CN115916158A

CN115916158A - 用于mRNA递送的脂质纳米颗粒配制品

Info

Publication number: CN115916158A
Application number: CN202180048752.3A
Authority: CN
Inventors: S·卡文; F·德罗萨; N·瓦加斯蒙托亚; A·汗莫哈米德
Original assignee: Translation Bio Co
Current assignee: Translation Bio Co
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2023-04-04
Also published as: EP4149425A1; CA3183399A1; WO2021231901A1; AU2021273502A1; US20210353556A1; JP2023526284A

Abstract

本发明尤其提供在不使用易燃溶剂的情况下将信使RNA包裹在脂质纳米颗粒中的方法，以及通过这些方法产生的组合物，以用于治疗用途中的mRNA递送。本发明部分基于如下令人惊讶的发现：可以在不使用乙醇溶剂的情况下在两亲性聚合物的存在下以高效率包裹mRNA。因此，本发明提供从大规模制造过程以及以低体积配制品产生LNP配制品的安全、划算且有效的方法，所述LNP配制品用于治疗应用。

Description

用于mRNA递送的脂质纳米颗粒配制品

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月15日提交的美国临时申请序列号63/025,355的权益和优先权，所述申请的公开内容通过引用以其整体特此并入。

背景技术

信使RNA(mRNA)疗法正在变成越来越重要的用于治疗多种疾病的方法。信使RNA疗法涉及将信使RNA施用至需要疗法的患者，以用于在患者体内产生由所述mRNA编码的蛋白质。脂质包裹的mRNA配制品如脂质纳米颗粒(LNP)组合物显示高度细胞摄取和蛋白质表达。脂质纳米颗粒配制品传统上使用乙醇作为脂质溶液的溶剂，然后将所述脂质溶液与mRNA溶液混合。

然而，易燃溶剂如乙醇的使用造成安全风险并增加生产成本，特别是在大规模应用中。另外，使用乙醇作为溶剂，目前也很难获得更适合于给药并减小下游处理体积和成本的低体积LNP配制品。低体积LNP配制品还因为它们允许床边混合以包括其他施用途径(例如，皮下或肌内)而是合意的。

发明内容

需要稳定、安全、划算的无乙醇LNP配制品，其具有用于在治疗用途中有效递送的高mRNA包裹效率。本发明尤其提供一种在不使用易燃溶剂的情况下将信使RNA包裹在脂质纳米颗粒中的稳定、安全、划算的方法，所述方法产生在治疗应用中具有用于mRNA递送的高包裹效率的LNP。在一个方面，本发明提供一种更安全且更划算的用于大规模制造过程的方法。在另一个方面，本发明提供一种用于以低体积产生LNP配制品的方法，其不仅减少制造中的下游处理，而且还适合于给药和床边混合，从而有利于包括皮下和肌内在内的多种施用途径。本发明是基于令人惊讶的如下发现：在两亲性聚合物的存在下将mRNA溶液与脂质溶液混合形成呈LNP配制品溶液的包裹在LNP内的mRNA(mRNA-LNP)。本发明尤其提供一种用于制备包含加载mRNA的脂质纳米颗粒的组合物的安全、有效且划算的方法。

在一个方面，本发明提供一种将信使RNA(mRNA)包裹在脂质纳米颗粒(LNP)中的方法，所述方法包括以下步骤：将(a)包含一种或多种mRNA的mRNA溶液与(b)包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种PEG修饰的脂质的脂质溶液混合，并且其中混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤包括在两亲性聚合物的存在下混合，以形成呈LNP配制品溶液的包裹在LNP内的mRNA(mRNA-LNP)。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含三种脂质组分。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含四种脂质组分。在特定实施方案中，所述脂质溶液的四种脂质组分是PEG修饰的脂质、阳离子脂质(例如ML-2或MC-3)、胆固醇和辅助(例如非阳离子)脂质(例如DSPC或DOPE)。

在一些实施方案中，所述两亲性聚合物包含普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)或其组合。因此，在一些实施方案中，所述两亲性聚合物包含普朗尼克。在一些实施方案中，所述两亲性聚合物包含聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，所述两亲性聚合物包含聚乙二醇。.

在一些实施方案中，所述PEG是三乙二醇单甲醚(mTEG)。在一些实施方案中，所述PEG是甲氧基聚乙二醇(mPEG)。在一些实施方案中，所述PEG是四乙二醇单甲醚。在一些实施方案中，所述PEG是五乙二醇单甲醚。在一些实施方案中，所述PEG是mTEG、mPEG、四乙二醇单甲醚和/或五乙二醇单甲醚的组合。

在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以大于25％体积/体积的浓度产生PEG。

在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约50％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约45％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约40％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约35％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约30％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约25％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约20％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约15％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约10％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约5％体积/体积的浓度包括PEG。在一些实施方案中，混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约1％体积/体积的浓度包括PEG。在特定实施方案中，所述PEG是mTEG。mTEG在所述mRNA-LNP配制品中特别合适的终浓度为约55％-65％体积/体积，例如约50％体积/体积。如例子中所示，mTEG的该终浓度维持mRNA溶解度和稳定性并且允许减小的处理体积和易于以更大规模制造所述配制品。

在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于5mM的柠檬酸盐，并且其中所述mRNA-LNP的包裹效率大于60％。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于5mM的柠檬酸盐，并且其中所述mRNA-LNP的包裹效率大于70％。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于5mM的柠檬酸盐，并且其中所述mRNA-LNP的包裹效率大于80％。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于5mM的柠檬酸盐，并且其中所述mRNA-LNP的包裹效率大于90％。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于5mM的柠檬酸盐，并且其中所述mRNA-LNP的包裹效率大于95％。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含小于5mM的柠檬酸盐，并且其中所述mRNA-LNP的包裹效率大于99％。

在一些实施方案中，所述mRNA溶液和/或所述脂质溶液处于大约环境温度下。

在一些实施方案中，所述环境温度低于约35℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约32℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约30℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约28℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约26℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约25℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约24℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约23℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约22℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约21℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约20℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约19℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约18℃。在一些实施方案中，所述环境温度低于约16℃。

在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约15-35℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约16-32℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约17-30℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约18-30℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约18-32℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约20-28℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约20-26℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约20-25℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约23-25℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约21-24℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约21-23℃。在一些实施方案中，所述环境温度的范围为约21-26℃。

在一些实施方案中，所述环境温度为约16℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约18℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约20℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约21℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约22℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约23℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约24℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约25℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约26℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约27℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约28℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约30℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约31℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约32℃。在一些实施方案中，所述环境温度为约35℃。

在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是二油酰磷脂酰甘油(DOPG)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是磷脂酰丝氨酸。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是鞘脂。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是脑苷脂。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是神经节苷脂。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是16-O-单甲基PE。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是16-O-二甲基PE。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是18-1-反式PE。在一些实施方案中，所述一种或多种非阳离子脂质是l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。

在一些实施方案中，所述mRNA溶液还包含海藻糖。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含20％海藻糖。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含15％海藻糖。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含10％海藻糖。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含5％海藻糖。

在一些实施方案中，所述方法不需要在所述混合步骤之前加热所述mRNA溶液和所述脂质溶液的步骤。

在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含每12L所述mRNA溶液大于约1gmRNA。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含每10L所述mRNA溶液大于约1g mRNA。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含每8L所述mRNA溶液约1g mRNA。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含每6L所述mRNA溶液大于约1g mRNA。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含每4L所述mRNA溶液约1g mRNA。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含每2L所述mRNA溶液约1g mRNA。在一些实施方案中，所述mRNA溶液包含每1L所述mRNA溶液大于约1g mRNA。

在一些实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度大于约0.05mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度大于约0.1mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度大于约0.125mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度大于约0.25mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度大于约0.5mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度大于约1.0mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度大于约1.5mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度大于约2.0mg/mL。在一些实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度在约0.05mg/mL与约0.5mg/mL之间。在特定实施方案中，所述mRNA溶液中的mRNA浓度在约0.1mg/mL至约0.5mg/mL之间，例如约0.1mg/mL或约0.35mg/mL。

在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以在1:1与10:1之间的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以在2:1与6:1之间的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约2:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约3:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约4:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约5:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约6:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以大于约2:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以大于约3:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以大于约4:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以大于约5:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以大于约6:1的比率(v/v)混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液(例如约100％mTEG-脂质溶液)以1-8:1，例如1-4:1的比率(v/v)混合。在特定实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液(例如约100％mTEG-脂质溶液)以约1:1的比率(v/v)混合。如例子中所示，mRNA溶液与所述脂质溶液的该比率维持mRNA溶解度和稳定性并允许减小的处理体积和易于以更大规模制造所述配制品。

在一些实施方案中，所述mRNA溶液的pH在2.5与5.5之间。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的pH在3.0与5.0之间。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的pH在3.5与4.5之间。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的pH为约3.0。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的pH为约3.5。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的pH为约4.0。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的pH为约4.5。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的pH为约5.0。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的pH为约5.5。

在一些实施方案中，所述混合步骤以在约3与10mL之间的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以在约1与10mL之间的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以在约1与15mL之间的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约1mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约2mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约3mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约4mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约5mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约6mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约7mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约8mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约9mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约10mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约12mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约13mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约14mL的总体积进行。在一些实施方案中，所述混合步骤以约15mL的总体积进行。

在一些实施方案中，所述方法不包括醇。

在一些实施方案中，所述方法还包括孵育所述mRNA-LNP的步骤。在一些实施方案中，所述方法还包括在混合后孵育所述mRNA-LNP的步骤。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在21℃与65℃之间的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在25℃与60℃之间的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在30℃与55℃之间的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在35℃与50℃之间的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约26℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约30℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约31℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约32℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约35℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约36℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约38℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约40℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约42℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约45℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约50℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约55℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约60℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP在约65℃的温度下孵育。

在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约20分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约30分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约40分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约50分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约60分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约70分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约80分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约90分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约100分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育大于约120分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约30分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约40分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约50分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约60分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约70分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约80分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约90分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约100分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约120分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约150分钟。在一些实施方案中，将所述mRNA-LNP孵育约180分钟。

在一些实施方案中，所述脂质溶液不包含醇。

在一些实施方案中，所述脂质溶液还包含一种或多种基于胆固醇的脂质。

在一些实施方案中，通过切向流过滤纯化所述mRNA-LNP。

在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于200nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于150nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于100nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于95nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于90nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于85nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于80nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于75nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于70nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于65nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于60nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于55nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于50nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于45nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于40nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小小于35nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小的范围为35nm至65nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小的范围为40-70nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小的范围为40nm至60nm。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的平均大小的范围为45nm至55nm。

在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的PDI小于约0.3。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的PDI小于约0.2。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的PDI小于约0.18。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的PDI小于约0.15。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的PDI小于约0.12。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的PDI小于约0.10。

在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约60％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约65％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约70％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约75％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约80％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约85％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约90％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约95％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约96％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约97％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约98％。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的包裹效率大于约99％。

在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的N/P比率在1至10之间。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的N/P比率在2至6之间。在一些实施方案中，所述mRNA-LNP的N/P比率为约4。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以在1至10之间的N/P比率混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以在2至6之间的N/P比率混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约2的N/P比率混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约4的N/P比率混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约6的N/P比率混合。在特定实施方案中，将所述mRNA溶液与脂质溶液以约4的N/P比率混合。如例子中所示，这样的N/P比率产生具有合适的大小和包裹效率的LNP以用于治疗用途。

在一些实施方案中，将5g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将10g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将15g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将20g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将25g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将30g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将40g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将50g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将75g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将100g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将150g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将200g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将250g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将500g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将750g或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将1kg或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将5kg或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，将10kg或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。

在一些实施方案中，通过无脉冲流泵混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液。在一些实施方案中，所述泵是齿轮泵。在一些实施方案中，所述泵是离心泵。

在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以如下范围的流速混合：约150-250ml/分钟、250-500ml/分钟、500-1000ml/分钟、1000-2000ml/分钟、2000-3000ml/分钟、3000-4000ml/分钟、4000-5000ml/分钟、6000-8000ml/分钟、8000-10000ml/分钟或10000-12000ml/分钟。

在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以如下流速混合：约100ml/分钟、约200ml/分钟、约500ml/分钟、约800ml/分钟、约1000ml/分钟、约1200ml/分钟、约2000ml/分钟、约3000ml/分钟、约4000ml/分钟、约5000ml/分钟、约6000ml/分钟、约8000ml/分钟、约10000ml/分钟、约12000ml/分钟或约15000ml/分钟。

在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约100ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约200ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约400ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约500ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约600ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约800ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约1000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约1200ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约1400ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约1600ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约1800ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约2000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约2400ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约3000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约4000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约5000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约6000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约7000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约8000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约9000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约10000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约12000ml/分钟的流速混合。在一些实施方案中，将所述mRNA溶液以约15000ml/分钟的流速混合。

在一些实施方案中，加工所述脂质溶液以如下范围的流速混合：约25-75ml/分钟、约75-200ml/分钟、约200-350ml/分钟、约350-500ml/分钟、约500-650ml/分钟、约650-850ml/分钟或约850-1000ml/分钟。在一些实施方案中，加工所述脂质溶液以如下流速混合：约50ml/分钟、约100ml/分钟、约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟、约400ml/分钟、约450ml/分钟、约500ml/分钟、约550ml/分钟、约600ml/分钟、约650ml/分钟、约700ml/分钟、约750ml/分钟、约800ml/分钟、约850ml/分钟、约900ml/分钟、约950ml/分钟、约1000ml/分钟、约1200ml/分钟或约1500ml/分钟。

在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速与所述脂质溶液的流速相同。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的2倍。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的3倍。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的4倍。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的4.5倍。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的5倍。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的5.5倍。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的6倍。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的8倍。在一些实施方案中，所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的10倍。

在一些实施方案中，通过所述方法制备一种包含包裹在脂质纳米颗粒中的mRNA的组合物。

在一些实施方案中，所述组合物包含1g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含5g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含10g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含15g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含20g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含25g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含50g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含75g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含100g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含125g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含150g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含250g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含500g或更多的mRNA。在一些实施方案中，所述组合物包含1kg或更多的mRNA。

在一些实施方案中，所述mRNA包含一种或多种修饰的核苷酸。

在一些实施方案中，所述mRNA是未修饰的。

在一些实施方案中，所述mRNA大于约0.5kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约1kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约2kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约3kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约4kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约5kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约6kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约8kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约10kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约20kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约30kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约40kb。在一些实施方案中，所述mRNA大于约50kb。

在一些实施方案中，所述脂质溶液包含四种脂质组分。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含PEG修饰的脂质、阳离子脂质(例如ML-2或MC-3)、辅助(例如非阳离子)脂质(例如DSPC或DOPE)以及任选地胆固醇。在一些实施方案中，所述LNP中一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为35-55:5-35:20-40:1-15。在特定实施方案中，将以mTEG作为溶剂(例如，100％mTEG)的脂质溶液与mRNA水溶液(例如，柠檬酸盐缓冲液)以1:1-4(例如约1:1)的体积比率混合，其中mRNA的终浓度为约0.05-0.5mg/mL，并且所述LNP中一种或多种阳离子脂质与一种或多种非-阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为35-55:25-35:20-40:1-15(例如约40:30:25:5)，使得所述一种或多种阳离子脂质与mRNA的N/P比率为约2-6(例如约4)。如例子中所示，这些制剂特别适合用于本发明的配制品中，因为它们确保合适的mRNA-LNP大小和包裹功效。此外，此类具有高脂质和mRNA浓度的mRNA-LNP配制品在减小处理体积并由此提高制造中的易处理性方面是有利的。

在一些实施方案中，使用少量挥发性有机化合物或不使用挥发性有机化合物纯化所述mRNA。在一些实施方案中，在不含挥发性有机化合物的过程中纯化所述mRNA。在一些实施方案中，在无醇过程中纯化所述mRNA。在一些实施方案中，使用无异丙醇过程纯化所述mRNA。在一些实施方案中，使用无苯甲醇过程纯化所述mRNA。

在一些实施方案中，在不含挥发性有机化合物的过程中将所述mRNA纯化并包裹在LNP中。在一些实施方案中，在无醇过程中将所述mRNA纯化并包裹在LNP中。在一些实施方案中，在不包括挥发性有机化合物的过程中将所述mRNA包裹在LNP中。在一些实施方案中，在不包括醇的过程中将所述mRNA包裹在LNP中。

本发明的其他特征、目的和优势在下文的详细说明、图式和权利要求中是清楚的。然而，应理解，尽管所述详细说明、所述图式和所述权利要求陈述了本发明的实施方案，但它们是仅以说明而非限制的方式给出的。本发明范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得清楚。

附图说明

以下图示仅用于说明目的而非用于限制。

图1是描绘来自小鼠的平均辐射率p/s/cm²/sr的图，所述小鼠被施用包裹在无乙醇配制品(即，mTEG)中或包裹在含乙醇配制品中的萤火虫萤光素酶(FFL)mRNA-LNP。此外，数据还显示从以高体积(1:4脂质溶液:mRNA溶液)或以低体积(1:1脂质溶液:mRNA溶液)制备的配制品获得的数据。

图2是描绘来自小鼠的以ng/mg总蛋白计的总鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)的图，所述小鼠被施用包裹在无乙醇配制品(即mTEG)中的OTC mNRA-LNP。数据还显示从以高体积(1:4脂质溶液:mRNA溶液)或以低体积(1:1脂质溶液:mRNA溶液)制备的配制品获得的数据。

定义

为了更容易地理解本发明，下文首先定义某些术语。以下术语和其他术语的另外的定义陈述于整个说明书中。本文中提到的用于描述本发明的背景和提供关于本发明实践的另外的细节的出版物和其他参考材料通过引用特此并入。

术语“或更多”、“至少”、“超过”等，例如，“至少一”应理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或超过所述值。还包括其间的任何更大的数字或分数。

反之，术语“不超过”包括小于所述值的每一个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间的任何更小的数字或分数。

术语“多个/多种”、“至少两个/至少两种”、“两个或更多个/两种或更多种”、“至少第二个/至少第二种”等应理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或更多。还包括其间的任何更大的数字或分数。

氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”以其最广泛含义指代可以掺入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有通用结构H₂N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指在天然存在的肽中常见的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文所用，“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)和/或取代。肽中的氨基酸(包括羧基末端和/或氨基末端氨基酸)可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基和/或用其他化学基团取代来修饰，其可以改变所述肽的循环半衰期但不会对其活性造成不良影响。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可以包含一个或翻译后修饰，如与一个或多个化学实体(例如，甲基、乙酸基、乙酰基、磷酸基、甲酰基部分、类异戊二烯基团、硫酸基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)缔合。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用，并且可以指代游离氨基酸和/或指代肽的氨基酸残基。根据使用所述术语的语境将清楚，所述术语是指游离氨基酸还是指肽的残基。

动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、基因工程化的动物和/或克隆。

大约或约：如本文所用，如应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与所述参考值类似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内。除非上下文另外清楚，否则本文提供的所有数值都被术语“大约”或“约”修饰。

批次：如本文所用，术语“批次”是指同时纯化(例如，在同一制造周期期间根据单一制造指令纯化)的mRNA的数量或量。批次可以是指在一个反应中纯化的mRNA的量。

生物活性的：如本文所用，短语“生物活性的”是指在生物系统中、特别是在生物体中具有活性的任何药剂的特征。例如，在被施用至生物体时对该生物体具有生物作用的药剂被认为是生物活性的。

包含(Comprising)：如本文所用，术语“包含(comprising)”或变体如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为暗示包括所述要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组，但是不排除任何其他要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的组。

组合：如本文所用，术语“组合”可与混合或共混互换使用。组合是指将具有不同特性的离散的LNP颗粒在同一溶液中放在一起，例如，组合mRNA-LNP与空LNP，以获得mRNA-LNP组合物。在一些实施方案中，两种LNP的组合是以所组合组分的特定比率来进行。在一些实施方案中，从所述组合获得的所得组合物具有与其组分中的任何一种或两种不同的特性。

递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部和全身递送二者。例如，mRNA的递送涵盖如下情况，其中将mRNA递送至靶组织并且所编码的蛋白质被表达和保留于靶组织内(也称为“局部分布”或“局部递送”)；以及如下情况，其中将mRNA递送至靶组织并且所编码的蛋白质被表达和分泌至患者的循环系统(例如，血清)中，并且全身分布且由其他组织吸收(也称为“全身分布”或“全身递送)。在一些实施方案中，递送是肺递送，例如，包括雾化。

dsRNA：如本文所用，术语“dsRNA”是指在体外转录(IVT)反应期间互补RNA序列的产生。互补RNA序列可以由于多种原因而产生，所述原因包括例如可以与新生RNA链中的互补序列杂交的短流产性转录物、用作RNA依赖性非DNA依赖性RNA转录的引物的短流产性转录物以及可能的RNA聚合酶模板逆转。

功效：如本文所用，术语“功效”或语法等效物是指生物相关终点的改进，如与编码相关蛋白质或肽的mRNA的递送相关。

包裹：如本文所用，术语“包裹”或其语法等效物是指将核酸分子限制在纳米颗粒内的过程。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指将mRNA翻译为多肽(例如，抗体的重链或轻链)、将多个多肽(例如，抗体的重链或轻链)组装为完整蛋白质(例如，抗体)和/或对多肽或完全组装的蛋白质(例如，抗体)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”和语法等效物可互换使用。

功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是呈如下形式的生物分子，在所述形式中，其展现其特征性的特性和/或活性。

改进、增加或减少：如本文所用，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等效物指示相对于基线测量值的值，所述基线测量值如在开始本文所述的治疗之前在同一个体中的测量值，或者在不存在本文所述的治疗的情况下在对照受试者(或多名对照受试者)中的测量值。“对照受试者”是受与所治疗受试者所患疾病相同的疾病形式折磨的受试者，其年龄与所治疗受试者大致相同。

杂质：如本文所用，术语“杂质”是指限制量的液体、气体或固体内部与目标材料或化合物的化学组成不同的物质。杂质也被称为“污染物”。

体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中(例如，在试管或反应器皿中、在细胞培养中等)，而不是在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体(如人和非人动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的情况下，所述术语可以用于指代在活细胞内(与例如体外系统相反)发生的事件。

分离的：如本文所用，术语“分离的”是指如下物质和/或实体：已经被(1)与最初产生时(在自然界中和/或在实验环境中)与其相连的至少一些组分分开，和/或(2)人工地产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％的最初与其相连的其他组分分开。在一些实施方案中，分离的药剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过约99％纯。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则所述物质是“纯的”。如本文所用，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲液、溶剂、水等)。

脂质体：如本文所用，术语“脂质体”是指任何层状、多层或固体纳米颗粒囊泡。通常，如本文所用的脂质体可以通过混合一种或多种脂质或者通过混合一种或多种脂质与一种或多种聚合物来形成。在一些实施方案中，适合于本发明的脂质体含有一种或多种阳离子脂质和任选地一种或多种非阳离子脂质、任选地一种或多种基于胆固醇的脂质和/或任选地一种或多种PEG修饰的脂质。

局部分布或递送：如本文所用，术语“局部分布”、“局部递送”或语法等效物是指组织特异性递送或分布。通常，局部分布或递送需要由mRNA编码的肽或蛋白质(例如，酶)在细胞内翻译和表达或分泌受限，以避免进入患者的循环系统。

信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用的mRNA涵盖修饰的和未修饰的RNA。mRNA可以含有一个或多个编码区和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在合适的情况下，例如，在化学合成分子的情形中，mRNA可以包含核苷类似物(如具有化学修饰的碱基或糖的类似物)、骨架修饰等。除非另有指示，否则mRNA序列以5'至3'方向呈现。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然核苷(例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、假尿苷和5-甲基胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；嵌入的碱基；修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。

mRNA完整性：如本文所用，术语“mRNA完整性”通常是指mRNA的质量。在一些实施方案中，mRNA完整性是指在纯化过程后未降解的mRNA的百分比。mRNA完整性可以使用本领域中熟知的方法来确定，例如，通过RNA琼脂糖凝胶电泳(例如，Ausubel等人,John Weley&Sons,Inc.,1997,Current Protocols in Molecular Biology)来确定。

N/P比率：如本文所用，术语“N/P比率”是指脂质纳米颗粒中阳离子脂质中的带正电荷的分子单元相对于包裹在该脂质纳米颗粒内的mRNA中的带负电荷的分子单元的摩尔比。像这样，通常将N/P比率计算为脂质纳米颗粒中阳离子脂质中的胺基的摩尔数相对于包裹在该脂质纳米颗粒内的mRNA中的磷酸基的摩尔数的比率。例如，每摩尔mRNA的阳离子脂质的4倍摩尔过量被称作“N/P比率”为约4。

核酸：如本文所用，术语“核酸”以其最广泛含义指代被掺入或可以被掺入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯键被掺入或可以被掺入多核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指单独核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含单独核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即，具有除了磷酸二酯骨架外的类似物。例如，本领域中已知且在骨架中用肽键代替磷酸二酯键的所谓的“肽核酸”被认为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可以包括内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并任选地纯化，化学合成等。在合适的情况下，例如，在化学合成分子的情形中，核酸可以包含核苷类似物(如具有化学修饰的碱基或糖的类似物)、骨架修饰等。除非另有指示，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；嵌入的碱基；修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。在一些实施方案中，本发明具体涉及“未修饰的核酸”，意指尚未进行化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。

患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以被施用所提供的组合物的任何生物体，例如，用于实验、诊断、预防、化妆和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施方案中，患者是人。人包括出生前和出生后形式。

药学上可接受的：如本文所用的术语“药学上可接受的”是指如下物质：在合理的医学判断的范围内适用于与人类和动物的组织接触且没有过度毒性、刺激、过敏反应或者其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。

药学上可接受的盐：药学上可接受的盐是本领域中熟知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences(1977)66:1-19中详细描述药学上可接受的盐。本发明的化合物的药学上可接受的盐包括从合适的无机和有机酸和碱衍生的那些。药学上可接受的无毒的酸加成盐的例子是氨基基团与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或与有机酸(如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用本领域中使用的其他方法(如离子交换)形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬酯酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对-甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。从适当的碱衍生的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N⁺(C_1-4烷基)₄盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。其他药学上可接受的盐在适当时包括使用反荷离子如卤根、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子。其他药学上可接受的盐包括使用适当的亲电体(例如，卤代烷)形成季铵化烷基化氨基盐，从胺的季铵化形成的盐。

沉淀：如本文所用，术语“沉淀”(或其任何语法等效物)是指在溶液中形成固体。在结合mRNA使用时，术语“沉淀”是指在液体中形成不溶或固体形式的mRNA。

过早流产的RNA序列：如本文所用的术语“过早流产的RNA序列”、“短流产性RNA种类”、“短体(shortmer)”和“长流产性RNA种类”是指mRNA合成反应(例如，体外合成反应)的不完全产物。出于多种原因，RNA聚合酶并非总是完全转录DNA模板；例如，RNA合成过早终止。RNA合成过早终止的可能原因包括DNA模板的质量、模板中存在的特定聚合酶的聚合酶终止子序列、降解缓冲液、温度、核糖核苷酸的耗尽以及mRNA二级结构。过早流产的RNA序列可能具有小于期望转录产物的预期长度的任何长度。例如，过早流产的mRNA序列可以为小于1000个碱基、小于500个碱基、小于100个碱基、小于50个碱基、小于40个碱基、小于30个碱基、小于20个碱基、小于15个碱基、小于10个碱基或更小。

盐：如本文所用，术语“盐”是指确实或者可能从酸与碱之间的中和反应得到的离子化合物。

全身分布或递送：如本文所用，术语“全身分布”、“全身递送”或语法等效物是指影响全身或整个生物体的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送通过身体的循环系统(例如，血流)来完成。与“局部分布或递送”的定义相比较。

受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施方案中，受试者是人类。受试者可以是患者，其是指呈现给医疗提供者用于诊断或治疗疾病的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换使用。受试者可能受疾病或障碍折磨或者易患疾病或障碍，但是可能展示或可能不展示所述疾病或障碍的症状。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现目的特征或特性的总体或接近总体范围或程度的定性情况。生物领域的普通技术人员将理解，生物和化学现象很少(如果有过的话)完成和/或进行至完成或者实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕捉在许多生物和化学现象中固有的潜在完整性缺乏。

基本上不含：如本文所用，术语“基本上不含”是指其中存在相对极少量的要去除的物质(例如，过早流产的RNA序列)的状态。例如，“基本上不含过早流产的RNA序列”意指过早流产的RNA序列以小于大约5％、4％、3％、2％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更少(w/w)杂质的水平存在。可替代地，“基本上不含过早流产的RNA序列”意指过早流产的RNA序列以小于约100ng、90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng、10ng、1ng、500pg、100pg、50pg、10pg或更低的水平存在。

靶组织：如本文所用，术语“靶组织”是指受要治疗的疾病影响的任何组织。在一些实施方案中，靶组织包括展示疾病相关病状、症状或特征的那些组织。

治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”意指在被施用至患有或易患疾病、障碍和/或病症的受试者时，足以治疗、诊断、预防所述疾病、障碍和/或病症和/或延迟其一种或多种症状的发作的量。本领域普通技术人员将了解，治疗有效量通常通过包括至少一个单位剂量的给药方案来施用。

治疗：如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防特定疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状或特征、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发病率的任何方法。可以将治疗施用至未展现疾病体征和/或仅展现疾病早期体征的受试者，用于降低发展与所述疾病相关的病状的风险的目的。

产率：如本文所用，术语“产率”是指如与作为起始材料的总mRNA相比，在包裹后回收的mRNA的百分比。在一些实施方案中，术语“回收率”可与术语“产率”互换使用。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域普通技术人员一般理解的以及与本申请所属领域常用的相同的含义；这样的技术通过引用以其整体并入。在冲突的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。

具体实施方式

本发明尤其提供在配制品中不使用乙醇或其他易燃溶剂的情况下，用于包含包裹在脂质纳米颗粒中的mRNA的配制品的方法和组合物。因此，本公开文本提供制备和使用稳定、安全、划算的无乙醇LNP配制品的方法，所述配制品具有高mRNA包裹效率用于治疗用途的有效mRNA递送。

本发明的各个方面详细描述于以下章节中。章节的使用不欲限制本发明。每个章节可以适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。

包裹mRNA的脂质体(mRNA-LNP)

本文公开的将mRNA包裹至脂质纳米颗粒中的方法可以应用于本领域中目前已知的多种技术。多种方法描述于以下文献中：公开的美国申请号US 2011/0244026、公开的美国申请号US 2016/0038432、公开的美国申请号US 2018/0153822、公开的美国申请号US2018/0125989以及2019年7月23日提交的美国临时申请号62/877,597，并且可以用于实践本发明，所有所述申请都是通过引用并入本文。包裹mRNA的常规方法包括在不首先使脂质预成形为脂质纳米颗粒的情况下将mRNA与脂质混合物混合，如US2016/0038432中所述，也称为方法A。可替代地，通过将预成形的脂质纳米颗粒与mRNA混合来包裹信使RNA(mRNA)的另一种方法称为方法B，如US 2018/0153822中所述。

对于核酸的递送，实现高包裹效率对于在体内保护药物物质(例如，mRNA)和减少活性损失是重要的。因此，增强由mRNA编码的蛋白质或肽的表达及其治疗效果与mRNA包裹效率高度相关。

为了实现使用方法A的高包裹效率，所述方法通常包括加热或将热量施加于10mM柠檬酸盐缓冲液中的一种或多种溶液，以实现或维持高于环境温度的温度。如公开的美国申请号US 2016/0038432中所述，加热一种或多种溶液增加mRNA包裹效率和回收率。此外，方法A通常包括10-100mM柠檬酸盐作为mRNA和/或脂质溶液中的缓冲液。可替代地，高包裹率可以在混合前不加热mRNA和/或脂质溶液的方法中通过在mRNA溶液中使用低浓度柠檬酸盐(即，≤5mM)来实现。

mRNA溶液

可以使用多种方法来制备适合于本发明的mRNA溶液。在一些实施方案中，可以将mRNA直接溶解于本文所述的缓冲溶液中。在一些实施方案中，可以在与脂质溶液混合以供包裹之前通过将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来生成mRNA溶液。在一些实施方案中，可以在与脂质溶液混合以供包裹之后立即通过将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合来生成mRNA溶液。在一些实施方案中，合适的mRNA储备溶液可以在水中以如下浓度含有mRNA：为或大于约0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、或1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml或5.0mg/ml。在一些实施方案中，合适的mRNA储备溶液以如下浓度含有mRNA：为或大于约1mg/ml、约10mg/ml、约50mg/ml或约100mg/ml。在一些实施方案中，mRNA储备溶液在水中以约0.05mg/mL与约0.5mg/mL之间的浓度含有mRNA。在特定实施方案中，mRNA储备溶液在水中以如下浓度含有mRNA：约0.1mg/mL至约0.5mg/mL，例如约0.1mg/mL或约0.35mg/mL。

通常，合适的mRNA溶液还可以含有缓冲剂和/或盐。通常，缓冲剂可以包括HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾和磷酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂的合适的浓度的范围可以为约0.1mM至100mM、0.5mM至90mM、1.0mM至80mM、2mM至70mM、3mM至60mM、4mM至50mM、5mM至40mM、6mM至30mM、7mM至20mM、8mM至15mM或9至12mM。在一些实施方案中，缓冲剂的合适的浓度的范围可以为2.0mM至4.0mM。

在一些实施方案中，缓冲溶液包含小于约5mM的柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲溶液包含小于约3mM的柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲溶液包含小于约1mM的柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲溶液包含小于约0.5mM的柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲溶液包含小于约0.25mM的柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲溶液包含小于约0.1mM的柠檬酸盐。在一些实施方案中，缓冲溶液不含柠檬酸盐。

示例性盐可以包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。在一些实施方案中，mRNA溶液中合适的盐浓度的范围可以为约1mM至500mM、5mM至400mM、10mM至350mM、15mM至300mM、20mM至250mM、30mM至200mM、40mM至190mM、50mM至180mM、50mM至170mM、50mM至160mM、50mM至150mM或50mM至100mM。合适的mRNA溶液中的盐浓度为或大于约1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或100mM。

在一些实施方案中，缓冲溶液包含约300mM NaCl。在一些实施方案中，缓冲溶液包含约200mM NaCl。在一些实施方案中，缓冲溶液包含约175mM NaCl。在一些实施方案中，缓冲溶液包含约150mM NaCl。在一些实施方案中，缓冲溶液包含约100mM NaCl。在一些实施方案中，缓冲溶液包含约75mM NaCl。在一些实施方案中，缓冲溶液包含约50mM NaCl。在一些实施方案中，缓冲溶液包含约25mM NaCl。

在一些实施方案中，合适的mRNA溶液的pH范围可以为约3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6或4.0-4.5。在一些实施方案中，合适的mRNA溶液的pH可以为或不大于约3.5、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.1、6.3和6.5。

在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约5.0。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约4.8。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约4.7。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约4.6。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约4.5。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约4.4。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约4.3。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约4.2。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约4.1。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约4.0。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约3.9。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约3.8。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约3.7。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约3.6。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约3.5。在一些实施方案中，缓冲溶液的pH为约3.4。

在一些实施方案中，使用泵将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合。示例性泵包括但不限于无脉冲流泵、齿轮泵、蠕动泵和离心泵。

通常，缓冲溶液以大于mRNA储备溶液的速率的速率进行混合。例如，缓冲溶液可以以比mRNA储备溶液的速率大至少1x、2x、3x、4x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、15x或20x的速率进行混合。在一些实施方案中，缓冲溶液以范围在约100-6000ml/分钟之间(例如，约100-300ml/分钟、300-600ml/分钟、600-1200ml/分钟、1200-2400ml/分钟、2400-3600ml/分钟、3600-4800ml/分钟、4800-6000ml/分钟或60-420ml/分钟)的流速进行混合。在一些实施方案中，缓冲溶液以为或大于约60ml/分钟、100ml/分钟、140ml/分钟、180ml/分钟、220ml/分钟、260ml/分钟、300ml/分钟、340ml/分钟、380ml/分钟、420ml/分钟、480ml/分钟、540ml/分钟、600ml/分钟、1200ml/分钟、2400ml/分钟、3600ml/分钟、4800ml/分钟或6000ml/分钟的流速进行混合。

在一些实施方案中，mRNA储备溶液以范围在约10-600ml/分钟之间(例如，约5-50ml/分钟、约10-30ml/分钟、约30-60ml/分钟、约60-120ml/分钟、约120-240ml/分钟、约240-360ml/分钟、约360-480ml/分钟或约480-600ml/分钟)的流速进行混合。在一些实施方案中，mRNA储备溶液以为或大于约5ml/分钟、10ml/分钟、15ml/分钟、20ml/分钟、25ml/分钟、30ml/分钟、35ml/分钟、40ml/分钟、45ml/分钟、50ml/分钟、60ml/分钟、80ml/分钟、100ml/分钟、200ml/分钟、300ml/分钟、400ml/分钟、500ml/分钟或600ml/分钟的流速进行混合。

在一些实施方案中，mRNA储备溶液以范围在约10-30ml/分钟之间、约30-60ml/分钟之间、约60-120ml/分钟之间、约120-240ml/分钟之间、约240-360ml/分钟之间、约360-480ml/分钟之间或约480-600ml/分钟之间的流速进行混合。在一些实施方案中，mRNA储备溶液以约20ml/分钟、约40ml/分钟、约60ml/分钟、约80ml/分钟、约100ml/分钟、约200ml/分钟、约300ml/分钟、约400ml/分钟、约500ml/分钟或约600ml/分钟的流速进行混合。

在一些实施方案中，mRNA溶液处于环境温度下。在一些实施方案中，mRNA溶液处于约20-25℃的温度下。在一些实施方案中，mRNA溶液处于约21-23℃的温度下。在一些实施方案中，在与脂质溶液混合之前不加热mRNA溶液。在一些实施方案中，将mRNA溶液保持在环境温度下。

脂质溶液

根据本发明，脂质溶液含有适合于形成用于包裹mRNA的脂质纳米颗粒的脂质混合物。根据本发明，在一些实施方案中，合适的脂质溶液不含乙醇、异丙醇或任何其他易燃有机溶剂。

合适的脂质溶液可以以多种浓度含有所需脂质的混合物。例如，合适的脂质溶液可以以如下总浓度含有所需脂质的混合物：为或大于约0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml、7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml或100mg/ml。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可以以范围如下的总浓度含有所需脂质的混合物：约0.1-100mg/ml、0.5-90mg/ml、1.0-80mg/ml、1.0-70mg/ml、1.0-60mg/ml、1.0-50mg/ml、1.0-40mg/ml、1.0-30mg/ml、1.0-20mg/ml、1.0-15mg/ml、1.0-10mg/ml、1.0-9mg/ml、1.0-8mg/ml、1.0-7mg/ml、1.0-6mg/ml或1.0-5mg/ml。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可以以如下总浓度含有所需脂质的混合物：高达约100mg/ml、90mg/ml、80mg/ml、70mg/ml、60mg/ml、50mg/ml、40mg/ml、30mg/ml、20mg/ml或10mg/ml。

任何所需脂质可以以适合于包裹mRNA的任何比率进行混合。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述混合物包括阳离子脂质、辅助脂质(例如非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)、两亲性嵌段共聚物(例如泊洛沙姆)和/或PEG化脂质。在一些实施方案中，合适的脂质溶液含有所需脂质的混合物，所述混合物包括一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质(例如非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和一种或多种PEG化脂质。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含三种脂质组分。在一些实施方案中，所述脂质溶液包含四种脂质组分。在特定实施方案中，所述脂质溶液的三种或四种脂质组分是PEG修饰的脂质、阳离子脂质(例如ML-2或MC-3)、辅助(例如非阳离子)脂质(例如DSPC或DOPE)以及任选地胆固醇。

在一些实施方案中，脂质溶液处于环境温度下。在一些实施方案中，脂质溶液处于约20-25℃的温度下。在一些实施方案中，脂质溶液处于约21-23℃的温度下。在一些实施方案中，在与脂质溶液混合之前不加热脂质溶液。在一些实施方案中，将脂质溶液保持在环境温度下。

在某些实施方案中，所提供的组合物包含脂质体，其中mRNA既缔合于所述脂质体的表面上且包裹在同一脂质体内。例如，在本发明的组合物的制备期间，阳离子脂质体可以经由静电相互作用与mRNA缔合。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括包裹在脂质体中的mRNA。在一些实施方案中，可以经一种或多种mRNA种类包裹在同一脂质体中。在一些实施方案中，可以将一种或多种mRNA种类包裹在不同脂质体中。在一些实施方案中，将mRNA包裹在一种或多种脂质体中，所述脂质体在其脂质组成、脂质组分的摩尔比、大小、电荷(ζ电位)、靶向配体和/或其组合的方面是不同的。在一些实施方案中，一种或多种脂质体可以具有基于固醇的阳离子脂质、中性脂质、PEG修饰的脂质和/或其组合的不同组成。在一些实施方案中，一种或多种脂质体可以具有不同摩尔比的用于产生脂质体的基于胆固醇的阳离子脂质、中性脂质和PEG修饰的脂质。

包裹方法

如本文所用，用于形成加载mRNA的脂质纳米颗粒(mRNA-LNP)的方法可与术语“mRNA包裹”或其语法变体互换使用。在一些实施方案中，通过将mRNA溶液与脂质溶液混合来形成mRNA-LNP，其中在混合之前将所述mRNA溶液和/或所述脂质溶液保持在环境温度下。

在一些实施方案中，将mRNA溶液和脂质溶液混合至溶液中，使得所述mRNA被包裹在所述脂质纳米颗粒中。这样的溶液也称为配制或包裹溶液。

在一些实施方案中，例如，可以将根据本发明的无乙醇的LNP配制品与包括诸如乙醇的溶剂的常规乙醇LNP配制或包裹溶液相比较。在先前使用乙醇作为溶剂的LNP配制品中，配制品以约10％-40％体积包含乙醇。其他先前LNP配制品以约10％至约40％体积使用异丙醇作为溶剂。相比之下，在一些实施方案中，本发明提供一种不包括易燃溶剂的LNP包裹方法。

因此，在一些实施方案中，本发明的合适的配制或包裹溶液不包括易燃溶剂。在一些实施方案中，合适的配制或包裹溶液不包括乙醇。

在一些实施方案中，合适的配制或包裹溶液还可以含有缓冲剂或盐。示例性缓冲剂可以包括HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾和磷酸钠。示例性盐可以包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。

在一些实施方案中，在mRNA的添加期间不存在乙醇、柠檬酸盐缓冲液和其他去稳定剂，并且因此配制品不需要任何进一步的下游处理。在一些实施方案中，配制溶液包含海藻糖。去稳定剂的缺乏和海藻糖溶液的稳定性使包裹mRNA的脂质纳米颗粒的配制和产生更易于按比例放大。

在一些实施方案中，脂质溶液含有一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种PEG脂质。在一些实施方案中，脂质还含有一种或多种胆固醇脂质。

在一些实施方案中，使用泵系统混合脂质和mRNA溶液。在一些实施方案中，泵系统包含无脉冲流泵。在一些实施方案中，泵系统是齿轮泵。在一些实施方案中，合适的泵是蠕动泵。在一些实施方案中，合适的泵是离心泵。在一些实施方案中，使用泵系统的方法以大规模进行。例如，在一些实施方案中，所述方法包括使用如本文所述的泵混合至少约1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、500mg、1g、10g、50g或100g或更多的mRNA的溶液与脂质溶液，以产生包裹在脂质纳米颗粒中的mRNA。在一些实施方案中，混合mRNA与脂质溶液的方法提供根据本发明的组合物，其含有至少约1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、500mg、1g、10g、50g或100g或更多的包裹的mRNA。

在一些实施方案中，将包裹mRNA的脂质纳米颗粒与脂质溶液组合的步骤是使用泵系统来进行。这样的组合可以使用泵来进行。在一些实施方案中，mRNA和脂质溶液以范围如下的流速进行混合：约25-75ml/分钟、约75-200ml/分钟、约200-350ml/分钟、约350-500ml/分钟、约500-650ml/分钟、约650-850ml/分钟或约850-1000ml/分钟。在一些实施方案中，mRNA溶液和脂质溶液以如下流速进行混合：约50ml/分钟、约100ml/分钟、约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟、约400ml/分钟、约450ml/分钟、约500ml/分钟、约550ml/分钟、约600ml/分钟、约650ml/分钟、约700ml/分钟、约750ml/分钟、约800ml/分钟、约850ml/分钟、约900ml/分钟、约950ml/分钟或约1000ml/分钟。

在一些实施方案中，mRNA溶液与脂质溶液的混合在没有任何泵的情况下进行。

在一些实施方案中，根据本发明的方法包括将包含脂质的溶液、包含mRNA的溶液和包含包裹mRNA的脂质纳米颗粒的混合溶液中的一种或多种维持在环境温度下(即，不从热源向溶液施加热量)。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之前将mRNA溶液和脂质溶液中的一种或两种维持在环境温度下的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤期间将包含脂质的溶液和包含mRNA的溶液中的一种或多种维持在环境温度下。在一些实施方案中，所述方法包括在混合步骤之后将包裹mRNA的脂质纳米颗粒维持在环境温度下的步骤。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的所述环境温度为或低于约35℃、30℃、25℃、20℃或16℃。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的所述环境温度的范围为约15-35℃、约15-30℃、约15-25℃、约15-20℃、约20-35℃、约25-35℃、约30-35℃、约20-30℃、约25-30℃或约20-25℃。在一些实施方案中，一种或多种溶液所维持的所述环境温度为20-25℃。

在一些实施方案中，根据本发明的方法包括在环境温度下进行混合mRNA与脂质溶液以形成包裹mRNA的脂质纳米颗粒的步骤。

在一些实施方案中，大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的纯化的纳米颗粒的大小小于约150nm(例如，小于约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm或约50nm)。在一些实施方案中，基本上全部纯化的纳米颗粒的大小小于150nm(例如，小于约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm或约50nm)。在一些实施方案中，大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化的纳米颗粒的大小的范围为50-150nm。在一些实施方案中，基本上全部纯化的纳米颗粒的大小的范围为50-150nm。在一些实施方案中，大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的纯化的纳米颗粒的大小的范围为80-150nm。在一些实施方案中，基本上全部纯化的纳米颗粒的大小的范围为80-150nm。

在一些实施方案中，根据本发明的方法导致大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的包裹率。在一些实施方案中，根据本发明的方法导致mRNA的大于约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％回收。

在一些实施方案中，根据本发明的配制品中的mRNA-LNP包裹效率与乙醇LNP配制品中的mRNA-LNP包裹效率相同。

在一些实施方案中，与乙醇LNP配制品相比，根据本发明的配制品中的mRNA-LNP包裹效率高至少2％。在一些实施方案中，与乙醇LNP配制品相比，根据本发明的配制品中的mRNA-LNP包裹效率高至少4％。在一些实施方案中，与乙醇LNP配制品相比，根据本发明的配制品中的mRNA-LNP包裹效率高至少5％。在一些实施方案中，与乙醇LNP配制品相比，根据本发明的配制品中的mRNA-LNP包裹效率高至少8％。在一些实施方案中，与乙醇LNP配制品相比，根据本发明的配制品中的mRNA-LNP包裹效率高至少10％。在一些实施方案中，与乙醇LNP配制品相比，根据本发明的配制品中的mRNA-LNP包裹效率高至少12％。在一些实施方案中，与乙醇LNP配制品相比，根据本发明的配制品中的mRNA-LNP包裹效率高至少15％。在一些实施方案中，与乙醇LNP配制品相比，根据本发明的配制品中的mRNA-LNP包裹效率高至少20％。

在一些实施方案中，根据本发明的方法包括在混合后孵育mRNA-LNP的步骤。在混合后孵育mRNA-LNP的步骤描述于2019年5月14日提交的美国临时申请号62/847,837中并且可以用于实践本发明，所有所述申请都是通过引用并入本文。

纯化

在一些实施方案中，将mRNA-LNP纯化和/或浓缩。可以使用多种纯化方法。在一些实施方案中，通过切向流过滤(TFF)方法纯化mRNA-LNP。在一些实施方案中，通过基于重力的正向流过滤(NFF)纯化mRNA-LNP。在一些实施方案中，通过任何其他合适的过滤方法纯化mRNA-LNP。在一些实施方案中，通过离心纯化mRNA-LNP。在一些实施方案中，通过色谱方法纯化mRNA-LNP。

递送媒介物

根据本发明，如本文所述的编码蛋白质或肽(例如，蛋白质或肽的全长、片段或部分)的mRNA可以作为裸RNA(未包装的)或经由递送媒介物来递送。如本文所用，术语“递送媒介物”、“转移媒介物”、“纳米颗粒”或语法等效物可互换使用。

递送媒介物可以与一种或多种另外的核酸、载体、靶向配体或稳定试剂组合配制，或者配制于药物组合物(其中将所述媒介物与合适的赋形剂混合)中。例如，包裹mRNA的脂质体可以如上文所述来形成。用于药物配制和施用的技术可以发现于以下文献中：“Remington's Pharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,伊士顿,宾夕法尼亚州,最新版。基于促进将核酸转染至靶细胞中的能力来选择特定递送媒介物。

在一些实施方案中，编码至少一种蛋白质或肽的mRNA可以经由单一递送媒介物来递送。在一些实施方案中，编码至少一种蛋白质或肽的mRNA可以经由一种或多种递送媒介物(每种具有不同组成)来递送。在一些实施方案中，一种或多种mRNA和/或包裹在同一脂质纳米颗粒内。在一些实施方案中，一种或多种mRNA包裹在单独的脂质纳米颗粒内。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒是空的。

根据多个实施方案，合适的递送媒介物包括但不限于基于聚合物的载体(如聚乙烯亚胺(PEI)、脂质纳米颗粒和脂质体、纳米脂质体、含有神经酰胺的纳米脂质体、脂蛋白体、天然和合成两种来源的外体、天然、合成和半合成层状体、纳米微粒、钙磷光体-硅酸盐纳米微粒、磷酸钙纳米微粒、二氧化硅纳米微粒、纳米晶体微粒、半导体纳米微粒、聚(D-精氨酸)、溶胶-凝胶、纳米树枝状聚合物、基于淀粉的递送系统、胶束、乳液、非离子表面活性剂囊泡(niosome)、多结构域-嵌段聚合物(乙烯基聚合物、聚丙基丙烯酸聚合物、动态聚共轭物)、干粉配制品、质粒、病毒、磷酸钙核苷酸、适配体、肽和其他矢量标签。还考虑使用生物纳米胶囊和其他病毒衣壳蛋白组装物作为合适的转移媒介物。(Hum.Gene Ther.2008年9月；19(9):887-95)。

脂质体递送媒介物

在一些实施方案中，合适的递送媒介物是脂质体递送媒介物，例如，脂质纳米颗粒。如本文所用，脂质体递送媒介物(例如，脂质纳米颗粒)通常特征为微型囊泡，其具有通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离的内部水空间。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，所述两亲性分子如合成或天然来源的脂质，其包含空间上分开的亲水结构域和疏水结构域(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性剂形成(例如，聚合物体(polymerosome)、非离子表面活性剂囊泡等)。在本发明的情况下，脂质体递送媒介物通常用于将所需核酸(例如，mRNA)运输至靶细胞或靶组织。在一些实施方案中，纳米颗粒递送媒介物是脂质体。在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质或者一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，脂质体包含不超过三种不同的脂质组分。在一些实施方案中，一种不同的脂质组分是基于固醇的阳离子脂质。

阳离子脂质

如本文所用，短语“阳离子脂质”是指多个脂质种类中的任一种，其在所选pH、如生理pH下具有净正电荷。

用于本发明的组合物和方法中的合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO2010/144740中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2013/149140中所述的可电离的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式之一的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中R₁和R₂各自独立地选自氢、任选地取代的、可变地饱和或不饱和的C₁-C₂₀烷基以及任选地取代的、可变地饱和或不饱和的C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂各自独立地选自氢、任选地取代的C₁-C₃₀烷基、任选地取代的可变地不饱和的C₁-C₃₀烯基以及任选地取代的C₁-C₃₀炔基；其中m和o各自独立地选自零和任何正整数(例如，在m为三的情况下)；并且其中n为零或任何正整数(例如，在n为一的情况下)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-l-基)二十四烷-15,18-二烯-1-胺(“HGT5000”)，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基)二十四烷-4,15,18-三烯-l-胺(“HGT5001”)，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基)二十四烷-5,15,18-三烯-1-胺(“HGT5002”)，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括国际专利公开案WO2010/053572中描述为氨基醇类脂质(lipidoid)的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2016/118725中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2016/118724中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括具有14,25-双十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷的式的阳离子脂质及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2013/063468和WO 2016/205691中所述的阳离子脂质，所述专利各自通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中R^L的每种情况独立地为任选地取代的C₆-C₄₀烯基。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2015/184256中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地为O或S；每个Y独立地为O或S；每个m独立地为0至20；每个n独立地为1至6；每个R_A独立地为氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个R_B独立地为氢、任选地取代的C1-50烷基、任选地取代的C2-50烯基、任选地取代的C2-50炔基、任选地取代的C3-10碳环基、任选地取代的3-14元杂环基、任选地取代的C6-14芳基、任选地取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“靶标23”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2016/004202中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如美国临时专利申请序列号62/758,179中所述的阳离子脂质，所述申请通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中每个R¹和R²独立地为H或C₁-C₆脂肪族基团；每个m独立地为具有1至4的值的整数；每个A独立地为共价键或亚芳基；每个L¹独立地为酯、硫代酸酯、二硫化物或酸酐基团；每个L²独立地为C₂-C₁₀脂肪族基团；每个X¹独立地为H或OH；并且每个R³独立地为C₆-C₂₀脂肪族基团。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如以下文献中所述的阳离子脂质：J.McClellan,M.C.King,Cell 2010,141,210-217和Whitehead等人,NatureCommunications(2014)5:4277，所述文献通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2015/199952中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/004143中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/075531中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中L¹或L²中的一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-；并且L¹或L²中的另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-或直接键；G¹和G²各自独立地为未取代的C₁-C₁₂亚烷基或C₁-C₁₂亚烯基；G³是C₁-C₂₄亚烷基、C₁-C₂₄亚烯基、C₃-C₈亚环烷基、C₃-C₈亚环烯基；R^a是H或C₁-C₁₂烷基；R¹和R²各自独立地为C₆-C₂₄烷基或C₆-C₂₄烯基；R³是H、OR⁵、CN、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或-NR⁵ C(＝O)R⁴；R⁴是C₁-C₁₂烷基；R⁵是H或C₁-C₆烷基；并且x是0、1或2。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/117528中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/049245中所述的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法的阳离子脂质包括下式之一的化合物：

及其药学上可接受的盐。对于这四个式中的任一个，R₄独立地选自-(CH₂)_nQ和-(CH₂)_nCHQR；Q选自-OR、-OH、-O(CH₂)_nN(R)₂、-OC(O)R、-CX₃、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(H)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环；并且n是1、2或3。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2017/173054和WO 2015/095340中所述的阳离子脂质，所述专利各自通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开案WO 2012/170889中所述的可切割的阳离子脂质，所述专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括下式的阳离子脂质：

其中R₁选自咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选地取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，如二甲氨基)和吡啶基；其中R₂选自以下两个式中的一个：

并且其中R₃和R₄各自独立地选自任选地取代的、可变地饱和或不饱和的C₆-C₂₀烷基以及任选地取代的、可变地饱和或不饱和的C₆-C₂₀酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十或更大)。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4001”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4002”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4003”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4004”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质“HGT4005”，其具有以下化合物结构：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际申请号PCT/US2019/032522中所述的可切割的阳离子脂质，并且所述申请通过引用并入本文。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有国际申请号PCT/US2019/032522中所述通式中的任一个或结构(1a)-(21a)和(1b)-(21b)和(22)-(237)中的任一个的阳离子脂质。在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括具有根据式(I')的结构的阳离子脂质，

其中：

R^X独立地为-H、-L¹-R¹或-L^5A-L^5B-B'；

L¹、L²和L³中的每一个独立地为共价键、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-或-C(O)NR^L-；

每个L^4A和L^5A独立地为-C(O)-、-C(O)O-或-C(O)NR^L-；

每个L^4B和L^5B独立地为C₁-C₂₀亚烷基；C₂-C₂₀亚烯基；或C₂-C₂₀亚炔基；

每个B和B'是NR⁴R⁵或5至10元含氮杂芳基；

每个R¹、R²和R³独立地为C₆-C₃₀烷基、C₆-C₃₀烯基或C₆-C₃₀炔基；

每个R⁴和R⁵独立地为氢、C₁-C₁₀烷基；C₂-C₁₀烯基；或C₂-C₁₀炔基；并且

每个R^L独立地为氢、C₁-C₂₀烷基、C₂-C₂₀烯基或C₂-C₂₀炔基。

在某些实施方案中，本发明的组合物和方法包括作为国际申请号PCT/US2019/032522的化合物(139)的阳离子脂质，其具有以下化合物结构：

(“18:1碳尾-核糖脂质”)。

在一些实施方案中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质N-[l-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)。(Feigner等人(Proc.Nat'l Acad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，其通过引用并入本文)。适合于本发明的组合物和方法的其他阳离子脂质包括例如5-羧基精基(spermyl)甘氨酸双十八烷基酰胺(“DOGS”)；2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙铵(“DOSPA”)(Behr等人Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)，美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；l,2-二油酰-3-二甲铵-丙烷(“DODAP”)；l,2-二油酰-3-三甲铵-丙烷(“DOTAP”)。

适合于本发明的组合物和方法的另外的示例性阳离子脂质还包括：l,2-二硬脂酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DSDMA”)；1,2-二油酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DODMA”)；1,2-二亚油酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLinDMA”)；l,2-二亚麻酰基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLenDMA”)；N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-l-(顺,顺-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“CLinDMA”)；2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基-l-(顺,顺-9',l-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(“CpLinDMA”)；N,N-二甲基-3,4-二油酰基氧基苄胺(“DMOBA”)；1,2-N,N'-二油酰基氨甲酰基-3-二甲氨基丙烷(“DOcarbDAP”)；2,3-二亚油酰氧基-Ν,Ν-二甲基丙胺(“DLinDAP”)；l,2-N,N'-二亚油酰基氨甲酰基-3-二甲氨基丙烷(“DLincarbDAP”)；l,2-二亚油酰氨甲酰基-3-二甲氨基丙烷(“DLinCDAP”)；2,2-二亚油酰基-4-二甲氨基甲基-[l,3]-二氧戊烷(“DLin-K-DMA”)；2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“辛基-CLinDMA”)；(2R)-2-((8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(“辛基-CLinDMA(2R)”)；(2S)-2-((8-[(3P)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,fsl-二甲基3-[(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(“辛基-CLinDMA(2S)”)；2,2-二亚油酰基-4-二甲氨基乙基-[l,3]-二氧戊烷(“DLin-K-XTC2-DMA”)；以及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,l 2-二烯-1-基)-l,3-二氧戊烷-4-基)-N,N-二甲基乙胺(“DLin-KC2-DMA”)(参见，WO 2010/042877，其通过引用并入本文；Semple等人,Nature Biotech.28:172-176(2010))。(Heyes,J.等人,JControlled Release 107:276-287(2005)；Morrissey,DV.等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开案WO 2005/121348)。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍部分中的至少一种。

在一些实施方案中，适合于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油酰基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊烷(“XTC”)；(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-胺(“ALNY-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“NC98-5”)。

在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按重量测量，其构成组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按mol％测量，其构成组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％。在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按重量测量，其构成组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按mol％测量，其构成组合物(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质含量的约30-70％(例如，约30-65％、约30-60％、约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。

非阳离子/辅助脂质

在一些实施方案中，脂质体含有一种或多种非阳离子(“辅助”)脂质。如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”是指多个脂质种类中的任一种，其在所选pH、如生理pH下携带净负电荷。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其混合物。

在一些实施方案中，非阳离子脂质是中性脂质，即，在配制和/或施用组合物的条件下不携带净电荷的脂质。

在一些实施方案中，这样的非阳离子脂质可以单独使用，但是优选地与其他脂质(例如，阳离子脂质)组合使用。

在一些实施方案中，非阳离子脂质可以以组合物中存在的总脂质的如下摩尔比(mol％)存在：约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％。在一些实施方案中，总非阳离子脂质可以以组合物中存在的总脂质的如下摩尔比(mol％)存在：约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可以为大于约5mol％、大于约10mol％、大于约20mol％、大于约30mol％或大于约40mol％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以为大于约5mol％、大于约10mol％、大于约20mol％、大于约30mol％或大于约40mol％。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比为不超过约5mol％、不超过约10mol％、不超过约20mol％、不超过约30mol％或不超过约40mol％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以为不超过约5mol％、不超过约10mol％、不超过约20mol％、不超过约30mol％或不超过约40mol％。

在一些实施方案中，非阳离子脂质可以以组合物中存在的总脂质的如下重量比(wt％)存在：约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％。在一些实施方案中，总非阳离子脂质可以以组合物中存在的总脂质的如下重量比(wt％)存在：约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％或约10％至约40％。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可以为大于约5wt％、大于约10wt％、大于约20wt％、大于约30wt％或大于约40wt％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以为大于约5wt％、大于约10wt％、大于约20wt％、大于约30wt％或大于约40wt％。在一些实施方案中，脂质体中非阳离子脂质的百分比为不超过约5wt％、不超过约10wt％、不超过约20wt％、不超过约30wt％或不超过约40wt％。在一些实施方案中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以为不超过约5wt％、不超过约10wt％、不超过约20wt％、不超过约30wt％或不超过约40wt％。

基于胆固醇的脂质

在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)、l,4-二(3-N-油酰基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美国专利号5,744,335)或咪唑胆固醇酯(ICE)，其具有以下结构，

在实施方案中，基于胆固醇的脂质是胆固醇。

在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可以包含脂质体中存在的总脂质的如下摩尔比(mol％)：约1％至约30％或约5％至约20％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以为大于约5mol％、大于约10mol％、大于约20mol％、大于约30mol％或大于约40mol％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以为不超过约5mol％、不超过约10mol％、不超过约20mol％、不超过约30mol％或不超过约40mol％。

在一些实施方案中，基于胆固醇的脂质可以以脂质体中存在的总脂质的如下重量比(wt％)存在：约1％至约30％或约5％至约20％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以为大于约5wt％、大于约10wt％、大于约20wt％、大于约30wt％或大于约40wt％。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以为不超过约5wt％、不超过约10wt％、不超过约20wt％、不超过约30wt％或不超过约40wt％。

PEG修饰的脂质

在一些实施方案中，脂质体包含一种或多种PEG化脂质。

例如，本发明还考虑聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生脂质如衍生神经酰胺(PEG-CER)(包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺))，其为单独的或优选地与其他脂质配制品(与其一起构成转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒))组合。

所考虑的PEG修饰的脂质包括但不限于共价附接至具有一条或多条C₆-C₂₀长度的烷基链的脂质的长度最大5kDa的聚乙二醇链。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质或PEG化脂质是PEG化胆固醇或PEG-2K。这样的组分的添加可以防止复杂聚集，并且还可以提供用于延长循环寿命和增加脂质-核酸组合物递送至靶组织的手段(Klibanov等人(1990)FEBSLetters,268(1):235-237)，或者可以选择它们以在体内从配制品快速交换出来(参见美国专利号5,885,613)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C₁₄或C₁₈)的PEG-神经酰胺。

本发明的PEG修饰的磷脂和衍生脂质可以包含脂质体转移媒介物中存在的总脂质的如下摩尔比：约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％或约2％。在一些实施方案中，按摩尔比，一种或多种PEG修饰的脂质构成总脂质的约4％。在一些实施方案中，按摩尔比，一种或多种PEG修饰的脂质构成总脂质的约5％。在一些实施方案中，按摩尔比，一种或多种PEG修饰的脂质构成总脂质的约6％。

两亲性嵌段共聚物

在一些实施方案中，合适的递送媒介物含有两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。可以使用多种两亲性嵌段共聚物来实践本发明。在一些实施方案中，两亲性嵌段共聚物也称为表面活性剂或非离子型表面活性剂。在一些实施方案中，适合于本发明的两亲性聚合物选自泊洛沙姆

泊洛沙胺

聚氧乙烯二醇山梨聚糖烷基酯(聚山梨酯)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

泊洛沙姆

在一些实施方案中，合适的两亲性聚合物是泊洛沙姆。例如，合适的泊洛沙姆具有以下结构：

其中a是在10与150之间的整数，并且b是在20与60之间的整数。例如，a为约12并且b为约20，或者a为约80并且b为约27，或者a为约64并且b为约37，或者a为约141并且b为约44，或者a为约101并且b为约56。

在一些实施方案中，适合于本发明的泊洛沙姆具有约10至约150个环氧乙烷单元。在一些实施方案中，泊洛沙姆具有约10至约100个环氧乙烷单元。

在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆84。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆101。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆105。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆108。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆122。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆123。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆124。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆181。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆182。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆183。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆184。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆185。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆212。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆215。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆217。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆231。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆234。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆235。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆237。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆238。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆282。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆284。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆288。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆304。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆331。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆333。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆334。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆335。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆338。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆401。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆402。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆403。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆407。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆是其组合。

在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约4,000g/mol至约20,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约1,000g/mol至约50,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约1,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约2,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约3,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约4,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约5,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约6,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约7,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约8,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约9,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约10,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约20,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约25,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约30,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约40,000g/mol。在一些实施方案中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约50,000g/mol。

其他两亲性聚合物

在一些实施方案中，两亲性聚合物是泊洛沙胺，例如，tetronic 304或tetronic904。

在一些实施方案中，两亲性聚合物是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，如分子量为3kDa、10kDa或29kDa的PVP。

在一些实施方案中，两亲性聚合物是聚乙二醇醚(Brij)、聚山梨酯、山梨聚糖及其衍生物。在一些实施方案中，两亲性聚合物是聚山梨酯，如PS 20。

在一些实施方案中，两亲性聚合物是聚乙二醇醚(Brij)、泊洛沙姆、聚山梨酯、山梨聚糖或其衍生物。

在一些实施方案中，两亲性聚合物是聚乙二醇醚。在一些实施方案中，合适的聚乙二醇醚是式(S-l)的化合物：

或其盐或异构体，其中：

t是在1与100之间的整数；

R^1BRIJ独立地为C_10-40烷基、C_10-40烯基或C_10-40炔基；并且任选地R^5PEG的一个或多个亚甲基独立地被以下替代：C_3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C_6-10亚芳基、4至10元亚杂芳基、-N(R^N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R^N)-、-NR^NC(O)-、-NR C(O)N(R)-、-C(O)O--OC(O)-、-OC(O)O--OC(O)N(R^N)-、-NR^NC(O)O--C(O)S--SC(O)-、-C(＝NR^N)-、-C(＝NR)N(R)-、-NRNC(＝NR^N)--NR^NC(＝NR^N)N(R^N)-、-C(S)-、-C(S)N(R^N)-、-NR^NC(S)-、-NR^NC(S)N(R^N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O--OS(O)O--OS(O)₂--S(O)₂O--OS(O)₂O--N(R^N)S(O)-、-S(O)N(R^N)--N(R^N)S(O)N(R^N)--OS(O)N(R^N)--N(R^N)S(O)0--S(O)₂--N(R^N)S(O)₂--S(O)₂N(R^N)-、-N(R^N)S(O)₂N(R^N)--OS(O)₂N(R^N)-或-N(R^N)S(O)₂O-；并且

R^N的每种情况独立地为氢、C_1-6烷基或氮保护基。

在一些实施方案中，R^1BRIJ是C是烷基。例如，聚乙二醇醚是式(S-la)的化合物：

或其盐或异构体，其中s是在1与100之间的整数。

在一些实施方案中，R^1BRIJ是C是烯基。例如，合适的聚乙二醇醚是式(S-lb)的化合物：

或其盐或异构体，其中s是在1与100之间的整数。

通常，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其临界胶束浓度(CMC)的量存在于配制品中。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以如下量存在于混合物中：低于其CMC约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以如下量存在于混合物中：低于其CMC约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％。在一些实施方案中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以如下量存在于混合物中：低于其CMC约55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％或95％。

在一些实施方案中，配制品中存在的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)的原始量的小于约0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％在去除后保留。在一些实施方案中，残留量的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)在去除后保留在配制品中。如本文所用，残留量意指在去除组合物中基本上全部物质(本文所述的两亲性聚合物，如泊洛沙姆)之后剩余的量。残留量可能是使用已知技术可定性地或定量地检测的。残留量可能是使用已知技术无法检测的。

在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于5％两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于3％两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于2.5％两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于2％两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于1.5％两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于1％两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于0.5％(例如，小于0.4％、0.3％、0.2％、0.1％)两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物包含小于0.01％两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施方案中，合适的递送媒介物含有残留量的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)。如本文所用，残留量意指在去除组合物中基本上全部物质(本文所述的两亲性聚合物，如泊洛沙姆)之后剩余的量。残留量可能是使用已知技术可定性地或定量地检测的。残留量可能是使用已知技术无法检测的。

聚合物

在一些实施方案中，合适的递送媒介物是使用聚合物作为载体来配制，所述聚合物是单独的或者与包括本文所述的各种脂质在内的其他载体组合。因此，在一些实施方案中，如本文所用的脂质体递送媒介物还涵盖包含聚合物的纳米颗粒。合适的聚合物可以包括例如聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原蛋白、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、PEG化鱼精蛋白、PLL、PEG化PLL和聚乙烯亚胺(PEI)。在PEI存在时，其可以是分子量范围为10至40kDa的支链PEI，例如，25kDa支链PEI(Sigma#408727)。

根据多个实施方案，构成脂质纳米颗粒的阳离子脂质、非阳离子脂质、PEG修饰的脂质、基于胆固醇的脂质和/或两亲性嵌段共聚物的选择以及这样的组分(脂质)相对于彼此的相对摩尔比是基于一种或多种所选脂质的特征、既定靶细胞的性质、要被递送的核酸的特征。另外的考虑包括例如烷基链的饱和，以及一种或多种所选脂质的大小、电荷、pH、pKa、融合原性(fusogenicity)和耐受性。因此，可以相应地调整摩尔比。

两亲性聚合物在无乙醇LNP配制品中的使用

在一些实施方案中，用于本文方法中的两亲性聚合物包含一种或多种普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)或其组合。在一些实施方案中，两亲性聚合物选自以下中的一种或多种：PEG三乙二醇、四乙二醇、PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG1,000、PEG 1,500、PEG 2,000、PEG 3,000、PEG 3,350、PEG 4,000、PEG 6,000、PEG 8,000、PEG 10,000、PEG 20,000、PEG 35,000和PEG 40,000或其组合。在一些实施方案中，两亲性聚合物是三乙二醇。在一些实施方案中，两亲性聚合物是四乙二醇。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 200。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 300。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 400。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 600。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 1,000。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 1,500。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 2,000。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 3,000。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 3,350。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 4,000。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 6,000。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 8,000。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 10,000。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 20,000。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 35,000。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG 40,000。

在一些实施方案中，两亲性聚合物包含使用两个或更多个种类的分子量PEG聚合物的混合物。例如，在一些实施方案中，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种分子量PEG聚合物构成两亲性聚合物。因此，在一些实施方案中，PEG溶液包含一种或多种PEG聚合物的混合物。在一些实施方案中，PEG聚合物的混合物包含具有不同分子量的聚合物。

在一些实施方案中，脂质溶液包含一种或多种两亲性聚合物。在一些实施方案中，脂质溶液中的溶剂包含PEG聚合物。本领域中认可多个种类的PEG聚合物，其中一些具有不同的几何构型。适合于本文方法的PEG聚合物包括例如具有直链、支链、Y形或多臂构型的PEG聚合物。在一些实施方案中，PEG处于包含具有不同几何构型的一种或多种PEG的悬浮液中。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用PEG-6000作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用PEG-400作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用三乙二醇(TEG)作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用三乙二醇单甲醚(mTEG)作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用叔丁基-TEG-O-丙酸酯作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用TEG-二甲基丙烯酸酯作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用TEG-二甲醚作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用TEG-二乙烯基醚作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用TEG-单丁醚作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用TEG-甲醚甲基丙烯酸酯作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用TEG-单癸醚作为溶剂来获得。在一些实施方案中，脂质溶液可以使用TEG-二苯甲酸酯作为溶剂来获得。这些基于PEG或TEG的试剂中的任一种可以用作与LNP配制品中的mRNA溶液混合的脂质溶液中的溶剂。这些试剂中的每一种的结构显示于下文表1中。

表1：用于脂质纳米颗粒配制品中的脂质溶液的非有机溶剂试剂

在一些实施方案中，脂质溶液包含PEG聚合物溶剂，其中所述PEG聚合物包含PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是DOPA-PEG缀合物。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是泊洛沙姆-PEG缀合物。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质包含DOTAP。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质包含胆固醇。

在一些实施方案中，脂质溶液包含两亲性聚合物。在一些实施方案中，脂质溶液包含前述PEG试剂中的任一种。在一些实施方案中，PEG以约10％至约100％重量/体积浓度处于悬浮液中。例如，在一些实施方案中，PEG以如下重量/体积浓度存在于悬浮液中：约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，以及其间的任何值。在一些实施方案中，PEG以约5％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约6％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约7％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约8％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约9％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约10％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约12％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约15％重量/体积存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约18％重量/体积存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约20％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约25％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约30％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约35％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约40％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约45％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约50％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约55％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约60％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约65％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约70％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约75％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约80％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约85％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约90％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约95％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约100％重量/体积浓度存在于悬浮液中。

在一些实施方案中，配制品包含约0.1至约5.0的PEG与总mRNA悬浮液体积的体积:体积比率。例如，在一些实施方案中，PEG以如下体积:体积比率存在于配制品中：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0。因此，在一些实施方案中，PEG以约0.1的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约0.2的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约0.3的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约0.4的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约0.5的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约0.6的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约0.7的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约0.8的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约0.9的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约1.0的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约1.25的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约1.5的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约1.75的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约2.0的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约2.25的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约2.5的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约2.75的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约3.0的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约3.25的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约3.5的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约3.75的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约4.0的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约4.25的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约4.50的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约4.75的体积:体积比率存在于配制品中。在一些实施方案中，PEG以约5.0的体积:体积比率存在于配制品中。

在特定实施方案中，PEG是mTEG(例如约100％或纯mTEG)。在特定实施方案中，脂质溶液为约100％mTEG-脂质。mTEG在mRNA-LNP配制品中特别合适的终浓度为约55-65％重量/体积，例如约50％重量/体积。如例子中所示，该浓度维持mRNA溶解度和稳定性并允许减小的处理体积和易于以更大规模制造所述配制品。

在一些实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液(例如约100％mTEG-脂质溶液)以1-8:1，例如1-4:1的比率(v/v)混合。在特定实施方案中，将所述mRNA溶液与所述脂质溶液(例如约100％mTEG-脂质溶液)以约1:1的比率(v/v)混合。如例子中所示，mRNA溶液与所述脂质溶液的该比率维持mRNA溶解度和稳定性并允许减小的处理体积和易于以更大规模制造所述配制品。

在一些实施方案中，配制品不含醇。在一些实施方案中，配制品是在不使用任何非水性溶剂(例如，醇)的情况下产生的。在一些实施方案中，溶剂不含易燃剂。在一些实施方案中，溶剂不含乙醇。在一些实施方案中，溶剂不含异丙醇、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙醇、甲醇、苯甲地那铵(denatonium)及其组合。在一些实施方案中，溶剂不含醇溶剂(例如，甲醇、乙醇或异丙醇)。在一些实施方案中，溶剂不含酮溶剂(例如，丙酮、甲基乙基酮或甲基异丁基酮)。在一些实施方案中，配制品是水性的。

在一些实施方案中，在不存在乙醇的情况下包裹mRNA。在一些实施方案中，在不存在乙醇的情况下纯化mRNA。在一些实施方案中，mRNA纯化、mRNA包裹或两个过程是在不存在乙醇的情况下进行。在一些实施方案中，mRNA纯化、mRNA包裹或两个过程不使用易燃剂。.在一些实施方案中，mRNA纯化、mRNA包裹或两个过程不使用非水性溶剂。

不同的脂质组分的比率

用于本发明的合适的脂质体可以以多个比率包括任何本文所述的阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇脂质、PEG修饰的脂质、两亲性嵌段共聚物和/或聚合物中的一种或多种。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含纳米颗粒的五种且不超过五种不同的组分。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含纳米颗粒的四种且不超过四种不同的组分。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含纳米颗粒的三种且不超过三种不同的组分。作为非限制性例子，合适的脂质体配合物可以包括选自以下的组合：cKK-E12(也称为ML2)、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；C12-200、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；HGT4003、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；ICE、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；或者ICE、DOPE和DMG-PEG2K。

在多个实施方案中，按摩尔比，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)构成脂质体的约30-60％(例如，约30-55％、约30-50％、约30-45％、约30-40％、约35-50％、约35-45％或约35-40％)。在一些实施方案中，按摩尔比，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE和/或HGT4003)的百分比是脂质体的为或大于约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％。

在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率可以分别在约30-60:25-35:20-30:1-15之间。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别为大约40:30:20:10。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别为大约40:30:25:5。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别为大约50:10:35:5。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别为大约60:35:0:5。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别为大约40:32:25:3。在一些实施方案中，一种或多种阳离子脂质与一种或多种非阳离子脂质与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的比率为大约50:25:20:5。

与本发明一起使用的示例性脂质混合物由四种脂质组分构成：阳离子脂质(例如ML-2或MC-3)、非阳离子脂质(例如，DSPC、DPPC、DOPE或DEPE)、基于胆固醇的脂质(例如，胆固醇)和PEG修饰的脂质(例如，DMG-PEG2K)。在一些实施方案中，LNP中一种或多种阳离子脂质(例如ML-2或MC-3)与一种或多种非阳离子脂质(例如DSPC或DOPE)与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的摩尔比可以分别在约35-55:5-35:20-40:1-15之间。在一些实施方案中，LNP中一种或多种阳离子脂质(例如ML-2)与一种或多种非阳离子脂质(例如DSPC或DOPE)与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的摩尔比为35-45:25-35:20-30:1-10。在特定实施方案中，LNP中一种或多种阳离子脂质(例如ML-2)与一种或多种非阳离子脂质(例如DSPC或DOPE)与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的摩尔比为约40:30:25:5。在一些实施方案中，LNP中一种或多种阳离子脂质(例如MC-3)与一种或多种非阳离子脂质(例如DSPC或DOPE)与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的摩尔比为45-55:5-15:30-40:1-10。在一些实施方案中，LNP中一种或多种阳离子脂质(例如MC-3)与一种或多种非阳离子脂质(例如DSPC或DOPE)与一种或多种基于胆固醇的脂质与一种或多种PEG修饰的脂质的摩尔比为约50:10:35:5。如例子中所示，这些制剂特别适合用于本发明的配制品中，因为它们确保合适的mRNA-LNP大小和包裹功效。

在一些实施方案中，与本发明一起使用的脂质混合物可以包含不超过三种不同的脂质组分。在一些实施方案中，这样的混合物中的一种不同的脂质组分是基于胆固醇的或基于咪唑的阳离子脂质。示例性脂质混合物可以由三种脂质组分构成：阳离子脂质(例如，基于胆固醇的或基于咪唑的阳离子脂质，如ICE、HGT4001或HGT4002)、非阳离子脂质(例如，DSPC、DPPC、DOPE或DEPE)以及PEG修饰的脂质(例如，DMG-PEG2K)。在一些实施方案中，阳离子脂质与非阳离子脂质与PEG修饰的脂质的摩尔比可以分别在约55-65:30-40:1-15之间。在一些实施方案中，LNP中阳离子脂质(例如ICE)与非阳离子脂质(例如DSPC)与PEG修饰的脂质的摩尔比为55-65:30-40:1-15。在特定实施方案中，LNP中阳离子脂质(例如ICE)与非阳离子脂质(例如DSPC或DOPE)与PEG修饰的脂质的摩尔比为60:35:5。如例子中所示，这些制剂特别适合用于本发明的配制品中，因为它们确保合适的mRNA-LNP大小和包裹功效。

在一些实施方案中，mRNA-LNP中脂质和mRNA的浓度使得一种或多种阳离子脂质(例如ML-2或MC-3)与mRNA的N/P比率为约2、3、4、5或6。如例子中所示，特别合适的N/P比率为约4，其允许有效LNP形成和mRNA包裹功效。

在脂质纳米颗粒包含脂质的三种且不超过三种不同的组分的实施方案中，总脂质含量的比率(即，脂质组分(1):脂质组分(2):脂质组分(3)的比率)可以表示为x:y:z，其中

(y+z)＝100-x。

在一些实施方案中，“x”、“y”和“z”各自表示脂质的三种不同组分的摩尔百分比，并且所述比率是摩尔比。

在一些实施方案中，“x”、“y”和“z”各自表示脂质的三种不同组分的重量百分比，并且所述比率是重量比。

在一些实施方案中，由变量“x”表示的脂质组分(1)是基于固醇的阳离子脂质。

在一些实施方案中，由变量“y”表示的脂质组分(2)是辅助脂质。

在一些实施方案中，由变量“z”表示的脂质组分(3)是PEG脂质。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在实施方案中，变量“x”为不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或者至少约50％但小于约60％。在实施方案中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或者至少约50％但小于约60％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。在实施方案中，变量“x”为不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(1)(例如，基于固醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或者至少约50％但小于约60％。在实施方案中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或者至少约50％但小于约60％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％或约5％至约10％。

在一些实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施方案中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％或约5％至约10％。

对于具有三种且仅三种不同的脂质组分的组合物，变量“x”、“y”和“z”可以呈任何组合，只要三个变量的总和相加为总脂质含量的100％即可。

mRNA合成

根据本发明的mRNA可以根据多种已知方法中的任一种来合成。多种方法描述于公开的美国申请号US 2018/0258423中，并且可以用于实践本发明，所有所述申请都是通过引用并入本文。例如，根据本发明的mRNA可以通过体外转录(IVT)来合成。简言之，IVT通常用以下来进行：含有启动子的直链或环状DNA模板、核糖核苷酸三磷酸库、可以包括DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。确切条件将根据具体应用而变化。

在一些实施方案中，合适的mRNA序列是编码蛋白质或肽的mRNA序列。在一些实施方案中，合适的mRNA序列针对有效表达人细胞进行密码子优化。在一些实施方案中，合适的mRNA序列是天然存在的或野生型序列。在一些实施方案中，合适的mRNA序列编码在氨基酸序列中含有一个或多个突变的蛋白质或肽。

本发明可以用于递送各种长度的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度为或大于约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、20kb、30kb、40kb或50kb的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明可以用于递送长度范围为约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb或约8-50kb的体外合成的mRNA。

在一些实施方案中，对于根据本发明的mRNA的制备，在体外转录DNA模板。合适的DNA模板通常具有用于体外转录的启动子(例如，T3、T7或SP6启动子)，之后为所需mRNA的所需核苷酸序列以及终止信号。

核苷酸

可以使用多种天然存在的或修饰的核苷来产生根据本发明的mRNA。在一些实施方案中，mRNA是或包含天然存在的核苷(或未修饰的核苷酸；例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷(例如，N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化的碱基)；嵌入的碱基；修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。

在一些实施方案中，合适的mRNA可以含有骨架修饰、糖修饰和/或碱基修饰。例如，修饰的核苷酸可以包括但不限于修饰的嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及嘌呤和嘧啶的修饰的核苷酸类似物或衍生物，如例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲基硫代-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、辫苷、.β.-D-甘露糖基-辫苷、维布托辛(wybutoxosine)和氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。这样的类似物的制备是本领域技术人员已知的，例如，根据以下文献：美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，所述文献的公开内容通过引用以其整体并入。

在一些实施方案中，mRNA包含一种或多种非标准核苷酸残基。所述非标准核苷酸残基可以包括例如5-甲基-胞苷(“5mC”)、假尿苷(“ψU”)和/或2-硫代-尿苷(“2sU”)。关于这样的残基以及将其掺入mRNA中的讨论参见例如美国专利号8,278,036或WO 2011/012316。mRNA可以是RNA，其被定义为25％的U残基是2-硫代-尿苷并且25％的C残基是5-甲基胞苷的RNA。RNA的用途的传授内容披露于美国专利公开案US 2012/0195936和国际公开案WO2011/012316中，所述专利通过引用以其整体特此并入。与具有相同序列但仅含标准残基的对照mRNA相比，非标准核苷酸残基的存在可以使mRNA更稳定和/或免疫原性更低。在其他实施方案中，mRNA可以包含选自以下的一种或多种非标准核苷酸残基：异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-率-6-氨基嘌呤胞嘧啶，以及这些修饰与其他核碱基修饰的组合。一些实施方案还可以包括对呋喃糖环或核碱基的另外的修饰。另外的修饰可以包括例如糖修饰或取代(例如，2'-O-烷基修饰、锁核酸(LNA)中的一种或多种)。在一些实施方案中，RNA可以与另外的多核苷酸和/或肽多核苷酸(PNA)复合或杂交。在糖修饰为2'-O-烷基修饰的一些实施方案中，这样的修饰可以包括但不限于2'-脱氧-2'-氟修饰、2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧基乙基修饰和2'-脱氧修饰。在一些实施方案中，这些修饰中的任一种可以单独或组合存在于0-100％的核苷酸中，例如，超过0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或100％的组成核苷酸中。

在一些实施方案中，mRNA可以含有RNA骨架修饰。通常，骨架修饰是如下修饰，其中RNA中所含核苷酸的骨架的磷酸酯被化学修饰。示例性骨架修饰通常包括但不限于来自以下的修饰：甲基膦酸酯、甲基氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(例如，胞苷5'-O-(1-硫代磷酸酯))、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、带正电荷的胍基等，这意味着通过用其他阴离子、阳离子或中性基团替代磷酸二酯键。

在一些实施方案中，mRNA可以含有糖修饰。典型地糖修饰是对核苷酸的糖的化学修饰，其含有包括但不限于选自以下的糖修饰：2'-脱氧-2'-氟-寡核糖核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸酯、2'-氟-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸酯)、2'-脱氧-2'-二胺-寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸酯、2'-氨基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸酯)、2'-O-烷基寡核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷5'-三磷酸酯、2'-甲基尿苷5'-三磷酸酯)、2'-C-烷基寡核糖核苷酸及其异构体(2'-阿糖胞苷5'-三磷酸酯、2'-阿糖尿苷(arauridine)5'-三磷酸酯)或叠氮基三磷酸酯(2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸酯、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸酯)。

合成后处理

通常，可以在合成后添加5'帽和/或3'尾。所述帽的存在在提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性方面是重要的。“尾”的存在用于保护mRNA免受外切核酸酶降解。

5'帽通常如下来添加：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸去除一个末端磷酸酯基团，留下两个末端磷酸酯；然后将鸟苷三磷酸(GTP)经由鸟苷酸转移酶添加至末端磷酸酯，产生5'5'5三磷酸酯连接；然后通过甲基转移酶使鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的例子包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。另外的帽结构描述于公开的美国申请号US 2016/0032356和公开的美国申请号US 2018/0125989中，所述申请通过引用并入本文。

通常，尾结构包括多(A)和/或多(C)尾。mRNA的3'末端上的多A或多C尾通常分别包括至少50个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少250个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少350个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少450个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少650个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少700个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少750个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少800个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少850个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少900个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少950个腺苷或胞嘧啶核苷酸或者至少1kb个腺苷或胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，多A或多C尾可以分别为约10至800个腺苷或胞嘧啶核苷酸(例如，约10至200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约50至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约100至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约150至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约200至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约250至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约300至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约350至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约400至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约450至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约500至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至100个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约20至70个腺苷或胞嘧啶核苷酸或者约20至60个腺苷或胞嘧啶核苷酸)。在一些实施方案中，尾结构包括本文所述的具有各种长度的多(A)与多(C)尾的组合。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％腺苷核苷酸。在一些实施方案中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％胞嘧啶核苷酸。

如本文所述，5'帽和/或3'尾的添加有利于对在体外合成期间生成的流产性转录物的检测，因为在没有加帽和/或加尾的情况下，那些过早流产的mRNA转录物的大小可能过小而无法检测。因此，在一些实施方案中，在测试mRNA的纯度(例如，mRNA中存在的流产性转录物的水平)之前，将5'帽和/或3'尾添加至合成的mRNA。在一些实施方案中，在如本文所述纯化mRNA之前，将5'帽和/或3'尾添加至合成的mRNA。在其他实施方案中，在如本文所述纯化mRNA之后，将5'帽和/或3'尾添加至合成的mRNA。

合成的mRNA可以在不进行进一步纯化的情况下用于本发明中。特定地，合成的mRNA可以在没有去除短体的步骤的情况下根据本发明来使用。在一些实施方案中，可以将合成的mRNA进一步纯化用于根据本发明使用。可以使用多种方法来纯化合成的mRNA。例如，mRNA的纯化可以使用离心、过滤和/或色谱法来进行。在一些实施方案中，通过乙醇沉淀或过滤或色谱或者凝胶纯化或任何其他合适的手段来纯化合成的mRNA。在一些实施方案中，通过HPLC纯化mRNA。在一些实施方案中，在本领域技术人员熟知的标准苯酚:氯仿:异戊醇溶液中提取mRNA。在一些实施方案中，使用切向流过滤纯化mRNA。合适的纯化方法包括以下文献中所述的那些：公开的美国申请号US 2016/0040154、公开的美国申请号US 2015/0376220、公开的美国申请号US 2018/0251755、公开的美国申请号US 2018/0251754、2018年11月8日提交的美国临时申请号62/757,612和2019年8月26日提交的美国临时申请号62/891,781，所有所述申请通过引用并入本文，并且所述纯化方法可以用于实践本发明。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前纯化mRNA。在一些实施方案中，在加帽和加尾之后纯化mRNA。在一些实施方案中，既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后纯化mRNA。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过离心纯化mRNA。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过过滤纯化mRNA。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过切向流过滤(TFF)纯化mRNA。

在一些实施方案中，在加帽和加尾之前或之后，或者既在加帽和加尾之前也在加帽和加尾之后，通过色谱法纯化mRNA。

在一些实施方案中，在不使用乙醇或任何其他易燃溶剂的情况下纯化mRNA。

纯化mRNA的表征

本文所述的mRNA组合物基本上不含污染物，所述污染物包含短流产性RNA种类、长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留体外转录酶、残留溶剂和/或残留盐。

本文所述的mRNA组合物的纯度为约60％与约100％之间。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约60％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约65％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约70％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约75％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约80％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约85％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约90％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约91％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约92％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约93％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约94％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约95％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约96％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约97％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约98％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约99％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度为约100％。

在一些实施方案中，本文所述的mRNA组合物具有小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％和/或小于0.1％的除了全长mRNA外的杂质。所述杂质包括IVT污染物，例如，蛋白质、酶、DNA模板、游离核苷酸、残留溶剂、残留盐、双链RNA(dsRNA)、过早流产的RNA序列(“短体”或“短流产性RNA种类”)和/或长流产性RNA种类。在一些实施方案中，纯化的mRNA基本上不含过程酶。

在一些实施方案中，本发明的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约1pg/mg、小于约2pg/mg、小于约3pg/mg、小于约4pg/mg、小于约5pg/mg、小于约6pg/mg、小于约7pg/mg、小于约8pg/mg、小于约9pg/mg、小于约10pg/mg、小于约11pg/mg或小于约12pg/mg。因此，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约1pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约2pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约3pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约4pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约5pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约6pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约7pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约8pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约9pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约10pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约11pg/mg。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约12pg/mg。

在一些实施方案中，根据本发明的方法去除超过约90％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上全部过早流产的RNA序列(也称为“短体”)。在一些实施方案中，mRNA组合物基本上不含过早流产的RNA序列。在一些实施方案中，mRNA组合物含有小于约5％(例如，小于约4％、3％、2％或1％)的过早流产的RNA序列。在一些实施方案中，mRNA组合物含有小于约1％(例如，小于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的过早流产的RNA序列。在一些实施方案中，mRNA组合物无法检测的过早流产的RNA序列，如通过例如以下所确定：高效液相色谱(HPLC)(例如，肩峰或单独峰)、溴乙锭、考马斯染色、毛细管电泳或乙二醛凝胶电泳(例如，单独较低区带的存在)。如本文所用，术语“短体”、“短流产性RNA种类”、“过早流产的RNA序列”或“长流产性RNA种类”是指小于全长的任何转录物。在一些实施方案中，“短体”、“短流产性RNA种类”或“过早流产的RNA序列”的长度小于100个核苷酸，长度小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20或小于10个核苷酸。在一些实施方案中，在添加5'-帽和/或3'-多A尾之后对短体进行检测或定量。在一些实施方案中，过早流产的RNA转录物包含小于15个碱基(例如，小于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3个碱基)。在一些实施方案中，过早流产的RNA转录物含有约8-15、8-14、8-13、8-12、8-11或8-10个碱基。

在一些实施方案中，本发明的纯化的mRNA基本上不含用于体外合成中的酶试剂，包括但不限于T7 RNA聚合酶、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制剂。在一些实施方案中，根据本发明的纯化的mRNA含有小于约5％(例如，小于约4％、3％、2％或1％)的用于体外合成中的酶试剂。在一些实施方案中，纯化的mRNA含有小于约1％(例如，小于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的用于体外合成中的酶试剂包括。在一些实施方案中，纯化的mRNA含有无法检测的用于体外合成中的酶试剂包括，如通过例如以下所确定：银染色、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)和/或毛细管电泳、溴乙锭和/或考马斯染色。

在多个实施方案中，本发明的纯化的mRNA维持高完整性程度。如本文所用，术语“mRNA完整性”通常是指mRNA在纯化后的质量。mRNA完整性可以使用本领域中熟知的方法来确定，例如，通过RNA琼脂糖凝胶电泳。在一些实施方案中，mRNA完整性可以通过RNA琼脂糖凝胶电泳的带型来确定。在一些实施方案中，与RNA琼脂糖凝胶电泳的参考取代相比，本发明的纯化的mRNA显示几乎没有显带。在一些实施方案中，本发明的纯化的mRNA的完整性大于约95％(例如，大于约96％、97％、98％、99％或更多)。在一些实施方案中，本发明的纯化的mRNA的完整性大于98％。在一些实施方案中，本发明的纯化的mRNA的完整性大于99％。在一些实施方案中，本发明的纯化的mRNA的完整性为大约100％。

在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的以下特征中的一种或多种：外观、身份、量、浓度、杂质的存在、微生物评估、pH水平和活性。在一些实施方案中，可接受的外观包括基本上不含可见微粒的透明无色溶液。在一些实施方案中，通过测序方法来评估mRNA的身份。在一些实施方案中，通过合适的方法(如UV分光光度法)来评估浓度。在一些实施方案中，合适的浓度在约90％与110％标称值之间(0.9-1.1mg/mL)。

在一些实施方案中，评估mRNA的纯度包括mRNA完整性的评估、残留质粒DNA的评估以及残留溶剂的评估。在一些实施方案中，通过琼脂糖凝胶电泳来评估可接受的mRNA完整性水平。分析凝胶以确定带型和表观核苷酸长度是否与分析参考标准一致。用于评估RNA完整性的另外的方法包括例如使用毛细管凝胶电泳(CGE)对纯化的mRNA的评估。在一些实施方案中，可接受的如通过CGE确定的纯化的mRNA的纯度是，纯化的mRNA组合物具有不大于约55％的长流产性/降解的种类。在一些实施方案中，通过本领域中的方法(例如通过qPCR的使用)来评估残留质粒DNA。在一些实施方案中，小于10pg/mg(例如，小于10pg/mg、小于9pg/mg、小于8pg/mg、小于7pg/mg、小于6pg/mg、小于5pg/mg、小于4pg/mg、小于3pg/mg、小于2pg/mg或小于1pg/mg)是可接受的残留质粒DNA水平。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过10,000ppm、9,000ppm、8,000ppm、7,000ppm、6,000ppm、5,000ppm、4,000ppm、3,000ppm、2,000ppm、1,000ppm。因此，在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过10,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过9,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过8,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过7,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过6,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过5,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过4,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过3,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过2,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过1,000ppm。

在一些实施方案中，对纯化的mRNA进行微生物测试，其包括例如对细菌内毒素的评估。在一些实施方案中，细菌内毒素为<0.5EU/mL、<0.4EU/mL、<0.3EU/mL、<0.2EU/mL或<0.1EU/mL。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.5EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.4EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.3EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.2EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.2EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.1EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/10mL、1CFU/25mL、1CFU/50mL、1CFU/75mL或不超过1CFU/100mL。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/10mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/25mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/50mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFR/75mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有1CFU/100mL。

在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA的可接受的pH在5与8之间。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA的pH为约5。在一些实施方案中，纯化的mRNA的pH为约6。在一些实施方案中，纯化的mRNA的pH为约7。在一些实施方案中，纯化的mRNA的pH为约7.5。在一些实施方案中，纯化的mRNA的pH为约8。

在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的翻译保真度。翻译保真度可以通过多种方法来评估并且包括例如转染和蛋白质印迹分析。纯化的mRNA的可接受的特征包括蛋白质印迹上在与参考标准类似的分子量处移行的带型。

在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的传导率。在一些实施方案中，纯化的mRNA的可接受的特征包括在参考标准的约50％与150％之间的传导率。

还评估纯化的mRNA的帽百分比和多A尾长度。在一些实施方案中，可接受的帽百分比包括帽1，面积％：NLT90。在一些实施方案中，可接受的多A尾长度为约100-1500个核苷酸(例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、和1000、1100、1200、1300、1400或1500个核苷酸)。

在一些实施方案中，还评估纯化的mRNA的任何残留PEG。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于10ng PEG/mg纯化的mRNA与1000ng PEG/mg mRNA之间。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约10ng PEG/mg纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约100ng PEG/mg纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约250ngPEG/mg纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约500ng PEG/mg纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约750ng PEG/mg纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约1000ng PEG/mg纯化的mRNA。

对mRNA纯度进行检测和定量的多种方法是本领域中已知的。例如，这样的方法包括印迹、毛细管电泳、色谱、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染色、光谱法、紫外线(UV)或UPLC或其组合。在一些实施方案中，在凝胶电泳(“乙二醛凝胶电泳”)之前首先通过乙二醛染料使mRNA变性。在一些实施方案中，在加帽或加尾之前对合成的mRNA进行表征。在一些实施方案中，在加帽和加尾之后对合成的mRNA进行表征。

组合物的治疗用途

为了促进mRNA在体内表达，可以将递送媒介物如脂质体与一种或多种另外的核酸、载体、靶向配体或稳定试剂组合配制，或者配制于药物组合物中，其中将其与合适的赋形剂混合。用于药物配制和施用的技术可以发现于以下文献中：“Remington'sPharmaceutical Sciences,”Mack Publishing Co.,伊士顿,宾夕法尼亚州,最新版。

在一些实施方案中，组合物包含用递送媒介物包裹或复合的mRNA。在一些实施方案中，所述递送媒介物选自脂质体、脂质纳米颗粒、固体-脂质纳米颗粒、聚合物、病毒、溶胶-凝胶和纳米凝胶。

所提供的加载mRNA的纳米颗粒和含有它的组合物可以根据当前医疗实践来施用和给药，其中考虑受试者的临床条件、施用部位和方法、施用的排程、受试者的年龄、性别、体重以及与本领域中普通技术的临床医师相关的其他因素。用于本文目的的“有效量”可以通过这样的相关考虑来确定，如实验临床研究、药理学、临床和医疗领域普通技术人员已知的。在一些实施方案中，所施用的量有效实现症状和其他指标的至少一些稳定、改进或消除，所述指标如由本领域技术人员选择作为疾病进展、消退或改进的适当量度。例如，合适的量和给药方案是引起至少暂时的蛋白质(例如，酶)产生的量和方案。

本发明提供递送mRNA用于体内蛋白质产生的方法，其包括将mRNA施用至需要递送的受试者。在一些实施方案中，mRNA是通过选自以下的递送途径来施用：静脉内递送、皮下递送、口服递送、真皮下递送、眼递送、气管内注射肺递送(例如雾化或滴注)、肌内递送、鞘内递送或关节内递送。因此，在一些实施方案中，本发明提供递送mRNA用于体内蛋白质产生的方法，其包括静脉内递送。在一些实施方案中，本发明提供递送mRNA用于体内蛋白质产生的方法，其包括肌内递送。在一些实施方案中，本发明提供递送mRNA用于体内蛋白质产生的方法，其包括气管内注射肺递送。

无乙醇LNP配制品的开发显著减少和/或消除消防安全问题并且还允许床边混合，导致产生低体积配制品，其具有1:1的柠檬酸盐-mRNA与溶剂-脂质比率，会更适合于给药。因此，在一些实施方案中，mRNA LNP配制品适合于在多种环境中制备和施用，包括例如床边混合、医院现场混合和药房现场混合。

合适的施用途径包括例如口服、直肠、阴道、经黏膜、肺(包括气管内或吸入)或肠施用；肠胃外递送，包括真皮内、透皮(外用)、肌内、皮下、髓内注射、以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内或鼻内。在一些实施方案中，肌内施用是施用至选自以下的肌肉：骨骼肌、平滑肌和心肌。在一些实施方案中，所述施用导致将mRNA递送至肌细胞。在一些实施方案中，所述施用导致将mRNA递送至肝细胞(即，肝脏细胞)。在特定实施方案中，肌内施用导致将mRNA递送至肌细胞。

肺递送和雾化的另外的传授内容描述于公开的美国申请号US 2018/0125989和公开的美国申请号US 2018/0333457中，每个所述申请通过引用以其整体并入。

可替代地或另外地，本发明的加载mRNA的纳米颗粒和组合物可以以局部而非全身方式施用，例如，通过将药物组合物直接注射至靶向的组织中，优选地在持续释放配制品中。局部递送可以以多种方式受影响，根据要靶向的组织而定。例如，可以吸入含有本发明的组合物的气溶胶(用于鼻、气管或支气管递送)；可以将本发明的组合物注射至例如损伤、疾病表现或疼痛的部位中；组合物可以以锭剂提供，用于口服、气管或食道应用；可以以液体、片剂或胶囊形式供应，用于施用至胃或肠，可以以栓剂形式供应，用于直肠或阴道应用；或者甚至可以通过使用乳膏、滴剂或甚至注射来递送至眼。含有与治疗性分子或配体复合的所提供组合物的配制品甚至可以通过手术来施用，例如与可以允许组合物从植入部位扩散至周围细胞的聚合物或其他结构或物质缔合。可替代地，它们可以在不使用聚合物或支持物的情况下通过手术来施加。

本发明提供的方法考虑单次以及多次施用治疗有效量的本文所述的治疗剂(例如，mRNA)。治疗剂可以以规律间隔来施用，根据受试者的病症的性质、严重性和程度而定。在一些实施方案中，可以将治疗有效量的本发明的治疗剂(例如，mRNA)以规律间隔(例如，每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三个月一次、每两月(每两个月一次)、每月(每月一次)、每两周(每两周一次)、一个月一次、每30天一次、每28天一次、每14天一次、每10天一次、每7天一次、每周、一周两次、每天或连续地)定期鞘内施用。

在一些实施方案中，配制所提供的脂质体和/或组合物以使得它们适合于其中所含mRNA的延长释放。这样的延长释放组合物可以以延长的给药间隔便捷地施用至受试者。例如，在一个实施方案中，将本发明的组合物一天两次、每天或每隔一天施用至受试者。在优选实施方案中，将本发明的组合物以以下间隔施用至受试者：一周两次、一周一次、每7天一次、每10天一次、每14天一次、每28天一次、每30天一次、每两周一次、每三周一次，或者更优选地每四周一次、一个月一次、一个月两次、每六周一次、每八周一次、每隔一个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每六个月一次、每八个月一次、每九个月一次或每年。还考虑配制用于储积施用(例如，肌内、皮下、玻璃体内)以在延长时间段中递送或释放治疗剂(例如，mRNA)的组合物和脂质体。优选地，所采用的延长释放手段与对mRNA作出的增强稳定性的修饰组合。

如本文所用，术语“治疗有效量”主要根据本发明的药物组合物中所含治疗剂的总量来确定。通常，治疗有效量足以实现对受试者有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或改善疾病或障碍)。例如，治疗有效量可以是足以实现所需治疗和/或预防效果的量。通常，施用至有需要的受试者的治疗剂(例如，mRNA)的量将取决于受试者的特征。这样的特征包括受试者的状况、疾病严重性、总体健康状况、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将能够根据这些和其他相关因素容易地确定适当的剂量。另外，可以任选地采用客观和主观测定二者来鉴定最佳剂量范围。

治疗有效量一般按可以包括多个单位剂量的给药方案来施用。对于任何特定的治疗蛋白，治疗有效量(和/或在有效给药方案内的适当单位剂量)可以例如根据施用途径、根据与其他医药剂的组合而变化。用于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可以取决于多种因素，包括所治疗的障碍和所述障碍的严重性；所采用的具体医药剂的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或所采用的具体蛋白质的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医疗领域中熟知的类似因素。

在一些实施方案中，治疗有效剂量的范围为约0.005mg/kg体重至500mg/kg体重，例如，约0.005mg/kg体重至400mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至300mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至200mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至100mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至90mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至80mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至70mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至60mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至50mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至40mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至30mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至25mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至20mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至15mg/kg体重、约0.005mg/kg体重至10mg/kg体重。

在一些实施方案中，治疗有效剂量为大于约0.1mg/kg体重、大于约0.5mg/kg体重、大于约1.0mg/kg体重、大于约3mg/kg体重、大于约5mg/kg体重、大于约10mg/kg体重、大于约15mg/kg体重、大于约20mg/kg体重、大于约30mg/kg体重、大于约40mg/kg体重、大于约50mg/kg体重、大于约60mg/kg体重、大于约70mg/kg体重、大于约80mg/kg体重、大于约90mg/kg体重、大于约100mg/kg体重、大于约150mg/kg体重、大于约200mg/kg体重、大于约250mg/kg体重、大于约300mg/kg体重、大于约350mg/kg体重、大于约400mg/kg体重、大于约450mg/kg体重、大于约500mg/kg体重。在特定实施方案中，治疗有效剂量为1.0mg/kg。在一些实施方案中，肌内或静脉内施用1.0mg/kg的治疗有效剂量。

本文还考虑包含一种或多种本文公开的脂质体的冻干的药物组合物和使用这样的组合物的相关方法，如例如2011年6月8日提交的美国临时申请号61/494,882中所披露，所述申请的传授内容通过引用以其整体并入本文。例如，根据本发明的冻干的药物组合物可以在施用前被重构或者可以在体内被重构。例如，可以将冻干的药物组合物配制为适当的剂型(例如，真皮内剂型，如盘、杆或膜)并施用，使得所述剂型在体内随时间被个体的体液再次水合。

可以将所提供的脂质体和组合物施用至任何所需组织。在一些实施方案中，通过所提供的脂质体或组合物递送的mRNA在被施用所述脂质体和/或组合物的组织中表达。在一些实施方案中，所递送的mRNA在与被施用所述脂质体和/或组合物的组织不同的组织中表达。可以递送和/或表达所递送的mRNA的示例性组织包括但不限于肝、肾、心脏、脾、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤和/或脑脊液。

在一些实施方案中，如与治疗前的基线表达水平相比，施用所提供的组合物导致来自受试者的生物样品中的mRNA表达水平增加。通常，紧接在治疗之前测量基线水平。生物样品包括例如全血、血清、血浆、尿液和组织样品(例如，肌肉、肝、皮肤成纤维细胞)。在一些实施方案中，如与紧接在治疗之前的基线水平相比，施用所提供的组合物导致mRNA表达水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，如与未被治疗的受试者的mRNA表达水平相比，施用所提供的组合物导致mRNA表达水平增加。

根据多个实施方案，可以调谐所递送的mRNA的表达时机以适合特定的医疗需要。在一些实施方案中，在施用所提供的脂质体和/或组合物之后1、2、3、6、12、24、48、72和/或96小时，由所递送的mRNA编码的蛋白质的表达是可检测的。在一些实施方案中，在施用后一周、两周和/或一个月，由所递送的mRNA编码的蛋白质的表达是可检测的。

本发明还提供递送具有编码目的肽或多肽的mRNA分子的组合物用于治疗受试者，例如，人类受试者或者人类受试者的细胞或者被处理且递送至人类受试者的细胞。

实施例

尽管已经根据某些实施方案专门描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实施例仅用于说明本发明且不意图限制本发明。

实施例1.使用聚合物代替乙醇作为溶剂的无乙醇脂质纳米颗粒(LNP)配制品的包裹效率。

此实施例说明在无乙醇LNP配制品的产生中通过使用三乙二醇单甲醚(mTEG)作为溶解多种阳离子脂质(包括ML-2和ICE)的示例性溶剂实现的包裹效率。无乙醇LNP配制品的开发会显著减少和/或消除消防安全问题并且还允许床边混合，导致产生低体积配制品，其具有1:1的柠檬酸盐-mRNA与溶剂-脂质比率，会更适合于给药。这样的低体积配制品是当前使用乙醇作为溶剂难以获得的。

示例性LNP配制品通过以下方式来制备：将水溶液中的mRNA与溶解于两亲性聚合物溶液中的脂质(例如，阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG修饰的脂质)混合，以形成包裹在LNP内的mRNA(mRNA-LNP)。在此实施例中，所述脂质是在无乙醇mTEG溶液中或在基于乙醇的溶液中制备。评估两种不同的阳离子脂质，即ML-2和ICE，并且在无乙醇聚合物混合物和在含有乙醇的混合物二者中，对于每种阳离子脂质，使用相同的PEG:阳离子脂质:胆固醇:非阳离子脂质的比率(参见表2)。评估来自无乙醇聚合物混合物和来自含有乙醇的混合物的LNP的粒度、多分散性指数和包裹效率。

表2.对于ML-2和ICE阳离子脂质，使用无乙醇mTEG混合物与乙醇混合物制备的mRNA-LNP的平均粒度、多分散性指数和包裹效率。

如在表2中所见，如与乙醇制备的LNP配制品相比，mTEG制备的配制品产生具有等效或改进的包裹效率的大小相当的LNP。相对于乙醇配制品，观察到多分散性指数在mTEG配制品中略高。

结果表明，可以使用mTEG来溶解脂质，从而允许具有等效或改进的包裹效率的无乙醇LNP配制品的安全制造。

实施例2.相对于使用脂质的乙醇溶剂，使用脂质的聚合物溶剂制备的mRNA-LNP的包裹效率

此实施例说明相对于使用脂质的乙醇溶剂配制的LNP配制品，在使用脂质的聚合物溶剂配制的LNP配制品中获得的平均粒度、多分散性指数(“PDI”)和包裹效率。使用聚合物溶剂(mTEG)或乙醇配制的LNP由PEG修饰的脂质、ML-2或MC3的阳离子脂质、胆固醇和辅助脂质(DSPC)构成。

示例性mRNA-LNP配制品通过以下方式来制备：将LNP的脂质溶解于100％mTEG溶液中或100％乙醇溶液中。所述脂质包括作为阳离子脂质的ML-2或MC-3、PEG修饰的脂质、胆固醇和辅助脂质(DSPC)。将mTEG-脂质或乙醇-脂质溶液与mRNA水溶液(在柠檬酸盐缓冲液中)以1:4(分别为mTEG-脂质溶液:mRNA溶液或乙醇-脂质溶液:mRNA溶液)的体积比率混合。在混合前，水溶液中的mRNA处于0.08mg/mL的浓度，并且脂质溶液中的脂质处于提供等于4的阳离子脂质(ML-2或MC-3)与mRNA的N/P比率所需的浓度。根据表3中提供的目标比率(相对于阳离子脂质)来制备PEG修饰的脂质、胆固醇和辅助脂质(DSPC)浓度。分析所得mRNA-LNP的粒度、多分散性指数和包裹效率(表3)。

表3.从1:4的脂质溶液体积与mRNA溶液体积混合制备的mRNA-LNP的平均粒度、多分散性指数和包裹效率，其中所述脂质溶液为无乙醇聚合物溶剂或乙醇溶剂。

如表3中所示，在MC-3是阳离子脂质的情况下，在mTEG制备的配制品和乙醇制备的配制品中获得大小相当的mRNA-LNP。对于使用ML-2作为阳离子脂质的配制品，与乙醇制备的脂质相比，从mTEG制备的脂质获得的那些mRNA-LNP更大。如与在相应的乙醇制备的MC-3mRNA-LNP配制品中获得的90％包裹效率相比，在mTEG制备的MC-3mRNA-LNP配制品中获得97％的更高包裹效率。对于使用ML-2作为阳离子脂质的配制品，与乙醇制备的脂质相比，从mTEG制备的脂质获得的mRNA-LNP的包裹效率是相当的。如与乙醇制备的mRNA-LNP配制品相比，mTEG制备的MC-3mRNA-LNP配制品中的多分散性指数有所增加。

这些结果显示，如与乙醇制备的LNP配制品相比，聚合物制备的LNP配制品、特别是mTEG制备的LNP配制品提供相当的LNP大小和潜在更高的包裹效率。使用mTEG代替乙醇来制备包裹mRNA的LNP还可以因为以下优点而是有利的：可以如与基于乙醇的配制品相比更安全地大规模制造无乙醇mTEG配制品，并且可能需要更少的后续处理来去除用于脂质组合物的溶剂。

实施例3.无乙醇配制品需要更低体积混合

此实施例显示在mRNA-LNP的制备中使用用于脂质的mTEG溶剂相比于乙醇溶剂的显著优势，特别是关于降低制备mRNA-LNP配制品中所需的体积，例如，对于给药。特定地，以1:1(v/v)比率混合包含脂质的100％乙醇溶液与包含mRNA的水溶液可以导致不稳定的mRNA溶解度，并且在一些情形中导致mRNA沉淀，由于所得混合物中的高浓度(50％vol/vol)乙醇所致。因此，在本发明之前，解决这个问题的方法包括稀释乙醇-脂质溶液中的乙醇组分(这会影响脂质溶解度)和/或增加mRNA水溶液的体积和/或添加第三流的水溶液，以在所得混合物中产生更低乙醇浓度且由此避免mRNA不稳定性和可能的mRNA沉淀。例如，将乙醇-脂质溶液(具有100％乙醇)与mRNA水溶液以1:4(v/v)的比率混合在所得混合物中产生更低量的乙醇(20％v/v)，从而有助于避免由乙醇引起的mRNA不稳定性和沉淀。不幸的是，这些方法都需要混合比原本所需(例如，如最低溶解度浓度和所需N/P比率可能要求的)更大的体积，通常会显著稀释脂质和mRNA在相应溶液中的量，这在大规模处理层面上会显著增加时间和成本，以及除了乙醇去除步骤外还需要后续的浓缩步骤，从而进一步增加时间和成本。

然而，在将包含脂质的100％mTEG溶液与包含mRNA的水溶液以1:1(v/v)的比率混合以生成mRNA-LNP时，所得混合物中高浓度的mTEG(50％v/v)似乎不会导致mRNA不稳定性或沉淀。使用优化的低体积的包含脂质的mTEG溶液和包含mRNA的水溶液(即，分别具有高脂质和mRNA浓度)大规模制备的这样的mRNA-LNP配制品可以在减小处理体积并由此提高制造中的易处理性方面是有利的。

为了评估脂质的mTEG溶剂相比于脂质的乙醇溶剂优化在mRNA-LNP配制品中使用的体积的能力，用包含溶解于100％mTEG或溶解于100％乙醇中的脂质的脂质体积以低体积比率(1:1脂质体积:mRNA体积)和以高体积比率(1:4脂质体积:mRNA体积)制备mRNA-LNP配制品。溶解的脂质包括PEG修饰的脂质、ML-2或MC3的阳离子脂质、胆固醇和辅助脂质(DSPC)。在混合前，用于低体积混合的mRNA水溶液的mRNA浓度为0.33mg/mL，是用于高体积混合的mRNA水溶液中0.08mg/mL的mRNA浓度的四倍，使得在每个过程中混合相同总量的mRNA。在脂质溶液中，脂质(在100％mTEG或100％乙醇溶液中)处于提供等于4的阳离子脂质(ML-2或MC-3)与mRNA的N/P比率所需的浓度，且根据表4中提供的目标比率(相对于阳离子脂质)来制备PEG修饰的脂质、胆固醇和辅助脂质(DSPC)的浓度。将每种制剂以低体积(1:1脂质溶液:mRNA溶液)或以高体积(1:4脂质溶液:mRNA溶液)体积混合，并且评估所得mRNA-LNP的大小、多分散性(PDI)和对mRNA的包裹百分比(EE％)。

使用包括作为阳离子脂质的ML-2且溶解于mTEG中的脂质制备的低体积(1:1)mRNA-LNP配制品实现69％包裹效率。相比之下，使用包括作为阳离子脂质的ML-2且溶解于乙醇中的脂质制备的低体积(1:1)mRNA-LNP配制品可能无法以低体积配制品稳定产生并且在混合后显示沉淀。

使用包括作为阳离子脂质的MC-3且溶解于mTEG中的脂质制备的低体积(1:1)mRNA-LNP配制品实现99％包裹效率，而使用包括作为阳离子脂质的MC-3且溶解于乙醇中的脂质制备的低体积(1:1)mRNA-LNP配制品显示95％包裹。

表4.与基于乙醇的mRNA-LNP配制品相比，高体积(1:4)和低体积(1:1)无乙醇mRNA-LNP配制品的平均粒度、多分散性指数和包裹效率

结果表明，相对于乙醇制备的LNP配制品，mTEG适合用于低体积、无乙醇mRNA-LNP配制品中并且提供改进的混合后mRNA稳定性以及潜在地改进的包裹效率。

实施例4.测试使用各种聚合物和脂质的无乙醇配制品

此实施例将测试使用各种聚合物和脂质的无乙醇LNP配制品。

将使用各种两亲性聚合物(包括但不限于聚乙二醇(PEG)、mPEG、四乙二醇单甲醚和五乙二醇单甲醚)来制备LNP配制品。

将使用一种或多种非阳离子脂质来制备LNP配制品，所述非阳离子脂质包括二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、和16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)。

将进一步分析使用不显示降解的组分的LNP配制品的包裹效率、LNP大小和多分散性指数，如实施例2中所述。

将以低体积配制品测试显示有利的包裹效率的LNP配制品，如实施例3中所述。

根据上述步骤，将制备安全、划算、低体积的无乙醇LNP配制品用于mRNA递送。

实施例5.在体内测试无乙醇LNP配制品中的mRNA递送

此实施例说明测量无乙醇LNP配制品的体内功效。

制备无乙醇LNP配制品和乙醇LNP配制品用于mRNA递送，如实施例1中所述。

为了测试无乙醇配制品的体内功效，将包含包裹mRNA的LPN的无乙醇LNP配制品和乙醇LNP配制品以在0.1至1.0mg/kg小鼠体重范围内的各种剂量(例如，以0.5mg/kg)通过尾静脉注射静脉内(IV)递送至小鼠，或者气管内递送至小鼠。

通过生物发光研究以及通过对mRNA和蛋白质表达的定量测量来评价各个器官中的LNP生物分布。将用无乙醇LNP配制品获得的生物分布、mRNA和蛋白质表达结果与用乙醇LNP配制品获得的生物分布、mRNA和蛋白质表达相比较。

肺递送

向小鼠施用包裹在LNP中的萤火虫萤光素酶(FFL)mRNA，其是使用无乙醇包裹方法或含有乙醇的包裹方法产生的。对于这些体内研究，通过导管向小鼠气管内施用含有mRNA的LNP，并且在施用后约24小时评估FFL蛋白表达。

被施用至小鼠的FFL mRNA LNP的特征显示于下表5中。如表5中所总结，在此研究中使用低体积(1:1脂质溶液:mRNA溶液)或高体积(1:4脂质溶液:mRNA溶液)配制品，其是在无乙醇条件(例如，使用mTEG代替乙醇)中进行包裹或者是在含有乙醇的条件中进行包裹。

表5.与基于乙醇的mRNA-LNP配制品相比，高体积(1:4)和低体积(1:1)无乙醇mRNA-LNP配制品的平均粒度、多分散性指数和包裹效率

表5显示，使用无乙醇mRNA条件包裹mRNA LNP配制品的包裹和大小参数与含有乙醇的mRNA-LNP配制品(1:4脂质溶液:mRNA溶液；高体积条件)类似或优于含有乙醇的mRNA-LNP配制品(1:1脂质溶液:mRNA溶液；低体积条件)。

体内肺递送研究的结果总结于图1中。图1显示，与接受使用含有乙醇的包裹方法使用高体积(1:4脂质溶液:mRNA溶液)包裹的mRNA LNP的那些动物相比，被施用使用无乙醇包裹方法(例如，mTEG)使用高体积条件(1:4脂质溶液:mRNA溶液)包裹的mRNA LNP的小鼠在动物体内表达的蛋白质的量更高。

结果表明了无乙醇LNP配制品在体内mRNA递送中的功效和可行性。

静脉内递送

向小鼠施用包裹在使用无乙醇包裹方法产生的LNP中的鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)mRNA。对于这些体内研究，通过尾静脉注射向小鼠静脉内施用含有mRNA的LNP，随后在施用后24小时评估血清和肝中的OTC蛋白质表达。

被施用至小鼠的OTC mRNA LNP的特征显示于下表6中。如表6中所总结，在此研究中使用低体积(1:1脂质溶液:mRNA溶液)或高体积(1:4脂质溶液:mRNA溶液)配制品，其是在无乙醇条件中进行包裹。作为此研究的对照，使用以MC-3和DOPE配制的OTC mRNA LNP。

表6.高体积(1:4)和低体积(1:1)无乙醇mRNA-LNP配制品的平均粒度、多分散性指数和包裹效率

*“标准”是指基于乙醇的包裹方法

来自这些研究的数据呈现于图2中。数据显示，使用以下mRNA-LNP配制品时，在血清和肝中存在OTC的表达：(MC-3)1:1 mTEG；(ML-2)1:4 mTEG；以及(ML-2)1:1 mTEG。结果表明了无乙醇LNP配制品在体内mRNA递送中的功效和可行性。

将通过进行数小时和数天的测量在无乙醇LNP配制品和乙醇LNP配制品中比较mRNA和蛋白质表达的其他稳定性研究。

等同物和范围

本领域的技术人员仅使用常规实验就将认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同方案。本发明的范围并不意图受限于上文说明，而是如以下权利要求中所述：

Claims

1.一种将信使RNA(mRNA)包裹在脂质纳米颗粒(LNP)中的方法，所述方法包括以下步骤：将(a)包含一种或多种mRNA的mRNA溶液与(b)包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质和一种或多种PEG修饰的脂质的脂质溶液混合，并且其中混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤包括在两亲性聚合物的存在下混合，以形成呈LNP配制品溶液的包裹在LNP内的mRNA(mRNA-LNP)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述两亲性聚合物包含普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)或其组合。

3.根据权利要求2所述的方法，其中PEG选自三乙二醇单甲醚(mTEG)、甲氧基聚乙二醇mPEG、四乙二醇单甲醚、五乙二醇单甲醚或其组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述PEG是三乙二醇单甲醚(mTEG)。

5.根据权利要求1所述的方法，其中混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以大于25％体积/体积的浓度产生PEG。

6.根据权利要求1所述的方法，其中混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液的所述步骤以约50％体积/体积的浓度包括PEG。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含小于5mM的柠檬酸盐，并且其中所述mRNA-LNP的包裹效率大于60％。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液和/或所述脂质溶液处于大约环境温度下。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述环境温度低于约35℃、低于约30℃、低于约26℃、低于约23℃、低于约21℃、低于约20℃或低于约18℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述环境温度的范围为约18-32℃、约21-26℃或约23-25℃。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非阳离子脂质选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或其混合物。[]

12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非阳离子脂质是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液还包含海藻糖。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法不需要在所述混合步骤之前加热所述mRNA溶液和所述脂质溶液的步骤。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液包含每12L所述mRNA溶液大于约1g mRNA。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述mRNA溶液包含每8L所述mRNA溶液约1gmRNA。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述mRNA溶液包含每4L所述mRNA溶液约1gmRNA。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述mRNA溶液包含每2L所述mRNA溶液约1gmRNA。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述mRNA溶液中mRNA的浓度为大于约0.125mg/mL、大于约0.25mg/mL、大于约0.5mg/mL或大于约1.0mg/mL。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以在2:1与6:1之间的比率(v/v)混合。

21.根据权利要求20所述的方法，其中将所述mRNA溶液与所述脂质溶液以约4:1的比率(v/v)混合。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液的pH在3.0与5.0之间。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述mRNA溶液的pH为约3.5、4.0或4.5。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合步骤以在约3与10mL之间的总体积进行。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述混合步骤以约3mL的总体积进行。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法不包括醇。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括孵育所述mRNA-LNP的步骤。

28.根据权利要求27所述的方法，其中将所述mRNA-LNP在21℃与65℃之间的温度下孵育。

29.根据权利要求28所述的方法，其中将所述mRNA-LNP在约26℃、约30℃或约65℃的温度下孵育。

30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中将所述mRNA-LNP孵育大于约20分钟、约30分钟、约60分钟、约90分钟或约120分钟。

31.根据权利要求30所述的方法，其中将所述mRNA-LNP孵育约60分钟。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液不包含醇。

33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质溶液还包含一种或多种基于胆固醇的脂质。

34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过切向流过滤纯化所述mRNA-LNP。

35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA-LNP的平均大小为小于150nm、小于100nm、小于80nm、小于60nm或小于40nm。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述mRNA-LNP的平均大小的范围为40-70nm。

37.根据权利要求中任一项所述的方法，其中所述脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.3、小于约0.2、小于约0.18、小于约0.15、小于约0.1。

38.根据权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA-LNP的包裹效率大于约70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述mRNA-LNP的N/P比率在1至10之间。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述mRNA-LNP的N/P比率在2至6之间。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述mRNA-LNP的N/P比率为约4。

42.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将5g或更多、10g或更多、20g或更多、50g或更多、100g或更多或者1kg或更多的mRNA以单一批次包裹在脂质纳米颗粒中。

43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过无脉冲流泵混合所述mRNA溶液与所述脂质溶液。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述泵是齿轮泵。

45.根据权利要求44所述的方法，其中所述泵是离心泵。

46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述mRNA溶液以如下范围的流速混合：约150-250ml/分钟、250-500ml/分钟、500-1000ml/分钟、1000-2000ml/分钟、2000-3000ml/分钟、3000-4000ml/分钟或4000-5000ml/分钟。

47.根据权利要求46所述的方法，其中将所述mRNA溶液以如下流速混合：约800ml/分钟、约1000ml/分钟或约12000ml/分钟。

48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述脂质溶液以如下范围的流速混合：约25-75ml/分钟、约75-200ml/分钟、约200-350ml/分钟、约350-500ml/分钟、约500-650ml/分钟、约650-850ml/分钟或约850-1000ml/分钟。

49.根据权利要求48所述的方法，其中将所述脂质溶液以如下流速混合：约100ml/分钟,约150ml/分钟、约200ml/分钟、约250ml/分钟、约300ml/分钟、约350ml/分钟。

50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中所述mRNA溶液的流速是所述脂质溶液的流速的2倍、4倍或6倍。

51.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在不含挥发性有机化合物的过程中纯化所述mRNA。

52.根据权利要求51所述的方法，其中在不含醇的过程中纯化所述mRNA。

53.一种组合物，所述组合物包含通过根据前述权利要求中任一项所述的方法制备的包裹在脂质纳米颗粒中的mRNA。

54.根据权利要求51所述的组合物，其中所述组合物包含5g或更多、10g或更多、20g或更多、50g或更多、100g或更多或者1kg或更多的mRNA。

55.根据权利要求51或52所述的组合物，其中所述mRNA包含一种或多种修饰的核苷酸。

56.根据权利要求51或52所述的组合物，其中所述mRNA是未修饰的。

57.根据权利要求51-54中任一项所述的组合物，其中所述mRNA大于约0.5kb、1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、8kb、10kb、20kb、30kb或40kb。