ES2263038T3

ES2263038T3 - Aislamiento de oligonucleotidos antisentido.

Info

Publication number: ES2263038T3
Application number: ES03773016T
Authority: ES
Inventors: Kjell Amersham Biosciences AB ERIKSSON; Bo-Lennart Amersham Biosciences AB JOHANSSON
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2002-11-28
Filing date: 2003-11-17
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2023-11-17
Also published as: AU2003279676A1; US7368561B2; CA2506196A1; DE60305075T2; AU2003279676B2; SE0203521D0; EP1578968B1; JP2006507825A; CN100343390C; EP1578968A1; US20060003331A1; DE60305075D1; CN1717484A; WO2004048569A1; ATE325191T1

Abstract

Un método para aislar oligonucleótidos antisentido de una sola hebra completamente tioados desde solución biológica, comprendiendo dicho método las etapas de contacto de la solución biológica con resina de cromatografía de adsorción de ión metálico inmovilizado (IMAC) para adsorber oligonucleótidos antisentido a esa resina y, a continuación, contacto de la resina con un eluyente en condiciones que proporcionan la desorción de los oligonucleótidos antisentido desde dicha resina, separándose los oligonucleótidos antisentido completamente tioados desde los oligonucleótidos antisentido incorrectamente tioados de dicha solución.

Description

Aislamiento de oligonucleótidos antisentido.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método de aislamiento de oligonucleótidos antisentido desde otros componentes de una solución biológica.

Antecedentes

El uso de los métodos biotecnológicos está extendiéndose cada vez más en la producción de proteínas, péptidos, ácidos nucleicos y otros compuestos biológicos, con fines de investigación, así como para preparar nuevas clases de fármacos. Dada su versatilidad y sensibilidad para los compuestos, frecuentemente, la cromatografía es el método de purificación preferible en este contexto. El término cromatografía abarca una familia de métodos de separación íntimamente relacionados basados todos ellos en el principio de que dos fases mutuamente inmiscibles entran en contacto. Más específicamente, se introduce el compuesto objetivo en una fase móvil que se pone en contacto con una fase fija. El compuesto objetivo experimentará a continuación una serie de interacciones entre las fase fija y móvil, a medida que atraviesa el sistema a través de la fase móvil. Las interacciones explotan las diferencias de las propiedades físicas y químicas de los componentes de la muestra.

En un método de purificación cromatográfico, denominado cromatografía de adsorción de iones metálicos inmovilizados (IMAC), también conocido como cromatografía de afinidad quelante metálica (MCAC), que se utiliza a menudo para la purificación de proteínas, se utilizan las interacciones entre el compuesto objetivo y los grupos quelantes metálicos presentes en la fase fija. El principio que hay detrás de la IMAC radica en el hecho de que muchos iones de metal de transición se pueden coordinar con los grupos fosfato y los átomos de nitrógeno, como por ejemplo los aminoácidos histidina, cisteína y triptofano, a través de grupos donantes de electrones en las cadenas laterales de aminoácido. Para utilizar esta interacción con fines cromatográficos, el ión metálico debe estar inmovilizado en un soporte insoluble. Esto se puede llevar a cabo uniendo un grupo quelante a la matriz cromatográfica. Es sobre todo importante que, para que sea útil, el metal seleccionado tenga una afinidad más alta para la matriz que para los compuestos que se van a purificar. Entre los ejemplos de iones coordinantes adecuados se incluyen Cu(II), Zn(II), Ni(II), Ca(II), Co(II), Mg(II), Fe(III), Al(III), Ga(III), Sc(III), etc.

Se conocen diversos grupos quelantes para su uso en IMAC, como por ejemplo ácido iminodiacético (IDA) que es un quelador tridentado, y ácido nitrilotriacético (NTA), que es un quelador tetradentado. Normalmente, se lleva a cabo la elución de una resina IMAC, en lo que se refiere a las proteínas, por adición de imidazol. Alternativamente, se lleva a cabo convencionalmente la elución reduciendo el pH.

En los últimos años, se ha logrado utilizar IMAC para la purificación de proteínas y péptidos, introduciéndose etiquetas-His por técnicas recombinantes para facilitar una eficiente purificación de las mismas por IMAC. Por esta razón, la IMAC ha asumido un papel más importante en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos. Por otra parte, se ha utilizado también IMAC en la purificación de proteínas y péptidos fosforilados a partir de digestos de proteína trípticos. Dichas proteínas y péptidos fosforilados pueden analizarse posteriormente por ESI/EM/EM para determinar los sitios fosforilados que contienen.

Asimismo, durante el período en el que la IMAC era relativamente nueva, se sugirió su uso para la purificación de diversos compuestos. Por ejemplo, Porath y cols. (USP 4.677.027) describió en 1985 cómo se podían separar macromoléculas y partículas biológicas utilizando un producto que consistía en una fase sólida que tenía iones metálicos inmovilizados en su superficie sustituidos vía un enlace quelato metálico con un polímero. Las biomoléculas previstas son virus y células, pero también se mencionan polisacáridos, proteínas y también oligonucleótidos. No obstante, desde entonces, se han hallado nuevas aplicaciones para los oligonucleótidos, como consecuencia de hallazgos científicos más recientes, que necesitan a su vez nuevas modificaciones de los mismos.

Un ejemplo de un campo desarrollado más recientemente, en el que se modifican oligonucleótidos, es la tecnología anti-sentido en el descubrimiento de fármacos. Los fármacos antisentido funcionan a nivel genético para interrumpir el proceso a través del cual se producen proteínas que causan enfermedad. Esto es posible, ya que se ha demostrado que las proteínas desempeñan un papel central en virtualmente todos los aspectos del metabolismo humano. Prácticamente todas las enfermedades humanas son el resultado de una producción de proteínas inapropiada, o un comportamiento de la proteína desordenado. Esto se aplica tanto a las enfermedades de hospedador, como el cáncer, como a las enfermedades infecciosas, como el SIDA. Los fármacos tradicionales están diseñados para interactuar por todo el organismo con las moléculas de proteína que soportan o causan las enfermedades. Los fármacos anti-sentido están diseñados para inhibir la producción de proteínas que causan enfermedades. Se pueden diseñar para tratar una amplia gama de enfermedades incluyendo infecciones, enfermedades inflamatorias y cardiovasculares y cáncer y tienen el potencial de ser más selectivos y, en consecuencia, más eficaces y menos tóxicos que los fármacos tradicionales. Los mecanismos que hay detrás de la tecnología anti-sentido han sido ampliamente descritos, ver por ejemplo Uhlmann y cols. en Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Principle, Chemical Reviews, vol. 90, número 4, junio de 1990. Brevemente, tal como se conoce, durante la transcripción de ADN en ARN, las dos hebras complementarias del ADN se desenrollan parcialmente, en virtud de lo cual la hebra conocida como la hebra sentido se separa de la hebra conocida como hebra anti-sentido. La hebra antisentido, se utiliza entonces como plantilla para transcribir enzimas que ensamblan ARNm en el proceso conocido como transcripción. A continuación, el ARNm se desplaza hacia la célula, donde los ribosomas leen la información codificada y encadenan aminoácidos para formar una proteína específica en el proceso que se conoce como traducción. Ahora, los fármacos antisentido son hebras complementarias de segmentos pequeños de ARNm y pueden ser tanto ADN como ARN. Para crear fármacos anti-sentido, los nucleótidos se unen en cadenas cortas conocidas como oligonucleótidos. Cada fármaco antisentido se designa para su unión con una secuencia de nucleótidos específica en su ARNm blanco para inhibir la producción de proteína codificada por el ARNm blanco.

La unión de oligonucleótidos se puede llevar a cabo en cualquier tipo de sintetizador de fase sólida automático asequible en el comercio para la síntesis de oligonucleótidos en condiciones cGMP para estudios clínicos y suministro de fármacos comerciales). En dicha síntesis, se producen fácilmente los oligonucleótidos intercambiándose un átomo de oxígeno del grupo fosfato de cada base en el ácido nucleico nativo por un átomo de azufre. No obstante, un problema inherente a la síntesis de dichos oligonucleótidos tioados, denominados aquí oligonucleótidos anti-sentido, es el hecho de que será prácticamente imposible llevarlo a cabo con un rendimiento del 100% oligonucleótidos correctamente fosforotioados. Por el contrario, normalmente se consigue un rendimiento de aproximadamente 70 a 75%. Por consiguiente, antes de poder preparar cualquier fármaco antisentido del mismo, el producto de síntesis requerirá una posterior purificación con el fin de asegurar una calidad suficiente.

La HPLC de fase inversa se utiliza comúnmente para la purificación de oligonucleótidos anti-sentido. Sin embargo, el uso de altas presiones, por lo general, no se considera como unas condiciones ventajosas para este tipo de proceso, ya que exige un equipo especial y también hace que el proceso sea difícil y, en consecuencia, costoso, para aplicarlo a gran escala. Por otra parte, los disolventes orgánicos utilizados comúnmente en esta tecnología pueden ser poco deseables para algunas aplicaciones.

Deshmukh y cols. (Deshmukh, R.R. Miller, J.E. De Leon, P. Leitch, W.E., Cole, D.L., y Sanghvi, Y. S. en "Process Development for Purification of Therapeutic Antisense Oligonucleotides by Anion-Exchange Chromatography", Organic Process Research & Development 2000, 4, 205-213) describe el desarrollo de un método de cromatografía de intercambio de aniones para la purificación de oligonucleótidos antisentido de fosforotioato. Más específicamente, se sintetizaron 20 meros que son inhibidores anti-sentido de la molécula de adhesión de célula ICAM-1 y a continuación, se purificaron en un intercambiador de aniones que llevaba grupos funcionales de amonio cuaternario sobre una matriz a base de poliestireno (Fuente 15 y Fuente Q 30, ambas de Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia). Se observa la resolución más ventajosa para el valor pH más alto sometido a ensayo para determinar la elución, que era un pH de 11. No obstante, sigue pendiente de demostración si se puede separar o no un 20-mero completamente tioados de un 20-mero, en el que no se han sustituido uno o más de los oxígenos blanco por azufres. Según esto, la selectividad que se puede obtener con intercambio iónico para purificación de oligonucleótidos anti-sentido no es todavía completamente satisfactoria. Por otra parte, otro inconveniente es que dicha purificación de oligonucleótidos anti-sentido por cromatografía de intercambio de aniones también requerirá una etapa de desalación a continuación, lo que implica una etapa más de proceso y en consecuencia, un coste de proceso mayor en total.

De manera similar, Deshmukh y cols. (Deshmukh, R.R., Warner, T.N. Hutchison, F. Murphy, M., Leitch, W.E. De Leon, P., Srivatsa, G.S., Cole, D.L., y Sanghvi, Y. S., en "Large-scale purification of antisense oligonucleotides by high-performance membrane adsorber chromatography", Journal of Chromatography A, 890 (2000) 179-192) han sugerido la purificación de oligonucleótidos anti-sentido utilizando membranas de intercambio de aniones fuertes. No obstante, al igual que el método descrito anteriormente, la selectividad que se puede obtener sigue sin ser totalmente satisfactoria (si es esto cierto, se pueden añadir otros inconvenientes/diferencias). Por otra parte, el uso de membranas entraña una baja capacidad y por tanto se requerirán membranas de gran tamaño para conseguir un proceso razonablemente eficiente. Finalmente, este método requerirá, al igual que el intercambio aniónico antes mencionado, una etapa de desalación a continuación.

WO 99/09045 (Somagenics, Inc.) se refiere a sistema terapéutico anti-sentido y antigénico con mejores propiedades de unión y métodos para su uso. Más específicamente, la invención se refiere a oligonucleótidos antisentido y antígeno capaces de unirse topológicamente a un ácido nucleico blanco de una manera que mejora las propiedades de inhibición de traducción y transcripción. En un modo de realización, se describen análogos de fósforotioato de ácidos nucleicos, que tienen azufre en lugar de oxígenos sin puente unidos al fósforo en fosfatos terminales o de internucleótido. Se señala que esta modificación es capaz de una unión más fuerte a los medios de cromatografía de metalo-afinidad que los equivalentes sin modificar. No obstante, no se sugiere o se orienta en ningún modo sobre que la cromatografía de metalo-afinidad pueda ser útil para separar oligonucleótidos con un grado diverso de tioación. Por otra parte, en otro modo de realización, se han platinado los oligonucleótidos. Dichos oligonucleótidos platinados se pueden separar fácilmente de mezclas de reacción por electroforesis preparativa o, alternativamente, por cromatografía de columna de intercambio iónico. Se sugiere asimismo el uso de cromatografía de metalo-afinidad sobre columnas mercuradas como método de purificación de una sola etapa de oligonucleotidos platinados, pero se trata de una simple sugerencia. No existe en este documento nada que dé prueba de que dicha purificación sea eficiente o incluso que funcione, y los componentes de dicha "mezcla de reacción" no se definen.

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de procedimientos alternativos para la purificación de oligonucleótidos antisentido, especialmente de métodos lo suficientemente sensibles como para separar oligonucleótidos antisentido de diferente grado de tioación entre sí.

Compendio de la presente invención

Uno de los objetos de la presente invención consiste en proporcionar un método para aislar oligonucleótidos anti-sentido desde los oligonucleótidos incorrectamente sintetizados correspondientes y/o oligonucleótidos no completamente tioados en una solución biológica. Esto se puede conseguir a través del método que se define en las reivindicaciones.

Un objeto específico de la invención consiste en proporcionar un método para aislar oligonucleótidos anti-sentido desde una solución biológica, presentado dicho método una mejor selectividad en comparación con los métodos de la técnica anterior.

Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar un método de aislamiento de oligonucleótidos anti-sentido a partir de una solución biológica, reduciendo dicho método la necesidad de disolventes orgánicos y/o altas presiones en comparación con los métodos de la técnica anterior.

Otro método más de la presente invención consiste en proporcionar un método de aislamiento de oligonucleótidos anti-sentido desde una solución biológica, siendo fácil de pasar a gran escala dicho método y, por tanto, siendo más rentable que los métodos de la técnica anterior.

Otros objetos y ventajas de la presente invención se pondrán de manifiesto con la descripción detallada que se expone a continuación.

Breve descripción de los gráficos

La figura 1 muestra un ejemplo de fosforotioato tioado completamente de longitud completa de siete bases (a); su análogo mono-fosforodiéster (b) y una secuencia de supresión única (c).

La figura 2 muestra IMAC con el empleo de Fe^{3+} como ión metálico tal como se describe en el ejemplo 1 más adelantes, e ilustra una comparación de elución de dos oligonucleótidos diferentes con la misma secuencia de bases.

La figura 3 muestra IMAC con el empleo de Zr^{2+} como ión metálico tal como se describe en el ejemplo 2 más adelante, e ilustra una comparación de la elución de dos oligonucleótidos diferentes con la misma secuencia de bases.

La figura 4 muestra un ejemplo de una separación eficiente de un oligonucleótido tioado completamente (20S) desde un oligonucleótido con dos enlaces fosfodiéster ("2P") utilizando IMAC.

La figura 5 muestra una separación clara de un oligonucleótido totalmente tioado (20S) desde un oligonucleótido con dos enlaces fosfodiéster ("2P") utilizando IMAC, esta vez por elución en etapas.

Definiciones

En la presente memoria descriptiva, el término "oligonucleótido" se utiliza en su sentido convencional, es decir, significa una secuencia de nucleótidos, y el término "polinucleótido" se refiere a una secuencia más larga de nucleótidos que el oligonucleótido.

El término "nucleotido" significa un radical que comprende dos tres partes, en concreto un fosfato inorgánico, un azúcar simple y o bien o una base purina o bien una base pirimidina. En cada nucleótido, las tres partes están unidas entre sí en el orden -fosfato - azúcar - base. En un oligonucleótido, los enlaces éster unen los componentes azúcar y fosfato de monómeros nucleótido adyacentes. Dado que el azúcar y el fosfato dentro de un monómero nucleótido están unidos también vía un enlace éster, la unión azúcar-fosfato-azúcar a lo largo de la cadena principal de la cadena poli- u oligonucleótido se conoce como un enlace fosfodiéster.

El término "cromatografía" abarca los métodos de separación cromatográfica realizados en columnas rellenas, en lechos expandidos o suspendidos y sobre membranas.

El término "resina" se refiere a la fase sólida utilizada en cromatografía, es decir, el absorbente que captura la especie blanco. Se puede producir una "resina" en forma de partículas porosas o no porosas, esféricas o esencialmente esféricas, perlas, como por ejemplo perlas de adsorción de lecho expandido, y monolitos. Asimismo, al proporcionar la resina sobre un soporte, se pueden proporcionar membranas que son útiles también para el aislamiento de una especie desde un líquido. La resina se conoce también en este campo como matriz.

El término "adsorción" significa aquí la unión de una especie a un ligando sobre una resina.

El término "eluyente" se utiliza aquí en su significado convencional, es decir, para una solución capaz de perturbar la interacción entre la fase sólida (resina) y el producto (especie blanco) y promover la disociación selectiva del producto desde la fase sólida.

\newpage

En consecuencia, el término "desorción" significa perturbar la interacción tal como se ha explicado antes. El término "tampón" o "solución tamponada" se refiere a una mezcla de ácido y base que, cuando está presente en una solu-
ción, reduce o modula cambios en el pH que podrían producirse si no en la solución cuando se añaden ácido o base.

El término "aislamiento" significa aquí una separación de otros componentes y proporciona un compuesto objetivo sustancialmente puro, como por ejemplo un oligonucleótido antisentido sustancialmente puro.

Descripción detallada de la invención

Un primer aspecto de la presente invención consiste en un método de aislamiento de oligonucleótidos antisentido de una sola hebra tioados desde una solución biológica, que comprende las etapas de contacto de la solución biológica con una resina de cromatografía de adsorción de ión metálico inmovilizado (IMAC) para absorber los oligonucleótidos anti-sentido a dicha resina y, a continuación, el contacto de la resina con el eluyente en condiciones adecuadas para proporcionar la desorción de los oligonucleótidos anti-sentido desde dicha resina, separándose los oligonucleótidos antisentido totalmente tioados de los oligonucleótidos anti-sentido incorrectamente tioados en dicha solución. Según esto, la presente invención permite purificar los otros componentes de oligonucleótidos anti-sentido de hebra única completamente tioados de una solución biológica, y por tanto, permite obtener dichos oligonucleótidos en una forma sustancialmente pura.

Tal como conocen las personas especializadas en este campo, durante la síntesis de oligonucleótidos antisentido, además de los oligonucleotidos de una longitud incorrecta, la contaminación más prevalente es la de oligonucleótidos que no han sido tioados completamente. Por consiguiente, la presente invención satisface una importante necesidad en la producción de oligonucleótidos antisentido para aplicaciones terapéuticas y otras.

Por consiguiente, la presente invención aprovecha por primera vez para nuestro conocimiento la interacción de un metal con el grupo fosfotioato de cadena principal de un ácido nucleico en la purificación de oligonucleicos anti-sentido. Sin pretender limitar la presente invención a ninguna interacción específica, se supone que los átomos de nitrógeno de una o más bases de adenina, guanina, uracilo, citosina y timidina del oligonucleótido pueden participar en esta unión.

En el contexto de la presente invención, debe entenderse que el término "completamente" tioado significa que en un 100% de los grupos de cadena principal de fosfato presentes en un oligonucleótido nativo correspondiente, uno de los átomo de oxígeno sin puente en la cadena principal de fosfato ha sido reemplazado por un átomo de azufre.

La resina IMAC utilizada en el método de la presente invención puede ser cualquier resina, como por ejemplo las enumeradas como ejemplos en la sección "Antecedentes". Brevemente, entre los grupos quelantes metálicos se incluyen por ejemplo el grupo iminodiacético (IDA), el grupo tris(carboximetil)-etilendiamina (TED), el grupo N-(hidroxietil)etilendiaminotriacético, y derivados como los grupos IDA N-(metil)- y N-(hidroximetilo). Estos grupos pueden estar reticulados con el soporte polimérico natural o sintético a través de uniones éter alifáticas normales y reactivos, como bisoxirano, epiclorohidrina y 1,4-bis(2,3-epoxipropoxi)butano. Entre los ejemplos de materiales de soporte poliméricos naturales se incluyen v.g., agarosa, alginato, carragenano, gelatina, etc. Los polímeros sintéticos se pueden ilustrar con estireno o derivados, divinilbenceno, acrilamida, ésteres de acrilato, ésteres de metacrilato, ésteres vinílicos, vinil amidas, etc, opcionalmente, reticulados con cualquier agente de reticulación convencional como divinilbenceno, ésteres de (met)acrilato di- o polifuncionales, (met)acrilamidas di- o polifuncionales, trialilisocianurato, divinilamidas. Con fines de claridad, en este contexto, se entiende que una resina de IMAC tal como se utiliza en el presente método comprende un soporte al que se han unido grupos quelantes, cargada con iones coordinantes. Entre los ejemplos de iones metálicos coordinantes adecuados se incluyen v.g., iones Al, Ce, Cu, Co, Fe, In, Ga, Ge, Lu, Ni, Ru, Sb, Sc, Sn, Yc, Zn, Zr, Ta y Th. En uno de los modos de realización de la presente invención, el ión metálico consiste en Zr^{2+} o Fe^{3+}. De acuerdo con la presente invención, este modo de realización proporciona un enlace más fuerte para el fósforo del puente que el azufre correspondiente. Las resinas de IMAC también son asequibles en el comercio, como por ejemplo HiTrap^{TM} Chelating HP Columns y Chelating Sepharose^{TM} Fast Flow, ambas de Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia.

En este contexto, se entiende que el término "resina" se utiliza para abarcar partículas y perlas así como monolitos y membranas.

Los oligonucleótidos antisentido deseados se pueden separar de muchas clases de componentes de la solución biológica, como por ejemplo proteínas u oligonucleótidos incorrectamente sintetizados, dependiendo en gran medida de la naturaleza de la solución biológica. Según esto, en un modo de realización, la solución biológica se proporciona a partir de una síntesis automática de oligonucleotidos antisentido. Según esto, en este modo de realización, la solución biológica es una solución de síntesis. En un modo de realización similar, la solución biológica es una solución en la que los oligonucleótidos antisentido han sido sintetizados con el uso de métodos no automáticos. Por consiguiente, la síntesis se puede llevar a cabo en una solución, con arreglo a métodos muy conocidos o en cualquier tipo de equipo asequible comercialmente, como ÄKTA^{TM} oligopilot (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia). En otro modo de realización, la solución biológica es suero, como por ejemplo suero humano, y el propósito del método puede consistir entonces en cuantificar los oligonucleótidos anti-sentido presentes. Este modo de realización, puede formar parte de un esquema de tratamiento, en el que es deseable someter a ensayo la presencia del fármaco, es decir, oligonucleótido anti sentido en la sangre del paciente.

En un modo de realización, los oligonucleótidos antisentido de una sola hebra (ss) aislados son de un tamaño dentro del intervalo de 10 a 30 bases, por ejemplo de 15 a 25 bases, más específicamente de 18 a 21 bases. En un modo de realización específico, los oligonucleótidos anti-sentidos son de un tamaño dentro del intervalo de aproximadamente 18 a 20 bases. En otro modo de realización, los oligonucleótidos anti-sentido consisten en aproximadamente 25 bases, por ejemplo hasta 20 bases. En otro modo de realización más, los oligonucleótidos antisentido comprenden al menos 5 bases, como por ejemplo al menos aproximadamente 10 bases. No obstante, en este contexto, dado que se conoce que el tipo de estado patológico que se va a tratar empleando la tecnología anti-sentido decidirá la naturaleza, como por ejemplo la secuencia de bases y el tamaño del oligonucleótido anti sentido, debe entenderse que la presente invención también abarca oligonucleótidos más cortos y más largos también, si son útiles en un fármaco basado en la tecnología anti-sentido. Dichos fármacos son útiles en el tratamiento tanto de enfermedades de hospedador, como cáncer, como en enfermedades infecciosas, tal como se explica con mayor detalle en la sección "Antecedentes" anterior.

No obstante, tal como se indica también en la sección de antecedentes anterior, la síntesis de oligonucleótidos antisentido a menudo tiene como resultado en parte oligonucleótidos antisentido incorrectamente sintetizados. Las impurezas más comunes en una solución biológica que resultan de dicha síntesis son las secuencias de supresión, es decir, oligonucleotidos antisentido que son una o más bases más cortos que el producto deseado. Dichos oligonucleótidos suprimidos se pueden describir como (n-1)meros, (n-2)meros, (n-3)meros, etc. representando n el número de nucleótidos del producto de longitud completa deseado. Según esto, en uno de los modos de realización del método de la presente invención, se separan los oligonucleótidos antisentido completamente tioados de los oligonucleótidos incorrectamente sintetizados. Otros ejemplos de oligonucleótidos incorrectamente sintetizados son las secuencias de adición, es decir, oligonucleotidos anti-sentido que son más largos que los productos deseados, y productos ramificados.

Otro ejemplo de componentes no deseados en una solución biológica como resultado de la síntesis de oligonucleotido anti-sentido es la secuencia incorrectamente tioada, es decir, oligonucleótidos no totalmente tioados. Tal como se ha mencionado anteriormente, constituye una de las contaminaciones que se dan más comúnmente en una solución de síntesis. La forma que más domina es la de los oligonucleótidos con uno o más enlaces sin tioación. Por consiguiente, en uno de los modos de realización del método de la presente invención, se separan los oligonucleótidos anti-sentido completamente tioados de oligonucleótidos anti-sentido incorrectamente tioados que contienen de 1 a 5, por ejemplo 1 ó 2, enlaces sin tioación. Otros ejemplos de oligonucleótidos incorrectamente tioados son por ejemplo oligonucleótidos 20-méricos en los que no se ha tioado correctamente un grupo fosfodiéster, y por tanto, se separa el oligonucleótido, que está tioado en aproximadamente un 95%, de los totalmente tioados. De manera similar, un oligonucleótido 19-mérico, 18-mérico o 17-mérico en el que una base no ha sido tioada correctamente es tioado hasta aproximadamente un 94%. Por consiguiente, en un modo de realización, los oligonucleotidos antisentido completamente tioados presentes se aíslan de los oligonucleótidos que están tioados en aproximadamente un 90%, por ejemplo aproximadamente un 94%, preferiblemente aproximadamente un 95%. En otro modo de realización, los oligonucleótidos antisentido completamente tioados presentes se aíslan de los oligonucleótidos que están tioados en aproximadamente un 40%, preferiblemente, aproximadamente un 60%, más preferiblemente aproximadamente un 80%, siendo sobre todo preferible aproximadamente un 90%.

En la técnica anterior, cuando las proteínas y/o péptidos han sido aislados empleando IMAC, se emplean condiciones de pH neutro o cercano al neutro, como por ejemplo aproximadamente 7,5 a 8,0. Los autores de la presente invención han observado de manera inesperada que cuando se aíslan oligonucleótidos antisentido empleando IMAC, es más favorable un pH más bajo. Por lo tanto, en un modo de realización del método de la presente invención, las condiciones para la adsorción se definen por un valor de pH por debajo del neutro. En un modo de realización específico, se adapta el pH por debajo de aproximadamente 7, como por ejemplo aproximadamente 5. Por lo tanto, el pH de la solución biológica en contacto con la resina puede oscilar en el intervalo de 0,7 a 0,6 o 0,5. El pH puede ser ajustado fácilmente por la persona especializada en este campo añadiendo un tampón o ácido adecuado, como por ejemplo ácido acético diluido. En un modo de realización ventajoso, el pH se ajusta en aproximadamente 5,0 y el tampón utilizado consiste en acetato sódico 15 mM. Tal como se podrá apreciar, dado que los oligonucleótidos son sensibles a valores de pH extremos, deberá adoptarse un especial cuidado para no ajustar el pH de ningún modo que pueda dañar los oligonucleótidos anti-sentido.

La elución de los oligonucleotidos anti-sentido deseados desde la resina puede llevarse a cabo según los métodos convencionales utilizando un pH mayor y/o un gradiente de fosfato, como por ejemplo, empleando fosfato potásico. Como ejemplo de gradiente se puede mencionar el utilizado en la parte experimental más adelante, es decir partiendo del pH utilizado para la adsorción, por ejemplo desde 0,1% de ácido acético a fosfato potásico 0,5 M. En un modo de realización alternativo, el gradiente está comprendido entre un pH 3,0 y fosfato potásico 0,2 M. Son útiles también para la elución otras sales y tampones conocidos pudiendo las personas especializadas establecer las condiciones apropiadas para la elución. Tal como advertirán las personas especializadas en este campo, la adición de una sal aumentará la concentración iónica, y por lo tanto, el pH en torno a los oligonucleótidos antisentido cambiará ligeramente. No obstante, el pH en general durante la adsorción de los oligonucleotidos antisentido será todavía más bajo que las condiciones conocidas para el uso de IMAC para la separación de proteínas.

En un modo de realización específico, el método de la presente invención comprende además una etapa posterior de pulido de los oligonucleótidos anti-sentido aislados. Dicho pulido puede ser realizado fácilmente por las personas especializadas en este campo, por ejemplo por filtración de gel, precipitado de destritilación, desalación, cambio de tampón, etc.

A pesar de que los ejemplos que se exponen más adelante son a pequeña escala de laboratorio, se entiende que las personas especializadas en este campo podrán aumentar la escala del método de la presente invención a una dimensión útil para una planta de producción. Por consiguiente, una ventaja del método de la presente invención es que requiere menos disolventes caros y menos equipo que v.g., el método de cromatografía en fase inversa anteriormente sugerido (RPC).

Un tercer aspecto de la presente invención consiste en el uso de una resina de cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) para aislar oligonucleótidos antisentido desde los oligonucleótidos correspondientes en una solución biológica. La resina IMAC puede ser tal como se ha explicado anteriormente en relación con el método según la invención, pudiéndose aplicar también las consideraciones antes expuestas para este uso.

Finalmente, la presente invención se refiere también a un estuche para la purificación de oligonucleótidos antisentido de una sola hebra completamente tioados desde una solución biológica, comprendiendo dicho estuche una columna de cromatografía rellenada con una resina de cromatografía de adsorción de ión metálico inmovilizado (IMAC) e instrucciones escritas para la separación de dichos oligonucleótidos completamente tioados desde oligonucleótidos que no están completamente tioados. Dicho estuche puede comprender una columna a escala de laboratorio o una columna de un tamaño adecuado para la producción a gran escala de oligonucleótidos antisentido. Por otra parte, el estuche puede comprender tampones adecuados para la elución y, opcionalmente, también para el lavado en un compartimiento distinto.

Descripción detallada de los gráficos

La figura 1 muestra un ejemplo de un fosforotioato completamente tioado de longitud completa de siete bases (a); su análogo de fosfodiéster (b) y una secuencia de supresión única que tiene como resultado un (n-1)mero (c).

La figura 2 muestra IMAC utilizando Fe^{3+} como ión metálico tal como se ha descrito en el ejemplo 1 a continuación e ilustra una comparación de elución de dos oligonucleótidos diferentes con la misma secuencia de bases. El eje de las X muestra el volumen de retención en ml, mientras que el eje de las Y muestra la absorbancia UV a 260 nm en mAU. Uno de los oligonucleótidos está completamente tioado (representado 20S en la figura 2), mientras que el otro está sin modificar (representado 20P en la figura 2). Se ve claramente que el oligonucleótido antisentido se puede separar de la forma fosfodiéster (sin modificar) de oligonucleótidos, eluyéndose la forma tioada como un pico relativamente estrecho a 7,3 ml, antes de la forma sin modificar. Los dos picos pequeños eluidos anteriormente en el cromatograma están relacionados con la síntesis presumiblemente y son causados por impurezas en la muestra que no contiene ningún grupo fosfotioato o fosfodiéster.

La figura 3 muestra IMAC en la que se utiliza Zr^{2+} como ión metálico, tal como se describe en el ejemplo 2 más adelante, e ilustra una comparación de elución de dos oligonucleótidos diferentes, con la misma secuencia de bases. Los ejes de las X y las Y se han descrito anteriormente. Uno de los oligonucleótidos está totalmente tioado (representado 20S en la figura 3), mientras que el otro está sin modificar (representado 20P en la figura 3). Resulta evidente que el oligonucleótido anti-sentido se puede separar de la forma fosfodiéster (no modificada) de oligonucleótidos, eluyéndose de nuevo la forma tioada como un pico relativamente estrecho a aproximadamente 9,4 ml, antes de la forma sin modificar. Los dos picos pequeños eluidos anteriormente el en cromatograma se explican como se ha explicado anteriormente para la figura 2. Una comparación de la figura 2 y la figura 3 revela una afinidad más fuerte de los oligonucleótidos para el ión Zr que para el ión Fe, sin embargo, se señala que las condiciones utilizadas no han sido optimizadas.

La figura 4 muestra un ejemplo de una separación eficiente de dos oligonucleótidos que tienen la misma secuencia, tal como se ha descrito en detalle en el ejemplo 3. Más específicamente, este gráfico muestra que es bastante posible separar un oligonucleótido completamente tioado (20S) de un oligonucleótido con dos enlaces fosfodiéster ("2P") utilizando IMAC. Los picos están claramente separados en el cromatograma. Para la elución, se utilizó un gradiente lineal 10 CV desde acetato sódico 15 mM a fosfato potásico 0,2 M.

La figura 5 muestra otra vez una clara separación de dos oligonucleótidos que tienen la misma secuencia que la descrita en el ejemplo 4. Más específicamente, este gráfico muestra una resolución de referencia completa de los picos correspondientes a un oligonucleótido completamente tioado (20S) desde un oligonucleótido con dos enlaces fosfodiéster ("2P"). Por consiguiente, la presente invención demuestra que es posible separar un oligonucleótido completamente tioado de un oligonucleótido con dos enlaces fosfodiéster empleando IMAC y elución en etapas. Para la elución, se aplicó un gradiente en etapas: la etapa 1 consistió en fosfato potásico 0,1 M y la etapa dos en fosfato potásico 0,2 M. Los resultados obtenidos en los ejemplos 3 y 4 tal como se ilustran en las figuras 4 y 5 proporcionan datos que corroboran una importancia esencial de los grupos fosfonato en dicha unión, no las bases. Por consiguiente, esto contradice lo indicado anteriormente en WO 99/09045 antes citada, donde se afirma que un grado de tioación más alto podría producir una unión más fuerte para una resina IMAC.

Parte experimental

Los ejemplos que se exponen a continuación tienen un fin ilustrativo solamente y no deberán interpretarse como limitativos de la presente invención, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Todos los documentos citados a continuación y en otras partes de la memoria descriptiva se incluyen en el presente documento como referencia.

Ejemplo 1 Purificación de oligonucleótidos anti-sentido de una sola hebra por IMAC utilizando Fe^{3+} como ión metálico

Los oligonucleótidos utilizados en este estudio fueron 20-meros con la secuencia GCC CAA GCT GGC ATC CGT CA. Se utilizaron dos oligonucleótidos diferentes, uno totalmente tioado y otro sin ninguna modificación (forma fosfodiéster).

Para el estudio se utilizó una columna IMAC pequeña con química IDA, la columna HiTrap^{TM} Chelating HP (volumen 1 ml) (comercializada por Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia, Prod# 17-0408-01).

Los disolventes/tampón utilizados en este ejemplo son bastante inhabituales para IMAC. Como "tampón" de unión se utilizó una solución de ácido acético al 0,1% en agua. Se consiguió la elución con un gradiente lineal de volumen de columna 10 a partir de 0,1% de ácido acético en agua a fosfato potásico 0,05M. No obstante, se advierte que estas condiciones no estaban optimizadas, ni para la unión (adsorción) ni para la elución.

La velocidad de flujo del eluyente fue 1 ml/min y la detección se realizó con UV a 260 nm.

Por consiguiente, se sometió a ensayo Fe^{3+} y se observó que era útil como ión metálico en el método según la invención. Los resultados de este ejemplo son los que se muestran en la figura 2.

Ejemplo 2 Purificación de oligonucleótidos anti-sentido de hebra única por IMAC empleando Zr^{2+} como ión metálico

Los oligonucleótidos utilizados en este estudio fueron los 20-meros descritos en el ejemplo 1 anterior. Para el estudio se utilizó una columna de IMAC pequeña con química IDA, la columna HiTrap^{TM} Chelating HP (volumen 1 ml) (comercializada por Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia, Prod# 17-0408-01).

En este ejemplo, el "tampón" de unión fue como el del ejemplo 1, una solución de ácido acético al 0,1% en agua. Se alcanzó una elución aquí con un gradiente lineal de volumen de columna 10 desde ácido acético al 0,1% en
agua hasta fosfato potásico 0,2 M. No obstante, se observa que estas condiciones no fueron tampoco optimi-
zadas.

La velocidad de flujo del eluyente fue 1 ml/min y se llevó a cabo la detección con UV a 260 nm.

Por consiguiente, se sometió a ensayo Zr^{2+} y se observó que era útil como ión metálico en el método según la invención. En la figura 3 se muestran los resultados de este ejemplo.

Ejemplo 3 Purificación de oligonucleótidos (antisentido) sintéticos a partir de oligonucleótidos completamente tioados por IMAC, elución por gradiente lineal

En este ejemplo se demuestra que con el método según la presente invención se pueden separar oligonucleótidos completamente tioados de oligonucleótidos solo parcialmente tioados.

Los oligonucleótidos utilizados en este estudio fueron 20-meros con la secuencia GCC CAA GCT GGC ATC CGT CA. Se utilizaron dos oligonucleótidos diferentes, uno totalmente tioado y uno con dos de los enlaces sin modificación (forma fosfodiéster). Los enlaces fosfodiéster estaban en la posición 10 y 15 (definida desde el extremo 5'), respectivamente.

Para el estudio, se utilizó una columna IMAC pequeña con química IDA, la columna HiTrap^{TM} Chelating HP (volumen 1 ml) (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia, Prod# 17-0408-01). El metal estudiado fue Zr^{2+}.

Los disolventes y tampones utilizados aquí son bastante inhabituales para IMAC. Como tampón de unión, se utilizó acetato sódico 15 mM y un pH de 5,0. Se consiguió la elución con fosfato potásico, 0,2 M, pH 6,5. La velocidad de flujo fue 1 ml/min y la detección se hizo con UV a 260 nm.

En la figura 4 se muestran los resultados, que también proporcionan una comparación entre el oligonucleótido completamente tioado (20S) y el oligonucleótido con dos enlaces fosfodiéster ("2P").

\newpage

Ejemplo 4 Purificación de oligonucleotidos (antisentido) sintéticos a partir de oligonucleótidos completamente tioados por IMAC, elución por gradiente en etapas

Este es un segundo ejemplo en el que se ilustra cómo con el método según la presente invención se pueden separar oligonucleótidos completamente tioados de oligonucleótidos parcialmente tioados. Los materiales de partida y los instrumentos fueron como los del ejemplo 3 anterior, el tampón fue acetato sódico 15 mM, pH 5,0, y en este ejemplo, la elución se realizó por gradiente en etapas. La primera etapa consistió en 2 CV en fosfato potásico 0,1 M y la segunda etapa consistió en 2 CV en fosfato potásico 0,2 M. En la figura 5 se muestran los resultados, en la que se muestra una separación de una mezcla de dos oligonucleótidos, un oligonucleótido completamente tioado (20S) y un oligonucleótido con dos enlaces fosfodiéster ("2P").

Claims

1. Un método para aislar oligonucleótidos antisentido de una sola hebra completamente tioados desde solución biológica, comprendiendo dicho método las etapas de contacto de la solución biológica con resina de cromatografía de adsorción de ión metálico inmovilizado (IMAC) para adsorber oligonucleótidos antisentido a esa resina y, a continuación, contacto de la resina con un eluyente en condiciones que proporcionan la desorción de los oligonucleótidos antisentido desde dicha resina, separándose los oligonucleótidos antisentido completamente tioados desde los oligonucleótidos antisentido incorrectamente tioados de dicha solución.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la solución biológica tiene como resultado la síntesis de oligonucleótidos antisentido.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en el que se separan los oligonucleótidos anti-sentido completamente tioados desde oligonucleótidos antisentido incorrectamente sintetizados.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que los oligonucleótidos antisentido completamente tioados se separan de oligonucleótidos anti-sentido incorrectamente tioados que contienen de 1 a 5, por ejemplo 1 ó 2, enlaces sin tioación.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el ión metálico es Zr^{2+} ó Fe^{3+}.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que los oligonucleótidos antisentido tienen un tamaño dentro del intervalo de 5 a 30, preferiblemente de 15 a 25 pares de base.

7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el pH de la solución biológica está por debajo de aproximadamente 7 durante la adsorción de oligonucleótidos antisentido.

8. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que la adición comprende una etapa posterior de pulido de los oligonucleótidos antisentido aislados.

9. El uso de resina de cromatografía de adsorción de ión metálico inmovilizado (IMAC) para aislamiento de oligonucleótidos antisentido de una sola hebra completamente tioados desde oligonucleótidos antisentido incorrectamente tioados en una solución biológica.