CN108473526B - 寡核苷酸的制备方法以及核苷、核苷酸或寡核苷酸 - Google Patents

寡核苷酸的制备方法以及核苷、核苷酸或寡核苷酸 Download PDF

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Abstract

本发明提供寡核苷酸的制备方法，其包括：(1)在非极性溶剂中，使其中5’位羟基未被保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)等，与其中5’位羟基被保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)缩合，以获得含有亚磷酸三酯产物(c)的反应液的步骤；(3)使亚磷酸三酯产物(c)氧化或硫化，以获得含有其中5’位羟基被保护的寡核苷酸(d)的反应液的步骤；(4)将寡核苷酸(d)脱保护，以获得含有其中5’位羟基未被保护的寡核苷酸(e)的反应液的步骤；和(6)向含有寡核苷酸(e)的反应液中添加极性溶剂，并通过固液分离或萃取来纯化寡核苷酸(e)的步骤。

Description

寡核苷酸的制备方法以及核苷、核苷酸或寡核苷酸
技术领域
本发明涉及寡核苷酸的制备方法以及在上述制备方法中可有效使用的核苷、核苷酸或寡核苷酸。
背景技术
作为寡核苷酸的制备方法，目前广泛使用采用亚磷酰胺法的固相法(非专利文献1)。固相法就速度方面而言是有利的，因为已对工艺进行优化并且已取得自动化进展。然而，与其相关的缺陷在于由于设备限制而限制了规模放大。此外，利用液相法的寡核苷酸的制备方法也已得到研究。然而，由于操作复杂且收率低，因此难以大规模且快速合成多聚合度的寡核苷酸。
近年来，作为解决固相法和液相法的各自缺陷的尝试，已公开了使用疏水基团连接的核苷的制备方法(专利文献1)、或者使用具有被特定有机基团保护的3’位羟基的核苷或寡核苷酸的制备方法(专利文献2)等。
上述专利文献2中描述了寡核苷酸的制备方法，其包括下列步骤(i)～(iv)：
(i)除去核苷或寡核苷酸的5’位羟基的保护基(例如二甲氧基三苯甲基)(脱保护)；
(ii)使通过脱保护所获得的核苷或寡核苷酸与其中3’位羟基被亚磷酰胺化且5’位羟基被保护的核苷或寡核苷酸缩合；
(iii)使通过缩合所获得的亚磷酸三酯产物氧化或硫化；以及
(iv)对通过氧化或硫化所获得的具有被保护的5’位羟基的寡核苷酸进行固液分离。
可通过重复上述步骤(i)～(iv)来延长寡核苷酸链。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：JP-A-2010-275254
专利文献2：WO 2012/157723
非专利文献
非专利文献1：S.L.Beaucage，D.E.Bergstorm，G.D.Glick，R.A.Jones，CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry；John Wiley&Sons(2000)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是提供能够有效进行缩合的寡核苷酸的制备方法。
解决问题的手段
本发明人已进行深入研究，结果发现可通过改变专利文献2中所描述的步骤的顺序，并实施以下步骤来有效进行缩合：
(I)使其中5’位羟基未被保护、且3’位羟基等的至少一个基团被保护基保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)等与其中3’位羟基或3’位氨基被亚磷酰胺化、且5’位羟基被保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)缩合；
(II)使通过缩合所获得的亚磷酸三酯产物(c)氧化或硫化；
(III)从通过氧化或硫化所获得的寡核苷酸(d)除去5’位羟基的保护基(脱保护)；以及
(IV)通过固液分离或萃取来纯化经脱保护所获得的其中5’位羟基未被保护的寡核苷酸(e)。
对于专利文献2中所描述的步骤(i)～(iv)的重复而言，在脱保护(步骤(i))之后实施缩合(步骤(ii))。对于上述步骤(I)～(IV)的重复而言，在固液分离或萃取(步骤(IV))之后实施缩合(步骤(I))。因此，在含有上述步骤(I)～(IV)的制备方法中，缩合期间不存在由脱保护所产生的杂质，且可有效实施缩合。基于以上发现的本发明描述如下。
[1]寡核苷酸的制备方法，该方法包含以下的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，
步骤(1)：在非极性溶剂中，向包含核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)的反应液中添加核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)，使核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)缩合，以获得包含5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的亚磷酸三酯产物(c)的反应液，
所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)中，5’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基、3’位羟基和3’位氨基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基和3’位氨基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，
所述取代的核苷酸或寡核苷酸(α)中，5’位羟基未被保护，3’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，上述式中Ln1表示有机基团，
所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)中，3’位羟基或3’位氨基被亚磷酰胺化，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护；
步骤(3)：向包含亚磷酸三酯产物(c)的反应液中添加氧化剂或硫化剂，使亚磷酸三酯产物(c)氧化或硫化，以获得包含5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的寡核苷酸(d)的反应液；
步骤(4)：向氧化或硫化后的反应液中添加酸来除去5’位羟基的临时保护基，以获得包含5’位羟基未被保护的寡核苷酸(e)的反应液；和
步骤(6)：向包含寡核苷酸(e)的反应液中添加极性溶剂，通过固液分离或萃取来纯化寡核苷酸(e)。
[2]上述[1]所述的制备方法，其中，在步骤(1)中使用：
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)，其中5’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，或者
取代的核苷酸或寡核苷酸(α)，其中5’位羟基未被保护，3’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，上述式中Ln1表示有机基团；以及
核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)，其中3’位羟基被亚磷酰胺化，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护。
[3]上述[1]所述的制备方法，其中，在步骤(1)中使用：
核苷或寡核苷酸(a)，其中5’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护；以及
核苷或寡核苷酸(b)，其中3’位羟基被亚磷酰胺化，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护。
[4]上述[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(1)之后且步骤(3)之前还包含以下的步骤(2)，
步骤(2)：向缩合后的反应液中添加猝灭剂。
[5]上述[4]所述的制备方法，其中，步骤(2)中使用的猝灭剂是选自醇类、酚类和胺类中的至少一种。
[6]上述[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，向步骤(1)之后且步骤(4)之前的反应液中添加羧酸和有机碱的混合物、无机酸或胺类，在步骤(3)中向反应液中添加5-[(N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮作为硫化剂。
[7]上述[6]所述的制备方法，其中，相对于羧酸所具有的羧基1摩尔，有机碱所具有的碱性氮原子的量是1～2摩尔。
[8]上述[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(3)中使用的硫化剂是选自3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物、3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物、二硫化四乙基秋兰姆、四硫化双亚戊基秋兰姆、苯基-3H-1，2，4-二噻唑-3-酮、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮和硫中的至少一种。
[9]上述[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(3)中使用的氧化剂是选自碘、(1S)-(+)-(10-莰基磺酰基)氧氮杂环丙烷、叔丁基过氧化氢、过氧化甲乙酮、1，1-二氢过氧环十二烷、双(三甲基硅基)过氧化物和间氯过氧苯甲酸中的至少一种。
[10]上述[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，临时保护基是二甲氧基三苯甲基或单甲氧基三苯甲基。
[11]上述[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，非极性溶剂是选自卤系溶剂、芳族系溶剂、酯系溶剂和脂肪族系溶剂中的至少一种。
[12]上述[1]～[11]中任一项所述的制备方法，步骤(4)中使用的酸是选自三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸和对甲苯磺酸中的至少一种。
[13]上述[1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基具有碳数10以上的直链脂肪族烃基、或者具有有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下。
[14]上述[1]～[13]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(6)是如下步骤：向包含寡核苷酸(e)的反应液中添加极性溶剂，通过固液分离来纯化寡核苷酸(e)。
[15]上述[1]～[14]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(6)中使用的极性溶剂是腈系溶剂。
[16]上述[1]～[15]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(4)之后且步骤(6)之前还包含以下的步骤(5)，
步骤(5)：向包含寡核苷酸(e)的反应液中添加碱来进行中和。
[17]上述[16]所述的制备方法，其中，步骤(5)中使用的碱是选自吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1，2，4-三唑、N-苯基咪唑、2-氨基-4，6-二甲基嘧啶、1，10-菲咯啉、咪唑、N-甲基咪唑、2-氯苯并咪唑、2-溴苯并咪唑、2-甲基咪唑、2-苯基苯并咪唑、N-苯基苯并咪唑和5-硝基苯并咪唑中的至少一种。
[18]上述[1]～[17]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(6)之后还包含以下的步骤(7)，
步骤(7)：除去所得的寡核苷酸的全部保护基后，分离未被保护的寡核苷酸。
[19]上述[1]～[18]中任一项所述的制备方法，其中，在阳离子捕获剂的存在下进行步骤(4)中除去临时保护基的反应，或者在除去临时保护基的反应之后向反应液中添加阳离子捕获剂。
[20]上述[19]所述的制备方法，其中，阳离子捕获剂是选自吡咯、2-甲基吡咯、3-甲基吡咯、2，3-二甲基吡咯、2，4-二甲基吡咯、吲哚、3-甲基吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5，6-二甲基吲哚、6，7-二甲基吲哚、2-甲基呋喃、2，3-二甲基呋喃、2-甲基-3-(甲硫基)呋喃和薄荷呋喃中的至少一种。
[21]寡核苷酸的制备方法，该方法包含以下的步骤(1’)、(3’)、(4’)和(6’)：
步骤(1’)：在非极性溶剂中，向包含核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)的反应液中添加核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)，使核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)缩合，以获得包含3’位羟基或3’位氨基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的亚磷酸三酯产物(c’)的反应液，
所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)中，3’位羟基或3’位氨基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和5’位羟基、以及脱氧核糖残基的5’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，
所述取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)中，3’位羟基或3’位氨基未被保护，5’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，上述式中Ln1表示有机基团，
所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)中，5’位羟基被亚磷酰胺化，3’位羟基或3’位氨基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护；
步骤(3’)：向包含亚磷酸三酯产物(c’)的反应液中添加氧化剂或硫化剂，使亚磷酸三酯产物(c’)氧化或硫化，以获得包含3’位羟基或3’位氨基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的寡核苷酸(d’)的反应液；
步骤(4’)：向氧化或硫化后的反应液中添加酸来除去3’位羟基或3’位氨基的临时保护基，以获得包含3’位羟基或3’位氨基未被保护的寡核苷酸(e’)的反应液；和
步骤(6’)：向包含寡核苷酸(e’)的反应液中添加极性溶剂，通过固液分离或萃取来纯化寡核苷酸(e’)。
[22]上述[21]所述的制备方法，其中，在步骤(1’)中使用：
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)，其中3’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和5’位羟基、以及脱氧核糖残基的5’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，或者
取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)，其中3’位羟基未被保护，5’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，上述式中Ln1表示有机基团；以及
核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)，其中5’位羟基被亚磷酰胺化，3’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护。
[23]上述[21]所述的制备方法，其中，在步骤(1’)中使用：
取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)，其中3’位羟基未被保护，5’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，上述式中Ln1表示有机基团；以及
核苷或寡核苷酸(b’)，其中5’位羟基被亚磷酰胺化，3’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护。
[24]上述[21]所述的制备方法，其中，在步骤(1’)中使用：
核苷或寡核苷酸(a’)，其中3’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和5’位羟基、以及脱氧核糖残基的5’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护；以及
核苷或寡核苷酸(b’)，其中5’位羟基被亚磷酰胺化，3’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护。
[25]上述[21]～[24]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(1’)之后且步骤(3’)之前还包含以下的步骤(2’)，
步骤(2’)：向缩合后的反应液中添加猝灭剂。
[26]上述[25]所述的制备方法，其中，步骤(2’)中使用的猝灭剂是选自醇类、酚类和胺类中的至少一种。
[27]上述[21]～[26]中任一项所述的制备方法，其中，向步骤(1’)之后且步骤(4’)之前的反应液中添加羧酸和有机碱的混合物、无机酸或胺类，在步骤(3’)中向反应液中添加5-[(N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮作为硫化剂。
[28]上述[27]所述的制备方法，其中，相对于羧酸所具有的羧基1摩尔，有机碱所具有的碱性氮原子的量是1～2摩尔。
[29]上述[21]～[26]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(3’)中使用的硫化剂是选自3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物、3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物、二硫化四乙基秋兰姆、四硫化双亚戊基秋兰姆、苯基-3H-1，2，4-二噻唑-3-酮、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮和硫中的至少一种。
[30]上述[21]～[26]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(3’)中使用的氧化剂是选自碘、(1S)-(+)-(10-莰基磺酰基)氧氮杂环丙烷、叔丁基过氧化氢、过氧化甲乙酮、1，1-二氢过氧环十二烷、双(三甲基硅基)过氧化物和间氯过氧苯甲酸中的至少一种。
[31]上述[21]～[30]中任一项所述的制备方法，其中，羟基的临时保护基是二甲氧基三苯甲基或单甲氧基三苯甲基。
[32]上述[21]～[31]中任一项所述的制备方法，其中，非极性溶剂是选自卤系溶剂、芳族系溶剂、酯系溶剂和脂肪族系溶剂中的至少一种。
[33]上述[21]～[32]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(4’)中使用的酸是选自三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸和对甲苯磺酸中的至少一种。
[34]上述[21]～[33]中任一项所述的制备方法，其中，在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基具有碳数10以上的直链脂肪族烃基、或者具有有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下。
[35]上述[21]～[34]中任一项所述的制备方法，步骤(6’)是如下步骤：向包含寡核苷酸(e’)的反应液中添加极性溶剂，通过固液分离来纯化寡核苷酸(e’)。
[36]上述[21]～[35]中任一项所述的制备方法，其中，步骤(6’)中使用的极性溶剂是腈系溶剂。
[37]上述[21]～[36]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(4’)之后且步骤(6’)之前还包含以下的步骤(5’)，
步骤(5’)：向包含寡核苷酸(e’)的反应液中添加碱来进行中和。
[38]上述[37]所述的制备方法，其中，步骤(5’)中使用的碱是选自吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1，2，4-三唑、N-苯基咪唑、2-氨基-4，6-二甲基嘧啶、1，10-菲咯啉、咪唑、N-甲基咪唑、2-氯苯并咪唑、2-溴苯并咪唑、2-甲基咪唑、2-苯基苯并咪唑、N-苯基苯并咪唑和5-硝基苯并咪唑中的至少一种。
[39]上述[21]～[38]中任一项所述的制备方法，其中，在步骤(6’)之后还包含以下的步骤(7’)，
步骤(7’)：除去所得的寡核苷酸的全部保护基后，分离未被保护的寡核苷酸。
[40]上述[21]～[39]中任一项所述的制备方法，其中，在阳离子捕获剂的存在下进行步骤(4’)中除去临时保护基的反应，或者在除去临时保护基的反应之后向反应液中添加阳离子捕获剂。
[41]上述[40]所述的制备方法，其中，阳离子捕获剂是选自吡咯、2-甲基吡咯、3-甲基吡咯、2，3-二甲基吡咯、2，4-二甲基吡咯、吲哚、3-甲基吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5，6-二甲基吲哚、6，7-二甲基吲哚、2-甲基呋喃、2，3-二甲基呋喃、2-甲基-3-(甲硫基)呋喃和薄荷呋喃中的至少一种。
[42]由式(a-II)表示的核苷或寡核苷酸：
Figure BDA0001701464970000081
式中：
m表示0以上的整数；
m个碱基各自独立地表示任选被保护的核酸碱基；
m+1个X各自独立地表示氢原子、卤素原子、任选被保护的羟基、或与2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团；
m个R10各自独立地表示氧原子或硫原子；
m个Rp1各自独立地表示磷酸基团的保护基；
L表示单键、或者由式(a1)或(a1’)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000091
式中：
*表示与Y的键合位置；
**表示与氧原子的键合位置；
R1和R2各自独立地表示C1-22烃基；
L1表示任选取代的二价C1-22烃基；
L2表示单键、或表示由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，式中***表示与L1的键合位置，****表示与C＝O的键合位置，R4表示C1-22亚烷基，R3和R5各自独立地表示氢原子或C1-22烷基，或者R3与R5任选地一起形成环；
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基；以及
Z表示由式(a2)、式(a2’)或式(a2”)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000092
式中：
*表示键合位置；
R6是氢原子，或者当Rb是由下式(a3)表示的基团时，环A或环B的R6任选地与R8一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；
k表示1～4的整数；
k个Q各自独立地表示-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
环A和环B各自独立地，除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自：卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子；以及
Rb表示氢原子、或由式(a3)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000101
式中：
*表示键合位置；
j表示0～4的整数；
j个Q各自独立地如上所定义；
j个R9各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
R8表示氢原子、或者任选地与环A或环B的R6一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；以及
环C除了具有j个QR9以外，还任选具有取代基，所述取代基选自：卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；或
Ra与Rb一起形成氧代基(oxo group)，
R11表示甲基，R12和R13各自独立地表示C1-5烷基，或者R11和R12任选地连同与它们所键合的碳原子和氮原子一起形成5元或6元含氮烃环。
[43]上述[42]所述的核苷或寡核苷酸，其中，Rp1是由-CH2CH2WG表示的基团，式中WG表示吸电子基团。
[44]上述[42]或[43]所述的核苷或寡核苷酸，其中，R11是甲基，R12和R13各自独立地为C1-5烷基。
[45]上述[42]～[44]中任一项所述的核苷，其中，m是0。
[46]由式(a-IV)表示的核苷或寡核苷酸：
Figure BDA0001701464970000111
式中：
m表示0以上的整数；
m+1个碱基各自独立地表示任选被保护的核酸碱基；
m+1个X各自独立地表示氢原子、卤素原子、任选被保护的羟基、或与2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团；
m个R10各自独立地表示氧原子或硫原子；
m个Rp1各自独立地表示磷酸基团的保护基；
L表示单键、或者由式(a1)或(a1’)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000112
式中：
*表示与Y的键合位置；
**表示与氧键的键合位置；
R1和R2各自独立地表示C1-22烃基；
L1表示任选取代的二价C1-22烃基；
L2表示单键、或者表示由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，式中***表示与L1的键合位置，****表示与C＝O的键合位置，R4表示C1-22亚烷基，R3和R5各自独立地表示氢原子或C1-22烷基，或者R3与R5任选地一起形成环；
Y表示单键、氧原子或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基；以及
Z′表示由式(a2”)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000121
式中：
*表示键合位置；
R6是氢原子，或者当Rb是由下式(a3)表示的基团时，R6任选地与R8一起表示单键或-O-，以与环B及环C一起形成稠环；
k表示1～4的整数；
k个Q各自独立地表示-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
环B除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自：卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子；以及
Rb表示氢原子、或由式(a3)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000122
式中：
*表示键合位置；
j表示0～4的整数；
j个Q各自独立地如上所定义；
j个R9各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
R8表示氢原子、或者任选地与R6一起表示单键或-O-，以与环B及环C一起形成稠环；以及
环C除了具有j个QR9以外，还任选具有取代基，所述取代基选自：卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者
Ra与Rb一起形成氧代基。
[47]上述[46]所述的核苷或寡核苷酸，其中，Rp1是由-CH2CH2WG表示的基团，式中WG表示吸电子基团。
[48]上述[46]或[47]所述的核苷，其中，m是0。
[49]由式(I)表示的核苷酸或寡核苷酸：
Figure BDA0001701464970000131
式中：
m表示0以上的整数；
m+1个碱基各自独立地表示任选被保护的核酸碱基；
m+1个X各自独立地表示氢原子、卤素原子、任选被保护的羟基、或与2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团；
m个R10各自独立地表示氧原子或硫原子；
m个Rp1各自独立地表示磷酸基团的保护基；
Rn1和Rn2中的一个表示氢原子，另一个表示由式(II)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000132
式中：
*表示键合位置；
R10表示氧原子或硫原子；
Rp1表示磷酸基团的保护基；
Ln1表示有机基团；
L表示单键、或者由式(a1)或(a1’)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000141
式中：
*表示与Y的键合位置；
**表示与氧原子的键合位置；
R1和R2各自独立地表示C1-22烃基；
L1表示任选取代的二价C1-22烃基；
L2表示单键、或者表示由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，式中***表示与L1的键合位置，****表示与C＝O的键合位置，R4表示C1-22亚烷基，R3和R5各自独立地表示氢原子或C1-22烷基，或者R3与R5任选地一起形成环；
Y表示单键、氧原子、或NR，其中R表示氢原子、烷基或芳烷基；以及
Z表示由式(a2)、式(a2’)或式(a2”)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000142
式中：
*表示键合位置；
R6是氢原子，或者当Rb是由下式(a3)表示的基团时，环A或环B的R6任选地与R8一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；
k表示1～4的整数；
k个Q各自独立地表示-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
环A和环B各自独立地，除了具有k个QR7之外，还任选具有取代基，所述取代基选自：卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra表示氢原子；以及
Rb表示氢原子、或由式(a3)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000151
式中：
*表示键合位置；
j表示0～4的整数；
j个Q各自独立地如上所定义；
j个R9各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
R8表示氢原子、或者任选地与环A或环B的R6一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；以及
环C除了具有j个QR9以外，还任选具有取代基，所述取代基选自：卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基，或者
Ra与Rb一起形成氧代基。
[50]上述[49]所述的核苷酸或寡核苷酸，其中，Rn1是由式(II)表示的基团，Rn2是氢原子。
[51]上述[49]或[50]所述的核苷酸或寡核苷酸，其中，Ln1是亚乙基。
[52]上述[49]～[51]中任一项所述的核苷酸，其中，m是0。
发明的效果
根据本发明的寡核苷酸的制备方法，可有效地实施缩合。
具体实施方式
[术语]
除非在文中另外指明，否则在本说明书中使用的任何技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。与本说明书中描述的方法和材料同样或同等的任意方法和材料均可在本发明的实施或试验中使用，并且优选的方法和材料描述于下文中。通过引用将本说明书中提及的所有出版物和专利并入本文，以便描述和公开例如可与所描述的发明相关使用的出版物中所描述的构成产品和方法论。
在本说明书中，作为寡核苷酸的结构单元的“核苷”是指，其中通过N-苷化使核酸碱基与糖(例如2-脱氧核糖或核糖、或者其中2位碳原子与4位碳原子通过二价有机基团键合的2-脱氧核糖或核糖等)的1’位键合的化合物。
在本说明书中，“糖”还包括其中羟基被氨基置换的氨基糖以及其中2位羟基被卤素原子置换的核糖。
其中2位碳原子与4位碳原子通过二价有机基团键合的2-脱氧核糖或核糖的实例包括下列化合物。
Figure BDA0001701464970000161
氨基糖的实例包括其中3位羟基被氨基置换的2-脱氧核糖、其中3位羟基被氨基置换的核糖、以及其中3位羟基被氨基置换且2位羟基被卤素置换的核糖，显示于以下(在下式中Xs是卤素原子)。
Figure BDA0001701464970000162
在本说明书中，“磷酸基团”不仅包括-O-P(O)(OH)2，而且包括其中氧原子被硫原子或NH置换的基团(例如-O-P(S)(OH)2、-NH-P(O)(OH)2、-NH-P(S)(OH)2)。另外，其中磷酸基团中的羟基(-OH)被-ORp(其中Rp是例如磷酸基团的保护基等有机基团)置换的基团(例如被保护的磷酸基团)也包括在“磷酸基团”中。
在本说明书中，“核苷酸”是指其中磷酸基团与核苷键合的化合物。其中3’位羟基或5’位羟基被磷酸基团置换的核苷酸的实例包括由下式表示的化合物(下式中，Rm1和Rm2各自独立为氢原子或有机基团(排除核苷残基)，且Xm是氢原子、羟基或卤素原子)。
Figure BDA0001701464970000171
在本说明书中，“寡核苷酸”是指其中1个以上核苷酸与核苷键合的化合物。“寡核苷酸”还包括其中磷酸基团的氧原子被硫原子置换的硫代磷酸酯型寡核苷酸、其中磷酸基团的-O-被-NH-置换的寡核苷酸、以及其中磷酸基团中的羟基(-OH)被-ORp(其中Rp是有机基团)置换的寡核苷酸。虽然本发明中寡核苷酸的核苷数量没有特别限制，但是优选为3-50个，更优选5-30个。
在本说明书中，“3’位氨基”是指与核苷、核苷酸或寡核苷酸的3’位碳原子键合的氨基。
在本说明书中，“5’位氨基”是指与核苷、核苷酸或寡核苷酸的5’位碳原子键合的氨基。
在本说明书中，“3’位磷酸基团”是指与核苷酸或寡核苷酸的3’位碳原子键合的磷酸基团。
在本说明书中，“5’位磷酸基团”是指与核苷酸或寡核苷酸的5’位碳原子键合的磷酸基团。
在本说明书中，“核酸碱基”不受到特别限制，只要它可用于核酸的合成，并包括例如嘧啶碱基，例如可提及胞嘧啶基、尿嘧啶基、胸腺嘧啶基等；以及嘌呤碱基，例如腺嘌呤基、鸟嘌呤基等。“任选保护的核酸碱基”是指例如腺嘌呤基、鸟嘌呤基或胞嘧啶基(其为具有氨基的核酸碱基)中，氨基可被保护，且优选这样的核酸碱基：其中的氨基被可耐受核苷酸的5’位的脱保护条件的保护基保护。
“氨基的保护基”不受到特别限制，其实例包括描述于Greene′s PROTECTIVEGROUPSIN ORGANIC SYNTHESIS，第4版，Wiley-Interscience出版，2006年等中的保护基。该保护基的具体实例包括新戊酰基、新戊酰氧基甲基、乙酰基、三氟乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、1-(二甲基氨基)亚乙基(1-(dimethylamino)ethylidene group)、9-芴甲氧羰基。其中，乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基和1-(二甲基氨基)亚乙基是优选的。
核酸碱基的羰基也任选被保护，且可例如通过与以下化合物反应来保护：苯酚、2，5-二氯苯酚、3-氯苯酚、3，5-二氯苯酚、2-甲酰基苯酚、2-萘酚、4-甲氧基苯酚、4-氯苯酚、2-硝基苯酚、4-硝基苯酚、4-乙酰基氨基苯酚、五氟苯酚、4-新戊酰氧基苯甲醇、4-硝基苯乙醇、2-(甲磺酰基)乙醇、2-(苯磺酰基)乙醇、2-氰基乙醇、2-(三甲硅基)乙醇、二甲氨基甲酰氯、二乙氨基甲酰氯、乙基苯基氨基甲酰氯、1-吡咯烷碳酰氯、4-吗啉碳酰氯、二苯基氨基甲酰氯等。在一些情况下，不需要特别引入羰基的保护基。
除了上述基团之外，“核酸碱基”中还包括修饰的核酸碱基(例如8-溴腺嘌呤基、8-溴鸟嘌呤基、5-溴胞嘧啶基、5-碘胞嘧啶基、5-溴尿嘧啶基、5-碘尿嘧啶基、5-氟尿嘧啶基、5-甲基胞嘧啶基、8-氧代鸟嘌呤基、次黄嘌呤基等)，其是在任意位置处被1～3个任意的取代基(例如卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烷氧基烷基、羟基、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、羧基、氰基、硝基等)取代的核酸碱基。
在本说明书中，“卤素原子”是指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
在本说明书中，“烷基(基团)”可为直链和支链的任何形式。作为“烷基(基团)”，可提及碳数为1以上的烷基。当不特别限制碳数范围时，其优选为C1-10烷基，更优选C1-6烷基，进一步优选C1-5烷基。当不特别限制碳数范围时，具体的优选实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等，且甲基和乙基是特别优选的。
在本说明书中，“Ca-b”是指碳数为a以上且b以下(a、b是整数)。
在本说明书中，作为“芳烷基(基团)”，可提及C7-20芳烷基，且优选C7-16芳烷基(C6-10芳基-C1-6烷基)。具体的优选实例包括苄基、1-苯基乙基、2-苯基乙基、1-苯基丙基、萘基甲基、1-萘基乙基、1-萘基丙基等，且特别优选苄基。
在本说明书中，“烷氧基(基团)”可为直链和支链的任何形式。作为“烷氧基(基团)”，可提及具有1个以上碳原子的烷氧基。当不特别限制碳数范围时，其优选为C1-10烷氧基，更优选C1-6烷氧基。当不特别限制碳数范围时，具体的优选实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等，特别优选为甲氧基和乙氧基。
在本说明书中，“酰基(基团)”可为直链和支链的任何形式。“酰基(基团)”的实例包括C1-6烷酰基、C7-13芳酰基等。其具体实例包括甲酰基、乙酰基、正丙酰基、异丙酰基、正丁酰基、异丁酰基、新戊酰基、戊酰基、己酰基、苯甲酰基、萘甲酰基、乙酰丙酰基(levulinyl)等，这些基团各自任选被取代。
在本说明书中，“烯基(基团)”可为直链和支链的任何形式。“烯基(基团)”的实例包括C2-6烯基等。其具体实例包括乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基等。其中，优选C2-4烯基。
在本说明书中，“炔基(基团)”可为直链和支链的任何形式。“炔基(基团)”的实例包括C2-6炔基等。其具体实例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、4-己炔基、5-己炔基等。其中，优选C2-4炔基。
在本说明书中，“环烷基(基团)”是指环状烷基，其实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。其中，优选C3-6环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基等，且特别优选环己基。
在本说明书中，“芳基(基团)”是指单环芳族或多环(稠合)芳族烃基。其具体实例包括C6-14芳基，例如苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基、2-蒽基等。其中，更优选C6-10芳基，且特别优选苯基。
在本说明书中，“烃基”的实例包括脂肪族烃基、芳族脂肪族烃基、单环饱和烃基、芳族烃基等，其具体实例包括一价基团，例如烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基等；以及由它们衍生的二价基团。
在本说明书中，“C6-14烃环”的实例包括C6-10环烷烃、C6-10环烯烃、C6-14芳族烃环。
该“C6-10环烷烃”的实例包括环己烷、环庚烷、环辛烷。
该“C6-10环烯烃”的实例包括环己烯、环庚烯、环辛烯。
该“C6-14芳族烃环”的实例包括苯、萘。
在本说明书中，“亚烷基(基团)”可为直链和支链的任何形式。作为“亚烷基(基团)”，可提及碳数为1以上的亚烷基。当不特别限制碳数范围时，其优选为C1-10亚烷基，更优选C1-6亚烷基。具体的优选实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基，且特别优选亚甲基和亚乙基。
在本说明书中，“连接基”的实例包括-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)-、-S-、-SO-、-SO2-、-Si(R’)(R”)O-、-Si(R’)(R”)-(R’、R”各自独立为氢原子或C1-22烃基)等。
在本说明书中，“任选取代”中的“取代基”包括上述卤素原子、烷基、芳烷基、烷氧基、酰基、烯基、炔基、环烷基、芳基、以及羟基、硝基、氰基、胍基、羧基、烷氧基羰基(烷氧基部分与上述烷氧基中的相同)、磺基(sulfo group)、二氧磷基(phospho group)、烷硫基(烷基部分与上述烷基中的相同)、烷基亚磺酰基(烷基部分与上述烷基中的相同)、烷基磺酰基(烷基部分与上述烷基中的相同)、氨基、单烷基氨基(烷基部分与上述烷基中的相同)、二烷基氨基(烷基部分与上述烷基中的相同)、氧代基等。
[寡核苷酸的制备方法]
本发明的制备方法包括其中在从3’末端到5’末端的方向上延长寡核苷酸链(下文有时简称为“3’-5’合成”)的实施方案、和其中在从5’末端到3’末端的方向上延长寡核苷酸链(下文有时简称为“5’-3’合成”)的实施方案两者。下面说明涉及3’-5’合成的本发明制备方法。
3’-5’合成
涉及3’-5’合成的本发明制备方法包括下列步骤(1)、(3)、(4)和(6)。必要时，该制备方法可进一步含有下列步骤(2)、(5)和(7)。
步骤(1)：在非极性溶剂中，向包含核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)的反应液中添加核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)，使核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)缩合，以获得包含5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的亚磷酸三酯产物(c)的反应液，
所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)中，5’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基、3’位羟基和3’位氨基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基和3’位氨基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选被用于核酸合成的保护基保护，
所述取代的核苷酸或寡核苷酸(α)中，5’位羟基未被保护，3’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选被用于核酸合成的保护基保护，上述式中Ln1表示有机基团，
所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)中，3’位羟基或3’位氨基被亚磷酰胺化，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护；
步骤(2)：必要时，向缩合后的反应液中添加猝灭剂；
步骤(3)：向包含亚磷酸三酯产物(c)的反应液中添加氧化剂或硫化剂，使亚磷酸三酯产物(c)氧化或硫化，以获得包含5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的寡核苷酸(d)的反应液；
步骤(4)：向氧化或硫化后的反应液中添加酸来除去5’位羟基的临时保护基，以获得包含5’位羟基未被保护的寡核苷酸(e)的反应液；以及
步骤(5)：必要时，向包含寡核苷酸(e)的反应液中添加碱来进行中和；
步骤(6)：向包含寡核苷酸(e)的反应液中添加极性溶剂，通过固液分离或萃取来纯化寡核苷酸(e)；以及
步骤(7)：必要时，除去所得的寡核苷酸的全部保护基后，分离未被保护的寡核苷酸。
可通过重复步骤(1)、(3)、(4)和(6)(优选步骤(1)～(6))的循环来延长寡核苷酸链。包括步骤(1)、(3)、(4)和(6)的寡核苷酸的制备方法包括在本发明中。
步骤(1)(缩合)
在该步骤中，使核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)(在每一者中，5’位羟基未被保护，3位羟基等中的至少一个被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护)与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)(其中3’位羟基或3’位氨基被亚磷酰胺化，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护)缩合，以获得其中5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的亚磷酸三酯产物(c)。
在本步骤的优选实施方案中，使用：
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)，其中5’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选被用于核酸合成的保护基保护，或者
取代的核苷酸或寡核苷酸(α)，其中5’位羟基未被保护，3’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，其中Ln1是有机基团，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选被用于核酸合成的保护基保护，以及
核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)，其中3’位羟基被亚磷酰胺化，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护。
针对Ln1的有机基团是指其中烃基或烃基中的碳原子被杂原子置换的基团。杂原子的实例包括氧原子、氮原子、硫原子等。有机基团可具有取代基，该取代基例如羟基、氨基、氧代基(＝O)等。有机基团可具有的羟基和氨基优选被保护基保护。有机基团的形状可以是链(直链或支链)、环或这些的组合。
有机基团可具有对细胞具有功能性的基团。对细胞具有功能性的基团优选与有机基团的主链或侧链的末端键合。对细胞具有功能性的基团的实例包括“通过改进化合物的脂溶性来改进该化合物的细胞膜渗透性的基团”、“改进化合物经由细胞膜受体向细胞内摄取的基团”等。“通过改进化合物的脂溶性来改进该化合物的细胞膜渗透性的基团”的实例包括胆固醇残基、生育酚残基等。“改进化合物经由细胞膜受体向细胞内摄取的基团”的实例包括N-乙酰半乳糖胺残基等。
-OLn1-OH的具体实例包括以下例子(下式中，*表示与磷原子的键合位置，且Ac是乙酰基)。
Figure BDA0001701464970000231
Ln1优选为C2-6亚烷基，更优选为亚乙基。
在本步骤的更优选实施方案中，使用：
核苷或寡核苷酸(a)，其中5’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和3’位羟基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选被用于核酸合成的保护基保护，以及
核苷或寡核苷酸(b)，其中3’位羟基被亚磷酰胺化，5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选被用于核酸合成的保护基保护。
本步骤中使用的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)在溶液中的浓度没有特别限制，只要其溶解于溶剂中即可，但是其优选为1～30wt％。
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)、取代的核苷酸或寡核苷酸(α)和核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)的氨基优选被上述保护基保护。作为该保护基，优选乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、和1-(二甲基氨基)亚乙基。当核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)和核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)具有多个氨基时，氨基的保护基可仅为1种或者可为2种以上。
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)中，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基、3’位羟基和3’位氨基、以及脱氧核糖残基的3’位羟基和3’位氨基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护。核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)中，优选选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的3’位羟基以及脱氧核糖残基的3’位羟基中的至少一个基团被上述保护基保护，更优选核糖残基的3’位羟基或脱氧核糖残基的3’位羟基被上述保护基保护。
取代的核苷酸或寡核苷酸(α)中，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护。
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)和取代的核苷酸或寡核苷酸(α)所具有的“在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基”、以及核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)所任选具有的“在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基”各自独立地且优选为具有碳数10以上的直链脂肪族烃基、或具有有机基团的保护基(下文有时简称为“锚固物(anchor)”)，以有效实施步骤(6)(固液分离或萃取)，所述有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下。
所述锚固物对核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)和取代的核苷酸或寡核苷酸(α)(在一些情况中，以及核苷、核苷酸或寡核苷酸(b))赋予疏水性，并改进在非极性溶剂中的溶解性。其还可降低在极性溶剂中的溶解性。各自被此类锚固物保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)和取代的核苷酸或寡核苷酸(α)可在非极性溶剂的液相中实施缩合反应。在之后的步骤(6)中，通过向反应液中添加极性溶剂，被锚固物保护的寡核苷酸(e)沉淀，并可实施其固液分离。或者，在步骤(6)中，向反应液中添加极性溶剂，在极性溶剂与非极性溶剂之间发生分层，并将寡核苷酸(e)转移到非极性溶剂中，由此可实施其萃取。作为此类锚固物，可使用例如专利文献1、专利文献2和WO2013/122236中描述的那些。
在步骤(6)中实施通过固液分离的纯化时，所述锚固物优选为具有碳数10以上的直链脂肪族烃基的保护基。在步骤(6)中实施通过萃取的纯化时，所述锚固物优选为具有有机基团的保护基，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下。
首先说明对于固液分离而言合适的锚固物。对于固液分离而言合适的锚固物的实例包括：具有经由连接基键合有烃基的C6-14烃环的保护基，所述烃基经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基。
上述碳数10以上的直链脂肪族烃基优选选自直链C10-40烷基和直链C10-40烯基，更优选直链C10-40烷基，进一步优选直链C10-30烷基，特别优选直链C12-28烷基，最优选直链C14-26烷基。
上述连接基优选选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-、-NHC(＝O)-、-S-、-SO-、-SO2-和-Si(R’)(R”)O-、-Si(R’)(R”)-(R’、R”各自独立为氢原子或C1-22烃基)，更优选选自-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-和-NHC(＝O)-，进一步优选-O-。
上述C6-14烃环优选选自苯环、萘环和环己烷环，更优选选自苯环和环己烷环，进一步优选苯环。
对于固液分离而言合适的锚固物优选为具有经由-O-键合有烃基的苯环的保护基，所述烃基经由单键或-O-键合有直链C10-40烷基。
接着说明对于萃取而言合适的锚固物。“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”中的“支链”是直链或支链的饱和脂肪族烃基，且优选为C1-6烷基，更优选C1-4烷基，进一步优选甲基或乙基。该“支链”任选被1个以上卤素原子取代。
“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”中的“脂肪族烃基”是直链的饱和或不饱和脂肪族烃基，为C2-300烷基(优选C3-100烷基，更优选C3-60烷基)、C2-300烯基(优选C3-100烯基，更优选C3-60烯基)或C2-300炔基(优选C3-100炔基，更优选C3-60炔基)。
“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”中的“含有1条以上支链的脂肪族烃基”的位置没有特别限制，可存在于末端(一价基团)、或者存在于末端以外的位置(例如二价基团)。
“含有1条以上支链的脂肪族烃基”的实例包括以下基团的支化异构体(branchedisomer)：丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基阴桂基)、十三烷基、肉豆蔻基、鲸蜡基、硬脂基、二十烷基、山萮基、油烯基、亚油基(linolyl group)、二十四烷基等；并且是含有1条以上支链的一价基团和由其衍生的二价基团。“含有1条以上支链的脂肪族烃基”优选3，7，11-三甲基十二烷基、3，7，11，15-四甲基十六烷基(下文有时候也称作2，3-二氢植基(2，3-dihydrophytyl group))、2，2，4，8，10，10-六甲基十一烷-5-基等。
当“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”中存在多个“含有1条以上支链的脂肪族烃基”时，它们可以相同或不同。
可任意设定“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”中的“含有1条以上支链的脂肪族烃基”以外的部分。例如，任选具有-O-、-S-、-CO-、-NH-、-COO-、-OCONH-、-CONH-、-NHCO-、烃基(一价基团或二价基团)等部分。“烃基”的实例包括脂肪族烃基、芳族脂肪族烃基、单环饱和烃基、芳族烃基等。具体地，例如使用烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、芳烷基等一价基团以及由它们衍生的二价基团。作为“烷基”，优选C1-6烷基，例如可提及甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。作为“烯基”，优选C2-6烯基，例如可提及乙烯基、1-丙烯基、烯丙基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基等。作为“炔基”，优选C2-6炔基，例如可提及乙炔基、炔丙基、1-丙炔基等。作为“环烷基”，优选C3-6环烷基，例如可提及环丙基、环丁基、环戊基、环己基。作为“芳基”，优选C6-14芳基，例如可提及苯基、1-萘基、2-萘基、联苯基、2-蒽基等。其中，更优选C6-10芳基，且特别优选苯基。作为“芳烷基”，优选C7-20芳烷基，例如可提及苄基、1-苯基乙基、2-苯基乙基、1-苯基丙基、萘基甲基、1-萘基乙基、1-萘基丙基等。其中，更优选C7-16芳烷基(C6-10芳基-C1-6烷基)，且特别优选苄基。该“烃基”任选被选自卤素原子(氯原子、溴原子、氟原子、碘原子)，氧代基等的取代基取代。
“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”中的“总碳酸”为14以上，优选16以上，更优选18以上，且为300以下，优选200以下，更优选160以下。“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”中的支链的数量(条数)没有特别限制，且优选2以上，更优选3以上，更优选4以上，更优选8以上，进一步优选10以上。该支链的数量越多，即使在寡核苷酸链成为长链的情况下，被具有“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”的锚固物保护的核苷或寡核苷酸在有机溶剂(尤其非极性溶剂)中也良好地溶解。
作为“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”，优选具有由式(A)表示的相同或不同的二价基团的基团：
Figure BDA0001701464970000271
式中：
*是与邻接原子的键合位置；
R14和R15各自独立为氢原子或C1-4烷基；以及
X1是单键或C1-4亚烷基，
条件为，R14和R15不同时为氢原子。
具有由式(A)表示的二价基团的基团的实例包括由下式(B)～(D)中任一者表示的基团。式(B)～(D)中的各符号的定义中的碳数、重复单元的数目(m1、n0-n2)等是为了方便而表示的，可在上述定义的范围内进行适当变化，以使总碳数可为14以上(优选16以上，更优选18以上)且300以下(优选200以下，更优选160以下)。以下依序说明式(B)～(D)。
式(B)如下所描述。
Figure BDA0001701464970000272
式中：
*是与邻接原子的键合位置；
R16和R17是氢原子或一起表示＝O；
n0是2～40的整数；
n0个R18和R19各自独立为氢原子或C1-4烷基；
n0个X2各自独立为单键或C1-4亚烷基；
R20是氢原子或C1-4烷基；以及
R21是C1-4烷基，
条件是，R18和R19不同时是氢原子，且当n0是2时，R20是C1-4烷基。
作为式(B)的基团，优选以下基团：其中，
R16和R17各自是氢原子；
n0是2～40的整数；
n0个R18和R19各自独立为氢原子、甲基或乙基；
n0个X2各自独立为单键、亚甲基或亚乙基；以及
R20是氢原子、甲基或乙基(条件是，R18和R19不同时是氢原子，且当n0是2时，R20是甲基或乙基)。
式(B)的基团更优选肉豆蔻基、鲸蜡基、硬脂基、二十烷基、山萮基等的碳数14～160的支化异构体，其中特别优选2，3-二氢植基、3，7，11-三甲基十二烷基、2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰基。
式(C)如下所描述。
Figure BDA0001701464970000281
式中：
*是与邻接原子的键合位置；
m1个OR22各自独立为被由式(B)表示的基团取代的羟基；以及
m1是1～3的整数。
式(C)中的“由式(B)表示的基团”如上所描述，除了其中的*是与O(即邻接原子)的键合位置。
式(C)的基团中，R22更优选肉豆蔻基、鲸蜡基、硬脂基、二十烷基、山萮基等碳数14～30的支化异构体基团，其中特别优选2，3-二氢植基、3，7，11-三甲基十二烷基。
式(D)如下所描述。
Figure BDA0001701464970000282
式中：
*是与Q的键合位置；
n1是1～10的整数；
n2是1～10的整数；
n1个R26和R27各自独立为氢原子或C1-4烷基；
n1个X3各自独立为单键或C1-4亚烷基；
n2个R28和R29各自独立为氢原子或C1-4烷基；
n2个X5各自独立为单键或C1-4亚烷基；
X4是单键或C1-4亚烷基；以及
R23、R24、R25、R30、R31和R32各自独立为氢原子或C1-4烷基，
条件是，R26和R27且/或R28和R29不同时是氢原子，且当n1+n2是2时，R23、R24和R25中的2者以上各自独立为C1-4烷基，或者R30、R31和R32中的2者以上各自独立为C1-4烷基。
作为式(D)的基团，更优选以下基团：其中，
n1是1～5的整数；
n2是1～5的整数；
n1个R26和R27各自独立为氢原子、甲基或乙基；
n1个X3各自独立为单键、亚甲基或亚乙基；
n2个R28和R29各自独立为氢原子、甲基或乙基；
n2个X5各自独立为单键、亚甲基或亚乙基；
X4是单键、亚甲基或亚乙基；以及
R23、R24、R25、R30、R31和R32各自独立为氢原子或C1-4烷基，
条件是，R26和R27且/或R28和R29不同时是氢原子，且当n1+n2是2时，R23、R24和R25中的2者以上各自独立为C1-4烷基，或者R30、R31和R32中的2者以上各自独立为C1-4烷基。
作为式(D)的特别优选基团，可提及以下基团：其中，
n1是1～5的整数；
n2是1～5的整数；
n1个R26和R27各自独立为氢原子或甲基；
n1个X3各自独立为单键或亚甲基；
n2个R28和R29各自独立为氢原子或甲基；
n2个X5各自独立为单键或亚甲基；
X4是单键或亚甲基；以及
R23、R24、R25、R30、R31和R32是甲基，
条件是，R26和R27且/或R28和R29不同时是氢原子。
“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”的具体实例包括下列基团。在各基团中，*表示键合位置；在式中，n3是3以上的整数；且可适当设定n4，以使该基团的总碳酸为14以上300以下。
Figure BDA0001701464970000301
“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”的具体的优选实例包括下列基团：
3，7，11，15-四甲基十六烷基(别名：2，3-二氢植基)；
3，7，11-三甲基十二烷基；
2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰基；
3，4，5-三(3’，7’，11’，15’-四甲基十六烷基氧基)苄基；和
3，5-二(3’，7’，11’，15’-四甲基十六烷基氧基)苄基。
锚固物更优选由下式(g-I)表示的基团(下文有时简称为“锚固物(g-I)”)。
**L-Y-Z (g-I)
式中：
**是与被保护的基团的键合位置；
L是单键、或由式(a1)或(a1’)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000302
式中：
*是与Y的键合位置；
**如上所定义；
R1和R2各自独立为C1-22烃基；
L1是任选取代的二价C1-22烃基；
L2是单键、或由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，其中***是与L1的键合位置，****是与C＝O的键合位置，R4是C1-22亚烷基，R3和R5各自独立为氢原子或C1-22烷基，或者R3和R5任选地一起形成环；
Y是单键、氧原子或NR(其中R是氢原子、烷基或芳烷基)；以及
Z是由式(a2)、式(a2’)或式(a2”)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000311
式中：
*表示键合位置；
R6是氢原子，或者当Rb是由下式(a3)表示的基团时，环A或环B的R6任选地与R8一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；
k是1～4的整数；
k个Q各自独立为-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R7各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
环A和环B各自独立地，除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra是氢原子；以及
Rb是氢原子、或由式(a3)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000312
式中：
*表示键合位置；
j是整数0～4的整数；
j个Q各自独立如上所定义；
j个R9各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
R8是氢原子、或者任选地与环A或环B的R6一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；以及
环C除了具有j个QR9以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；或
Ra和Rb一起形成氧代基。
式(a2)、式(a2’)和式(a2”)中的R7以及式(a3)中的R9所具有的碳数10以上的直链脂肪族烃基各自独立地优选选自直链C10-40烷基和直链C10-40烯基，更优选直链C10-40烷基，进一步优选直链C10-30烷基，特别优选直链C12-28烷基，最优选直链C14-26烷基。
式(a2)、式(a2’)和式(a2”)中的R7以及式(a3)中的R9所具有的连接基各自独立地优选为-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-，更优选为-O-。
式(a2)、式(a2’)和式(a2”)中的R7以及式(a3)中的R9的“经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基”优选为直链C10-40烷基、经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的苄基、或经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的环己基甲基。
式(a2)、式(a2’)和式(a2”)中的R7以及式(a3)中的R9的一个实施方案，即“具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下的有机基团”各自独立地优选为具有由上述式(A)表示的二价基团的基团，更优选由上述式(B)～(D)中任一者表示的基团，进一步优选为由上述式(B)表示的基团，特别优选为2，3-二氢植基、3，7，11-三甲基十二烷基、或2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰基。
式(a2)、式(a2’)、式(a2”)和式(a3)中的Q优选为-O-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-，更优选为-O-。
式(g-I)中，由式(a1)表示的L的优选实施方案是以下基团：其中，
L1是二价C1-22烃基或CH2-O-1，4-亚苯基-O-CH2；以及
L2是单键、或由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，其中***是与L1的键合位置，****是与C＝O的键合位置，R4是C1-6亚烷基，R3和R5各自独立为氢原子或任选取代的C1-6烷基，或者R3和R5任选地一起形成任选取代的C1-6亚烷基。
由式(a1)表示的L的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
L1是二价C1-22烃基；以及
L2是单键。
由式(a1)表示的L的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
L1是亚乙基；以及
L2是由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，其中***是与L1的键合位置，****是与C＝O的键合位置，R4是C1-22亚烷基，R3和R5各自独立为氢原子或C1-22烷基，或者R3和R5任选地一起形成环。
由式(a1)表示的L的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
L1是亚乙基；以及
L2是由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，其中***是与L1的键合位置，****是与C＝O的键合位置，且N(R3)-R4-N(R5)部分形成1，4-哌嗪二基。
由式(a1)表示的L的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
L1是亚乙基；以及
L2是由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，其中***是与L1的键合位置，****是与C＝O的键合位置，R4是亚戊基或亚己基，且R3和R5各自独立为氢原子或甲基。
由式(a1)表示的L的特别优选实施方案是琥珀酰基，其容易获得且是经济的。
以下对式(g-I)中由式(a1’)表示的L进行说明。
式(a1’)中的L1优选为二价C6-10芳族烃基，更优选为亚苯基。
式(a1’)中的L2优选为单键。
式(a1’)中的L1和L2的优选组合是，L1为二价C6-10芳族烃基与L2为单键的组合。式(a1’)中的L1和L2的更优选组合是，L1为亚苯基与L2为单键的组合。
式(a1’)中的R1和R2各自独立地优选为C1-22烷基，更优选为C1-10烷基。
由式(a1’)表示的L的优选实施方案是以下基团：其中，
R1和R2各自独立为C1-22烷基；
L1是二价C6-10芳族烃基；以及
L2是单键。
由式(a1’)表示的L的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
R1和R2各自独立为C1-10烷基；
L1是亚苯基；以及
L2是单键。
当式(g-I)中的Y是NR时，上述R优选为氢原子、C1-6烷基或C7-16芳烷基，更优选为氢原子、甲基、乙基或苄基，进一步优选为氢原子。Y优选为单键、氧原子或NR，更优选为单键或氧原子。
式(g-I)中的Z优选为由式(a2)或式(a2”)表示的基团，更优选为由式(a2”)表示的基团。相比于具有由式(a2)表示的Z(即苄基的结构)的锚固物，使用具有由式(a2”)表示的的Z(即环己基甲基的结构)的锚固物，可显著改进核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)等在非极性溶剂中的溶解性。因此，可在更高浓度下实施本发明的制备方法，并且显著改进生产率。
式(a2)中，R6优选为氢原子。式(a2)中，Ra和Rb各自优选为氢原子，或者一起形成氧代基。
对于固液分离而言，由式(a2)表示的Z的优选实施方案是以下基团：其中，
Ra和Rb是氢原子；
R6是氢原子；
k是1～3的整数；
k个Q是-O-；以及
k个R7各自独立为直链C10-40烷基。
对于固液分离而言，由式(a2)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra和Rb是氢原子；
R6是氢原子；
k是1～3的整数；
k个Q是-O-；以及
k个R7各自独立为经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的苄基，或者经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的环己基甲基；以及
环A除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。
对于固液分离而言，由式(a2)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra是氢原子；以及
Rb是由式(a3)表示的基团，其中*表示键合位置，j是0～3的整数，j个Q是-O-，j个R9各自独立为直链C10-40烷基，R6和R8各自为氢原子。
对于固液分离而言，由式(a2)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra是氢原子；以及
Rb是由式(a3)表示的基团，其中*表示键合位置，j是0～3的整数，j个Q是-O-，j个R9各自独立为直链C10-40烷基，R8与R6一起表示单键或-O-，以与环A和环C一起形成稠环。
对于固液分离而言，由式(a2)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra和Rb一起形成氧代基；
R6是氢原子；
k是1～3的整数；
k个Q是-O-；以及
k个R7各自独立为直链C10-40烷基。
对于固液分离而言，由式(a2)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra和Rb一起形成氧代基；
R6是氢原子；
k是1～3的整数；
k个Q是-O-；以及
k个R7各自独立为经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的苄基，或者经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的环己基甲基；以及
环A除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。
式(a2”)中，R6优选为氢原子。式(a2”)中，Ra和Rb各自优选为氢原子，或者一起形成氧代基。
对于固液分离而言，由式(a2”)表示的Z的优选实施方案是以下基团：其中，
Ra和Rb是氢原子；
R6是氢原子；
k是1～3的整数；
k个Q是-O-；以及
k个R7各自独立为直链C10-40烷基。
对于固液分离而言，由式(a2”)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra和Rb是氢原子；
R6是氢原子；
k是1～3的整数；
k个Q是-O-；以及
k个R7各自独立为经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的苄基，或者经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的环己基甲基；以及
环B除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。
对于固液分离而言，由式(a2”)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra是氢原子；
Rb是由式(a3)表示的基团，其中*表示键合位置，j是0～3的整数，j个Q是-O-，j个R9各自独立为C10-40烷基，且R6和R8是氢原子。
对于固液分离而言，由式(a2”)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra是氢原子；
Rb是由式(a3)表示的基团，其中*表示键合位置，j是0～3的整数，j个Q是-O-，j个R9各自独立为直链C10-40烷基，R8与R6一起表示单键或-O-，以与环B和环C一起形成稠环。
对于固液分离而言，由式(a2”)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra和Rb一起形成氧代基；
R6是氢原子；
k是1～3的整数；
k个Q是-O-；以及
k个R7各自独立为直链C10-40烷基。
对于固液分离而言，由式(a2”)表示的Z的另一种优选实施方案是以下基团：其中，
Ra和Rb一起形成氧代基；
R6是氢原子；
k是1～3的整数；
k个Q是-O-；以及
k个R7各自独立为经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的苄基，或者经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的环己基甲基；以及
环B除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基。
对于固液分离而言，合适的锚固物(g-I)优选是以下基团：其中，
L是琥珀酰基、或由式(a1’)表示的基团(式(a1’)中，R1和R2各自独立为C1-10烷基，L1是二价亚苯基，L2是单键)，以及
Y-Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基、3，5-双(二十二烷氧基)苄氧基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3，4，5-三(十八烷氧基)苄基氨基、2，4-双(二十二烷氧基)苄基氨基、3，5-双(二十二烷氧基)苄基氨基、双(4-二十二烷氧基苯基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]苄基氨基、2，4-双(十二烷氧基)苄基氨基、苯基(2，3，4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)苯基]甲基氨基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2，4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、双(4-二十二烷氧基环己基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2，4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、苯基(2，3，4-三(十八烷氧基)环己基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)环己基]甲基氨基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基或3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基，或者
以下基团：其中，
L-Y是单键或琥珀酰基-1，4-哌嗪二基，以及
Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苯甲酰基、3，5-双(二十二烷氧基)苯甲酰基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基、或3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基。
对于固液分离而言，合适的锚固物(g-I)更优选是以下基团：其中，
L是琥珀酰基，以及
Y-Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基、3，5-双(二十二烷氧基)苄氧基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄氧基、3，4，5-三(十八烷氧基)苄基氨基、2，4-双(二十二烷氧基)苄基氨基、3，5-双(二十二烷氧基)苄基氨基、双(4-二十二烷氧基苯基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]苄基氨基、2，4-双(十二烷氧基)苄基氨基、苯基(2，3，4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)苯基]甲基氨基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苄基氨基、3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2，4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、双(4-二十二烷氧基环己基)甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2，4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、苯基(2，3，4-三(十八烷氧基)环己基)甲基氨基、双[4-(12-二十二烷氧基十二烷氧基)环己基]甲基氨基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、或3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基，或者
以下基团：其中，
L-Y是单键或琥珀酰基-1，4-哌嗪二基，以及
Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苯甲酰基、3，5-双(二十二烷氧基)苯甲酰基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基、或3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)苄氧基]苯甲酰基。
对于固液分离而言，合适的锚固物(g-I)进一步优选是以下基团：其中，
L是琥珀酰基，以及
Y-Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基、3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2，4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2，4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、或3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基，或者
以下基团：其中，
L-Y是单键或琥珀酰基-1，4-哌嗪二基，以及
Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苯甲酰基。
对于固液分离而言，合适的锚固物(g-I)特别优选是以下基团：其中，
L是琥珀酰基，以及
Y-Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基、3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、或苯基(2，3，4-三(十八烷氧基)苯基)甲基氨基，或者
以下基团：其中，
L-Y是琥珀酰基-1，4-哌嗪二基，以及
Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苯甲酰基。
对于固液分离而言，合适的锚固物(g-I)最优选是以下基团：其中，
L是琥珀酰基，以及
Y-Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基、或3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基，或者
以下基团：其中，
L-Y是琥珀酰基-1，4-哌嗪二基，以及
Z是3，4，5-三(十八烷氧基)苯甲酰基。
对于萃取而言，合适的锚固物(g-I)优选是2-{2，4-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基；3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄氧基琥珀酰基；4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄氧基琥珀酰基；2-{1-[(2-氯-5-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基)]苄基氨基羰基}乙基羰基；3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄氧基琥珀酰基；2-{3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基；2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基；2-{2-[3’，4’，5’-三(2”，3”-二氢植基氧基)苄氧基]-4-甲氧基苄基氨基羰基}乙基羰基；2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲氧基苄基氨基羰基}乙基羰基；4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄氧基琥珀酰基；2-{4-(2’，3’-二氢植基氧基)-2-甲基苄基氨基羰基}乙基羰基；4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰基氨基]苄氧基琥珀酰基；2-{4-[2，2，4，8，10，10-六甲基-5-十二烷酰基氨基]苄基氨基羰基}乙基羰基；4-(3，7，11-三甲基十二烷氧基)苄氧基琥珀酰基；2-{4-(3，7，11-三甲基十二烷氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基；2-{3，5-二(2’，3’-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基；2-{1-[2，3，4-三(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]苄基氨基羰基}乙基羰基；2-{1-[4-(2’，3’-二氢植基氧基)苯基]-4’-(2’，3’-二氢植基氧基)苄基氨基羰基}乙基羰基；3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄氧基琥珀酰基；或2-{3，4，5-三[3，4，5-三(2’，3’-二氢植基氧基)苄基]苄基氨基羰基}乙基羰基。
用于形成锚固物的由式Z-Y-H表示的醇化合物或胺化合物可通过例如下列步骤或与其类似的步骤来制备。
Figure BDA0001701464970000401
其中Q’是-O-、-S-、-C(＝O)O-或-NH-，Rg是氢原子、ORh基团(其中Rh是例如C1-6烷基等烷基、例如苄基等芳烷基)或由式(a3)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000402
式中各符号如上所定义，
Y1是离去基团，例如卤素原子等，且其它符号如上所定义。
步骤(a)
在该步骤中，将R7引入由式(IV)表示的化合物(下文简称为化合物(IV))的Q’H(其中Q’是-O-、-S-、-C(＝O)O-或-NH-)，来制备由式(IVa)表示的化合物(下文简称为化合物(IVa))。当Q’是-O-、-S-或-NH-时，在不影响反应的溶剂中，在存在或不存在碱的条件下，使用对应于R7的卤化物(氯化物、溴化物或碘化物)、对应于R7的羧酸或酰基卤或者对应于R7的烷基磺酰氧基化物(alkylsulfonyloxylationproduct)(例如甲磺酰氧基化物等)或芳基磺酰氧基化物(例如对甲苯磺酰氧基化物等)来实施该反应。当Q’是-O-时，在三苯基膦和偶氮二甲酸二异丙酯的存在下，在使化合物(IV)与对应于R7的氢氧化物反应的光延(Mitsunobu)反应条件下，也可实施该反应。此外，当Q’是-C(＝O)O-时，例如可在下述缩合剂的存在下，通过使化合物(IV)与对应于R7的胺或氢氧化物反应来合成化合物(IVa)。
碱的实例包括碱金属盐，例如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、氢化钠、氢化钾、叔丁醇钾等；胺类，例如吡啶、三乙胺、N，N-二甲基苯胺、1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯等；等等，其中优选碳酸钠、碳酸钾、氢化钠等。
溶剂的实例包括芳族烃类，例如甲苯、二甲苯等；醚类，例如四氢呋喃、二氧六环等；酰胺类，例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺等；卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷等；腈类，例如乙腈等；N-甲基吡咯烷酮等或它们的混合物。其中，优选二甲基甲酰胺、四氢呋喃、甲苯、N-甲基吡咯烷酮等。
反应温度优选为50～150℃，更优选60～130℃。反应时间优选为2～30hr，更优选3～10hr。
步骤(b)
在该步骤中，使化合物(IVa)还原，以制备由式(I-a)表示的化合物(下文简称为化合物(I-a))。可通过使用还原剂的方法来实施该还原反应。
用于该还原反应的还原剂的实例包括金属氢化物(硼氢化钠、硼氢化锂、氰基硼氢化钠、三乙酰氧基硼氢化钠、二丁基氢化铝、氢化铝、氢化铝锂等)等，其中优选硼氢化钠、二丁基氢化铝等。
在不影响反应的溶剂中实施该反应。溶剂的实例包括醇类，例如甲醇、乙醇等；醚类，例如二乙醚、四氢呋喃、二氧六环等；芳族烃类，例如甲苯、二甲苯等；或它们的混合物，其中优选四氢呋喃、甲苯等。反应温度优选为0～100℃，更优选30～70℃。反应时间优选为1～24hr，更优选2～5hr。
步骤(c)
在该步骤中，以与上述步骤(b)中相同的方法使化合物(IVa)(式(IVa)中，Rg不是氢原子或ORh基团)还原。
步骤(d-1)
在该步骤中，使化合物(IVa)(式(IVa)中，Rg是氢原子)肟化，以制备由式(I’-a)表示的化合物(下文简称为化合物(I’-a))。
通过在不影响反应的溶剂中，在碱的存在下，使化合物(IVa)与羟基胺的酸加成盐反应来实施该肟化反应。
羟基胺的酸加成盐的实例包括无机酸盐，例如盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐等；有机酸盐，例如乙酸盐、三氟乙酸盐、甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等；等等，且特别优选盐酸盐。
此类碱的实例包括碱金属盐，例如氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸钾等；有机胺类，例如吡啶、三乙胺、二异丙基乙胺、N，N-二甲基苯胺、1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯等；等等，其中优选三乙胺、二异丙基乙胺等。
溶剂的实例包括卤系溶剂，例如氯仿、二氯甲烷等；芳族烃类，例如甲苯、二甲苯等；醚类，例如四氢呋喃、二氧六环等；和/或它们的混合物，其中优选二氯甲烷、氯仿、甲苯等。反应温度优选为10～100℃，更优选20～60℃。反应时间优选为0.5～30hr，更优选2～20hr。
步骤(d-2)
在该步骤中，通过在诸如钯碳、雷尼镍等金属催化剂存在下的催化加氢反应、或与上述步骤(b)中同样的还原剂(例如金属氢化物等)将化合物(I’-a)还原，以制备由式(I-b)表示的化合物(下文简称为化合物(I-b))。
还可经由步骤(d-3)、步骤(d-4)和步骤(d-5)以制备化合物(I-b)。
步骤(d-3)
在该步骤中，使用例如氯化剂(例如乙酰氯、亚硫酰氯等)或溴化剂(例如乙酰溴、三溴化磷、二苯基膦/溴等)将化合物(I-a)卤化，以制备由式(I’-b)表示的化合物(下文简称为化合物(I’-b))。
溶剂的实例包括卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷等；芳族烃类，例如甲苯、二甲苯等；醚类，例如四氢呋喃、二氧六环等；它们的混合物；其中优选氯仿、四氢呋喃、甲苯等。反应温度优选为10～150℃，更优选30～80℃。反应时间优选为0.5～30hr，更优选2～20hr。
步骤(d-4)
在该步骤中，使用叠氮化试剂(例如叠氮化钠等)使化合物(I’-b)叠氮化，以制备由式(I’-c)表示的化合物(下文简称为化合物(I’-c))。通过在不影响反应的溶剂中使化合物(I’-b)与叠氮化试剂反应来实施该反应。
溶剂的实例包括卤代烃类，例如氯仿、二氯甲烷等；芳族烃类，例如甲苯、二甲苯等；醚类，例如四氢呋喃、二氧六环等；酰胺类，例如N，N-二甲基甲酰胺等；它们的混合物，其中优选氯仿、N，N-二甲基甲酰胺等。反应温度优选为10～150℃，更优选20～100℃。反应时间优选为0.5～30hr，更优选2～20hr。
步骤(d-5)
在该步骤中，使化合物(I’-c)胺化，以制备化合物(I-b)。通过在不影响反应的溶剂中，在水的存在下，使化合物(I’-c)与三苯基膦反应，或者通过催化加氢还原来实施该反应。
相对于化合物(I’-c)1摩尔，三苯基膦的使用量优选为1～10摩尔，特别优选1～5摩尔。相对于化合物(I’-c)1摩尔，水的使用量优选为1～10摩尔，特别优选1～5摩尔。
溶剂的实例包括芳族烃类，例如甲苯、二甲苯等；醚类，例如四氢呋喃、二氧六环等；及它们的混合物，其中优选甲苯、四氢呋喃等。反应温度优选为10～150℃，更优选20～100℃。反应时间优选为0.5～30hr，更优选2～20hr。
步骤(d-6)
在该步骤中，使化合物(I’-b)与RNH2(R如上所定义)反应，以制备由式(I-c)表示的化合物，其中Y是-NHR基团(下文简称为化合物(I-c))。在该步骤中，在不影响反应的溶剂中，必要时在诸如叔胺(三乙胺、二异丙基乙胺等)等碱的存在下，使化合物(I’-b)与由R-NH2表示的胺反应。
溶剂的实例包括芳族烃类，例如甲苯、二甲苯等；醚类，例如四氢呋喃、二氧六环等；以及卤系溶剂，例如氯仿、二氯甲烷等，或它们的混合物，其中优选甲苯、四氢呋喃、氯仿等。反应温度优选为10～100℃，更优选20～60℃。反应时间优选为0.5～30hr，更优选2～20hr。
步骤(d-7)
在该步骤中，使化合物(I-d)与具有-CONH2基团或-OCONH2基团的化合物反应，然后用碱处理，以制备化合物(I-e)。在不影响反应的溶剂中，使用酸催化剂来实施化合物(I-d)与具有-CONH2基团或-OCONH2基团的化合物的反应。
酸催化剂的实例包括甲磺酸、三氟甲磺酸、甲苯磺酸等，其中优选甲磺酸或甲苯磺酸。相对于化合物(I-d)1摩尔，酸催化剂的使用量优选为0.05～0.5摩尔，特别优选0.1～0.3摩尔。
具有-CONH2基团或-OCONH2基团的化合物的实例包括Fmoc-NH2、HCONH2、CF3CONH2、AcNH2、EtOCONH2、Cbz-NH2等，其中优选Fmoc-NH2、EtOCONH2等。这里，“Fmoc-”是指9-芴甲氧羰基(下文也称作Fmoc基团)，且“Cbz-”是指苄氧基羰基(下文也称作Cbz基团)。
作为用作步骤(a)的材料的试剂[即，对应于R7的氢氧化物、卤化物、烷基磺酰氧基化物(例如甲磺酰氧基化物等)或芳基磺酰氧基化物(例如对甲苯磺酰氧基化物等)，下文简称为“步骤(a)的试剂”]，可使用市售品。步骤(a)的试剂例如可通过以下方式来制备：
(1)对应于R7的氢氧化物的卤化、烷基磺酰氧基化或芳基磺酰氧基化，或者
(2)对应于R7的不饱和氢氧化物的还原反应(例如在诸如铂碳(Pt/C)、钯碳(Pd/C)、铑碳(Rh/C)、雷尼镍等的金属催化剂的存在下的催化加氢反应)，以及随后的卤化、烷基磺酰氧基化或芳基磺酰氧基化。
在步骤(a)的试剂的制备中，从羟基向离去基团的转换中所用的试剂的实例包括卤化剂，例如氯化剂(亚硫酰氯、N-氯代琥珀酰亚胺(NCS)等)、溴化剂(氢溴酸、乙酰基溴、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、三溴化磷、二苯基膦/溴等)等，此外还包括烷基磺酰化剂，例如甲磺酰氯、三氟甲磺酰氯等；芳基磺酰化剂，例如苯磺酰氯、对甲苯磺酰氯等，其中优选作为卤化剂的亚硫酰氯、氢溴酸等。
在不影响反应的溶剂中实施该反应。溶剂的实例包括水；卤化烃类，例如氯仿、二氯甲烷等；芳族烃类，例如苯、甲苯、二甲苯等；腈类，例如乙腈、丙腈等；醚类，例如四氢呋喃、1，4-二氧六环、二乙醚等，其中优选水；卤化烃类，例如氯仿等。反应温度优选为10～120℃，更优选50～100℃。反应时间优选为1～72hr，更优选3～24hr。
还可通过例如下列方法来制备由Z-Y-H表示的上述化合物，其中Q’是单键。即，可通过以下方式来实施苯环上R7的引入：
(1)使用对应于R7的卤化物(氯化物、溴化物或碘化物)、对应于R7的羧酸或酰基卤的弗里德尔-克拉夫茨(Friedel-Crafts)反应，
(2)通过维蒂希(Wittig)反应使对应于上述化合物(IV)的化合物(其中Q’H基团被-CHO基团置换的化合物)进行增碳后，进行催化加氢等的方法，或者
(3)常规的有机合成反应，例如使用金属催化剂的交叉偶联等。
上述各方案中，由R7表示的有机基团的碳数、卤素原子的种类、反应试剂等是为了方便而表示的，可在上述定义的范围内适当变化。
本步骤中使用的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)的实例包括由下式(a-I)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)。
Figure BDA0001701464970000451
式中：
m是0以上的整数；
m+1个碱基各自独立为任选被保护的核酸碱基；
m+1个X各自独立为氢原子、卤素原子、任选被保护的羟基、或与2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团；
m+1个Xn1各自独立为氧原子或NH；
m个R10各自独立为氧原子或硫原子；
m个Rp1各自独立为磷酸基团的保护基；
L、Y和Z如上所定义。
下文中，由式(a-I)表示的化合物有时简称为“化合物(a-I)”。由其它式表示的化合物有时也同样进行简称。
核酸碱基的氨基优选被保护基保护。作为该保护基，优选乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、以及＝NC(R11)-N(R12)(R13)基团，其中R11是甲基，R12和R13各自独立为C1-5烷基，或者R11与R12任选地连同与它们所键合的碳原子和氮原子一起形成5元或6元含氮烃环。上述＝NC(R11)-N(R12)(R13)基团的实例包括1-(二甲基氨基)亚乙基。当化合物(a-I)具有多个氨基时，氨基的保护基可为仅仅一种或为两种以上。
当m是0时，化合物(a-I)是核苷，且当m是1以上时，化合物(a-I)是寡核苷酸。m优选为49以下，更优选29以下，进一步优选19以下，特别优选4以下，且最优选2以下。
作为针对X的卤素原子，优选氟原子或氯原子，且更优选氟原子。
针对X的任选被保护的羟基的保护基没有特别限制，可提及例如描述于PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS(第3版)JOHN WILLY&SONS(1999)等中的任意的保护基。具体地，可提及甲基、苄基、对甲氧基苄基、叔丁基、甲氧基甲基、甲氧基乙基、2-四氢吡喃、乙氧基乙基、氰基乙基、氰基乙氧基甲基、苯基氨基甲酰基、1，1-二氧代硫代吗啉-4-硫代氨基甲酰基、乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、三甲硅基(三甲基甲硅烷基)、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(Tom)基团、1-(4-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)基团等。任选被保护的羟基的保护基优选为三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基，从经济性和易得性方面考虑，特别优选叔丁基二甲基甲硅烷基。
针对X的“与2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团”没有特别限制，只要它与核苷的2位碳原子和4位碳原子键合即可。该二价有机基团的实例包括任选取代的C2-7亚烷基，以及任选取代的C1-7亚烷基和二价连接基构成的二价有机基团，所述二价连接基选自-O-、-NR33-(R33是氢原子或C1-6烷基)、-S-、-CO-、-COO-、-OCONR34-(R34是氢原子或C1-6烷基)和-CONR35-(R35是氢原子或C1-6烷基)等。C1-7亚烷基和C2-7亚烷基任选具有的取代基的实例包括亚甲基(CH2＝)。
作为“与2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团”，优选任选取代的C2-7亚烷基、-ORi-(Ri是与4位碳原子键合的C1-6亚烷基)、-O-NR33-Rj-(Rj是与4位碳原子键合的C1-6亚烷基，R33如上所定义)、-O-Rk-O-R1-(Rk是C1-6亚烷基，Rl是与4位碳原子键合并交联的C1-6亚烷基)，更优选-ORi-(Ri如上所定义)、-O-NR33-Rj-(Rj和R33如上所定义)、-O-Rk-O-R1-(Rk和R1如上所定义)。针对Ri、Rj、Rk和Rl的C1-6亚烷基各自独立优选为亚甲基或亚乙基。
作为“与2位碳原子和4位碳原子键合的二价有机基团”，更优选-O-CH2-、-O-CH2-CH2-、-O-NR33-CH2-(R33如上所定义)、-O-CH2-O-CH2-，进一步优选-O-CH2-、-O-CH2-CH2-、-O-NH-CH2-、-O-N(CH3)-CH2-、-O-CH2-O-CH2-(其各自的左侧与2位碳原子键合且右侧与4位碳原子键合)。
m+1个X各自独立优选为氢原子、卤素原子或任选被保护的羟基，更优选氢原子或任选被保护的羟基。
针对Rp1的磷酸基团的保护基没有特别限制，只要它在碱性条件下可除去，且可用作磷酸基团的保护基即可。优选由-CH2CH2WG(WG是吸电子基团)表示的基团。
针对WG的吸电子基团的实例包括氰基、硝基等，优选为氰基。
m个Rp1各自独立优选为由-CH2CH2WG表示的基团。
m+1个Xn1优选为氧原子。
L、Y和Z的说明如上所述。
化合物(a-I)优选为由下式(a-i)表示的化合物(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000471
可通过本身已知的方法或与其类似的方法来制备化合物(a-I)。例如，其中m是0、Xn1是氧原子、L是琥珀酰基的化合物(a-I)可通过例如如下式中的方式来制备：首先在碱的存在下使5’位羟基被临时保护基Q”保护的核苷(i)与琥珀酸酐反应，合成核苷(ii)，然后在缩合剂的存在下，使所获得的核苷(ii)与化合物Z-Y-H缩合，以合成3’位和5’位羟基被保护的核苷，然后用酸除去临时保护基Q”。
Figure BDA0001701464970000472
在对反应惰性的溶剂中实施从核苷(i)到核苷(ii)的转化反应是有利的。此类溶剂没有特别限制，只要反应进展即可，且优选卤系溶剂，例如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等；芳族系溶剂，例如苯、甲苯、二甲苯等；或脂肪族系溶剂，例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷等；或醚系溶剂，例如二乙醚、四氢呋喃、环戊基甲基醚等，及其混合溶剂。其中，特别优选二氯甲烷或氯仿。
虽然核苷(ii)的合成中所使用的碱没有特别限制，但是优选有机碱，且更优选三乙胺。
在对反应惰性的溶剂中实施用于合成核苷(iii)的缩合反应是有利的。此类溶剂没有特别限制，只要反应进展即可，且优选卤系溶剂，例如二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、氯仿、四氯化碳等；芳族系溶剂，例如苯、甲苯、二甲苯等；脂肪族系溶剂，例如戊烷、己烷、庚烷、辛烷等；以及这些溶剂的组合。其中，特别优选二氯甲烷和氯仿。
作为核苷(ii)与Z-Y-H的缩合反应中所使用的缩合剂，可提及二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、N-乙基-N’-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺及其盐酸盐(EDC·HCl)、六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基鏻(PyBop)、O-(苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓-3-氧化物六氟磷酸盐(HCTU)、O-苯并三唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)等。其中，优选HBTU、HCTU、N-乙基-N’-3-二甲基氨基丙基碳二亚胺及其盐酸盐(EDC·HCl)。
相对于核苷(ii)1摩尔，缩合剂的使用量例如为1～10摩尔，优选1～5摩尔。相对于核苷(ii)1摩尔，Z-Y-H的使用量例如为1～10摩尔，优选1～5摩尔。反应温度没有特别限制，只要反应进展即可，优选为-10℃～50℃，更优选为0℃～30℃。反应时间例如为30min～70hr。
可以与本发明的步骤(4)同样操作来实施从核苷(iii)除去临时保护基Q(脱保护)。
对于L为琥珀酰基以外的化合物(a-I)，还可通过使用相应的酸酐、相应的二羧酸卤化物(dicarboxylic acidhalide)、相应的二羧酸的活性酯等代替上述合成方法中的琥珀酸酐，实施同样的反应来合成。对于Xn1是NH的化合物(a-I)，可通过使用其中3’位羟基是氨基的核苷代替上述合成方法中的核苷(i)，实施同样的反应来合成。对于m是1以上的化合物(a-I)，可通过使用其中m是0的化合物(a-I)作为原料并重复5’-末端延伸过程来合成。
在化合物(a-i)中，优选由式(a-II)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)。
Figure BDA0001701464970000491
式中：
m、m个碱基、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义；
R11是甲基；R12和R13各自独立为C1-5烷基；或者R11和R12任选地连同与它们所键合的碳原子和氮原子一起形成5元或6元含氮烃环。
在式(a-II)中，优选地，m个Rp1各自独立为由-CH2CH2WG表示的基团。
在式(a-II)中，m优选为0。即，化合物(a-II)中，优选由式(a-III)表示的化合物(即核苷)(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000492
式(a-II)和式(a-III)中，R11优选为甲基，R12和R13各自独立优选为C1-5烷基，且R11、R12和R13更优选为甲基。
式(a-II)和式(a-III)中的其它符号的说明如上所述。
本发明中，当制备其中最初的残基具有腺嘌呤作为核酸碱基的寡核苷酸时，作为原料的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)，通过使用化合物(a-II)(尤其是化合物(a-III))可抑制支化产物(branch product)的生成等。如本文中所使用的，支化产物是指当目标化合物的核酸碱基中的氨基的保护基脱落，且该氨基与单体键合而生成的副产物。
化合物(a-i)中，优选由式(a-IV)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)。
Figure BDA0001701464970000501
式中：
m、m+1个碱基、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L和Y各自独立如上所定义；
Z’是由式(a2”)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000502
式中：
*表示键合位置；
R6是氢原子，或者当Rb是由下式(a3)表示的基团时，其任选地与R8一起表示单键或-O-，以与环B和环C一起形成稠环；
k是1～4的整数；
k个Q各自独立为-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R7各自独立为经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
环B除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra是氢原子；以及
Rb是氢原子、或由式(a3)表示的基团：
Figure BDA0001701464970000511
式中：*表示键合位置；
j是0～4的整数；
j个Q各自独立地如上所定义；
j个R9各自独立地表示经由单键或连接基键合有碳数10以上的直链脂肪族烃基的烃基、或者表示有机基团，该有机基团具有至少一个含有1条以上支链的脂肪族烃基且总碳数为14以上300以下；
R8是氢原子、或者任选地与R6一起表示单键或-O-，以与环B和环C一起形成稠环；以及
环C除了具有j个QR9以外，还任选具有取代基，所述取代基选自：卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；或
Ra与Rb一起形成氧代基。
式(a-IV)中，m个Rp1各自独立优选为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(a-IV)中，m优选为0。
式(a-IV)中的其它符号的说明如上所述。
式(a-IV)中，优选由下式(a-V)表示的化合物(即核苷)(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000512
化合物(a-I)中，相比于锚固物中具有由式(a2)表示的Z(即苄基的结构)的其它化合物(a-I)，锚固物中具有由式(a2”)表示的Z’(即环己基甲基的结构)的化合物(a-IV)(尤其化合物(a-V))在非极性溶剂中显示高溶解性。因此，通过使用化合物(a-IV)(尤其化合物(a-V))，可在更高浓度下实施本发明的制备方法，并且极大改进生产率。由式(a2”)表示的Z’的说明与由上述式(a2”)表示的Z的说明相同。
式(a-IV)和(a-V)中，对于固液分离而言，优选以下组合：其中，
L是琥珀酰基、或由式(a1’)表示的基团(式(a1’)中，R1和R2各自独立为C1-10烷基，L1是二价亚苯基，且L2是单键)，以及
Y-Z’是3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2，4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2，4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、或3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基。
式(a-IV)和(a-V)中，对于固液分离而言，更优选以下组合：其中，
L是琥珀酰基，以及
Y-Z’是3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲基氨基、2，4-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、4-甲氧基-2-[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、2，4-双(十二烷氧基)环己基甲基氨基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基、或3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲基氨基。
式(a-IV)和(a-V)中，对于固液分离而言，进一步优选以下组合：其中，
L是琥珀酰基，以及
Y-Z’是3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双(二十二烷氧基)环己基甲氧基、3，5-双[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基、或3，4，5-三[3’，4’，5’-三(十八烷氧基)环己基甲氧基]环己基甲氧基。
式(a-IV)和(a-V)中，对于固液分离而言，特别优选以下组合：其中，
L是琥珀酰基，以及
Y-Z’是3，4，5-三(十八烷氧基)环己基甲氧基。
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)的实例包括由下式(a-VI)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)。
Figure BDA0001701464970000531
式中：
m+1个碱基1中的至少一个是被-L-Y-Z保护的核酸碱基，其余是任选被保护的核酸碱基；
m个Xn1各自独立为氧原子或NH；
Xn2是被保护的羟基或氨基；
m、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义。
式(a-VI)中，m+1个碱基1中的至少一个是被-L-Y-Z保护的核酸碱基。核酸碱基和-L-Y-Z的说明如上所述。
任选被保护的核酸碱基的说明也如上所述。
被保护的羟基(Xn2)的保护基没有特别限制，且可提及例如描述于PROTECTIVEGROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，第3版，JOHN WILLY&SONS(1999)等中的任意的保护基。具体地，可提及甲基、苄基、对甲氧基苄基、叔丁基、甲氧基乙基、乙氧基乙基、氰基乙基、氰基乙氧基甲基、苯基氨基甲酰基、1，1-二氧代硫代吗啉-4-硫代氨基甲酰基、乙酰基、新戊酰基、苯甲酰基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、[(三异丙基甲硅烷基)氧基]甲基(Tom)基团、1-(4-氯苯基)-4-乙氧基哌啶-4-基(Cpep)基团等。羟基的保护基优选为三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基，从经济性和易得性方面考虑，更优选叔丁基二甲基甲硅烷基。羟基的保护和脱保护是众所周知的，且可通过例如上述PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS中描述的方法来实施。
被保护的氨基(Xn2)的保护基没有特别限制，且可提及例如Greene’s PROTECTIVEGROUPS in ORGANIC SYNTHESIS，第4版，Wiley-Interscience(2006)等中描述的保护基。各保护基的具体实例包括新戊酰基、新戊酰氧基甲基、乙酰基、三氟乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、4-叔丁基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、1-(二甲基氨基)亚乙基和9-芴甲氧羰基。氨基的保护基优选为乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基或1-(二甲基氨基)亚乙基。氨基的保护和脱保护是众所周知的，且可通过例如上述PROTECTIVEGROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS中描述的方法来实施。
式(a-VI)中，m个Xn1优选为氧原子。
式(a-VI)中，Xn2优选为被保护的羟基。
式(a-VI)中，m个Rp1各自独立优选为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(a-VI)中，其它符号的说明如上所述。
化合物(a-VI)优选为由下式(a-vi)表示的化合物。
Figure BDA0001701464970000541
式中：
Rn4是羟基的保护基；
m、m+1个碱基1、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义。
式(a-vi)中的Rn4的说明与针对Xn2中的羟基的保护基的说明相同。
式(a-vi)中的其它符号的说明如上所述。
取代的核苷酸或寡核苷酸(α)的实例包括由下式(a-VII)表示的化合物。
Figure BDA0001701464970000551
式中：
m+1个Xn1各自独立为氧原子或NH；
Ln1是有机基团；
m、m+1个碱基、m+1个X、m+1个R10、m+1个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义。
式(a-VII)中，Ln1优选为C2-6亚烷基，更优选为亚乙基。
式(a-VII)中，m+1个Xn1优选氧原子。
式(a-VII)中，m+1个Rp1各自独立优选为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(a-VII)中的其它符号的说明如上所述。
化合物(a-VII)优选为由下式(a-vii)表示的化合物(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000552
可通过本身已知的方法或与其类似的方法来制备化合物(a-VII)。可例如通过下列步骤来制备其中m是0、Xn1是氧原子、且L是琥珀酰基的化合物(a-VII)。
(i)使化合物Z-Y-H与琥珀酸酐缩合，以制备Z-Y-CO(CH2)2COOH，
(ii)在缩合剂的存在下，使所获得的Z-Y-CO(CH2)2COOH与由式HO-Ln1-OQ”表示的化合物(其中Q”是临时保护基，且Ln1是有机基团)缩合，然后脱保护，以制备Z-Y-CO(CH2)2CO-O-Ln1-OH，
(iii)使所获得的Z-Y-CO(CH2)2CO-O-Ln1-OH与亚磷酰胺化核苷反应，以制备化合物(a-VII)，其中m是0，Xn1是氧原子且L是琥珀酰基。
上述缩合反应和脱保护反应对于本领域普通技术人员而言是众所周知的，且本领域普通技术人员可通过适当设定条件来实施它们。
对于L为琥珀酰基以外的化合物(a-VII)，还可通过使用相应的酸酐、相应的二羧酸卤化物、相应的二羧酸的活性酯等代替琥珀酸酐，实施同样的反应来制备。对于Xn1是NH的化合物(a-VII)，可通过使用3’位氨基被亚磷酰胺化的核苷，实施同样的反应来制备。对于m是1以上的化合物(a-VII)，可通过使用其中m是0的化合物(a-VII)作为原料，重复延伸过程来制备。
本步骤中使用的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)优选为化合物(a-I)、化合物(a-VI)或化合物(a-VII)，更优选化合物(a-i)、化合物(a-vi)或化合物(a-vii)，进而更优选化合物(a-i)或化合物(a-vi)，进一步优选化合物(a-i)，进一步更优选化合物(a-II)或化合物(a-IV)，特别优选化合物(a-III)或化合物(a-V)。
本步骤中使用的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)中，5’位羟基被临时保护基保护。羟基的临时保护基没有特别限制，只要它可在酸性条件下脱保护，并可用作羟基的保护基即可。其实例包括三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基噻吨基、诸如1，1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基(二甲氧基三苯甲基)等双(C1-6烷氧基)三苯甲基、诸如1-(4-甲氧基苯基)-1，1-二苯基甲基(单甲氧基三苯甲基)等单(C1-18烷氧基)三苯甲基等。其中，从脱保护的容易性、获取容易性的观点出发，羟基的临时保护基优选为单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基，更优选二甲氧基三苯甲基。
可根据使亚磷酰胺化试剂反应的已知方法(例如M.H.Caruthers等，Method inEnzymology 1987，154，287-313；S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters1981，22，1859-1862)来合成核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)。亚磷酰胺化试剂为市售的，且还可容易地获得。例如，可在诸如二氯甲烷等卤系溶剂中，通过使具有3’位氨基的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)与2-氰基乙基N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺反应，来合成其中3’位氨基被亚磷酰胺化的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)。
作为核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)的制备方法的一种实施方案，下面说明从具有3’位羟基的亚磷酰胺化的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)(下文有时候简称为“化合物(b)”)制备其中3’位羟基被亚磷酰胺化的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)(下文有时候简称为“亚磷酰胺化的化合物(b)”)的方法。
该制备方法包括如下反应：单选择性地使在三价磷上具有两个氮取代基的亚磷酸化剂前体活化而提供亚磷酸化剂，使用该亚磷酸化剂，在碱的存在下使化合物(b)的3’位羟基亚磷酸化(phosphitylating)。即，该制备方法是亚磷酰胺化的化合物(b)的制备方法，其包括以下步骤(P1)和步骤(P2)。
步骤(P1)：在溶剂中，使活化剂作用于由下式(p1)表示的亚磷酸化剂前体，以制备由下式(p2)表示的亚磷酸化剂，
Figure BDA0001701464970000571
式中：
Xp1是氧原子或硫原子；
Rp2是芳环、羟基的保护基或巯基(thiol group)的保护基；
Rp3和Rp4各自独立为烷基，且该烷基可与邻接的氮原子一起形成环，
Figure BDA0001701464970000572
式中：
Za是源自活化剂的基团；以及
其它符号如上所定义，
步骤(P2)：在溶剂中，在碱的存在下，使步骤(P1)中获得的亚磷酸化剂作用于化合物(b)，以使化合物(b)的3’位羟基亚磷酸化。
步骤(P1)
式(p1)中，作为Rp2的芳环，可提及苯基、4-硝基苯基、2，4-二硝基苯基、五氟苯基、五氯苯基、2-溴苯基、4-溴苯基、2-甲基苯基、2，6-二甲基苯基等，且优选4-硝基苯基。
式(p1)中，Rp2中的羟基的保护基或巯基的保护基的实例包括C1-6烷基(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基)；氰化C1-6烷基(例如2-氰基乙基、2-氰基-1，1-二甲基乙基)；被取代甲硅烷基取代的乙基(例如2-甲基二苯基甲硅烷基乙基、2-三甲基甲硅烷基乙基、2-三苯基甲硅烷基乙基)；卤化C1-6烷基(例如2，2，2-三氯乙基、2，2，2-三溴乙基、2，2，2-三氟乙基)；C2-6烯基(例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-甲基-2-丙烯基、1-甲基-1-丙烯基)；C3-6环烷基(例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基)；氰化C1-6烯基(例如2-氰基丁烯基)；C7-11芳烷基(例如苄基、α-萘基甲基、β-萘基甲基)；以及C6-10芳基(例如苯基、茚基、萘基)，更优选氰化C1-6烷基，特别优选2-氰基乙基。
式(p1)中，Rp3和Rp4各自独立为烷基，该烷基可与邻接的氮原子一起形成环(例如吡咯烷)。Rp3和Rp4各自优选为异丙基。
作为亚磷酸化剂前体，特别优选下列化合物。
Figure BDA0001701464970000581
通过使活化剂作用于亚磷酸化剂前体来获得亚磷酸化剂。
活化剂是能够取代亚磷酰胺上的胺，赋予与羟基等的反应性取代基的酸。具体是pKa为5以上的弱酸性活化剂，更优选是选自pKa为5以上的唑系化合物及其C上取代产物中的至少一种。作为唑系化合物，可提及四唑、三唑、咪唑等，作为C上取代产物，可使用二氰基咪唑、双(三氟甲基)咪唑、二氯咪唑等被卤素原子二取代的化合物。特别优选二氰基咪唑和二氯咪唑。
式(p2)中，Za是源自活化剂的基团，例如通过从活化剂除去一个氢原子所获得的基团。当二氰基咪唑用作活化剂时，Za是二氰基咪唑基，且当二氯咪唑用作活化剂时，Za是二氯咪唑基。
本步骤中使用的溶剂没有特别限制，只要可溶解亚磷酸化剂前体，使活化剂成为难溶性即可，且通常不含酸性或碱性官能团。如本文中所使用的，“难溶性”的基准是溶剂中的活化剂的浓度为6μM以下。具体地，可提及甲苯、苯、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯、乙基苯、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、环戊烷、环己烷、二乙醚、二异丙基醚、叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚、四氯化碳等，优选甲苯和环己烷，特别优选甲苯。
该步骤的反应温度和反应时间没有特别限制，只要基质或产物不析出，且各自通常为40℃以下，优选为0～30℃，更优选为5～15℃，特别优选为10℃左右，通常为0.5～24hr，优选为1～12hr，更优选为1～6hr。
活化剂和亚磷酸化剂前体的使用量没有特别限制，只要亚磷酸化剂前体被活化即可，相对于亚磷酸化剂前体，其通常为过量，优选为1.5～10摩尔当量。通过使过量的活化剂在溶剂中作用于亚磷酸化剂前体，从而使亚磷酸化剂前体活化，且同时使亚磷酸化时的二异丙胺副产物作为与活化剂的盐沉淀。因此，必要时，在步骤(P1)与下述步骤(P2)之间可实施(且优选实施)用于分离诸如沉淀等的不溶性物质的步骤。
步骤(P2)
在该步骤中，在溶剂中，在碱的存在下，使步骤(P1)中获得的亚磷酸化剂作用于化合物(b)，使化合物(b)的3’位羟基亚磷酸化而制备亚磷酰胺化的化合物(b)。
作为在该步骤中使用的溶剂，可使用与步骤(P1)中使用的溶剂同样的那些(例如甲苯)。作为在该步骤中使用的溶剂，可提及例如二氯甲烷、氯仿等。优选甲苯与二氯甲烷的混合溶剂。
作为在该步骤中使用的碱，选择如下碱：具有足以中和通过反应而生成的酸(活化剂)的碱性，且不会引起磷酸上的脱氰基乙基、不形成P-N键。作为此类碱，具体是pKa为5～8的碱，可优选使用三甲基吡啶(collidine)、N-甲基吗啉、二乙基苯胺等。当使用pKa高于8的碱时，脱氰基化变得显著，且当使用pKa低于5的碱时，随着反应的进展而再生的活化剂的捕获变得不充分，且产生副产物。
步骤(P2)中，可添加或不添加亚磷酸化剂前体，但是优选添加。
核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)的实例包括由下式(b-I)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)。
Figure BDA0001701464970000601
式中：
q是0以上的整数；
q+1个碱基2各自独立为任选被选自-L-X-Z和用于核酸合成的保护基中的保护基保护的核酸碱基；
q+1个X、q+1个Rp1、q个R10、L、X和Z各自独立地如上所定义；
q+1个Xn1各自独立为氧原子或NH；
Q”是在酸性条件下可除去的羟基的临时保护基；
R36和R37各自独立地表示烷基、或者表示与邻接的氮原子一起形成的5元或6元饱和环状氨基，该饱和环状氨基中，除了具有氮原子之外，作为环构成原子还任选具有一个氧原子或硫原子。
R36和R37各自独立优选为C1-10烷基、或者为与邻接的氮原子一起形成的5元或6元饱和环状氨基，更优选为C1-10烷基，进一步优选为C1-6烷基。
在酸性条件下可除去的羟基的临时保护基的说明如上所述。Q”优选为单甲氧基三苯甲基或二甲氧基三苯甲基，更优选为二甲氧基三苯甲基。
式(b-I)中的核酸碱基的氨基优选被保护基保护。作为该保护基，可提及选自-L-X-Z和用于核酸合成的保护基中的保护基。L、X和Z的说明如上所述。作为用于核酸合成的保护基，优选乙酰基、苯氧基乙酰基、4-异丙基苯氧基乙酰基、苯甲酰基、异丁酰基、(2-己基)癸酰基、二甲基甲脒基、以及＝NC(R11)-N(R12)(R13)基团，其中R11是甲基，R12和R13各自独立为C1-5烷基，或者R11和R12任选地连同与它们所键合的碳原子和氮原子一起形成5元或6元含氮烃环。上述＝NC(R11)-N(R12)(R13)基团的实例包括1-(二甲基氨基)亚乙基。当化合物(b-I)具有多个氨基时，氨基的保护基可仅仅为一种或为2种以上。
当q是0时，化合物(b-I)是核苷；且当q是1以上时，化合物(b-I)是寡核苷酸。在该步骤中使用的化合物(b-I)中，q优选为49以下，更优选为29以下，进一步优选为19以下，特别优选为4以下，且最优选为2以下。
q+1个X各自独立地优选为氢原子、卤素原子或任选被保护的羟基，更优选为氢原子或任选被保护的羟基。
碱基2各自独立地优选为任选被选自用于核酸合成的保护基中的保护基保护的核酸碱基。
q+1个Rp1各自独立优选为由-CH2CH2WG表示的基团。
q+1个Xn1优选为氧原子。
L、X和Z的说明如上所述。
化合物(b-I)优选为由下式(b-i)表示的化合物。
Figure BDA0001701464970000611
式中：
q+1个碱基3各自独立为任选被用于核酸合成的保护基保护的核酸碱基，
q、q+1个X、q+1个Rp1、q个R10、Q”、R36和R37各自独立地如上所定义。
式(b-i)中，用于核酸合成的保护基、q、q+1个X、q+1个Rp1、q个R10、Q”、R36和R37的说明如上所述。
作为该步骤中使用的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)的组合，
优选化合物(a-I)、化合物(a-VI)或化合物(a-VII)与化合物(b-I)的组合，
更优选化合物(a-i)、化合物(a-vi)或化合物(a-vii)与化合物(b-i)的组合，
仍更优选化合物(a-i)或化合物(a-vi)与化合物(b-i)的组合，
进一步优选化合物(a-i)与化合物(b-i)的组合，
仍进一步优选化合物(a-II)或化合物(a-IV)与化合物(b-i)的组合，
特别优选化合物(a-III)或化合物(a-V)与化合物(b-i)的组合。
当该步骤中缩合反应的进展缓慢时，可添加缩合剂(例如吡啶-三氟乙酸盐、四唑、5-苄基硫代-1H-四唑、4，5-二氰基咪唑等)。
在非极性溶剂中实施该步骤。非极性溶剂的实例包括卤系溶剂，例如氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷等；芳族系溶剂，例如苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯等；酯系溶剂，例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯等；脂肪族系溶剂，例如己烷、戊烷、庚烷、辛烷、壬烷、环己烷等；非极性醚系溶剂，例如二乙醚、环戊基甲基醚、叔丁基甲基醚等。非极性溶剂可使用仅仅一种，或者可组合使用两种以上。作为非极性溶剂，优选卤系溶剂、芳族系溶剂、酯系溶剂、脂肪族系溶剂以及这些的组合；更优选二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、己烷、戊烷、庚烷、壬烷、环己烷、乙酸乙酯、乙酸异丙酯以及这些的组合；且进一步优选氯仿、二氯甲烷、甲苯以及这些的组合。该步骤以及随后步骤中使用的非极性溶剂也同样。
相对于该步骤中的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)的使用量1摩尔，该步骤中的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)的使用量例如为1～10摩尔，优选1～5摩尔。
该步骤中的反应温度没有特别限制，只要反应进展即可，且优选为0℃～100℃，更优选为20℃～50℃。反应时间根据所使用的材料的种类、反应温度等而不同，且例如为5min～24hr。
步骤(2)(亚磷酰胺化的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)的猝灭)
本发明中，在步骤(1)(缩合)之后实施步骤(3)(氧化或硫化)和步骤(4)(脱保护)。因此，为抑制步骤(3)和(4)中的副产物的生成，优选在步骤(3)之前使核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)猝灭。因此，本发明的制备方法优选包含向缩合后的反应液中添加猝灭剂的步骤(2)。
在寡核苷酸的制备方法的领域中，已知的亚磷酰胺化的核苷或寡核苷酸的猝灭剂可用作该步骤中的猝灭剂。猝灭剂可使用仅仅一种，或者可组合使用2种以上。猝灭剂的实例包括醇类、酚类和胺类。
可用作猝灭剂的醇类的实例包括任选卤化的一元醇，例如甲醇、2-丙醇、叔丁醇、2，2，2-三氟乙醇、四氢糠醇、糠醇、2，3-O-亚异丙基-D-呋喃核糖、3’-O-三异丙基甲硅烷基-胸苷等；任选卤化的多元醇，例如乙二醇、二甘醇等。
可用作猝灭剂的酚类的实例包括4-硝基苯酚和五氟苯酚。可用作猝灭剂的胺类的实例包括吗啉。
猝灭剂优选为选自醇类和胺类中的至少一种，更优选选自甲醇、2-丙醇、叔丁醇、2，2，2-三氟乙醇、四氢糠醇和吗啉中的至少一种。在步骤(4)(脱保护)中的脱保护期间，为防止寡核苷酸(e)的核酸碱基中的氨基的保护基的脱落，猝灭剂进一步优选为选自2-丙醇、叔丁醇和2，2-三氟乙醇中的至少一种。
相对于步骤(1)中的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)的使用量1摩尔，该步骤中的猝灭剂的使用量优选为1～20摩尔，更优选为1～10摩尔，进一步优选为1～5摩尔。
添加猝灭剂之后的反应液的温度没有特别限制，只要可使核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)猝灭即可，且优选为5℃～40℃，更优选为15℃～30℃。添加猝灭剂之后的反应液的搅拌时间根据所使用的猝灭剂的种类、温度等而不同，且例如为10min～3hr。
步骤(3)(氧化或硫化)
在该步骤中，使其中5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的亚磷酸三酯产物(c)与氧化剂或硫化剂反应，以将其亚磷酸三酯键转化为磷酸三酯键或硫代磷酸三酯键，以获得其中5’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的寡核苷酸(d)。当使用氧化剂时，可仅仅使用一种，或者可组合使用2种以上。当使用硫化剂时，可仅仅使用一种，或者可组合使用2种以上。
该步骤中使用的氧化剂没有特别限制，只要其具有将亚磷酸三酯键氧化成磷酸三酯键，而不氧化其它部分的能力即可，优选使用选自碘、(1S)-(+)-(10-莰基磺酰基)氧氮杂环丙烷、叔丁基过氧化氢(TBHP)、过氧化甲乙酮、1，1-二氢过氧环十二烷、双(三甲硅基)过氧化物和间氯过氧苯甲酸中的至少一种。
为实现良好的氧化反应，氧化剂优选为选自碘、(1S)-(+)-(10-莰基磺酰基)氧氮杂环丙烷，叔丁基过氧化氢，过氧化甲乙酮和1，1-二氢过氧环十二烷中的至少一种，更优选选自碘、(1S)-(+)-(10-莰基磺酰基)氧氮杂环丙烷、叔丁基过氧化氢和过氧化甲乙酮中的至少一种，进一步优选选自碘和叔丁基过氧化氢中的至少一种，特别优选碘。对于该氧化剂，可通过用合适的溶剂稀释以达到0.05～2M的浓度来使用。此类稀释溶剂没有特别限制，只要其对反应惰性即可，且可提及吡啶、THF、二氯甲烷、水以及这些的组合。其中，优选使用例如碘/水/吡啶-THF或碘/吡啶-乙酸、过氧化剂(TBHP)/二氯甲烷或叔丁基过氧化氢/壬烷。
该步骤中使用的硫化剂没有特别限制，只要其具有将亚磷酸三酯键转化为硫代磷酸三酯键的能力即可，并且优选5-[(N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)、3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物(Beaucage试剂)、3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物(PADS)、二硫化四乙基秋兰姆(TETD)、3-氨基-1，2，4-二噻唑-5-硫酮(ADTT)和硫。
从可使反应良好进展的观点考虑，更优选5-[(N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮、3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物、3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮、和苯乙酰二硫化物，进一步优选5-[(N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮和3H-1，2-苯并二硫醇-3-酮-1，1-二氧化物，且特别优选5-[(N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮。对于该硫化剂，可通过用合适的溶剂稀释以达到0.05～2M的浓度来使用。此类稀释溶剂没有特别限制，只要其对反应惰性即可，并且可提及例如，二氯甲烷、乙腈、吡啶或这些中的任意的混合溶剂。
相对于亚磷酸三酯产物(c)1摩尔，氧化剂或硫化剂的使用量例如为1～50摩尔，优选为1～5摩尔。
反应温度没有特别限制，只要反应进展即可，且优选为0℃～100℃，更优选为20℃～50℃。反应时间根据亚磷酸三酯产物(c)的种类、所使用的氧化剂或硫化剂的种类、反应温度等而不同，且例如为1min～3hr。
本发明人已经发现，在步骤(3)(氧化或硫化)之后不进行固液分离的情况下实施步骤(4)(脱保护)的本发明的制备方法中，当5-[(N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮(DDTT)用作硫化剂时，发生其中在步骤(4)期间DDTT的分解产物附加于5’位羟基的副反应，并阻碍之后的缩合反应。为解决该问题，本发明人已经进行了深入研究并发现，当步骤(3)中使用DDTT时，可通过在步骤(1)之后且步骤(4)之前，向反应液中添加羧酸和有机碱的混合物(中和盐)、无机酸或胺类来抑制上述副反应。上述羧酸、有机碱、无机酸和胺类，各自可使用仅仅一种或者可组合使用2种以上。
上述混合物中的羧酸优选为任选被卤素原子取代的C2-5羧酸，例如乙酸、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、氟乙酸、二氟乙酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、戊酸等，更优选任选被卤素原子取代的乙酸，进一步优选乙酸。
上述混合物中的有机碱优选为选自任选被1～3个C1-3烷基取代的吡啶和任选被1～3个C1-3烷基取代的咪唑中的至少一种，例如吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、咪唑、N-甲基咪唑等，更优选任选被1～3个C1-3烷基取代的吡啶，进一步优选为2，4，6-三甲基吡啶。
上述混合物中，有机碱的量优选与羧酸的量相同或超过羧酸的量。上述混合物中，相对于羧酸所具有的羧基1摩尔，有机碱所具有的碱性氮原子的量更优选为1～5摩尔，进一步优选为1～2摩尔，特别优选为1摩尔。当咪唑用作有机碱时，仅其3位氮原子作为碱性氮原子来计数。
上述混合物的使用量基于该混合物中所含的羧酸的量(即，中和盐的量)来确定。相对于步骤(3)中的DDTT的使用量1摩尔，该羧酸的量优选为1～10摩尔，更优选为1～5摩尔，进一步优选为1～3摩尔。
还可通过添加无机酸来代替上述羧酸和有机碱的混合物(中和盐)，来抑制上述副反应。无机酸的实例包括盐酸、氢氟酸、氢溴酸。其中，优选盐酸和氢氟酸，更优选盐酸。相对于步骤(3)中的DDTT的使用量1摩尔，无机酸的使用量优选为1.0～20摩尔，更优选为1.5～10摩尔，进一步优选为2.0～5.0摩尔。
还可通过添加胺类来代替上述羧酸和有机碱的混合物(中和盐)，来抑制上述副反应。胺类的实例包括苯胺、2-氯苯胺、3-氯苯胺、2，4-二氯苯胺、2-氟苯胺、4-甲氧基苯胺、4-硝基苯胺、2，6-二氯苯胺、2，6-二甲基苯胺。其中，优选2-氯苯胺和2，6-二甲基苯胺，更优选2，6-二甲基苯胺。相对于步骤(3)中的DDTT的使用量1摩尔，胺类的使用量优选为1.0～20摩尔，更优选为1.5～10摩尔，进一步优选为2.0～5.0摩尔。
步骤(4)(脱保护)
在该步骤中，用酸除去寡核苷酸(d)的临时保护基，以获得其中5’位羟基未被保护的寡核苷酸(e)。酸可使用仅仅一种，或者可组合使用2种以上。
该步骤中使用的酸没有特别限制，只要可实现良好的脱保护即可，且优选使用三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸、对甲苯磺酸等。为实现良好的反应，更优选三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸，进一步优选三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸，仍进一步优选三氟乙酸、三氟甲磺酸，特别优选三氟乙酸。可用上述非极性溶剂稀释这些酸。当使用上述酸时，可组合特定的碱，以适当调节酸性度，并使用混合物。相对于寡核苷酸(d)1摩尔，该步骤中酸的使用量例如为1～100摩尔，优选为1～40摩尔。
该步骤中的反应温度没有特别限制，只要反应进展即可，且优选为-10℃～50℃，更优选为0℃～40℃。反应时间根据所使用的寡核苷酸(d)、酸的种类、非极性溶剂的种类、反应温度等而不同，且其为例如5min～5hr。
在该步骤中，优选在寡核苷酸(d)的5’位羟基的临时保护基的除去反应中或除去反应之后使用阳离子捕获剂。即，临时保护基的除去反应优选在阳离子捕获剂的存在下实施，或者在临时保护基的除去反应之后，优选向反应液中添加阳离子捕获剂。阳离子捕获剂可使用仅仅一种，或者可组合使用2种以上。
阳离子捕获剂没有特别限制，只要不会被已除去的临时保护基重新保护(返回到原料)或者不进行针对已脱保护的官能团的副反应。可使用吡咯衍生物，例如吡咯、2-甲基吡咯、3-甲基吡咯、2，3-二甲基吡咯、2，4-二甲基吡咯等；吲哚衍生物，例如吲哚、3-甲基吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5，6-二甲基吲哚、6，7-二甲基吲哚等；呋喃衍生物，例如2-甲基呋喃、2，3-二甲基呋喃、2-甲基-3-(甲硫基)呋喃、薄荷呋喃等。从可获得良好的阳离子捕获效果的观点考虑，优选吡咯、2-甲基吡咯、3-甲基吡咯、2，3-二甲基吡咯、2，4-二甲基吡咯、吲哚、3-甲基吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5，6-二甲基吲哚、6，7-二甲基吲哚、2-甲基呋喃、2，3-二甲基呋喃、2-甲基-3-(甲硫基)呋喃、薄荷呋喃，更优选吡咯、3-甲基吡咯、2，4-二甲基吡咯、吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5，6-二甲基吲哚、6，7-二甲基吲哚，进一步优选吡咯、3-甲基吡咯、吲哚，仍进一步优选吡咯、吲哚，且特别优选吡咯。相对于寡核苷酸(d)1摩尔，该步骤中阳离子捕获剂的使用量例如为1～50摩尔，优选5～20摩尔。
步骤(5)(中和)
步骤(4)(脱保护)之后，为中和步骤(4)中使用的酸，可向反应液中添加碱。然而，本发明的制备方法中，步骤(4)之后，必要时，实施步骤(6)(固液分离或萃取)和洗涤，由此可从寡核苷酸(e)除去步骤(4)中使用的酸。因此，步骤(5)不是必需的。
在该步骤中，碱可使用仅仅一种，或者可组合使用2种以上。作为使用的碱，优选有机碱。作为有机碱，优选吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1，2，4-三唑、N-苯基咪唑、2-氨基-4，6-二甲基嘧啶、1，10-菲咯啉、咪唑、N-甲基咪唑、2-氯苯并咪唑、2-溴苯并咪唑、2-甲基咪唑、2-苯基苯并咪唑、N-苯基苯并咪唑、5-硝基苯并咪唑，更优选吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1，2，4-三唑、N-苯基咪唑、N-甲基咪唑、2-氨基-4，6-二甲基嘧啶、1，10-菲咯啉，进一步优选吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1，2，4-三唑、N-苯基咪唑，特别优选吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1，2，4-三唑，且最优选吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、苯并咪唑。
相对于步骤(4)中酸的使用量1摩尔，该步骤中碱的使用量例如为1～10摩尔，优选为1～3摩尔。
步骤(6)(固液分离或萃取)
在该步骤中，向含有寡核苷酸(e)的反应液中添加极性溶剂，以将寡核苷酸(e)沉淀并纯化(固液分离)，或者向该反应液中添加极性溶剂，以在极性溶剂与非极性溶剂之间分层，将寡核苷酸(e)转移到非极性溶剂层中，并进行纯化(萃取)。固液分离和萃取两者中，极性溶剂可使用仅仅一种，或者可组合使用2种以上。
首先说明固液分离。固液分离中使用的极性溶剂的实例包括醇系溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇等；腈系溶剂，例如乙腈、丙腈等；酮系溶剂，例如丙酮、2-丁酮等；极性醚系溶剂，例如1，4-二氧六环、四氢呋喃等；酰胺系溶剂，例如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基哌啶酮等；亚砜系溶剂，例如二甲基亚砜等；水等，以及这些的混合溶剂。其中，优选腈系溶剂，且更优选乙腈。
为提高寡核苷酸(e)的回收率，相对于反应液中所含有的非极性溶剂1mL，固液分离中的极性溶剂的添加量优选为1～20mL，更优选为1～10mL，进一步优选为1～5mL。
极性溶剂可含有水，以使寡核苷酸(e)在极性溶剂中的损失达到最小。在这种情况下，极性溶剂中的水的含量优选为1～10％(v/v)，更优选为3～8％(v/v)。当水的含量过低时，可能增加寡核苷酸(e)在极性溶剂中的损失，并且当水的含量过高时，极性溶剂中杂质的除去趋于不充分。
为提高寡核苷酸(e)的回收率，还可使用WO2016/117663中描述的沉淀促进剂(例如2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄酯)。
现在说明萃取。虽然萃取操作没有特别限制，但是其优选包括向含有寡核苷酸(e)的反应液中添加极性溶剂，以使极性溶剂与非极性溶剂之间分层，并将寡核苷酸(e)转移到非极性溶剂层中。通过该萃取，可将诸如残留的原料、副产物等的杂质转移到极性溶剂层中并除去。
用于萃取的极性溶剂的实例包括醇系溶剂，例如甲醇、乙醇、异丙醇等；腈系溶剂，例如乙腈、丙腈等；酮系溶剂，例如丙酮、2-丁酮等；极性醚系溶剂，例如1，4-二氧六环、四氢呋喃等；酰胺系溶剂，例如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基哌啶酮等；亚砜系溶剂，例如二甲基亚砜等；水等，以及其2种以上的混合溶剂。其中，优选酰胺系溶剂、腈系溶剂、以及这些的组合，更优选使用乙腈、N，N-二甲基甲酰胺、N-甲基哌啶酮、以及这些的组合。其中，优选腈系溶剂，且更优选乙腈。
用于萃取的极性溶剂可含有水，以改进与非极性溶剂的分层性。在这种情况下，极性溶剂中的水的含量优选为1～10％(v/v)，更优选为3～8％(v/v)。当水的含量过低时，分层性可能改进不多。当水的含量过高时，杂质在极性溶剂中的溶解性下降，并且其除去效率趋于下降。
对于萃取而言，必要时可将非极性溶剂与极性溶剂一起添加至反应液中。非极性溶剂可使用仅仅一种，或者可组合使用2种以上。作为必要时添加的非极性溶剂，可提及卤系溶剂，例如氯仿、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷等；芳族系溶剂，例如苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯等；酯系溶剂，例如乙酸乙酯、乙酸异丙酯等；脂肪族系溶剂，例如己烷、戊烷、庚烷、辛烷、壬烷、环己烷等；非极性醚系溶剂，例如二乙醚、环戊基甲基醚、叔丁基甲基醚等。其中，优选芳族系溶剂、脂肪族系溶剂、或这些的组合，更优选苯、甲苯、己烷、戊烷、庚烷、壬烷、环己烷、或这些的组合等，更优选甲苯、庚烷、壬烷、或这些的组合，进一步优选甲苯、庚烷或这些的组合，且特别优选庚烷。
极性溶剂与非极性溶剂之间分层之后，可通过去除极性溶剂层的操作来除去杂质。可通过以下方式进一步降低杂质的量：除去极性溶剂层之后，向非极性溶剂层中进一步添加极性溶剂，搅拌混合物，以分层，然后实施除去极性溶剂的操作。
相对于非极性溶剂1mL，用于一次萃取操作的极性溶剂的量优选为0.1～10mL，更优选为0.2～5mL，进一步优选为0.2～1mL。
可通过对所获得的非极性溶剂层进行浓缩来分离寡核苷酸(e)。
步骤(7)(脱保护和分离)
本发明的制备方法还可包括以下步骤：在步骤(6)(固液分离或萃取)之后，除去所得的寡核苷酸的全部保护基后，分离未被保护的寡核苷酸。作为脱保护的方法，例如，可根据PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，第3版，JOHN WILLY&SONS(1999)等中描述的脱保护方法来除去寡核苷酸的全部保护基。具体而言，锚固物、以及作为核酸碱基的保护基的苯氧基乙酰基、乙酰基等、以及保护磷酸骨架的氰基乙基等可通过用氨水、氨水/乙醇溶液、或氨水与甲基胺水溶液的混合物进行处理来全部除去。另外，可通过用步骤(4)中所用的酸或此类酸的适当稀释的溶液进行处理来除去5’羟基的保护基。未被保护(即，没有保护基)的寡核苷酸容易被酶降解，因此，优选在空气清洁度控制下分离未被保护的寡核苷酸。
可通过与常规液相有机合成反应同样的方法来确认上述各步骤中的反应进程。即，可通过薄层硅胶色谱、高效液相色谱等来追踪反应。
5’-3’合成
涉及5’-3’合成的本发明制备方法包括下列步骤(1’)、(3’)、(4’)和(6’)。必要时，该制备方法可进一步包括下列步骤(2’)、(5’)和(7’)。
步骤(1’)：在非极性溶剂中，向包含核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)的反应液中添加核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)，使核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)缩合，以获得包含3’位羟基或3’位氨基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的亚磷酸三酯产物(c’)的反应液，
所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)中，3’位羟基或3’位氨基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和5’位羟基、以及脱氧核糖残基的5’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，
所述取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)中，3’位羟基或3’位氨基未被保护，5’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，上述式中Ln1表示有机基团，
所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)中，5’位羟基被亚磷酰胺化，3’位羟基或3’位氨基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护；
步骤(2’)：必要时，向缩合后的反应液中添加猝灭剂；
步骤(3’)：向包含亚磷酸三酯产物(c’)的反应液中添加氧化剂或硫化剂，使亚磷酸三酯产物(c’)氧化或硫化，以获得包含3’位羟基或3’位氨基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的寡核苷酸(d’)的反应液；
步骤(4’)：向氧化或硫化后的反应液中添加酸来除去3’位羟基或3’位氨基的临时保护基，以获得包含3’位羟基或3’位氨基未被保护的寡核苷酸(e’)的反应液；
步骤(5’)：必要时，向包含寡核苷酸(e’)的反应液中添加碱来进行中和；
步骤(6’)：必要时，向包含寡核苷酸(e’)的反应液中添加极性溶剂，获得沉淀的寡核苷酸(e’)；以及
步骤(7’)：必要时，除去所获得的寡核苷酸的全部保护基，并分离未被保护的寡核苷酸。
可通过重复步骤(1’)、(3’)、(4’)和(6’)(优选步骤(1’)～(6’))的循环来延长寡核苷酸链。包括步骤(1’)、(3’)和(4’)的寡核苷酸的制备方法包括在本发明中。
涉及5’-3’合成的本发明制备方法的说明与涉及上述3’-5’合成的本发明制备方法的说明基本相同，除了使用3’位羟基或3’位氨基未被保护的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)、以及5’位羟基被亚磷酰胺化的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)来制备3’位羟基或3’位氨基未被保护的寡核苷酸(e’)。换句话说，步骤(1’)～(7’)、“核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)”、取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)、“核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)”、亚磷酸三酯产物(c’)、寡核苷酸(d’)和寡核苷酸(e’)的说明与上述步骤(1)～(7)、“核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)”、取代的核苷酸或寡核苷酸(α)、“核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)”、亚磷酸三酯产物(c)、寡核苷酸(d)和寡核苷酸(e)的那些说明基本相同，除了3’位羟基或3’位氨基以及5’位羟基的保护等实施方案更换。下面说明5’-3’合成与3’-5’合成的区别。
步骤(1’)(缩合)
该步骤中使用的核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)具有被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的3’位羟基或3’位氨基。羟基的临时保护基的说明与步骤(1)中的说明相同。
氨基的临时保护基的实例包括三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基等。其中，优选三苯甲基和单甲氧基三苯甲基。
在该步骤的优选实施方案中，使用
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)，其中3’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和5’位羟基、以及脱氧核糖残基的5’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，或者
取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)，其中3’位羟基未被保护，5’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，上述式中Ln1表示有机基团；以及
核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)，其中5’位羟基被亚磷酰胺化，3’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护。
在该步骤的更优选实施方案中，使用
取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)，其中3’位羟基未被保护，5’位磷酸基团的一个羟基被-OLn1-OH置换，-OLn1-OH的羟基被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护，上述式中Ln1表示有机基团；以及
核苷或寡核苷酸(b’)，其中5’位羟基被亚磷酰胺化，3’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被选自在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基和用于核酸合成的保护基中的保护基保护。
在该步骤的更优选的另一种实施方案中，使用
核苷或寡核苷酸(a’)，其中3’位羟基未被保护，选自核酸碱基的氨基和亚氨基、核糖残基的2’位羟基和5’位羟基、以及脱氧核糖残基的5’位羟基中的至少一个基团被在酸性条件下不可除去但在碱性条件下可除去的保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护；以及
核苷或寡核苷酸(b’)，其中5’位羟基被亚磷酰胺化，3’位羟基被在酸性条件下可除去的临时保护基保护，且其它基团任选进而被用于核酸合成的保护基保护。
可如步骤(1)中那样来实施核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸α’)所具有的3’位羟基与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)所具有的亚磷酰胺化的5’位羟基的缩合。因此，步骤(1’)中的缩合的说明与步骤(1)中的说明相同，除了“核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)”被“核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)”替换，且“核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)”被“核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)”替换。
还可如步骤(1)中那样来实施核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)所具有的3’位氨基与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)所具有的亚磷酰胺化的5’位羟基的缩合。因此，步骤(1’)中的缩合的说明与步骤(1)中的说明相同，除了“核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)”被“核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)”替换，且“核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)”被“核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)”替换。
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)的实例包括由下式(a-I’)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)。
Figure BDA0001701464970000721
式中：
m、m+1个碱基、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义；
m个Xn1各自独立为氧原子或NH；以及
Xn3是羟基或氨基。
式(a-I’)中，m个Xn1优选为氧原子。
式(a-I’)中，Xn3优选为羟基。
式(a-I’)中，m个Rp1各自独立优选为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(a-I’)中的其它符号的说明如上所述。
化合物(a-I’)优选为由下式(a-i’)表示的化合物(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000722
化合物(a-i’)中，优选由式(a-II’)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000731
式(a-II’)中，m个Rp1优选各自独立为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(a-II’)中，m优选为0。
式(a-II’)中的其它符号的说明如上所述。
化合物(a-II’)中，优选由下式(a-III’)表示的化合物(即，核苷)(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000732
化合物(a-I’)中，优选由下式(a-IV’)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000733
式(a-IV’)中，m个Rp1优选各自独立为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(a-IV’)中，m优选为0。
式(a-IV’)中的其它符号的说明如上所述。
化合物(a-IV’)中，优选由下式(a-V’)表示的化合物(即，核苷)(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000741
核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)的实例包括由下式(a-VI’)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)。
Figure BDA0001701464970000742
式中：
m+1个碱基1中的至少一个是被-L-Y-Z保护的核酸碱基，且其余为任选被保护的核酸碱基；
m个Xn1各自独立为氧原子或NH；
Xn3是羟基或氨基；
Rn4是羟基的保护基；
m、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义。
式(a-VI’)中，m个Xn1优选是氧原子。
式(a-VI’)中，Xn3优选为羟基。
式(a-VI’)中，m个Rp1优选各自独立为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(a-VI’)中，其它符号的说明如上所述。
化合物(a-VI’)优选为由下式(a-vi’)表示的化合物(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000751
取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)的实例包括由下式(a-VII’)表示的化合物。
Figure BDA0001701464970000752
式中：
m+1个Xn1各自独立为氧原子或NH；
Xn3是羟基或氨基；
Ln1是有机基团；
m、m+1个碱基、m+1个X、m+1个R10、m+1个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义。
式(a-VII’)中，Xn3优选为羟基。
式(a-VII’)中，m+1个Rp1优选各自独立为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(a-VII’)中的其它符号的说明如上所述。
化合物(a-VII’)优选为由下式(a-vii’)表示的化合物(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000761
该步骤中使用的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)优选为化合物(a-I’)、化合物(a-VI’)或化合物(a-VII’)，更优选为化合物(a-i’)、化合物(a-vi’)或化合物(a-vii’)，进一步优选为化合物(a-i’)或化合物(a-vii’)，特别优选为化合物(a-vii’)。
核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)的实例包括由下式(b-I’)表示的化合物(即，核苷或寡核苷酸)。
Figure BDA0001701464970000762
式中：
q+1个碱基2各自独立为任选被选自-L-X-Z和用于核酸合成的保护基中的保护基保护的核酸碱基；
q个Xn1各自独立为氧原子或NH；
Xn4是被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的羟基或氨基；
q、q+1个X、q+1个Rp1、q个R10、R36、R37和Q”各自独立地如上所定义。
式(b-I’)中的羟基的临时保护基和氨基的临时保护基的说明如上所述。Xn4优选为被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的羟基。
式(b-I’)中，q+1个Rp1优选各自独立为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(b-I’)中，其它符号的说明如上所述。
化合物(b-I’)优选为由下式(b-i’)表示的化合物(下式中的符号的定义和说明如上所述)。
Figure BDA0001701464970000771
上述化合物(a-I’)～化合物(a-vii’)、化合物(b-I’)和(b-i’)的说明与上述化合物(a-I)～化合物(a-vii)、化合物(b-I)和(b-i)的那些说明基本上相同，除了更换3’位羟基和5’位羟基的保护等的实施方案。
该步骤中使用的核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)的组合是，
优选化合物(a-I’)、化合物(a-VI’)或化合物(a-VII’)与化合物(b-I’)的组合，
更优选化合物(a-i’)、化合物(a-vi’)或化合物(a-vii’)与化合物(b-i’)的组合，
进一步优选化合物(a-i’)或化合物(a-vii’)与化合物(b-i’)的组合，
特别优选化合物(a-vii’)与化合物(b-i’)的组合。
步骤(4’)(脱保护)
在该步骤中，用酸除去寡核苷酸(d’)的3’位羟基或3’位氨基的临时保护基，以获得其中3’位羟基或3’位氨基未被保护的寡核苷酸(e’)。酸可使用仅仅一种，或者可组合使用2种以上。
羟基的临时保护基的除去的说明与步骤(1)中的说明相同。
用来除去氨基的临时保护基的酸没有特别限制，只要可实现良好的脱保护即可，且优选使用三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸、对甲苯磺酸等。可用上述非极性溶剂来稀释这些酸。相对于寡核苷酸(d’)1摩尔，氨基的临时保护基的除去中的酸的使用量例如为1～100摩尔，优选为1～40摩尔。用于除去氨基的临时保护基的反应温度没有特别限制，只要反应进展即可，且优选为-10℃～50℃，更优选为0℃～40℃。氨基的临时保护基的反应时间根据所使用的寡核苷酸(d’)、酸的种类、非极性溶剂的种类、反应温度等而不同，且其例如为5min～5hr。
寡核苷酸
还可通过进一步应用有机合成反应来使步骤(6)或(6’)(固液分离或萃取)中获得的寡核苷酸(e)或(e’)、或者步骤(7)或(7’)(脱保护和分离)中获得的未被保护的寡核苷酸产生所需的衍生物。由本发明制备方法所获得的寡核苷酸可用于各种用途，例如人或动物用药品(RNA、DNA、寡核酸药物等)、功能性食品、用于特定保健的食品、食品、化学产品、用于生物体或用于工业的高分子材料等。
核苷酸或寡核苷酸
本发明提供可用于上述步骤(1)或步骤(1’)中的由下式(I)表示的化合物(即，核苷酸或寡核苷酸)。
Figure BDA0001701464970000781
式中：
m、m+1个碱基、m+1个X、m个R10和m个Rp1各自独立地如上所定义；以及
Rn1和Rn2中的一个是氢原子，另一个是由式(II)表示的基团(下式中的符号的定义如上所述)。
Figure BDA0001701464970000782
式(I)中，Rn1优选为由式(II)表示的基团，且Rn2优选为氢原子。
式(I)和(II)中，m+1个Rp1优选各自独立为由-CH2CH2WG表示的基团。
式(II)中，Ln1优选为C2-6亚烷基，更优选为亚乙基。
式(I)中，m优选为0。
式(I)和式(II)中的其它符号的说明如上所述。
其中Rn1是氢原子，且Rn2是由式(II)表示的基团的化合物(I)对应于上述化合物(a-vii)。其中Rn1是由式(II)表示的基团，且Rn2是氢原子的化合物(I)对应于上述化合物(a-vii’)。
使用化合物(I)作为原料所获得的寡核苷酸在3’位或5’位处具有修饰的磷酸基团。已知，如此修饰的寡核苷酸用来改进对核酸外切酶的抗性(Bioorganic&MedicinalChemistry 1997，5，2235-2243)。
实施例
以下通过例举实施例等对本发明进行更详细的说明，本发明不受这些实施例等的限制。还有可能通过在可与上文和下文的主旨相符的范围内做出适当的变更来实施本发明，所有变更均包括在本发明的技术范围内。
下述实施例等中使用的简称的含义如下所述。
另外，下述实施例等中使用的rAOMe(Bz)-CE亚磷酰胺等有时候在下文中统称为亚磷酰胺单体。
下述实施例等中使用的简称的含义如下所述。
DMTr：4，4’-二甲氧基三苯甲基
TOB：3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基
SUC：琥珀酰基
Ac-TOB：乙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯
HO-dA-SUC-TOB：琥珀酸N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯
HO-dT-SUC-TOB：琥珀酸脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯
HO-U-SUC-TOB：琥珀酸2’-O-甲基-尿苷-3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯
MeOC(O)-TOB：3，4，5-三(十八烷氧基)苯甲酸甲酯
HO-(CH2)2-SUC-TOB：2-羟基乙基琥珀酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯
CSO：(1S)-(+)-(10-莰基磺酰基)氧氮杂环丙烷
DBU：1，8-二氮杂双环[5.4.0]-7-十一烯
DDTT：5-[(N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮
DPTT：四硫化双亚戊基秋兰姆
PADS：苯乙酰二硫化物
rAOMe(Bz)-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N6-苯甲酰基-2’-O-甲基-腺苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
2’-OMe-rA(Bz)-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N6-苯甲酰基-2’-O-甲基-腺苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
dG-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰基-脱氧腺苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
dT-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
U-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲基-尿苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
dT-5’-CE亚磷酰胺：3’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)脱氧胸苷-5’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
Cm(Bz)-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N4-苯甲酰基-2’-O-甲基-胞苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
GMOE(iBu)-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰基-2’-O-甲氧基乙基-鸟苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
AMOE(Bz)-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N6-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-腺苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
TMOE-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-O-甲氧基乙基-胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
2’F-U-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-氟-尿苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
2’F-G-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰基-2’-氟-鸟苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
N4-苯甲酰基-5-Me-dC-CE亚磷酰胺：5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N4-苯甲酰基-2’-脱氧-5-甲基胞苷-3’-[O-(2-氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺
实施例1：硫代磷酸酯(phosphorothioate)二聚体(2’-O-甲基-尿苷-3’-[O-(2-氰 基乙基)]硫代磷酰基(phosphorothionyl)2’-O-甲基-尿苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧 基)苄基]琥珀酸酯)的合成
Figure BDA0001701464970000811
在氩气氛下，将HO-U-SUC-TOB(82.2mg，66.0μmol)和MeOC(O)-TOB(100mg，106μmol)加入10mL施兰克(Schlenk)管中，并使它们溶解在脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中所制备的5-苄基硫基-1H-四唑(37.8mg，197μmol)和U-CE亚磷酰胺(150mg，197μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(70.3μL，983μmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加PADS(178mg，590μmol)，并在室温下搅拌混合物2hr。依次添加5-甲氧基吲哚(193mg，1.31mmol)和三氟乙酸(45.2μL，590μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(85.5μL，649μmol)，向反应液中添加乙腈(10mL)，并使用桐山(KIRIYAMA)漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状二聚体(2’-O-甲基-尿苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2’-O-甲基-尿苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(197mg，收率95％)。
实施例2：硫代磷酸酯二十聚体(SEQ ID NO：1：5’-TCCCGCCTGTGACATGCATT-3’)的 液体中连续合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970000821
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(619mg，0.500mmol)和AcO-TOB(773mg，0.808mmol)加入200mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)和dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(1.07mL，15.0mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，进一步添加乙酸(172μL，3.00mmol)和2，4，6-三甲基吡啶(594μL，4.50mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。添加DDTT(340mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(689μL，9.00mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(1.31mL，9.90mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，并使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(789mg，收率98％)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯十九聚体的合成
进一步重复与上述(1)相同的操作18次，以获得十九聚体(脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(2.78g)。
(3)3’位羟基被锚固物保护且5’位羟基被DMTr基团保护的硫代磷酸酯二十聚体的合成
在氩气氛下，将上述(2)中获得的十九聚体(2.78g)加入200mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)中所制备的5-苄基硫基-1H-四唑(287mg，1.49mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.11g，1.49mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。添加DDTT(338mg，1.64mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二十聚体(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-乙酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-乙酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-乙酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(2.79g)。
(4)DMTr基团的除去
在氩气氛下，将上述(3)中所获得的二十聚体(1.00g)加入100mL两颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(10m)中。添加5-甲氧基吲哚(245mg，1.66mmol)和三氟乙酸(100μL，1.31mmol)，在室温下搅拌混合物1.5hr，并用2，4，6-三甲基吡啶(190μL，1.44mmol)进行中和。添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的除去了DMTr基团的二十聚体(脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-乙酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-乙酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-乙酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(867mg)。
(5)脱保护
将上述(4)中获得的二十聚体(20mg)与30wt％氨水(5.00mL)的混合物加入高压釜中，在55℃下加热16hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的脱氧胸苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3’-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3’-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3’-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-3’-硫代磷酰基-脱氧腺苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3’-硫代磷酰基-脱氧腺苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3’-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胞苷-3’-硫代磷酰基-脱氧腺苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胸苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胸苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-60％，λ＝260nm)：Rt＝6.87min(83.3面积％)；TOF/MS：6646.05
实施例3：脱保护之后不进行酸中和(步骤(5))的液体中连续合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(100mg，81μmol)和MeOC(O)-TOB(100mg，106μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(4.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(46.6mg，242μmol)与dT-CE亚磷酰胺(181mg，242μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(86.6μL，1.21mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。此外，添加乙酸(13.9μL，242μmol)和2，4，6-三甲基吡啶(31.9μL，242μmol)的混合物和DDTT(54.7mg，267μmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，依次添加5-甲氧基吲哚(238mg，1.62mmol)和三氟乙酸(55.7μL，727μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加乙腈(10mL)，并一边用乙腈(20mL)进行洗涤一边使用桐山漏斗通过抽吸过滤来收集沉淀的固体，并进行减压干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(222mg，收率96％)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯三聚体的合成
进一步重复与上述(1)相同的操作一次，以获得三聚体(N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(251mg，收率89％)。
实施例4：硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970000851
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(100mg，81μmol)和MeOC(O)-TOB(100mg，106μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(5.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(46.6mg，242μmol)与dT-CE亚磷酰胺(181mg，242μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(86.6μL，1.21mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。此外，添加DPTT(28.0mg，73.0μmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，依次添加5-甲氧基吲哚(234mg，1.62mmol)和三氟乙酸(55.7μL，727μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。用2，4，6-三甲基吡啶(105μL，800μmol)中和反应液，添加亚磷酸三乙酯(8.6μL，73.0μmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，向反应液中添加乙腈(10mL)，并使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(222mg，收率88％)。
实施例5：硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970000861
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(80.3mg，65.0μmol)和MeOC(O)-TOB(99.0mg，105μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(37.4mg，195μmol)与dT-CE亚磷酰胺(145mg，195μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(69.5μmL，973μmol)，并在室温下搅拌混合物15min。此外，添加PADS(177mg，584μmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，依次添加5-甲氧基吲哚(191mg，1.30mmol)和三氟乙酸(44.7μL，584μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。用2，4，6-三甲基吡啶(84.6μL，642μml)中和反应液。添加乙腈(10mL)，并使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(73.3mg，85％)。
TOF/MS：1557.0116
实施例6：硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970000862
在氩气氛下，将脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)环己基-1-甲基]琥珀酸酯(500mg，0.402mmol)和3，4，5-三(十八烷氧基)环己基-1-羧酸甲酯(500mg，0.528mmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(4.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.4mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(116mg，0.603mmol)与dT-CE亚磷酰胺(449mg，0.603mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(129μL，1.81mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。此外，添加DPTT(54.1mg，0.141mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.18g，8.04mmol)和三氟乙酸(115μL，1.51mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。用2，4，6-三甲基吡啶(218μL，1.66mmol)中和反应液，向反应液中添加乙腈(20mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)环己基-1-甲基]琥珀酸酯)(1.15g，收率100％)。
实施例7：硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970000871
在氩气氛下，将脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苯甲酰基哌嗪]琥珀酸酯(100mg，76.0μmmol)和3，4，5-三(十八烷氧基)环己基-1-羧酸甲酯(100mg，0.106mmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.3mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(43.7mg，227μmol)与2’-OMe-rA(Bz)-CE亚磷酰胺(202mg，0.227mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加吗啉(99.0μL，1.14mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。此外，添加(2R，8aS)-(+)-(樟脑磺酰基)氧氮杂环丙烷(54.7mg，0.239mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。依次添加5-甲氧基吲哚(223mg，1.52mmol)和三氟乙酸(34.8μL，0.455mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。用2，4，6-三甲基吡啶(65.9μL，500μmol)中和反应液，向反应液中添加乙腈(10mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(N6-苯甲酰基-2’-O-甲基-腺苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苯甲酰基哌嗪]琥珀酸酯)(214mg，收率89％)。
实施例8：二核苷酸的合成
Figure BDA0001701464970000881
在氩气氛下，将3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯(100mg，81.0μmmol)和3，4，5-三(十八烷氧基)苯基-1-羧酸甲酯(100mg，0.106mmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(5.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(46.6mg，242μmol)与dG-CE亚磷酰胺(204mg，0.242mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加吗啉(106μL，1.21mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。此外，添加碘(64.6mg，0.254mmol)、2，4，6-三甲基吡啶(83.8μL，0.636mmol)和水(6.60μL，0.364mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。依次添加5-甲氧基吲哚(238mg，1.62mmol)和三氟乙酸(55.7μL，0.727mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。用2，4，6-三甲基吡啶(105μL，800μmol)中和反应液，向反应液中添加乙腈(10mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤来收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二核苷酸(N2-异丁酰基-脱氧腺苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(209mg，收率88％)。
试验例1：猝灭剂的研究
(1)反应液的制备
在氩气氛下，使HO-dT-SUC-TOB(100mg，80.8μmol)和MeOC(O)-TOB(100mg，106μmol)溶解于脱水二氯甲烷(4.0mL)中。向该溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的dG-CE亚磷酰胺(204mg，242μmol)与5-苄基硫基-1H-四唑(46.5mg，242μmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物30min。通过薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1(体积比))来确认反应的完成，添加表1中所示的种类和量的猝灭剂，并在室温下搅拌混合物30min。然后添加表1中所示的氧化剂(254μmol，相对于亚磷酰胺单体为1.05摩尔当量)，并在室温下搅拌混合物1hr，以制备反应液。
(2)试验液的制备(用于分析的前处理)
将所获得的反应液(50μL)分配到1.5mL小瓶中，用四氢呋喃(450μL)稀释，向其中添加DBU(20μL)，并搅拌混合物30秒，以制备试验液。
(3)分析
使用LC-TOF MS(Agilent 6230)通过质谱来测量所获得的试验液。通过下式基于所观察的各化合物(目标化合物和副产物)的丰度(abundance)来计算副产物的量。
支化产物的量(％)＝(支化产物的丰度/目标产物的丰度)×100
磷酸三酯裂解产物的量(％)＝(磷酸三酯裂解产物的丰度/目标产物的丰度)×100
如本文所使用的，目标化合物指反应液中所含的目标寡核苷酸，支化产物指通过目标化合物的核酸碱基中的氨基的保护基脱落以及该氨基与单体的结合所生成的副产物，且磷酸三酯裂解产物指通过裂解目标化合物的磷酸三酯所生成的副产物。结果示于表1中。
[表1]
Figure BDA0001701464970000891
(注)
“猝灭剂的量”＝“相对于亚磷酰胺单体的摩尔当量”
“-”＝“检测限以下”
如表1中所示，当使用CSO作为氧化剂，且使用吗啉、四氢糠醇、二甘醇或乙二醇作为猝灭剂时，证实已有效抑制了支化产物和磷酸三酯裂解产物的生成。
试验例2：猝灭剂的研究
(1)反应液的制备
在氩气氛下，使HO-dT-SUC-TOB(100mg，80.8μmol)溶解于脱水二氯甲烷(4.0mL)中，添加rAOMe(Bz)-CE亚磷酰胺(215mg，242μmol)和5-苄基硫基-1H-四唑(46.5mg，242μmol)在脱水乙腈(0.5mL)中的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。通过薄层色谱(二氯甲烷/甲醇＝10/1(体积比))来确认反应的完成，添加表2中所示的种类和量的猝灭剂，并在室温下搅拌混合物30min。然后，添加CSO(58.2mg，254μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。此外，向反应液中添加5-甲氧基吲哚(238mg，1.62mmol)和三氟乙酸(92.5μL，1.21mmol)，并在室温下搅拌混合物18hr，以制备反应液。
(2)试验液的制备和分析
以与试验例1中相同的方式，通过质谱来测量所制备的试验液，并通过下式基于所观察的各化合物(目标化合物和副产物)的丰度来计算副产物的量。
+1单体产物的量(％)＝(+1单体产物的丰度/目标化合物的丰度)×100
碱基部分脱保护产物的量(％)＝(碱基部分脱保护产物的丰度/目标化合物的丰度)×100
如本文所使用的，+1单体产物指通过使目标化合物进而与1个多余的单体结合所生成的副产物，且碱基部分脱保护产物指通过目标化合物的核酸碱基中的氨基的保护基脱落而生成的副产物。结果示于表2中。
[表2]
Figure BDA0001701464970000901
(注)
“猝灭剂的量”＝“相对于亚磷酰胺单体的摩尔当量”
“-”＝“检测限以下”
如表2中所示，当使用四氢糠醇、二甘醇或乙二醇作为猝灭剂时，证实已有效抑制+1单体产物和碱基部分脱保护产物的生成。
试验例3：猝灭剂的研究
(1)反应液的制备
如下述参考例1～11中所示，制备反应液。
(2)试验液的制备和分析
以与试验例2中相同的方式，通过质谱来测量所制备的试验液，并计算+1单体产物的量和碱基部分脱保护产物的量。结果示于表3中。
[表3]
Figure BDA0001701464970000911
(注)
“猝灭剂的量”＝“相对于亚磷酰胺单体的摩尔当量”
“中和盐的量”＝“相对于亚磷酰胺单体的摩尔当量”
“-”＝“检测限以下”
如表3中所示，当使用甲醇、叔丁醇、2，2，2-三氟乙醇或2-丙醇作为猝灭剂时，证实了已抑制+1单体产物的生成。此外，当使用叔丁醇、2，2，2-三氟乙醇或2-丙醇时，还证实了已抑制碱基部分脱保护产物的生成。另外，当乙酸与2，4，6-三甲基吡啶的中和盐连同醇(该醇是证实了对+1单体产物和碱基部分脱保护产物的生成具有抑制效果的醇)共存时，证实已抑制了副产物的生成。
试验例4：未反应原料的研究
(1)反应液的制备
如下述参考例12～15中所示，制备反应液。
(2)试验液的制备
向参考例12～15中所获得的反应液中添加表4中所示的种类和量的猝灭剂和中和盐。将该反应液(50μL)分配到1.5mL小瓶中，添加DDTT(2.5mg，12μmol)，并振动混合物30秒。用四氢呋喃(450μL)稀释混合物，添加DBU(20μL)，并搅拌混合物30秒，以获得试验液。
(3)分析
使用LC-TOF MS(Agilent 6230)通过质谱来测量所获得的试验液。未反应原料的量通过下式基于所观察的各化合物(目标化合物和未反应原料)的丰度(m/z＝2)来计算。
未反应原料的量(％)＝(未反应原料的丰度/目标化合物的丰度)×100
如本文所使用的，未反应原料指制备反应液时所使用的亚磷酰胺单体。
[表4]
Figure BDA0001701464970000921
(注)
“猝灭剂的量”＝“相对于亚磷酰胺单体的摩尔当量”
“中和盐的量”＝“相对于亚磷酰胺单体的摩尔当量”
“-”＝“检测限以下”
如表4中所示，当叔丁醇或2，2，2-三氟乙醇和乙酸与2，4，6-三甲基吡啶的中和盐共存时，证实缩合反应已有效地进行而在缩合反应期间没有残留未反应原料。
试验例5：硫代磷酸酯十聚体的纯度的研究
通过HPLC来分析下述参考例16～20中所获得的硫代磷酸酯十聚体，并计算所获得的十聚体的纯度(面积％)。所使用的猝灭剂、中和盐和十聚体的纯度(面积％)的结果示于表5中。
[表5]
Figure BDA0001701464970000931
(注)
“猝灭剂的量”＝“相对于亚磷酰胺单体的摩尔当量”
“中和盐的量”＝“相对于亚磷酰胺单体的摩尔当量”
如表5中所示，当使用2，2，2-三氟乙醇或叔丁醇、以及乙酸与2，4，6-三甲基吡啶的中和盐时，证实十聚体的纯度变高。
参考例1(实施例9)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(619mg，500μmol)和Ac-TOB(619mg，648μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加甲醇(608μL，15.0mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(340mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(345μL，4.50mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(654μL，4.95mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，并使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(762mg，收率95％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(762mg，473μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(273mg，1.42mmol)与dA-CE亚磷酰胺(1.22g，1.42mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加甲醇(575μL，14.2mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(321mg，1.56mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.39g，9.46mmol)和三氟乙酸(326μL，4.26mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。
由于参考例1包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例2(实施例10)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(80.4mg，64.9μmol)和Ac-TOB(99.6mg，104μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(37.4mg，195μmol)与dT-CE亚磷酰胺(145mg，195μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加甲醇(39.5μL，975μmol)，添加乙酸(22.3μL，390μmol)与2，4，6-三甲基吡啶(77.0μL，585μmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(44.0mg，215μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(89.6μL，1.17mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(170μL，1.29mmol)，向反应液中添加乙腈(10mL)，并使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(104mg，收率99％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(104mg，64.2μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(37.5mg，195μmol)与dA-CE亚磷酰胺(165mg，195μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加甲醇(39.5μL，975μmol)，添加乙酸(22.3μL，390μmol)与2，4，6-三甲基吡啶(77.0μL，585μmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(44.0mg，214μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(158mg，1.07mmol)和三氟乙酸(74.7μL，975μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。
由于参考例2包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例3(实施例11)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(618mg，499μmol)和Ac-TOB(618mg，646μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.11g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加乙酸(857μL，15.0mmol)与吡啶(1.82mL，22.4mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(338mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(344μL，4.49mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(653μL，4.94mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(753mg，收率94％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(753mg，468μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(270mg，1.40mmol)与dA-CE亚磷酰胺(1.20g，1.40mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加乙酸(402μL，7.01mmol)与吡啶(567μL，7.01mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(317mg，1.54mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.38g，9.35mmol)和三氟乙酸(322μL，4.21mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。
由于参考例3包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例4(实施例12)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(619mg，500μmol)和Ac-TOB(770mg，807μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加乙酸(172μL，3.00mmol)与N-甲基咪唑(178μL，2.25mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(339mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(574μL，7.50mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加N-甲基咪唑(653μL，8.25mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，并使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(792mg，98％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(792mg，492μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(284mg，1.48mmol)与dA-CE亚磷酰胺(1.27g，1.48mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加乙酸(169μL，2.95mmol)与N-甲基咪唑(175μL，2.21mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(333mg，1.62mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.45g，9.83mmol)和三氟乙酸(565μL，7.37mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。
由于参考例4包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例5(实施例13)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(619mg，500μmol)和Ac-TOB(770mg，807μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加甲醇(608μL，15.0mmol)，添加乙酸(172μL，3.00mmol)与N-甲基咪唑(356μL，4.50mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(339mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(689μL，9.00mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加N-甲基咪唑(784μL，9.90mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(779mg，收率97％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(779mg，483μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(279mg，1.45mmol)与dA-CE亚磷酰胺(1.24g，1.45mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加甲醇(588μL，14.5mmol)，添加乙酸(166μL，2.90mmol)与N-甲基咪唑(344μL，4.35mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(328mg，1.60mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.42g，9.67mmol)和三氟乙酸(666μL，8.70mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。
由于参考例5包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例6(实施例14)和参考例13(实施例15)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(80.3mg，65.0μmol)和Ac-TOB(100mg，105μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(37.4mg，195μmol)与dT-CE亚磷酰胺(145mg，195μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加叔丁醇(186μL，1.95mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(44.0mg，214μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(94.6mg，642μmol)和三氟乙酸(44.7μL，584μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(84.6μL，642μmol)，向反应液中添加乙腈(10mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(104mg，收率100％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(104mg，65.0μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(37.3mg，194μmol)与dA-CE亚磷酰胺(167mg，194μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。将该时间点获得的反应液作为参考例13的反应液在上述试验例4中使用。
向如上述所获得的反应液中添加叔丁醇(186μL，1.94mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(43.9mg，214μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(94.3mg，641μmol)和三氟乙酸(44.6μL，583μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。将该时间点获得的反应液作为参考例6的反应液在上述试验例3中使用。
由于参考例6和参考例13包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它们各自是本发明的一种实施方案。
参考例7(实施例16)和参考例14(实施例17)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(619mg，500μmol)和Ac-TOB(772mg，808μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加叔丁醇(1.43mL，15.0mmol)，添加乙酸(173μL，3.00mmol)与2，4，6-三甲基吡啶(594μL，4.50mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(339mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(689μL，8.99mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(1.31mL，9.89mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，并使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(798mg，收率99％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(798mg，495μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(286mg，1.49mmol)与dA-CE亚磷酰胺(1.27g，1.49mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。将该时间点获得的反应液作为参考例14的反应液在上述试验例4中使用。
向如上述所获得的反应液中添加叔丁醇(1.42mL，14.8mmol)，添加乙酸(171μL，2.97mmol)与2，4，6-三甲基吡啶(589μL，4.46mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(335mg，1.63mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.46g，9.90mmol)和三氟乙酸(569μL，7.43mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。将该时间点获得的反应液作为参考例7的反应液在上述试验例3中使用。
由于参考例7和参考例14包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它们各自是本发明的一种实施方案。
参考例8(实施例18)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(80.3g，65.0μmol)加入10mL施兰克管中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(37.4mg，195μmol)与dT-CE亚磷酰胺(145mg，195μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2-丙醇(74.8μL，974μmol)，添加乙酸(22.2μL，390μmol)与2，4，6-三甲基吡啶(77.1μL，585μmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(44.0mg，214μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(94.6mg，643μmol)和三氟乙酸(44.7μL，584μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(84.6μL，643μmol)，向反应液中添加乙腈(10mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(101mg，收率98％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(101mg，63.0μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(36.3mg，189μmol)与dA-CE亚磷酰胺(162mg，189μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2-丙醇(72.5μL，944μmol)，添加乙酸(10.8μL，189μmol)与2，4，6-三甲基吡啶(37.3μL，283μmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(42.6mg，208μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(91.7mg，623μmol)和三氟乙酸(43.4μL，566μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。
由于参考例8包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例9(实施例19)和参考例15(实施例20)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(180mg，64.9μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(37.4mg，195μmol)与dT-CE亚磷酰胺(145mg，195μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(140μL，1.95mmol)，添加乙酸(22.3μL，390μmol)与2，4，6-三甲基吡啶(77.0μL，585μmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(44.0mg，215μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(189mg，1.17mmol)和三氟乙酸(89.6μL，1.17mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(170μL，1.29mmol)，向反应液中添加乙腈(10mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(104mg，收率99％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(101mg，62.5μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(36.1mg，188μmol)与dA-CE亚磷酰胺(161mg，188μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。将该时间点获得的反应液作为参考例15的反应液在上述试验例4中使用。
向如上述所获得的反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(134μL，1.88mmol)，添加乙酸(21.5μL，376μmol)与2，4，6-三甲基吡啶(74.3μL，564μmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(42.5mg，207μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(147mg，1.00mmol)和三氟乙酸(72.0μL，910μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。将该时间点获得的反应液作为参考例9的反应液在上述试验例3中使用。
由于参考例9和参考例15包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它们各自是本发明的一种实施方案。
参考例10：反应液的制备
在氩气氛下，将HO-dA-SUC-TOB(182mg，60.5μmol)加入10mL施兰克管中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(35.0mg，182μmol)与dT-CE亚磷酰胺(135mg，182μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(65.3μL，910μmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(41.1mg，200μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(88.4mg，600μmol)和三氟乙酸(41.8μL，546μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，制备反应液。
参考例11：反应液的制备
在氩气氛下，将HO-dA-SUC-TOB(182mg，60.5μmol)加入10mL施兰克管中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(35.0mg，182μmol)与dT-CE亚磷酰胺(135mg，182μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加叔丁醇(87.0μL，910μmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(41.1mg，200μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(88.4mg，600μmol)和三氟乙酸(41.8μL，546μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。
参考例12(实施例21)：反应液的制备
(1)二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(80.3mg，65.0μmol)和Ac-TOB(100mg，105μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(37.4mg，195μmol)与dT-CE亚磷酰胺(145mg，195μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(69.6μL，973μmol)，添加DDTT(44.0mg，214μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(94.6mg，642μmol)和三氟乙酸(44.7μL，584μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(84.6μL，642μmol)，向反应液中添加乙腈(10mL)，并使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(98.3mg，收率94％)。
(2)三聚体的合成
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(98.3mg，61.0μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(0.5mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(35.2mg，183μmol)与dA-CE亚磷酰胺(157mg，183μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr，以制备反应液。
由于参考例12包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例16(实施例22)：硫代磷酸酯十聚体(SEQ ID NO：2：5’-GACATGCATT-3’)的液 体中连续合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(619mg，500μmol)和Ac-TOB(619mg，648μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加甲醇(608μL，15.0mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(340mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(345μL，4.50mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(654μL，4.95mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(762mg，收率95％)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯九聚体的合成
进一步重复与上述(1)同样的操作7次，以获得九聚体(N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(2.03g)。
(3)3’位羟基被锚固物保护，且5’位羟基被DMTr基团保护的硫代磷酸酯十聚体的合成
在氩气氛下，将上述(2)的九聚体(2.03g)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(228mg，1.19mmol)与dG-CE亚磷酰胺(1.00g，1.19mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。添加DDTT(338mg，1.64mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的十聚体(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(2.28g)。
(4)脱保护
将上述(3)中获得的十聚体(20mg)与30wt％氨水(5.00mL)的混合物加入高压釜中，在55℃下加热16hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mmGD/X PVDF0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5 μm4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-60％，λ＝260nm)：Rt＝6.61，6.75min(41.3+41.3％)；
TOF/MS：3471.489
由于参考例16包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例17(实施例23)：硫代磷酸酯十聚体(SEQ ID NO：2：5’-GACATGCATT-3’)的液 体中连续合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(619mg，500μmol)和Ac-TOB(619mg，648μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加甲醇(608μL，15.0mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。之后，添加另外制备的乙酸(172μL，3.00mmol)与2，4，6-三甲基吡啶(595μL，4.50mmol)的混合物，进一步添加DDTT(339mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(689μL，9.00mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。用2，4，6-三甲基吡啶(654μL，4.95mmol)中和混合物，添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(765mg，收率95％)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯九聚体的合成
进一步重复与上述(1)同样的操作7次，以获得九聚体(N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(2.18g)。
(3)3’位羟基被锚固物保护且5’位羟基被DMTr基团保护的硫代磷酸酯十聚体的合成
在氩气氛下，将上述(2)中获得的九聚体(2.18g)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(272mg，1.42mmol)与dG-CE亚磷酰胺(1.19g，1.42mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。添加DDTT(320mg，1.56mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的十聚体(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(2.39g)。
(4)脱保护
将上述(3)中获得的十聚体(20mg)与30wt％氨水(5.00mL)的混合物加入高压釜中，在55℃下加热16hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-60％，λ＝260nm)：Rt＝7.06，7.19min(41.1+42.3％)；
TOF/MS：3471.49
由于参考例17包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例18(实施例24)：硫代磷酸酯十聚体(SEQ ID NO：2：5，-GACATGCATT-3’)的液 体中连续合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(617.5mg，499μmol)和Ac-TOB(619mg，648μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(3.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加另外制备的乙酸(857μL，15.0mmol)与脱水吡啶(1.82mL，22.5mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。搅拌之后，添加DDTT(338mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(345μL，4.50mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(653μL，4.94mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，并使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(753mg，收率94％)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯九聚体的合成
进一步重复与上述(1)同样的操作7次，以获得九聚体(N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(1.41g)。
(3)3’位羟基被锚固物保护且5’位羟基被DMTr基团保护的硫代磷酸酯十聚体的合成
在氩气氛下，将上述(2)中获得的九聚体(1.41g)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(159mg，829μmol)与dG-CE亚磷酰胺(696mg，829μmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。添加DDTT(187mg，912μmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤来收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的十聚体(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(1.51g)。
(4)脱保护
将上述(3)中获得的十聚体(20mg)与30wt％氨水(5.00mL)的混合物加入高压釜中，在55℃下加热16hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-60％，λ＝260nm)：Rt＝7.32，7.47min(40.3面积％+39.7面积％)；TOF/MS：3471.493
由于参考例18包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例19(实施例25)：硫代磷酸酯十聚体(SEQ ID NO：2：5’-GACATGCATT-3’)的液 体中连续合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(619mg，500μmol)和Ac-TOB(619mg，648μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(1.09mL，15.0mmol)的混合物，并在室温下搅拌混合物15min。之后，添加另外制备的乙酸(172μL，3.00mmol)与2，4，6-三甲基吡啶(595μL，4.50mmol)的混合物，进一步添加DDTT(339mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(345μL，4.50mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(653μL，4.94mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(788mg，收率98％)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯九聚体的合成
进一步重复与上述(1)同样的操作7次，以获得九聚体(N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(1.97g)。
(3)3’位羟基被锚固物保护且5’位羟基被DMTr基团保护的硫代磷酸酯十聚体的合成
在氩气氛下，将上述(2)的化合物(1.97g)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(222mg，1.16mmol)与dG-CE亚磷酰胺(972mg，1.16mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。添加DDTT(261mg，1.27mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的十聚体(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(2.21g)。
(4)脱保护
将上述(3)中获得的十聚体(20mg)与30wt％氨水(5.00mL)的混合物加入高压釜中，在55℃下加热16hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-60％，λ＝260nm)：Rt＝7.36，7.48min(48.8面积％+44.8面积％)；TOF/MS：3471.495
由于参考例19包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
参考例20(实施例26)：硫代磷酸酯十聚体(SEQ ID NO：2：5’-GACATGCATT-3’)的液 体中连续合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
在氩气氛下，将HO-dT-SUC-TOB(619mg，500μmol)和Ac-TOB(619mg，648μmol)加入300mL四颈烧瓶中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(288mg，1.50mmol)与dT-CE亚磷酰胺(1.12g，1.50mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加叔丁醇(1.43mL，15.0mmol)，并在室温下搅拌混合物15min。之后，添加另外制备的乙酸(173μL，3.00mmol)与2，4，6-三甲基吡啶(594μL，4.50mmol)的混合物，进一步添加DDTT(339mg，1.65mmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。之后，依次添加5-甲氧基吲哚(1.47g，10.0mmol)和三氟乙酸(689μL，8.99mmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。此外，添加2，4，6-三甲基吡啶(1.31mL，9.89mmol)，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(798mg，收率99％)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯九聚体的合成
进一步重复与上述(1)相同的操作7次，以获得九聚体(N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(1.93g)。
(3)3’位羟基被锚固物保护且5’位羟基被DMTr基团保护硫代磷酸酯十聚体的合成
在氩气氛下，将上述(2)中获得的九聚体(1.93g)加入300mL四颈烧瓶中，并使其溶解于脱水二氯甲烷(25mL)中。向所获得的溶液中添加通过溶解于脱水乙腈(2.0mL)中而制备的5-苄基硫基-1H-四唑(218mg，1.13mmol)与dG-CE亚磷酰胺(950mg，1.13mmol)的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1.5hr。添加DDTT(256mg，1.23mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，向反应液中添加乙腈(150mL)，使用桐山漏斗通过抽吸过滤来收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的十聚体(5’-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基)-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N2-异丁酰基-脱氧鸟苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-(2-己基)癸酰基-脱氧胞苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N6-苯甲酰基-脱氧腺苷3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷3’-[O-(2-氰基乙基)]磷酰基-脱氧胸苷3’-基3，4，5-三(十八烷氧基)苄基琥珀酸酯)(2.14g)。
(4)脱保护
将上述(3)中获得的十聚体(20mg)与30wt％氨水(5.00mL)的混合物加入高压釜中，在55℃下加热16hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧鸟苷酰-[3’→5’]-脱氧胞苷酰-[3’→5’]-脱氧腺苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷酰-[3’→5’]-脱氧胸苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-60％，λ＝260nm)：Rt＝6.95，7.08min(44.3面积％+42.7面积％)；TOF/MS：3471.493
由于参考例20包括上述二聚体的合成中的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，因此它是本发明的一种实施方案。
实施例27：硫代磷酸酯二聚体(5’-TT-3’)的合成
(1)5’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯单体的合成
Figure BDA0001701464970001091
在氩气氛下，将HO-(CH2)2-SUC-TOB(84.6mg，80μmol)、2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(84.6mg，84.8μmol)和dT-5’-CE亚磷酰胺(179mg，240μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(4.0mL)与脱水乙腈(0.4mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加5-乙基硫基-1H-四唑(31.2mg，240μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(87.4μL，1.20mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，添加2，6-二甲基苯胺(152μL，1.236mmol)、DDTT(51.7mg，252μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。此外，添加2，3-二甲基呋喃(127μL，1.20mmol)，滴加三氟乙酸(184μL，2.40mmol)溶解于脱水二氯甲烷(368μL)中的溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。用2，4，6-三甲基吡啶(666μL，5.04mmol)中和混合物，向反应液中添加乙腈(17mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的单体(5’-{[3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基]琥珀酰氧基-乙基-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基}-脱氧胸苷)(106mg，收率92％)。
(2)5’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970001101
在氩气氛下，将上述(1)中获得的单体(85.9mg，60.0μmol)、2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(63.4mg，63.5μmol)和dT-5’-CE亚磷酰胺(134mg，180μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(3.0mL)与脱水乙腈(0.3mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加5-乙基硫基-1H-四唑(23.4mg，180μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(65.6μL，900μmol)，并在室温下搅拌混合物30min。添加2，6-二甲基苯胺(114μL，927μmol)、DDTT(38.8mg，189μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。添加2，3-二甲基呋喃(94.9μL，900μmol)，向反应液中滴加三氟乙酸(138μL，1.80mmol)溶解于脱水二氯甲烷(276μL)中的溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。添加2，4，6-三甲基吡啶(500μL，3.78mmol)，向反应液中添加乙腈(13mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(5’-{[3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基]琥珀酰氧基-乙基-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基}-脱氧胸苷)(107mg，收率99％)。
(3)脱保护
将上述(2)中获得的二聚体(3.01mg)与30wt％氨水(5.0mL)的混合物加入高压釜中，在65℃下加热4hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的5’-[O-(2-羟基乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胸苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-30％，λ＝260nm)：Rt＝1.49min(99.3面积％)；TOF/MS：702.09
实施例28：缩合之后不进行猝灭(步骤(2))的液体中连续合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970001111
在氩气氛下，将2’-O-甲基-尿苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯(104mg，83.3μmol)、2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(105mg，106μmol)和Cm(Bz)-CE亚磷酰胺(216mg，250μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(4.2mL)与脱水乙腈(0.4mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加5-乙基硫基-1H-四唑(32.6mg，250μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，6-二甲基苯胺(78.8μL，639μmol)、DDTT(53.8mg，263μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。添加2，3-二甲基呋喃(132μL，1.25mmol)，滴加三氟乙酸(191μL，2.50mmol)溶解于脱水二氯甲烷(255μL)中的溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，4，6-三甲基吡啶(463μL，3.50mmol)，添加乙腈(18mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(N4-苯甲酰基-2’-O-甲基-胞苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-2’-O-甲基-尿苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(140mg，收率96％)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯三聚体的合成
Figure BDA0001701464970001121
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(130mg，74.5μmol)、2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(94.5mg，94.8μmol)和Cm(Bz)-CE亚磷酰胺(186mg，224μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(4.2mL)与脱水乙腈(0.4mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加5-乙基硫基-1H-四唑(29.2mg，224μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，6-二甲基苯胺(78.8μL，639μmol)，添加DDTT(48.3mg，235μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。添加2，3-二甲基呋喃(118μL，1.12mmol)，滴加三氟乙酸(172μL，2.24mmol)溶解于脱水二氯甲烷(255μL)中的溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，4，6-三甲基吡啶(463μL，3.50mmol)，添加乙腈(18mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的三聚体(N4-苯甲酰基-2’-O-甲基-胞苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰基-2’-O-甲基-胞苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基-N4-苯甲酰基-2’-O-甲基-尿苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(153mg，收率92％)。
(3)脱保护
将上述(2)中获得的三聚体(3.01mg)与30wt％氨水(5.0mL)的混合物加入高压釜中，在65℃下加热4hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的2’-O-甲基-胞苷-3’-硫代磷酰基-2’-O-甲基-胞苷-3’-硫代磷酰基-2’-O-甲基-尿苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-30％，λ＝260nm)：Rt＝1.72，1.98min(47.9+50.6面积％)；TOF/MS：928.11
实施例29：硫代磷酸酯四聚体(5’-TAGT-3’)的液体中连续合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970001131
在氩气氛下，将脱氧胸苷-3’-基-N-[2，3，4-三(十八烷氧基)二苯甲基]琥珀酰胺酸酯(49.8mg，37.9μmol)、2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(49.8mg，49.9μmol)和GMOE(iBu)-CE亚磷酰胺(104mg，114μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(1.9mL)与脱水乙腈(0.6mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加5-乙基硫基-1H-四唑(14.8mg，114μmol)，并在室温下搅拌混合物1.5hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(41.4μL，570μmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，添加2，6-二甲基苯胺(72.2μL，586μmol)和DDTT(24.5mg，119μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。此外，添加2，3-二甲基呋喃(60.0μL，570μmol)，滴加三氟乙酸(87.1μL，1.14mmol)溶解于脱水二氯甲烷(174μL)中的溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。用2，4，6-三甲基吡啶(316μL，2.39mmol)中和混合物，向反应液中添加乙腈(8.0mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(N2-异丁酰基-2’-O-甲氧基乙基-鸟苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-N-[2，3，4-三(十八烷氧基)二苯甲基]琥珀酰胺酸酯)(69.9mg，收率99％)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯三聚体的合成
Figure BDA0001701464970001141
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(63.5mg，34.2μmol)和2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(44.9mg，45.0μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(1.7mL)与脱水乙腈(0.5mL)的混合溶剂中。添加AMOE(Bz)-CE亚磷酰胺(112mg，120μmol)和5-乙基硫基-1H-四唑(15.6mg，120μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(43.6μL，595μmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，添加2，6-二甲基苯胺(75.9μL，571μmol)和DDTT(25.8mg，126μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。添加2，3-二甲基呋喃(63.1μL，595μmol)，滴加三氟乙酸(91.7μL，1.20mmol)溶解于脱水二氯甲烷(183μL)中的溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。用2，4，6-三甲基吡啶(332μL，2.51mmol)中和混合物，向反应液中添加乙腈(8.0mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的三聚体(N6-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-腺苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N2-异丁酰基-2’-O-甲氧基乙基-鸟苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-N-[2，3，4-三(十八烷氧基)二苯甲基]琥珀酰胺酸酯)(69.9mg，收率85％)。
(3)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯四聚体的合成
Figure BDA0001701464970001151
在氩气氛下，将上述(2)中获得的三聚体(62.7mg，26.0μmol)和2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(34.0mg，34.1μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(1.3mL)和脱水乙腈(0.4mL)的混合溶剂中。添加TMOE-CE亚磷酰胺(63.8mg，78.0μmol)和5-乙基硫基-1H-四唑(10.1mg，78.0μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(28.4μL，390μmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，添加2，6-二甲基苯胺(49.4μL，401μmol)和DDTT(16.8mg，82.0μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。添加2，3-二甲基呋喃(41.0μL，390μmol)，滴加三氟乙酸(59.6μL，780μmol)溶解于脱水二氯甲烷(119μL)中的溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。添加2，4，6-三甲基吡啶(216μL，1.64mmol)、水(2μL)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加乙腈(6mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的四聚体(2’-O-甲氧基乙基-胸苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N6-苯甲酰基-2’-O-甲氧基乙基-腺苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N2-异丁酰基-2’-O-甲氧基乙基-鸟苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基脱氧胸苷-3’-基-N-[2，3，4-三(十八烷氧基)二苯甲基]琥珀酰胺酸酯)(58.9mg，收率79.2％)。
(4)脱保护
将上述(3)中获得的四聚体(3.10mg)与30wt％氨水(5.0mL)的混合物加入高压釜中，在65℃下加热4hr，并在冰浴中冷却。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的2’-O-甲氧基乙基-胸苷-3’-硫代磷酰基-2’-O-甲氧基乙基-腺苷-3’-硫代磷酰基-2’-O-甲氧基乙基-鸟苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胸苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-30％，λ＝260nm)：Rt＝4.42，4.49min(31.0+66.7面积％)；TOF/MS：1458.30
实施例30：使用核酸碱基部分被锚固物保护的原料的三聚体的合成
(1)核酸碱基部分被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970001161
在氩气氛下，将N4-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基]琥珀酰基-3’-O-(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基-脱氧胞苷(100mg，80.0μmol)、2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(100mg，100μmol)和2’F-U-CE亚磷酰胺(180mg，240μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(4.0mL)与脱水乙腈(0.4mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加5-乙基硫基-1H-四唑(31.2mg，240μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(87.4μL，1.20mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，添加2，6-二甲基苯胺(152μL，1.24mmol)、DDTT(51.7mg，252μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。此外，添加2，3-二甲基呋喃(127μL，1.20mmol)，滴加三氟乙酸(184μL，2.40mmol)和2，6-二甲基苯胺(3.0μL，20μmol)溶解于脱水二氯甲烷(368μL)中的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，4，6-三甲基吡啶(666μL，5.04mmol)，添加乙腈(17mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的二聚体(2’-氟-尿苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基]琥珀酰基-3’-O-(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基-脱氧胞苷)(127mg，收率98％)。
(2)核酸碱基部分被锚固物保护的硫代磷酸酯三聚体的合成
Figure BDA0001701464970001171
在氩气氛下，将上述(1)中获得的二聚体(114mg，70.0μmol)、2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(87.5mg，87.7μmol)和2’F-G-CE亚磷酰胺(180mg，210μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(3.5mL)与脱水乙腈(0.3mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加5-乙基硫基-1H-四唑(27.3mg，210μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(76.5μL，1.05mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。搅拌之后，添加2，6-二甲基苯胺(133μL，1.08mmol)、DDTT(45.3mg，220μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。此外，添加2，3-二甲基呋喃(111μL，1.05mmol)，滴加三氟乙酸(161μL，2.10mmol)和2，6-二甲基苯胺(2.6μL，20μmol)溶解于脱水二氯甲烷(321μL)中的混合溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，4，6-三甲基吡啶(583μL，4.41mmol)，添加乙腈(15mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的三聚体(N2-异丁酰基-2’-氟-鸟苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2’-氟-尿苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基]琥珀酰基-3’-O-(1，1-二甲基乙基)二甲基甲硅烷基-脱氧胞苷)(139mg，收率94％)。
(3)3’位羟基的甲硅烷基保护基的除去
Figure BDA0001701464970001172
将上述(2)中获得的二聚体(110mg，50.0μmol)和2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(62.5mg，62.6μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于二氯甲烷(2.0mL)与四氢呋喃(4.0mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加三乙胺三氢氟酸盐(196μL，1.20mmol)和吡啶(193μL，2.40mmol)，并在室温下搅拌混合物16hr。向反应液中添加乙腈(20mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的三聚体(N2-异丁酰基-2’-氟-鸟苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2’-氟-尿苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N4-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄氧基]琥珀酰基-脱氧胞苷)(100mg，收率96％)。
(4)脱保护
将上述(3)中获得的三聚体(3.12mg)与30wt％氨水(5.0mL)的混合物加入高压釜中，在65℃下加热4hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的2’-氟-鸟苷-3’-硫代磷酰基-2’-氟-尿苷-3’-硫代磷酰基-脱氧胞苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5-30％，λ＝260nm)：Rt＝1.15，1.40min(11.2+85.1面积％)；TOF/MS：914.11
实施例31：硫代磷酸酯三聚体的合成
(1)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯二聚体的合成
Figure BDA0001701464970001181
在氩气氛下，将N6-[1-(二甲基氨基)亚乙基]-脱氧腺苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯(105mg，80.0μmol)、2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(105mg，106μmol)和U-CE亚磷酰胺(183mg，240μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(4.0mL)与脱水乙腈(0.4mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加5-乙基硫基-1H-四唑(31.2mg，240μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(87.4μL，1.20mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。添加2，6-二甲基苯胺(152μL，1.24mol)和DDTT(51.7mg，252μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。此外，添加2，3-二甲基呋喃(127μL，1.20mmol)，滴加三氟乙酸(184μL，2.40mmol)溶解于脱水二氯甲烷(368μL)中的溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，4，6-三甲基吡啶(666μL，5.04mmol)，添加乙腈(17mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以定量获得白色固体状的二聚体(2’-O-甲基-尿苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N6-[1-(二甲基氨基)亚乙基]-脱氧腺苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)。
(2)3’位羟基被锚固物保护的硫代磷酸酯三聚体的合成
Figure BDA0001701464970001191
在氩气氛下，将上述(1)中获得的化合物(119mg，70.0μmol)、2，2-二甲基丙酸3，4，5-三(十八烷氧基)苄基酯(92.2mg，92.4μmol)和N4-苯甲酰基-5-Me-dC-CE亚磷酰胺(178mg，210μmol)加入10mL施兰克管中，并使它们溶解于脱水二氯甲烷(4.0mL)和脱水乙腈(0.4mL)的混合溶剂中。向所获得的溶液中添加5-乙基硫基-1H-四唑(27.3mg，210μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，2，2-三氟乙醇(76.5μL，1.05mmol)，并在室温下搅拌混合物30min。添加2，6-二甲基苯胺(133μL，1.08mol)和DDTT(45.3mg，221μmol)，并在室温下搅拌混合物1hr。此外，添加2，3-二甲基呋喃(111μL，1.05mmol)，滴加三氟乙酸(161μL，2.10mmol)溶解于脱水二氯甲烷(322μL)中的溶液，并在室温下搅拌混合物1hr。向反应液中添加2，4，6-三甲基吡啶(583μL，4.41mmol)，添加乙腈(17mL)，通过过滤收集沉淀的固体并进行干燥，以获得白色固体状的三聚体(N4-苯甲酰基-5-甲基-脱氧胞苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基2’-O-甲基-尿苷-3’-[O-(2-氰基乙基)]硫代磷酰基N6-[1-(二甲基氨基)亚乙基]-脱氧腺苷-3’-基-[3，4，5-三(十八烷氧基)苄基]琥珀酸酯)(131mg，收率85％)。
(3)脱保护
将上述(2)中获得的三聚体(3.02mg)与30wt％氨水(5.0mL)的混合物加入高压釜中，在65℃下加热4hr，并冷却到室温。通过针头过滤器(Whatman 25mm GD/X PVDF 0.45μm)除去反应液中的不溶性物质，并将滤液冷冻干燥，以获得作为目标产物的5-甲基-脱氧胞苷-3’-硫代磷酰基-2’-O-甲基-尿苷-3’-硫代磷酰基-脱氧腺苷。
HPLC(WATERS XBridgeTM C18 2.5μm 4.6×75mm柱，流量1.0mL/min，8mM TEA+100mM HFIP，MeOH，梯度：0-10min；5～30％，λ＝260nm)：Rt＝1.92，2.23min(14.8+75.6面积％)；TOF/MS：906.17
工业应用性
根据本发明的寡核苷酸的制备方法，可有效率地实施缩合。由本发明制备方法所获得的寡核苷酸可用于各种各样的用途，例如人或动物用药品(RNA、DNA、寡核酸药物等)、功能性食品、用于特定保健的食品、食品、化学产品、用于生物体或用于工业的高分子材料等。
本申请基于在日本提出的专利申请No.2015-245564，该申请的内容整体并入本文。
<110> 味之素株式会社
<120> 寡核苷酸的制备方法以及核苷、核苷酸或寡核苷酸
<130> 092541
<150> JP 2015-245564
<151> 2015-12-16
<160> 2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的硫代磷酸酯
<400> 1
tcccgcctgt gacatgcatt 20
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的硫代磷酸酯
<400> 2
gacatgcatt 10

Claims (18)

1.寡核苷酸的制备方法，该方法包含以下的步骤(1)、(3)、(4)和(6)，
步骤(1)：在非极性溶剂中，向包含核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)的反应液中添加核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)，使核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)缩合，以获得包含5’位羟基被临时保护基保护的亚磷酸三酯产物(c)的反应液；
步骤(3)：向包含亚磷酸三酯产物(c)的所述反应液中添加氧化剂或硫化剂，使亚磷酸三酯产物(c)氧化或硫化，以获得包含5’位羟基被临时保护基保护的寡核苷酸(d)的反应液；
步骤(4)：向氧化或硫化后的所述反应液中添加酸来除去5’位羟基的临时保护基，以获得包含5’位羟基未被保护的寡核苷酸(e)的反应液；和
步骤(6)：向包含寡核苷酸(e)的所述反应液中添加极性溶剂，通过固液分离来纯化寡核苷酸(e)，
其中非极性溶剂是选自卤系溶剂、芳族系溶剂、酯系溶剂和脂肪族系溶剂中的至少一种，
其中所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(a)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α)是由式(a-i)表示的化合物、由式(a-vi)表示的化合物、或者由式(a-vii)表示的化合物；
所述式(a-i)为：
Figure FDA0003676673880000011
式中：
m是0以上且49以下的整数；
m+1个碱基各自独立为任选被保护的核酸碱基；
m+1个X各自独立为氢原子、卤素原子、或任选被保护的羟基；
m个R10各自独立为氧原子或硫原子；
m个Rp1各自独立为磷酸基团的保护基；
L是单键、或由式(a1)或(a1’)表示的基团：
Figure FDA0003676673880000021
式中：
*是与Y的键合位置；
**是与氧原子的键合位置；
R1和R2各自独立为C1-22烃基；
L1是任选取代的二价C1-22烃基；
L2是单键、或由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，其中***是与L1的键合位置，****是与C＝O的键合位置，R4是C1-22亚烷基，R3和R5各自独立为氢原子或C1-22烷基，或者R3和R5任选地一起形成环；
Y是单键、氧原子或NR，其中R是氢原子、烷基或芳烷基；以及
Z是由式(a2)、式(a2’)或式(a2”)表示的基团：
Figure FDA0003676673880000022
式中：
*表示键合位置；
R6是氢原子，或者当Rb是由下式(a3)表示的基团时，环A或环B的R6任选地与R8一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；
k是1～4的整数；
k个Q各自独立为-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R7各自独立地表示直链C10-40烷基、经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的苄基、或经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的环己基甲基；
环A和环B各自独立地，除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra是氢原子；以及
Rb是氢原子、或由式(a3)表示的基团：
Figure FDA0003676673880000023
式中：
*表示键合位置；
j是0～4的整数；
j个Q各自独立如上所定义；
j个R9各自独立地表示直链C10-40烷基、经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的苄基、或经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的环己基甲基；
R8是氢原子、或者任选地与环A或环B的R6一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；以及
环C除了具有j个QR9以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；或
Ra和Rb一起形成氧代基；
所述式(a-vi)为：
Figure FDA0003676673880000031
式中：
m+1个碱基1中的至少一个是被-L-Y-Z保护的核酸碱基，其余是任选被保护的核酸碱基；
Rn4是羟基的保护基；
m、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义；
所述式(a-vii)为：
Figure FDA0003676673880000041
式中：
Ln1是C2-6亚烷基；
m、m+1个碱基、m+1个X、m+1个R10、m+1个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义；
其中所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(b)是由式(b-i)表示的化合物：
Figure FDA0003676673880000042
式中：
q是0以上且49以下的整数；
q+1个碱基3各自独立为任选被用于核酸合成的保护基保护的核酸碱基；
Q”是临时保护基；
R36和R37各自独立地表示烷基、或者表示与邻接的氮原子一起形成的5元或6元饱和环状氨基，该饱和环状氨基中，除了具有氮原子之外，作为环构成原子还任选具有一个氧原子或硫原子；
q+1个X、q+1个Rp1、和q个R10各自独立地如上所定义；
其中所述临时保护基是三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基噻吨基、1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、或1-(4-甲氧基苯基)-1,1-二苯基甲基；
其中步骤(3)中使用的氧化剂是选自碘、(1S)-(+)-(10-莰基磺酰基)氧氮杂环丙烷、叔丁基过氧化氢、过氧化甲乙酮、1,1-二氢过氧环十二烷、双(三甲基硅基)过氧化物和间氯过氧苯甲酸中的至少一种；
其中步骤(3)中使用的硫化剂是选自5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物、二硫化四乙基秋兰姆、四硫化双亚戊基秋兰姆、苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮和硫中的至少一种，并且当使用5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮作为硫化剂时，向步骤(1)之后且步骤(4)之前的所述反应液中添加羧酸和有机碱的混合物、无机酸或胺类；
其中步骤(6)中使用的极性溶剂是腈系溶剂。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，在步骤(1)之后且步骤(3)之前还包含以下的步骤(2)，
步骤(2)：向缩合后的所述反应液中添加猝灭剂，
其中步骤(2)中使用的猝灭剂是选自醇类、酚类和胺类中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，相对于羧酸所具有的羧基1摩尔，有机碱所具有的碱性氮原子的量是1～2摩尔。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，临时保护基是1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、或1-(4-甲氧基苯基)-1,1-二苯基甲基。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，步骤(4)中使用的酸是选自三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸和对甲苯磺酸中的至少一种。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，在步骤(4)之后且步骤(6)之前还包含以下的步骤(5)，
步骤(5)：向包含寡核苷酸(e)的所述反应液中添加碱来进行中和。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，步骤(5)中使用的碱是选自吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1,2,4-三唑、N-苯基咪唑、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶、1,10-菲咯啉、咪唑、N-甲基咪唑、2-氯苯并咪唑、2-溴苯并咪唑、2-甲基咪唑、2-苯基苯并咪唑、N-苯基苯并咪唑和5-硝基苯并咪唑中的至少一种。
8.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，在步骤(6)之后还包含以下的步骤(7)，
步骤(7)：除去所得的寡核苷酸的全部保护基后，分离未被保护的寡核苷酸。
9.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，在阳离子捕获剂的存在下进行步骤(4)中除去临时保护基的反应，或者在除去临时保护基的反应之后向所述反应液中添加阳离子捕获剂，
其中所述阳离子捕获剂是选自吡咯、2-甲基吡咯、3-甲基吡咯、2,3-二甲基吡咯、2,4-二甲基吡咯、吲哚、5-甲氧基吲哚、3-甲基吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5,6-二甲基吲哚、6,7-二甲基吲哚、2-甲基呋喃、2,3-二甲基呋喃、2-甲基-3-(甲硫基)呋喃和薄荷呋喃中的至少一种。
10.寡核苷酸的制备方法，该方法包含以下的步骤(1’)、(3’)、(4’)和(6’)：
步骤(1’)：在非极性溶剂中，向包含核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)的反应液中添加核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)，使核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)与核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)缩合，以获得包含3’位羟基被临时保护基保护的亚磷酸三酯产物(c’)的反应液，
步骤(3’)：向包含亚磷酸三酯产物(c’)的所述反应液中添加氧化剂或硫化剂，使亚磷酸三酯产物(c’)氧化或硫化，以获得包含3’位羟基被临时保护基保护的寡核苷酸(d’)的反应液；
步骤(4’)：向氧化或硫化后的所述反应液中添加酸来除去3’位羟基的临时保护基，以获得包含3’位羟基未被保护的寡核苷酸(e’)的反应液；和
步骤(6’)：向包含寡核苷酸(e’)的所述反应液中添加极性溶剂，通过固液分离来纯化寡核苷酸(e’)，
其中非极性溶剂是选自卤系溶剂、芳族系溶剂、酯系溶剂和脂肪族系溶剂中的至少一种；
其中所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(a’)或者取代的核苷酸或寡核苷酸(α’)是由式(a-i’)表示的化合物、由式(a-vi’)表示的化合物、或者由式(a-vii’)表示的化合物；
所述式(a-i’)为：
Figure FDA0003676673880000061
式中：
m是0以上且49以下的整数；
m+1个碱基各自独立为任选被保护的核酸碱基；
m+1个X各自独立为氢原子、卤素原子、或任选被保护的羟基；
m个R10各自独立为氧原子或硫原子；
m个Rp1各自独立为磷酸基团的保护基；
L是单键、或由式(a1)或(a1’)表示的基团：
Figure FDA0003676673880000071
式中：
*是与Y的键合位置；
**是与氧原子的键合位置；
R1和R2各自独立为C1-22烃基；
L1是任选取代的二价C1-22烃基；
L2是单键、或由***C(＝O)N(R3)-R4-N(R5)****表示的基团，其中***是与L1的键合位置，****是与C＝O的键合位置，R4是C1-22亚烷基，R3和R5各自独立为氢原子或C1-22烷基，或者R3和R5任选地一起形成环；
Y是单键、氧原子或NR，其中R是氢原子、烷基或芳烷基；以及
Z是由式(a2)、式(a2’)或式(a2”)表示的基团：
Figure FDA0003676673880000072
式中：
*表示键合位置；
R6是氢原子，或者当Rb是由下式(a3)表示的基团时，环A或环B的R6任选地与R8一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；
k是1～4的整数；
k个Q各自独立为-O-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-C(＝O)NH-或-NHC(＝O)-；
k个R7各自独立地表示直链C10-40烷基、经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的苄基、或经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的环己基甲基；
环A和环B各自独立地，除了具有k个QR7以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；
Ra是氢原子；以及
Rb是氢原子、或由式(a3)表示的基团：
Figure FDA0003676673880000081
式中：
*表示键合位置；
j是0～4的整数；
j个Q各自独立如上所定义；
j个R9各自独立地表示直链C10-40烷基、经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的苄基、或经由-O-键合有1～3个直链C10-40烷基的环己基甲基；
R8是氢原子、或者任选地与环A或环B的R6一起表示单键或-O-，以与环A或环B及环C一起形成稠环；以及
环C除了具有j个QR9以外，还任选具有取代基，所述取代基选自卤素原子、任选被卤素原子取代的C1-6烷基、和任选被卤素原子取代的C1-6烷氧基；或
Ra和Rb一起形成氧代基；
所述式(a-vi’)为：
Figure FDA0003676673880000082
式中：
m+1个碱基1中的至少一个是被-L-Y-Z保护的核酸碱基，其余是任选被保护的核酸碱基；
Rn4是羟基的保护基；
m、m+1个X、m个R10、m个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义；
所述式(a-vii’)为：
Figure FDA0003676673880000091
式中：
Ln1是C2-6亚烷基；
m、m+1个碱基、m+1个X、m+1个R10、m+1个Rp1、L、Y和Z各自独立地如上所定义；
其中所述核苷、核苷酸或寡核苷酸(b’)是由式(b-i’)表示的化合物：
Figure FDA0003676673880000092
式中：
q是0以上且49以下的整数；
q+1个碱基3各自独立为任选被用于核酸合成的保护基保护的核酸碱基；
Q”是临时保护基；
R36和R37各自独立地表示烷基、或者表示与邻接的氮原子一起形成的5元或6元饱和环状氨基，该饱和环状氨基中，除了具有氮原子之外，作为环构成原子还任选具有一个氧原子或硫原子；
q+1个X、q+1个Rp1、和q个R10各自独立地如上所定义；
其中所述临时保护基是三苯甲基、9-(9-苯基)呫吨基、9-苯基噻吨基、1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、或1-(4-甲氧基苯基)-1,1-二苯基甲基；
其中步骤(3’)中使用的氧化剂是选自碘、(1S)-(+)-(10-莰基磺酰基)氧氮杂环丙烷、叔丁基过氧化氢、过氧化甲乙酮、1,1-二氢过氧环十二烷、双(三甲基硅基)过氧化物和间氯过氧苯甲酸中的至少一种；
其中步骤(3’)中使用的硫化剂是选自5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮-1,1-二氧化物、3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮、苯乙酰二硫化物、二硫化四乙基秋兰姆、四硫化双亚戊基秋兰姆、苯基-3H-1,2,4-二噻唑-3-酮、3-氨基-1,2,4-二噻唑-5-硫酮和硫中的至少一种，并且当使用5-[(N,N-二甲基氨基亚甲基)氨基]-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮作为硫化剂时，向步骤(1’)之后且步骤(4’)之前的所述反应液中添加羧酸和有机碱的混合物、无机酸或胺类；
其中步骤(6’)中使用的极性溶剂是腈系溶剂。
11.根据权利要求10中所述的制备方法，其中，在步骤(1’)之后且步骤(3’)之前还包含以下的步骤(2’)，
步骤(2’)：向缩合后的所述反应液中添加猝灭剂，
其中步骤(2’)中使用的猝灭剂是选自醇类、酚类和胺类中的至少一种。
12.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中，相对于羧酸所具有的羧基1摩尔，有机碱所具有的碱性氮原子的量是1～2摩尔。
13.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中，羟基的临时保护基是1,1-双(4-甲氧基苯基)-1-苯基甲基、或1-(4-甲氧基苯基)-1,1-二苯基甲基。
14.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中，步骤(4’)中使用的酸是选自三氟乙酸、二氯乙酸、三氟甲磺酸、三氯乙酸、甲磺酸、盐酸、乙酸和对甲苯磺酸中的至少一种。
15.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中，在步骤(4’)之后且步骤(6’)之前还包含以下的步骤(5’)，
步骤(5’)：向包含寡核苷酸(e’)的所述反应液中添加碱来进行中和。
16.根据权利要求15所述的制备方法，其中，步骤(5’)中使用的碱是选自吡啶、2,4,6-三甲基吡啶、苯并咪唑、1,2,4-三唑、N-苯基咪唑、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶、1,10-菲咯啉、咪唑、N-甲基咪唑、2-氯苯并咪唑、2-溴苯并咪唑、2-甲基咪唑、2-苯基苯并咪唑、N-苯基苯并咪唑和5-硝基苯并咪唑中的至少一种。
17.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中，在步骤(6’)之后还包含以下的步骤(7’)，
步骤(7’)：除去所得的寡核苷酸的全部保护基后，分离未被保护的寡核苷酸。
18.根据权利要求10或11所述的制备方法，其中，在阳离子捕获剂的存在下进行步骤(4’)中除去临时保护基的反应，或者在除去临时保护基的反应之后向所述反应液中添加阳离子捕获剂，
其中所述阳离子捕获剂是选自吡咯、2-甲基吡咯、3-甲基吡咯、2,3-二甲基吡咯、2,4-二甲基吡咯、吲哚、5-甲氧基吲哚、3-甲基吲哚、4-甲基吲哚、5-甲基吲哚、6-甲基吲哚、7-甲基吲哚、5,6-二甲基吲哚、6,7-二甲基吲哚、2-甲基呋喃、2,3-二甲基呋喃、2-甲基-3-(甲硫基)呋喃和薄荷呋喃中的至少一种。
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