JP5808025B2 - アミノ化オリゴヌクレオチド用固相担体 - Google Patents
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Description
PG1a及びPG1bは、互いに独立して、水素原子若しくはアミノ基の保護基であるか、又は
PG1a及びPG1bは、一緒になってアミノ基の保護基を形成しており、
R2は、主鎖の員数1〜10の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜10で環の員数3〜20の二価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であり、
R3は、主鎖の員数1〜20の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜20で環の員数3〜20の二価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であるか、又は
R2及びR3は、それらが結合するカルバメート基と一緒になって環の員数5〜10の置換若しくは非置換の脂環式基(但し、R2及びR3の主鎖の員数は、互いに独立して、1〜10である)を形成しており、
Aは、オリゴヌクレオチドである]
で表されるアミノ化オリゴヌクレオチド。
R5は、直接結合、又は置換若しくは非置換の員数1〜9のアルキレン基であり;
R6及びR7は、互いに独立して、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、置換若しくは非置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アミド基、置換若しくは非置換のC1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基若しくはC2〜C20アルキニル基、置換若しくは非置換のC1〜C20アルコキシル基、又は置換若しくは非置換のC3〜C20シクロアルキル基若しくはC3〜C20ヘテロシクリル基であり;
R8は、直接結合、又は置換若しくは非置換の員数1〜5のアルキレン基である]
で表される、上記(1)のアミノ化オリゴヌクレオチド。
R9、R10、R11及びR12は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、置換若しくは非置換のC1〜C10アルキル基、C2〜C10アルケニル基若しくはC2〜C10アルキニル基、又は置換若しくは非置換のC1〜C10アルコキシル基であるか、又は
R9若しくはR10とR11若しくはR12とが、それらが結合する炭素原子と一緒になって複素原子を含んでいてもよい環の員数3〜20の置換若しくは非置換の脂環式基を形成する]
で表される、上記(1)のアミノ化オリゴヌクレオチド。
PG1a及びPG1bは、互いに独立して、水素原子若しくはアミノ基の保護基であるか、又は
PG1a及びPG1bは、一緒になってアミノ基の保護基を形成しており、
R3は、主鎖の員数1〜20の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜20で環の員数3〜20の二価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であり、
Aは、オリゴヌクレオチドである]
で表される上記(1)〜(4)のいずれかのアミノ化オリゴヌクレオチド。
Xは、担体材料であり、
R1aは、直接結合又は二価の基であり、
R1bは、水素原子であるか、又は
R1a及びR1bは、一緒になってX及びアミノ基と結合する基を形成しており、
R2は、主鎖の員数1〜10の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜10で環の員数3〜20の二価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であり、
R3は、主鎖の員数1〜20の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜20で環の員数3〜20の二価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であるか、又は
R2及びR3は、それらが結合するカルバメート基と一緒になって環の員数5〜10の置換若しくは非置換の脂環式基(但し、R2及びR3の主鎖の員数は、互いに独立して、1〜10である)を形成しており、
R4は、水酸基の保護基である]
で表される固相担体。
R5は、直接結合、又は置換若しくは非置換の員数1〜9のアルキレン基であり;
R6及びR7は、互いに独立して、水素原子、ハロゲン、ヒドロキシル基、置換若しくは非置換のアミノ基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アミド基、置換若しくは非置換のC1〜C20アルキル基、C2〜C20アルケニル基若しくはC2〜C20アルキニル基、置換若しくは非置換のC1〜C20アルコキシル基、又は置換若しくは非置換のC3〜C20シクロアルキル基若しくはC3〜C20ヘテロシクリル基であり;
R8は、直接結合、又は置換若しくは非置換の員数1〜5のアルキレン基である]
で表される、上記(6)の固相担体。
R9、R10、R11及びR12は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン、置換若しくは非置換のC1〜C10アルキル基、C2〜C10アルケニル基若しくはC2〜C10アルキニル基、又は置換若しくは非置換のC1〜C10アルコキシル基であるか、又は
R9若しくはR10とR11若しくはR12とが、それらが結合する炭素原子と一緒になって複素原子を含んでいてもよい環の員数3〜20の置換若しくは非置換の脂環式基を形成する]
で表される、上記(6)の固相担体。
Xは、担体材料であり、
R1aは、直接結合又は二価の基であり、
R1bは、水素原子であるか、又は
R1a及びR1bは、一緒になってX及びアミノ基と結合する基を形成しており、
R3は、主鎖の員数1〜20の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜20で環の員数3〜20の二価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であり、
R4は、水酸基の保護基である]
で表される上記(6)〜(9)のいずれかの固相担体。
Xは、担体材料であり、
PG1a及びPG1bは、互いに独立して、水素原子若しくはアミノ基の保護基であるか、又は
PG1a及びPG1bは、一緒になってアミノ基の保護基を形成しており、
R13は、主鎖の員数1〜10の置換若しくは非置換の三価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜10で環の員数3〜20の三価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であり、
R3は、主鎖の員数1〜20の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜20で環の員数3〜20の二価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であるか、又は
R13及びR3は、それらが結合するカルバメート基と一緒になって環の員数5〜10の置換若しくは非置換の脂環式基(但し、R2及びR3の主鎖の員数は、互いに独立して、1〜10である)を形成しており、
R4は、水酸基の保護基である]
で表される固相担体。
M1a及びM1bは、互いに独立して、水素原子若しくはプローブ分子から誘導される基であるか、又は
M1a及びM1bは、一緒になってプローブ分子から誘導される基を形成しており、
R2は、主鎖の員数1〜10の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜10で環の員数3〜20の二価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であり、
R3は、主鎖の員数1〜20の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基、又は主鎖の員数1〜20で環の員数3〜20の二価の脂環式基(上記基は、1又は複数の複素原子を含んでいてもよい)であるか、又は
R2及びR3は、それらが結合するカルバメート基と一緒になって環の員数5〜10の置換若しくは非置換の脂環式基(但し、R2及びR3の主鎖の員数は、互いに独立して、1〜10である)を形成しており、
Aは、オリゴヌクレオチドである]
で表されるアミノ化オリゴヌクレオチドプローブ。
PG1a及びPG1bが、互いに独立して、水素原子又はアミノ基の保護基であり、
R2及びR3が、互いに独立して、置換又は非置換のC1〜C10アルキレン基であり、
Aが、オリゴヌクレオチドである。
PG1a及びPG1bが、互いに独立して、水素原子又はアミノ基の保護基であり、
R2が、エチレンであり、
R3が、ヘキシレンであり、
Aが、オリゴヌクレオチドである。
PG1a及びPG1bは、互いに独立して、水素原子若しくはアミノ基の保護基であるか、又は
PG1a及びPG1bは、一緒になってアミノ基の保護基を形成しており、
R3は、二価の基であり、
Aは、オリゴヌクレオチドである]
で表される。
M1a及びM1bは、互いに独立して、水素原子若しくはプローブ分子から誘導される基であるか、又は
M1a及びM1bは、一緒になってプローブ分子から誘導される基を形成しており、
R2及びR3は、互いに独立して、二価の基であるか、又は
R2及びR3は、それらが結合するカルバメート基と一緒になって環を形成しており、
Aは、オリゴヌクレオチドである。
Xが、ガラス及びプラスチックから選択される担体材料であり、
R1aが、直接結合であり、
R1bが、水素原子であるか、又は
R1a及びR1bが、一緒になってX及びアミノ基と結合する員数1〜10の置換若しくは非置換の脂肪族炭化水素基、置換若しくは非置換の環の員数3〜20の脂環式基、又は置換若しくは非置換の環の員数5〜20の芳香族基を形成しており、
R2及びR3が、互いに独立して、置換又は非置換のC1〜C10アルキレン基であり、
R4が、トリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基である。
Xが、アミノ基を有するCPG又はポリスチレン樹脂であり、
R1a及びR1bが、一緒になって、Xのアミノ基とアミドを、R2と結合したアミノ基とイミド又はアミドを形成したベンゼン-1,2,4-トリカルボン酸のイミド又はアミドを形成しており、
R2が、エチレンであり、
R3が、ヘキシレンであり、
R4が、トリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基である。
Xが、ガラス及びプラスチックから選択される担体材料であり、
R13が、員数1〜10の置換若しくは非置換の三価の脂肪族炭化水素基であり、
R3が、置換又は非置換のC1〜C10アルキレン基であり、
R4が、トリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基である。
Xが、アミノ基を有するCPG又はポリスチレン樹脂であり、
R13が、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基及びケトン基からなる群より選択される1個の官能基によってXとの間で形成される結合を有する置換エチレンであり、
R3が、ヘキシレンであり、
R4が、トリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基である。
Xは、担体材料であり、
R1aは、直接結合又は二価の基であり、
R1bは、水素原子であるか、又は
R1a及びR1bは、一緒になってX及びアミノ基と結合する基を形成しており、
R3は、二価の基であり、
R4は、水酸基の保護基である]
で表される。
で表されるアミノリンカー化合物を合成中間体として製造することができる。
で表されるアミノリンカー化合物を形成させるステップ;
を含む方法によって製造することができる。
(C)式Xで表されるアミノリンカー化合物を、R1a及びR1bの前駆体化合物並びにXの前駆体材料と反応させて、式IVで表される固相担体を形成させるステップ
を含む方法によって製造することができる。
[材料及び方法]
薄層クロマトグラフィーは、Silica gel 60F254プレート(Merck社)上で行った。カラムクロマトグラフィーには、Wakogel C-200(和光純薬工業)、Silica Gel 60(ナカライタスク)、又はWakogel 100 C18(逆相、和光純薬工業)を用いた。1H NMR(270 MHz)及び13C NMR(67.8 MHz)は、ジメチルスルホキシド-d6を溶媒、テトラメチルシランを内部標準とし、JEOL JNM-EX270を用いて測定した。
<1-[(2-アミノエチル)アミノカルボニル]オキシ-6-ヘキサノール(化合物2a)>
アルゴン雰囲気下、1,6-ヘキサンジオール(化合物1)590 mg(5.00 mmol)をアセトニトリル20 mlに溶解し、トリエチルアミン0.42 ml(3.00 mmol)及び1,1’-カルボニルジイミダゾール324 mg(2.00 mmol)を加えて、室温で1.5時間撹拌した。続いて反応液にエチレンジアミン0.33 ml(5.00 mmol)を加え、室温で2時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮後、残渣をエタノール(10 ml×3回)で共沸した。残渣を水15 mlに溶解し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:アセトニトリル−水)により精製して、標記化合物(化合物2a)270 mg(収率75%)を白色固体状物質として得た。
<1-[(4-カルボキシフタルイミジルエチル)アミノカルボニル]オキシ-6-ヘキサノール(化合物3a)>
アルゴン雰囲気下、1-[(2-アミノエチル)アミノカルボニル]オキシ-6-ヘキサノール(化合物2a)670 mg(3.30 mmol)及び無水トリメリト酸576 mg(3.00 mmol)をピリジン25 mlに溶解し、80℃で1時間、さらに120℃で18時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、減圧下で濃縮した。残渣をエタノール(5 ml×3回)で共沸し、残った白色物質を酢酸エチル20 mlに懸濁した。懸濁液から沈殿物を濾取して標記化合物(化合物3a)1.10 g(88%)を白色粉状物質として得た。
<1-[(4-カルボキシフタルイミジルエチル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物4a)>
アルゴン雰囲気下、1-[(4-カルボキシフタルイミジルエチル)アミノカルボニル]オキシ-6-ヘキサノール(化合物3a)1.02 g(2.70 mmol)をピリジン27 mlに溶解し、塩化ジメトキシトリチル915 mg(2.70 mmol)を加えて室温で撹拌した。2時間後、反応液に塩化ジメトキシトリチル440 mg(1.30 mmol)を追加して、室温でさらに2時間撹拌した。反応液にエタノール5 mlを加えた後、減圧下で濃縮した。残渣をクロロホルム150 mlに溶解し、水50 mlで2回、飽和食塩水50 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、トルエン5 mlで共沸し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:エタノール−クロロホルム、0.3%ピリジン含有)により精製して、標記化合物(化合物4a)1.88 g(ピリジン塩、収率92%)を黄色泡状物質として得た。
<1-[(4-ペンタフルオロフェノキシカルボニルフタルイミジルエチル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物5a)>
アルゴン雰囲気下、1-[(4-カルボキシフタルイミジルエチル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物4a、ピリジン塩)380 mg(0.50 mmol)をピリジン8 mlに溶解し、トリフルオロ酢酸ペンタフルオロフェニル0.17 ml(1.00 mmol)及びトリエチルアミン0.28 ml(2.00 mmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮した後、残渣を酢酸エチル80 mlに溶解し、水50 mlで1回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液50 mlで1回、水50 mlで1回、飽和食塩水50 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、トルエン5 mlで共沸し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン、0.3%ピリジン含有)により精製して、標記化合物(化合物5a)375 mg(収率89%)を黄色泡状物質として得た。
<revHリンカーCPG固相担体(化合物6a)>
ガラスバイアル瓶中、1-[(4-ペンタフルオロフェノキシカルボニルフタルイミジルエチル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物5a)84.7 mg(0.10 mmol)をピリジンとトリエチルアミンの混合溶液(9:1)5 mlに溶解し、LCAA-CPG220 mg(25 μmol)を加えて、室温で24時間激しく振盪した。CPGをピリジン(5 ml×4回)及び塩化メチレン(10 ml×2回)で洗浄した後、減圧下室温で1.5時間乾燥した。続いて、CPGにキャッピング溶液(0.1M ジメチルアミノピリジンを含むピリジンと無水酢酸(9:1)の混合溶液)5 mlを加えて室温で2時間激しく振盪した。CPGをピリジン(5 ml×4回)及び塩化メチレン(10 ml×2回)で洗浄した後、減圧下で室温で乾燥して、標記化合物(化合物6a)(34.8μmol/g)を得た。
<1-[(3-アミノプロピル)アミノカルボニル]オキシ-6-ヘキサノール(化合物2b)>
1,6-ヘキサンジオール(化合物1)1.77 g(15.0 mmol)を原料として、エチレンジアミンの代わりに1,3-プロパンジアミン1.25 ml(15.0 mmol)を用いて化合物2aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物2b)859 mg(収率65%)を白色固体状物質として得た。
<1-[(4-カルボキシフタルイミジルプロピル)アミノカルボニル]オキシ-6-ヘキサノール(化合物3b)>
1-[(3-アミノプロピル)アミノカルボニル]オキシ-6-ヘキサノール(化合物2b)655 mg(3.00 mmol)を原料として化合物3aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物3b)949 mg(収率81%)を白色固体状物質として得た。
<1-[(4-カルボキシフタルイミジルプロピル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物4b)>
1-[(4-カルボキシフタルイミジルプロピル)アミノカルボニル]オキシ-6-ヘキサノール(化合物3b)643 mg(1.70 mmol)を原料として化合物4aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物4b、ピリジン塩)1.14 g(収率86%)を黄色泡状物質として得た。
<1-[(4-ペンタフルオロフェノキシカルボニルフタルイミジルプロピル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物5b)>
1-[(4-カルボキシフタルイミジルプロピル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物4b、ピリジン塩)387 mg(0.50 mmol)を原料として化合物5aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物5b)404 mg(収率94%)を黄色泡状物質として得た。
<revProリンカーCPG固相担体(化合物6b)>
1-[(4-ペンタフルオロフェノキシカルボニルフタルイミジルプロピル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物5b)86.1 mg(0.10 mmol)を原料として化合物6aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物6b)(31.7μmol/g)を得た。
<revHリンカーポリスチレン固相担体(化合物6c)>
ガラスバイアル瓶中、1-[(4-ペンタフルオロフェノキシカルボニルフタルイミジルエチル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物5a)84.7 mg(0.10 mmol)をジメチルホルムアミドとピリジンの混合溶液(9:1)3 mlに溶解し、アミノ化ポリスチレン担体材料400 mgを加えて室温で24時間激しく振盪した。ポリスチレン固相担体をジメチルホルムアミド(5 ml×4回)、メタノール(10 ml×2回)及び塩化メチレン(10 ml×2回)で洗浄した後、減圧下室温で2時間乾燥した。続いて、ポリスチレン固相担体にキャッピング溶液(0.1 Mジメチルアミノピリジンを含むピリジンと無水酢酸(9:1)の混合溶液)5 mlを加えて室温で2時間激しく振盪した。ポリスチレン固相担体をピリジン(5 ml×4回)、メタノール(10 ml×2回)及び塩化メチレン(10 ml×2回)で洗浄した後、減圧下で室温で乾燥して標記化合物(化合物8c)(120.5 μmol/g)を得た。
市販のアミノ化修飾用樹脂(3’-PT-Amino-modifier C6 CPG、Glen Research社)を用いた。
アルゴン雰囲気下、2-(モノメトキシトリチル)アミノエタノール(化合物7)6.67 g(20.0 mmol)及びジメチルアミノピリジン490 mg(4.00 mmol)をジメチルホルムアミド120 mlに溶解し、1,1’-カルボニルジイミダゾール1.95 g(12.0 mmol)を加えて室温で撹拌した。2時間後に1,1’-カルボニルジイミダゾール1.95 g(12.0 mmol)を追加し、室温でさらに4時間撹拌した。続いて反応液に6-アミノ-1-ヘキサノール7.03 g(60.0 mmol)を加え、室温で20時間撹拌した。反応液に酢酸エチル350 mlを加え、水100 mlで4回、飽和食塩水100 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:酢酸エチル−ヘキサン)により精製して標記化合物(化合物8)8.35g(収率88%)を無色飴状物質として得た。
<N-(2-アミノエトキシカルボニル)-6-アミノ-1-ヘキサノール(化合物9)>
アルゴン雰囲気下、N-[2-(モノメトキシトリチル)アミノエトキシカルボニル]-6-アミノ-1-ヘキサノール(化合物8)5.87 g(12.32 mmol)をエタノール70 mlに溶解し、80%酢酸水溶液50 mlを加えて室温で1.5時間撹拌した。反応液を減圧下濃縮後、エタノール(20 ml×3回)で共沸した。残渣を水150 mlに溶解し、ジエチルエーテル70 mlで2回洗浄した。溶液を約70 mlまで減圧下で濃縮した後、1 N水酸化ナトリウム水溶液を加えて溶液のpHを12とし、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:アセトニトリル−水)により精製して標記化合物(化合物9)2.11 g(収率84%)を白色固体状物質として得た。
<N-[(4-カルボキシフタルイミジル)エトキシカルボニル]-6-アミノ-1-ヘキサノール(10)>
N-(2-アミノエトキシカルボニル)-6-アミノ-1-ヘキサノール(化合物9)204 mg(1.00 mmol)を原料として化合物3aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物10)295 mg(収率78%)を白色泡状物質として得た。
<N-[(4-カルボキシフタルイミジル)エトキシカルボニル]-6-アミノ-O-(モノメトキシトリチル)-1-ヘキサノール(化合物11)>
N-[(4-カルボキシフタルイミジル)エトキシカルボニル]-6-アミノ-1-ヘキサノール(化合物10)757 mg(2.00 mmol)をピリジン20 mlに溶解し、塩化モノメトキシトリチル1.24 g(4.00 mmol)を加えて室温で18時間撹拌した。反応液にエタノール5 mlを加えた後、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチル200 mlに溶解し、水70 mlで2回、飽和食塩水70 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下濃縮後、トルエン(10 ml×2回)で共沸し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:エタノール−クロロホルム)により精製して標記化合物(化合物11)918 mg(収率71%)を白色泡状物質として得た。
<N-[(4-ペンタフルオロフェノキシカルボニルフタルイミジル)エトキシカルボニル]-6-アミノ-O-(モノメトキシトリチル)-1-ヘキサノール(12)>
N-[(4-カルボキシフタルイミジル)エトキシカルボニル]-6-アミノ-O-(モノメトキシトリチル)-1-ヘキサノール(化合物11)260 mg(0.40 mmol)を原料として化合物5aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物12)300 mg(収率89%)を白色泡状物質として得た。
<ssH-リンカーCPG固相担体(化合物13)>
N-[(4-ペンタフルオロフェノキシカルボニルフタルイミジル)エトキシカルボニル]-6-アミノ-O-(モノメトキシトリチル)-1-ヘキサノール(化合物12)85.0 mg(0.10 mmol)を原料として化合物8aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物13)(28.5μmol/g)を得た。
実施例1(revHリンカーCPG)、実施例2(revProリンカーCPG)、比較例1(C6リンカーCPG)及び比較例2(ssHリンカーCPG)の3’アミノ化修飾用固相担体の0.2μmol相当量をそれぞれ量りとり、各固相担体上でデオキシヌクレオシド3’-ホスホロアミダイト(Glen Research社)を配列に従って順次縮合させ、実施例1若しくは2、又は比較例1若しくは2のアミノリンカーを含む、5塩基又は25塩基鎖長の3’アミノ化オリゴヌクレオチドを合成した。
T5-revH (C59H84N12O38P5)-、計算値: m/e 1723.370、測定値: 1723.750
T5-revPro (C60H86N12O38P5)-、計算値: m/e 1737.385、測定値: 1737.797
T5-C6 (C56H79N11O36P5)-、計算値: m/e 1636.338、測定値: 1636.819
Sp25-revH (C252H325N95O150P25)-、計算値: m/e 7857.423、測定値: 7857.657
Sp25-revPro (C253H327N95O150P25)-、計算値: m/e 7871.439、測定値: 7872.029
Sp25-C6 (C249H320N94O148P25)-、計算値: m/e 7770.391、測定値: 7770.082
5塩基3’アミノ化オリゴヌクレオチド(T5-X; X=C6、ssH、revH又はrevPro)の配列:
5’ TTTTT-X 3’
(X=C6、ssH、revH又はrevPro)
25塩基3’アミノ化オリゴヌクレオチド(Sp25-X; X=C6、ssH、revH又はrevPro)の配列:
5’ TCTTCCAAGCAATTCCAATGAAAGC-X 3’(配列番号1)
式中、Xは、C6リンカーCPG、ssHリンカーCPG、revHリンカーCPG又はrevProリンカーCPGである。
実施例1(revHリンカーCPG)の3’アミノ化修飾用固相担体の0.2μmol相当量を量りとり、固相担体上で2’-O-TBDMS-3’-ホスホロアミダイト(Glen Research社)を配列に従って順次縮合させ、20塩基鎖長の3’revH化オリゴリボヌクレオチド(r20-revH)を合成した。
r20-revH (C197H254N73O141P20)-、計算値: m/e 6518.977、測定値: 6518.982
20塩基3’revH化オリゴリボヌクレオチド(r20-revH)の配列:
5’ AAACCUCUUCCAAGCAAUUC-X 3’(配列番号2)
式中、Xは、revHリンカーCPGである。
移動相
A溶液:5% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
B溶液:25% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
溶出条件
B溶液の%:15-35%/20分
カラム
Waters μ-Bondasphere C18、300 Å(内径3.9 mm×長さ150 mm、Waters社)
〔使用例1:固相担体からの切り出し処理の確認〕
実施例1若しくは2、又は比較例1若しくは2の3’アミノ化修飾用固相担体に結合した5塩基のオリゴヌクレオチド(T5-revH-CPG、T5-revPro-CPG、T5-C6-CPG又はT5-ssH-CPG)を合成後、各固相担体に基づき0.1μmol相当量の3’アミノ化修飾用固相担体結合オリゴヌクレオチドを密閉バイアルに量り取り、下記の脱保護条件で処理した。その後、各反応溶液から20μlを分注して減圧下で溶媒留去後、滅菌水25μlに溶解して、逆相HPLCによって分析した。各分析の結果を図2に示す。
AMA溶液[40%メチルアミン:濃アンモニア水(1:1)](2 ml、65℃、10分)
上記の結果より、本発明のアミノリンカーを含む3’アミノ化オリゴヌクレオチドは、AMA溶液では分解することなく、固相担体より回収されることを確認した。
固相合成した固相担体結合オリゴヌクレオチドの担体からの切り出しと、オリゴヌクレオチド部分の保護基の脱保護は、アルカリ条件下において通常行われる。そこで、アルカリ条件におけるアミノリンカーの安定性を明確に評価するため、以下の実験を行った。
移動相
A溶液:5% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
B溶液:25% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
溶出条件
B溶液の%:0-50%/20分
〔使用例3:Sp25-Xの固相担体からの切り出しと精製〕
実施例1若しくは2、又は比較例1若しくは2の3’アミノ化修飾用固相担体に結合した25塩基のオリゴヌクレオチド(Sp25-revH-CPG、Sp25-revPro-CPG、Sp25-C6-CPG又はSp25-ssH-CPG)に、AMA溶液2 mlを加えて65℃で10分間反応させて、固相担体からの3’アミノ化オリゴヌクレオチドの切り出しと脱保護処理を行った。減圧下で溶媒を留去した後、残渣を滅菌水に溶解して、目的物を逆相HPLCによって精製した。
移動相
A溶液:5% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
B溶液:25% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
溶出条件
B溶液の%:20-40%/20分(Sp25-revPro、Sp25-C6及びSp25-ssHの精製に使用)
B溶液の%:25-45%/20分(Sp25-revHの精製に使用)
〔使用例4:フルオレセインイソチオシアナート(FITC)との反応〕
実施例1、又は比較例1若しくは2のアミノリンカーを含む3’アミノ化オリゴヌクレオチド(Sp25-revH、Sp25-C6又はSp25-ssH)(150 pmol)とFITC(DOJINDO)(150 nmol)を、10%(v/v)ジメチルホルムアミド、0.25 Mリン酸緩衝溶液(pH8.0)に溶解し(全量100 μl)、遮光し40℃で反応を開始した。反応開始60分後に、反応液をNAP5(GEヘルスケア社)で脱塩し、溶出液を逆相HPLCで分析した。原料のSp25-Xの総量(mol)に対する反応生成物の量(mol)の割合(%)を図5に示す。
移動相
A溶液:5% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
B溶液:50% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
溶出条件
B溶液の%:0-100%/20分
カラム
Waters μ-Bondasphere C18、300 Å(内径3.9 mm×長さ150 mm、Waters社)
〔使用例5:ビオチンスクシンイミジルエステルとの反応〕
実施例1、又は比較例1若しくは2のアミノリンカーを含む3’アミノ化オリゴヌクレオチド(Sp25-revH、Sp25-C6又はSp25-ssH)(150 pmol)とビオチンスクシンイミジルエステル(DOJINDO)(15nmol)を、0.25 M リン酸緩衝溶液(pH8.0)に溶解し(全量100 μl)、40℃で反応を開始した。反応開始30分後に、反応液をNAP5(GEヘルスケア社)で脱塩し、溶出液を逆相HPLCで分析した。原料のSp25-Xの総量(mol)に対する反応生成物の量(mol)の割合(%)を図6に示す。
移動相
A溶液:5% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
B溶液:25% アセトニトリル/0.1M TEAA(pH7.0)
溶出条件
B溶液の%:0-80%/20分
カラム
Waters μ-Bondasphere C18、300 Å(内径3.9 mm×長さ150 mm、Waters社)
〔使用例6:ポリエチレングリコールスクシンイミジルエステルとの反応〕
実施例1、又は比較例1若しくは2のアミノリンカーを含む3’アミノ化オリゴヌクレオチド(Sp25-revH、Sp25-C6又はSp25-ssH)(150 pmol)とポリエチレングリコールスクシニミジルエステル(40K;日油)(75 nmol)を、0.25 M リン酸緩衝溶液(pH8.0)に溶解し(全量100 μl)、40℃で反応を開始した。反応開始60分後に、反応液をNAP5(GEヘルスケア社)で脱塩し、溶出液を逆相HPLCで分析した。原料のSp25-Xの総量(mol)に対する反応生成物の量(mol)の割合(%)を図7に示す。
移動相
A溶液:20% アセトニトリル
B溶液:2 M ギ酸アンモニウム/20% アセトニトリル
溶出条件
B溶液の%:5-70%/20分
カラム
Waters μ-Bondasphere C18、300 Å(内径3.9 mm×長さ150 mm、Waters社)
図5〜7に示すように、本発明のアミノリンカーを含む3’アミノ化オリゴヌクレオチドは、従来技術のC6リンカー(比較例1)を含む3’アミノ化オリゴヌクレオチドよりも顕著に高い反応効率でFITC及び活性エステルと反応した。また、本発明のアミノリンカーを含む3’アミノ化オリゴヌクレオチドは、特許文献1に記載のssHリンカー(比較例2)を含む3’アミノ化オリゴヌクレオチドと実質的に同等の反応効率でFITC及び活性エステルと反応した。
アルゴン雰囲気下、O-ジメトキシトリチル-1,6-ヘキサンジオール(化合物14)1.05 g(2.50 mmol)をジメチルホルムアミド25 mlに溶解し、トリエチルアミン1.74 ml(12.5 mmol)及び1,1’-カルボニルジイミダゾール490 mg(3.00 mmol)を加えて、室温で5時間撹拌した。続いて反応液にL-アラニンアミド塩酸塩623 mg(5.00 mmol)、及びジメチルアミノピリジン31 mg (0.25 mmol)を加え、80℃で24時間撹拌した。反応液に酢酸エチル150 mlを加え、水50 mlで4回、飽和食塩水50 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:エタノール−クロロホルム、0.3%ピリジン含有)により精製して、標記化合物(化合物15)720 mg(収率54%)を白色泡状物質として得た。
<(S)-O-ジメトキシトリチル-6-ヒドロキシヘキシル 1-アミノ-2-プロピルカルバメート(化合物16)>
アルゴン雰囲気下、ボランのテトラヒドロフラン溶液8.08 ml(1.1 mol/L、9.0 mmol)をテトラヒドロフラン40 mlに加えて氷冷し、ここに、N-(O-ジメトキシトリチル-6-ヒドロキシヘキシルオキシカルボニル)-L-アラニンアミド(化合物15)1.60 g(3.00 mmol)をテトラヒドロフラン30 mlに溶解した溶液を滴下した。反応液を0℃で15分撹拌した後、70℃で1時間加熱した。反応液を室温に戻した後、飽和塩化アンモニウム水溶液10 mlを加えて12時間撹拌した。反応液に酢酸エチル200 mlを加え、水80 mlで2回、飽和食塩水80 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:エタノール−クロロホルム、0.3%ピリジン含有)により精製して、標記化合物(化合物16)732 mg(収率47%)を無色オイル状物質として得た。
<(S)-1-[(4-カルボキシフタルイミジル-2-プロピル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物17)>
アルゴン雰囲気下、(S)-O-ジメトキシトリチル-6-ヒドロキシヘキシル 1-アミノ-2-プロピルカルバメート(化合物16)270 mg(0.52 mmol)及び無水トリメリト酸110 mg(0.57 mmol)をピリジン20 mlに溶解し、80℃で1時間、さらに120℃で19時間加熱還流した。反応液を室温まで冷却した後、減圧下で濃縮した。残渣をピリジン(5 ml×3回)で共沸した後、残渣をピリジン10 mlに溶解し、塩化ジメトキシトリチル264 mg(0.78 mmol)を加えて室温で撹拌した。1時間後、反応液に塩化ジメトキシトリチル100 mg(0.30 mmol)を追加して、室温でさらに1時間撹拌した。反応液にエタノール1 mlを加えた後、減圧下で濃縮した。残渣をクロロホルム70 mlに溶解し、水25 mlで2回、飽和食塩水25 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、トルエン5 mlで共沸し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:エタノール−クロロホルム、0.3%ピリジン含有)により精製して、標記化合物(化合物17)262 mg(ピリジン塩、収率65%)を白色泡状物質として得た。
<(S)-1-[(4-ペンタフルオロフェノキシカルボニルフタルイミジル-2-プロピル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物18)>
(S)-1-[(4-カルボキシフタルイミジル-2-プロピル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物17、ピリジン塩)232 mg(0.30 mmol)を原料として化合物5aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物18)183 mg(収率71%)を白色泡状物質として得た。
<revMeリンカーCPG固相担体(化合物19)>
(S)-1-[(4-ペンタフルオロフェノキシカルボニルフタルイミジル-2-プロピル)アミノカルボニル]オキシ-O-(ジメトキシトリチル)-6-ヘキサノール(化合物18)103 mg(0.12 mmol)を原料として化合物6aの合成と同様に処理し、標記化合物(化合物19)(35.0μmol/g)を得た。
アルゴン雰囲気下、O-ジメトキシトリチル-1,6-ヘキサンジオール(化合物14)1.34 g(3.20 mmol)をジメチルホルムアミド40 mlに溶解し、トリエチルアミン2.23 ml(16.0 mmol)及び1,1’-カルボニルジイミダゾール570 mg(3.52 mmol)を加えて、室温で3時間撹拌した。続いて反応液にL-セリンアミド塩酸塩675 mg(4.80 mmol)、及びジメチルアミノピリジン39 mg (0.32 mmol)を加え、80℃で2日間撹拌した。反応液に酢酸エチル250 mlを加え、水100 mlで4回、飽和食塩水100 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:エタノール−クロロホルム、0.3%ピリジン含有)により精製して、標記化合物(化合物20)685 mg(収率39%)を白色泡状物質として得た。
<(R)-O-ジメトキシトリチル-6-ヒドロキシヘキシル [1-ヒドロキシ-3-(トリフルオロアセチル)アミノ]-2-プロピルカルバメート(化合物21)>
アルゴン雰囲気下、N-(O-ジメトキシトリチル-6-ヒドロキシヘキシルオキシカルボニル)-L-セリンアミド(化合物20)110 mg(0.20 mmol)をテトラヒドロフラン10 mlに溶解して氷冷し、ボランのテトラヒドロフラン溶液0.50 ml(1.2 mol/L、0.60 mmol)を加えた。反応液を0℃で15分撹拌した後、70℃で1時間加熱した。反応液を室温に戻した後、飽和塩化アンモニウム水溶液1 mlを加えて1時間撹拌した。反応液に酢酸エチル40 mlを加え、水15 mlで2回、飽和食塩水15 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、残渣をメタノール5.0 mlに溶解し、トリエチルアミン0.084 ml (0.60 mmol)、及びトリフルオロ酢酸エチル0.048 ml (0.40 mmol)を加えて室温で1時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:エタノール−クロロホルム、0.3%ピリジン含有)により精製して、標記化合物(化合物21)88 mg(収率82%)を白色泡状物質として得た。
<(R)-O-ジメトキシトリチル-6-ヒドロキシヘキシル [1-ヒドロキシ-3-(トリフルオロアセチル)アミノ]-2-プロピルカルバメート コハク酸エステル(化合物22)>
アルゴン雰囲気下、(R)-O-ジメトキシトリチル-6-ヒドロキシヘキシル [1-ヒドロキシ-3-(トリフルオロアセチル)アミノ]-2-プロピルカルバメート(化合物21)168 mg(0.27 mmol)をピリジン5 mlに溶解し、コハク酸無水物81 mg (0.81 mmol)、及びジメチルアミノピリジン33 mg (0.27 mmol)を加えて、室温で6時間撹拌した。反応液に水1 mlを加えた後、減圧下で濃縮した。残渣にクロロホルム40 mlを加え、飽和リン酸二水素カリウム水15 mlで2回、飽和食塩水15 mlで1回洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥した。溶液を減圧下で濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(溶出溶媒:エタノール−クロロホルム、0.3%ピリジン含有)により精製して、標記化合物(化合物22)190 mg(収率96%)を白色泡状物質として得た。
<revMeOHリンカーCPG固相担体(化合物23)>
ガラスバイアル瓶中、(R)-O-ジメトキシトリチル-6-ヒドロキシヘキシル [1-ヒドロキシ-3-(トリフルオロアセチル)アミノ]-2-プロピルカルバメート コハク酸エステル(化合物22)146 mg(0.20 mmol)をピリジン8 mlに溶解し、LCAA-CPG 350 mg(40.0 μmol)、EDC 383 mg (2.0 mmol)、トリエチルアミン80μl、及びジメチルアミノピリジン12 mg (0.10 mmol)を加えて、室温で27時間激しく振盪した。CPGをピリジン(10 ml×4回)及び塩化メチレン(10 ml×2回)で洗浄した後、減圧下室温で1.5時間乾燥した。続いて、CPGにキャッピング溶液(0.1M ジメチルアミノピリジンを含むピリジンと無水酢酸(9:1)の混合溶液)8 mlを加えて室温で2時間激しく振盪した。CPGをピリジン(10 ml×4回)及び塩化メチレン(10 ml×2回)で洗浄した後、減圧下で乾燥して、標記化合物(化合物23)(44.9μmol/g)を得た。
実施例4(revMeリンカーCPG)及び実施例5(revMeOHリンカーCPG)の3’アミノ化修飾用固相担体を原料として合成例2と同様に処理し、各固相担体上でデオキシヌクレオシド3’-ホスホロアミダイト(Glen Research社)を配列に従って順次縮合させ、実施例4又は5のアミノリンカーを含む、5塩基鎖長の3’アミノ化オリゴヌクレオチドを合成した。
5’ TTTTT-X 3’
(X= revMe又はrevMeOH)
〔使用例7:アルカリ条件での安定性の確認〕
使用例1又は2と同様の方法により、実施例4(revMeリンカーCPG)及び実施例5(revMeOHリンカーCPG)のアミノリンカーを含むアミノ化オリゴヌクレオチドのアルカリ条件における安定性を評価した。合成したアミノ化オリゴヌクレオチドを濃アンモニア水で処理した反応液のHPLC分析結果を図9に示し、全3’アミノ化オリゴヌクレオチド(T5-X)量に対するAMA溶液処理又は濃アンモニア水処理によって分解したT5-Xの量の割合(%)を図10に示す。
AMA溶液[40%メチルアミン:濃アンモニア水(1:1)、65℃、10分]
濃アンモニア水[濃アンモニア水、55℃、16時間]
図9に示すように、実施例4のアミノリンカーを含む5塩基の3’アミノ化オリゴヌクレオチド(T5-revMe)では、濃アンモニア水処理によって分解由来のピークが検出された。実施例5のアミノリンカーを含む5塩基の3’アミノ化オリゴヌクレオチド(T5-revMeOH)でも、濃アンモニア水処理によって分解由来のピークが検出されたが、分解由来のピーク強度は、T5-revMeの場合と比較してより大きかった。
Claims (15)
- R2が、メチレン、エチレン又はプロピレンである、請求項1のアミノ化オリゴヌクレオチド。
- R 3 が、主鎖の員数2〜15の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基である、請求項1又は2のアミノ化オリゴヌクレオチド。
- R 3 が、ヘキシレンである、請求項4のアミノ化オリゴヌクレオチド。
- R2が、メチレン、エチレン又はプロピレンである、請求項6の固相担体。
- R 3 が、主鎖の員数2〜15の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基である、請求項6又は7の固相担体。
- R 3 が、ヘキシレンである、請求項9の固相担体。
- R4が、トリチル基又はモノ置換若しくはジ置換トリチル基である、請求項6〜10のいずれか1項の固相担体。
- R 2 が、メチレン、エチレン又はプロピレンである、請求項12のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブ。
- R 3 が、主鎖の員数2〜15の置換若しくは非置換の二価の脂肪族炭化水素基である、請求項12又は13のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブ。
- R 2 が、メチレンであり、R 3 が、ヘキシレンである、請求項14のアミノ化オリゴヌクレオチドプローブ。
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