或与非假型化rAAV结合使用，以将一个或多个基因转移到细胞(例如，哺乳动物细胞)中。例如，在已经对非假型化rAAV产生免疫应答的哺乳动物中，在施用非假型化rAAV之后可以使用假型化rAAV。来自任何AAV血清型的衣壳蛋白都可以与这样的rAAV基因组一起使用，其源自或可获自不同血清型的野生型AAV基因组，或者是嵌合基因组，即由来自两种或更多种不同血清型的AAV DNA形成，例如具有2个ITR(每个ITR来自不同的血清型)或嵌合ITR的嵌合基因组。使用嵌合基因组(如包含来自两种AAV血清型的ITR或嵌合ITR的嵌合基因组)可以导致定向重组，这可以进一步增强转录活性分子间多联体的产生。因此，本发明的rAAV载体内的5'和3'ITR可以是同源的，即来自相同的血清型；异源的，即来自不同的血清型；或嵌合的，即具有来自超过一种AAV血清型的ITR序列的ITR。

在一些实施方案中，rAAV载体是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11载体。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV1。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV2。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV3。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV4。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV5。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV6。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV7。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV8。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV9。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV10。在一些实施方案中，rAAV载体是AAV11。在一些实施方案中，rAAV载体是经序列优化的。在一些实施方案中，rAAV衣壳是经修饰的。例如，在一些实施方案中，rAAV8衣壳是经修饰的。

实施例

虽然已经根据某些实施方案具体描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本发明的化合物，并不旨在限制本发明。

实施例1.糖、缓冲液比率和pH对LNP稳定性的影响

进行分析以评估LNP在不同量的糖(此处为海藻糖)、不同的缓冲液强度和/或不同的pH水平的存在下的稳定性。总的来说，来自这些研究的数据表明，在较低的pH水平下，需要较高的最小缓冲液强度来维持稳定性。此外，结果还表明，当将糖(海藻糖)在配制品内维持在恒定的百分比时，随着配制品的pH上升，维持LNP稳定性所需的最小缓冲液强度下降。

图1A是这样的图，其表明在pH 7.5下，增加糖(海藻糖)在LNP配制品中的百分比导致LNP配制品中所需的最小缓冲液强度的伴随增加。图1B是这样的图，其表明当将海藻糖维持在恒定的百分比(即，2.7％)时，随着pH水平增加，最小缓冲液强度降低。

这些数据表明，在特定pH下需要较低的糖/缓冲液比率。此外，数据还表明，LNP配制品的pH越低，在特定糖浓度下稳定LNP所需的缓冲液强度越高。例如，如果将糖浓度维持恒定，则pH水平越低，维持LNP稳定性所需的缓冲液强度越高。

实施例2.降低缓冲液强度导致在脂质的pKa以下的稳定性更高

进行研究以评估脂质pKa依赖性行为。对于这些研究，分析了这样的LNP配制品，它们被配制成包含2.7％海藻糖和pH 4.5(使用柠檬酸盐缓冲液)。这些分析表明，降低缓冲液强度导致在脂质的pKa以下的LNP稳定性更高。具体而言，观察到LNP稳定性随着所测试的缓冲液强度的增加(即，1、10、20、50、75至100mM)而降低。这在图2中以图形格式说明。

这些数据表明，缓冲液强度在样品稀释后稳定LNP配制品方面更好。例如，在以下情况下在视觉上观察稳定性：1)2.7％海藻糖+100mM Tris pH 7.5(观察到溶液-澄清的)；2)2.7％海藻糖+20mM Tris pH 7.5+100mM NaCl(观察到溶液-破碎/浑浊的)；3)2.7％海藻糖+16mM Tris pH 7.5+220mM NaCl(观察到溶液-澄清的)。

总的来说，根据这些数据得出的结论是，需要维持较高的离子强度以防止LNP聚集，并由此得到mRNA稳定性。据推断，这可以以各种方式实现，例如通过1)具有高缓冲液强度(例如，100mM或更高)；2)将低缓冲液强度(例如，15-20mM)与高盐浓度(例如，200mM或更高)组合；或将中等缓冲液强度(例如，40-50mM)与中等盐浓度(例如，50-100mM)组合来实现。

实施例3.效力与稳定性

先前已经观察到，高效力LNP与更高量的LNP聚集和后续mRNA降解相关。研究了本文所述的LNP配制品，以确定这些配制品是否对获得包封mRNA的对聚集和后续mRNA降解具有抗性的LNP的能力有任何影响。

在6小时和25小时测试包封人促红细胞生成素(EPO)mRNA的各种LNP配制品的稳定性。先前已经发现所测试的LNP配制品易于发生聚集。如图3A和图3B所示，使用本文所述的LNP配制品允许成功配制出对聚集具有抗性的所需的高效力LNP。

图3A和图3B描绘了所测试的不同LNP配制品。来自图3B的数据来自这样的体内研究，在其中在小鼠给药后6小时或24小时分析所描述的LNP配制品。数据示出了当使用高效力脂质(包括例如具有高浓度DOPE的类脂质)时人EPO蛋白在6小时和24小时的表达。

图4A示出了在LNP配制品中测试的缓冲液和盐浓度的各种组合以及与各种LNP配制品相关的所得稀释后稳定性。数据与实施例2中呈现的结果一致，即需要较高的离子强度以防止LNP聚集，并由此得到mRNA稳定性。特别地，这些数据证实，将中等缓冲液强度(例如，40-50mM)与中等盐浓度(例如，50-125mM)组合产生稀释后稳定的LNP配制品。

图4B示出了总结LNP配制品的稀释后稳定性的表格。对于这些测定，LNP仅根据Tris或磷酸盐缓冲液浓度而变化。本研究中的LNP都在Tris或磷酸盐缓冲液和2.7％海藻糖中配制。如数据所示，在20mM缓冲液强度下达到配制品pH，然而，这些LNP配制品并不稳定。当缓冲液强度达到100mM或更高时，LNP配制品是稳定的。数据与实施例2中呈现的结果一致，即需要较高的离子强度以防止LNP聚集，并由此得到mRNA稳定性。

实施例4.糖与缓冲液的比率对包封效率和脂质纳米颗粒尺寸的影响

进行研究以评估糖与缓冲液的比率对配制品在-20℃下的稳定性的影响。对于这些研究，分析了这样的LNP配制品，它们以在0.9mg/ml至1.6mg/ml之间的起始mRNA浓度配制并且包含在0.19至0.47之间的示例性的海藻糖与PBS比率(表1)。在4℃和25℃下在LNP配制品的不同的海藻糖与PBS比率下评价包封效率(图5A和图5B)和脂质纳米颗粒尺寸(图6A和图6B)。这些分析表明，LNP配制品的较低的海藻糖与PBS比率有利于防止包封的减少和LNP尺寸的增加，从而导致LNP配制品的稳定性更高。总体而言，LNP配制品稳定性在低的糖与缓冲液比率下更高。这以图形格式说明，其示出了糖与缓冲液的比率对包封效率(图5A和图5B)和LNP尺寸(图6A和图6B)的影响。

表1.具有不同的海藻糖与PBS比率的LNP配制品

在不同的示例性时间点(0小时、1小时、3小时、6小时和24小时)评价包封效率，并且以图形方式描绘了在4℃(图5A)和25℃(图5B)下观察到的包封效率百分比。结果表明，在LNP配制品中，随着海藻糖与PBS比率的增加，观察到包封的减少，表明稳定性降低。在4℃下的结果是引人注目的，但是在25℃下观察到类似的趋势。

在不同的示例性时间点(0小时、1小时、3小时、6小时和24小时)测量LNP尺寸，并且以图形方式描绘了在4℃(图6A)和25℃(图6B)下观察到的LNP尺寸(以纳米计)。结果表明，在LNP配制品中，随着海藻糖与PBS比率的增加，观察到包封的减少，表明稳定性降低。在25℃下的结果是引人注目的，但是在4℃下观察到类似的趋势。

总体而言，来自这些研究的结果表明，低的海藻糖与PBS比率有利于包封增加和LNP尺寸减小，这对应于LNP的更高稳定性。

将本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用以其整体并入。另外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，并不旨在是限制性的。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但本文描述了合适的方法和材料。

等效方案

本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。本发明的范围并不旨在受限于上文说明书，而是如以下权利要求中所阐述：

Claims

1.一种包封编码肽或多肽的mRNA的对聚集和mRNA降解具有抗性的液体脂质纳米颗粒(LNP)配制品，所述LNP配制品包含：

a.具有脂质组分的一个或多个LNP，所述脂质组分包含阳离子脂质、非阳离子脂质、经PEG修饰的脂质和任选的胆固醇或由其组成；

b.包封在所述一个或多个脂质纳米颗粒内并且编码肽或多肽的mRNA；

c.糖或糖醇；

d.6.0至8.0的LNP配制品pH；

e.在最小缓冲离子强度下提供所述LNP配制品pH的pH缓冲液；

f.为所述LNP配制品提供离子强度的任选的一种或多种另外的试剂；

其中来自(e.)的pH缓冲液和来自(f.)的任选的一种或多种另外的试剂的总浓度为所述LNP配制品提供至少两倍于所述最小缓冲离子强度的离子强度。

2.根据权利要求1所述的LNP配制品，其中在-20℃下冷冻并再解冻三轮后，与在所述LNP配制品中仅具有所述最小缓冲离子强度而不是至少两倍于所述最小缓冲离子强度的离子强度的相同LNP配制品相比，所述LNP配制品展现出(i)更少的聚集、(ii)经包封的mRNA的更少的降解、或(iii)(i)和(ii)两者。

3.根据权利要求1所述的LNP配制品，其中所述非阳离子脂质选自1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE或1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。

4.根据权利要求3所述的LNP配制品，其中所述非阳离子脂质是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

5.根据权利要求4所述的LNP配制品，其中所述DOPE的脂质摩尔比为10％或更大，例如10％-30％。

6.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述阳离子脂质是类脂质，任选地其中所述类脂质的脂质摩尔比为40％-60％，例如40％-50％。

7.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述mRNA编码受试者体内缺乏的蛋白质。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的LNP配制品，其中所述mRNA编码疫苗抗原。

9.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述糖或糖醇选自右旋糖、山梨糖醇、海藻糖、蔗糖、棉子糖、右旋糖酐和菊粉。

10.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述糖是二糖。

11.根据权利要求10所述的LNP配制品，其中所述二糖的浓度为约1％-20％。

12.根据权利要求11所述的LNP配制品，其中所述二糖的浓度为约2.5％-3.0％。

13.根据权利要求12所述的LNP配制品，其中二糖与缓冲液的比率在0.2-0.5之间。

14.根据权利要求10-13中任一项所述的LNP配制品，其中所述二糖是海藻糖。

15.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述pH在约6.0与约8.0之间，例如6.0-7.0、6.5-7.5或7.0-8.0。

16.根据权利要求1所述的LNP配制品，其中所述pH是7.4。

17.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述pH缓冲液的pKa在6.0与8.2之间。

18.根据权利要求17所述的LNP配制品，其中所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、咪唑缓冲液、组氨酸缓冲液和Good's缓冲液。

19.根据权利要求18所述的LPN配制品，其中所述Good's缓冲液是Tris缓冲液或HEPES缓冲液。

20.根据权利要求18或19所述的LPN配制品，其中所述pH缓冲液是磷酸盐缓冲液(例如，柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液)、Tris缓冲液或咪唑缓冲液。

21.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述最小缓冲离子强度是至少75mM、至少100mM、至少125mM、至少150mM或至少200mM。

22.根据权利要求21所述的LNP配制品，其中所述最小缓冲离子强度是约75mM-200mM、75mM-150mM、75mM-100mM或100mM-200mM。

23.根据权利要求22所述的LNP配制品，其中所述最小缓冲离子强度在100mM-200mM之间。

24.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中提供离子强度的所述一种或多种试剂包括盐或糖。

25.根据权利要求24所述的LNP配制品，其中所述盐选自NaCl、KCl和CaCl₂，并且其中所述糖是海藻糖。

26.根据权利要求1-22中任一项所述的LNP配制品，其中提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度在约50-300mM、50-150mM或75-125mM之间。

27.根据权利要求26所述的LNP配制品，其中pH缓冲液的总浓度在约15-250mM、30-150mM或40-50mM之间。

28.根据权利要求26所述的LNP配制品，其中所述pH缓冲液和提供离子强度的所述一种或多种另外的试剂的总浓度选自约40mM Tris缓冲液和约50-200mM NaCl、约50mM Tris缓冲液和约50mM-200mM NaCl、约100mM Tris缓冲液和约50mM-200mM NaCl、约40mM咪唑和约50mM-200mM NaCl、约50mM咪唑和50mM-200mM NaCl、约100mM咪唑和50mM-200mM NaCl、约40mM磷酸盐和50mM-200mM NaCl、约50mM磷酸盐和50-200mM NaCl、约100mM磷酸盐和50-200mM NaCl。

29.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述LNP配制品的离子强度至少2.25倍于、至少2.5倍于、至少2.75倍于、至少3倍于、至少3.5倍于、至少4倍于、至少4.5倍于、至少5倍于所述最小缓冲离子强度。

30.根据权利要求1-28中任一项所述的LNP配制品，其中所述LNP配制品的离子强度不到20倍于、不到19倍于、不到18倍于、不到17倍于、不到16倍于、不到15倍于、不到14倍于、不到13倍于、不到12倍于、不到11倍于、不到10倍于、不到9倍于、不到8倍于、不到7倍于、不到6倍于、不到5倍于、不到4倍于所述最小缓冲离子强度。

31.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于所述最小缓冲离子强度，并且其中所述LNP配制品的离子强度在约150mM-750mM、150mM-500mM、150mM-400mM、150mM-300mM、150mM与200mM之间。

32.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述LNP配制品的离子强度至少两倍于且不到20倍于所述最小缓冲离子强度，并且其中所述LNP配制品的离子强度是或大于150mM。

33.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中通过浊度分析来确定更少的聚集。

34.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中通过浊度分析来确定经包封的mRNA的更少的降解。

35.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中在-20℃下冷冻并再解冻超过三轮后，与在所述LNP配制品中仅具有所述最小缓冲离子强度而不是至少两倍于所述最小缓冲离子强度的离子强度的相同LNP配制品相比，所述LNP配制品展现出(i)更少的聚集、(ii)经包封的mRNA的更少的降解、或(iii)(i)和(ii)两者。

36.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述LNP的直径小于约100nm。

37.根据权利要求32所述的LNP配制品，其中所述LNP的直径在约70nm-90nm之间。

38.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述脂质组分包含DMG-PEG-2000、cKK-E10、胆固醇和DOPE或由其组成。

39.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中N/P比在约3-5之间。

40.根据权利要求39所述的LNP配制品，其中N/P比是约4。

41.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述mRNA的最终浓度在约0.05mg/mL与1.0mg/mL之间。

42.根据权利要求41所述的LNP配制品，其中所述mRNA的浓度在约0.2mg/mL与0.5mg/mL之间。

43.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述LNP在-20℃下稳定至少3个月、6个月、12个月或超过12个月。

44.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中所述LNP配制品在稀释后是稳定的。

45.根据前述权利要求中任一项所述的LNP配制品，其中与不包含浓度为或低于300mM且pH在约7.0与7.5之间的缓冲液的配制品相比，所述配制品的皮下或肌内递送伴随着减轻的疼痛。

46.根据权利要求45所述的LNP配制品，其中通过10cm视觉模拟量表(VAS)或六项语言评定量表(VRS)评估经减轻的疼痛。

47.一种减少LNP降解和/或聚集的方法，所述方法包括将所述LNP储存在根据前述权利要求中任一项所述的配制品中。