PT109053A - Suporte cromatográfico para purificação de dna plasmídico por cromatografia de afinidade e respetivo método de purificação - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO A UM NOVO SUPORTE CROMATOGRÁFICO QUE CONSISTE NUM CRIOGEL DE POLI METACRILATO DE 2 -HIDROXIETILO (POLI (HEMA) ) E RESPETIVO MÉTODO DE PURIFICAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO (PDNA), A PARTIR DE LISADOS CELULARES, UTILIZANDO CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE. A FASE ESTACIONÁRIA CONSISTE NUM CRIOGEL DE POLI(HEMA) QUE APRESENTA UMA ELEVADA AFINIDADE PARA O PDNA, PERMITINDO UMA ELEVADA RAPIDEZ E CAPACIDADE DE PURIFICAÇÃO. UTILIZANDO O SUPORTE CROMATOGRÁFICO DE POLI (HEMA) , O MÉTODO DE PURIFICAÇÃO DE PDNA COMPREENDE AS SEGUINTES FASES: PREPARAÇÃO DO SUPORTE CROMATOGRÁFICO, PREPARAÇÃO DA AMOSTRA BIOLÓGICA E EXTRAÇÃO DO PDNA E PURIFICAÇÃO DO PDNA ATRAVÉS DE UMA TÉCNICA DE CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE. ESTA INVENÇÃO É ÚTIL PARA A ELIMINAÇÃO DE IMPUREZAS (1) E OBTENÇÃO RÁPIDA E EFICIENTE DE PDNA (2) COM ELEVADO GRAU DE PUREZA, PARA POSTERIOR APLICAÇÃO TERAPÊUTICA.

Description

DESCRIÇÃO

Suporte cromatográfico de um críogel de polimetacrilafco de 2-hidroxietilo para purificação de DNA plasmídico por croitiatografia de afinidade e respetivo método de purificação

Domínio da invenção A presente invenção dis respeito à utilinação do suporte tromatogrãf xco ique: çansiste num críogel de metaçrilato de 2 ~ h Idroxx © i ϋο : (H.1MA) e te spe ti να método de pur i £ í cação de DMA plasmídioo ;(pEBA)f por um peocwaa© de Gronmtografia de afinidade, para posterior aplicação terapêutica. Este supor te x nova dor apresent. a uma elevada afinidade para o pftíÃ, permitindo a sua ef icaa separação dos eenfcam1 iiaíites que usual.mente i estão presentes nãS: misturas complexas a purificar, tais como RHA, proteínas e endotoxinasEsta invenção pertence ao domínio da Biotecxiologia/Engenharia Bioquímica.

Sumário da invenção A presente invenção possibilita a preparação de pDMA puro í 2) de alta- qua 1 idadea par t i r de soluçdes complexas de iisados celulares, através do uso de apenas um passo de cromaLograiía de afinidade. Para isso, tira-se part ido da è levada af i nidade da mo lé era la de HEMS, const! tuinte de um críogel para com o pDNA. A presente invenção: ê útil na eliminação de impurecas {i} de 1xsados celulares e na obtenção de pDNA de elevado grau

DESCRIÇÃO

Suporte cromatografico de para purificação de DNA plasmídico por cromatograf ia de afinidade e respetivo método de purificação

Domínio da invenção A presente invenção diz respeito ã utilização do suporte cromatográfico que consiste num criogel de metacrilato de 2“hídroxietílo KHBMA) & respetivo método na purificação de DNA plasmídico {pDNA} por um processo de cromatograf ia de afinidade, para posterior aplicação terapêutica. Este suporte inovador apresenta uma elevada afinidade para o pDNA, permitindo a sua eficaz separação dos contaminanf.es que usualmente estão presentes nas misturas complexas a puríficar, tais como PUA, proteínas e endotoxinas, Esta invenção pertence ao domínio da Biotecnologia/Engenharia Bioquímica.

Sumário da invenção A presente invenção possibilita a preparação de pDNA puro (2) de alta qualidade, a partir de soluções complexas de Iisados celulares, através do uso de apenas um passo de cromatograf ia de afinidade. Para isso, tira·-se partido da. elevada afinidade da molécula de HEMA, constituinte de um criogel, para com o pDNA. A presente invenção é ufcil na eliminação de impurezas {1) de Iisados celulares e na obtenção de pDNA de elevado grau de pureza, para utilização futura como vetor terapêutico em

Terapia Géuica ou Vacinas de DNA.

Esfcado da técnica

As terapias moleculares como a Terapia Génica e as vacinas de DNA têm sido estabelecidas, de forma crescente, como alternativas promissoras aos tratamentos médicos clássicos. Ambas as metodologias se baseiam na introdução de uma. molécula terapêutica de ácido nucleico nas células ou tecidos a tratar, através da utilização de um vetor. O organismo ou tecido recetor adquire a capacidade de sintetizar, ele: próprio, o agente terapêutico através da informação recebida. Desta forma, o objetivo ê reparar o genoma, substituindo a região defeituosa pela correta, introduzindo novos genes, ou modificando a expressão dos existentes.

Inicialmente, os vetores virais apresentavam-se como os mais populares e aqueles com os quais estava, a. ser desenvolvido mais trabalho de investigação. No entanto, a segurança deste tipo de vetores tem sido ultimamente posta em causa, pois para além de poderem desencadear uma resposta imunitária aguda, levando â neutralização do vírus e destruição do DNA terapêutico, existe ainda a possibilidade da ativação de oncogenes.

Desta forma, vetores não virais como o pDNA estão a emergir como potentes alternativas, tanto em termos de segurança, como em simplicidade de utilização, facilidade de produção em larga escala, e baixo custo. Assim, é de esperar que nos próximos anos exista um aumento cada vez maior na procura de grandes quantidades de pDNA de pureza elevada.

De um modo geral, o processo de produção de pDNA inc'Uii um passo de construção do plasmídeo, com o gene alvo a 2: de pureza, para ; utilização futura como vetor terapêutico em

Terapia Génica ou Vacinas de DBA..

Estado da técnica

As terapias moleculares como a terapia génica e as vacinas de DNA têm sido estabelecidas, de forma crescente, como alternativas promissoras aos tratamentos médicos clássicos. Ambas as metodologias se baseiam na introdução de uma molécula terapêutica de ácido nucleico nas células ou tecidos a tratar, através- da utilização de um vetor. 0 organismo ou tecido recetor adquire, a capacidade de sintetizar, ele próprio, o agente terapêutico através da informação recebida. Desta forma, o objetivo é reparar o genoma, substituindo a região defeituosa pela correta, introduzindo novos genes, ou modificando a expressão dos existentes.

Inicialmente, os vetores virais apresentavam-se como os ma Is populares: e aqueles com os quais estava a ser desenvolvido maia trabalho de investigação, No entanto,, a segurança deste tipo de vetores tem sido ultimamente posta em causa, pois para além de poderem desencadear uma resposta imunitária aguda, levando a neutralização do vírus e destruição do DNA terapêutico, existe ainda a possibilidade da ativação de oncogenes.

Sesta forma, vetores não virai.s domo o p.DNA estad· a emergir como potentes alternativas, tanto em termos de segurança, como em simplicidade de utilização, facilidade de produção em larga escala e baixo custo. Assim, é de esperar que nos próximos anos exista um aumento cada vez maior na procura de grandes quantidades de pDN.A de pureza elevada.

De ura modo geral, o processo de produção de pDMA: inclui, um passo de. constr-ução do plasmideo, com o gene alvo a reparar, crescimento celular, geralmente em Escherichia extração por lise celular, recuperação primária e vários passos de purificação, que visam a separação do pDNA de outros componentes celulares como o RNA, o DNA genõmico, proteínas e end©toxinas.

Por norma, a técnica de separação usada apõs os processos de clarificação e concentração, tem sido a cromatcgrafia nas suas diferentes vertentes. A cromatografia de afinidade e de pseudo-afinidade é definida como uma técnica de cromatografia liquida, que faz uso de interações biológicas específicas paira a separação e análise de diferentes espécies numa amostra (Sousa et al, 2008}. 0 sucesso da purificação de pDNA depende muito da seleção de uma fase estacionária adequada, sendo o suporte idealmente sólido, macroporoso, química e fisicamente estável. A utilização desta abordagem cromatografica em geral requer também um agente de ligação às moléculas a separar, conhecido como ligando de afinidade, o qual interage seletivamente com a especí e desej ada. A molécula de HBMA jã foi usada como monómero na polimerização de críogéís funcionalizados (Perçin et. al, 2011; Òzek et al, 2013; Andaç et al, 2016). Os criogéis são matrizes superporosas de hidrogêís preparados em condições criogénícas, formados pela reação entre precursores monoméricos qué permitem melhorar a difusão, assim como aumentar a capacidade de ligação do suporte à molécula alvo (Andaç et al, 2016}. Estas fases estacionárias apresentam altas taxas de fluxo a baixa pressão, e são muito estáveis, baratas e fáceis de produzir. Os seus raacroporos ínterconectados, ao contrario dos suportes convencíonaís de agarose (Caramelo-Nunes et al, 2013) permitem a difusão de biomoléculas de grande tamanho como o pDNA (Andaç et al, 2016}. 3 reparar, crescimento celular, geralmente em Escherichia coil, extração por li se celular, recuperação primaria e vários passos de purificação, que visam a separação do pDNA de outros componentes celulares como ο ΕΝΑ, o DMA genómico, proteínas e enddtoxinas.

Por norma, a técnica de separação usada após os processos de clarificação e concentração, tem sido a c r omat ogra fia nas suas diferentes vertentes. A cromatografia de afinidade e de pseudo-afinidade é definida como uma técnica de cromatografia liquida, que faz uso de interações biológicas específicas para a separação e análise de diferentes espécies numa amostra (Sousa et ai 2008} . 0 sucesso da purificação de pDNA depende muito da seleção de uma. fase estacionária adequada, sendo o suporte idealroerte sólido, macropor o so, química e f isícamente est. ãvei . A ut i 1 Inação desta abordagem cromatogrâfica em geral requer também um agente de llg-ação âs moléculas a separar, conhecido: como ligando de afinidade, o qual interage selétívaménte com a espéc ie âese j ada. A molécula de HEMA j á foi usada como monómero na polimerização de criogéis funeiona1ízados {Perçín et ai,, 2Dili Èfeek et al, 2Ql3; Andaç et al. , 201 ê".} . Os criogéis são matrizes superporosas de hidrogéís preparados em condições criogénícas, formados pela reação entre precursores monomer.icos que permitem melhorar a difusão, assim como aumentar a capacidade de ligação do suporte à molécula alvo (Andaç et al, 2016}. Istas fases estacionárias apresentara altas taxas de fluxo a baixa pressão, e são muito estáveis, baratas e fáceis de produzir. Os seus macroporos interconectados, ao contrário dos suportes convencionais de aqarose (Caramelo --Munes et al, 2013} permitem a difusão de biomoléculas de; grande tamanho coma o pDNA (Andaç et al, 2016}. 3 O criogei poli (HEMA) foi usado joara separar o pDNA das impurezas que estão presentes nos lísados celulares. 0 raeta.cri.lato de 2 -hidroxiet ílo {HEMA) é um monomer o çrue apresenta uma elevada afinidade pai'a com o DNA sendo as suas ínteracções maioritariamente por pontes de hidrogénio. Assim, este suporte apresenta-se como uma alternativa promissora a. ser \isada em processos de crcmatografia de afinidade que visam a purificação de pDNA a partir de misturas celulares complexas. A invenção aqui descrita difere das outras que se relacionam com criogéis baseados em HEMA pelo facto de não ser necessária a ligação de qualquer ligando especifico, funcionando a- própra matriz como agente de interação e retenção das moléculas de pDNA a separar.

Está já descrita a purificação de pDNA utilizando nanopartícuias magnéticas baseadas em poli (HEMA) derivatizadas com Histidina (Perçin et al 2012) e de criogéis de poli(HEMA-GMA) ou poli(HEMA) acoplads a ligandos específicos como proteínas ou aminoãcidos (Perçin et al, 2011; Ôzek et al, 2013; Andaç et al, 2016), contudo a imobilização destes ligandos acarreta um significativo aumento de esforços e custo, A presente invenção apresenta, os criogéis poli(HEMA) sem ligando adicional imobolizado, o que permite a purificação de pDNA através de um modo altamente eficiente por uma matriz macroporosa sintética, de fácil produção e com custos reduzidos. Neste caso, a molécula de HEMA, apesar de não ser um ligando, funciona como ligando especifico e é a responsável pelas interações estabelecidas com as espécies biológicas, O documento de Rittich et al (2003) divulga o suporte HEMA-310 1000 que foi utilizado para separar o fago lambda e pDNA e que difere do descrito na presente invenção pelo facto de ser baseado não sõ em metacrilato de 2- O cri ©gel poli (‘HEMS,) foi usado para separar o pDNA das impux'ezas que estão presentes nos lísados celulares. O metacrílato de ; 2-bidroxietilo (HEMA) é um monomer©: que apresenta uma elevada afinidade para com o DNA sendo as suas interações ; maioritariamente pox' pontes de hidrogénio. Assim, este suporte apresenta-se como uma alternativa promissora a ser usada em processos de cromatografia de afinidade que visam a puri f icação de pDNA a partir de misturas celulares complexas. A vantagem desta invenção relativamente aos outros criogéis baseados em HEMA, é o facto de nâo sér necessária a ligação de nenhum ligando específico, funcionando a própria matriz como agente de interação e retenção cias moléculas de pDNA a separar.

Está já descrita a purificação de pDNA utilizando nanopartÍGulas : magnéticas baseadas em poli (HEMA) derívatízadas com Histídina {Perçin et a:l, 2012} e de Griógeis de poli (HSM&-GMA) ou poli (HEMA): acoplados a ligandos específicos como proteínas ou aminoãcídos (Perçin et a3U 2011; Ôzek et al,2 Oil; Andaç et a 1.2016), contudo a imobilização destes ligandos acarreta um aumento de custo no processo. A presente invenção apresenta os criogéis poli(HEMA)sem ligando adicional imobilizado, o que permite a puri f í cação ; de pDNA de um modo alt amente ef ic .lente através da uma matriz macroporosa sintética, de fácil produção e de custos reduzidos. Neste caso, a molécula de HEMA:,: apesar de não ser um 1 í o ando, funciona como ligando específico e é a responsável peias interações estabelecidas com as espécies biológicas, O documento de Rittich et al (2 003} divulga o suporte HEMA--BIO 1000 que foi utilizado para separar o fago lambda e pDNA e que difere da presente invenção pelo facto de ser baseado não sô em mstaerilat© de 2 -hldroxíetílo (HEMA) , mas também em dimetacrilato de etileno, o seu mecanismo de hidroxietilo (ΗΞΜΆ), mas também em dimetacrilato de etileno. O seu mecanismo de separação nâo envolve interação entre o suporte e as biomoléculas (piasmídeos) a separar, sendo feita em função do tamanho das partículas do suporte e das moléculas (cromatografis "slalom"},, o que é muito pouco e£íciente.

Pelo contrário, a presente invenção permite uma separação muito específica de pDNA, devido â interação de afinidade que envolve diferentes tipos de forças, permitindo uma separação altamente seletiva do pDNA. AS patentes US6730781 (BI) e US20041S7244 (Al) dizem respeito a métodos cromatogrãficos de purificação de DNA plasmídico para uso terapêutico. A presente invenção destaca-se das anteriormente referidas, bem como dos trabalhos em artigo supracitados, pelo facto de o suporte cromatogrãfico não necessitar de derivatização com ligandos adicionais, sendo por isso menos dispendioso em termos de custos e tempo de produção, permitindo a obtenção de pDNA de elevado grau de pureza, através de um processo rápido, fácil e inovador:.

Descrição geral da invenção A presente invenção refere-se a um novo suporte cromatogrãfico, que faz uso da elevada afinidade que a molécula de HKMA tem para cora o DNA, sendo por isso adequado para a purificação de pDNA a partir de Usados celulares. O HBMA liga-se â dupla cadeia de DNA por pontes de hidrogénio estabelecidas entre os grupos OH da molécula de HEMA e os grupos fosfato do DNA. Estas interações permitem a separação eficiente dos outros constituintes dos lisados celulares, como o RNA, endotoxinas, DNA genõmico £ separação não envolve interação entre o suporte e as bíotnoléculas (plasnúcleos) a separar, sendo feita em função do tamanho das partículas do suporte e das moléculas (cromatografia ''slalom"!, o que é muito pouco eficiente» Pelo contrário, : a presente invenção permite uma separação muito especifica de pDKA, devido à .interação de afinidade que envolve diferentes tipos de forças, permitindo uma separação altamente seletiva do pDNA*

As patentes US6730781 (BI) e Í1S2 004157244 í AI} di 2em respeito a métodos cromatográficos de purificação de DNA plasmídico para uso terapêutico, A presente invenção destaca-se das anteriormente referidas, bem como dos trabalhos em artigo supracitados, pelo facto de o suporte cromatográfíco não necessitar de der1vat1sação com ligandos adicionai.s, sendo por isso menos dispendioso em termos de custos e tempo de produção, permitindo a obtenção de pDNA de elevado grau de purera, através de um processo rápido, fâc.íl e inovador.

Descrição geral da invenção A presente invenção refere-se a um novo suporte cromatográfico, que faz uso da elevada afinidade que a molécula de HEMA tem para com o DNA, sendo por isso adequado para a purificação de pDNA a partir de Usados celulares, O HEMA liga-se à dupla cadeia de DNA por pontes de hidrogénio estabelecidas entre os grupos OH da molécula de HEMA- e os !grupos fosfato do DNA, Estas interações permitem a separação eficiente dos outros constituintes dos Usados celulares, como o: RNA, endotoxinas, DNA genõmico ígDNA) . A diferente afinidade do ligando DA PP para. o pDNA e para os diferentes contaminantes permite a sua separação

CgDNA), A diferente afinidade do ligando DAPP para © pDNA © para os diferentes contaminantes permite a sua separação seletiva, jã que a fração constituída pelos contaminantes é recolhida em primeiro lugar, enquanto o pDNA permanece ligado à coluna, demonstrando uma grande afinidade para com essa biomoiéeula. 0 pDNA ê posteriormente eluído, com um elevado grau dê pureza, por aumento da força íónica do eluente. Desta forma, o suporte criogel poli(HEMA) apresenta uma maior afinidade para. com o pDNA. O suporte cromatogrãfico foi preparado em condições criogénicas, ~12"C contendo todos os precursores necessários (HEMA, persulfato de amónio, a N,Ν'-metilenc-bis {acrilaraída) , Ν,Ν,Ν' , -tetrametilenodiami.no} , passando por todos os passos de críocongelação.

Apesar de jã terem sido descritos vários suportes para a purificação de pDNA por cromatografía de afinidade, o aqui proposto apresenta vantagens nâo sô em termos de consumo de reagentes e tempo despendido na sua produção, mas também no rendimento.

Em termos gerais, o processo integral realizado ê composto pelos seguintes passos: 1. Preparação do suporte cromatogrãfico criogel pol.i(HEMA} . O criogel é polím.erizado a -12CC num banho de acetona durante 24h; 2. Preparação da amostra biológica para extração do pDNA. Após o crescimento celular, a amostra obtém-se por um método de lise celular alcalina (ou outra) e consequente precipitação com isopropanol. Depois de um passo de centrifugação, o pellet de amostra (principalmente ácidos nucleicos e proteínas) ressuspende-se numa solução tampão de acetato de. sódio, pH 5 (pH de trabalho) . A amostra de pDNA obtida é submetida a um passo de clarificação, no ...............................................................................................................................................................6........... seletiva, já que a fração constituída pelos contaminant.es i 1; é recolhida em primeiro lugar:, enquanto o pDN& permanece ligado à coluna, demonstrando ura a grande afinidade para com essa biomoléeula, 0 pDNA (2) é posteriormente éluldo, com um elevado grau de purena, por aumento da força iônica do eluente. Desta forma, o suporte criogel poli(HEMA) apresenta uma maior afinidade para com o pDNA. O suporte cromatográfico foi preparado em condições criogénicas, -12"C contendo todos os precursores necessários (HEMA, persulfate· de amónio, a D, H' - me ti leno-b.is (acrílamldaj ϋ, N,N' ,K' ~ tetramet11enodiamino} , passando por todos os passos de críocongelação.

Apesar de já terera sido descritos vários suportes para à purificação de: pDNA por cromatografia de afinidade, a presente invenção apresenta vantagens não só em termos de consumo de reagentes e tempo despendido na sua produção, mas também no rendimento.

Em termos gerais, o processo integral realirado é composto pelos seguintes passos: 1. Preparação do suporte cromatográfico criogel poli{HEMA) por polimeriração a temperatura negativa, 2. Preparação da amostra biológica para extração do pDNA. Após o crescimen to celu lar , a. amost ra obtém- se por um método de lise celaiar alcalina (ou outraí e consequente precipitação com isopropa.no!. Depois de um passo de centrifugação, o pellet de amostra {principalmente ácidos nueleieos e proteínas): ressuspende~ se numa solução tampão de acetato de sódio a pH de trabalho. A amostra de pDNA obtida é submetida a um passo de clarificação, no presente caso por preei.p.11a.ção dos contam.ínantes com uma quant idade adequada de sulfato de amou i.o. No final, a 6 presente caso por precipitação dos contaminantes com uma quantidade adequada de sulfato de amónio, No final, a amostra é lavada com o mesmo tampão sem sal de forma a adequar a força íõnica da solução para o passo seguinte; 3. Purificação e obtenção do pDNA, a partir de lisados celulares, por cromatografia de afinidade usando o suporte criogel poli{ΒΕΜΑΐ; a) Ligação de todos os constituintes do lisado celular ao suporte cromatogrãfíeo.

Injeta-se uma amostra do lisado obtido anteriormente na coluna ligada a ura sistema de cromatograf ia liquida, empacotada com o suporte criogel poli(HEMA) e previamente equilibrada com o tampão adequado sem adição de sal. Neste passo, o pDNA e as impure cas ligam-se â coluna na sua totalidade. b) Eluição das impurezas·..

Ao introduzir uma concentração adequada de cloreto de sódio (NaGl) no tampão, as impurezas, sao eluídas e separadas do pDNA; c) Obtenção do pDNA.

Com um único passo de eluição, após aumento da concentração de cloreto de sódio no tampão, obtém-se a fração de pDNA com uni grau de pureza bastante elevado.

Este tipo de cromatografia explora interações por pontes de hidrogénio entre o suporte cromatogrãfico e os constituintes dos lisados celulares, nmeadamente o pDNA. Especifiearner.te, envolve interações entre os grupos OH do suporte e o pDNA de dupla, cadeia, o DNA genõmico e os ácidos nucleicos de cadeia simples (RNA, oligonucleotides e formas desnaturadas de pDNA) que constituem a grande maioria das impurezas (1). 7 amostra é lavada com o meet»©· tampão sem sal de forma a adequar a força ionica da solução para o passo seguinte; 3. Purificação e obtenção do pDKA, a partir de Iisados celulares, por cromatograf ia de afinidade usando o suporte criogel poli {MEMA} « a) Ligação de todos os constituintes do lisado celular ao suporte cromatogrãfíeo,

Injeção de;uma amostra do lisado obtido anteriormente na coluna: ligada a nm sistema de cromatografia liquida> empacotada com o suporte criogel polílBEMA) e previamente equilibrada com o tampão adequado sem adição de sal. fies te pass o, as impurezas (l) e o pDHA (2} ligam ~se ã coluna na sua totalidade. b) Eluição das Impurezas,...................................................................................................................

Ao introduzir uma concentração adequada da cloreto de sódio (EaCl) nó tampão, as impure zás (1): são eluidas e separadas do pDNA; c) Obtenção do pDNA.

Com um único passo de eluição, após aumento da concentração de cloreto de sódio no tampão, obtém-se a fração de pLB.A (2) com um grau de pureza bastante elevado.

Este tipo de cromatograf ia explora interações por pontes de. hidrogénio entre o suporte c romafcográ fico e os constituintes dos Iisados celulares, nomeadamente o pIMã,

Especificament.e, envolve interações entre os grupos OH do supor t e e o pDKA de dupla cade ia i 2) , o DMA genómi. co os ácidos nucleicos de cadeia simples (RBA, óXígonuoleõtidos e formas desnaturadas de pDBA) que constituem a grande maior ia das impurezas (1) . ...............................................................................................................................................................7...........

Descrição das figuras

Figura It Representação esquemática do cromatograma correspondente â separação do plasmídeo pVAXl~LacZ das impurezas do lisado celular utilizando o suporte criogel poli(HEMA) apôs ligação de todos os constituintes celulares com tampão acetato 10 mM pH 5, no qual o pico 1 corresponde às impurezas (1) eluídas com 0,24 9 M de NaCl no mesmo tampão e o pico corresponde ao pDNA puxo (2) eiuído após aumento da concentração de NaCl para 0,40 M.

Figura 2; Representação esquemática do gel de electroforese em agarose, onde são analisadas as frações de pVAXl-LaeE recolhidas ao longo do processo cromatográfico, na qual a linha A representa a amostra injetada de lisado clarificado injetado, a linha 1 representa as impurezas (2) recolhidas após eluição com tampão acetato, pH 5, com 0,249 M de NaCl e a linha 2 representa a fração de pDNA puro (2) recolhida após eluição com tampão com 0,40 M de NaCl.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção diz respeito a um método cromatográfico inovador para a purificação de DNA plasmídieo, a partir de lisados celulares, o qual faz uso da elevada afinidade que a molécula de HEMA tem para com o DNA, O método compreende os seguintes passos: 1. Preparação do suporte cromatográfico criogel poli(HEMA}, 3

Descrição das figuras

Figura 1: Representação esquemática do crotnatograma correspondente à separação do plasmideo pVAXl-LacZ das impurezas do lisado celular utilizando o suporte criogel poli(HEMA) após ligação de todos os constituintes celulares com tampão acetato 10 mM pH 5, no qual o primeiro pico corresponde âs impurezas (1) eluidas com 0,24 9 M: de Naól no mesmo tampão e o segundo pico corresponde, ao pDNA puro (2} eluído após aumento da concent ração de Had para 0,.40. M<

Figura 2: Representação esquemática, do gel de eleecroforese em agarose, onde são analisadas as frações de pVAXl~La.cZ recolhidas ao longo do processo cromatográfico, na qual a linha A representa a amostra injetada de lisado clarificado, a linha 1 representa as impurezas (1) recolhidas após eluição cora tampão acetato, pH 5, com 0,249 M de NaC.1 e a linha 2: representa a fração de pDtJA puro (2) recolhida após eluição eom tampão com õ,4D M de NaCl.

Descrição detalhada da invenção Ά presente invenção diz respeito a um método cromatográfico inovador para a purificação de DNA plasmídico, a partir de lisados celulares, o qual faz uso da elevada afinidade que a molécula de HERA tem para com o DNA. O método compreende os seguintes passos: 1. Preparação do suporte cromatográfíco criogel poiiíHSMA). §

Numa primeira fase, o criogel é formado a partir de uma solução inicial contendo todos os precursores e polimerizada a uma temperatura de -12c' C num banho de cetona, durante 24h. 0 criogel resultante é descongelado e lavado com agua.

Os estudos cromatográficos foram realizados num sistema de Fast Protein Liquid Chromatography (FLPC) à temperatura ambiente. Uma coluna cromatográfica de poliprclileno econo-pac foi empacotada com 3crn de altura de criogel poli(HEMA) e equilibrada com solução tampão acetato 10 mM pH 5 sem sal, a um fluxo de 1 mL/min. 2. Preparação da amostra biológica para extração do pDNA. Células de Escherichia coli foram cultivadas em meio LB (250 mL·} a 37 °c e 250 rmp até uma densidade ótica de aprox-imadamente 10. A amostra de lísado foi preparada por Xise alcalina das células segundo o método de Sambrook et al (1989). G lísado obtido foi submetido posteriormente a uma precipitação com 0,7 volumes de isopropanol e incubado em gelo durante 30 mín a 4 °C. O pellet foi depois redíssoivido em 1 mL de solução tampão acetato 10 mM, pH 5. O pDNA presente nessa solução foi clarificado por adição de sulfato de amónio solido até uma concentração de 2,5 M. A solução foi incubada em gelo durante 15 min e centrifugada a 10,000 g durante 20 min, descartando-se o pellet resultante. A amostra fo.i depois lavada com tampão acetato sem sal de forma a adequar a força iónica da solução para o passo seguinte. Este passo pode ser realizado usando diferentes tipos de culturas celulares, de acordo com os plasmideos a purificar e com a disponibilidade e conveniência de materiais. O método de preparação das amostras aqui descrito é apenas um exemplo, podendo ser aplicados outros processos. ................................................................................................................................................................$...........

Buma primeira fase, o eriogel poli (ííEMA) foi sintetizado a partir de uma solução inicial contendo todos os precursores e polimerizada ia uma temperatura de ~12“Uf mim banbo de acetona, durante 24h. 0 c.riogel resultante foi descongelado e lavado com água.

Os estudos cromatogrãfícos foram realizados num sistema de FPLC (Fas t Protein: Liquid ChLonmtaqraphy) è temperatura ambiente, Uma coluna oromatogrâf íca de polipropilero econo-paé foi empacotada com 3 em de altura de eriogel poli (BEMA} e equilibrada com solução tampão acetato 10 rat! pH 5 sem sal, a ura fluxo ide 1 mL/min. 2. Preparação da. amostra biológica para extração do pDNA. Células de BsOderi.akía cal1 foram cu 1 tívadas em méiio LB (250 ml} a 37 : “C e 25Q rpm até uma densidade ôtie.a de aproximadamente 10. A amostra de lisado foi preparada por li se alcalina das células segundo o método de Sambrook. et al., (1083). 0 11 sado obtido foi submetido depois a uma precipitação com 0,7 volumes de isopropanol e incubado em gelo durante 30iminutos. O pbBA, RMA e outros constituintes como as proteínas, foram recuperados por centrifugação a 16,000 g durante 3 0 minutos,, a 4 :' C, O pel let......foi depois redis sol ui do em 1 ml, de solução tampão acetato 10 mM. pH 5. O pDMA presente; nessa solução foi clarificada por adição de sulfato de amónio sólido até uma concentração de 2,5 M. A solução foi incubada era gelo durante 15 minutos e cent ri f ugada. a i 0.0 0 0 g durante 20 minutos , descar c.ando - se o pellet re suit, ante. A amos tra foi depois lavada com t arapao acetato sem sal de forma a adequar a força fónica da solução para, o passo seguinte. Este passo pode ser realizado usando di fsrenfces tipos de culturas, meios, processos de lise e clarificação, de acordo com os ............................................................................................................o........... 3. Purificação do pDNA. derivado de lisados celulares, por cromatograf ia de afinidade usando o suporte criogel poli(HEMA).

Este processo compreende os seguintes passost a. Ligação de todos os constituintes do iisado celular ao suporte cromatogrãfico sem o uso de sal no eluente.

Aplicaram-se no suporte 25 ,uL de amostra de Iisado clarificado com uma concentração de 600 μ$ de ácidos nucleicos/mL èm tampão de equilíbrio (acetato 10 inM, pH 5 sem sal, com um fluxo de 1 mL/min, A absorvância foi continuamente monitorizada a 280 nm. Nestas condições, as impurezas (1) e o pDNA puro {2} ficam completamente retidos na coluna; b. Obtenção do pDNA e separação dos contaminantes celulares.

As impurezas (2) foram eluídas usando o tampão acetato 10 mM pH 5, com 0,249 M de cloreto de sódio. O pDNA puro (2) foi eluído num único passo, por aumento da concentração de sal para 0,40 M, no mesmo tampão.

Recolheram-se as frações de 0,5 mL em tubos de 1,5 mL. As frações de pDNA foram recolhidas segundo o cromatograma obtido (figura 1) , concentradas e dessalínizadas usando concentradores com um Molecular Weight Cut-Off (MWCO) de 10.000 da Vivaspin (Vivascience). A análise das mesmas foi realizada por eletroforese em gel de agarose 0,8%, com 0,6 μ<$ {mL· de Greensaf e. Na figura 2 apresenta-se a análise das frações de pDNA recolhidas em gel de agarose 0,8%. A linha A corresponde â amostra de Iisado clarificado, a linha 1 corresponde à fraç;ão de impurezas 10 plasmideos a purificar e com a disponibilidade e conveniência de materiais para cada caso. O método de preparação das amostras aqui descrito é apenas um exemplo, podendo ser aplicados outros processos. 3. Purificação do pDNA derivado de Usados celulares, por cromafcografia de afinidade usando o suporte críogel poli (ΉΕΜ&amp;) .

Este processo c orap r e end eu os seguintes passos : a) Ligação de itodos os consti tuintes do lisado celular ao suporte croraatográfico sem o uso de sal no eluente, Âpl i ca r am ~ se no supor t e 25 uL de amostra: de lisado clarificado com uma concentração de 60S pg de: ácidos nucleicos/mL em tampão de equilíbrio (acetato 10 raM, pK 5 s<em' sa 1, á um fluxo de traba 1 ho de 1 mL/roin . A absorvânoia foi continusmente monitor içada a 280 nm. Sestas: condições, os contaminant és (11 e o pDNA (2) ficam eompistamente retidos na coluna; b) Obtenção do pDBA. e separação dos eontamixiantes celulares.:

Ás espécies eoxitaminartes (1) foram eluidas usando tampao acetato 10 taM píí :§, com 0,24 9 M de cloreto de sâdio» 0 pDMA (11 foi elu ido, num único pas so, por aumento da c oncen t r ação de sei par a 0,4 0 M , no mesmo t ampã o < Recolheram - se frações de 0,5 mL em tubos de. 1,5: rol,. As frações de pDNAforam recolhidas segundo o e roaia t ogr ama obtido (figura ; 1} , concentradas e dessalinísadas usando para isso concentradores com um MKfÇD de 1.0.000 da Vi vaspin (Vi vascienc e) . A anal i se das roes má s foi realisada por eletroforese em gel de agarose 0,8%, com 0,6 ug/ml de GreenSafe, B:a figura 2 apresenta~se a análise das frações de pDNA recolhidas ero gel de agarose 0,8%. A linha A corresponde à amostra de lisado clarificado, a linha 1 ............................................................................................................................................................i o............ (1) recolhidas após eluição cora tampão de acetato 10 m.M, pH 5, corn 0,249 M de cloreto de sódio e a linha 2 corresponde à fração de pDNA puro {2} recolhida após aumento da concentração de sal para 0,40 M.

Exemplos de aplicação

Exemplo 1: A potencialidade de aplicação da invenção aqui apresentada foi testada especificamente na purificação por cromatografia de afinidade do plasmídeo pVAXl-LacZ (6,05 Kpb) a partir de lisado clarificado de Escherichia coli, utilizando o suporte cromatogrãfico criogel poli(HERA). Apôs análise das frações de pDNA recolhidas, verificou-se que a amostra apresentava um grau de pureza, por High Performance Liquid Chromatography (HPLC) , d.e 97%, confirmando os resultados da eletroforese em gel de agarose, A ausência de proteínas na amostra de pDNA foi confirmada através do método de Pierce' BCA. Os níveis de contaminação por DNA genómico foram determinados recorrendo â técnica de Real-Time PCR, verificando-se que estão dentro do nível recomendado pelas agências reguladoras para as preparações a utilizar em terapias moleculares (1% massa gDNA/(massa gDNA + Massa pDNA}), Por sua vez, os níveis de endotoxinas na amostra foram determinados através do método de Limulus Amehccyte Lysate (LAL) Cromogénico e correspondem a 3 EU/mg de pDNA, encontrando-se muito abaixo do valor máximo aceite pelas agências reguladoras (< 40 SO/mg de pDNA) .i ............................................................................................................................................................11........... corresponde ã f ração de Impurezas {!) recolhidas apos eluiçâo com tampão acetato íd mM, pH S, com 0.,243 M de cloreto de sódio e a linha 2 corresponde a fração de pPMA poro (2} recolhida após aumento da concentração de sal para 0,40 M.

Exemplos de aplicação

Exemplo 1: A potencialidade de aplicação da invenção aqui apresentada foi testada especificamante na purificação por cromatografia de afinidade do plasmídeo pVAXl-Lac2 {6,05 Kpb} a partir de 1isado clarificado de Escherichi a eol i, utilizando o suporte cromafcogrãfíco criogel poli (ΗΕΜΆ) . Apôs análise das frações de pDNA recolhidas, verificou--se que a amostra apresentava, um grau de pureza, por HPLC, de 97%, confirmando os resultados da eletroforese em gel de agarose* A ausência, de proteínas na. amostra de pDNA foi confirmada através do método de í?íerce:" BC&amp;, Os níveis de contaminação por DMA genómico foram determinados recorrendo à técnica de Real-Time RCR, verificando-se que estão dentro do nível recomendado pelas agências reguladoras para as preparações a utilizar em. terapia:® mo 1 ecu ia res (l % massa griPA/(mas sa gPMA + Massa pENA)} , Por sua vez , os níveis de endotoxinas na amostra foram determinados através do método de L ímulus Amefoocyte Lysa te {LAI.} Gromdgén í co e correspondem a 3 EG/mg de pPMA, encontrando-se muito abaixo do valor máximo aceite pelas agências reguladoras {< 40 .......EU/mg de pDNA) il..............................................................................................................................................................................

Exemplo 2: ............................................................................................................................................................h 'd.............

Exemplo 2: A invenção aqui apresentada pode ser aplicada a nível industrial em larga escala, aumentando para isso a quantidade de criogel poli(HEMA) empacotado. Este método permite a purificação rápida e de baixo custo de pDNA para uso terapêutico. As quantidades de cloreto de sódio usadas são relat.ivamen.te baixas, para além de se tratar de um sal com um potencial eutrófico baixo.

Este método cromafcogrãf ico pode. ser aplicado a lísados bacterianos após qualquer tipo de obtenção e clarificação, não estando condicionado aos apresentados anteriormente: lise alcalina e clarificação por precipitação com sulfato de amónio.

Referências

Andaç M., Galaev I.Y., Denisli A, "Affinity based add molecularly imprinted cryogels: Applications in biomolecule purification" J. Chroraatogr. B Analyt Techno1 Biomed Life Sci 1021 (2016} 69-80.

Caramelo-Nunes C., Almeida P.f Marcos J.C., Tomas C.T, "Dynamic binding capacity and specificity of DAPP-Sepharose support for purification of supercoi led plasmid DMA:" , ” J. Chroraatogr. A, 1307 {2013} 91-98.

Perçin I., Karakoç V. , Akgõl S., Aksõs E. , Denisli A. ., "Poly(hydrcxyethyl methacrylate} based magnetic nanoparticles for plasmid DNA purification from Escherichia coli lysate" Mater1ads Sci Eng.....32 {2012} 1133-1140.

Perçin I. , Saglar E. , Yavus H., Aksõs E. , Denisli A. "Poly (hydroxyethyl raethacry.late) based aff inity crycgel for plasmid DMA purification " Int j Biol Ma cromo.I 48 {2011:) 577-582 . .............................................................................................................................................................12.......... A invenção aqui apresentada pode ser aplicada a nível industrial em larga escala, aumentando para isso a quantidade de crí©gel poli ÍBBMA} empacotado. Este método irá permitir a purificação rápida e de baixo custo de pDXAA para uso terapêutico. As quantidades de cloreto de sódio usadas são relativamente baixas,, para além de se tratar de tim sal com um potencial eutrofico baixo,

Este método cromatográf ico pode ser aplicado a .1 isados bacterianos após qualquer tipo de obtenção e clarificação, não estando condicionado aos apresentados anteriormente: li.se alcalina e clarificação por precipitação com sulfato ......de amónio.....................................................................................................................................................................................................

Referências Ândaç M. , Galaev IY. , Denizli h, "Affio.ity based and molecular ly imprinted eryogels: Applications ín biomacromoleculê purr i:leal ion" J Chromatogr B Analyt

Teebmol Blamed bife Soí . 102.1 (2016} 69-8Q.

Caramelo-Nunes, C., Almeida, P., Marcos, J.C., Tomas, C.T. " py a am i o: bi PP i ng ç a P S ç i t y a nd spec i; fiei t y o f DA PP - fíepharose support for purification of supercoiled plasmid DBA"," Journal of Cbromatograpby A;f 1307, 31-98, 2013.

Ferçin, I., Karaboç, Vi , Afcfolr 3, , Absos, E., Denicli A, "Poly(hydroxyetbyl metb.aeryl.ate} based magnetic nauopar t ides for plasmid J2N&amp; pur 1 f i cat ion from EBaA&amp;richta coli lysate·" Materials Sci Engineering? C, 32 (2012} 11,.33-1140, ............................................................................................................................................................la...........

Rittich B., Spanovã A., Skalníková M., Benes M.J. ''Chromatographic behavior and purification: of linear lambda phage and plasmid DNA molecules on 2-hydroxyethyl methacrylate - ethylene dimethacrylate - ba sed suppor t s" J

Chromatogr A 1009 (2003) 207-214.

Samfcrook J,,. ; Fritsoh E. F. e Maniatis T,, "Molecular

Cloning", 2nd i Edn, CSH Labor at cry Press, Cold Spring Harbor, PL, l$m.

Sousa F., Prazeres D.M.F. e Queiroz J. A., "Affinity chromatography approaches to overcome the challenges of purifying plasmid DNA", Trends Biotechnol. 26 (2008) 518- 525 ..

Or eh E .,, Uzun 1,., Sen el S., Denizli A. "Banospines incorporation into the structure of the hydrophobil cryogels via novel cryogelation method: an alternative sorbent: for plasmid DNA purification" Colloids Surf E Biointerfaces 102 (2013) 243-250.

Patentes citadas

Wils Pierre e Ollivier Monique. Purification of plasmid DNA of pharmaceutical quality. US Patent 6,730,781-B1. 2004.

Gregg Budahasi e Blake Goff, Process for purification of plasmid DNA, US Patent 2004/0157244~A1. 2004.

Covilhã, 21 dezembro de 2015, ..............................................................................................................................................................Λ ..........

Per ç in, I,, Sagiar E... Yavuz, H. , Aksoz, E. .. Denizl i A:. "Poly{hydroxyethyl methacrylate) based affinity cryogel for plasmid ONA purification" Int. j, Biol. Macromol. 48 (20111 577-582.

Rittich, B., Bpanovâ , Skalnfková M» , Benes MJ. " Ch r orna t og raphe. c behaviour and purl float ion of linear lambda phage and plasmid DNA molecules on 2-hydroxy©thy1 methacrylate-ethylene dime uhacrylate-ba sect supports. J Chroma fcogxr A. 100.9 (2003) 207-14. 5 a mb rook J,, Frhtsch E.F, e Man)atie T. , ''Molecular Ginning":, 2nd i Edn> CSn Labe;ratory frees, Gold Dp ηeg

Harbor, FL, 1989. ........Sousa F1, Pr ale res D . Pu F . e Goe i r of G L A h, "Affin It y chromatography ; approaches to overcome the challenges of purifying plasmid IMA'', ’Freuds Biotechuol. 26 (20:08;) 5.18- 525 .

Ozek R, Ozu.n ; L, §enel S, Denir 11 A- "Manospinee incorporation unto the structure of the hydrophobic oryogels via novel cryogelatiox'i: methods an alternative

soreent for.......plasmid DNA pur if 1 pa ti sii." € cl hoi as Surf B B.1 o.1 nt,erf aces . 102 {2013): 2« 3 -50 .

Batentes citadas kills Pierra e Ollivier Monique. Purification of plasmid IWA of pharmaceutical quality< VI'S Patexet 5,730,781-Bl> 2004. .............................................................................................................................................................13...........

Gregg Budahazi e Blake Goff» Process for purification of plasmid DMA. US Patent 2004/0IS7244 ~M . 2004 .

Covilhã, 19 d.e denerabro de 2016'. ........................................................................................................................................................14...............

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Suporte c r om. a t o g r á f i c o para purificação de DMA plasmidico í p DN A) por c r orna L o g r a f i a de afinidade caraterizado por ser um. crxogei de poli metacriiato de 2~ hidroxietilo poli íHE MA), aplicado na purificação de pDNA a partir de iisados celulares. 2: - Método de rpur if reação de pDNA por croma to grafia de a f ir-idade caraterizado por apresentar uma fase .........es ta ci on ária"" com.....e levada.....afinidade.....e.....seletividade" para.....o...................... pONA superenrolado presente em misturas celulares complexas»
2. 3 - Método de purificação de pDNA por cromatograiia de afinidade caraterizado por pode r ser aplicado no tratamento de soluções complexas de Iisados celulares de diferentes estirpes hacterianas.
3. 4 - Método de purificação de pDNA por cromatografia de afinidade, de ; acordo com as reivindicações 2 e 3 caraterizado por permitir a separação das impurezas presentes em amostras biológicas complexas:, como RM.A, proteínas, endotoxinas e ONA çienomico, das frações de pDNA superenrolado com elevada pureza. § - Método de pUrificação de pDNA superenrolado per e r o.m a t. o g r a f i a de afinidade que compreende os seguintes passos: a5 Preparação do suporte crornatográfico criogei ..................................poli(HEMA) ;...................................................................................................................................................................... ......................................................................................................................................................................................................................1..................... REIVINDICAÇÕES 1 ~ Suporte eroma.tográf ico para purificação de DMA plasmidico (pDMA). por cromatograf ía de afinidade que consiste na ρχ-eparação de uma fase estacionária de criogel de poli metacrilato de 2 "bidroxietilo (poli (HEMA) ) , aplicado na purificação de pDNA a partir de 1i sados celulares,

   2 - Suporte cromatografico para purificação de DNA plasmidico (pDNA) por cromatografía de afinidade caraterizado por constituir uma fase estacionária com elevada afinidade e seletividade para o pDNA presente em misturas celulares complexasi uma vez que este é o último constituinte a ser eluido após adição de uma pequena iguant-ídade de sal ao eluente,.

   2 - Suporte cromatogrãfico para purificação de DMA plasmidico (pDMA) por cromatografía de afinidade caracteriaado por pcder ser aplicado no tratamento de soluções complexas de lisados celulares de diferentes estirpes hacterianas, 1 1 ~ Suporte cromatogrãfico para purificação de DNA plasmidico {pDNA} por cromatografía de afinidade> de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3 caraterizado por permitir a separação das impurezas presentes em amostras biológicas complexas, como RNA, proteínas, endotoxinas e DNA genómieo, das frações de pDNA com elevada pureza. b) Preparação das amostras de lissdo celular por a® método ide iise das células fcacterianas e clarificação dos Usados brutos; c) Ligação do pDtI&amp; e dos restanteá corns ti taintes do lisado celular a o cr iogei poIiCHEMã) após injeção das amostras ciar ir.d cadas, util irando tampão acetato 10 mM, pH 5 sem adição de sal; d) Slçiçâo dos contaminantes usando tampão acetato 1.0 mM, pH 5 com sai; ei Eleição e obtenção de pDNA superenrolado puro por aumento da concentração de cloreto de sódio para ..................................0, 4 0 M em t ampâo acetato .10 mM " pH" '.'5-1......................................................................... Covilhã, 06 de março de 201?. ................................................................ ......................................................................................................................................................2:..................... 5 ~ Método de purificação de pBWA por cromatografia de afinidade que compreende os seguintes passos; a} Preparação do suporte crotnacográfico oríogel poli (HSMA) i; b) Preparação das amostras de lisado celular por um método de lise das células foacterianas e clarificação dos lis ados brutos; c) M-gação- do psm e dos restantes cons ti tuíntes do lisado celular ao criogel poli/(HEiMA) apos ingeção das amostras clarificadas, utilizando tampão acetato IQ raM, pH 5 sero adição de sal; d) Kluíção dos contaminantes usando tampão acetato 10 r«M, pH B Com sal; e) Bluíção ei obtenção: de pDKA puro por aumento da concentração de cloreto de sódio para 0,40 M em tampão acetato 10 mM, pH s.
4. 6 - Suporte 'cromatogrâ fico para purificação de DMA plasmídico por cromatografia. de afinidade e respetivo método de purificação, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5 caraterizado por constituir uma fase estacionária e um método cromatografíco adequados para a puri f.i cação de pDNA stiperenrolado à escala Industrial. Covilbã, 19 de dezembro de 2016.