JPS63222187A - リン酸エステル形成用縮合剤及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明はリン酸エステル結合の形成方法において縮合
剤として有用な新規化合物及びその使用方法に関する。

この方法は、オリゴデオキシヌクレオチド又はポリデオ
キシヌクレオチドの化学合成における鎖延長反応におい
て特に有用である。

〔従来の技術〕

オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド等核酸関連物質
の化学合成法としてはリン酸ジエステル法、リン酸トリ
エステル法、ホスファイト法等が知られており、いずれ
の方法においても縮合反応を促進するために縮合剤が使
用される。

例えばリン酸トリエステル法においては、主としてアレ
ンスルホニル誘導体が使用されており、副反応が少ない
点、反応時間が短い点等からメシチレンスルホニルニト
ロトリアゾリド（ＭＳＮＴ）が最も優れたものとして多
用されている。しかしながらＭＳＮＴを使用する場合で
も、縮合反応のために通常４０分間又はそれより長時間
を要し、この縮合反応がポリヌクレオチド合成における
律速要因となっている。

従って、一層短時間で縮合反応を完結することができる
強力な縮合剤の開発が望まれている。この様な縮合剤と
して本発明者等は先にビス（２゜４．６−トリハロフエ
ノキシ）トリクロロホスホランを見出した〔特願昭６１
−２０１７６４；Ｊ、Ｍａｔｓｕｚａｋｉ等、Ｔｅｔｒ
ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、　　、　′ｎ、　５６４５
（１９８６））　＠この縮合剤を使用する場合、縮合反
応は約５分間で完了し、約９０％以上の工程収率が得ら
れ、この縮合剤は従来の縮合剤に比べて非常に優れてい
る。

〔発明が解決しようとする問題点〕

しかしながら、前記縮合剤が縮合反応に関与した場合、
該縮合剤がビス（２，４，６−）リハロフェニル）ホス
ホロクロリデートとなり、これが反応体ヌクレオチドと
反応して副産物を生成する可能性を完全に排除すること
ができなかった。

〔問題点を解決するための手段〕

このため、本発明者等は、さらに効果的な縮合剤を開発
すべく研究を行った結果、前記副産物の生成の可能性を
完全に排除する縮合剤として、新規化合物であるトリス
（２，４，６−）リハロフェノキシ）ジクロロホスホラ
ンを見出した。この化合物は縮合反応に際しトリス（２
，４，６−トリハロフエニル）ホスフェートに変換され
るが、後者の化合物はヌクレオチド反応体と反応して副
産物を生成することがなく、この縮合剤を使用した縮合
反応では１分間という極めて短い時間に完了し、９９％
という高い工程収率が達成される。

従って本発明は、新規化合物トリス（２、４。

′　　６−トリハロフエノキシ）ジクロロホスホラン、
及びその使用方法、すなわちこの化合物を縮合剤として
使用するリン酸エステルの形成方法を提供するものであ
る。

〔具体的な説明〕

本発明の化合物トリス（２，４，６−１リハロフエノキ
シ）ジクロロホスホランは次の式で表わされる。

この式中、Ｘはハロゲンであり、例えば塩素、臭素等で
ある。好ましい例として、Ｘが臭素であるトリス（２，
４，６−７’ロムフエノキシ）ジクロロホスホランを挙
げることができる。

トリス（２、４、６−トリハロフエノキシ）ジクロロホ
スホランは、例えば２，４．６−トリハロフエノールと
五塩化リンとを反応せしめること応は２，４．６−）リ
ハロフェノールと五塩化リンとを３：１のモル比で使用
するのが好ましい。

例えば、トリス（２，４，６−）リブロムフェノキシ）
ジクロロホスホランを製造しようとする場合、２．４．
６−）リブロムフェノールと五塩化リンとを３：１のモ
ル比でベンゼン中で反応せしめるのが好ましい０反応部
合物から目的化合物を回収するには、反応媒体としての
溶剤を蒸発除去し、次に残渣を所望によりｎ−ヘキサン
等と共に共沸蒸発処理した後、適当な溶剤、例えばベン
ゼンから結晶化すればよい。

本発明の化合物を縮合剤として用いる縮合反応は、例え
ば次の反応式： ％式％（） （式中、ＲＩはオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチ
ドの化学合成においてデオキシリボースの５位のヒドロ
キシル基の保護のために常用される保護基、保護されて
いるモノデオキシヌクレオチド、又は保護されているオ
リゴデオキシヌクレオチドであり；Ｒ８はオリゴヌクレ
オチド又はポリヌクレオチドの化学合成においてリン酸
部分の保護のために常用される保護基であり；Ｒ１はデ
オキシリボース部分の３′位のヒドロキシル基の保護の
ための常用の保護基、固体支持体に結合しているリンカ
−、モノ−、オリゴ−もしくはポリープオキシリボヌク
レオチド、又は場合によってはリンカ−を介して固体支
持体に連結されている七ノー、オリゴ−もしくはポリー
プオキシリボヌクレオチドであり；そしてＢ、及びＢ！
は同一であるか又は異っており、そして場合によっては
保護されている核酸構成塩基を表わす） で表わされるリン酸エステル結合形成反応である。

本発明の方法は一般に、リン酸エステル結合を形成する
ための反応に広く適用することができるが、トリエステ
ル法によるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの
合成において特に有用である。また、カルボン酸エステ
ル、アミド、ラクトン、ラクタム等の形成のための縮合
反応における縮合剤としても期待される。

トリエステル法においては、前記の反応式により示され
るように、糖成分の５′位のヒドロキシル基及びリン酸
成分の酸基が適切に保護されており、さらに塩基部分中
の官能基が場合によっては保護されているヌクレオチド
（Ｉ）と、糖成分の３′位のヒドロキシル基が保護され
ておりそして塩基の官能基が場合によっては保護されて
いるヌクレオチド（ｎ）とを縮合せしめる。

式（１”）のヌクレオチドの保護基Ｒ，はオリゴヌクレ
オチド又はポリヌクレオチドの化学合成において糖成分
、例えばデオキシリボース成分の５′位のヒドロキシル
基の保護のために常用されている保護基であって、Ｒ，
がこのようないかなる保護基であってもこの発明の方法
を適用することができる。好ましい保護基としてはｐ、
ｐ’−ジメトキシトリチル基を挙げることができるが、
その他に各種のシリル基、各種のアシル基、各種のアル
キル基等を使用することができる。Ｒ，が保護されたモ
ノヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである場合、式
（Ｉ）の反応体は保護されたオリゴヌクレオチドを意味
し、この場合、複数個のヌクレオチドを延長単位として
ヌクレオチド鎖の延長を行うことができる。

保護基Ｒ２はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド
の化学合成においてリン酸成分の保護のために常用され
ている保護基であって、Ｒ２がいかなる保護基であって
もこの発明の方法を適用することができる。好ましい保
護基Ｒ２としてはアリールチオ基、例えばフェニルチオ
基を挙げることができ、さらにｐ−メトキシフェニルチ
オ基が挙げられる。その他の保護基としてアリールオキ
シ基、例えば０−クロロフェニルオキシ基及びｐ−クロ
ロフェニルオキシ基、種々のアルキルオキシ基、例えば
シアノエチルオキシ基を挙げることができる。さらに、
アルキルチオ基、例えばエチルチオ基が挙げられる。

式（１）で示されるヌクレオチドの反応に関与するリン
酸基は通常塩の形で存在し、対応する陽イオンとして例
えばアンモニウムイオン、例えばトリエチルアンモニウ
ムイオンを挙げることができる。この場合、式（Ｉ）の
ヌクレオチドは例えば次の式： ％式％ 式（■）で表わされる反応体はＲ１の種類により極めて
多様である０例えば、式（Ｉｆ）の反応体がモノヌクレ
オチドである場合、Ｒ３は該ヌクレオチドの糖成分の３
′位のヒドロキシル基の保護基であり、例えばベンゾイ
ル基である。本発明のリン酸エステル形成反応がオリゴ
ヌクレオチド又はポリヌクレオチドの合成における鎖延
長反応として行われる場合であって、この反応が液相合
成法として行われる場合、Ｒ１はオリゴヌクレオチド又
はポリヌクレオチドである。前記の反応が固相合成法と
して行われる場合、Ｒ１は固相支持体に連結されている
モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレ
オチドである。これらはその一端において直接固体支持
体に連結されている場合があり、また、適当なリンカ−
を介して固体支持体に連結されている場合もある。これ
らすべての場合に本発明の方法を適用することが可能で
ある。

固体支持体の種類、これとヌクレオチドとの連結方法、
リンカ−の種類、連結方法等は当業者によりよく知られ
ており、本発明においてはこれらの常法を用いることが
できる。

Ｂ、及びＢ、は、同一でも異っていてもよく、場合によ
っては保護されている核酸構成塩基である。これらの塩
基として、シトシン、アデニン、グアニン、チミン、ウ
ラシル等が挙げられる。さらに、核酸中に微量に存在す
る他の塩基類及び人工合成塩基を用いることもできる。

これらの塩基は通常、保護された状態で使用され、この
ための保護基としてはオリゴヌクレオチド又はポリヌク
レオチドの化学合成において常用されている任意の保護
基を使用することができ、これらは当業者によく知られ
ている。Ｋえば、シトシンのＮ４はｐ−メトキシベンゾ
イル基により、アデニンのＮ６はベンゾイル基により、
そしてグアニンのＮ２はプロピオニル基、０６はジフェ
ニルカルバモイル基又は、Ｉ　Ｎ　、　Ｎ”はビスイソ
ブチリルオキシエチレン基、Ｎ２はイソブチリル基によ
り保護するのが好ましい。チミジン及びウラシルは３Ｎ
をベンゾイル基などで保護するのが好ましい。

本発明の反応は、ピリジン、アセトニトリル、塩化メチ
レン等、種々の媒体中で行うことができ、３−ニトロ−
１，２，４−）リアゾールの存在下ピリジン中で行うの
が好ましい、″ 反応は１５℃〜５０℃の範囲の温度で行い、室温で行う
のが特に便利である。

例えば、液相法によるオリゴデオキシリボヌクレオチド
の合成に当ってはデオキシリボシル基の５′位のヒドロ
キシル基が遊離している反応体（ＩＩ）とリン酸基の反
応に関与する部分が塩例えばトリエチルアンモニウム塩
の形である反応体（Ｉ）とを適当な溶剤、例えば３−ニ
トロ−１゜２．３−）リアゾールを含むピリジン中の溶
液とし、これに本発明の縮合剤であるトリス（２、４゜
６−トリハロフエノキシ）ジクロロホスホラン、例えば
トリス（２，４，６−）リブロモフェノキシ）ジクロロ
ホスホランを、反応体と等モル量又はやや過剰モル量添
加し、室温にて約１分間反応せしめる０次に、必要に応
じて反応体（１）の５′位の未反応の水酸基をキャッピ
ングした後、反応生成物（ＩＩＩ）の保護基Ｒ１を除去
し、５′位を遊離のヒドロキシル基に転換する０次に、
上記の操作を繰り返してヌクレオチド鎖を５′方向に延
長する。

固相合成法の場合も上記と同様であるが、反応体（ｆｆ
）は固体支持体に連結されており、固体支持体は通常は
カラムに充填されている。従って、上記の縮合反応、キ
ャンピング反応、脱保護反応等はそのために必要な試薬
溶液をカラムに通すことにより行われ、これらの各工程
の間に洗浄液を流過せしめる。これらは常法に従って行
うことができ、このような一般的方法はすでによく知ら
れている。

（発明の効果〕 本発明によれば、非常に短時間でリン酸エステル結合形
成反応を行うことができ、しかも副反応はほとんど起ら
ない０本発明の方法は、液相法によるオリゴヌクレオチ
ド又はポリヌクレオチドの合成、固相法によるオリゴヌ
クレオチド又はポリヌクレオチドの合成等に広く利用す
ることができる。

次に、実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する
。

２０．８２ｇ　（０，１ｍｏｌ）の五塩化リンを５０℃
にて数分間減圧下に置くことにより夾雑オキシ塩化リン
を除去した０次に、この五塩化リンを３００ｍ１のベン
ゼンに溶解し、この溶液に９９．２５ｇ（０，３ｍｏＩ
ｌ）の２．４．６−トリブロムフエノールを加えた。こ
の反応混合物を８時間還流加熱し、次に減圧蒸発により
溶剤を除去した０次に、得られた残渣をｎ−ヘキサンと
共に共沸蒸発により処理した。こうして得られた白色粉
末を約５００ｍｊ＋のベンゼンから結晶化することによ
り２３．９ｇ　（収率２２％）の目的化合物を９２％の
純度で得た。

融点２３０℃〜２３１℃（ベンゼンより）　、　”Ｐ−
ＮＭＲ（ＣＤＣｌ　、−ピリジン、１　：　３　Ｖ／Ｖ
）　−６５，６４ｐｐｍ。

元素分析（Ｃ＋＊Ｈａ　Ｏｓ　Ｂｒ＊Ｃｌ１ｔ　Ｐ）：
ＣＨＢｒ＋ＣＩ 計算値（％）　　１９．８１　　０．５５　　７２．４
０測定値（％）　　２０．０５　　０．５９　　７２．
６４゜１隻■ム　１ン　エスールの （ｉ）ＴＴの合成 ２２２■（０，２４ｗｕｗｏ　ＩＩ　）のトリエチルア
ンモニウムＳ−フェニル５’−０−（４，４’−ジメト
キシトリチル）−３Ｎ−ベンゾイルチミジン−３′−〇
−ホスホロチオエート及び６９ａｇ　（０，６ｓ＋ｍｏ
Ｊ　）の３−ニトロ−１，２，４−）リアゾールを１ｍ
ｌの無水ピリジン中で数回共沸乾燥した。この混合物を
２ｍ７！の無水ピリジンに溶解し、この溶液を１ｍｌの
ピリジン中３９４ｇ（０，３６５ｍ１りのトリス（２，
４，６−）リブロムフェノキシ）ジクロロホスホラン溶
液に加えた。この混合溶液を、別途無水ピリジンにより
共沸乾燥した９１■（０，２ｍｍｏｆｆｉ　）の３’−
０，３Ｎ−ジベンゾイルチミジンに加え、全体を室温で
１分間攪拌した。少量の水を添加することによって反応
を停止せしめ、この反応液を５ｍｌずつのクロロホルム
で３回分液漏斗に洗い出し、１５ｍｆｆ１ずつの５％炭
酸水素ナトリウム水溶液により３回洗浄した。水相を１
０ｍｌ１のクロロホルムで抽出し、その有機相を５％炭
酸水素ナトリウム水溶液で１回洗浄した。２つの有機相
を混合し、無水炭酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留
去した。残った少量のピリジンを３ｍｌづつのトルエン
と供に２回共沸留去した。泡状の残査を’１ｍｌの塩化
メチレンに溶解し、シリカゲルカラム（３０ｇ）に負荷
し、そして塩化メチレン中メタノールのＯ〜０．５％の
グラジェントにより溶出し、目的物のみを含む百分を集
め、減圧下で溶媒を留去して２５０ｍｇ　（０，１９８
＋ｗｓｏｊ？　）のＳ−フェニル５　’　−０−ＤＭＴ
ｒ−３Ｎ−ベンジルチミジン−３’、３’−０−３Ｎジ
ベンジルチミジン−５′ホスホロチオエートを得た。収
率９９％。

（ｉｉ）ＣＴの合成 前記（ｉ）の方法を反復した。但し、リン酸ジエステル
反応体として、トリエチルアンモニウムＳ−フェニル５
　’　−０−ＤＭＴｒ−Ｎ’−アニソイルジオキシシナ
ジン−３′ホスホロチオエートを用いた。収率９５％。

（ｉｉｉ）ＡＴの合成 前記（ｉ）の方法を反復した。但し、リン酸ジエステル
反応体として、トリエチルアンモニウムＳ−フェニル５
　’　−０−ＤＭＴｒ　−Ｎ”−ベンゾイルデオキシア
デノシン−３′ホスホロチオエートを用いた。収率９２
％。

（ｉｖ）ＧＴの合成 前記（ｉ）の一方法を反復した。但し、リン酸ジエステ
ル反応体としてトリエチルアンモニウムＳ−フェニル５
　’　−０−ＤＭＴｒ　−Ｉ　Ｎ　、　Ｎ冨−ビスイソ
ブチリルオキシエチレン−Ｎｔ−イソブチリルデオキシ
グアノシン−３′ホスホロチオエートを使用した。収率
９３％。

これらの生成物を別途合成したダイマー（Ｊ。

Ｍａｔｓｕｚａｋｉ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅ
ｔｔ、　　、　２５　、４０９１（１９８４）　）と比
較することにより目的とするダイマーであることを確認
した。この分析において、元素分析、’Ｈ−ＮＭＲ１及
び”Ｐ−ＮＭＲの結果が一致することが確認された。

大隻皇１ 固相合成法により（’ｒ）＋ｔを合成した。この合成は
次の手順により行った。

（Ａ）常法に従って、アミノプロピル−コンドロールド
、ボア・グラス（ＣＰＧ）（孔サイズ５６０人）に３Ｎ
−ベンゾイルチミジンを導入した。導入量は２４μｍｍ
ｏｆ　／　ｇであった。

（Ｂ）次に、上記の固体担体１００■をコック付ガラス
フィルターに入れ、次の段階によりヌクレオチドの連結
を行った。

（１）　１％（Ｖ／Ｖ）　　トリクロロ酢酸／塩化メチ
レン混合液１ｍｌずつにより固体担体を３回処理し５′
位のジメトキシトリチル基の脱保護を行った。

（２）固体担体を２ｍｌ１ずつの塩化メチレンにより３
回洗浄した。

（３）担体を３００μｌの乾燥ピリジンで浸し、真空下
で乾燥を行った。

（４）５’位のヒドロキシル基および塩基部分の官能基
を保護したリン酸ジエステル体４．８μｌ１ｏ１及び３
−二トロー１．２．４−）リアゾール１２μ１Ｉｌｏｌ
を１ｍｆの乾燥ピリジンと伴に共沸乾燥し、７．２μｍ
ｏＪ！のトリス（２，４，６−トリプロモフエノキシ）
ジクロロホスホランと共に４００μｌの乾燥とリジンに
溶解した。

（５）前記（４）で調製した溶液を前記（３）の担体に
添加し、室温にて５分間放置することにより縮合反応を
行った。

（６）担体を１ｍｉずつのピリジンで２回洗浄し、さら
に２ｍ１ｌずつのクロロホルムで３回洗浄し、次に真空
乾燥した。

（７）０．ＩＮジメトキシアミノピリジンを含む無水酢
酸／ピリジン（１：　９Ｖ／Ｖ）混合液１ｒｒｌで固体
担体を処理することにより未反応の５′−ヒドロキシル
基のキャッピングを行った。

（８）前記（６）と同様の洗浄を行った。

前記（１）〜（８）の操作を目的の配列が得られるまで
反復した。

（Ｃ）最後に、次のようにしてオリゴヌクレオチド鎖の
固体担体からの切り離し及びオリゴヌクレオチドの脱保
護を行った。次に示す操作は担体５０■当りのものであ
る。ジオキサン／水（９：１　ｖ／ｖ）混合液中０．５
　Ｍ　２−ピリジルカルボアルドオキシム（ＰＡＯ）　
、Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−テトラメチルグアニジン（Ｔ
Ｍ（１；）の溶液２ｍｌにより室温にて２４時間処理し
た後、固相担体を濾去し、固体担体はジオキサン／水（
９：ＩＶ／■）混合液１ｍｌずつにてさらに２回洗浄し
た。

これらの濾液及び洗浄液を一緒にして減圧下で溶媒を留
去した。蒸発残渣に濃アンモニア水５ｍｌを加え、室温
にて１９時間及び５０℃にて３時間処理し、再度溶媒を
留去した。この操作により５′位のヒドロキシル基の保
護基以外の保護基を除去した０次に、μＢｏｎｄａｐａ
ｋ　Ｃ１Ｂカラムを用いる高速液体クロマトグラフィー
により目的分を分取した。このクロマトグラフィーは溶
液Ａ　：　０．　Ｉ　Ｍ酢酸アンモニウム、及び液Ｂ　
：　ＣＨ，ＩＣＨを用いる直線グラジェント（Ｂ：０−
５０％）（２５分間）により、５０℃にて行った。目的
物の両分を集め、凍結乾燥した。

この凍結乾燥物を５ｍｌの８０％酢酸により室温にて１
５分間処理して５′位の保護基を除去し、次に溶媒を留
去した。蒸発残渣を、上記と同様の高速液体クロマトグ
ラフィーにより処理することによって目的物を精製し、
凍結乾燥した０次に、Ｄｏｗｅｘ　５０ＷＸ８（Ｎａ”
型）カラム（湿容量３ｒｒｌ）を通すことにより塩交換
を行い、さらに５ｅｐｈａｄｅｘＧ２５により脱塩し、
凍結乾燥することにより白色繊維状の目的物質を得た。

収量は６Ａｔｈ。ユニットであった。

合成収率は１１量体目までの全体収率が８２％、平均単
工程収率が９８％であった。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘはハロゲン原子である） で表わされるトリス（２，４，６−トリハロフェノキシ
   ）ジクロロホスホラン。 ２、Ｘが臭素である特許請求の範囲第１項に記載の化合
   物。 ３、次の式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｘはハロゲン原子である） で表わされるトリス（２，４，６−トリハロフェノキシ
   ）ジクロロホスホランを縮合剤として使用することを特
   徴とするリン酸エステルの形成方法。 ４、Ｘが臭素原子である特許請求の範囲第３項に記載の
   方法。 ５、次の反応式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオ
   チドの化学合成においてデオキシリボース部分の５′位
   のヒドロキシル基の保護のために常用される保護基、保
   護されているモノデオキシヌクレオチド、又は保護され
   ているオリゴデオキシヌクレオチドであり；Ｒ＿２はオ
   リゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの化学合成にお
   いてリン酸部分の保護のために常用される保護基であり
   ；Ｒ＿３はデオキシリボース部分の３′位のヒドロキシ
   ル基の保護のための常用の保護基、固体支持体に結合し
   ているリンカ−、モノ−、オリゴ−もしくはポリ−デオ
   キシリボヌクレオチド、又は場合によってはリンカ−を
   介して固体支持体に連結されているモノ−、オリゴ−も
   しくはポリ−デオキシリボヌクレオチドであり；そして
   Ｂ＿１及びＢ＿２は同一であるか又は異っており、そし
   て場合によっては保護されている核酸構成塩基を表わす
   ） で表わされるリン酸エステル結合形成方法において、縮
   合剤としてトリス（２，４，６−トリハロフェノキシ）
   ジクロロホスホランを使用することを特徴とする特許請
   求の範囲第３項に記載の方法。 ６、前記縮合剤がトリス（２，４，６−トリブロムフェ
   ノキシ）ジクロロホスホランである特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。 ７、Ｒ＿１がｐ，ｐ′−ジメトキシトリチル基、シリル
   基、アルキル基又はアシル基である特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。 ８、Ｒ＿２がアリールチオ基、アリールオキシ基、アル
   キルチオ基、又はアルキルオキシ基である特許請求の範
   囲第５項に記載の方法。 ９、前記反応を３−ニトロ−１，２，４−トリアゾール
   の存在下ピリジン中で行う特許請求の範囲第５項に記載
   の方法。 １０、前記反応をオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオ
   チドの化学合成における鎖延長反応として行う特許請求
   の範囲第５項に記載の方法。 １１、前記反応の基質中の反応に関与するリン酸基がト
   リエチルアンモニウム塩の形である特許請求の範囲第５
   項に記載の方法。