NL8302921A - Werkwijze voor de synthese van een oligonucleotide op een vaste drager. - Google Patents

Description

f V * VO 4982 ‘ 1 *

Werkwijze voor de synthese van een oligonucleotide op een vaste drager.

De uitvinding heeft betrekking op een methode voor de synthese van deoxyribodligonucleotiden en riboöligonucleotiden op een vaste drager.

Gedurende de laatste jaren zijn door wetenschappers me-5 thoden ontwikkeld voor de synthese van oligonucleotiden met gedefinieerde volgorden, die gebruikt kunnen worden om DNA en RNA te manipuleren. Bijvoorbeeld kunnen synthetische stukken DNA met een grootte van 10 tot 14 eenheden door specifieke enzymatische technieken worden samengevoegd onder vorming van hele genen of dienst doen als peil-middelen 10 die hulp bieden in het identificeren van een gewenste DNA volgorde. Ketens van synthetische oligonucleotiden kunnen dienst doen als linkers (verbindingsbruggen) om hulp te bieden in het samenbinden van stukken DNA of in de constructie van recombinant DNA moleculen.

Oligonucleotiden werden voor het eerst op synthetische 15 wijze bereid door Khorana et al. door middel van een diëster synthese, J.Molec. Biol. 72 : 251 (1972). Narang et al., J. Biological Chemistry 250 : 4592 (1975), breiden deze procedure uit met de ontwikkeling van een triëstersynthese. Deze oudere methoden waren lastig en verbruikten veel tijd. Veel tijd was nodig om nucleotiden met succes samen te voe-20 gen, om reagentia voor condensatie te bereiden en om de produkten na elke condensatiestap te zuiveren, alsmede om de uiteindelijke nucleo-tidevolgorde te isoleren en te zuiveren.

Letsinger, et al., J. am. Chem. Society 97 : 3278-79 (1975) verbeterde de synthesemethoden voor oligonucleotiden door de beschrij-25 ving van de fosfiet-triëster-procedure. Deze fosfiet-triëster-benade-ring werd . later uitgebreid tot een vaste-fase synthese van oligonucleotiden. Vaste-fase of polymeerdrager-synthesemethoden verdienen de voorkeur omdat ze de scheidings- en zuiveringsstappen vergemakkelijken. Vaak wordt silicagel, een stijf, niet zwelbaar colloid als drager 30 gebruikt. In de vaste-fase procedure wordt een beschermd nucleoside in reactie gebracht met een fo'sfityleringsmiddel zoals methoxydichloro-fosfine. Het resulterende nucleoside fosfomonochloridiet wordt daarna in reactie gebracht met een tweede beschermd nucleoside, dat aan een Ö Ö J -α i i 2 drager is gebonden. Een daaropvolgende milde oxydatie onder toepassing van jodium in tetrahydrofuran, lutidine en water zet het fosfiet om in een fosfaat. Hoewel deze werkwijze veel sneller is dan de oudere methoden, wordt een aanzienlijke hoeveelheid van het 3'-31-isomeer gevormd, 5 zelfs wanneer de reactie wordt uitgevoerd bij -78°C en de verhouding van nucleoside tot fosfityleringsmiddel nauwkeurig wordt geregeld. Een ander nadeel was de instabiliteit van de reactieve tussenprodukten ten opzichte van hydrolyse en oxydatie door de lucht.

Caruthers et al., J. Am. Chem. Soc. 103 : 3185 - 3191 10 (19811, wijzigden deze procedure door een tetrazolide-derivaat van nucleo- side-fosfiet te introduceren. Dit tussenprodukt is echter niet erg stabiel en bereiding van het derivaat introduceert een extra stap, die bij -78°C moet worden uitgevoerd.

Caruthers et al., Tetrahedron Letters 22, 1859 - 62 15 (1981), wijzigden de basisprocedure ook zodanig, dat methoxydichloro- fosfine, het fosfityleringsmiddel, wordt omgezet in een Ν,Ν'-dialkylamino-derivaat dat bij behandeling met een nucleoside een behoorlijk stabiel nucleoside-fosfiet geeft. Het produkt wordt daarna behandeld met sili-cagel dat een nucleoside draagt, in tegenwoordigheid van tetrazool. Hoe-20 wel deze procedure een tussenprodukt geeft met grotere stabiliteit dan tevoren, wordt dit nadeel afgezwakt door de tijdvergende bereidingsmethode van het uitgangsmateriaal.

Er bestaat derhalve een blijvende behoefte aan een procedure voor de synthese van een oligonucleotide op een vaste drager, 25 welke procedure betrekkelijk eenvoudig en gemakkelijk kan worden uitgevoerd en die de bovenstaand beschreven problemen vermijdt. Doel van de onderhavige is derhalve om een werkwijze te ontwikkelen voor de vaste-fase synthese van oligonucleotiden, die gemakkelijk en op economische wijze kan worden uitgevoerd en een stabiel produkt geeft.

30 Gevonden is dat oligonucleotiden gemakkelijk op een vaste drager kunnen worden gesynthetiseerd door een methode, waarbij de vaste drager wordt behandeld met een fosfityleringsmiddel, gevolgd door behandeling met het nucleoside. Dit staat in tegenstelling tot de bestaande methoden, waarbij het nucleoside wordt behandeld met het fosfi-. 35 tyleringsmiddel, gevolgd door behandeling met de drager.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze ' 8302921

JS

3 voor de synthese van oligonucleotiden op een vaste-fase drager, op de eerste plaats silicagel. Een nucleoside wordt aan de vaste-fase drager gekoppeld met zijn 31-hydroxylgroep. De 5'-hydroxylgroep van het nucleoside wordt door een beschermingsgroep beschermd. De beschermingsgroep .

5 wordt verwijderd, en de vrije 5'-hydroxylgroep reageert met een bifunctio-neel fosfitileringsmiddel. De drager wordt daarna behandeld met een beschermd nucleoside. De fosfietgroepen worden geoxydeerd tot fosfaten, en de 5'-hydroxylbeschermingsgroep wordt van het tweede nucleoside verwijderd. Daarna wordt de keten verlengd volgens dezelfde cyclus van 10 reacties: behandeling met fosfitileringsmiddel, behandeling met een ander nucleoside, en oxydatie. Aan het eind van de synthese wordt het oligonucleotide van de drager afgesplitst, gedeblokkeerd, en gezuiverd.

Met deze procedure kunnen oligonucleotiden bij gematigde temperaturen worden gesynthetiseerd. De synthese kan plaatsvinden in 15 een enkel vat en kan gemakkelijk worden geautomatiseerd. Bovendien kan een grote overmaat reagerende materialen worden gebruikt en gemakkelijk na de reactie worden teruggewonnen.

Volgens de onderhavige uitvinding kunnen oligonucleotiden op een vaste-fase drager worden gesynthetiseerd. De hier gebruikte 20 term ’'oligonucleotide” omvat zowel riboöligonucleotiden als deoxyribo-oligonucleotiden.

In de eerste stappen van de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding, wordt een nucleoside aan een vaste drager gekoppeld.

Als algemene regel kan als drager in de onderhavige werkwijze een vaste 25 drager worden gebruikt, die toestaat dat moleculen vrijelijk daarin diffunderen, en die niet op irreversibele wijze reagentia absorbeert. Een geprefereerde drager is silicagel. De koppeling vindt plaats tussen de 2'-hydroxylgroep van het nucleoside en de drager; de 5’-hydroxylgroep wordt beschermd door een beschermingsgroep zoals een monomethoxytrityl-30 of dimethoxytrityl-groep, waarvan de dimethoxytrityl-groep de voorkeur heeft. Deze beschermingsgroep wordt verwijderd en het nucleoside wordt behandeld met een bifunctioneel fosfitileringsmiddel om een aan de drager gebonden nucleoside-fosfomonochloridiet te vormen. Als fosfitileringsmiddel kan ook alkyl- of aryl-fosfodichloridiet worden gebruikt, 35 waarbij methoxydichlorofosfine de voorkeur heeft.

Dit bifunctionele fosfitileringsmiddel kan direct aan A .·> “Ί -\ ^ .!« c -·; i ï 4 het nucleoside worden toegevoegd, of kan eerst worden gemodificeerd door het om te zetten in een tetrazool-derivaat. Modificatie van het fosfiti-leringsmiddel op deze wijze kan de mogelijke vorming van 5'-5' verknoping tussen twee naast elkaar gelegen oligonucleotide-ketens verhinde-5 ren. Een dergelijke verknoping wordt geen ernstig probleem geacht wanneer de opname van nucleosiden op de vaste drager gematigd klein is (ongeveer 30 ^umol/g), maar kan significant worden wanneer de opname van nucleosiden groter wordt. De omzetting van het fosfitileringsmiddel kan worden uitgevoerd door dit direct met het tetrazool te laten reageren voor-10 dat het aan het nucleoside wordt toegevoegd of door het tetrazool aan het nucleoside toe te voegen voordat het nucleoside met het fosfiti-leringsmiddel wordt behandeld.

De molverhouding van nucleoside tot fosfitilerings-middel bedraagt in het algemeen ongeveer 1 : 10 tot ongeveer 1 : 20, bij 15 voorkeur ongeveer 1 : 15. Het reactiemengsel kam snel worden geschud en gecentrifugeerd en de overmaat fosfodichloridiet worden verwijderd. De totale reactietijd varieert in het algemeen van ongeveer 2 tot ongeveer 10 minuten.

Wanneer het fosfitileringsmiddel wordt gemodificeerd 20 met tetrazool, bedraagt de molverhouding van fosfitileringsmiddel tot tetrazool in het algemeen ongeveer 1 : 2 tot ongeveer 1 : 10, bij voorkeur ongeveer 1 : 3. De reactieomstandigheden voor deze uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding omvatten in het algemeen een totale reactietijd van ongeveer 15 minuten bij een temperatuur van ongeveer 0eC.

25 Na de behandeling met het fosfitileringsmiddel wordt de drager in reactie gebracht met een overmaat van een tweede nucleoside.

De reactie laat men in het algemeen gedurende 10 tot 15 minuten bij ongeveer 27°C verlopen. Na de reactie met het tweede nucleoside worden de intemucleotide fosfietbanden geoxydeerd tot fosfaten volgens con-30 ventionele technieken, zoals bijvoorbeeld met jodium in een waterige oplossing van tetrahydrofuran en lutidine. Een geprefereerde verhouding van tetrahydrofuran tot lutidine tot water is ongeveer 2:1:1.

De beschermingsgroep van het tweede nucleoside wordt Λ daarna verwijderd. Het dimeer kan desgewenst van de drager worden afge-35 splitst, gedeblokkeerd en gezuiverd. De opbrengst van deze reactie bedraagt typerend ongeveer 95%.

8*£ λ r\ o £ ·· ' ·' i 5

De keten kan volgens dezelfde cyclus van reacties als bovenstaand beschreven worden verlengd: behandeling van nucleoside met fosfitileringsmiddel, behandeling met een ander nucleoside, en oxydatie van de fosfietgroepen. Aan het eind van de synthese wordt het oligo-5 nucleotide bij voorkeur van de drager afgesplitst, gedeblokkeerd en gezuiverd.

De tussentijdse centrifugeringsstap om overmaat fosfiti-leringsmiddel te verwijderen, kan vocht in het reactiemengsel introduceren. Gevonden is dat centrifugeren van het reactiemengsel dat het sili-10 ciumoxyde en het f osf itileringsmiddel bevat, niet nodig is om hoge opbrengsten van het gewenste uiteindelijke oligonucleotide te verzekeren.

De procedure kan zoals bovenstaand beschreven worden uitgevoerd, waarbij de centrifugeringsstap wordt weggelaten. Vervolgens kan, nadat het oligonucleotide volgens een conventionele oxydatietechniek is geoxydeerd, 15 de drager verscheidene malen grondig met organische oplosmiddelen worden gewassen. In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt de drager gewassen met 50% ’s waterig tetrahydrofuran, gevolgd door tetrahydrofuran en tenslotte ether. Als eerder bedraagt de opbrengst van het gewenste dimeer ongeveer 90 tot 100%. Deze hoge opbrengsten laten zien dat zelfs wanneer een 20 overmaat van het fosfitileringsmiddel aanwezig is, de gewenste 5'-3' koppeling kan worden gerealiseerd door een overmaat nucleoside te gebruiken. Verder toont dunnelaagchromatografie (TLC) analyse van de bovenstaande vloeistof van de reactiemengsels dat tenminste ongeveer 80% van het toegevoegde nucleoside intact blijft en derhalve desgewenst 25 teruggewonnen en opnieuw gebruikt kan worden.

Zoals bovenstaand aangegeven heeft deze procedure een aantal voordelen ten opzichte van de bekende procedures. De onderhavige procedure vereist geen voorgevormde uitgangsmaterialen, kan worden uitgevoerd bij veel gematigder temperaturen dan tevoren mogelijk was en kan 30 in een enkel vat plaatsvinden. Hij kan gemakkelijk worden geautomatiseerd. Zowel riboöligonucleotiden als deoxyribodligonucleotiden kunnen met deze methode worden gesynthetiseerd. Tenslotte kan overmaat nucleoside worden teruggewonnen wanneer de reactie eenmaal is uitgevoerd, waardoor deze methode zeer economisch is.

35 De onderhavige werkwijze wordt in de volgende voorbeel den nader toegelicht, maar niet beperkt.

Λ ’j’’ % ;-V .

V V U t t-a j 6

Voorbeeld I

Bereiding van dimeer door directe behandeling met fosfitileringsmiddel Men behandelde 100 mg siliciumoxyde (Vydak TP) dat 4 ^umol deoxythymidine droeg, met 60 ^umol methoxydichlorofosfine in 0,2 5 ml watervrij pyridine bij kamertemperatuur. Men schudde het reactiemengsel snel en centrifugeerde (de totale reactietijd met inbegrip van het centrifugeren bedroeg 2 minuten bij kamertemperatuur). De bovenstaande vloeistof werd verwijderd en men voegde een tienvoudige overmaat 51-dimethoxytritylcytidine in 0,2 ml pyridine aan het siliciumoxyde toe.

10 Na 10' bij kamertemperatuur werd het reactiemengsel geoxydeerd met jodium in een tetrahydrofuran/lutidine/water (2:1:1) mengsel. De opbrengst van de reactie bleek, geschat door verwijdering van de trityl-groep en HPLC na deblokkering, 95% te zijn.

Voorbeeld II

15 Bereiding van dimeer door directe behandeling met fosfitileringsmiddel

Men behandelde 100 mg siliciumoxyde (Vydak.TP) dat 4 ^umol deoxythymidine droeg, met 60 ^umol methoxydichlorofosfine in 0,2 ml pyridine gedurende 10' bij 0°C of 1 - 2 minuten bij kamertemperatuur. Men voegde vervolgens 200 ^umol 5'-dimethoxytritylcytidine in 0,2 tot 20 0,25 ml pyridine aan het reactiemengsel toe zonder te centrifugeren. Na 10' bij kamertemperatuur, werd een oxydatie met jodium in tetrahydrofuran/ lutidine/water (2:1:1) uitgevoerd. Het siliciumoxyde werd daarna grondig met 50%'s waterig tetrahydrofuran, tetrahydrofuran en tenslotte ether gewassen. De opbrengst bedroeg na schatting 95% door de absorptie 25 van tritylkationen bij 498 nm. De opbrengst werd ook bevestigd door omgekeerde fase HPLC analyse na deblokkering (12 - 16 uur bij 50°C met geconcentreerd ammoniumhydroxyde, gevolgd door behandeling met 80% azijnzuur). De dimeerpiek werd tijdens de HPLC analyse verzameld en het UV spectrum bleek zeer goed overeen te stemmen met het door de computer gemaakte 30 spectrum.

Voorbeeld III

Andere dimeren werden met de methode volgens voorbeeld II bereid. De geïsoleerde opbrengst van elk dimeer wordt in de volgende tabel vermeld: 35 fi ” Γ. - 9 1 V ’m' / ·. o’ 3 7

TABEL A

Verbinding Geïsoleerde opbrengst, % d-CpC 96 d-GpT 87 d-CpT 95 5 d-GpG 98 d-CpG 84 d-GpA 81

Voorbeeld IV

Synthese van C-T dimeer, gebruikmakend van gemodificeerd bifunctioneel 10 fosfitileringsmiddel 100 mg Siliciumoxyde (Vydac TP), dat 4,2 ^umol N-ben-2oyldeoxycytidine en 630 ^umol tetrazool droeg, werd aan een azeotroop-• ehandeling met pyridine onderworpen. Het siliciumoxyde en het tetrazool werden behandeld met 63 ^umol methoxydichlorofosfine in 0,3 ml pyri—· IS dine gedurende 10 minuten bij 0°C. Daarna werd 210 ^umol 51-dimethoxy-trityl-thymidine aan het reactiemengsel toegevoegd. Na 15 minuten bij kamertemperatuur werd het reactiemengsel geoxydeerd met jodium in te-trahydrofuran/lutidine/water (2 : 1 : 1). Het siliciumoxyde werd grondig gewassen met 50%'s waterig tetrahydrofuran, tetrahydrofuran, en tenslotte 20 ether. De opbrengst bedroeg naar schatting 98% door de absorptie van de tritylkationen bij 498 nm.

Voorbeeld V

Synthese van pentameer, gebruikmakend van gemodificeerd fosfltllerings-middel 25 100 mg Siliciumoxyde (Vydac TP), dat 4,2 ^umol N- benzoyl-deoxycytidine en 630 ^umol tetrazool droeg, werd aan een azeo- i troop-behandeling met pyridine onderworpen. Het siliciumoxyde en het tetrazool werden daarna gedurende 10 minuten bij 0°C behandeld met 15-voudig (63 ^umol) methoxydichlorofosfine in 0,3 ml pyridine. Men voegde 30 een 50-voud van 5'-dimethoxytritylthymidine in 0,3 ml pyridine toe aan het reactiemengsel. Na 15 minuten bij kamertemperatuur werd een oxydatie met jodium in tetrahydrofuran/lutidine/water (2:1:1) uitgevoerd.

Het siliciumoxyde werd daarna gewassen als in voorbeeld IV. De trityl-groep werd verwijderd door behandeling met 5%'s trichloro-azijnzuur 35 in chloroform. Het siliciumoxyde werd grondig met chloroform gewassen.

£T ·' · ^ 1

'*W .. V

8

Deze cyclus werd herhaald om de keten uit te breiden tot de pentameer-volgorde T-T-T-T-C. De verhouding voor de reagentia werd gedurende de gehele synthese constant gelaten; het pyridinevolume werd naar behoefte ingesteld.

5 De totale opbrengst voor de synthese van het T-T-T-T-C

pentameer bedroeg 53%.

Voorbeeld VI

Het octameer C-A-A-G-C-T-A-G werd met de methode volgens voorbeeld V gesynthetiseerd met een totale opbrengst van 24%.

10 Voorbeeld VII

100 mg Siliciumoxyde (Vydac TP), dat 2,9 ^umol N-iso-butyldeoxyguanosine en een 45-voud (130 ^umol) tetrazool droeg, werd aan een azeotroop-behandeling met pyridine onderworpen. Men voegde 0,1 ml watervrije pyridine aan het siliciumoxyde-tetrazoolmengsel 15 toe voordat het siliciumoxyde gedurende 10' bij 0°C met een 15-voud (43 yUmol) methoxydichlorofosfine werd behandeld. Men voegde 5'-dime-thoxytrityl-N-benzoyldeoxyadenosine in 0,2 ml pyridine toe. Na 15’ bij kamertemperatuur werd een oxydatie met jodium in tetrahydrofuran/lutidi.-ne/water (2:1:1) uitgevoerd. Het siliciumoxyde werd daarna met 50%'s 20 waterig tetrahydrofuran, tetrahydrofuran, en ether gewassen. De opbrengst bedroeg naar schatting ongeveer 100%, gebaseerd op de tritylabsorptie van de tritylkationen bij 498 nm.

Voorbeeld VIII

Men behandelde 100 mg siliciumoxyde (Vydac TP), dat 25 2,9 ^umol N-isobutyryldeoxyguanosine droeg, gedurende 15' bij 0°C met 0,2 ml pyridine, dat 43,5.^umol methoxydichlorofosfine en 130 ^umol tetrazool bevatte. Men voegde 5*-dimethoxytrityl-N-benzoyladenosine in 0,2 ml aan het reactiemengsel toe. Na 15' bij kamertemperatuur, werd het reactiemengsel geoxydeerd en gewassen als in de voorgaande voorbeel-30 den. De opbrengst bedroeg naar schatting ongeveer 100%.

Voorbeeld IX

Synthese van A-T-G-C-A-C-A-C-A-A-G-A-G

Men droogde 500 mg siliciumoxyde (Vydak TP), dat 14,5 ^umol N-isobutyryldeoxyguanosine droeg, door wassen met 2 keer 10 ml 35 watervrij pyridine en 10 ml watervrije diëthylether. Het siliciumoxyde werd verder in een vacuum-dessicator gedroogd totdat het werd gebruikt.

Λ^ν1 V.’ \tV \,J „ ^ ·.*, —· » Λ 9

Men loste een 45-voudige overmaat van tetrazool (652 ^umol) bij 0°C op in 1 ml pyridine. Men voegde een 15-voudige overmaat (217 yUmol) methoxydichlorofosfine aan de tetrazool-pyridine-oplossing toe/ voegde de oplossing vervolgens aan het siliciumoxyde toe. Na 15 5 minuten bij 0eC, werd een· 50-voudige overmaat van 5'-O-(dimethoxytri-tyl) r-N-benzoyldeoxyadenosine in 1,0 ml pyridine toegevoegd. De reactie werd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voortgezet, waarna het reactiemengsel werd geoxydeerd en werd gewassen volgens de methode van de voorgaande voorbeelden. Het siliciumoxyde werd behandeld met 5%'s 10 trichloroazijnzuur in chloroform cm de dimethoxytritylgroep te verwijderen. Na wassen met chloroform, watervrij pyridine en watervrije ether, was de oplossing gereed voor de toevoeging van het volgende nucleoside.

De overige 11 nucleosiden werden op exact dezelfde wijze als boven is aangegeven toegevoegd. De hoeveelheid en concentratie 15 van de reagentia bleef gedurende de gehele synthese gelijk.

Een kwalitatieve schatiing van de opbrengst werd verkregen na elke toevoeging, gebaseerd op de oranje kleur die resulteerde uit de behandeling met 5% trichloroazijnzuur. In alle gevallen bleek de opbrengst uitstekend te zijn.

20 Kwantitatieve schattingen van de opbrengst werden ver kregen door behandeling van een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid siliciumoxyde met 2% benzeensulfonzuur in acetonitrile en waarneming van de ab-sorpties van de tritylkationen bij 498 nm. De totale opbrengst op verscheidene tijdstippen wordt onderstaand gegeven: 25

Oligonucleotide-lengte Opbrengst (%).

2 100 5 90 9 78-73 13 60 - 70 0 7 ^ ί

y? . - r I

*3* ..-13 —» *

Claims (15)

1. Werkwijze voor de synthese van een ologonucleotide op een vaste drager, waarbij a) een eerste nucleoside, waarvan de 5'-hydroxylgroep door een beschenningsgroep is beschermd, door de 3'-hydroxylgroep van 5 het eerste nucleoside aan een vaste-fase drager wordt gebonden; b) de beschenningsgroep aan de 5*-hydroxylgroep van het eerste nucleoside wordt verwijderd; c) de 5'-hydroxylgroep in reactie wordt gebracht met een bifunctionele fosfityleringsgroep; 10 d) een volgend nucleoside, waarvan de 5'-hydroxylgroep door een beschenningsgroep is beschermd, aan de drager wordt gebonden door koppeling van de 3'-hydroxylgroep van dit volgende nucleoside met de 51-hydroxylgroep van het eerste nucleoside; d) de tussen de nucleosiden gevormde fosfietband wordt 15 geoxydeerd; f) de stappen b t/m e worden herhaald totdat het gewenste aantal nucleosiden aan de drager is toegevoegd; g) het oligonucleotide van de drager wordt afgesplitst; en 20 h) het oligonucleotide wordt gedeblokkeerd en gezuiverd.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het bifunctionele fosfityleringsmiddel van stap c in een tetrazoolderivaat wordt omgezet voordat de reactie met de 51-hydroxylgroep van het nucleoside wordt uitgevoerd.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het nucleoside met tetrazool wordt gemengd voordat het behandeld wordt met het bifunc-tionele fosfityleringsmiddel.

4. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin de vaste drager siliciumoxyde is.

5. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin de beschenningsgroep de monomethoxy-tritylgroep is.

6. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin de beschenningsgroep dimethoxytrityl is. 35 o "Z r O Γ· P 1 Si V ixf iilfl V * e π

7. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin het biftuctionele fosfityleringsmiddel een alkyl- of aryl-fosfodichlori-diet is.

8. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin 5 het bifunctionele fosfityleringsmiddel methoxydichlorofosfine is.

9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin de molverhouding van nucleoside tot fosfityleringsmiddel varieert van ongeveer lr10 tot ongeveer 1:20.

10. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin 10 de molverhouding van nucleoside tot fosfityleringsmiddel ongeveer 1 : 15 is.

11. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, waarin de molverhouding van fosfityleringsmiddel tot tetrazool varieert van ongeveer 1 : 2 tot ongeveer 1 : 10.

12. Werkwijze volgens conclusie 2 of 3, waarin de molver houding van fosfityleringsmiddel tot tetrazool ongeveer 1 : 3 is.

13. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin de reacties worden uitgevoerd bij ongeveer 0 tot ongeveer 27eC.

14. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin 20 de reacties worden uitgevoerd bij 0eC.

15. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, waarin overmaat nucleoside door extractieprocedures kan worden teruggewonnen en opnieuw kan worden gebruikt. - . " . i